BR112013030880B1

BR112013030880B1 - Composição aquosa estabilizada de furina recombinante

Info

Publication number: BR112013030880B1
Application number: BR112013030880-0A
Authority: BR
Inventors: Meinhard Hasslacher; Andrzej Citkowicz; Catherine White; Ken Franke
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2022-04-12
Also published as: KR102050609B1; JP2014519506A; CN103889454B; CN103889454A; EP2714087B1; JP5797837B2; RU2610436C2; AU2012261813A1; SG195261A1; JP6064007B2; SG10201604488TA; AU2017202050A1; US8877473B2; AU2012261813B2; CA2837948A1; AR086672A1; US20150079068A1; TW201249989A; ES2715289T3; JP2016006106A

Abstract

COMPOSIÇÃO AQUOSA ESTABILIZADA DE FURINA RECOMBINANTE, E, MÉTODO PARA A DILUIÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE RFURINA AQUOSA. O presente pedido fornece formulações estabilizadas de furina (por exemplo, rfurina) contendo um sugar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico. Em comparação a composições não estabilizadas, as formulações de furina divulgadas no presente documento retêm maiores quantidades de atividade de farina e teor de furina monomérica, enquanto reduzem a agregação de furina quando armazenadas e/ou submetidas à tensão mecânica. São também fornecidos métodos para a diluição estável de composições de furina (por exemplo, rfurina).

Description

FORMULAÇÕES DE FURINA RECOMBINANTE REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° 61/492.712, depositado em 2 de junho de 2011, cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

CAMPO DO PEDIDO

[0002] O presente pedido geralmente se refere ao campo de formulações de proteína.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] A família das pró-proteína convertases tipo subtilisina proteolíticas de mamíferos (SPC ou PC) é homóloga a subtilisinas bacterianas e Kex2p da levedura. Até à data, sete membros distintos da família de SPC foram identificados, incluindo furina, PC1 (também conhecido como PC3), PC2, PACE4, PC4, PC5 (também conhecido como PC6), PC7 (LPC, PC8, ou SPC7), cada qual exibe distribuição de tecido única.

[0004] Furina, também denominada PACE (enzima de clivagem de aminoácido básico pareado) é ubiquitariamente expressa em todos os tecidos de mamíferos e linhas celulares e é capaz de processar uma ampla gama de proteínas precursoras bioativas na via secretora, incluindo também, hormônios, fatores de crescimento, receptores, proteínas virais e bacterianas, e proteínas plasmáticas. É uma endoprotease serina dependente de cálcio estruturalmente disposta em vários domínios, particularmente um peptídeo sinal, pró-peptídeo, domínio catalítico, domínio médio, (também denominado homo-B ou P-domínio), domínio rico em cisteína localizado C-terminalmente, domínio de transmembrana e cauda citoplasmática. O sítio de clivagem de furina protease compreende uma sequência de reconhecimento que é caracterizada pela sequência de aminoácido Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka et al., J Biol Chem. 1991; 266:12127-30).

[0005] Furina pertence à família das pró-proteína convertases e é dependente de cálcio (Ca2 +). A furina especificamente cliva a ligação peptídica de C-terminal da arginina dentro de uma sequência específica, contendo arginina nas posições -1 e -4. Essa sequência pode ser encontrada em várias proteínas humanas, mostrando que furina desempenha um papel importante na maturação de uma série de pró-proteínas humanas. Nesse sentido, a furina é uma pró-proteína convertase que processa proteínas precursoras latentes em seus produtos biologicamente ativos. Furina é uma endoprotease serina dependente de cálcio que cliva proteínas precursoras em seus sítios de processamento de aminoácido básicos pareados. Um substrato para furina é o Fator von Willebrand (vWF).

[0006] Furina (por exemplo, rfurina) é capaz de converter pró-VWF (pró-fator von Willebrand) em VWF maduro pela clivagem da ligação peptídica de Arg741-Ser742 do VWF. Esta etapa de maturação é parte de, por exemplo, um processo de produção de rVWF que fornece uma terapia para Doença de von Willebrand tipo B. A produção de proteínas recombinantes ativadas é de alta importância clínica e diagnóstica. Por exemplo, proteínas ativas ou maduras, tal como VWF maduro, podem ser usadas para controlar a coagulação sanguínea.

[0007] Formulações de furina, formulações de furina particularmente recombinante (rfurina), frequentemente têm vida de prateleira baixa (de menos de 6 meses) devido a uma perda da atividade de rfurina da degradação de proteína (frequentemente de autoclivagem da proteína de furina). Além disso, quando usadas em determinados processos de produção, tal como produção de vWF maduro, as formulações de rfurina são diluídas, frequentemente por 200 vezes, e a rfurina diluída geralmente mostra uma perda de atividade desproporcional. Nesse sentido, há uma necessidade no campo de métodos e formulações que estabilizam composições de furina (por exemplo, rfurina), bem como métodos para diluir composições de furina concentrada (por exemplo, rfurina) sem perder uma fração substancial da atividade de furina.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente divulgação cumpre estas e outras necessidades no campo da formulação, armazenamento, e manipulação de furina (por exemplo, rfurina), fornecendo métodos e formulações para estabilizar furina (por exemplo, composições de rfurina). Essas necessidades são atendidas, pelo menos em parte, pela descoberta de que a adição de açúcares, álcoois de açúcar, e/ou surfactantes não iônicos aumenta significativamente a estabilidade das composições de furina (por exemplo, rfurina) durante o armazenamento e estresse mecânico.

[0009] Nesse sentido, a presente invenção fornece formulações de furina altamente estabilizadas, particularmente formulações de rfurina altamente estabilizadas que mostram maior estabilidade sob condições de alta temperatura, agitação, e variação de pH quando comparadas às formulações de furina de partida (controle).

[00010] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma composição aquosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), a composição compreendendo: de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina; de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 a 200 ppm de surfactante não iônico; de 10 a 200 mM de agente tamponador; e um pH de 5,5 a 7,5.

[00011] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem 150 mM a 250 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 190±10 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável.

[00012] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio.

[00013] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem 0,9±0,2 mM de cálcio. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 0,92 mM de cálcio.

[00014] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem de 5% a 15% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 10% de açúcar ou álcool de açúcar.

[00015] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o açúcar ou o álcool de açúcar é a sacarose.

[00016] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem de 50 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 75 ppm de surfactante não iônico. a. Em uma modalidade das composições fornecidas acima, o surfactante não iônico é polissorbato 80. b. Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem de 50 mM a 150 mM de agente tamponador. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 90±10 mM de agente tamponador. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 91 mM de agente tamponador.

[00017] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, o agente tamponador compreende acetato. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o agente tamponador compreende HEPES. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o agente tamponador compreende MES. Em outra modalidade das composições fornecidas acima, o agente tamponador compreende acetato e HEPES.

[00018] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima incluem de 25 mM a 75 mM de acetato e de 25 a 75 mM de HEPES. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 45±5 mM de acetato e 45±5 mM de HEPES. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima incluem 45 mM de acetato e 46 mM de HEPES.

[00019] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 6,0±0,2. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 6,0.

[00020] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição tem maior estabilidade quando armazenada a 37°C em comparação com uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

[00021] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de atividade de rfurina quando armazenada a 37°C em comparação com uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

[00022] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de teor de monômero de rfurina quando armazenada a 37°C em comparação com uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

[00023] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição tem maior estabilidade quando agitada em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00024] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de atividade de rfurina quando agitada em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00025] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de teor de monômero de rfurina quando agitada em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00026] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição tem maior estabilidade quando diluída em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00027] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de atividade de rfurina quando diluída em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00028] Em uma modalidade das composições fornecidas acima, a composição mantém um percentual mais alto de teor de monômero de rfurina quando diluída em comparação com uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

[00029] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma composição aquosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), a composição compreendendo: de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina; 190 mM de cloreto de sódio; 0,92 mM de cálcio; 10% de trealose; 75 ppm de Polissorbato 80; 45 mM de ácido acético; 46 mM de HEPES; e um pH de 5,5 a 7,5.

[00030] Em uma modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima tem um pH de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 6,0±0,2. Em outra modalidade, as composições fornecidas acima têm um pH de 6,0.

[00031] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para diluir uma composição aquosa de rfurina, o método compreendendo adicionar um tampão de diluição compreendendo de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico para a composição de rfurina aquosa, formando uma composição de rfurina diluída.

[00032] Em uma modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição compreende de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição compreende de 50 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição compreende 75 ppm de surfactante não iônico.

[00033] Em uma modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição tem um pH de 5,5 a 7,5. Em outra modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição tem um pH de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição tem um pH de 6,0±0,2. Em outra modalidade dos métodos fornecidos acima, o tampão de diluição tem um pH de 6,0.

[00034] Em uma modalidade dos métodos fornecidos acima, a composição de rfurina diluída compreende pelo menos 50% de atividade de rfurina presente na composição de rfurina aquosa antes da diluição.

[00035] Em uma modalidade dos métodos fornecidos acima, a composição de rfurina diluída compreende pelo menos 75% da atividade de rfurina presente na composição de rfurina aquosa antes da diluição.

[00036] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma formulação altamente estabilizada de furina recombinante (rfurina), a referida formulação compreendendo: 8.000 a 52.000 U/mL de rfurina; 1 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,1 mM a 2 mM de cloreto de cálcio; 1% a 20% de açúcar e/ou dihidrato de açúcar; 50 a 100 ppm de um surfactante; e 1 mM a 100 mM de um ácido carboxílico, um agente tamponador em concentração suficiente para manter um pH de 4,0 a 7,0, ou ambos o referido ácido carboxílico e o referido agente tamponador.

[00037] Em uma modalidade, as formulações fornecidas acima incluem 180 a 200 mM de sal.

[00038] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o sal é cloreto de sódio.

[00039] Em uma modalidade, as formulações fornecidas acima incluem 0,5 a 1,0 mM de cálcio.

[00040] Em uma modalidade, as formulações fornecidas acima incluem 5 a 15% de açúcar ou dihidrato de açúcar.

[00041] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o açúcar ou o dihidrato de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos.

[00042] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o surfactante é Polissorbato 80.

[00043] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o surfactante está presente em uma concentração de cerca de 65 a cerca de 85 ppm.

[00044] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o ácido carboxílico é ácido acético.

[00045] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o ácido carboxílico está em uma concentração de 35 a 55 mM.

[00046] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o agente tamponador é HEPES.

[00047] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, o agente tamponador está em uma concentração de cerca de 20 a cerca de 100 mM.

[00048] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, a formulação mostra estabilidade aprimorada após armazenamento a 37°C em comparação com uma formulação que não contém um açúcar ou dihidrato de açúcar.

[00049] Em uma modalidade das formulações fornecidas acima, a formulação é preparada pela adição de rfurina a uma composição compreendendo 1% de Polissorbato 80, 500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de cloreto de cálcio, e pó de dihidrato de trealose, em que a referida composição tem um pH de 6.0 antes da adição da referida rfurina.

[00050] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma formulação altamente estabilizada de furina recombinante (rfurina), a referida formulação compreendendo: 8.000 a 57.000 U/mL de rfurina; 190 mM de cloreto de sódio; 0,92 mM de cloreto de cálcio; 10% p/p de dihidrato de trealose; 75 ppm de Polissorbato 80; 45 mM de ácido acético; e 46 mM de HEPES.

[00051] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma formulação altamente estabilizada de furina recombinante (rfurina) que inclui: (a) 8.000 a 52.000 U/mL de rfurina; (b) 1 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; (c) 0,1 mM a 2 mM de cloreto de cálcio; (d) 1% a 20% de açúcar e/ou dihidrato de açúcar; (e) 50 a 100 ppm de um surfactante; e (f) 1 mM a 100 mM de um ácido carboxílico ou um agente tamponador em concentração suficiente para manter um pH de 4,0 a 7,0, ou ambos os ácido carboxílico e agente tamponador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00052] Figura 1. rFurina na formulação de controle - um estudo de temperatura analisado usando o ensaio de atividade de furina. Amostras de rfurina na formulação de controle foram incubadas a: temperatura ambiente, 37°C, ou 45°C por até sete dias. As atividades de amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação. Barras de erro são ± 1 desvio- padrão; n = 4.

[00053] Figura 2. rFurina na formulação de controle - um estudo de temperatura analisado usando SEC. As mesmas amostras como na figura 1 foram analisadas usando SEC. As alturas de pico relativas de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação. As alturas de pico relativas foram calculadas como os percentuais da altura de pico de rfurina no tempo zero.

[00054] Figura 3. rFurina na formulação de controle incubada a 37°C, analisada usando SEC. As amostras de rFurina na formulação de controle foram incubadas a 37°C durante sete dias. A figura 3 mostra uma sobreposição de perfis de absorção de SEC em 280 nm de seis pontos de tempo. O mesmo estudo como figura 1.

[00055] Figura 4. rFurina na formulação de controle incubada à temperatura ambiente e 37°C, analisada usando Western blotting. O mesmo estudo como na figura 1. Pista: (1) Marcador MWM; (2) T = 0; (3) rfurina incubada à temperatura ambiente durante 1 dia; (4) rfurina incubada à temperatura ambiente por 2 dias; (5) rfurina incubada à temperatura ambiente por 3 dias; (6) rfurina incubada à temperatura ambiente por 7 dias; (7) Marcador MWM; (8) rfurina incubada a 37°C durante 1 dia; (9) rfurina incubada a 37°C durante 2 dias; (10) rfurina incubada a 37°C durante 3 dias; e (11) rfurina incubada a 37°C durante 7 dias.

[00056] Figura 5. rFurina na formulação de controle - um estudo de congelamento/descongelamento analisado usando o ensaio de atividade de furina. A atividade de rFurina é plotada contra o número de ciclos de congelamento/descongelamento. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n = 4.

[00057] Figura 6. rFurina na formulação de controle - um estudo de congelamento/descongelamento analisado usando SEC. As alturas de pico de rFurina são plotadas contra o número de ciclos de congelamento/descongelamento.

[00058] Figura 7. rFurina na formulação de controle - um estudo de agitação analisado usando o ensaio de atividade. A atividade de rFurina é plotada contra o tempo de agitação. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n = 4.

[00059] Figura 8. rFurina na formulação de controle - um estudo de agitação analisado usando SEC. As alturas de rFurina são plotadas contra o tempo de agitação.

[00060] Figura 9. Comparação de diferentes lotes de rfurina usando Western blotting. Vários lotes de rfurina foram analisados usando Western blotting. A ordem de produção é denotada por ordem alfabética. Pista: (1) Marcador MWM; (2) referência de furina; (3) 04/03/09 (lote 018342, frasco de 2 mL); (4) 08/03/09 (lote 018365, frasco de 2 mL); (5) 15/03/09 (lote 018366, 2 mL); (6) 01/03/09 (lote 018315, frasco de 2 mL); (7) 26/07/10 (lote X572, garrafa de 200 mL); (8) 06/03/09 (lote 018365, garrafa de 200 mL); (9) 01/08/10 (lote X576, garrafa de 200 mL); (10) 09/03/09 (lote 018366, garrafa de 200 mL); (11) Marcador MWM; (12) referência de furina; (13) 03/08/10 (lote X577, garrafa de 200 mL); (14) 24/07/10 (lote X573, garrafa de 200 mL); (15) 30/07/10 (lote X 575, garrafa de 200 mL); (16) 018346 (estabilidade QC a -80°C); (17) 018346 (estabilidade QC a -25°C); (18) 018315 (estabilidade QC a -80°C); e (19) 018315 (estabilidade QC a -25°C).

[00061] Figura 10. Impacto do método de descongelamento na atividade de rfurina analisado usando o ensaio de atividade de furina. As atividades da amostra de rFurina são mostradas como barras para vários lotes de rfurina descongelados em qualquer um de: 4°C (à esquerda) ou à temperatura ambiente (TA; à direita). Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n = 4.

[00062] Figura 11. Efeito de pH 5 e 5,5 na atividade de rfurina analisado usando o ensaio de atividade de furina. As amostras de rFurina foram incubadas a 37°C em qualquer pH: 5,0, 5,5 ou 6,0 (formulação de controle) por até sete dias. As atividades de amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n = 4.

[00063] Figura 12. Efeito de pH 5 e 5,5 na atividade de rfurina analisado usando SEC. As amostras de rFurina foram incubadas a 37°C em qualquer pH: 5,0, 5,5 ou 6,0 (formulação de controle). As alturas de pico relativas de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação. As alturas de pico relativas foram calculadas como o percentual da altura de pico de rfurina no tempo zero.

[00064] Figura 13. Estabilidade de rFurina a 37°C, na formulação de controle analisada usando SEC. Uma amostra de rfurina na formulação de controle foi incubada durante quatro dias a 37°C. A sobreposição dos perfis de absorção de 280 nm mostra três pontos de tempo: T = 0, 1 dia, e 4 dias de incubação.

[00065] Figura 14. Estabilidade de rFurina em MES, pH 6.0 analisado usando SEC. Uma amostra de rfurina foi marcada com MES (final C=100 mM, pH 6,0) e incubada durante quatro dias a 37°C. Uma sobreposição de perfis de absorção de 280 nm mostra três pontos de tempo: T=0, 1 dia, e 4 dias de incubação.

[00066] Figura 15. Estabilidade de rFurina em HEPES, pH 7,0 analisada usando SEC. Uma amostra de rfurina foi marcada com HEPES (final C=100 mM, pH 7,0) e incubada durante quatro dias a 37°C. A sobreposição dos perfis de absorção de 280 nm mostra três pontos de tempo: T=0, 1 dia, e 4 dias de incubação.

[00067] Figura 16. Estabilidade de rFurina em HEPES, pH 8,0 analisada usando SEC. Uma amostra de rfurina foi marcada com HEPES (final C=100 mM, pH 8,0) e incubada durante quatro dias a 37°C. A sobreposição dos perfis de absorção de 280 nm mostra três pontos de tempo: T=0, 1 dia, e 4 dias de incubação.

[00068] Figura 17. Efeitos de aditivos de sacarose e Polissorbato 80 na estabilidade de rfurina a 37°C analisados usando SEC. As amostras foram incubadas a 37°C durante quatro dias. As alturas de pico relativas de rfurina são plotadas contra o tempo de incubação. As alturas de pico relativas foram calculadas como os percentuais da altura de pico de rfurina no tempo zero.

[00069] Figura 18. Efeitos da sacarose e Polissorbato 80 na estabilidade de rfurina na formulação de controle a 37°C analisados usando o ensaio de atividade de furina. As atividades relativas de amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação para comparar as seguintes amostras: formulação de controle sem aditivos, formulação de controle mais 10% de sacarose, e formulação de controle mais 10% de sacarose mais 25 ppm de Polissorbato 80. Os valores da atividade relativa foram calculados como os percentuais da atividade de furina no tempo zero. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão=4.

[00070] Figura 19. Efeitos da sacarose e Polissorbato 80 na estabilidade de rfurina no tampão MES a 37°C analisados usando o ensaio de atividade de furina. As atividades relativas das amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação para comparar as seguintes amostras: formulação de controle sem aditivos, marcada com MES (final C=100 mM, pH 6,0), marcada com MES (final C=100 mM, pH 6 mais 10% de sacarose, e marcada com MES (final C=100 mM, pH 6,0) mais 10% de sacarose mais 25 ppm de Polissorbato 80. Os valores da atividade relativa foram calculados como os percentuais da atividade de furina no tempo zero. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00071] Figura 20. Comparação da estabilidade de rfurina a 37°C na formulação de controle à formulação no tampão MES analisada usando o ensaio de atividade de furina. As atividades relativas de amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação para comparar as seguintes amostras: formulação de controle sem aditivos, formulação de controle mais 10% de sacarose, e marcada com MES (final C=100 mM, pH 6,0) mais 10% de sacarose. Os valores da atividade relativa foram calculados como os percentuais da atividade de furina no tempo zero. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00072] Figura 21. Comparação da estabilidade de rfurina a 37°C em sacarose ao manitol analisado usando o ensaio de atividade de furina. Todas as amostras foram marcadas com HEPES/ácido acético, pH 6,0. As atividades relativas de amostras de rfurina são plotadas contra o número de dias de incubação para comparar as seguintes amostras: sem aditivos, 10% de sacarose, 10% de manitol, 10% de sacarose mais 25 ppm de Polissorbato 80, e 10% de manitol mais 25 ppm de Polissorbato 80. Os valores da atividade relativa foram calculados como os percentuais da atividade de furina no tempo zero. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00073] Figura 22. Estabilidade de rFurina a 37°C: sacarose vs. manitol analisado usando SEC. As mesmas amostras como na Figura 21 foram analisadas usando SEC. As alturas de pico relativas de rfurina são plotadas contra o tempo de incubação. As alturas de pico relativas foram calculadas como as percentagens da altura de pico de rfurina no tempo zero.

[00074] Figura 23. Estabilidade de rFurina em trealose após 5 dias de incubação a 37°C analisada pelo ensaio da atividade de furina. Os efeitos de quantidades variadas de trealose e Polissorbato 80 na estabilidade de rfurina a 37°C são examinados usando o ensaio da atividade de furina. Em primeiro lugar, todas as amostras foram marcadas com HEPES e ácido acético (concentrações finais: HEPES - 50 mM, ácido acético - 50 mM, pH 6,0) em seguida, 10% de sacarose ou várias quantidades de trealose e/ou Polissorbato 80 foram adicionados. Uma amostra de rfurina na formulação de controle também está incluída. Os dados são classificados dos valores de atividade mais altos aos mais baixos após 5 dias de incubação a 37°C (barra à direita em cada par). A barra à esquerda em cada par retrata valores de atividade de furina no tempo zero. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00075] Figura 24. Atividade de rFurina em trealose após 5 dias de incubação a 37°C. As mesmas amostras como na figura 23 são exibidas após recálculo para mostrar qual é o percentual da atividade inicial de cada amostra restante após cinco dias de incubação a 37°C. Uma amostra de rfurina na formulação de controle também está incluída. Barras de erro são ± 1 desvio- padrão; n=4.

[00076] Figura 25. Estabilidade de rFurina em trealose após 5 dias de incubação a 37°C analisada usando SEC. As mesmas amostras como na Figura 24. O gráfico mostra qual é o percentual do pico de rfurina inicial de cada amostra restante após cinco dias de incubação a 37°C. Uma amostra de rfurina na formulação de controle também está incluída.

[00077] Figura 26. Estabilidade de rFurina em trealose após 5 dias de incubação a 35°C analisada usando Western blotting. As mesmas amostras como na Figura 24. As amostras são pareadas: primeira amostra - tempo zero, segunda amostra - incubada a 37°C durante 5 dias. Pistas: (1) Marcador MWM; (2) referência de furina, (3) controle; (4) formulação de controle, T = 0; (5) formulação de controle, 5 dias; (6) 10% de sacarose, T = 0; (7) 10% de sacarose, 5 dias; (8) 2% de trealose, T = 0; (9) 2% de trealose, 5 dias; (10) 10% de trealose, T = 0; (11) 10% de trealose, 5 dias; (12) Marcador MWM; (13) furina de referência; (14) controle; (15) 5% de trealose, T = 0; (16) 5% de trealose, 5 dias; (17) 5% de trealose, + 10 ppm de Tween80, T=0; (18) 5% de trealose, + 10 ppm de Tween80, 5 dias; (19) 5% de trealose, + 25 ppm de Tween80, T=0; (20) 5% de trealose, + 25 ppm de Tween80, 5 dias; (21) 5% de trealose, + 100 ppm de Tween80, T=0; e (22) 5% de trealose, + 100 ppm de Tween80, 5 dias.

[00078] Figura 27. Efeito do teor de trealose na atividade de rfurina testado após 5 dias de incubação a 37°C. O mesmo experimento como na figura 24. Em primeiro lugar, todas as amostras foram marcadas com HEPES e ácido acético (concentrações finais: HEPES - 50 mM, ácido acético - 50 mM, pH 6,0) em seguida, várias quantidades de trealose foram adicionadas. A atividade de furina após cinco dias de incubação a 37°C é plotada contra o percentual de trealose adicionado às amostras. Barras de erro são ± 1 desvio- padrão; n=4.

[00079] Figura 28. Efeito do teor de trealose na estabilidade de rfurina a 37°C analisado usando SEC após 5 dias de incubação. O mesmo experimento como na figura 27. As alturas de pico de rFurina após cinco dias de incubação a 37°C são plotadas contra o percentual de trealose adicionado às amostras.

[00080] Figura 29. Efeito do teor de Polissorbato 80 na atividade de rfurina testado após 5 dias de incubação a 37°C. O mesmo experimento como na figura 24. Em primeiro lugar, todas as amostras foram marcadas com HEPES, ácido acético (concentrações finais: HEPES - 50 mM, ácido acético - 50 mM, pH 6,0), e 5% de trealose, em seguida, várias quantidades de Polissorbato 80 foram adicionadas. A atividade de furina após cinco dias de incubação a 37°C é plotada contra a quantidade de Polissorbato 80 adicionada às amostras. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00081] Figura 30. Efeito do teor de Polissorbato 80 na estabilidade de rfurina a 37°C analisado usando SEC após 5 dias de incubação. As mesmas amostras como na Figura 29. As alturas de pico de rFurina após cinco dias de incubação a 37°C são plotadas contra a quantidade de Polissorbato 80 adicionada às amostras.

[00082] Figura 31. rFurina na formulação altamente estabilizada - estudo de agitação analisado usando o ensaio de atividade de furina. As amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada foram marcadas com várias quantidades de Polissorbato 80. O gráfico mostra valores de atividade de furina antes e após três horas de agitação. Os dados são classificados da atividade mais alta para a mais baixa. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4. As barras à esquerda em cada par mostram atividade no tempo 0, as barras à direita em cada par mostram atividade após agitação.

[00083] Figura 32. rFurina na formulação altamente estabilizada - estudo de agitação analisado usando SEC. O mesmo experimento como na figura 31. O gráfico mostra alturas de pico de rfurina antes e após três horas de agitação. Os dados são classificados dos mais altos aos mais baixos. As barras à esquerda em cada par mostram atividade no tempo 0, as barras à direita em cada par mostram atividade após agitação.

[00084] Figura 33. rFurina na formulação altamente estabilizada - efeitos do teor de polissorbato em um estudo de agitação analisados usando o ensaio de atividade de furina. As mesmas amostras como na Figura 32. A atividade de furina após três horas de agitação é plotada contra o teor de Polissorbato 80. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00085] Figura 34. rFurina na formulação altamente estabilizada - efeito de Polissorbato 80 no estudo de agitação analisado usando SEC. As mesmas amostras como na Figura 32. As alturas de pico de rFurina após três horas de agitação são plotadas contra o teor de Polissorbato 80.

[00086] Figura 35. rFurina na formulação de controle - estudo de agitação analisado usando SEC. O cromatograma mostra uma sobreposição de perfis de absorção de SEC em 280 nm comparando amostras de rfurina na formulação de controle antes e após três horas de agitação. O pico de rfurina da amostra agitada é significativamente mais baixo do que o da amostra controle. Observa-se a ausência de altos picos de massa molecular na amostra agitada (vide parágrafo 3.5.1 para explicação).

[00087] Figura 36. Espectros UV de rfurina na formulação de controle (as mesmas amostras como na figura 35). O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil inclinado e extremamente elevado em comparação com a amostra antes da agitação, que indica a presença de um nível significativo de agregados na amostra agitada.

[00088] Figura 37. Espectros UV das amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada sem Polissorbato 80. O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil elevado em comparação com a amostra antes da agitação, que indica a presença de um nível significativo de agregados na amostra agitada.

[00089] Figura 38. rFurina na formulação altamente estabilizada sem Polissorbato 80 - um estudo de agitação analisado usando SEC. O cromatograma mostra uma sobreposição de perfis de absorção de SEC em 280 nm comparando amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada sem Polissorbato 80 antes e após três horas de agitação. O pico de rfurina da amostra agitada é significativamente mais baixo do que o da amostra controle. Observa-se a ausência de altos picos de massa molecular.

[00090] Figura 39. Espectros UV das amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada contendo 10 ppm de Polissorbato 80. O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil ligeiramente elevado em comparação com a amostra antes da agitação, que indica a presença de agregados na amostra agitada. Os espectros 'agitados' estão mais próximos aos espectros 'agitados antes', em relação àqueles vistos nas amostras sem Polissorbato (figuras 36 e 37), que indicaram que o nível de agregação é menor do que o visto nas amostras sem Polissorbato.

[00091] Figura 40. Espectros UV das amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada contendo 25 ppm de Polissorbato 80. O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil ligeiramente elevado em comparação com a amostra antes da agitação, o que indica a presença de uma pequena quantidade de agregados na amostra agitada.

[00092] Figura 41. Espectros UV das amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada contendo 50 ppm de Polissorbato 80. O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil muito similar ao da amostra antes da agitação. Nenhum dos espectros é inclinado ou elevado, o que indica que nenhuma amostra contém quantidades significativas de grandes agregados.

[00093] Figura 42. Espectros UV das amostras de rfurina na formulação altamente estabilizada contendo 100 ppm de Polissorbato 80. O espectro UV da amostra de rfurina após três horas de agitação mostra um perfil muito similar ao da amostra antes da agitação. Nenhum dos espectros é inclinado ou elevado, o que indica que nenhuma amostra contém quantidades significativas de grandes agregados.

[00094] Figura 43. rFurina na formulação altamente estabilizada - um estudo de congelamento/descongelamento analisado usando o ensaio de atividade de furina. As amostras de rFurina na formulação altamente estabilizada foram marcadas com diferentes quantidades de Polissorbato 80. Os dados mostram a atividade de rfurina nas amostras antes e após 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Os dados são classificados dos mais altos aos mais baixos. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00095] Figura 44. rFurina na formulação altamente estabilizada - um estudo de congelamento/descongelamento analisado usando SEC. As mesmas amostras como na figura 43. Os dados mostram as alturas de pico de rfurina antes e após 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Os dados são classificados dos mais altos aos mais baixos.

[00096] Figura 45. rFurina na formulação altamente estabilizada - um estudo de congelamento/descongelamento analisado usando SEC. As mesmas amostras como na figura 44. As alturas de pico relativas de rfurina são plotadas contra o número de ciclos de congelamento/descongelamento. As alturas de pico relativas foram calculadas como os percentuais das alturas de pico de rfurina antes do primeiro ciclo de congelamento/descongelamento.

[00097] Figura 46. Estabilidade de rFurina na formulação altamente estabilizada a 37°C analisada usando o ensaio de atividade de furina. As amostras de rFurina em qualquer formulação de controle ou na formulação altamente estabilizada foram incubadas a 37°C por 4 dias. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00098] Figura 47. Estabilidade de rFurina na formulação altamente estabilizada a 37°C analisada usando o ensaio de atividade de furina. As mesmas amostras como na figura 46 recalculadas. A atividade relativa de cada amostra foi calculada como o percentual de sua atividade inicial. Barras de erro são ± 1 desvio-padrão; n=4.

[00099] Figura 48. Estabilidade de rFurina na formulação altamente estabilizada a 37°C analisada usando SEC. As mesmas amostras como na figura 46. A altura de pico relativa de rfurina para cada amostra foi calculada como o percentual de sua altura de pico inicial. Barras de erro são ± 1 desvio- padrão; n=4.

[000100] Figura 49. Efeito da temperatura no pH (B) e condutividade (A) do tampão de estoque da formulação altamente estabilizada (500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de CaCl2, pH 6,0).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Introdução

[000101] A presente divulgação é baseada em parte na descoberta de que composições de furina aquosas podem ser estabilizadas contra vários estresses químicos e mecânicos pela adição de açúcares, álcoois de açúcar, e surfactantes não iônicos. As composições de furina aquosas descritas neste documento são significativamente mais estáveis quando armazenadas em ou acima da temperatura ambiente, bem como quando submetidas a estresse mecânico, em comparação com composições de furina similares sem açúcares, álcoois de açúcar, e surfactantes não iônicos. A presente divulgação também é baseada em parte na descoberta de que a adição de surfactantes não iônicos a tampões de diluição de furina permite uma maior recuperação da atividade de furina quando a enzima é diluída a concentrações mais baixas usadas durante a fabricação de vários produtos biológicos recombinantes, tal como VWF.

[000102] Vantajosamente, os estudos descritos neste documento demonstram que a adição de açúcar ou álcoois de açúcar a uma composição de furina melhora a estabilidade da composição quando armazenada por um período de tempo. Por exemplo, mostra-se neste documento que a inclusão de tão pouco quanto 2% de açúcar ou álcool de açúcar em uma formulação de furina aquosa pode aumentar a estabilidade da composição em mais do que 10%. Além disso, mostra-se que a inclusão de 10% de açúcar ou álcool de açúcar em uma formulação de furina aquosa pode aumentar a estabilidade da composição em mais do que 75%.

[000103] Vantajosamente, os estudos descritos neste documento também demonstraram que a adição de surfactante não iônico a uma composição de furina melhora a estabilidade da composição quando submetida a estresse mecânico. Por exemplo, mostra-se neste documento que a inclusão de tão pouco quanto 10 ppm de surfactante não iônico em uma formulação de furina aquosa pode aumentar a estabilidade da composição em mais do que 75%.

[000104] Vantajosamente, os estudos descritos neste documento também demonstram que a inclusão de surfactante não iônico de um tampão de diluição de furina aumenta a recuperação da atividade de furina após a diluição. Por exemplo, mostra-se neste documento que a inclusão de 75 ppm de surfactante não iônico em um tampão de diluição de furina aumenta a recuperação da atividade de furina após a diluição em 3 a 4 vezes.

[000105] Nesse sentido, a presente divulgação fornece composições de formulações de furina altamente estabilizadas. Embora a maioria da discussão neste documento seja em termos de formulações altamente estabilizadas de furina recombinante (rfurina), será apreciado que qualquer proteína furina, incluindo furina isolada de um indivíduo ou quaisquer derivados ou mutantes de furina, pode ser incluída nas formulações da presente invenção.

[000106] Em um aspecto, a presente divulgação fornece formulações de furina altamente estabilizadas que mostram estabilidade aprimorada em formulações de controle quando analisadas após submeter a formulação a um ou mais estressores, incluindo sem limitação exposição das formulações a uma gama de temperaturas, a vários ciclos de congelamento/descongelamento, e/ou à agitação. A estabilidade aprimorada é geralmente avaliada pelo nível de atividade de furina - por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura mais alta do que a temperatura ambiente, uma formulação de furina altamente estabilizada mostrará um nível mais alto de atividade do que uma formulação de controle armazenada sob condições idênticas, em comparação com a atividade de cada uma antes do armazenamento (isto é, no tempo = 0). Métodos para avaliar a estabilidade de uma formulação de furina são descritos neste documento.

[000107] Em aspectos adicionais, a presente divulgação fornece métodos para a formação de formulações de furina altamente estabilizadas da presente invenção. Tais métodos incluem métodos para estabilização de uma formulação de furina para o armazenamento, incluindo armazenamento congelado, armazenamento à temperatura ambiente ou acima, ou liofilização.

[000108] Em ainda outros aspectos, a presente divulgação fornece métodos para diluir soluções de furina concentradas que resultam em maior retenção da atividade de furina após a diluição. Em comparação com composições de furina diluídas com soluções sem surfactante não iônico, composições de furina aquosas diluídas de acordo com os métodos fornecidos neste documento mantêm 3 a 4 vezes mais de atividade enzimática.

Definições

[000109] Como usado neste documento, o termo "furina" se refere a qualquer proteína ou polipeptídeo com atividade de furina, particularmente a capacidade de clivar a ligação peptídica entre os resíduos Arg-763 e Ser-764 do polipeptídeo do pró-fator de von Willebrand (pró-VWF). Em uma modalidade exemplar, a furina se refere a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica ou altamente idêntica à de NP_002560.1 (pré-pró-proteína de furina humana). Em uma modalidade exemplar, furina se refere a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica ou altamente idêntica aos aminoácidos 25-794 de NP_002560.1 (pró-proteína de furina humana). Em uma modalidade exemplar, furina se refere a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica ou altamente idêntica aos aminoácidos 108-794 de NP_002560.1 (proteína de furina madura humana). Como usado neste documento, polipeptídeos de furina também incluem variantes naturais de furina com atividade de clivagem de VWF, bem como construtos de furina modificados com atividade de clivagem de VWF. Como usado neste documento, furina engloba quaisquer variantes naturais, sequências alternativas, isoformas ou proteínas mutantes que mantêm alguma atividade basal (por exemplo, pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de atividade em comparação com a atividade de furina tipo selvagem). Exemplos de mutações de furina encontrados na população humana incluem, sem limitação, A43E, A43G, A43V, R50W, Y64C, L77P, R81C, E97A, E97V, V109M, V109L, R130W, A139V, P169T, N245S, E271K, Q339R, N407S, E457Q, R464W, K469R, S524Y, T536S, L570F, D624N, A642T, S685P, V728I, V735I, R745Q, P772L, e A793T. Os polipeptídeos de furina também incluem polipeptídeos contendo modificação pós-traducional. Por exemplo, mostrou- se que a furina fosforilada nos resíduos S773 e S775, e foi previsto que a furina é glicosilada nos resíduos N387, N440, e N553.

[000110] No contexto da presente divulgação, proteínas de furina incluem polipeptídeos de furina recombinante, bem como polipeptídeos de furina nativa isolados de um material de origem (por exemplo, tecido ou sangue). Os polipeptídeos de furina (recombinantes e purificados de origem) podem ser derivados de um organismo adequado, por exemplo, um mamífero tal como um primata, humano, macaco, coelho, porco, roedores, camundongo, rato, hamster, gerbo, canino, felino, e derivados biologicamente ativos dos mesmos. Os polipeptídeos de furina mutantes e variantes que têm atividade de clivagem de VWF também são englobados, assim como fragmentos funcionais, e proteínas de fusão que compreendem polipeptídeos de furina. Além disso, os polipeptídeos de furina descritos neste documento podem adicionalmente compreender marcações que facilitam a purificação, detecção, ou ambas. Os polipeptídeos de furina descritos neste documento podem ser adicionalmente modificados com uma porção terapêutica ou uma porção adequada para imagem in vitro ou in vivo.

[000111] A furina recombinante proteoliticamente ativa pode ser preparada pela expressão em cultura celular (por exemplo, cultura celular de mamíferos). Exemplos não limitantes de métodos de expressão e purificação para preparar furina recombinante são descritos no WO 1991/06314, WO 1992/09698, Patentes U.S. Nos 6.210.929 e 6.596.526, bem como na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nos. 2009/0181423 e 2009/0304669, cujos conteúdos são por este meio incorporados por referência em suas totalidades para todas as finalidades.

[000112] Como usado neste documento, "atividade" se refere a uma atividade funcional ou atividades de furina ou porção da mesma associada a uma proteína de comprimento total (completa). As atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, atividade biológica, incluindo a participação na maturação proteolítica de substratos de pró-proteína e clivagem de substratos de teste tais como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; AMC = 7-amino-4-metóxi cumarina). Os substratos para furina incluem fator de von Willebrand, hormônio pró-paratireoide, precursor do fator de crescimento transformante beta 1, pró-albumina, pró-beta-secretase, matriz metaloproteinase 1 tipo membrana, e a subunidade beta do fator de crescimento do pró-nervo. Em uma modalidade, uma Unidade (U) de atividade de furina é definida como a quantidade de furina que libera 1 pmol de AMC de Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1) por minuto.

[000113] Como usado neste documento, o termo "estabilidade" (tal como estabilidade de furina ou estabilidade de formulação de furina) é usado em um contexto estrutural, por exemplo, em relação à integridade estrutural de uma proteína, ou em um contexto funcional, por exemplo, em relação à capacidade de uma proteína manter sua função e/ou atividade ao longo do tempo. Conforme será apreciado, a proteína em discussão pode estar contida em uma formulação em conformidade com os métodos e as composições descritas neste documento, e a estabilidade dessa proteína se refere à sua estabilidade nessa formulação. Em uma modalidade, a estabilidade de uma composição de furina é determinada medindo a atividade de furina da composição. Por exemplo, usando um substrato de furina detectável, tal como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; por exemplo, ALX-260-040- M001 vendido por Enzo Life Sciences), por exemplo, em um ensaio conforme descrito em Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402, cujo conteúdo é por este meio incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todas as finalidades. Em uma modalidade, a estabilidade da composição de furina formulada com açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico, como descrito neste documento, é comparada à de uma composição de furina formulada sem o açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico.

[000114] Como usado neste documento, uma composição de furina aquosa "estável em armazenamento" se refere a uma solução de polipeptídeo de furina (por exemplo, uma solução de polipeptídeo de rfurina) que foi formulada para aumentar a estabilidade da proteína na solução, por exemplo, pelo menos, 10%, ao longo de um determinado tempo de armazenamento. No contexto da presente divulgação, uma solução de polipeptídeo de furina (por exemplo, uma solução de polipeptídeo de rfurina) pode ser feita "estável em armazenamento" pela adição de açúcar, álcool de açúcar, surfactante não iônico como um agente estabilizador. Em algumas modalidades, a estabilidade do polipeptídeo de furina em qualquer formulação fornecida pode ser medida, por exemplo, monitorando a formação de agregados, perda de atividade enzimática em massa, ou formação de produtos de degradação, durante um período de tempo. A estabilidade absoluta de uma formulação e os efeitos estabilizadores do açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico variarão dependendo da composição específica sendo estabilizada. Em uma modalidade, a estabilidade de uma composição de furina é determinada medindo a atividade de furina da composição. Por exemplo, usando um substrato de furina detectável, tal como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; por exemplo, ALX-260-040-M001 vendido por Enzo Life Sciences), em um ensaio, por exemplo como descrito em Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402, cujo conteúdo é por este meio incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todas as finalidades. Em uma modalidade, a estabilidade da composição de furina formulada com açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico, como descrito neste documento, é comparada à de uma composição de furina formulada sem o açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico.

[000115] Como usado neste documento, "vida de prateleira" se refere ao período de tempo em que uma formulação mantém um nível predeterminado de estabilidade a uma temperatura predeterminada. Em modalidades específicas, a temperatura pré-determinada se refere à temperatura de congelamento (por exemplo, -80°C, - 25°C, 0°C), refrigerada (por exemplo, 0° a 10°C), ou ambiente (por exemplo, 18°C a 32°C) de armazenamento.

[000116] Como usado neste documento, o termo "tempo de estabilidade" se refere ao período de tempo em que uma formulação é considerada estável. Por exemplo, o tempo de estabilidade para uma formulação pode se referir ao período de tempo em que o nível de agregação e/ou degradação da proteína na formulação permanece abaixo de um determinado limite (por exemplo, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, etc.), e/ou o período de tempo em que uma formulação mantém atividade biológica acima de um determinado limite (por exemplo, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, etc.) da quantidade de atividade presente na formulação no início do período de armazenamento.

[000117] No contexto da presente divulgação, uma composição aquosa estável em armazenamento de um polipeptídeo de furina (por exemplo, polipeptídeo de rfurina) formulada com um açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico terá um tempo de estabilidade mais longo do que de uma composição do mesmo polipeptídeo de furina formulado sem o açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico. Em algumas modalidades, uma composição aquosa estável em armazenamento de um polipeptídeo de furina, terá um tempo de estabilidade, isto é, por exemplo, pelo menos 10% maior do que o tempo de estabilidade para a mesma composição formulada na ausência de açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico, ou pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% maior, ou pelo menos 2 vezes maior, ou pelo menos 2,5 vezes, 3,0 vezes, 3,5 vezes, 4,0 vezes, 4,5 vezes, 5,0 vezes, 5,5 vezes, 6,0 vezes, 6,5 vezes, 7,0 vezes, 7,5 vezes, 8,0 vezes, 8,5 vezes, 9,0 vezes, 9,5 vezes, 10 vezes, ou mais vezes maior do que o tempo de estabilidade para a mesma composição formulada na ausência do açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico.

[000118] Como usado neste documento, "armazenamento" significa que uma formulação não é imediatamente administrada a um indivíduo ou utilizada em um processo de produção, uma vez preparada, mas é mantida por um período de tempo sob condições específicas (por exemplo, temperatura específica) antes do uso. Por exemplo, uma formulação de furina pode ser mantida por dias, semanas, meses ou anos, antes da administração a um indivíduo sob temperaturas variadas tal como temperatura de congelamento (por exemplo, -80°C, -25°C, 0°C), refrigerada (por exemplo, 0° a 10°C), ou ambiente (por exemplo, 18°C a 32°C). Como será apreciado, tais formulações podem ser formulações líquidas ou liofilizadas.

[000119] Como usado neste documento, o termo "cerca de" denota uma faixa aproximada de mais ou menos 10% de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem "cerca de 20%" engloba uma faixa de 18 a 22%.

[000120] Como usado neste documento, quando se referindo a uma concentração de um componente individual de uma composição, as frases "não mais do que X" e "de 0 a X" são equivalentes e se referem a qualquer concentração entre e incluindo 0 e X. Por exemplo, as frases "uma concentração não superior a 2%" e "uma concentração de 0% a 2%" são equivalentes e incluem 0%, 1%, e 2%.

[000121] Como usado neste documento, quando se refere a uma concentração de um componente individual de uma composição, as frases "não menos do que X" se refere a qualquer concentração X ou mais alta. Por exemplo, a frase "uma concentração de não menos do que 98%" inclui 98%, 99% e 100%.

[000122] Como usado neste documento, quando se refere a uma concentração de um componente individual de uma composição, as frases "entre X e Y" e "de X a X" são equivalentes e se referem a qualquer concentração entre e incluindo X e Y. Por exemplo, as frases "uma concentração de entre 49% e 51%" e "uma concentração de 49% a 51%" são equivalentes e incluem 49%, 50% e 51%.

[000123] Como usado neste documento, um "açúcar" se refere a monossacarídeos, tendo a fórmula geral CxH2yOy (linear) ou CxH(2y-1)Oy (cíclico), e dissacarídeos consistindo em duas unidades de monossacarídeo formadas através de uma reação de desidratação. Monossacarídeos podem ser classificados pelo número de átomos de carbono, eles contêm: diose (2), triose (3), tetrose (4), pentose (5), hexose (6), heptose (7), etc. Nesse sentido, como usado neste documento, um açúcar C(X) se refere a um açúcar contendo um número X de moléculas de carbono. Por exemplo, um açúcar C(5) se refere a um açúcar pentose, enquanto um açúcar C(6) se refere a um açúcar hexose. Exemplos não limitantes de açúcares que podem ser utilizados nas formulações fornecidas neste documento incluem: açúcar diose glicolaldeído, açúcares triose gliceraldeído e dihidroxiacetona; açúcares tetrose eritrose, treose, e eritrulose; açúcares pentose arabinose, lixose, ribose, xilose, ribulose, e xilulose; açúcares hexose alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, frutose, sorbose, e tagatose; açúcares heptose sedoheptulose, mannoheptulose e L-glicero-D-manno-heptose; e todas as combinações possíveis de açúcares dissacarídeo formadas dos mesmos, incluindo sem limitação, sacarose, lactulose, lactose, maltose, trealose, celobiose, kojibiose, nigerose, isomaltose, β, β-trealose, α, β- trealose, soforose, laminaribiose, gentiobiose, turanose, maltulose, palatinose, gentiobiulose, mannobiose, melibiose, melibiulose, rutinose, rutinulose e xilobiose.

[000124] Como usado neste documento, um "álcool de açúcar" se refere a uma forma hidrogenada de mono- ou dissacarídeo, cujo grupo carbonila foi reduzido para formar uma hidroxila primária ou secundária. Em uma modalidade, o álcool de açúcar tem entre cerca de 4 e cerca de 8 átomos de carbono. Exemplos não limitantes de álcoois de açúcar que podem ser usados nas formulações fornecidas neste documento incluem glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomalte, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol.

[000125] Como usado neste documento, um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que é seguro para a administração a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) em uma formulação de droga. A seleção e o uso de sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica, por exemplo, vide Stahl and Wermuth, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 2nd Revised edition, Wiley, Hoboken, New Jersey. Em determinadas modalidades, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou uma combinação dos mesmos.

[000126] Como usado neste documento, o termo "surfactante não iônico" se refere a um agente ativo de superfície que é não ionizado sob condições fisiologicamente relevantes. Exemplos não limitantes de surfactantes não iônicos úteis para as composições de furina aquosas estabilizadas fornecidas neste documento incluem: mono-, di- e tri-glicerídeos solúveis em água não iônicos (por exemplo, dicarpilato/dicaprato de propileno glicol (por exemplo, MIGLYOL® 840), mono- e diglicerídeos de cadeia média (por exemplo, CAPMUL® e IMWITOR® 72), triglicerídeos de cadeia média (por exemplo, triglicerídeos caprílicos e cápricos, tais como LAVRAFAC, MIGLYOL® 810 ou 812, CRODAMOL® GTCC-PN, e SOFTISON 378), monoglicerídeos de cadeia longa (por exemplo, monooleatos de glicerila tal como PECEOL®, e monolinoleatos de glicerila tal como MAISINE®), óleo de rícino polioxil (por exemplo, ricinoleato de macrogolglicerol, hidroxiestearato de macrogolglicerol, éter cetoestearílico de macrogol); ésteres de ácido mono- e di-graxos solúveis em água não iônicos de polietileno glicol; ésteres de ácido graxo de sorbitana solúveis em água não iônicos (por exemplo, monolauratos de sorbitana tais como monolaurato de sorbitana (TWEEN 20) de polioxietileno (20) e monolaurato de sorbitana (SPAN 20); monopalmitatos de sorbitana tais como monopalmitatos de sorbitana (TWEEN 40) de polioxietileno (20) e monopalmitato de sorbitana (SPAN 40); monoestearatos de sorbitana tais como monoestearato de sorbitana (TWEEN 60) de polioxietileno (20) e monoestearato de sorbitana (SPAN 60); monooleatos de sorbitana tais como monooleato de sorbitana (TWEEN 80) de polioxietileno (20) e monooleato de sorbitana (SPAN 80); trioleatos de sorbitana tais como trioleato de sorbitana (SPAN 85); e triestearatos de sorbitana tais como triestearato de sorbitana (SPAN65); glicerídeos poliglicolizados (por exemplo, macrogol-6 glicerídeos de lauroíla (Labrafil® M2130CS); succinato de d-α-tocoferil polietilenoglicol 1000 (TPGS), 12-hidroxiestearato de polietilenoglicol 660 (SOLUTOL® HS 15), oleato e estearato de polioxila (por exemplo, monoestearato PEG 400 e monoestearato PEG 1750); copolímeros de tribloco solúveis em água não iônicos (por exemplo, copolímeros de tribloco de poli(etileno-óxido)/poli- (propileno-óxido)/poli(etileno-óxido) tal como polímero de metil-oxirano BHT (PLURONIC® F-127).

[000127] Em uma modalidade, composições de furina estáveis em armazenamento (por exemplo, rfurina) são fornecidas que contêm um surfactante não iônico, selecionado a partir de um monoglicerídeo solúvel em água não iônico, um diglicerídeo solúvel em água não iônico, um triglicerídeo solúvel em água não iônico, ésteres de ácido monograxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, ésteres de ácido digraxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico, um glicerídeo poliglicolizado não iônico, um copolímero de tribloco solúvel em água não iônico, e uma combinação dos mesmos.

[000128] Como usado neste documento, o termo "derivado biologicamente ativo" quando usado no contexto do polipeptídeo de furina, também engloba polipeptídeos obtidos através da tecnologia de DNA recombinante. Isto pode incluir qualquer método conhecido na técnica para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, por exemplo, através da transcrição reversa de RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introduzir de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, por exemplo, através de eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar as referidas células transformadas, por exemplo, de forma contínua ou descontínua, (iv) expressar proteína de furina, por exemplo, constitutivamente ou mediante indução, e (v) isolar a referida proteína de furina, por exemplo, do meio de cultura ou colheita das células transformadas, a fim de (vi) obter proteína de furina recombinante substancialmente purificada, por exemplo, através de cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, e similares. O termo "derivado biologicamente ativo" também inclui moléculas quiméricas tal como, por exemplo, uma proteína de furina, ou fragmento funcional da mesma, em combinação com um segundo polipeptídeo, por exemplo, um domínio Fc de imunoglobulina ou um domínio de albumina, com a finalidade de aprimorar as propriedades biológicas/farmacológicas tal como, por exemplo, meia-vida da proteína de furina no sistema circulatório de um mamífero, particularmente um ser humano.

[000129] Como usado neste documento e nas reivindicações acrescentadas, as formas singulares "um" "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Desse modo, por exemplo, a referência a "um agente tamponador" se refere a um agente ou misturas desses agentes, e a referência ao "método" inclui referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante.

[000130] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica a esta invenção pertence. Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas neste documento por referência, com a finalidade de descrever e divulgar dispositivos, composições, formulações e metodologias que são descritos na publicação e que podem ser usados em conexão com a invenção atualmente descrita.

[000131] Onde uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior da faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa faixa declarada é englobado na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem independentemente ser incluídos nas escalas menores e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa indicada. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo ambos os limites incluídos também são incluídas na invenção.

[000132] Como usado neste documento, "BDS" se refere à "Substância Ativa a Granel". Composições Aquosas Estabilizadas de Furina Recombinante

[000133] Em um aspecto, a presente divulgação fornece formulações aquosas estabilizadas de furina, por exemplo, rfurina. As seguintes modalidades são baseadas, em parte, na descoberta de que a inclusão de um açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico estabiliza composições de furina aquosas, em comparação com composições sem açúcar, álcool de açúcar, e/ou surfactante não iônico.

[000134] Como será reconhecido por uma pessoa versada na técnica, composições de furina (por exemplo, composições de rfurina) formuladas de acordo com as modalidades fornecidas neste documento podem conter, além dos componentes explicitamente divulgados, contraíons contribuídos pela inclusão dos componentes da solução ou agentes modificadores de pH, por exemplo, sódio ou potássio contribuídos a partir de um sal de acetato, hidróxido de sódio, ou hidróxido ou cloreto de potássio contribuídos pelo cloreto de cálcio ou ácido clorídrico. No contexto da presente divulgação, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, rfurina) consistindo em ou consistindo essencialmente em uma determinada formulação pode adicionalmente compreender um ou mais contraíons, conforme necessário pelo processo de formulação em um pH específico.

[000135] Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, composição de rfurina) fornecida neste documento será estabilizada à temperatura ambiente (isto é, entre 18°C e 32°C) por um período de tempo. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição de imunoglobulina aquosa, estável em armazenamento será estável quando armazenada à temperatura ambiente por pelo menos 4 dias. Em outras modalidades, a composição será estável à temperatura ambiente por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, ou mais dias. Em outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 1 mês. Em ainda outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou mais meses. Em determinadas modalidades, a temperatura ambiente se refere a uma temperatura entre 20°C e 30°C, entre 21°C e 29°C, entre 22°C e 28°C, entre 23°C e 27°C, entre 24°C e 26°C, ou cerca de 25°C. Em uma modalidade específica, a composição será estável por um período de tempo prolongado, quando armazenada a uma temperatura entre 20°C e 25°C.

[000136] Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, composição de rfurina) fornecida neste documento será estabilizada à temperatura refrigerada (isto é, entre 2°C e 10°C) por um período de tempo. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição de imunoglobulina aquosa, estável em armazenamento será estável quando armazenada à temperatura refrigerada por pelo menos 4 dias. Em outras modalidades, a composição será estável à temperatura refrigerada por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, ou mais dias. Em outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 1 mês. Em ainda outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou mais meses. Em uma modalidade específica, a composição será estável por um período de tempo prolongado, quando armazenada a uma temperatura entre 2°C e 8°C.

[000137] Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, composição de rfurina) fornecida neste documento será estabilizada à temperatura elevada (isto é, entre 32°C e 42°C) por um período de tempo. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição de imunoglobulina aquosa, estável em armazenamento será estável quando armazenada à temperatura elevada pelo menos 4 dias. Em outras modalidades, a composição será estável à temperatura elevada por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, ou mais dias. Em outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 1 mês. Em ainda outras modalidades, a composição será estável durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou mais meses. Em uma modalidade específica, a composição será estável por um período de tempo prolongado, quando armazenada a uma temperatura entre 35°C e 40°C.

[000138] Em uma modalidade, uma composição de furina armazenada é considerada estável em armazenamento desde que a composição mantenha pelo menos 40% da atividade de furina presente no início do período de armazenamento (por exemplo, no tempo = 0). Em outra modalidade, uma composição armazenada é considerada estável desde que a composição mantenha pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais da atividade de furina presente no início do período de armazenamento (por exemplo, no tempo = 0). Em uma modalidade, a atividade de furina é medida em um ensaio como descrito em Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402.

[000139] Em uma modalidade, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 10% mais de atividade de furina após o armazenamento por um período de tempo, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador. Em outras modalidades, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou um percentual maior de mais atividade de furina após o armazenamento por um período de tempo, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador.

[000140] Em uma modalidade, uma composição de furina armazenada é considerada estável desde que o percentual de furina presente em um estado agregado permaneça não mais do que 50%. Em outras modalidades, uma composição de furina armazenada é considerada estável desde que a percentagem de furina presente em um estado agregado permaneça não mais do que 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos.

[000141] Em uma modalidade, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 10% de menos de atividade de furina após o armazenamento por um período de tempo, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador. Em outras modalidades, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, ou um percentual maior de menos de furina presente em um estado agregado após o armazenamento por um período de tempo, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador.

[000142] Em uma modalidade, uma composição de furina armazenada é considerada estável em armazenamento desde que a composição mantenha pelo menos 40% da atividade de furina de partida (por exemplo, no tempo = 0) após ser submetida a estresse mecânico. Em outra modalidade, uma composição armazenada é considerada estável desde que a composição mantenha pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais da atividade de furina de partida (por exemplo, no tempo = 0) após ser submetida a estresse mecânico. Em uma modalidade específica, o estresse mecânico é agitação (por exemplo, sacudindo).

[000143] Em uma modalidade, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 10% de mais de atividade de furina após ser submetida a estresse mecânico, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador. Em outras modalidades, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar, ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou um percentual maior de mais atividade de furina após ser submetida a estresse mecânico, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador. Em uma modalidade específica, o estresse mecânico é agitação (por exemplo, sacudindo).

[000144] Em uma modalidade, uma composição de furina armazenada é considerada estável desde que o percentual de furina presente em um estado agregado permaneça não mais do que 50%. Em outras modalidades, uma composição de furina armazenada é considerada estável desde que o percentual de furina presente em um estado agregado permaneça não mais do que 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos, após ser submetida a estresse mecânico. Em uma modalidade específica, o estresse mecânico é agitação (por exemplo, sacudindo).

[000145] Em uma modalidade, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, açúcar, álcool de açúcar ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 10% de menos furina presente em um estado agregado após ser submetida a estresse mecânico, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma quantidade menor do agente estabilizador. Em outras modalidades, uma composição de furina é considerada ter sido estabilizada pela adição de um agente estabilizador (por exemplo, um açúcar, álcool de açúcar ou surfactante não iônico) quando a composição contém pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, ou um percentual maior de menos furina presente em um estado agregado após ser submetida a estresse mecânico, em comparação com uma composição de furina não contendo o agente estabilizador ou contendo uma menor quantidade do agente estabilizador. Em uma modalidade específica, o estresse mecânico é agitação (por exemplo, sacudindo).

[000146] Embora as formulações de furina (por exemplo, rfurina) descritas neste pedido possam ser liofilizadas e reconstituídas nas concentrações indicadas, será apreciado que estas preparações também podem ser reconstituídas na forma mais diluída. Por exemplo, uma preparação de acordo com a presente divulgação que é liofilizada e/ou reconstituída normalmente em 2 mL de solução também pode ser reconstituída em um volume maior de diluente, tal como 5 mL. Da mesma forma, formulações de furina liofilizadas (por exemplo, rfurina) também podem ser reconstituídas na forma mais concentrada. Por exemplo, uma preparação de acordo com a presente divulgação que é liofilizada e/ou reconstituída normalmente em 2 ml de solução também pode ser reconstituída em um volume menor, tal como 1 mL.

[000147] Vantajosamente, em um aspecto, as formulações de furina altamente estabilizadas (por exemplo, de rfurina) da presente invenção são combinadas com um diluente que confere maior recuperação de furina quando a composição resultante é usada em um método de produção, por exemplo, na maturação de rVWF (também referido neste documento como um "método de maturação de rVWF"). A maturação do pró-fator von Willebrand (vWF) para sua forma ativa requer processamento proteolítico após um par de aminoácidos dibásicos (-Lys-Arg-) no resíduo 763. Mostrou-se que vWF preferencialmente é processado pela furina de enzima de clivagem de aminoácido dibásico pareado. Processos de produção para vWF, portanto, incluem o uso de furina, preferencialmente em uma formulação altamente estabilizada. Em um outro aspecto, a formulação altamente estabilizada neste diluente aumenta a recuperação de atividade de furina na etapa de maturação de rVWF por três a quatro vezes em comparação com formulações de controle colocadas em diluentes controle.

[000148] Em determinados aspectos, as formulações altamente estabilizadas da invenção tem uma vida de prateleira de pelo menos 6 meses. Conforme será apreciado, esta vida de prateleira pode ser em temperaturas de congelamento (isto é, -80°C, -25OC, 0°C), temperaturas refrigeradas (0oC a 10°C), ou temperatura ambiente (20°C a 32°C) na forma líquida ou liofilizada. Em aspectos adicionais, as formulações altamente estabilizadas da invenção tem uma vida de prateleira de pelo menos 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 ou 60 meses.

[000149] Em aspectos adicionais e em conformidade com o acima exposto, a vida de prateleira é determinada por uma atividade percentual restante após armazenamento em qualquer uma das temperaturas acima para qualquer um dos períodos de tempo acima. Em determinadas modalidades, vida de prateleira significa que a formulação mantém pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de atividade de furina como medido por qualquer um dos ensaios descritos neste documento ou conhecidos na técnica em comparação com a atividade antes do armazenamento para qualquer um dos períodos de tempo acima em qualquer uma das temperaturas acima.

[000150] Em um aspecto, uma formulação altamente estabilizada de furina (por exemplo, rfurina) de acordo com a presente invenção inclui: (a) 8.000 a 57.000 U/mL de furina (por exemplo, rfurina); (b) 190 mM de cloreto de sódio; (c) 0,92 mM de cloreto de cálcio; (d) 10% p/p de dihidrato de trealose; (e) 75 ppm de Polissorbato 80; (f) 45 mM de ácido acético; e (g) 46 mM de HEPES.

[000151] Em determinados aspectos, formulações altamente estabilizadas da presente divulgação incluem os seguintes componentes: 47 mM de HEPES, 46 mM de ácido acético, 195 mM de cloreto de sódio, 0,094 mM de cloreto de cálcio, 0,0075% de Polissorbato 80, 10% p/p de dihidrato de trealose, pH 6,0.

[000152] Em aspectos adicionais, formulações altamente estabilizadas de furina, incluindo rfurina, em conformidade com a presente divulgação incluem (a) cerca de 5.500 U/mL a 55.000 U/mL; 6.000 U/mL a 50.000 U/mL; 6.500 U/mL a 45.000 U/mL; 7.000 U/mL a 40.000 U/mL; 7.500 U/mL a 35.000 U/mL; 8.000 U/mL a 30.000 U/mL; 8.500 U/mL a 25.000 U/mL; 9.000 U/mL a 20.000 U/mL; 9.500 U/mL a 15.000 U/mL; ou 10.000 U/mL de furina; (b) cerca de 100 mM a 300 mM, 110 mM a 280 mM, 120 mM a 260 mM, 130 mM a 240 mM, 140 mM a 220 mM, 150 mM a 200 mM, ou 160 mM a 180 mM de cloreto de sódio; (c) cerca de 0,5 mM a 9 mM, 1 mM a 8 mM, 1,5 mM a 7 mM, 2 mM a 6 mM, 2,5 mM a 5 mM, ou cerca de 3 mM a 4,5 mM de cloreto de cálcio; (d) cerca de 0,5% a 19%, 1% a 18%, 1,5% a 17%, 2,0% a 16%, 2,5% a 15%, 3,0% a 14%, 3,5% a 13%, 4,0% a 12%, 4,5% a 11%, 5,0% a 10%, 5,5% a 9% ou 6,0% a 8% de dihidrato de trealose; (e) cerca de 0,5 ppm a 140 ppm, 1,0 ppm a 130 ppm, 10 ppm a 120 ppm, 20 ppm a 110 ppm, 30 ppm a 100 ppm, 40 ppm a 95 ppm, 50 ppm a 90 ppm, 55 ppm a 85 ppm, 60 ppm a 80 ppm, ou 70 ppm a 75 ppm de Polissorbato 80; (f) cerca de 25 mM a 90 mM, 30 mM a 80 mM, 35 mM e 70 mM, 40 mM a 60 mM, ou 45 mM a 50 mM de ácido acético e (g) 15 mM a 95 mM, 20 mM a 90 mM, 25 mM e 85 mM, 30 mM a 80 mM, 35 mM a 75 mM, 40 mM a 70 mM, 45 mM a 65 mM, ou 50 mM a 60 mM de HEPES.

[000153] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma composição de furina aquosa estabilizada (por exemplo, rfurina) compreendendo: furina (por exemplo, rfurina) de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico; de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 10 mM de cálcio, um agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar é um açúcar pentose ou hexose.

[000154] Em uma modalidade, uma composição de furina aquosa estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende: furina (por exemplo, rfurina), de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 100 a 200 ppm de surfactante não iônico; de 10 a 200 mM de agente tamponador; e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar é um açúcar pentose ou hexose.

[000155] Em uma modalidade específica, formulações altamente estabilizadas da invenção incluem os seguintes componentes: 47 mM de HEPES, 46 mM de ácido acético, 195 mM de cloreto de sódio, 0,094 mM de cloreto de cálcio, 0,0075% de Polissorbato 80, 10% p/p de dihidrato de trealose, pH 6,0.

[000156] Em outra modalidade específica, uma formulação altamente estabilizada de furina (por exemplo, de rfurina), em conformidade com a presente invenção inclui: (a) 8.000 a 57.000 U/mL de rfurina; (b) 190 mM de cloreto de sódio; (c) 0,92 mM de cloreto de cálcio; (d) 10% p/p de dihidrato de trealose; (e) 75 ppm de Polissorbato 80; (f) 45 mM de ácido acético; e (g) 46 mM de HEPES.

Agentes Estabilizadores

[000157] Vantajosamente, descobriu-se que a inclusão de açúcares, álcoois de açúcar, e surfactantes não iônicos estabiliza composições de furina aquosas (por exemplo, de rfurina). Estes efeitos são demonstrados nos exemplos fornecidos neste documento. Por exemplo, a adição destes agentes aumenta a retenção da atividade de furina no armazenamento de líquidos, reduz a agregação de polipeptídeos de furina no armazenamento de líquidos, reduz a degradação de polipeptídeos de furina no armazenamento de líquidos, reduz a perda da atividade de furina na agitação de uma composição de furina aquosa, e reduz a agregação causada pela agitação de uma composição de furina aquosa.

[000158] Nesse sentido, em uma modalidade, a presente divulgação fornece uma composição de furina aquosa (por exemplo, uma composição de rfurina) compreendendo de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar e de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade, a composição compreende de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar e de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade, a composição compreende 10±2% de açúcar ou açúcar álcool e 75±25 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade específica, a composição compreende 10% de açúcar ou álcool de açúcar e 75 ppm de surfactante não iônico. Em ainda outras modalidades, a composição compreende uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. à Tabela9. Tabela 1. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactantes não iônicos úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, de rfurina).

Var. = Variação Tabela2. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, rfurina).

Var. = Variação Tabela3. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina).

Var. = Variação Tabela4. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina). (%) de Açúcar ou Álcool de Açúcar

Var. = Variação Tabela5. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina). Surfactantenão iônico (ppm)

Var. = Variação Tabela6. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, rfurina). Surfactantenão iônico (ppm)

Var. = Variação Tabela7. Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina). Surfactante não iônico (ppm)

Var. = Variação Tabela8.Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina). Surfactantenão iônico (ppm)

Var. = Variação Tabela9.Modalidades exemplares para a combinação de açúcar ou álcool de açúcar e concentrações de surfactante não iônico úteis para a estabilização de composições de furina (por exemplo, de rfurina).

Var. = Variação

1. AÇÚCARES E ÁLCOOIS DE AÇÚCAR

[000159] Vantajosamente, descobriu-se que a adição de açúcar e/ou álcool de açúcar a composições de furina (por exemplo, composições de rfurina) aumenta a estabilidade de armazenamento da composição. Por exemplo, como mostrado nas figuras 17 a 20 e 22 a 25, a inclusão de apenas 2% de açúcar e/ou álcool de açúcar pode aumentar a estabilidade de armazenamento de uma composição de furina em pelo menos 20%. E a inclusão de 10% de açúcar e/ou álcool de açúcar pode aumentar a estabilidade de armazenamento de uma composição de furina em pelo menos 75%. Nesse sentido, em um aspecto da presente divulgação, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, rfurina) contém uma quantidade estabilizadora de açúcar e/ou álcool de açúcar.

[000160] Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, de rfurina) contém açúcar monossacarídeo. Em uma determinada modalidade, o açúcar monossacarídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um açúcar diose, um açúcar triose, um açúcar tetrose, um açúcar pentose, um açúcar hexose, um açúcar heptose e um açúcar octose. Em uma determinada modalidade, o açúcar é um açúcar pentose, um açúcar hexose, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar é um açúcar hexose.

[000161] Em outra modalidade, a composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, de rfurina) contém um açúcar dissacarídeo. Em uma determinada modalidade, o açúcar dissacarídeo é selecionado a partir de açúcares dissacarídeo formados a partir de monossacarídeos de pentose e/ou hexose. Em outra modalidade específica, o açúcar é selecionado a partir de açúcares dissacarídeo formados a partir de monossacarídeos de hexose. Em uma modalidade, o açúcar é sacarose, trealose, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar é sacarose. Em outra modalidade específica, o açúcar é trealose. Em uma modalidade, o açúcar é formulado como dihidrato de trealose.

[000162] Em outra modalidade, a composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, de rfurina) contém um álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, o álcool de açúcar é selecionado a partir de glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomalte, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em outra modalidade específica, o álcool de açúcar é manitol.

[000163] Em outra modalidade, a composição estável de furina (por exemplo, de rfurina) contém uma mistura de açúcar e álcool de açúcar. Em uma modalidade, a mistura contém pelo menos dois de um monossacarídeo, um dissacarídeo, e um álcool de açúcar. Em outra modalidade, a mistura contém pelo menos dois de um açúcar pentose, um açúcar hexose, um dissacarídeo formado a partir de monossacarídeos de pentose e/ou hexose, e um álcool de açúcar. Em outra modalidade, a mistura contém pelo menos dois de sacarose, trealose, e manitol.

[000164] Em uma modalidade, o açúcar ou álcool de açúcar está presente em uma concentração de 2% a 20%, 2% a 17,5%, 2% a 15%, 2% a 12,5%, 2% a 10%, 2% a 9%, 2% a 8%, 2% a 7%, 5% a 20%, 5% a 17,5%, 5% a 15%, 5% a 12,5%, 5% a 10%, 7,5% a 20%, 7,5% a 17,5%, 7,5% a 15%, 7,5% a 12,5%, 10% a 20%, 10% a 17,5%, 10% a 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%. Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose.

[000165] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento adicionalmente compreende de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000166] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000167] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 2% a 20% de trealose; de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000168] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. a Tabela9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000169] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; uma combinação de trealose e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. a Tabela9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000170] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 100 a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento adicionalmente compreende de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000171] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000172] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 20% de trealose; de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000173] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. a Tabela9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000174] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 100 a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de trealose e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. a Tabela9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000175] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar; 90±25 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento compreende adicionalmente de 10 a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de açúcar ou álcool de açúcar.

[000176] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 a 100 ppm de surfactante não iônico, 90±25 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de açúcar ou álcool de açúcar.

[000177] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; 10±5% de trealose; de 10 a 100 ppm de surfactante não iônico, 90±25 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de trealose. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de trealose. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de trealose.

[000178] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada.

[000179] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de trealose e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. à Tabela9, a partir de 90±25 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000180] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,9 mM de cálcio; 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar; 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, uma composição de furina estável em armazenamento compreende adicionalmente de 10 a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de açúcar ou álcool de açúcar.

[000181] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,9 mM de cálcio; 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar; 75 ppm de surfactante não iônico, 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de açúcar ou álcool de açúcar. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de açúcar ou álcool de açúcar.

[000182] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,9 mM de cálcio; 10±5% de trealose; 75 ppm de surfactante não iônico, 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±2% de trealose. Em outra modalidade específica, a composição contém 10±1% de trealose. Em outra modalidade específica, a composição contém 10% de trealose.

[000183] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,9 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. à Tabela9, 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000184] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,9 mM de cálcio; uma combinação de trealose e surfactante não iônico selecionados a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. à Tabela9, 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000185] Em algumas modalidades, agentes estabilizadores usados nas formulações da presente divulgação são selecionados a partir de um grupo que inclui, sem limitação: sacarose, trealose, manitol, rafinose, e arginina. Estes agentes estão presentes nas formulações da presente invenção em uma quantidade de 0,1% a 20%. Em determinadas modalidades, o agente estabilizador está presente em uma quantidade de 5% a 15%, ou de cerca de 10%. Em outras modalidades, as formulações da presente divulgação incluem agentes estabilizadores em uma quantidade de 0,5% a 19%, 1% a 18%, 1,5% a 17%, 2,0% a 16%, 2,5% a 15%, 3,0% a 14%, 3,5% a 13%, 4,0% a 12%, 4,5% a 11%, 5,0% a 10%, 5,5% a 9%, ou 6,0% a 8%. Determinadas formulações incluem manitol, sacarina e/ou trealose em combinação com um ou mais dos outros componentes da formulação divulgados neste documento.

2. SURFACTANTES NÃO IÔNICOS

[000186] Vantajosamente, descobriu-se que a adição de açúcar ou surfactante não iônico a composições de furina (por exemplo, composições de rfurina) aumenta a estabilidade da composição a estresse mecânico. Por exemplo, como mostrado nas figuras 31 a 42, a inclusão de tão pouco quanto 10 ppm de surfactante não iônico pode aumentar a estabilidade de uma composição de furina submetida a estresse mecânico por pelo menos 25%. E a inclusão de 50 ppm de surfactante não iônico pode aumentar a estabilidade de uma composição de furina submetida a estresse mecânico por pelo menos 40%. Nesse sentido, em um aspecto da presente divulgação, uma composição de furina estável em armazenamento (por exemplo, de rfurina) contém uma quantidade estabilizadora de surfactante não iônico.

[000187] Em uma modalidade, composições de furina estáveis em armazenamento (por exemplo, de rfurina) são fornecidas que contêm um surfactante não iônico, selecionado a partir de um monoglicerídeo solúvel em água não iônico, um diglicerídeo solúvel em água não iônico, um triglicerídeo solúvel em água não iônico, ésteres de ácido monograxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, ésteres de ácido digraxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico, um glicerídeo poliglicolizado não iônico, um copolímero de tribloco solúvel em água não iônico, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

[000188] Em uma modalidade, o surfactante não iônico está presente em uma concentração de 10 a 200 ppm, 10 a 175 ppm, 10 a 150 ppm, 10 a 125 ppm, 10 a 100 ppm, 10 a 90 ppm, 10 a 80 ppm, 10 a 75 ppm, 10 a 70 ppm, 10 a 60 ppm, 10 a 50 ppm, 10 a 25 ppm, 25 a 200 ppm, 25 a 175 ppm, 25 a 150 ppm, 25 a 125 ppm, 25 a 100 ppm, 25 a 90 ppm, 25 a 80 ppm, 25 a 70 ppm, 25 a 60 ppm, 25 a 50 ppm, 50 a 200 ppm, 50 a 175 ppm, 50 a 150 ppm, 50 a 125 ppm, 50 a 90 ppm, 50 a 80 ppm, 75 a 200 ppm, 75 a 175 ppm, 75 a 150 ppm, 100 a 200 ppm, 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm, ou 200 ppm. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

[000189] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000190] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000191] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar; de 10 ppm a 200 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000192] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionados a partir de variações 1 a 6035 encontradas na Tabela 1 a Tabela 9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico e o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir de trealose, sacarose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000193] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende: de 50 mM a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 5 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico selecionado a partir das variações 1 a 6035 encontradas na Erro! Fonte de referência não encontrada. à Tabela9, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000194] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 mM a 200 mM de agente tamponador, e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000195] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000196] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 200 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000197] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9 de 10 mM a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em ainda outra modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água e o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000198] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9 de 10 mM a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000199] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; 75±25% de surfactante não iônico, 90±25 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de surfactante não iônico.

[000200] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, 90±25 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de surfactante não iônico.

[000201] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água, 90±25 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água.

[000202] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9, 90±25 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em ainda outra modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água e o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000203] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9, 90±25 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000204] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,9 mM de cálcio; 75±25% de surfactante não iônico, 91 mM de agente tamponador e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é Polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de surfactante não iônico.

[000205] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, de rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,9 mM de cálcio; 10% de açúcar ou álcool de açúcar; 75 ±25 ppm de surfactante não iônico, 91 mM de agente tamponador, e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o pH da composição é de 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de surfactante não iônico. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de surfactante não iônico.

[000206] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo,rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,9 mM de cálcio; 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água, 91 mM de agente tamponador e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, o pH da composição é de 6,0. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±15 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, a composição contém 75±5 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, a composição contém 75 ppm de éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água.

[000207] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,9 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e surfactante não iônico selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9, 91 mM de agente tamponador e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em outra modalidade específica, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em ainda outra modalidade específica, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água e o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pH da composição é de 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000208] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,9 mM de cálcio; uma combinação de açúcar ou álcool de açúcar e éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água selecionado a partir de varações de 1 a 6035 encontrados na Erro! Fonte de referência não encontrada. até a Tabela9, 91 mM de agente tamponador e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em outra modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em outra modalidade específica, o éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o pH da composição é de 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000209] As composições de furina (por exemplo, rfurina) da presente invenção também incluem, de preferência, um surfactante, de preferência um surfactante não iônico, e, de preferência, em uma quantidade de 0,1 ppm a 150 ppm, ou de 65 ppm a 80 ppm, ou cerca de 75 ppm. Em outras modalidades, as composições de furina (por exemplo, rfurina) incluem um surfactante em uma quantidade de 0,5 ppm a 140 ppm, 1,0 ppm a 130 ppm, 10 ppm a 120 ppm, 20 ppm a 110 ppm, 30 ppm a 100 ppm, 40 ppm a 95 ppm, 50 ppm a 90 ppm, 55 ppm a 85 ppm, 60 ppm a 80 ppm, ou ppm 70 a 75 ppm. Em determinadas modalidades, o surfactante é escolhido a partir do grupo consistindo de polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80, polióis Puronic, glicerol, glucamidas (comoMega 8), Tritons e Brij 35 (polioxietileno 23 lauril éter). Diversas classes de polióis pluronic (vendidos sob o nome comercial Pluronic, fabricado pela BASF Wyandotte Corporation) estão disponíveis. Estes polióis, de massa molecular (de 1.000 a mais de 16.000) e propriedades físico-químicas diversificadas têm sido usados como surfactantes. Pluronic F-38, de massa molecular de 5.000 e Pluronic F- 68, massa molecular 9.000, ambos contêm (por massa), 80 por cento de grupos polioxietileno hidrofílicos e 20 por cento de grupos polioxipropileno hidrofóbicos. Em uma modalidade, o surfactante é Polissorbato 80. Em uma determinada modalidade, o Polissorbato 80 é Polissorbato 80 derivado de vegetal. Sais Farmaceuticamente Aceitáveis

[000210] As composições estabilizadas de furina (por exemplo, rfurina) fornecidas neste documento geralmente incluem um sal farmaceuticamente aceitável em uma concentração tolerada pelo polipeptídeo de furina durante o armazenamento. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de cloreto. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de cloreto monovalente. Em uma modalidade mais específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes.

[000211] Em uma modalidade, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável em uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) aqui apresentada é de 10 mM a 500 mM. Em outra modalidade, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável é de 100 mM a 300 mM. Em outra modalidade, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável é de 150 mM a 250 mM. Em ainda outras modalidades, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável nas composições estabilizadas de furina (por exemplo, rfurina) aqui apresentada é selecionada de variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10. Tabela 10.Concentrações exemplares de sal farmaceuticamente aceitável úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, rfurina).

Var. = Variação

[000212] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000213] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000214] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000215] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000216] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontrados na Tabela 10, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade, a concentração do agente tamponador é 90±25 mM. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000217] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende um sal farmaceuticamente aceitável a uma concentração selecionada a partir das variações de 6036 a 6180 encontrados na Tabela 10, de 0,9 mM de cálcio, 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75 ppm de surfactante não iônico, de 91 mM de agente tamponador e um pH de 6,0±0,2. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000218] Em algumas modalidades, sais de cloreto monovalente, tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio, são usados em formulações da presente divulgação. Embora o componente da formulação compreendendo sais de cloreto monovalente seja descrito principalmente em termos de cloreto de sódio, será apreciado que qualquer sal de cloreto monovalente, incluindo cloreto de potássio, pode ser utilizado em conformidade com as descrições neste documento para cloreto de sódio. Em determinadas modalidades, cloreto de sódio está incluído nas formulações presentes em uma quantidade de 50 a 500 mM. Em outras modalidades, o cloreto de sódio está incluído nas formulações em uma quantidade de 100 a 300 mM, de 150 a 250 mM, ou cerca de 190 mM. Em outras modalidades, o cloreto de sódio está incluído nas formulações presentes em uma quantidade de 100 a 300 mM, 110 a 280 mM, 120 a 260 mM, 130 a 240 mM, 140 a 220 mM, 150 a 200 mM ou 160 a 180 mM. Em uma modalidade específica, a formulação inclui 190 mM de cloreto de sódio em combinação com um ou mais dos outros componentes de formulação divulgados neste documento. Agentes Tamponadores

[000219] Vantajosamente, foi constatado que composições de furina (por exemplo, rfurina) são estabilizadas em pH 6,0 a 7,0. Por exemplo, é mostrado nas Figuras 11 e 12 que composições de furina formuladas em pH 5,5 são estabilizadas em comparação com composições de furina formuladas em pH 5,0. É também mostrado que composições de furina formuladas em pH 6,0 são mais estabilizadas em comparação com composições de furina formuladas em pH 5,5. Além disso, conforme mostrado na Figura 17, composições de furina (por exemplo, rfurina) formuladas em pH 7,0 têm estabilidade semelhante às composições formuladas em pH 6,0.

[000220] Nesse sentido, em determinadas modalidades, as composições de furina estabilizadas (por exemplo, rfurina) fornecidas neste documento são formuladas em um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade específica, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) é formulada com um pH de 6,0 a 7,0. Em outra modalidade específica, uma composição de furina estabilizada é formulada com um pH de 6,0±2,0. Em uma modalidade mais específica, uma composição de furina estabilizada é formulada com um pH 6,0. Em ainda outras modalidades, uma composição de furina estabilizada é formulada com pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Tabela11. Faixas de pH exemplares úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, rfurina).

Var. = Variação

[000221] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000222] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH selecionado a partir das variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000223] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000224] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000225] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000226] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 300 mM de um sal farmaceuticamente, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, de 10 a 200 mM de agente tamponador e um pH aceitável a partir das variações de 6181 a 6403 encontrados na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000227] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, de 90±25 mM de agente tamponador e um pH aceitável a partir das variações de 6181 a 6403 encontrados na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000228] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 191 mM de um sal farmaceuticamente, 0,9 mM de cálcio, 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75 ppm de surfactante não iônico, 91 mM de agente tamponador e um pH aceitável a partir das variações de 6181 a 6403 encontrados na Tabela11. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000229] Em uma modalidade, as composições de furina estabilizadas (por exemplo, rfurina) fornecidas neste documento são formuladas com um pH apropriado usando um ou mais agentes tamponadores. Em uma modalidade, a um ou mais agentes tamponadores são selecionados de histidina, imidazol, fosfato, citrato, Tris, acetato (por exemplo, ácido acético), BIS-Tris propano, PIPES, MOPS, HEPES, MES, ACES e uma combinação dos mesmos. Em uma determinada modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES.

[000230] O agente tamponador está presente nas composições de furina estabilizadas (por exemplo, rfurina) em uma concentração adequada para manter o pH da composição durante o armazenamento por um período de tempo (por exemplo, semanas, meses ou anos). Em uma modalidade, a concentração do agente tamponador na formulação é de 10 mM a 300 mM. Em outra modalidade, a concentração do agente tamponador na formulação está entre 10 mM e 200 mM. Em uma modalidade específica, a concentração do agente tamponador na formulação é 90±25 mM. Em ainda outras modalidades, a concentração de um agente tamponador na composição é selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas no Tabela12. Tabela12.Concentrações exemplares de agente tamponador (mM) úteis para a estabilização das composições de furina (por exemplo, rfurina).

Var. = Variação

[000231] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas na Tabela12 e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000232] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas na Tabela12 e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, a composição de furina estável em armazenamento compreende ainda de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico. Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000233] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 200 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas na Tabela12e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000234] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 500 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 5 mM de cálcio, de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas na Tabela12e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000235] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, de 2% a 10% de açúcar ou álcool de açúcar, de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas na Tabela12e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000236] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende de 50 a 300 mM de um sal farmaceuticamente, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir das variações de 6404 a 6469 encontrados na Tabela12 e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000237] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 190±50 mM de um sal farmaceuticamente, de 0,5 mM a 2 mM de cálcio, 10±5% de açúcar ou álcool de açúcar, 75±25 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir das variações de 6404 a 6469 encontrados na Tabela12 e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000238] Em uma modalidade, uma composição de furina estabilizada (por exemplo, rfurina) compreende 191 mM de um sal farmaceuticamente, de 0,9 mM de cálcio, 10% de açúcar ou álcool de açúcar, 75 ppm de surfactante não iônico, agente tamponador em uma concentração selecionada a partir das variações de 6404 a 6469 encontrados na Tabela12 e um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônico solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana). Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana) e o açúcar ou o álcool de açúcar é trealose. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES. Em uma modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH da composição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH da composição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH da composição é 6,0. Em uma modalidade específica, a composição contém de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina.

[000239] Tampões também podem estar presentes nas formulações da invenção em combinação com um ou mais de qualquer outro componente da formulação aqui descrito. Como mostrado nos Exemplos, as formulações altamente estabilizadas da presente invenção mostram maior estabilidade em pH 6,0. Em determinadas modalidades, o pH das formulações altamente estabilizadas deve, de preferência, ser mantido na faixa de 6,0 a 8,0, ou com um pH de cerca de 6,0. O agente tamponador pode ser qualquer entidade química fisiologicamente aceitável ou combinação de entidades químicas que possuem a capacidade de agir como tampões, incluindo, entre outros: histidina, imidazol, fosfato, citrato, Tris, Acetato, BIS-Tris propano, PIPES, MOPS, HEPES, MES e ACES. As denominações químicas completas de muitos destes agentes tamponadores são listadas na Tabela 1 abaixo. Em determinadas modalidades, se o cálcio estiver presente na formulação em uma concentração acima de 5 mM, o fosfato não é usado como um agente tamponador. Em algumas modalidades, o agente tamponador é incluído em uma concentração de 10 mM a 200 mM, ou de 10 a 100 mM, ou de 30 a 60 mM ou cerca de 46 mM. Em outras modalidades, um agente tamponador individual está incluído em uma concentração de 15 a 95 mM, de 20 a 90 mM, de 25 a 85 mM, de 30 a 80 mM, de 35 a 75 mM, de 40 a 70 mM, de 45 a 65 mM ou de 50 a 60 mM. Em determinadas modalidades, a formulação contém dois agentes tamponadores. Tabela13.Agentes Tamponadores Exemplares

[000240] Em certos aspectos, as presentes formulações incluem um ácido carboxílico em combinação com um ou mais dos componentes da formulação aqui descritos. Em aspectos adicionais, o ácido carboxílico é preferencialmente ácido acético (por exemplo, acetato). Em determinadas modalidades, a formulação inclui 20 mm a 100 mM de ácido acético, ou de 30 mm a 50 mM, ou aproximadamente 45 milímetros de ácido acético ou qualquer outro ácido carboxílico. Em outras modalidades, a formulação inclui de 25 mM a 90 mM, de 30 mM a 80 mM, de 35 mM a 70 mM, de 40 mM a 60 mM, ou de 45 mM, 50 mM em ácido acético ou qualquer outro ácido carboxílico.

D. Componentes Adicionais da Formulação

[000241] As formulações altamente estabilizadas da presente divulgação incluem furina, por exemplo, rfurina e um ou mais de agentes estabilizantes, agentes tamponador, cloreto de sódio, sais e outros excipientes. Tais componentes são descritos em mais detalhes abaixo. Como será apreciado, qualquer um dos componentes da formulação aqui descritos pode ser usado isoladamente ou em qualquer combinação.

[000242] As formulações Furina altamente estabilizadas da presente divulgação mostram aumento da estabilidade para cisalhamento (agitação), liofilização e estresse de congelamento/descongelamento, bem como resistência à perda ou desnaturação do produto em superfícies de contêiner em comparação com o controle ou formulações iniciais.

[000243] A Furina está incluída nas formulações da presente divulgação em concentrações de 5.000 a 500.000 U/mL. Em determinadas modalidades, a furina está incluída em concentrações de 5.500 a 55.000, de 6.000 a 50.000, de 6.500 a 45.000, de 7.000 a 40.000, de 7.500 a 35.000, de 8.000 a 30.000, de 8.500 a 25.000, de 9.000 a 20.000, de 9.500 a 15.000 e cerca de 10.000 U/mL. Em ainda outras modalidades, a furina está incluída nas formulações da presente divulgação em uma concentração selecionada a partir de variações de 6470 a 6533 encontradas na Tabela14 relatadas em milhares de Unidades de atividade de furina por mL. Em modalidades específicas, a furina contida nas formulações altamente estabilizadas da presente divulgação é rfurina. Tabela14.Concentrações de furina exemplares (por exemplo, rfurina) (expressadas em milhares de Unidades de atividade de furina por mL) utilizadas nas composições estabilizadas aqui apresentadas.

Var. = Variação

[000244] Em outra modalidade, a concentração de furina (por exemplo, rfurina) de uma composição estabilizada aqui apresentada pode ser expressa como a massa de furina presente na composição. Em uma modalidade, furina (por exemplo, rfurina) está presente em uma composição estabilizada como descrita no presente documento em uma concentração de 100 ng/mL a 100 mg/mL. Em uma modalidade, furina (por exemplo, rfurina) está presente em uma composição estabilizada conforme descrito no presente documento em uma concentração de 1 μg/mL a 10 mg/mL. Em outra modalidade, furina (por exemplo, rfurina) está presente em uma composição estabilizada conforme descrito no presente documento em uma concentração de 1 μg/mL a 1 mg/mL. Em ainda outras modalidades, furina (por exemplo, rfurina) está presente em uma composição estabilizada conforme descrito no presente documento em uma concentração selecionada a partir de variações de 6534 a 6638 encontradas na Tabela15. Em modalidades específicas, a furina contida nas formulações altamente estabilizadas da presente divulgação é rfurina. Tabela15. Concentrações de furina exemplares (por exemplo, rfurina) utilizadas nas composições estabilizadas aqui apresentadas.

Var. = Variação

[000245] Em alguns aspectos da presente divulgação, formulações furina (por exemplo, rfurina) incluem cálcio ou outros cátions metálicos divalente. Em aspectos adicionais, o cátion divalente está presente como um sal, de preferência um sal de cloreto. Em determinadas modalidades, de 0,1 mM a 10 mM de um sal de cátion divalente pode ser usado, ou de 0,5 mM a 2 mM, ou cerca de 0,92 mM. Em modalidades adicionais, de 0,5 mm a 9 mM, de 1 mM a 8 mM, de 1,5 mM a 7 mM, de 2 mM a 6 mM, de 2,5 mM a 5 mM, ou de 3mM a 4,5 mM de sal de cátion divalente é usado em formulações da invenção. Quando sal de cálcio é usado, é de preferência o cloreto de cálcio, mas também podem ser outros sais de cálcio. tais como gluconato de cálcio, glubionato de cálcio ou gluceptato de cálcio. Cátions divalentes, incluindo cálcio, podem ser incluídos em combinação com uma ou mais outros componentes da formulação divulgados neste documento. Exemplos não restritivos de cátions metálicos divalentes úteis nas formulações aqui fornecidas incluem cálcio, bário, manganês, magnésio, cobalto, cobre, níquel e zinco.

[000246] Em algumas modalidades, as formulações de furina (por exemplo, rfurina) incluem um antioxidante. Constatou-se que a adição de antioxidantes em formulações aquosas e liofilizadas melhora a estabilidade destas formulações e, assim, estende sua durabilidade. Os antioxidantes usados devem ser compatíveis para uso com uma preparação farmacêutica e, além disso, são preferencialmente solúveis em água. Ao adicionar antioxidantes em uma formulação, é preferível adicionar tais antioxidantes o mais tarde no processo antes da liofilização quanto possível, a fim de evitar a oxidação espontânea do antioxidante. A Tabela 2 abaixo lista antioxidantes adequados, que estão disponíveis comercialmente através de empresas como Calbiochem e Sigma. Tabela16.Antioxidantes Exemplares

[000247] Concentrações na faixa de cerca de 0,05 mg/ml a mais de 1,0 mg/ml de antioxidantes podem ser usadas, e acredita-se que concentrações mais elevadas também seriam úteis (até o ponto de efeitos tóxicos ou efeitos adversos de fabricação, tais como a depressão da temperatura de transição vítrea do produto liofilizado). Nesse sentido, em uma modalidade, a composição de furina (por exemplo, rfurina) compreende de 0,05 mg/mL a 1,0 mg/mL de antioxidante. Em outras modalidades, a composição de furina (por exemplo, rfurina) compreende de 0,05 a 0,5 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,9 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,8 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,7 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,6 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,4 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,3 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,2 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,9 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,8 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,7 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,6 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,4 mg/mL, de 0,2 mg/mL a 0,3 mg/mL, de 0,3 mg/mL a 0,7 mg/mL, de 0,4 mg/mL a 0,6 mg/mL de antioxidante.

E.Desenvolvimento de Formulações

[000248] Em certos aspectos da presente divulgação, formulações altamente estabilizadas de furina (por exemplo, rfurina) são preparadas, fornecendo uma formulação inicial de furina (controle) e adicionando componentes para atingir um nível desejado de concentrações de componente. Por exemplo, a adição de uma parte de 750 ppm de surfactante não iônico para 9 partes de composição de furina sem surfactante não iônico para fornecer uma formulação final composta por 75 ppm de surfactante não iônico. Este processo é também chamado dopagem (“spiking”) para uma formulação inicial.

[000249] Em determinadas modalidades, para produzir as formulações de furina altamente estabilizadas (por exemplo, rfurina) da presente divulgação, a furina está contida em uma formulação inicial e uma composição de tampão é dopada na formulação inicial. Em outras modalidades, a formulação de furina altamente estabilizada (por exemplo, rfurina) é formada usando diálise de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidade, os métodos de formulação envolvem a dopagem de uma composição de tampão concentrada em uma formulação inicial de furina. Em uma modalidade, polissorbato 80 é adicionado à formulação inicial antes da adição de outros componentes, particularmente antes da adição de trealose, a fim de proteger a Furina contra agitação durante a mistura.

[000250] Em uma modalidade exemplar, fármaco a granel (BDS) de furina (por exemplo, rfurina) está contido em uma formulação inicial de 10 mM de acetato de sódio, 230 mM de cloreto de sódio, 1 mM de cloreto de cálcio, pH 6,0. Em uma modalidade, os seguintes componentes são dopados na formulação inicial: 1% de polissorbato 80, 500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de CaCl2, pH 6,0 e pó de trealose dihidratada para atingir a seguinte composição: 46 mM de HEPES, 45 mM de ácido acético, 190 mM de NaCl, 0,92 mM de CaCl2, 75 ppm de polissorbato 80, 10% m/m de trealose dihidrato, pH 6.0. O aumento do ácido acético e a adição de HEPES resulta em maior estabilidade do pH. Embora em pH 6,0 ambos ácido acético e HEPES estejam fora de sua mais alta capacidade tamponante, a alta concentração destes produtos químicos aumenta consideravelmente a capacidade tamponante da formulação altamente estabilizada. Em determinadas modalidades, o polissorbato 80 é adicionado à formulação inicial antes de outros componentes para proteger a furina contra agregação e adsorção a superfícies do recipiente durante a mistura quando os outros reagentes forem adicionados. Em determinadas modalidades, a furina na formulação inicial é misturada com polissorbato 80 e/ou quaisquer outros componentes, exceto trealose. Trealose e todos e quaisquer componentes restantes são adicionados depois de polissorbato 80 ser adicionado para proteger furina contra agregação e adsorção durante a mistura.

[000251] Em determinadas modalidades, a formulação estabilizada é combinada com um diluente para que a formulação possa ser usada em métodos, tais como um processo de maturação de rVWF. Em outras modalidades, um diluente estabilizado é preparado pela dopagem de um diluente inicial (50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, pH 7,0) com polissorbato 80 a 75 ppm. A combinação da formulação de furina altamente estabilizada (por exemplo, rfurina), da presente divulgação com este diluente estabilizado aumenta a recuperação de furina na etapa de maturação de rVWF em três a quatro vezes em comparação com o uso de formulações iniciais de furina e de diluente.

[000252] Em determinadas modalidades, as formulações de furina altamente estabilizadas da presente divulgação são liofilizadas. Durante a liofilização, a formulação é convertida de uma fase aquosa para uma fase sólida amorfa, o que se consideraproteger a proteína contra instabilidade química e/ou conformacional. Em modalidades adicionais, a preparação liofilizada não só contém uma fase amorfa, como também inclui um componente que se cristaliza durante a liofilização.

[000253] Um ou mais componentes de formulações altamente estabilizadas em algumas modalidades podem ser dispersos na fase amorfa do bolo liofilizado. Além disso, a temperatura de transição vítrea (Tg') aparente da fase amorfa é, de preferência, relativamente elevada durante a liofilização, e a temperatura de transição vítrea (Tg) do sólido é, igualmente de preferência, alta durante o armazenamento. IV.Métodos de Diluição de Composições Aquosas de Furina Recombinante

[000254] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para diluir as composições aquosas de furina (por exemplo, rfurina). As modalidades seguintes se baseiam em parte na descoberta que essa inclusão de surfactante não iônico em um tampão usado para diluir furina (por exemplo, rfurina) resultado na recuperação de 3-4 vezes mais atividade de furina em comparação com a diluição com um tampão que sem o surfactante não iônico.

[000255] Em uma modalidade, o método inclui a adição de um tampão de diluição contendo surfactante não iônico em uma composição furina (por exemplo, rfurina), para formar uma composição de furina diluída (por exemplo, rfurina). Em algumas modalidades, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 1,000:1 (composição de furina: tampão de diluição). Em outra modalidade, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 500:1 (composição de furina: tampão de diluição). Em outra modalidade, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 250:1 (composição de furina: tampão de diluição). Em outra modalidade, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 200:1 (composição de furina: tampão de diluição). Em outra modalidade, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 100:1 (composição de furina: tampão de diluição). Em outra modalidade, o tampão de diluição é adicionado a uma proporção de 1:1 (composição de furina: tampão de diluição) a 50:1 (composição de furina: tampão de diluição).

[000256] Em uma modalidade, o método compreende uma primeira etapa de adição de surfactante não iônico em uma composição de furina (por exemplo, rfurina) e uma segunda etapa de adição de um tampão de diluição na composição de furina (por exemplo, rfurina) contendo surfactante não iônico, para formar uma composição de furina diluída. Em uma modalidade, o surfactante será adicionado à composição de furina em uma concentração final de X-vezes uma concentração desejada na composição de furina diluída, onde X é o fator de diluição. Por exemplo, se uma concentração final de 10 ppm de surfactante não iônico é desejada em uma composição de furina a ser diluída 100 vezes, o surfactante não iônico é adicionado à composição de furina inicial em uma concentração final de 1.000 ppm (10 ppm x diluição 100 vezes), e a composição é posteriormente diluída por adição de 99 partes de tampão de diluição por 1 parte de solução inicial (correspondendo ao volume adicionado durante a adição de surfactante não iônico).

[000257] Em determinadas modalidades, a composição de furina (por exemplo, rfurina) é diluída de 1 vez a 1.000 vezes, de 1 vez a 500 vezes, de 1 vez a 250 vezes, de 1 vez a 200 vezes, de 1 vez a 100 vezes, de 1 vez a 50 vezes, de 1 vez a 10 vezes, de 10 vezes a 1.000 vezes, de 10 vezes a 500 vezes, de 10 vezes a 250 vezes, de 10 vezes a 200 vezes, de 10 vezes a 100 vezes, de 10 vezes a 50 vezes, de 50 vezes a 1.000 vezes, de 50 vezes a 500 vezes, de 50 vezes a 250 vezes, de 50 vezes a 200 vezes, de 50 vezes a 100 vezes, de 100 vezes a 1.000 vezes, de 100 vezes a 500 vezes, de 100 vezes a 250 vezes, de 100 vezes a 200 vezes, de 200 vezes a 1.000 vezes, de 200 vezes a 500 vezes, ou de 200 vezes a 250 vezes.

A.Tampão de Diluição de Furina

[000258] Em uma modalidade, o tampão de diluição de furina incluirá um sal farmaceuticamente aceitável, surfactante não iônico e um agente tamponador. Em uma modalidade, o tampão de diluição inclui ainda cálcio. Em outra modalidade, o tampão de diluição inclui ainda um açúcar e/ou álcool de açúcar.

[000259] Em uma modalidade, um sal farmaceuticamente aceitável está presente no tampão de diluição em uma concentração de 10 mM a 500 mM. Em outra modalidade, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável é de 100 mM a 300 mM. Em outra modalidade, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável é de 150 mM a 250 mM. Em ainda outras modalidades, a concentração de sal farmaceuticamente aceitável no tampão de diluição de furina é selecionada de variações de 6036 a 6180 encontradas na Tabela 10 Em uma modalidade, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é um cloreto de sódio. Em outra modalidade específica, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de potássio.

[000260] Em uma modalidade, o tampão de diluição tem um pH de 5,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH do tampão de diluição é de 5,5 a 7,0. Em outra modalidade, o pH do tampão de diluição é de 5,5 a 6,5. Em outra modalidade, o pH do tampão de diluição é 6,0±0,2. Em uma modalidade específica, o pH do tampão de diluição é 6,0. Em outras modalidades, o tampão de diluição tem um pH selecionado a partir de variações de 6181 a 6403 encontradas na Tabela11.

[000261] Em uma modalidade, o agente tamponador está presente no tampão de diluição em uma concentração de 10 mM a 300 mM. Em outra modalidade, a concentração do agente tamponador no tampão de diluição está entre 10 mM e 200 mM. Em outras modalidades, a concentração do agente tamponador no tampão de diluição é selecionada a partir de variações de 6404 a 6469 encontradas no Tabela12. Em uma modalidade, o agente tamponador é acetato, HEPES ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o agente tamponador é uma combinação de acetato e HEPES.

[000262] Em algumas modalidades, o tampão de diluição de furina inclui cálcio ou outro cátion metálico divalente. Em uma modalidade, o cátion divalente é adicionado como um sal, de preferência um sal de cloreto. Em determinadas modalidades, a concentração de cátions divalentes (por exemplo, de cálcio) no tampão de diluição é de 0,1 mM a 10 mM, de 0,5 mM a 2 mM ou cerca de 0,92 mM. Em modalidades adicionais, de 0,5 mm a 9 mM, de 1 mM a 8 mM, de 1,5 mM a 7 mM, de 2 mM a 6 mM, de 2,5 mM a 5 mM, ou de 3mM a 4,5 mM de sal de cátion divalente é usado no tampão de diluição. Quando sal de cálcio é usado, é de preferência o cloreto de cálcio, mas também podem ser outros sais de cálcio. tais como gluconato de cálcio, glubionato de cálcio ou gluceptato de cálcio. Cátions divalentes, incluindo cálcio, podem ser incluídos em combinação com uma ou mais outros componentes da formulação divulgados neste documento. Exemplos não restritivos de cátions metálicos divalentes úteis nos tampões de diluição aqui fornecidos incluem cálcio, bário, manganês, magnésio, cobalto, cobre, níquel e zinco.

[000263] Em algumas modalidade, o tampão de diluição de furina inclui ainda um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o tampão de diluição contém um açúcar monossacarídeo. Em uma determinada modalidade, o açúcar monossacarídeo é selecionado a partir do grupo constituído por um açúcar diose, um açúcar triose, um açúcar tetrose, um açúcar pentose, um açúcar hexose, um açúcar heptose e um açúcar octose. Em uma determinada modalidade, o açúcar é um açúcar pentose, um açúcar hexose ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o açúcar é um açúcar hexose.

[000264] Em outra modalidade, o tampão de diluição contém um açúcar dissacarídeo. Em uma determinada modalidade, o açúcar dissacarídeo é selecionado de açúcares dissacarídeos formados a partir de monossacarídeos pentose e/ou hexose. Em outra determinada modalidade, o açúcar é selecionado de açúcares dissacarídeos formados a partir de monossacarídeos hexose. Em uma modalidade, o açúcar é sacarose, trealose ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar é sacarose. Em outra modalidade específica, o açúcar é trealose. Em uma modalidade, o açúcar é formulado como dihidrato de trealose.

[000265] Em outra modalidade, o tampão de diluição contém um álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, o álcool de açúcar é selecionado a partir de glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomalte, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em outra modalidade específica, o álcool de açúcar é manitol.

[000266] Em ainda outra modalidade, o tampão de diluição contém uma mistura de açúcar e álcool de açúcar. Em uma modalidade, a mistura contém pelo menos dois de um monossacarídeo, um dissacarídeo e um álcool de açúcar. Em outra modalidade, a mistura contém pelo menos dois de um açúcar pentose, um açúcar hexose, um dissacarídeo formado a partir de monossacarídeos pentose e/ou hexose e um álcool de açúcar. Em outra modalidade, a mistura contém pelo menos dois de sacarose, trealose e manitol.

[000267] Em uma modalidade, o açúcar ou álcool de açúcar está presente no tampão de diluição em uma concentração de 2% a 20%, 2% a 17,5%, 2% a 15%, 2% a 12,5%, 2% a 10%, 2% a 9%, 2% a 8%, 2% a 7%, 5% a 20%, 5% a 17,5%, 5% a 15%, 5% a 12,5%, 5% a 10%, 7,5% a 20%, 7,5% a 17,5%, 7,5% a 15%, 7,5% a 12,5%, 10% a 20%, 10% a 17,5%, 10% a 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5±1%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%. Em uma modalidade, o açúcar ou o álcool de açúcar é selecionado a partir de sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o açúcar ou álcool de açúcar é trealose.

[000268] Em uma modalidade, composições estáveis em armazenamento de furina (por exemplo, rfurina) são fornecidas que contêm um surfactante não iônico, selecionado a partir de um monoglicerídeo solúvel em água não iônico, um diglicerídeo solúvel em água não iônico, um triglicerídeo solúvel em água não iônico, ésteres de ácido monograxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, ésteres de ácido digraxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico, um glicerídeo poliglicolizado não iônico, um copolímero de tribloco solúvel em água não iônico, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

1. SURFACTANTES NÃO IÔNICOS

[000269] Em uma modalidade, o tampão de diluição de furina, ou solução de surfactante não iônico composições adicionada antes da diluição, contém um surfactante não iônico selecionado a partir de um monoglicerídeo solúvel em água não iônico, um diglicerídeo solúvel em água não iônico, um triglicerídeo solúvel em água não iônico, ésteres de ácido monograxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, ésteres de ácido digraxo solúveis em água não iônicos de polietileno glicol, um éster de ácido graxo de sorbitana solúvel em água não iônico, um glicerídeo poliglicolizado não iônico, um copolímero de tribloco solúvel em água não iônico, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

[000270] Em uma modalidade, o surfactante não iônico está presente no tampão de diluição em uma concentração de 10 a 200 ppm, 10 a 175 ppm, 10 a 150 ppm, 10 a 125 ppm, 10 a 100 ppm, 10 a 90 ppm, 10 a 80 ppm, 10 a 75 ppm, 10 a 70 ppm, 10 a 60 ppm, 10 a 50 ppm, 10 a 25 ppm, 25 a 200 ppm, 25 a 175 ppm, 25 a 150 ppm, 25 a 125 ppm, 25 a 100 ppm, 25 a 90 ppm, 25 a 80 ppm, 25 a 70 ppm, 25 a 60 ppm, 25 a 50 ppm, 50 a 200 ppm, 50 a 175 ppm, 50 a 150 ppm, 50 a 125 ppm, 50 a 90 ppm, 50 a 80 ppm, 75 a 200 ppm, 75 a 175 ppm, 75 a 150 ppm, 100 a 200 ppm, 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm, ou 200 ppm. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

[000271] Em uma modalidade, a concentração alvo de surfactante não iônico está presente no tampão de diluição em uma concentração de 10 a 200 ppm, 10 a 175 ppm, 10 a 150 ppm, 10 a 125 ppm, 10 a 100 ppm, 10 a 90 ppm, 10 a 80 ppm, 10 a 75 ppm, 10 a 70 ppm, 10 a 60 ppm, 10 a 50 ppm, 10 a 25 ppm, 25 a 200 ppm, 25 a 175 ppm, 25 a 150 ppm, 25 a 125 ppm, 25 a 100 ppm, 25 a 90 ppm, 25 a 80 ppm, 25 a 70 ppm, 25 a 60 ppm, 25 a 50 ppm, 50 a 200 ppm, 50 a 175 ppm, 50 a 150 ppm, 50 a 125 ppm, 50 a 90 ppm, 50 a 80 ppm, 75 a 200 ppm, 75 a 175 ppm, 75 a 150 ppm, 100 a 200 ppm, 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm, ou 200 ppm. Em uma modalidade, o surfactante não iônico é um éster de ácido graxo de sorbitana não iônica solúvel em água. Em uma modalidade específica, o surfactante não iônico é polissorbato 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana).

[000272] Em uma modalidade, a inclusão de um surfactante não iônico em um tampão de diluição de furina, ou adição antes da diluição, aumenta a atividade de furina recuperada em uma composição de furina diluída por pelo menos 10% em comparação com a atividade recuperada em uma composição de furina diluída sem uso do surfactante não iônico, ou com o uso do surfactante não iônico em uma concentração mais baixa. Em outras modalidades, a atividade de furina recuperada após diluição usando um surfactante não iônico é de pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou mais superior à atividade de furina recuperada após diluição sem surfactante não iônico ou usando uma menor concentração de surfactante não iônico.

V.Ensaios de Estabilidade

[000273] Como discutido neste documento, as formulações de furina altamente estabilizadas (por exemplo, rfurina) da presente divulgação apresentam uma estabilidade melhorada em comparação com as formulações de controle. Em uma modalidade, estabilidade melhorada inclui a retenção de um percentual maior de atividade do que formulações de controle em vários ensaios de estabilidade. Tais ensaios podem ser usados para determinar se uma fórmula é uma formulação altamente estabilizada. Em algumas modalidades, a formulação altamente estabilizada tem pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de atividade do que uma formulação de controle quando avaliada por qualquer um dos ensaios de estabilidade discutidos neste documento ou conhecidos na técnica.

[000274] Em mais aspectos, formulações de furina (por exemplo, rfurina) são testadas sob condições de estressores, tais como armazenamento em alta temperatura, agitação, ciclos de congelamento/descongelamento ou alguma combinação destes. Após tais estressores, as formulações são testadas usando qualquer um dos métodos descritos neste documento ou conhecidos na técnica para determinar a estabilidade nestas condições.

[000275] Em um aspecto, ensaios de atividade furina são utilizados para avaliar a estabilidade de uma formulação. Em algumas modalidades, ensaios atividade furina envolvem uma medição de clivagem de substrato. Em uma modalidade, o substrato é Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; AMC = 7-amino-4-metoxi cumarina), que é clivada pela furina, liberando 7-amino-4-metoxi cumarina. O ensaio é realizado, por exemplo, em uma placa de ELISA. A atividade de furina em uma amostra é determinada a partir de uma curva padrão criada, por exemplo, a partir de um padrão de furina para controle de qualidade (QC). Os valores das atividades geralmente são calculados como valores médios de duas diluições, cada um em duplicado.

[000276] Em outro aspecto, cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é usada para avaliar a estabilidade de uma formulação furina (por exemplo, rfurina). Em tais ensaios, a estabilidade é indicada pela altura do pico correspondente à furina monomérica. Uma redução na altura do pico de monômero significa que o produto está sendo perdido (instável) e a geração de picos mais elevados de massa molecular indica que está ocorrendo agregação e picos mais baixos de massa molecular indicam que o produto está em degradação. Em uma modalidade exemplar, após 4 dias a 37°C, o pico relativo de uma formulação de furina controle foi de 58,5%, mas em uma formulação altamente estabilizada, o pico relativo foi 74,8% (FIG. 48). Assim, a formulação altamente estabilizada manteve a estabilidade da furina na composição e manteve uma porcentagem maior da altura do pico em comparação com a constatada antes do armazenamento de quatro dias a uma temperatura mais elevada (37°C).

[000277] Em outro aspecto, ensaios qualitativos, tais como análises de Western blot, são usados para avaliar a estabilidade de uma formulação de Furina. Por exemplo, a Figura 26 mostra que depois de 5 dias a 35°C, um percentual maior do sinal está presente como a molécula intacta de furina ao invés da espécie degradada na formulação estabilizada (rota 11), em comparação com uma formulação não estabilizada (rota 5).

[000278] Em ainda outro aspecto, ensaios qualitativos como espectros UV são utilizados para avaliar a estabilidade. Tais ensaios são especialmente úteis quando o estressor usado é agitação. Os espectros UV podem indicar a presença de agregado - a presença de um agregado é uma indicação de instabilidade. Por exemplo, a Figura 36 mostra um grande deslocamento dos espectros para cima (indicando agregação) quando a formulação de controle é agitada. Figuras 41 e 42 mostram o poder de proteção de uma formulação altamente estabilizada em que, com agitação, os espectros da amostra agitada não são deslocadas para cima, mas sobrepõem a amostra não agitada, o que indica que a agregação não foi formada quando a formulação foi colocada sob estresse através de agitação.

[000279] A prática da presente invenção pode empregar, salvo indicação em contrário, as técnicas e descrições convencionais de química orgânica, tecnologia de polímero, biologia molecular (incluindo técnicas de recombinação), biologia celular, bioquímica e imunologia, que se encontram na técnica. Tais técnicas convencionais incluem a síntese de arranjo de polímeros, hibridação, ligadura e a detecção de hibridação usando uma marca. Ilustrações específicas de técnicas adequadas podem ser obtidas por referência ao exemplo abaixo. No entanto, outros procedimentos equivalentes convencionais também podem ser usados. Tais técnicas e descrições convencionais podem ser encontradas nos manuais de laboratório padrão tais como Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos da Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. e Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y., todos os que são incorporados, para todos os efeitos, em sua totalidade ao presente por referência.

[000280] Na seguinte descrição, inúmeros detalhes específicos são estabelecidos a fim de fornecer uma compreensão mais completa da presente invenção. No entanto, será evidente para aqueles versados na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais destes detalhes específicos. Em outros casos, características bem conhecidas e procedimentos conhecidos por aqueles versados na técnica não foram descritos a fim de não obscurecer a invenção.

[000281] Embora a presente invenção seja descrita principalmente com referência a modalidades específicas, também se prevê que outras modalidades se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica após a leitura da presente divulgação, e pretende-se que tais modalidades estejam incluídas contido nos presentes métodos inventivos.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Estabilidade de armazenamento de formulações aquosas de rfurina

[000282] A estabilidade de uma formulação de furina de controle foi testada em três temperaturas diferentes: temperatura ambiente (por exemplo, 25°C), 37°C e 45°C. Estes estudos em temperaturas elevadas foram utilizados para o estudo de estabilidade acelerada, que é comparável aos estudos de longo prazo de estabilidade em temperaturas mais baixas. As amostras foram testadas no tempo zero, então, após 1, 2, 3, 4 e 7 dias de incubação. Análises incluíam o ensaio da atividade de furina, SEC e western blotting.

[000283] Brevemente, vários frascos de 5 mL de polipropileno foram preenchidos com 3 mL de rfurina e incubados em três temperaturas diferentes: ambiente, 37°C e 45°C. Um frasco de cada condição de incubação foi retirado no tempo zero, então, após 1, 2, 3, 4 e 7 dias. Alíquotas de 200 μL foram feitas em frascos de 0,65 mL de polipropileno e congeladas a -80°C, aguardando as análises.

[000284] A estabilidade de várias formulações de furina foi determinada nestas condições. São dadas especificidades das várias formulações na Tabela 17. Tabela 17. Formulações de furina testadas para a estabilidade durante o armazenamento em temperaturas elevadas.

[000285] Um método de avaliação de estabilidade é através de um ensaio da atividade de furina. Neste ensaio, a atividade de furina é determinada a partir da taxa de uma clivagem de substrato. O substrato, Boc- Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1; AMC = 7-amino-4-metoxi cumarina), é clivado pela furina e uma AMC fluorescente é liberada. O ensaio é realizado, por exemplo, em uma placa de ELISA. A atividade de furina em uma amostra é determinada a partir de uma curva padrão criada, por exemplo, a partir de um padrão de rfurina para controle de qualidade. Os valores das atividades foram calculados como valores médios de duas diluições, cada um em duplicado. Estabilidade de rFurina na formulação altamente estabilizada a 37°C. O objetivo deste experimento foi testar a estabilidade de rfurina em uma formulação estabilizada contendo 75 ppm de polissorbato 80. Houve uma pequena mudança na composição dessa amostra porque o dihidrato de trealose (C12H22O11*2H2O, FW 378,33) foi usado, em vez de trealose não hidratada (C12H22O11, FW 342,30) Uso de dihidrato de trealose criou uma amostra um pouco mais diluída. Estudos de agitação sugeriram que a concentração de polissorbato 80 deve ser mantida entre 50 ppm e 100 ppm para fornecer a melhor proteção contra desnaturação de rfurina induzida por agitação. Neste estudo, uma amostra de rfurina na formulação de teste N° 1 foi dopada com polissorbato 80 a 75 ppm e incubada a 37° C durante quatro dias. Uma amostra de rfurina formulada com a formulação de controle serviu como um controle.

[000286] Análises pelo ensaio da atividade de Furina (Figura 1) mostram perda de atividade nas amostras na formulação de controle que foram incubadas a 37°C e 45°C. Já que a amostra a 45°C estava altamente degradada e agregada após apenas dois dias, a amostra não foi testada após esse tempo. Para as amostras incubadas à temperatura ambiente, os dados foram inconclusivos devido à quantidade de variabilidades no ensaio, mas os dados sugeriram que a atividade de rfurina foi relativamente estável, com a atividade depois de 7 dias aproximadamente equivalente a T=0. a. Em contraste com os dados na formulação de controle, análises pelo ensaio de atividade de furina (Figura 46) mostram que a rfurina na formulação de teste N° 1 manteve mais de sua atividade do que na formulação de controle. Após quatro dias de incubação a 37°C, a rfurina reteve 76,7% de sua atividade original, enquanto a formulação de controle preservou apenas 55,5% de sua atividade original (Figura 47).

[000287] Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) também foi usada para avaliar a estabilidade de várias formulações de furina. Para métodos de SEC, foram utilizados os seguintes equipamentos e materiais: • HPLC Série 1100 da Agilent, equipado com um amostrador automático controlado por temperatura e um detector de arranjo de fotodiodos • Frascos de polipropileno de 100 μL do amostrador automático • Coluna de Cromatografia de Exclusão por Tamanho da TOSOH Bioscience, TSKgel • G3000SWxl, 7,8 mm ID x 30 cm, 5 μm Além disso, as seguintes condições foram usadas para o método SEC: • Fase móvel: 50mm de MOPS, 200 mM de sulfato de sódio, 0,02% de azida de sódio, pH 7,0 • Taxa de Fluxo: 0,5 mL/min • Tempo de Execução: 30 min • Volume de Amostra: 100 μL • Temperatura do Amostrador Automático: 4°C • Temperatura da Coluna: Ambiente

[000288] A absorção de comprimento de onda única a 280 nm (Sem Referência) foi usada para criar cromatógrafos Após a integração manual, a altura do pico principal em 19 min, correspondente ao índice de rfurina da formulação, foi utilizada para avaliar a estabilidade. A razão para usar a altura do pico ao invés da área do pico foi que os picos cromatográficos frequentemente não tinham linha base separada, o que poderia levar a grandes erros. Foi realizada apenas uma injeção de cada amostra. Análises repetidas da formulação de rfurina de controle apresentou variação inferior a 2% na altura do pico (dados não mostrados).

[000289] Os resultados da SEC foram correlacionados aos resultados de ensaio de atividade de furina acima relatados. Análises por SEC (Figura 2) mostram que a altura do pico do monômero de rfurina (tempo de retenção 19 min) da formulação de controle diminuiu com o tempo de incubação para todas as temperaturas. A taxa de diminuição do pico do monômero de rfurina foi relativamente baixa nas amostras incubadas à temperatura ambiente, já que 82% da altura do pico de manteve após sete dias de incubação. No entanto, a 37°C, a altura do pico do monômero de rfurina caiu para 21,6%, da altura original, após sete dias de incubação. A 45°C, após dois dias de incubação, o pico principal diminuiu para 14,1%. Consistente com a perda do teor de monômero de rfurina, outros picos cromatográficos começaram a aparecer ao longo do tempo (Figura 3), correspondentes a agregados (eluição em pontos de tempo anteriores) e produtos de degradação (eluição em pontos de tempo posteriores). Estes picos adicionais indicam que tanto a degradação quanto a agregação de rfurina na formulação de controle. Maior degradação a 37°C em comparação com armazenamento em temperatura ambiente também foi confirmada porWestern blotting (Figura 4). A degradação de rfurina pode ser causada por proteases que foram copurificadas com rfurina, ou pela atividade autocatalítica da própria rfurina.

[000290] Em contraste, a análise SEC confirmou o aumento da estabilidade da formulação de teste N° 1 (Figura 48), contendo trealose, em comparação com a formulação de controle, que não contém um açúcar ou álcool de açúcar. A Figura 48 mostra que a formulação de teste N° 1 manteve 74,8% da altura do pico do monômero de rfurina da solução inicial após incubação a 37°C por 4 dias, em comparação com a formulação de controle, que manteve apenas 58,5% da altura do pico do monômero de rfurina da solução inicial durante a mesma incubação.

Exemplo 2 - Estabilidade em armazenamento de formulações aquosas de rfurina após congelamento/descongelamento

[000291] A estabilidade do controle da formulação e formulações de teste N° 2-6 foram testadas por um estudo de congelamento/descongelamento. Cinco ciclos de congelamento/descongelamento foram concluídos e as amostras foram analisadas pelo ensaio da atividade de furina e SEC. Investigar o impacto de congelamento/descongelamento é importante porque as amostras de rfurina neste estudo e BDS de rfurina são armazenadas congeladas. Experimentos de congelamento/descongelamento usando a formulação de controle (n = 4) demonstram uma perda menor de atividade de furina (aproximadamente 7%) depois de um total de cinco ciclos de congelamento/descongelamento. Enquanto parece haver uma tendência descendente, isto pode ser devido à grande perda de proteína ou a um reflexo da variabilidade do ensaio. De qualquer maneira, esses dados comprovam a capacidade de congelar e descongelar a rFurina, não apenas uma vez, mas várias vezes, com pouca ou nenhuma perda de atividade. Da mesma forma, a análise da SEC do estado oligomérico da furina na formulação de controle não exibiu perda alguma no teor monomérico ao longo do experimento de congelamento/descongelamento (Figura 6).

[000292] Já que a rFurina é geralmente armazenada congelada, foi avaliado o impacto de um método de descongelamento. Análises pelo ensaio da atividade (figura) não demonstram nenhuma diferença significativa entre os dois métodos de descongelamento: descongelamento a 4°C durante a noite, ou em temperatura ambiente por 2 horas.

[000293] Obtidos juntos, esses dados sugerem que rfurina na formulação de controle é relativamente estável durante curtos períodos à temperatura ambiente. Ademais, perda de atividade após armazenamento em temperaturas elevadas se correlaciona com a degradação de rfurina e a agregação. Além disso, a rfurina na formulação de controle manteve sua atividade mesmo após cinco ciclos de congelamento/descongelamento. Estudo de congelamento/descongelamento de rFurina em uma Formulação altamente estabilizada. O estudo de congelamento/descongelamento foi realizado utilizando o mesmo conjunto de amostras que o estudo anterior de Congelamento/descongelamento; a estabilidade de rfurina nas formulações de teste N° 2 (0 ppm de polissorbato 80), N° 3 (10 ppm de polissorbato 80), N° 4 (25 ppm de polissorbato 80), N° 5 (50 ppm de polissorbato 80) e N° 6 (100 ppm de polissorbato 80) foi avaliada. A furina na formulação de controle serviu como um controle. Consistente com a análise prévia da formulação de controle, a análise de atividade de furina (Figura 43) não demonstrou perda significativa de atividade após cinco ciclos de congelamento/descongelamento em qualquer uma das formulações testadas. Análises do teor de monômero de rfurina por SEC (Figuras 44 e 45) demonstraram apenas uma pequena tendência de deterioração da amostra após congelamento/descongelamento. Mesmo após cinco ciclos de congelamento/descongelamento, todas as amostras retiveram mais de 95% de sua atividade original.

Exemplo 3 - Estabilidade em armazenamento de formulações aquosas de rfurina após estresse mecânico

[000294] Sem restrição pela teoria, um mecanismo potencial do efeito de agitação em amostras de rfurina é que induz a desnaturação de rfurina, expondo as superfícies hidrofóbicas. As superfícies hidrofóbicas são atraídas por outras superfícies hidrofóbicas, tais como outras proteínas desnaturadas de rFurina que induzem agregação, ou causando adsorção a superfícies hidrofóbicas em materiais e em tubos de amostra.

[000295] O estudo de agitação não foi projetado para imitar o verdadeiro processo de uso de rfurina, e sim para submeter a amostra a alto estresse. Para ser considerada estabilizada, uma formulação de rfurina tem um desempenho pelo menos tão bom quanto o da formulação de controle, e uma formulação altamente estabilizada tem um desempenho melhor do que a formulação de controle.

[000296] O estudo de agitação foi realizado com a agitação de uma amostra de rfurina em um frasco contendo esferas de Teflon. Amostras foram colhidas após 2 e 17 horas de agitação e analisadas pelo ensaio da atividade de furina e SEC. Conforme demostrado nos resultados do ensaio da atividade furina e da análise de SEC (Figuras 7 e 8, respectivamente), a rfurina na formulação de controle é bastante resistente à agitação por um período limitado de tempo. Após duas horas de agitação vigorosa, como pode ocorrer durante uma etapa de diafiltração, mais de 85% da rfurina ainda estava ativa na formulação de controle. No entanto, após 17 horas de agitação, como pode ocorrer durante o transporte de uma amostra, menos de 10% do teor de rfurina permaneceu ativo.

[000297] O efeito foi então testado nas formulações de teste de furina N° 2 a 6, que foram criadas por dopagem de nove partes de uma amostra de rFurina com uma parte de 500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de CaCl2, pH 6 mais 10% m/m de trealose mais variadas quantidades de polissorbato 80.

[000298] Este estudo de agitação foi realizado agitando as formulações de teste de furina e formulação de controle contendo frascos com esferas de Teflon por três horas. Formulações de teste contendo os seguintes níveis de polissorbato 80 foram avaliadas: nenhum, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm ou 100 ppm. Como mostrado na Figura 31, o polissorbato 80 nas formulações de teste forneceu proteção significativa para rfurina durante a agitação. Depois de três horas de agitação, a atividade de rFurina nas amostras contendo polissorbato 80 variou de 31.499 ± 1.218 U/mL a 36.787 ± 847 U/mL, enquanto a amostra nas formulações sem polissorbato 80 tinha 17.835 ± 1.706 U/mL de atividade de Furina. A amostra na formulação de controle (10 mM de acetato de sódio, 230 mM de cloreto de sódio, 1 mM de cloreto de cálcio, pH 6,0) tinha uma atividade de 24.368 ± 1.135 U/mL.

[000299] Análises por SEC confirmaram o efeito benéfico de polissorbato 80 neste estudo (Figura 32). Após três horas de agitação, as alturas dos picos de rfurina nas amostras contendo polissorbato 80 variaram de 37,5 mAU a 35,9 mAU, enquanto a altura do pico de rFurina na formulação sem polissorbato 80 foi 22,1 mAU. A altura do pico de rFurina na formulação de controle foi 29,9 mAU. O efeito de polissorbato 80 também é mostrado nas Figuras 33 e 34. A pequena tendência sugere que a adição de 10 ppm e 25 ppm de polissorbato 80, enquanto ainda é benéfica, não é tão eficaz quanto o uso de 50 ppm ou 100 ppm de polissorbato 80. O perfil da SEC para a amostra agitada na formulação de controle (Figura 35) não mostra quaisquer picos adicionais em relação à amostra nãoagitada. Isto sugere que a adsorção de superfície foi a principal razão para a perda de atividade. No entanto, os espectros de absorção de UV (Figura 36) mostram que a amostra agitada tem um perfil elevado e inclinado, o que é um sinal de espalhamento de luz e obscurecimento causados pela presença de agregados. O obscurecimento é geralmente causado por agregados muito grandes que são mais opacos do que moléculas menores, que causam uma elevação dos espectros de UV. Este fenômeno não pode ser distinguido da absorção por um espectrofotômetro porque seu detector mede a quantidade de luz que passa através de uma amostra. Uma vez que menos luz chega ao detector, é relatada como absorção; portanto, o perfil de absorção é elevado.

[000300] Luz também pode ser espalhada por agregados, o que diminuiria também a quantidade de luz entrando em um detector. Quanto menor o comprimento de onda, mais luz é dispersa (a quantidade de luz espalhada é inversamente proporcional à quarta potência no comprimento de onda). Isto significa que quanto menor o comprimento de onda, menos luz chega a um detector; portanto, o perfil de absorção é inclinado. É provável que os agregados estivessem presentes nesta amostra, mas a análise de SEC não foi capaz de detectá-los. Esses tipos de problemas com análises de SEC não são incomuns, já que agregados de proteína são muitas vezes demasiadamente grandes para passar através da coluna, ou são absorvidos pela matriz da coluna. O espectro de absorção UV da amostra de rfurina na formulação sem polissorbato 80 (Figura 37) mostra um perfil elevado semelhante. Novamente, não foram detectados agregados na análise de SEC desta amostra (figura 38). As amostras formuladas com polissorbato 80 mostram menos agregação do que aquelas sem polissorbato 80 quando analisadas por espectros de absorção de UV (Figuras 39 a 42). Embora um espectro UV não possa quantificar a quantidade de agregados, novamente, uma pequena tendência pode ser observada insinuando que as amostras com polissorbato 80 a 50 ppm e 100 ppm eram melhores na proteção de rFurina de agregação do que 10 ppm ou 25 ppm. Os dados sugerem que polissorbato 80 incluída na mesma a um nível de 75 ppm seria eficaz, pois esta concentração está no meio de um vasto platô (50-10 ppm) e representaria uma condição robusta.

[000301] A análise de espectrofotometria UV foi realizada utilizando os seguintes equipamentos e materiais: • Espectrofotômetro 8453 da Agilent • Cubeta de quartzo com caminho ótico de 1 cm

[000302] A análise de espectrofotometria foi realizada, primeiro, colocando 0,5 mL de uma formulação adequada em uma cubeta e medida como um espaço em branco. Então, foi colocado 0,5 mL de uma amostra de rfurina em uma cubeta, e a varredura foi feita de 240 nm a 400 nm.

Exemplo 4 - Impacto do pH, sacarose e polissorbato 80 na estabilidade de rFurina

[000303] Amostras de rFurina foram dopadas com vários tampões para ajustar o pH para 5,0, 5,5, 6,0, 7,0 e 8,0. Além disso, a sacarose e/ou o polissorbato 80 foram adicionados às amostras com pH 6,0, 7,0 e 8,0. As amostras foram incubadas a 37°C e testadas pelo ensaio de atividade de furina e SEC.

[000304] Ambos o ensaio de atividade de furina (Figura 11) e SEC (Figura 12) mostraram que a 37°C, a rfurina era mais estável com pH 6,0 do que com pH 5,0 ou 5,5. As amostras com pH 6,0, na formulação de controle (Figura 13) e em MES (Figura 14), eram mais estáveis do que aquelas formuladas em pH 7,0 ou 8,0 (Figuras 15 e 16) quando analisadas por SEC. A adição de sacarose nas amostras em pH 6,0 e 7,0 teve um efeito benéfico sobre a estabilidade da rfurina. As análises de SEC (Figura 17) demonstraram que, após quatro dias de incubação a 37°C, as alturas das amostras contendo sacarose foram em média em 75% de T=0, em comparação com 52% sem a sacarose. Análises pelo ensaio de atividade de furina confirmaram os resultados dos experimentos de SEC (Figuras 18 e 19). A adição de sacarose melhorou a estabilidade de rfurina na formulação de controle e em MES com pH 6,0 (Figuras 18 e 19), com estabilidade semelhante observada usando qualquer tampão (Figura 20). Os efeitos de polissorbato 80 na estabilidade de rfurina em uma formulação que contém sacarose a 37°C foram mínimos, se tanto, como mostrado nas Figuras 17, 18 e 19.

[000305] Esses dados sugerem que a 37°C, a rfurina é mais estável nas formulações com pH 6,0 em comparação com pH 5,0, 5,5, 7,0 e 8,0. Os dados ainda mostram que a sacarose teve um efeito benéfico sobre a estabilidade de rfurina a 37°C. Além disso, nenhuma diferença significativa foi vista na estabilidade de rfurina entre o tampão de controle (acetato) ou MES em pH 6,0, na presença de 10% de sacarose. Finalmente, não houve efeito significativo de polissorbato 80 na estabilidade de rfurina em uma formulação de sacarose a 37°C. Exemplo 5 - Comparação da estabilidade da formulação de furina em sacarose e manitol

[000306] Como visto no Exemplo 4, a adição de sacarose abrandou a degradação e/ou perda de atividade de rfurina a 37°C. Enquanto a sacarose não é usada em aplicações a jusante, tais como o processo de rVWF, outros açúcares e/ou álcoois de açúcar são, como o manitol. A adição de manitol para a formulação de rfurina ao invés de sacarose, portanto, não introduziria uma nova matéria-prima ao processo de vWF. Este estudo foi realizado para determinar se a adição de manitol teria um efeito benéfico sobre a estabilidade de rfurina. A formulação de teste também possuía uma maior capacidade de tamponamento por adição de HEPES e ácido acético nas concentrações finais de 50 mM cada em pH 6,0. Uma formulação estabilizada foi criada por dopagem de uma amostra de rfurina com 10% de 500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de CaCl2, pH 6 e, então, a adição de sacarose, manitol, ou polissorbato 80. Análises tanto pelo ensaio da atividade de furina (Figura 21) e SEC (Figura 22) mostraram que, após quatro dias de incubação a 37°C, manitol e sacarose tinham tiveram efeitos estabilizantes semelhantes em formulações de rfurina. Novamente, o efeito de polissorbato 80 em tais formulações não foi significativo. Embora os dados de atividade (Figura 21) mostrem que a amostra que contém manitol e polissorbato 80, após 4 dias de incubação a 37°C, foi melhor do que outras amostras, não só esta amostra não segue o padrão global, como também as análises de SEC (Figura) não confirmaram isso. É provável que esse resultado tenha sido atípico.

Exemplo 6 - Comparação da estabilidade da formulação de Furina em sacarose e trealose

[000307] Várias publicações mostraram que o manitol acelera a desnaturação das proteínas durante o congelamento, o que gerou algumas preocupações sobre a sua inclusão no tampão da formulação de rfurina. Não foram relatados tais problemas trealose, outro açúcar que já faz parte do processo de produção de rVWF. Este estudo foi realizado para determinar se a adição de trealose teria um efeito benéfico sobre a estabilidade de rfurina. Além disso, foram avaliadas diferentes concentrações de polissorbato 80. Analises usando o ensaio de atividade de furina (Figuras 23 e 24) mostraram que após 5 dias de incubação a 37°C, a amostra contendo 10% de sacarose reteve 66,2% ±2,9% de sua atividade original, enquanto a amostra contendo 10% trealose reteve 60,1% ± 4%. A diferença entre estas amostras não é significativa. Ambas as amostras foram significativamente melhores na preservação da atividade de rfurina do que a formulação de controle, que manteve apenas 37,5% ±4.2% de sua atividade original.

[000308] Análises por SEC (Figura 25) confirmaram as análises da atividade. O pico de rfurina para a amostra em 10% de sacarose reteve 78,3% de sua altura em comparação com 75,1% para a amostra em 10% de trealose e 44,2% para a formulação de controle. Além disso, as análises por western blotting (Figura 26) exibiram a degradação mais baixa nas amostras contendo 10% de sacarose ou 10% de trealose. Note-se que as amostras são apresentadas em pares, com dia 0 seguido por dia 5 para cada uma das formulações.

[000309] Ambas as análises do ensaio da atividade de furina (Figura 27) e de SEC (Figura 28) mostram que 10% de trealose era melhor do que 5% ou 2% na preservação da atividade de rfurina a 37°C. Tais descobertas também foram confirmadas por western blotting (Figura 26). O impacto de polissorbato 80 na estabilidade de rfurina a 37°C foi mínimo, de acordo com as análises pelo ensaio da atividade de furina e SEC (Figuras 29 e 30, respectivamente).

[000310] SEC e ensaios de atividade de furina foram realizados conforme descrito acima. Foi realizado western blotting utilizando os seguintes equipamentos e materiais: • Anticorpo primário anti-furina (peptídeo) de cabra (Cat# SC-12484) da Santa Cruz Biotechnology, Inc. • Anticorpo secundário conjugado IgG-HRP anti-cabra de coelho (Cat# A5420) da Sigma • Kit de Substrato Reforçado por Metal da Pierce contendo 10X DAB/Concentrado de Metal, • Pierce (Cat# 1856090) e Tampão Peroxidase Estável, Pierce (Cat# 185591) • 4-20% de Gel Tris-Glicina (Cat # EC6025BOX) da Invitrogen • Amostra de Agente Redutor NuPAGE® (0,5M DTT, 10x, Cat# NP0004) da Invitrogen • Amostra de Tampão NãoRedutor (4X, Cat# 84788) da Thermo • PBS (Cat# P4417) da Sigma • Tween 20 (Cat# 9480) da EMD Chemicals • BSA (Cat# A7906) da Sigma • Dispositivo de transferência de gel (iBLOT Cat# IB401001) da Invitrogen • Membrana de transferência de PVDF (Immobilon-P, Cat# IPVH07850) da Millipore

[000311] Um anticorpo policlonal foi usado neste estudo, em vez de um anticorpo monoclonal para aumentar a detecção dos produtos da degradação de rFurina. 5 μl de uma amostra foi combinada com 1 μl de 10x DTT e 4 μl de 4x corante não redutor. A amostra foi aquecida a 70°C a 75°C por 10 minutos. 10 μl da amostra foi carregada para 4-20% de gel SDS-PAGE e executada a 150 V por 60 a 70 minutos. O gel de proteína foi transferido para a membrana de PVDF usando o iBLOT a 20 V por 6 minutos. A membrana de PVDF foi, então, bloqueada com o tampão PBS contendo 0,1% de TWEEN 20 e 3% de BSA por 1 hora. A membrana foi incubada durante uma hora no anticorpo primário diluído 125 vezes com o mesmo tampão. A membrana foi lavada com tampão PBST por cinco minutos, três vezes cada uma. A membrana foi incubada durante uma hora no anticorpo secundário diluído 10.000 vezes com o mesmo tampão que o anticorpo primário. O tempo de incubação foi de 1 hora. O blot foi lavado com tampão PBST por cinco minutos, três vezes cada um. O blot foi desenvolvido em 10 mL de substrato cromagênico pré-misturado (1 ml de concentrado mais 9 ml de Tampão Peroxidase Estável), seguido por lavagem com água por 10 minutos. Exemplo 7 - Efeitos de agentes estabilizadores após diluição de composições de furina

[000312] O estudo de diluição de rFurina foi realizado para comparar uma formulação inicial e seu diluente com uma formulação estabilizada e um diluente estabilizado. O estudo imitou o método de diluição utilizado no processo de maturação de rVWF. Brevemente, BDS de rfurina foi passada através de um filtro, seguido pela adição de um volume de 200 vezes o diluente. A principal diferença entre o método de diluição de teste e o método de diluição inicial é que, no método de teste (altamente estabilizado), 75 ppm de polissorbato 80 está presente em ambos a BDS de rfurina e o diluente, enquanto no método inicial não há nenhum polissorbato 80 na BDS de rfurina ou no diluente.

[000313] Foram realizados dois experimentos de diluição e ambos mostraram que a combinação da formulação estabilizada com seu diluente estabilizado foi superior às formulações de furina e de diluente. No primeiro experimento, o método de teste usando as formulações estabilizadas recuperou 83% a 87% da atividade de rfurina esperada, enquanto os métodos de controle recuperaram apenas 21% a 22% (Tabela 18). Neste experimento, a amostra de rfurina foi passada através de um filtro e seguida por um volume de 200vezes o diluente. O filtrado foi coletado para uma bolsa e, então, transferido para um cilindro graduado. Tabela 18. Resultados experimentais dos experimentos de diluição de rfurina realizados com e sem surfactantes não iônicos.

[000314] No segundo experimento, o método de teste recuperou 80% da atividade de rfurina esperada, enquanto o método de controle recuperou apenas 27% (Tabela 19). Neste experimento, a amostra de rfurina foi passada através de um filtro e seguida por um volume de 200vezes o diluente. O filtrado foi colhido para um cilindro. A combinação da formulação estabilizada de rfurina e o diluente estabilizado aumentou a recuperação de rfurina três a quatro vezes em comparação com o método de controle. A recuperação melhorada está, sem restrição pela teoria, associada à presença de polissorbato 80. Tabela 19. Resultados experimentais dos experimentos de diluição de rfurina realizados com e sem surfactantes não iônicos.

Exemplo 8 - Características do estoque do tampão da formulação estabilizada

[000315] O estoque do tampão da formulação estabilizada de rfurina (500 mM de HEPES, 400 mM de ácido acético, 1 mM de CaCl2, pH 6,0) pode ser feito consistentemente (Tabela 20). Os RSDs para pH e condutividade foram < 0,3%. O pH foi ligeiramente e indiretamente correlacionado com temperatura, caindo 0,014 unidades por graus Celsius, enquanto a condutividade foi diretamente correlacionada com a temperatura, subindo 0,40 mS/cm por grau C (Figura 49). A temperatura média das amostras quando o pH e a condutividade foram medidos era 27,6°C. Na fabricação, as amostras são lidas a 25±0,5°C. Foram calculados o pH e a condutividade esperados a 25°C com base nas regressões lineares na Figura 48,. O desvio padrão relativo da Tabela 20 foi aplicado a este valor para determinar a faixa esperada (±3 dp). Espera-se que o pH a 25°C seja 6,04 (±0,01). Espera-se que a condutividade a 25°C seja 19,9±0,2 mS/cm. Estas faixas esperadas são baseadas em três lotes feitos sob circunstâncias limitadas. As faixas de especificação para o tampão não precisam ser definidas tão estritamente. A especificação de pH será igual á especificação final de pH de BDS, 5,90-6,10. A faixa de condutividade será semelhante à utilizada para o tampão BDS anterior, por exemplo, com uma faixa de ±20%, para uma especificação de 15,9-23,9 mS/cm. Os requisitos do processo de rVWF geralmente não são motivo de preocupação na definição das especificações de tampão, já que a rfurina vai ser diluída 200vezes no processo de rVWF. Dados experimentais na

Tabela 21 e na Tabela 22 correspondem aos gráficos apresentados na Figura 49. Tabela 20. Características do estoque do tampão da formulação estabilizada.

Tabela 21. Dependência da condutividade do estoque do tampão em temperatura.

Tabela 22. Dependência do pH do estoque do tampão em temperatura.

REFERÊNCIAS

[000316] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência a este documento na sua totalidade e para todos os efeitos, na mesma medida como se cada publicação ou patente ou pedido patente individual tivesse sido especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência, na sua totalidade, para todos os efeitos.

[000317] Muitas das modificações e variações deste pedido podem ser feitas sem que haja desvio de seu espírito e escopo, como será evidente para aqueles versados na técnica. As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas a título de exemplo somente, e o pedido será limitado somente pelos termos das reivindicações acrescentadas, juntamente com o escopo completo de equivalentes a que as reivindicações têm direito.

Claims

1. Composição aquosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), caracterizada pelo fato de compreender: (a) de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina; (b) de 100 mM a 300 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; (c) de 0,5 mM a 2 mM de cálcio; (d) de 2% a 20% de açúcar ou álcool de açúcar; (e) de 10 a 200 ppm surfactante não iônico; (f) de 10 a 200 mM de agente tamponador; e (g) um pH de 5,5 a 7,5.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender de 150 mM a 250 mM de um sal farmaceuticamente aceitável.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de compreender 190±10 mM de um sal farmaceuticamente aceitável.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de compreender 0,9±0,2 mM de cálcio.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender de 5% a 15% de açúcar ou álcool de açúcar.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender 10±2% de açúcar ou álcool de açúcar.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o açúcar ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo constituído por sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o açúcar ou álcool de açúcar é trealose ou sacarose.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de compreender de 10 ppm a 100 ppm de surfactante não iônico.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o surfactante não iônico é polisorbato 80.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de compreender de 50 mM a 150 mM de agente tamponador.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender 90±10 mM de agente tamponador.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o agente tamponador compreende um agente selecionado do grupo consistindo de acetato, HEPES e MES.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada pelo fato de ter um pH de 5,5 a 7,0.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a composição tem maior estabilidade quando armazenada a 37°C em comparação a uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a composição mantém um percentual maior de atividade de rfurina quando armazenada a 37°C em comparação a uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a composição mantém um percentual maior de teor de monômero de rfurina quando armazenada a 37°C em comparação a uma composição de rfurina que não contém um açúcar ou álcool de açúcar.

19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a composição tem maior estabilidade quando agitada em comparação a uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composição tem maior estabilidade quando diluída em comparação a uma composição de rfurina que não contém um surfactante não iônico.

21. Composição aquosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), caracterizada pelo fato de compreender: (a) de 8.000 U/mL a 500.000 U/mL de rfurina; (b) 190 mM de cloreto de sódio; (c) 0,92 mM de cálcio; (d) 10% de trealose; (e) 75 ppm de polisorbato 80; (f) 45 mM de ácido acético; (g) 46 mM de HEPES; e (h) um pH de 5,5 a 7,5.