JP2016006106A - 組換えフューリン製剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖、糖アルコール、及び／又は非イオン性界面活性剤を含む、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤及び、当該組成物を安定に希釈する方法の提供。【解決手段】（ａ）８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬのｒフューリン；（ｂ）１９０?１０ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜２０％の糖又は糖アルコール；（ｅ）１０〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；及び（ｆ）１０〜２００ｍＭの緩衝剤；並びに（ｇ）５．５〜７．５のｐＨ、を含む安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物であり、保存された場合及び／又は機械的ストレスに曝された場合に、安定化されていない組成物に比べて高いフューリン活性と単量体フューリン含量を保持しつつ、フューリンの凝集を低減するフューリン製剤。【選択図】図１８
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月２日に出願の米国仮特許出願第６１／４９２，７１２号の優先権を主張し、あらゆる目的のために、その全体は参照することにより明示的に本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０１１年６月２日に出願の米国仮特許出願第６１／４９２，７１２号の優先権を主張し、あらゆる目的のために、その全体は参照することにより明示的に本明細書に組み入れられる。
本出願の分野
本出願は基本的に、タンパク質製剤の分野に関する。
本出願は基本的に、タンパク質製剤の分野に関する。
本発明の背景
タンパク質分解活性をもつ哺乳類のスブチリシン様プロプロテイン変換酵素（ＳＰＣまたはＰＣ）のファミリーは、細菌のスブチリシン類および酵母のＫｅｘ２ｐと相同性を有する。これまでに、フューリン、ＰＣ１（ＰＣ３としても知られている）、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５（ＰＣ６としても知られている）、ＰＣ７（ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７）を含む、７種類のそれぞれ異なるＳＰＣファミリーのメンバーが同定されており、これらはそれぞれ独自の組織分布を示す。
タンパク質分解活性をもつ哺乳類のスブチリシン様プロプロテイン変換酵素（ＳＰＣまたはＰＣ）のファミリーは、細菌のスブチリシン類および酵母のＫｅｘ２ｐと相同性を有する。これまでに、フューリン、ＰＣ１（ＰＣ３としても知られている）、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５（ＰＣ６としても知られている）、ＰＣ７（ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７）を含む、７種類のそれぞれ異なるＳＰＣファミリーのメンバーが同定されており、これらはそれぞれ独自の組織分布を示す。
ＰＡＣＥ（塩基性アミノ酸対開裂酵素）とも呼ばれているフューリンは、哺乳類の全ての組織および全ての細胞系列に普遍的に発現しており、かつ、ホルモン、成長因子、受容体、ウイルス性および細菌性タンパク質、ならびに血漿タンパク質などの、分泌経路に含まれている、生物学的に活性な多くの前駆タンパク質をプロセシングすることができる。フューリンはカルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼであり、その構造は、複数のドメイン、すなわちシグナルペプチド、プロペプチド、触媒ドメイン、中間ドメイン（ホモＢまたはＰ−ドメインとも呼ばれている）、Ｃ末端に局在するシステインに富むドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端から構成されている。フューリンプロテアーゼ開裂部位は、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇというアミノ酸配列を特徴とする認識配列を含んでいる（Ｈｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９１； ２６６：１２１２７−３０（非特許文献1））。
フューリンはプロプロテイン変換酵素のファミリーに属し、かつ、カルシウム（Ｃａ２＋）依存性である。フューリンは、-１番目および-４番目のアルギニンを含む特定の配列に含まれているアルギニンのＣ末端ペプチド結合を特異的に切断する。この配列は多数のヒトタンパク質で見ることができるため、このことは、フューリンがヒトのいくつかのプロプロテインの成熟に大きな役割を担っていることを示している。従ってフューリンは、潜在型の前駆タンパク質を生物学的に活性な産物へとプロセシングするプロプロテイン変換酵素である。フューリンは、塩基性アミノ酸対プロセシング部位で前駆タンパク質を切断するカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質の１つとして、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）がある。
フューリン（例えば、組換えフューリン）は、前駆ＶＷＦ（前駆フォン・ウィルブランド因子）をＶＷＦのＡｒｇ７４１−Ｓｅｒ７４２ペプチド結合において切断し、成熟したＶＷＦへと変換することができる。この成熟工程は、例えば、Ｂ型フォン・ウィルブランド病の治療となるｒＶＷＦの製造過程の一部である。活性をもつ組換えタンパク質の生産は、臨床および診断にとって非常に重要である。例えば、成熟したＶＷＦのような活性型または成熟型タンパク質を血液の凝固を抑制するために使用してもよい。
フューリン製剤、特に組換えフューリン（ｒフューリン）製剤の有効期間は、組換えフューリンの活性がタンパク質分解（多くがフューリンタンパク質の自己開裂）によって消失するため、短い（６ヶ月未満）ことが多い。加えて、成熟したｖＷＦの生産などの一定の製造工程で使用される場合に、組換えフューリン製剤は通常２００倍まで希釈されるが、希釈された組換えフューリンは一般に、活性の極度な消失を示す。そのため当該分野においては、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化させる方法および製剤、ならびに、濃縮されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を、フューリンの活性を実質的に消失させることなく希釈する方法が必要とされている。
Ｈｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９１； ２６６：１２１２７−３０
本開示は、フューリン（例えば、組換えフューリン組成物）を安定化する方法および製剤を提供することによって、フューリン（例えば、組換えフューリン）の製剤、保存、および操作の分野における、これらのおよび他の需要を満たすものである。これらの需要は、少なくとも部分的には、糖類、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えることで、保存している間および機械的ストレスに曝されている間のフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物の安定性が有意に向上するという発見によって満たされる。
従って本発明は、最初の（対照となる）フューリン製剤と比較して、高温、撹拌、および様々なｐＨの条件下で優れた安定性を示す、高度に安定化されたフューリン製剤、特に高度に安定化された組換えフューリン製剤を提供する。
一側面において、本開示は、組換えフューリン（ｒフューリン）の安定化された水性組成物を提供し、この組成物は、８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム；２％〜２０％の糖または糖アルコール；１０〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、ｐＨが５．５〜７．５である。
一態様において、上記の組成物は１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの薬学的に許容される塩を含む。別の態様において、上記の組成物は１９０±１０ｍＭの薬学的に許容される塩を含む。別の態様において、上記の組成物は１９０ｍＭの薬学的に許容される塩を含む。
上記の組成物の一態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。上記の組成物の別の態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。
一態様において、上記の組成物は０．９±０．２ｍＭのカルシウムを含む。別の態様において、上記の組成物は０．９２ｍＭのカルシウムを含む。
一態様において、上記の組成物は５％〜１５％の糖または糖アルコールを含む。別の態様において、上記の組成物は１０±２％の糖または糖アルコールを含む。別の態様において、上記の組成物は１０％の糖または糖アルコールを含む。
上記の組成物の一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。上記の組成物の別の態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。上記の組成物の別の態様では、糖または糖アルコールはスクロースである。
一態様において、上記の組成物は１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の態様において、上記の組成物は５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の態様において、上記の組成物は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
上記の組成物の一態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である。
一態様において、上記の組成物は５０ｍＭ〜１５０ｍＭの緩衝剤を含む。別の態様において、上記の組成物は９０±１０ｍＭの緩衝剤を含む。別の態様において、上記の組成物は９１ｍＭの緩衝剤を含む。
上記の組成物の一態様では、緩衝剤は酢酸塩を含む。上記の組成物の別の態様では、緩衝剤はＨＥＰＥＳを含む。上記の組成物の別の態様では、緩衝剤はＭＥＳを含む。上記の組成物の別の態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳを含む。
一態様において、上記の組成物は２５ｍＭ〜７５ｍＭの酢酸塩と２５〜７５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。別の態様において、上記の組成物は４５±５ｍＭの酢酸塩と４５±５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。別の態様において、上記の組成物は４５ｍＭの酢酸塩と４６ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
一態様において、上記の組成物のｐＨは、５．５〜７．０である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは６．０±０．２である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは６．０である。
上記の組成物の一態様では、３７℃で保存された場合の組成物の安定性は、糖または糖アルコールを含まない組換えフューリン組成物と比べて高い。
上記の組成物の一態様では、３７℃で保存された場合に、この組成物は、糖または糖アルコールを含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン活性を維持する。
上記の組成物の一態様では、３７℃で保存された場合に、この組成物は、糖または糖アルコールを含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン単量体含量を維持する。
上記の組成物の一態様では、撹拌された場合のこの組成物の安定性は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高い。
上記の組成物の一態様では、撹拌された場合に、この組成物は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン活性を維持する。
上記の組成物の一態様では、撹拌された場合に、この組成物は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン単量体含量を維持する。
上記の組成物の一態様では、希釈された場合のこの組成物の安定性は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高い。
上記の組成物の一態様では、希釈された場合に、この組成物は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン活性を維持する。
上記の組成物の一態様では、希釈された場合に、この組成物は、非イオン性界面活性剤を含まない組換えフューリン組成物と比べて高いパーセンテージの組換えフューリン単量体含量を維持する。
一側面において、本開示は、組換えフューリン（ｒフューリン）の安定化された水性組成物を提供し、この組成物は、８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；１９０ｍＭの塩化ナトリウム；０．９２ｍＭのカルシウム；１０％のトレハロース；７５ｐｐｍのポリソルベート８０；４５ｍＭの酢酸；４６ｍＭのＨＥＰＥＳを含み；かつ、ｐＨは５．５〜７．５である。
一態様において、上記の組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは６．０±０．２である。別の態様において、上記の組成物のｐＨは６．０である。
一側面において、本開示は、水性組換えフューリン組成物を希釈する方法を提供し、この方法は、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む希釈緩衝液を水性組換えフューリン組成物に添加する工程を含み、それによって、希釈された組換えフューリン組成物が生成される。
上記の方法の一態様では、希釈緩衝液は１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。上記の方法の別の態様では、希釈緩衝液は５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。上記の方法の別の態様では、希釈緩衝液は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
上記の方法の一態様では、希釈緩衝液のｐＨは５．５〜７．５である。上記の方法の別の態様では、希釈緩衝液のｐＨは５．５〜６．５である。上記の方法の別の態様では、希釈緩衝液のｐＨは６．０±０．２である。上記の方法の別の態様では、希釈緩衝液のｐＨは６．０である。
上記の方法の一態様では、希釈された組換えフューリン組成物は、希釈する前の水性組換えフューリン組成物の組換えフューリン活性の少なくとも５０％の活性を含む。
上記の方法の一態様では、希釈された組換えフューリン組成物は、希釈する前の水性組換えフューリン組成物の組換えフューリン活性の少なくとも７５％の活性を含む。
一側面において、本開示は、組換えフューリン（ｒフューリン）の非常に安定化された製剤を提供し、該製剤は、８，０００〜５２，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；１ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．１ｍＭ〜２ｍＭの塩化カルシウム；１％〜２０％の糖および／または糖二水和物；５０〜１００ｐｐｍの界面活性剤；および１ｍＭ〜１００ｍＭのカルボン酸、ｐＨを４．０〜７．０に維持するのに十分な濃度の緩衝剤、または前記カルボン酸および前記緩衝剤の両方を含む。
一態様において、上記の製剤は１８０〜２００ｍＭの塩を含む。
上記の製剤の一態様では、塩は塩化ナトリウムである。
一態様において、上記の製剤は０．５〜１．０ｍＭのカルシウムを含む。
一態様において、上記の製剤は５〜１５％の糖または糖二水和物を含む。
上記の製剤の一態様では、糖または糖二水和物は、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
上記の製剤の一態様では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
上記の製剤の一態様では、含まれる界面活性剤の濃度は約６５〜約８５ｐｐｍである。
上記の製剤の一態様では、カルボン酸は酢酸である。
上記の製剤の一態様では、カルボン酸の濃度は３５〜５５ｍＭである。
上記の製剤の一態様では、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。
上記の製剤の一態様では、緩衝剤の濃度は約２０〜約１００ｍＭである。
上記の製剤の一態様では、３７℃で保存した後に、この製剤は、糖または糖二水和物を含まない製剤と比べて高い安定性を示す。
上記の製剤の一態様では、１％のポリソルベート８０、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭの酢酸、１ｍＭの塩化カルシウム、およびトレハロース二水和物の粉末を含む組成物に組換えフューリンを加えることによって製剤は調製され、ここで該組換えフューリンを加える前の該組成物のｐＨは６．０である。
一側面において、本開示は、組換えフューリン（ｒフューリン）の高度に安定化された製剤を提供し、該製剤は、８，０００〜５７，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；１９０ｍＭの塩化ナトリウム；０．９２ｍＭの塩化カルシウム；１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物；７５ｐｐｍのポリソルベート８０；４５ｍＭの酢酸；および４６ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
一側面において、本開示は、（ａ）８，０００〜５２，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；（ｂ）１ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．１ｍＭ〜２ｍＭの塩化カルシウム；（ｄ）１％〜２０％の糖および／または糖二水和物；（ｅ）５０〜１００ｐｐｍの界面活性剤；および（ｆ）１ｍＭ〜１００ｍＭのカルボン酸もしくはｐＨを４．０〜７．０に維持するのに十分な濃度の緩衝剤またはカルボン酸と緩衝剤の両方を含む、組換えフューリン（ｒフューリン）の高度に安定化された製剤を提供する。
[本発明1001]
以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）8，000Ｕ／ｍＬ〜500，000Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）100ｍＭ〜300ｍＭの薬学的に許容される塩；
（ｃ）0．5ｍＭ〜2ｍＭのカルシウム；
（ｄ）2％〜20％の糖または糖アルコール；
（ｅ）10〜200ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および
（ｆ）10〜200ｍＭの緩衝剤；および
（ｇ）5．5〜7．5のｐＨ。
[本発明1002]
150ｍＭ〜250ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
190±10ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
190ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
前記薬学的に許容される塩が塩化ナトリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
前記薬学的に許容される塩が塩化カリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1007]
0．9±0．2ｍＭのカルシウムを含む、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
0．92ｍＭのカルシウムを含む、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
5％〜15％の糖または糖アルコールを含む、本発明1001〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1010]
10±2％の糖または糖アルコールを含む、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
10％の糖または糖アルコールを含む、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記糖または糖アルコールが、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
前記糖または糖アルコールがトレハロースである、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1014]
前記糖または糖アルコールがスクロースである、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1015]
10ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1001〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
50ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
75ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート80である、本発明1001〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
50ｍＭ〜150ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1001〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
90±10ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
91ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
前記緩衝剤が酢酸塩を含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記緩衝剤がＨＥＰＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記緩衝剤がＭＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記緩衝剤が酢酸塩およびＨＥＰＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1026]
25ｍＭ〜75ｍＭの酢酸塩および25〜75ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
45±5ｍＭの酢酸塩および45±5ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1026の組成物。
[本発明1028]
45ｍＭの酢酸塩および46ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
5．5〜7．0のｐＨを有する、本発明1001〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
6．0のｐＨを有する、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1034]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1033または1034の組成物。
[本発明1036]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1036または1037の組成物。
[本発明1039]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1038のいずれかの組成物。
[本発明1040]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1039または1040の組成物。
[本発明1042]
以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）8，000Ｕ／ｍＬ〜500，000Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）190ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｃ）0．92ｍＭのカルシウム；
（ｄ）10％のトレハロース；
（ｅ）75ｐｐｍのポリソルベート80；
（ｆ）45ｍＭの酢酸；
（ｇ）46ｍＭのＨＥＰＥＳ；および
（ｇ）5．5〜7．5のｐＨ。
[本発明1043]
5．5〜7．0のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1046]
6．0のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1047]
水性ｒフューリン組成物を希釈する方法であって、該水性ｒフューリン組成物に、10ｐｐｍ〜200ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む希釈緩衝液を加える工程を含み、それによって、希釈されたｒフューリン組成物が生成される、前記方法。
[本発明1048]
前記希釈緩衝液が10ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1043の方法。
[本発明1049]
前記希釈緩衝液が50ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記希釈緩衝液が75ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記希釈緩衝液が5．5〜7．5のｐＨを有する、本発明1043〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記希釈緩衝液が5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記希釈緩衝液が6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記希釈緩衝液が6．0のｐＨを有する、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記希釈されたｒフューリン組成物が、希釈前の前記水性ｒフューリン組成物に存在するｒフューリン活性の少なくとも50％を含む、本発明1043〜1051のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記希釈されたｒフューリン組成物が、希釈前の前記水性ｒフューリン組成物に存在するｒフューリン活性の少なくとも75％を含む、本発明1055の方法。
[本発明1001]
以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）8，000Ｕ／ｍＬ〜500，000Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）100ｍＭ〜300ｍＭの薬学的に許容される塩；
（ｃ）0．5ｍＭ〜2ｍＭのカルシウム；
（ｄ）2％〜20％の糖または糖アルコール；
（ｅ）10〜200ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および
（ｆ）10〜200ｍＭの緩衝剤；および
（ｇ）5．5〜7．5のｐＨ。
[本発明1002]
150ｍＭ〜250ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
190±10ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
190ｍＭの薬学的に許容される塩を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
前記薬学的に許容される塩が塩化ナトリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
前記薬学的に許容される塩が塩化カリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1007]
0．9±0．2ｍＭのカルシウムを含む、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
0．92ｍＭのカルシウムを含む、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
5％〜15％の糖または糖アルコールを含む、本発明1001〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1010]
10±2％の糖または糖アルコールを含む、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
10％の糖または糖アルコールを含む、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記糖または糖アルコールが、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
前記糖または糖アルコールがトレハロースである、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1014]
前記糖または糖アルコールがスクロースである、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1015]
10ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1001〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
50ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
75ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート80である、本発明1001〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
50ｍＭ〜150ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1001〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
90±10ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
91ｍＭの緩衝剤を含む、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
前記緩衝剤が酢酸塩を含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記緩衝剤がＨＥＰＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記緩衝剤がＭＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記緩衝剤が酢酸塩およびＨＥＰＥＳを含む、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1026]
25ｍＭ〜75ｍＭの酢酸塩および25〜75ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
45±5ｍＭの酢酸塩および45±5ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1026の組成物。
[本発明1028]
45ｍＭの酢酸塩および46ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
5．5〜7．0のｐＨを有する、本発明1001〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
6．0のｐＨを有する、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1034]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
37℃で保存された場合に、糖または糖アルコールを含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1033または1034の組成物。
[本発明1036]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
撹拌された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1036または1037の組成物。
[本発明1039]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高い安定性を有する、本発明1001〜1038のいずれかの組成物。
[本発明1040]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン活性を維持する、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
希釈された場合に、非イオン性界面活性剤を含まないｒフューリン組成物と比べて高いパーセンテージのｒフューリン単量体含量を維持する、本発明1039または1040の組成物。
[本発明1042]
以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）8，000Ｕ／ｍＬ〜500，000Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）190ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｃ）0．92ｍＭのカルシウム；
（ｄ）10％のトレハロース；
（ｅ）75ｐｐｍのポリソルベート80；
（ｆ）45ｍＭの酢酸；
（ｇ）46ｍＭのＨＥＰＥＳ；および
（ｇ）5．5〜7．5のｐＨ。
[本発明1043]
5．5〜7．0のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1046]
6．0のｐＨを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1047]
水性ｒフューリン組成物を希釈する方法であって、該水性ｒフューリン組成物に、10ｐｐｍ〜200ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む希釈緩衝液を加える工程を含み、それによって、希釈されたｒフューリン組成物が生成される、前記方法。
[本発明1048]
前記希釈緩衝液が10ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1043の方法。
[本発明1049]
前記希釈緩衝液が50ｐｐｍ〜100ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記希釈緩衝液が75ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記希釈緩衝液が5．5〜7．5のｐＨを有する、本発明1043〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記希釈緩衝液が5．5〜6．5のｐＨを有する、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記希釈緩衝液が6．0±0．2のｐＨを有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記希釈緩衝液が6．0のｐＨを有する、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記希釈されたｒフューリン組成物が、希釈前の前記水性ｒフューリン組成物に存在するｒフューリン活性の少なくとも50％を含む、本発明1043〜1051のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記希釈されたｒフューリン組成物が、希釈前の前記水性ｒフューリン組成物に存在するｒフューリン活性の少なくとも75％を含む、本発明1055の方法。
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本開示は、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤を加えることで、水性フューリン組成物を、様々な化学的ストレスや機械的なストレスに対して安定化することができるという発見に、部分的に基づいている。本明細書に記載の水性フューリン組成物は、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤を欠いた同様のフューリン組成物と比較して、室温または室温より高い温度で保存した場合に、ならびに機械的なストレスに曝した場合に有意に安定である。本開示は、フューリン希釈緩衝液に非イオン性界面活性剤を加えることで、ＶＷＦなどの様々な組換え生物製剤の製造工程で使用される、より低い濃度に酵素を希釈した場合に、フューリンの活性をより高く回収することができるという発見にも、部分的に基づいている。
Ｉ．序論
本開示は、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤を加えることで、水性フューリン組成物を、様々な化学的ストレスや機械的なストレスに対して安定化することができるという発見に、部分的に基づいている。本明細書に記載の水性フューリン組成物は、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤を欠いた同様のフューリン組成物と比較して、室温または室温より高い温度で保存した場合に、ならびに機械的なストレスに曝した場合に有意に安定である。本開示は、フューリン希釈緩衝液に非イオン性界面活性剤を加えることで、ＶＷＦなどの様々な組換え生物製剤の製造工程で使用される、より低い濃度に酵素を希釈した場合に、フューリンの活性をより高く回収することができるという発見にも、部分的に基づいている。
有利なことに、本明細書に記載の試験は、糖または糖アルコールをフューリン組成物に加えると、長期間保存した場合のこの組成物の安定性が高められることを示している。例えば本明細書では、僅か２％の糖または糖アルコールを水性フューリン製剤に加えることで、この組成物の安定性を、１０％を超えて高めることができることを示している。さらに、１０％の糖または糖アルコールを水性フューリン製剤に添加することで、組成物の安定性を、７５％を超えて高めることができることも示している。
有利なことに、本明細書に記載の試験はさらに、非イオン性界面活性剤をフューリン組成物に加えると、機械的ストレスに曝された場合のこの組成物の安定性が高まることを示している。例えば本明細書では、僅か１０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を水性フューリン製剤に加えることで、この組成物の安定性を、７５％を超えて高めることができることを示している。
有利なことに、本明細書に記載の試験はさらに、非イオン性界面活性剤をフューリン希釈緩衝液に加えると、希釈後のフューリン活性の回収が高まることを示している。例えば本明細書では、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をフューリン希釈緩衝液に加えると、希釈した後のフューリン活性が３〜４倍に高まることが示されている。
従って、本開示は、高度に安定化されたフューリン製剤の組成物を提供する。本明細書の議論の大部分は、高度に安定化された組換えフューリン（ｒフューリン）製剤に関するものであるが、対象から単離されたフューリン、または任意のフューリンの誘導体もしくは突然変異体を含むいかなるフューリンタンパク質も本発明の製剤に含めることができると見なされる。
一側面において、本開示は、広範囲の温度、複数回の凍結／融解、および／または撹拌に製剤を曝露することを含むがこれらには限定されない、１つ以上のストレスにこの製剤を曝した後に試験した場合に、対照製剤と比べて高い安定性を示す高度に安定化されたフューリン製剤を提供する。通常、高い安定性は、フューリン活性のレベルで評価する。例えば、周囲温度と比べて高い温度で保存した後に、高度に安定化されたフューリン製剤は、同一の条件で保存された対照製剤よりも、それぞれの保存前の（つまり時間＝０での）活性と比較して高レベルの活性を示す。フューリン製剤の安定性を評価する方法は本明細書に記載している。
さらなる側面において、本開示は、本発明の高度に安定化されたフューリン製剤の生成方法を提供する。そのような方法は、フューリン製剤を保存に対して安定化する方法を含み、ここで保存には、凍結保存、周囲の室温で、もしくは周囲の室温と比べて高い温度での保存、または凍結乾燥などが含まれる。
一層さらに他の側面において、本開示は、希釈後も高いフューリン活性を維持する、濃縮されたフューリン溶液の希釈方法を提供する。非イオン性界面活性剤を欠いた溶液で希釈されたフューリン組成物と比較して、本明細書で提供する方法に従って希釈されたフューリンの水性組成物は、３〜４倍高い酵素活性を維持する。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、「フューリン」という用語は、フューリン活性を有する、特に、前駆フォン・ウィルブランド因子（前駆ＶＷＦ）ポリペプチドのＡｒｇ−７６３とＳｅｒ−７６４の残基間のペプチド結合を切断する能力を有するいかなるタンパク質またはポリペプチドも指す。例示となる態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒトフューリン前駆タンパク質）のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例示的な態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒトフューリン前駆タンパク質）の２５番目〜７９４番目のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例示的な態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒト成熟フューリンタンパク質）の１０８番目〜７９４番目のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、フューリンポリペプチドには、ＶＷＦ切断活性をもつ、天然に生じるフューリンの変異型、ならびにＶＷＦ切断活性をもつ、修飾されたフューリン構築物も含まれる。本明細書で使用する場合、フューリンには、いかなる天然に生じる変異型、別の配列、イソ型または基本的な活性をある程度保持する（例えば、野生型フューリンの活性と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の活性を保持する）突然変異型タンパク質も包含される。ヒトの集団に見られるフューリン突然変異の例としては、Ａ４３Ｅ、Ａ４３Ｇ、Ａ４３Ｖ、Ｒ５０Ｗ、Ｙ６４Ｃ、Ｌ７７Ｐ、Ｒ８１Ｃ、Ｅ９７Ａ、Ｅ９７Ｖ、Ｖ１０９Ｍ、Ｖ１０９Ｌ、Ｒ１３０Ｗ、Ａ１３９Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｎ２４５Ｓ、Ｅ２７１Ｋ、Ｑ３３９Ｒ、Ｎ４０７Ｓ、Ｅ４５７Ｑ、Ｒ４６４Ｗ、Ｋ４６９Ｒ、Ｓ５２４Ｙ、Ｔ５３６Ｓ、Ｌ５７０Ｆ、Ｄ６２４Ｎ、Ａ６４２Ｔ、Ｓ６８５Ｐ、Ｖ７２８Ｉ、Ｖ７３５Ｉ、Ｒ７４５Ｑ、Ｐ７７２Ｌ、およびＡ７９３Ｔが挙げられるがこれらには限定されない。フューリンポリペプチドには、翻訳後修飾されたポリペプチドも含まれる。例えば、フューリンのＳ７７３とＳ７７５の残基がリン酸化されることが分かっており、また、フューリンのＮ３８７、Ｎ４４０、およびＮ５５３の残基がグリコシル化されると考えられている。
本明細書で使用する場合、「フューリン」という用語は、フューリン活性を有する、特に、前駆フォン・ウィルブランド因子（前駆ＶＷＦ）ポリペプチドのＡｒｇ−７６３とＳｅｒ−７６４の残基間のペプチド結合を切断する能力を有するいかなるタンパク質またはポリペプチドも指す。例示となる態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒトフューリン前駆タンパク質）のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例示的な態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒトフューリン前駆タンパク質）の２５番目〜７９４番目のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例示的な態様では、フューリンは、ＮＰ＿００２５６０．１（ヒト成熟フューリンタンパク質）の１０８番目〜７９４番目のアミノ酸配列と同一であるか、または非常に相同性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、フューリンポリペプチドには、ＶＷＦ切断活性をもつ、天然に生じるフューリンの変異型、ならびにＶＷＦ切断活性をもつ、修飾されたフューリン構築物も含まれる。本明細書で使用する場合、フューリンには、いかなる天然に生じる変異型、別の配列、イソ型または基本的な活性をある程度保持する（例えば、野生型フューリンの活性と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の活性を保持する）突然変異型タンパク質も包含される。ヒトの集団に見られるフューリン突然変異の例としては、Ａ４３Ｅ、Ａ４３Ｇ、Ａ４３Ｖ、Ｒ５０Ｗ、Ｙ６４Ｃ、Ｌ７７Ｐ、Ｒ８１Ｃ、Ｅ９７Ａ、Ｅ９７Ｖ、Ｖ１０９Ｍ、Ｖ１０９Ｌ、Ｒ１３０Ｗ、Ａ１３９Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｎ２４５Ｓ、Ｅ２７１Ｋ、Ｑ３３９Ｒ、Ｎ４０７Ｓ、Ｅ４５７Ｑ、Ｒ４６４Ｗ、Ｋ４６９Ｒ、Ｓ５２４Ｙ、Ｔ５３６Ｓ、Ｌ５７０Ｆ、Ｄ６２４Ｎ、Ａ６４２Ｔ、Ｓ６８５Ｐ、Ｖ７２８Ｉ、Ｖ７３５Ｉ、Ｒ７４５Ｑ、Ｐ７７２Ｌ、およびＡ７９３Ｔが挙げられるがこれらには限定されない。フューリンポリペプチドには、翻訳後修飾されたポリペプチドも含まれる。例えば、フューリンのＳ７７３とＳ７７５の残基がリン酸化されることが分かっており、また、フューリンのＮ３８７、Ｎ４４０、およびＮ５５３の残基がグリコシル化されると考えられている。
本開示の文脈では、フューリンタンパク質には、組換えフューリンポリペプチドおよび、供給源となる材料（例えば組織または血液）から単離された天然のフューリンポリペプチドが含まれる。（組換えおよび供給源から精製した）フューリンポリペプチドは、任意の適した生物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、齧歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコなどの哺乳類に由来するものであってよく、生物学的に活性なその誘導体であってもよい。ＶＷＦ切断活性を有するフューリンポリペプチドの突然変異型および変異型も包含され、また、機能性断片およびフューリンポリペプチドを含む融合タンパク質も同様に含まれる。さらに、本明細書に記載のフューリンポリペプチドは、精製、検出、またはその両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書に記載のフューリンポリペプチドを、治療用成分またはインビトロまたはインビボで画像化するのに適した成分でさらに修飾してもよい。
細胞培養（例えば、哺乳類細胞の培養）で発現させることによって、タンパク質分解活性をもつ組換えフューリンを調製してもよい。組換えフューリンを調製するための発現および精製方法の非限定的な例が、国際公開第１９９１／０６３１４号、同第１９９２／０９６９８号、米国特許第６，２１０，９２９号および同第６，５９６，５２６号、ならびに米国特許出願第２００９／０１８１４２３号および同第２００９／０３０４６６９号に記載されており、全ての目的のために、これらの内容の全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用する場合、「活性」とは、フューリンまたは完全長（完全な）タンパク質に関連するその一部の機能活性および活性を指す。機能活性には、プロタンパク質基質のタンパク質分解による成熟への関与や、試験物質、例えばＢｏｃ‐Ａｒｇ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐ＡＭＣ（配列番号１；ＡＭＣ＝７‐アミノ‐４‐メトキシクマリン）の切断への関与などの生物学的活性が含まれるがこれらには限定されない。フューリンの基質としては、フォン・ウィルブランド因子、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β１前駆体、プロアルブミン、βセクレターゼ前駆体、膜型マトリックスメタロプロテアーゼ１、および神経成長因子前駆体のβサブユニットが挙げられる。一態様では、１単位（Ｕ）のフューリン活性は、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（配列番号１）から１分間で１ｐｍｏｌのＡＭＣを放出するフューリンの量と定義される。
本明細書で使用する場合、「安定性」（例えばフューリンの安定性またはフューリン製剤の安定性）という用語は、構造に係る文脈で、例えば、タンパク質の構造の保全に関して、または機能に係る文脈で、例えば、タンパク質がその機能および／または活性を長期間保持するその能力に関して使用される。当然のことながら、議論されているタンパク質は、本明細書に記載の方法および組成物に従って製剤中に含有されており、そのタンパク質の安定性とは、その製剤中でのタンパク質の安定性を指す。一態様においてフューリン組成物の安定性は、例えば、検出可能なフューリンの基質、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（配列番号１；例えば、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから上市されているＡＬＸ−２６０−０４０−Ｍ００１）などを使用して、例えば、Ｍａｌｌｏｙ ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９２ Ａｕｇ １５；２６７（２３）：１６３９６−４０２（その内容の全体は、参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されているアッセイで組成物のフューリン活性を測定することによって決定される。一態様では、本明細書に記載したように、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤と共に生成したフューリン組成物の安定性を、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えないで生成したフューリン組成物と比較する。
本明細書で使用する場合、「保存安定性のある」水性フューリン組成物とは、溶液中のタンパク質の安定性が、一定の保存期間にわたって、例えば少なくとも１０％向上するように生成されている、フューリンポリペプチドの溶液（例えば、組換えフューリンポリペプチドの溶液）を指す。本開示では、フューリンポリペプチドの溶液（例えば、組換えフューリンポリペプチドの溶液）は、安定化剤として糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤を加えることによって、「保存安定性」にすることができる。いくつかの態様では、指定された任意の製剤中のフューリンポリペプチドの安定性は、例えば、凝集物の形成、大部分の酵素活性の消失、または分解産物の形成を、一定の期間モニタリングすることによって、測定することができる。製剤の絶対的な安定性、および糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤による安定化の効果は、安定化される特定の組成物によって異なり得る。一態様において、フューリン組成物の安定性は、例えば、検出可能なフューリンの基質、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（配列番号１；例えば、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから上市されているＡＬＸ−２６０−０４０−Ｍ００１）などを使用して、例えば、Ｍａｌｌｏｙ ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９２ Ａｕｇ １５；２６７（２３）：１６３９６−４０２（その内容の全体は、参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されているアッセイで組成物のフューリン活性を測定することによって決定される。一態様では、本明細書に記載したように、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤と共に調製したフューリン組成物の安定性を、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えないで生成したフューリン組成物と比較する。
本明細書で使用する場合、「有効期間」とは、製剤が、予め決められた温度で、予め決められたレベルの安定性を維持する期間を指す。特定の態様では、予め決められた温度とは、冷凍（例えば、−８０℃、−２５℃、０℃）、冷蔵（例えば、０〜１０℃）、または室温（例えば、１８℃〜３２℃）での保存を指す。
本明細書で使用する場合、「安定な期間」という用語は、製剤が安定であると考えられる期間の長さを指す。例えば、ある製剤が安定な期間とは、製剤中のタンパク質の凝集のレベルおよび／またはタンパク質分解のレベルが、一定の閾値よりも（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％など）下に維持されている期間の長さ、および／または製剤が、その製剤の保存期間の最初に有していた活性の量のうち、一定の閾値を（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％など）超えて生物学的活性を維持している期間の長さを指し得る。
本開示の文脈では、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えて生成した、保存安定性のあるフューリンポリペプチド（例えば、組換えフューリンポリペプチド）の水性組成物は、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えないで生成した同じフューリンポリペプチドの組成物よりも、安定な期間が長い。いくつかの態様では、保存安定性のあるフューリンポリペプチドの水性組成物の安定な期間は、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えずに生成した同じ組成物の安定な期間よりも、例えば、少なくとも１０％長いか、または、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％長い、あるいは、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えずに生成した同じ組成物の安定な期間よりも少なくとも２倍長いか、または少なくとも２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、もしくはそれ以上長い。
本明細書で使用する場合、「保存」とは、一度、製剤を調製し、その製剤をすぐに対象に投与、あるいは製造過程に使用しないで、使用前に一定の期間、特定の条件（例えば特定の温度）で維持することを意味する。例えば、フューリン製剤を、数日、数週間、数ヶ月、または数年、様々な温度、例えば冷凍（例えば、−８０℃、−２５℃、０℃）、冷蔵（例えば、０℃〜１０℃）、または室温（例えば、１８℃〜３２℃）で維持し、その後、対象に投与することができる。当然のことながら、そのような製剤は液体製剤であっても凍結乾燥した製剤であってもよい。
本明細書で使用する場合、「約（およそ）」という用語は、明示した値のプラスまたはマイナス１０％のおよその範囲を示す。例えば、「約２０％」という語は、１８〜２２％の範囲を含む。
本明細書で使用する場合、組成物の個々の成分の濃度に関する「Ｘ以下」および「０〜Ｘ」という句は同義であり、０とＸを含む０とＸの間の任意の濃度を指す。例えば、「２％以下の濃度」および「０％〜２％の濃度」という句は同義であり、０％、１％、および２％を含む。
本明細書で使用する場合、組成物の個々の成分の濃度に関する「Ｘ以上」という句は、Ｘまたはそれを上回る任意の濃度を指す。例えば、「９８％以上の濃度」という句は、９８％、９９％、および１００％を含む。
本明細書で使用する場合、組成物の個々の成分の濃度に関する「ＸからＹの間」および「Ｘ〜Ｘ」という句は同義であり、ＸとＹを含む、ＸとＹの間の任意の濃度を指す。例えば、「４９％から５１％の間の濃度」および「４９％〜５１％の濃度」という句は同義であり、４９％、５０％、および５１％を含む。
本明細書で使用する場合、「糖」は、一般式ＣｘＨ２ｙＯｙ（線状）またはＣｘＨ（２ｙ−１）Ｏｙ（環状）を有する単糖、および脱水反応を介して生成される２つの単糖単位を含む二糖を指す。単糖は、含まれる炭素原子の数によって、二炭糖（２）、三炭糖（３）、四炭糖（４）、五炭糖（５）、六炭糖（６）、七炭糖（７）などに分類することができる。従って本明細書で使用する場合、Ｃ（Ｘ）糖とは、Ｘ個の炭素原子を含む糖を指す。例えば、Ｃ（５）糖は五炭糖を指し、Ｃ（６）糖は六炭糖を指す。本明細書で提供する製剤に使用してもよい糖類の非限定的な例としては、二炭糖のグリコールアルデヒド、三炭糖のグリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトン；四炭糖のエリトロース、トレオース、およびエリトルロース；五炭糖のアラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、およびキシルロース；六炭糖のアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、およびタガトース；七炭糖のセドヘプツロース、マンノヘプツロース、およびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ならびにそれらの組み合わせによって形成される可能性のある全ての二糖類、例えば、スクロース、ラクツロース、乳糖、麦芽糖、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、ルチヌロース、およびキシロビオースなどが挙げられるがこれらには限定されない。
本明細書で使用する場合、「糖アルコール」とは、水素化された形態の単糖または二糖を指し、これらのカルボニル基は還元されて、第一ヒドロキシル基または第二ヒドロキシル基を形成している。一態様では、糖アルコールは約４個から約８個の炭素原子を含んでいる。本明細書で提供する製剤中で使用してもよい糖アルコールの非限定的な例としては、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、リビトール、フシトール、イジトール、ボルミトール（ｖｏｌｍｉｔｏｌ）、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、製剤中に含まれる、対象（例えばヒト）に投与しても安全な塩を指す。薬学的に許容される塩の選択や使用は当該分野においてよく知られている。例えば、Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ， ２ｎｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。ある態様において薬学的に許容される塩とは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはそれらの組み合わせである。
本明細書で使用する場合、「非イオン性界面活性剤」という用語は、生理学的に関連のある条件で非イオン化される界面活性剤を指す。本明細書で提供する安定化された水性フューリン組成物に有用な非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド（例えば、ジカプリル酸／ジカプリン酸プロピレングリコール（例えばＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８４０）、中鎖モノグリセリドおよびジグリセリド（例えばＣＡＰＭＵＬ（登録商標）およびＩＭＷＩＴＯＲ（登録商標）７２）、中鎖トリグリセリド（例えばカプリル酸トリグリセリドおよびカプリン酸トリグリセリド、例えばＬＡＶＲＡＦＡＣ、ＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１０または８１２、ＣＲＯＤＡＭＯＬ（登録商標）ＧＴＣＣ−ＰＮ、およびＳＯＦＴＩＳＯＮ３７８など）、長鎖モノグリセリド（例えばモノオレイン酸グリセリル、例えばＰＥＣＥＯＬ（登録商標）、およびモノリノール酸グリセリル、例えばＭＡＩＳＩＮＥ（登録商標））、ポリオキシヒマシ油（例えばリシノール酸マクロゴールグリセロール、ヒドロキシステアリン酸マクロゴールグリセロール、マクロゴールセトステアリルエーテル））；ポリエチレングリコールの非イオン性で水溶性のモノ脂肪酸エステルおよびジ脂肪酸エステル；非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ソルビタン、例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ＴＷＥＥＮ２０）およびモノラウリン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ２０）；モノパルミチン酸ソルビタン、例えばモノパルミチン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ＴＷＥＥＮ４０）およびモノパルミチン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ４０）；モノステアリン酸ソルビタン、例えばモノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ＴＷＥＥＮ６０）およびモノステアリン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ６０）；モノオレイン酸ソルビタン、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ＴＷＥＥＮ８０）およびモノオレイン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ８０）；ソルビタントリオレエート、例えばソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ８５）；およびトリステアリン酸ソルビタン、例えばトリステアリン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ６５））；ポリグリコール化グリセリド（例えば，ラウロイル・マクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ（登録商標）Ｍ２１３０ＣＳ）；ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００コハク酸塩（ＴＰＧＳ）、ポリエチレングリコール６６０ １２−ヒドロキシステアラート（ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ１５）、オレイン酸ポリオキシルおよびステアリン酸ポリオキシル（例えばモノステアリン酸ＰＥＧ４００およびモノステアリン酸ＰＥＧ１７５０））；非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体（例えばポリ（エチレンオキシド）／ポリ−（プロピレンオキシド）／ポリ（エチレンオキシド）トリブロック共重合体、例えばオキシランであるＢＨＴを含むメチル−オキシラン重合体（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−１２７））が挙げられる。
一態様では、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、非イオン性で水溶性のジグリセリド、非イオン性で水溶性のトリグリセリド、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのモノ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのジ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、非イオン性ポリグリコール化グリセリド、非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体、およびそれらの組み合わせから選択される非イオン性界面活性剤を含む、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）の組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、「生物学的に活性な誘導体」という用語は、フューリンポリペプチドに関して使用される場合、組換えＤＮＡ技術から得られたポリペプチドも包含する。組換えＤＮＡ技術には、（ｉ）遺伝子操作、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅によって組換えＤＮＡを生産するため、（ｉｉ）形質転換、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介して組換えＤＮＡを原核細胞または真核細胞に導入するため、（ｉｉｉ）形質転換された前記細胞を、例えば、持続的な様式またはバッチ式の様式で培養するため、（ｉｖ）フューリンタンパク質を、例えば、恒常的にまたは誘導した際に発現させるため、ならびに（ｖ）前記フューリンタンパク質を、例えば培地から、または形質転換された細胞を回収することで単離するため、（ｖｉ）例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって、実質的に精製された組換えフューリンタンパク質を得るための、当該分野で知られているいかなる方法もが含まれる。「生物学的に活性な誘導体」という用語にはキメラ分子も含まれ、キメラ分子としては、例えば、哺乳動物（特にヒト）の循環系でのフューリンタンパク質の半減期などの生物学的／薬理学的な特性を向上させるために第二のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンＦｃドメインまたはアルブミンドメイン）と組み合わされたフューリンタンパク質またはその機能性断片などが挙げられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数を表す「１つ（a）」、「１つ（an）」、および「その（the）」は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象も含む。従って、例えば、「緩衝剤（a buffering agent）」との言及は、１種類の薬剤またはそのような薬剤の混合物を指し、また、「その方法」との言及は、当業者に知られている、均等な工程および方法などへの言及も含むものである。
特段の規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書で言及した全ての出版物は、それらの出版物に記載されており、かつ、本明細書で説明する発明に関連して使用される場合のある、装置、組成物、製剤、および方法論を説明し、開示する目的で、参照することにより本明細書に組み入れられる
数値範囲が示される場合には、当然のことながら、その範囲の上限と下限の間にある各中間値（そうでないことが文脈に明確に示されていない場合には下限の単位の１０分の１まで）及びその示された範囲にある任意の他の示された値又は中間値が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限と下限は独立してそれらのより小さい範囲に含まれる場合があり、かつ、それらもまた本発明に包含され、その示された範囲中で特に除外されたいかなる限定にも依存する。示した範囲が片方又は両方の限定を含む場合、その含まれる範囲の片方又は両方を除いた範囲もまた本発明に含まれる。
本明細書で使用する場合、「ＢＤＳ」は、「原薬（Ｂｕｌｋ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」を指す。
ＩＩＩ．安定化された組換えフューリンの水性組成物
一側面において、本開示は、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）の水性製剤を提供する。以下の態様は、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えると、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を欠いた組成物よりも、水性フューリン組成物が安定化されるという発見に部分的に基づいている。
一側面において、本開示は、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）の水性製剤を提供する。以下の態様は、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を加えると、糖、糖アルコール、および／または非イオン性界面活性剤を欠いた組成物よりも、水性フューリン組成物が安定化されるという発見に部分的に基づいている。
当業者であれば分かるように、本明細書で提供される態様に従って調合されたフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）は、明示的に開示した成分に加えて、溶液の成分またはｐＨ調整剤を加えたことによる対イオン、例えば、酢酸塩、水酸化ナトリウム、もしくは水酸化カリウムによる、ナトリウムもしくはカリウム、または塩化カルシウムまたは塩酸による塩化物を含み得る。本開示では、所定の製剤からなるまたは本質的に所定の製剤からなる保存安定性のあるフューリン組成物（例えば、組換えフューリン）は、特定のｐＨでの製剤加工によって必然的に生じる１種以上の対イオンをさらに含み得る。
一態様では、本明細書で提供する保存安定性のあるフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）は、室温（つまり、１８℃〜３２℃の間）で一定の期間安定である。例えば、一態様では、保存安定性のある水性免疫グロブリン組成物は、室温で保存した場合に、少なくとも４日間安定である。他の態様では、組成物は、室温では少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日間、またはそれ以上の日数、安定である。他の態様において組成物は、少なくとも１ヶ月安定である。さらに他の態様では、組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月、またはそれ以上の期間、安定である。ある態様において、室温とは、２０℃から３０℃の間、２１℃から２９℃の間、２２℃から２８℃の間、２３℃から２７℃の間、２４℃から２６℃の間、または約２５℃を指す。具体的な態様では、組成物は２０℃から２５℃の間の温度で保存した場合に、長期間安定である。
一態様では、本明細書で提供する保存安定性のあるフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）は、冷蔵温度（つまり２℃から１０℃の間）で一定の期間安定である。例えば一態様では、保存安定性のある水性免疫グロブリン組成物は、冷蔵温度で保存した場合に、少なくとも４日間安定である。他の態様では、組成物は冷蔵温度では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日間、またはそれ以上の日数、安定である。他の態様では、組成物は少なくとも１ヶ月間、安定である。さらに他の態様では、組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月、またはそれ以上の期間、安定である。具体的な態様では、組成物は、２℃から８℃の間の温度で保存した場合に、長期間安定である。
一態様では、本明細書で提供する保存安定性のあるフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）は、高温（つまり３２℃から４２℃の間）で一定の期間安定である。例えば一態様では、保存安定性のある水性免疫グロブリン組成物は、高温で保存した場合に、少なくとも４日間安定である。他の態様では、組成物は高温で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日間、またはそれ以上の日数安定である。他の態様では、組成物は少なくとも１ヶ月安定である。さらに他の態様では、組成物は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月、またはそれ以上の期間、安定である。具体的な態様では、組成物は３５℃から４０℃の間の温度で保存した場合に長期間安定である。
一態様では、保存されたフューリン組成物は、組成物が保存期間の開始時（例えば、０時点）に示したフューリン活性の少なくとも４０％を維持する限り、保存安定性があると見なされる。別の態様では、保存された組成物は、組成物が保存期間の開始時（例えば、０時点）に示したフューリン活性の少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を維持する限り、安定であると見なされる。一態様では、フューリン活性は、Ｍａｌｌｏｙ ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９２ Ａｕｇ １５；２６７（２３）：１６３９６−４０２に記載されているアッセイでの測定値である。
一態様では、一定の期間保存した後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物が含むフューリン活性が、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１０％高い場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。他の態様では、一定の期間保存した後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物が、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上のパーセンテージのフューリン活性を有する場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。
一態様では、保存されたフューリン組成物は、凝集した状態で存在するフューリンのパーセンテージが５０％以下に維持されている場合に、安定であると見なされる。他の態様では、保存されたフューリン組成物は、凝集した状態で存在するフューリンのパーセンテージが４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に維持されている場合に、安定であると見なされる。
一態様では、一定の期間保存した後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物中に凝集した状態で存在するフューリンが、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１０％少ない場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。他の態様では、一定の期間保存した後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物中に凝集した状態で存在するフューリンが、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％少ない、またはそれ以上のパーセンテージ少ない場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。
一態様では、保存されたフューリン組成物は、機械的ストレスに曝された後に、最初の（例えば、０時点での）フューリン活性の少なくとも４０％を維持している限り、安定であると見なされる。別の態様では、保存された組成物は、機械的ストレスに曝された後に、最初の（例えば、０時点での）のフューリン活性の４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を維持している限り、安定であると見なされる。具体的な態様では、機械的ストレスは撹拌（例えば、振とう）である。
一態様では、機械的ストレスに曝された後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物が有するフューリン活性が、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１０％高い場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。他の態様では、機械的ストレスに曝された後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物が、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上のパーセンテージ高いフューリン活性を有する場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。具体的な態様では、機械的ストレスは撹拌（例えば、振とう）である。
一態様では、保存されたフューリン組成物は、機械的ストレスに曝された後に、凝集した状態で存在するフューリンのパーセンテージが５０％以下に維持されている限り、安定であると見なされる。他の態様では、保存されたフューリン組成物は、機械的ストレスに曝された後に、凝集した状態で存在するフューリンのパーセンテージが４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に維持されている限り、安定であると見なされる。具体的な態様では、機械的ストレスは撹拌（例えば、振とう）である。
一態様では、機械的ストレスに曝された後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物中に凝集した状態で存在するフューリンが、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１０％少ない場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。他の態様では、機械的ストレスに曝された後に、安定化剤（例えば、糖、糖アルコール、または非イオン性界面活性剤）を含むフューリン組成物中に凝集した状態で存在するフューリンが、安定化剤を含まないフューリン組成物またはより少量の安定化剤を含むフューリン組成物よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上のパーセンテージ少ない場合に、そのフューリン組成物は安定化剤の添加によって安定化されていると見なす。具体的な態様では、機械的ストレスは撹拌（例えば、振とう）である。
本出願に記載のフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を、凍結乾燥し、その後、指定された濃度に再構成することができるが、当然のことながら、これらの調製物を、より希釈した形態で再構成することもできる。例えば、凍結乾燥され、かつ／または通常は２ｍＬの溶液で再構成される本開示による製剤を、より多量の希釈剤、例えば５ｍＬの希釈剤で再構成することもできる。同様に、凍結乾燥されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を、より高濃度の形態で再構成することもできる。例えば、凍結乾燥され、かつ／または通常は２ｍＬの溶液で再構成される本開示による製剤を、より少量、例えば１ｍＬで再構成することもできる。
有利なことに、一側面では、本発明の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を、得られる組成物を製造方法、例えばｒＶＷＦの成熟（本明細書では「ｒＶＷＦ成熟法」とも呼ぶ）に使用する場合に、フューリンの回収が高まる希釈剤と併用する。前駆フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）をその活性化形態に成熟させるには、２つの塩基性アミノ酸対（−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−）の後ろ、７６３番目の残基でのタンパク質分解が必要である。ｖＷＦが主に、二塩基性アミノ酸対切断酵素であるフューリンによるプロセシングを受けることが分かっている。従って、ｖＷＦの生産過程には、フューリンの使用が、好ましくは高度に安定化された製剤中でのフューリンの使用が含まれる。さらなる側面では、この希釈剤に入れられた高度に安定化された製剤の、ｒＶＷＦ成熟工程でのフューリン活性の回収は、対照希釈剤に入れられた対照製剤よりも３倍から４倍高まる。
一定の側面では、本発明の高度に安定化された製剤の有効期間は、少なくとも６ヶ月である。当然のことながら、この有効期間は、液状または凍結乾燥された形態で、凍結温度（つまり−８０℃、−２５℃、０℃）であっても、冷蔵温度（０℃〜１０℃）であっても、または室温（２０℃〜３２℃）であってもよい。さらなる側面では、本発明の高度に安定化された製剤の有効期間は、少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、または６０ヶ月である。
さらなる側面では、また、上記に従って、有効期間は、上述した任意の温度で上述した任意の期間保存した後に維持されている活性（％）によって決定される。ある態様において、有効期間とは、本発明に記載のアッセイまたは当該分野で知られているアッセイのいずれかで測定した場合に、製剤が、上述した任意の期間、上述した任意の温度で保存する前の活性と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のフューリン活性を保持することを意味している。
一側面において、本開示の高度に安定化されたフューリン（例えば，組換えフューリン）製剤は、（ａ）８，０００Ｕ／ｍＬ〜５７，０００Ｕ／ｍＬのフューリン（例えば、組換えフューリン）；（ｂ）１９０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｃ）０．９２ｍＭの塩化カルシウム；（ｄ）１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物；（ｅ）７５ｐｐｍのポリソルベート８０；（ｆ）４５ｍＭの酢酸；および（ｇ）４６ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
特定の側面において、本開示の高度に安定化された製剤は、４７ｍＭのＨＥＰＥＳ、４６ｍＭの酢酸、１９５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０９４ｍＭの塩化カルシウム、０．００７５％のポリソルベート８０、１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物を含み、ｐＨは６．０である。
さらなる側面では、本開示の高度に安定化されたフューリン（組換えフューリンなど）製剤は、（ａ）約５，５００Ｕ／ｍＬ〜５５，０００Ｕ／ｍＬ、６，０００Ｕ／ｍＬ〜５０，０００Ｕ／ｍＬ、６，５００Ｕ／ｍＬ〜４５，０００Ｕ／ｍＬ、７，０００Ｕ／ｍＬ〜４０，０００Ｕ／ｍＬ、７，５００Ｕ／ｍＬ〜３５，０００Ｕ／ｍＬ、８，０００Ｕ／ｍＬ〜３０，０００Ｕ／ｍＬ、８，５００Ｕ／ｍＬ〜２５，０００Ｕ／ｍＬ、９，０００Ｕ／ｍＬ〜２０，０００Ｕ／ｍＬ、９，５００Ｕ／ｍＬ〜１５，０００Ｕ／ｍＬ、または１０，０００Ｕ／ｍＬのフューリン；（ｂ）約１００ｍＭ〜３００ｍＭ、１１０ｍＭ〜２８０ｍＭ、１２０ｍＭ〜２６０ｍＭ、１３０ｍＭ〜２４０ｍＭ、１４０ｍＭ〜２２０ｍＭ、１５０ｍＭ〜２００ｍＭ、または１６０ｍＭ〜１８０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｃ）約０．５ｍＭ〜９ｍＭ、１ｍＭ〜８ｍＭ、１．５ｍＭ〜７ｍＭ、２ｍＭ〜６ｍＭ、２．５ｍＭ〜５ｍＭ、または３ｍＭ〜４．５ｍＭの塩化カルシウム；（ｄ）約０．５％〜１９％、１％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、５．５％〜９％、または６．０％〜８％のトレハロース二水和物；（ｅ）約０．５ｐｐｍ〜１４０ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ〜１２０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、４０ｐｐｍ〜９５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍ、５５ｐｐｍ〜８５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍ、または７０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍのポリソルベート８０；（ｆ）約２５ｍＭ〜９０ｍＭ、３０ｍＭ〜８０ｍＭ、３５ｍＭ〜７０ｍＭ、４０ｍＭ〜６０ｍＭ、または４５ｍＭ〜５０ｍＭの酢酸、および（ｇ）１５ｍＭ〜９５ｍＭ、２０ｍＭ〜９０ｍＭ、２５ｍＭ〜８５ｍＭ、３０ｍＭ〜８０ｍＭ、３５ｍＭ〜７５ｍＭ、４０ｍＭ〜７０ｍＭ、４５ｍＭ〜６５ｍＭ、または５０ｍＭ〜６０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
一側面において、本開示は、フューリン（例えば、組換えフューリン）、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、５０ｍＭ〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜１０ｍＭのカルシウム、および緩衝剤を含む、ｐＨが５．５〜７．５の安定化された水性フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を提供する。具体的な態様では、糖は五炭糖または六炭糖である。
一態様では、安定化された水性フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、フューリン（例えば、組換えフューリン）、１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム；２％〜２０％の糖または糖アルコール；１００〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、ｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖は五炭糖または六炭糖である。
具体的な態様では、本発明の高度に安定化された製剤は、４７ｍＭのＨＥＰＥＳ、４６ｍＭの酢酸、１９５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０９４ｍＭの塩化カルシウム、０．００７５％のポリソルベート８０、１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物を含み、ｐＨは６．０である。
別の具体的な態様では、本発明の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は、（ａ）８，０００〜５７，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリン；（ｂ）１９０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｃ）０．９２ｍＭの塩化カルシウム；（ｄ）１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物；（ｅ）７５ｐｐｍのポリソルベート８０；（ｆ）４５ｍＭの酢酸；および（ｇ）４６ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
Ａ．安定化剤
有利なことに、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤の添加により、水性フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物が安定化されることが分かった。これらの効果を、本明細書で提供する実施例において示す。例えば、これらの薬剤を加えると、液体で保存した際のフューリン活性の保持が向上し、液体で保存した際のフューリンポリペプチドの凝集が低減され、液体で保存した際のフューリンポリペプチドの分解が低減され、水性フューリン組成物を撹拌した際のフューリン活性の消失が低減され、かつ水性フューリン組成物を撹拌すると生じる凝集が低下する。
有利なことに、糖類、糖アルコール、および非イオン性界面活性剤の添加により、水性フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物が安定化されることが分かった。これらの効果を、本明細書で提供する実施例において示す。例えば、これらの薬剤を加えると、液体で保存した際のフューリン活性の保持が向上し、液体で保存した際のフューリンポリペプチドの凝集が低減され、液体で保存した際のフューリンポリペプチドの分解が低減され、水性フューリン組成物を撹拌した際のフューリン活性の消失が低減され、かつ水性フューリン組成物を撹拌すると生じる凝集が低下する。
従って一態様では、本開示は、２％〜２０％の糖または糖アルコールと１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む水性フューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）を提供する。別の態様では、組成物は、２％〜１０％の糖または糖アルコールと１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の態様では、組成物は、１０±２％の糖または糖アルコールと７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。具体的な態様では、組成物は、１０％の糖または糖アルコールと７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。さらに他の態様では、組成物は、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせを含む。
（表１）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表２）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表３）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表４）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表５）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表６）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表７）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表８）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
（表９）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、糖または糖アルコールの濃度と非イオン性界面活性剤の濃度の組み合わせの例示的な態様。
Var.＝バリエーション
１．糖類および糖アルコール
有利なことに、糖および／または糖アルコールをフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）に加えると、その組成物の保存安定性が高まることが分かった。例えば、図１７〜２０および図２２〜２５に示すように、僅か２％の糖および／または糖アルコールを加えるだけでも、フューリン組成物の保存安定性を少なくとも２０％向上させることができる。また、１０％の糖および／または糖アルコールを加えることで、フューリン組成物の保存安定性を少なくとも７５％向上させることができる。従って、本開示の一側面では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、安定化させる量の糖および／または糖アルコールを含む。
有利なことに、糖および／または糖アルコールをフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）に加えると、その組成物の保存安定性が高まることが分かった。例えば、図１７〜２０および図２２〜２５に示すように、僅か２％の糖および／または糖アルコールを加えるだけでも、フューリン組成物の保存安定性を少なくとも２０％向上させることができる。また、１０％の糖および／または糖アルコールを加えることで、フューリン組成物の保存安定性を少なくとも７５％向上させることができる。従って、本開示の一側面では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、安定化させる量の糖および／または糖アルコールを含む。
一態様では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、単糖を含む。特定の態様では、単糖は、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、および八炭糖からなる群より選択される。特定の態様では、糖は、五炭糖、六炭糖、またはその組み合わせである。具体的な態様では、糖は六炭糖である。
別の態様では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は二糖を含む。特定の態様では、二糖は、五炭糖および／または六炭糖から形成される二糖から選択される。別の特定の態様では、糖は、六炭糖から形成される二糖から選択される。一態様において糖は、スクロース、トレハロース、またはその組み合わせである。具体的な一態様では、糖はスクロースである。別の具体的な態様では、糖はトレハロースである。一態様では、糖はトレハロース二水和物として調合される。
別の態様では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は糖アルコールを含む。特定の態様では、糖アルコールは、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、リビトール、フシトール、イジトール、ボルミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールから選択される。別の特定の態様では、糖アルコールはマンニトールである。
さらに別の態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、糖と糖アルコールの混合物を含む。一態様では、この混合物は、単糖、二糖、および糖アルコールのうちの少なくとも２種類を含む。別の態様では、混合物は、五炭糖、六炭糖、五炭糖および／または六炭糖から形成される二糖、ならびに糖アルコールのうちの少なくとも２種類を含む。別の態様では、混合物は、スクロース、トレハロース、およびマンニトールのうちの少なくとも２種類を含む。
一態様では、糖または糖アルコールの濃度は、２％〜２０％、２％〜１７．５％、２％〜１５％、２％〜１２．５％、２％〜１０％、２％〜９％、２％〜８％、２％〜７％、５％〜２０％、５％〜１７．５％、５％〜１５％、５％〜１２．５％、５％〜１０％、７．５％〜２０％、７．５％〜１７．５％、７．５％〜１５％、７．５％〜１２．５％、１０％〜２０％、１０％〜１７．５％、１０％〜１５％、４±２％、５±２％、６±２％、７±２％、８±２％、９±２％、１０±２％、１１±２％、１２±２％、１３±２％、１４±２％、１５±２％、１６±２％、１７±２％、１８±２％、３±１％、４±１％、５±１％、６±１％、７±１％、８±１％、９±１％、１０±１％、１１±１％、１２±１％、１３±１％、１４±１％、１５±１％、１６±１％、１７±１％、１８±１％、１９±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０ｍＭ〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は、８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％のトレハロース、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択されるトレハロースと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜２０％のトレハロース、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択されるトレハロースと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％の糖または糖アルコールを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、１０〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％の糖または糖アルコールを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％のトレハロース、１０〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％のトレハロースを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％のトレハロースを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％のトレハロースを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択されるトレハロースと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％の糖または糖アルコールを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％の糖または糖アルコールを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％の糖または糖アルコールを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０±５％のトレハロース、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±２％のトレハロースを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０±１％のトレハロースを含む。別の具体的な態様では、組成物は１０％のトレハロースを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択されるトレハロースと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
いくつかの態様では、本開示の製剤で使用される安定化剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、およびアルギニンを含むがこれらには限定されない群から選択される。これらの薬剤は本発明の製剤中に、０．１％〜２０％の量で含まれる。ある態様において安定化剤の量は５％〜１５％であるか、または約１０％である。さらなる態様では、本開示の製剤には、０．５％〜１９％、１％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、５．５％〜９％、または６．０％〜８％の量の安定化剤が含まれる。一定の製剤には、マンニトール、スクロース、および／またはトレハロースと、本明細書で開示した、製剤の他の成分のいずれか１種類以上が含まれる。
２．非イオン性界面活性剤
有利なことに、糖、非イオン性界面活性剤をフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）に加えると、この組成物の機械的ストレスに対する安定性が高まることが分かった。例えば、図３１〜４２に示すように、僅か１０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えるだけでも、機械的ストレスに曝されたフューリン組成物の安定性を少なくとも２５％向上させることができる。また、５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えることで、機械的ストレスに曝されたフューリン組成物の安定性を少なくとも４０％向上させることができる。従って、本開示の一側面では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、安定化させる量の非イオン性界面活性剤を含む。
有利なことに、糖、非イオン性界面活性剤をフューリン組成物（例えば、組換えフューリン組成物）に加えると、この組成物の機械的ストレスに対する安定性が高まることが分かった。例えば、図３１〜４２に示すように、僅か１０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えるだけでも、機械的ストレスに曝されたフューリン組成物の安定性を少なくとも２５％向上させることができる。また、５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えることで、機械的ストレスに曝されたフューリン組成物の安定性を少なくとも４０％向上させることができる。従って、本開示の一側面では、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、安定化させる量の非イオン性界面活性剤を含む。
一態様では、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、非イオン性で水溶性のジグリセリド、非イオン性で水溶性のトリグリセリド、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのモノ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのジ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、非イオン性ポリグリコール化グリセリド、非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体、およびそれらの組み合わせから選択される非イオン性界面活性剤を含む、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を提供する。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、非イオン性界面活性剤は、１０〜２００ｐｐｍ、１０〜１７５ｐｐｍ、１０〜１５０ｐｐｍ、１０〜１２５ｐｐｍ、１０〜１００ｐｐｍ、１０〜９０ｐｐｍ、１０〜８０ｐｐｍ、１０〜７５ｐｐｍ、１０〜７０ｐｐｍ、１０〜６０ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、１０〜２５ｐｐｍ、２５〜２００ｐｐｍ、２５〜１７５ｐｐｍ、２５〜１５０ｐｐｍ、２５〜１２５ｐｐｍ、２５〜１００ｐｐｍ、２５〜９０ｐｐｍ、２５〜８０ｐｐｍ、２５〜７０ｐｐｍ、２５〜６０ｐｐｍ、２５〜５０ｐｐｍ、５０〜２００ｐｐｍ、５０〜１７５ｐｐｍ、５０〜１５０ｐｐｍ、５０〜１２５ｐｐｍ、５０〜９０ｐｐｍ、５０〜８０ｐｐｍ、７５〜２００ｐｐｍ、７５〜１７５ｐｐｍ、７５〜１５０ｐｐｍ、１００〜２００ｐｐｍ、１００〜１７５ｐｐｍ、５０±２５ｐｐｍ、６０±２５ｐｐｍ、７０±２５ｐｐｍ、７５±２５ｐｐｍ、８０±２５ｐｐｍ、９０±２５ｐｐｍ、１００±２５ｐｐｍ、１２５±２５ｐｐｍ、１５０±２５ｐｐｍ、１７５±２５ｐｐｍ、３０±１０ｐｐｍ、４０±１０ｐｐｍ、５０±１０ｐｐｍ、６０±１０ｐｐｍ、７０±１０ｐｐｍ、７５±１０ｐｐｍ、８０±１０ｐｐｍ、９０±１０ｐｐｍ、１００±１０ｐｐｍ、１１０±１０ｐｐｍ、１２０±１０ｐｐｍ、１２５±１０ｐｐｍ、１３０±１０ｐｐｍ、１４０±１０ｐｐｍ、１５０±１０ｐｐｍ、１６０±１０ｐｐｍ、１７０±１０ｐｐｍ、１７５±１０ｐｐｍ、１８０±１０ｐｐｍ、１９０±１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、７５ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１１０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、１３０ｐｐｍ、１４０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ、１７０ｐｐｍ、１７５ｐｐｍ、１８０ｐｐｍ、１９０ｐｐｍ、または２００ｐｐｍの濃度で含まれる。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０ｍＭ〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。具体的な一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。さらに別の具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルであり、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルの組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００ｍＭ〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。さらに別の具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルであり、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１００〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルの組み合わせ、１０ｍＭ〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、７５±２５％非イオン性界面活性剤、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性にされたフューリン組成物は、２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍ非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。さらに別の具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルであり、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルの組み合わせ、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、７５±２５％非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、２％〜１０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍ非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。具体的な一態様では、組成物は７５±１５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。別の具体的な態様では、組成物は７５±５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。別の具体的な態様では、組成物は７５ｐｐｍの非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性界面活性剤の組み合わせ、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。さらに別の具体的な態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルであり、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、表１〜表９に見られるバリエーション１〜６０３５から選択される糖または糖アルコールと非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルの組み合わせ、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。別の具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。さらに別の具体的な態様では、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
好ましくは、本発明のフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物はさらに、界面活性剤を、好ましくは非イオン性界面活性剤を、好ましくは０．１ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍ、または６５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍ、または約７５ｐｐｍの量で含む。さらなる態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、０．５ｐｐｍ〜１４０ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ〜１２０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、４０ｐｐｍ〜９５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍ、５５ｐｐｍ〜８５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍ、または７０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍの量の界面活性剤を含む。ある態様において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プルロニックポリオール、グリセロール、グルカミド（Ｍｅｇａ８など）、トリトン、およびＢｒｉｊ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）からなる群より選択される。いくつかの等級のプルロニックポリオール（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造され、Ｐｌｕｒｏｎｉｃという登録商標で販売されている）が使用可能である。分子量（１，０００〜１６，０００以上）や物理化学的な特徴によって分類されているこれらのポリオールは界面活性剤として使用されている。分子量が５，０００のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−３８と分子量が９，０００のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８は両方とも、（重量で）８０パーセントの親水性ポリオキシエチレン基と２０パーセントの疎水性ポリオキシプロピレン基を含んでいる。一態様では、界面活性剤はポリソルベート８０である。特定の態様では、ポリソルベート８０は、植物性のポリソルベート８０である。
Ｂ．薬学的に許容される塩
本明細書で提供する安定なフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、全般的に、保存している間、フューリンポリペプチドが耐えられる濃度の薬学的に許容される塩を含む。一態様では、薬学的に許容される塩は塩化物塩である。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は、一価の塩化物塩である。より具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。
本明細書で提供する安定なフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、全般的に、保存している間、フューリンポリペプチドが耐えられる濃度の薬学的に許容される塩を含む。一態様では、薬学的に許容される塩は塩化物塩である。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は、一価の塩化物塩である。より具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。
一態様では、本明細書で提供する安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物に含まれる薬学的に許容される塩の濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。別の態様では、薬学的に許容される塩の濃度は１００ｍＭ〜３００ｍＭである。別の態様では、薬学的に許容される塩の濃度は１５０ｍＭ〜２５０ｍＭである。さらに他の態様では、本明細書で提供する安定なフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物に含まれる薬学的に許容される塩の濃度は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される。
（表１０）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な、薬学的に許容される塩濃度の例。
Var.＝バリエーション
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。一態様では、緩衝剤の濃度は９０±２５ｍＭである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される濃度の薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０％の糖または糖アルコール、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつｐＨは６．０±０．２である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
いくつかの態様では、一価の塩化物塩、例えば塩化ナトリウムや塩化カリウムを、本開示の製剤に使用する。一価の塩化物塩を含有する製剤成分を、主に塩化ナトリウムの観点から記載するが、当然のことながら、塩化ナトリウムに関する本明細書の記載に従って、塩化カリウムを含む任意の一価の塩化物塩を使用してもよい。ある態様では、５０〜５００ｍＭの量の塩化ナトリウムが本製剤に含まれる。他の態様では、１００〜３００ｍＭ、１５０〜２５０ｍＭ、または約１９０ｍＭの量の塩化ナトリウムが製剤に含まれる。さらなる態様では、１００〜３００ｍＭ、１１０〜２８０ｍＭ、１２０〜２６０ｍＭ、１３０〜２４０ｍＭ、１４０〜２２０ｍＭ、１５０〜２００ｍＭ、または１６０〜１８０ｍＭの量の塩化ナトリウムが製剤に含まれる。具体的な態様では、製剤は１９０ｍＭの塩化ナトリウムを、本明細書で開示する１種類以上の任意の他の製剤成分と共に含む。
Ｃ．緩衝剤
有利なことに、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物が６．０〜７．０のｐＨで安定することが分かった。例えば、図１１および１２に示すように、ｐＨ５．５で調合されたフューリン組成物は、ｐＨ５．０で調合されたフューリン組成物よりも安定である。ｐＨ６．０で調合されたフューリン組成物はｐＨ５．５で調合された組成物よりもさらに安定であることも示されている。さらに、図１７に示すように、ｐＨ７．０のフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、ｐＨ６．０で調合された組成物と同程度の安定性を有する。
有利なことに、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物が６．０〜７．０のｐＨで安定することが分かった。例えば、図１１および１２に示すように、ｐＨ５．５で調合されたフューリン組成物は、ｐＨ５．０で調合されたフューリン組成物よりも安定である。ｐＨ６．０で調合されたフューリン組成物はｐＨ５．５で調合された組成物よりもさらに安定であることも示されている。さらに、図１７に示すように、ｐＨ７．０のフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、ｐＨ６．０で調合された組成物と同程度の安定性を有する。
従って、ある態様では、本明細書で提供する安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５．５〜７．５のｐＨで調合される。具体的な態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は６．０〜７．０のｐＨで調合される。別の具体的な態様では、安定化されたフューリン組成物は、６．０±０．２のｐＨで調合される。より具体的な態様では、安定化されたフューリン組成物はｐＨ６．０で調合される。さらに他の態様では、安定化されたフューリン組成物は、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨで調合される。
（表１１）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用なｐＨの範囲の例。
Var.＝バリエーション
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、保存安定性にされたフューリン組成物は、２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９０±２５ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９１ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０％の糖または糖アルコール、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、９１ｍＭの緩衝剤を含み、かつ、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化された本明細書で提供するフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、適切なｐＨで、１種類以上の緩衝剤を使用して調合される。一態様では、１種類以上の緩衝剤は、ヒスチジン、イミダゾール、リン酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ、酢酸塩（例えば、酢酸）、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。
緩衝剤は、長期（例えば数週間、数ヶ月、または数年）にわたる保存の間、組成物のｐＨを維持するのに適した濃度で、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物中に含まれる。一態様では、製剤に含まれる緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜３００ｍＭである。別の態様では、製剤に含まれる緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜２００ｍＭである。具体的な態様では、製剤に含まれる緩衝剤の濃度は９０±２５ｍＭである。さらに他の態様では、組成物に含まれる緩衝剤の濃度は、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される。
（表１２）フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を安定化するのに有用な緩衝剤の濃度の例（ｍＭ）。
Var.＝バリエーション
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は２％〜２０％の糖または糖アルコールをさらに含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、保存安定性のあるフューリン組成物は１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤をさらに含む。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜２０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜５００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、２％〜１０％の糖または糖アルコール、１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、５０〜３００ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９０±５０ｍＭの薬学的に許容される塩、０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、１０±５％の糖または糖アルコール、７５±２５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
一態様では、安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、１９１ｍＭの薬学的に許容される塩、０．９ｍＭのカルシウム、１０％の糖または糖アルコール、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤、表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される濃度の緩衝剤を含み、かつｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）であり、糖または糖アルコールはトレハロースである。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。一態様では、組成物のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、組成物のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、組成物のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、組成物のｐＨは６．０である。具体的な態様では、組成物は８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬの組換えフューリンを含む。
本発明の製剤には、緩衝液も、本明細書に記載の１種類以上の任意の他の製剤成分と合わせて含まれ得る。実施例で示すように、本発明の高度に安定化された製剤は、ｐＨ６．０で高い安定性を示す。ある態様では、高度に安定化された製剤のｐＨを６．０〜８．０の範囲に、または約６．０に維持することが好ましい。緩衝剤は、緩衝剤として機能する能力を有する、任意の生理学的に許容可能な化学物質または化学物質の組み合わせであってもよく、例えば、ヒスチジン、イミダゾール、リン酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、酢酸塩、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、およびＡＣＥＳが含まれるがこれらには限定されない。このような緩衝剤の多くの完全な化学名を下記表１３に挙げる。ある態様では、製剤中に約５ｍＭを超えるカルシウムが含まれている場合には、緩衝剤としてリン酸は使用されない。いくつかの態様では、緩衝剤は、１０ｍＭ〜２００ｍＭ、または１０〜１００ｍＭ、もしくは３０〜６０ｍＭ、または約４６ｍＭの濃度で含まれる。さらなる態様では、含まれるそれぞれの緩衝剤の濃度が、１５〜９５ｍＭ、２０〜９０ｍＭ、２５〜８５ｍＭ、３０〜８０ｍＭ、３５〜７５ｍＭ、４０〜７０ｍＭ、４５〜６５ｍＭ、または５０〜６０ｍＭである。ある態様では、製剤は２種類の緩衝剤を含む。
（表１３）緩衝剤の例
一定の側面では、本製剤は、本明細書に記載の１種類以上の製剤成分と合わせて、カルボン酸を含む。さらなる側面では、カルボン酸は好ましくは酢酸（例えば、酢酸塩）である。ある態様では、製剤には、２０ｍＭ〜１００ｍＭの酢酸、または３０ｍＭ〜５０ｍＭ、もしくは約４５ｍＭの酢酸、または任意の他のカルボン酸が含まれる。さらなる態様では、製剤には、２５ｍＭ〜９０ｍＭ、３０ｍＭ〜８０ｍＭ、３５ｍＭ〜７０ｍＭ、４０ｍＭ〜６０ｍＭ、もしくは４５ｍＭ〜５０ｍＭの酢酸、または任意の他のカルボン酸が含まれる。
Ｄ．その他の製剤成分
本開示の高度に安定化された製剤は、フューリン（例えば組換えフューリン）、ならびに安定化剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、塩類、および他の賦形剤のうちの１種類以上を含む。このような成分について以下に詳細に記載する。当然のことながら、本明細書に記載の製剤成分はいずれも、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
本開示の高度に安定化された製剤は、フューリン（例えば組換えフューリン）、ならびに安定化剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、塩類、および他の賦形剤のうちの１種類以上を含む。このような成分について以下に詳細に記載する。当然のことながら、本明細書に記載の製剤成分はいずれも、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
本開示の高度に安定化されたフューリン製剤は、対照製剤すなわち最初の製剤と比べて、剪断（撹拌）、凍結乾燥、および凍結／融解ストレスに対する高い安定性、ならびに製品の損失または容器表面での変性に対する抵抗性を示す。
本開示の製剤中に、フューリンは５，０００〜５００，０００Ｕ／ｍＬの濃度で含まれる。ある態様では、フューリンは、５，５００〜５５，０００、６，０００〜５０，０００、６，５００〜４５，０００、７，０００〜４０，０００、７，５００〜３５，０００、８，０００〜３０，０００、８，５００〜２５，０００、９，０００〜２０，０００、９，５００〜１５，０００、および約１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で含まれる。さらに他の態様では、フューリンは、表１４に見られるバリエーション６４７０〜６５３３から選択される濃度で本開示の製剤に含まれる。表１４では、フューリンの活性を１ｍＬ当たりの１０００単位として表している。具体的な態様では、本開示の高度に安定化された製剤に含まれるフューリンは組換えフューリンである。
（表１４）本明細書で提供する安定化された組成物に使用される、フューリン（例えば、組換えフューリン）の濃度の例（１ｍＬ当たり１０００単位のフューリン活性として表す）。
Var.＝バリエーション
別の態様では、本明細書で提供する安定化された組成物中のフューリン（例えば、組換えフューリン）濃度は、組成物に含まれるフューリンの量として表すことができる。一態様では、安定化された組成物中に含まれるフューリン（例えば、組換えフューリン）の濃度は、本明細書に記載したように、１００ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。別の態様では、安定化された組成物中に含まれるフューリン（例えば、組換えフューリン）の濃度は、本明細書に記載したように、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。別の態様では、安定化された組成物中に含まれるフューリン（例えば、組換えフューリン）の濃度は、本明細書に記載したように、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである。さらに他の態様では、安定化された組成物中に含まれるフューリン（例えば、組換えフューリン）の濃度は、本明細書に記載したように、表１５に見られるバリエーション６５３４〜６６３８から選択される。具体的な態様では、本開示の高度に安定化された製剤に含まれるフューリンは組換えフューリンである。
（表１５）本明細書で提供する安定化された組成物に使用されるフューリン（例えば組換えフューリン）の濃度の例。
Var.＝バリエーション
本開示のいくつかの側面では、フューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は、カルシウムまたは別の二価の金属カチオンを含む。さらなる側面では、二価のカチオンは塩として、好ましくは塩化物塩として存在する。ある態様では、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの二価のカチオンを、または０．５ｍＭ〜２ｍＭ、もしくは約０．９２ｍＭの二価のカチオンを使用することができる。その上さらなる態様では、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、１ｍＭ〜８ｍＭ、１．５ｍＭ〜７ｍＭ、２ｍＭ〜６ｍＭ、２．５ｍＭ〜５ｍＭ、または３ｍＭ〜４．５ｍＭの二価のカチオン塩が本発明の製剤に使用される。カルシウム塩を使用する場合、使用するカルシウム塩は好ましくは塩化カルシウムであるが、グルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、またはグルセプト酸カルシウムなどの他のカルシウム塩も使用することができる。カルシウムなどの二価のカチオンを、本明細書で開示する、１種類以上の他の製剤成分と合わせて含めることができる。本明細書で提供する製剤に有用な二価の金属カチオンの非限定的な例としては、カルシウム、バリウム、マンガン、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル、および亜鉛が挙げられる。
いくつかの態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は酸化防止剤を含む。酸化防止剤を水性の製剤や凍結乾燥した製剤に加えると、これらの製剤の安定性が向上し、その有効期限が延長されることが分かった。使用される酸化防止剤は、医薬品と共に使用するのに適したものでなければならず、加えて、水溶性であることが好ましい。製剤に酸化防止剤を加える場合には、酸化防止剤が自然に酸化するのを回避するために、可能な限り製造過程の遅い段階で、凍結乾燥の前に、そのような酸化防止剤を加えることが好ましい。ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍやＳｉｇｍａなどの会社から市販されている、適した酸化防止剤を下記表２に挙げる。
（表１６）酸化防止剤の例
約０．０５ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌを上回る濃度範囲の酸化防止剤を使用することができ、また、より高濃度であっても（製造工程における反作用または悪影響のうちのいずれか、例えば凍結乾燥製剤のガラス転移温度の低下が生じる濃度未満で）有用であると考えられている。従って一態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの酸化防止剤を含む。他の態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物は、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．７ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．６ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．２ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．９ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．７ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．６ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ〜０．７ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ〜０．６ｍｇ／ｍＬの酸化防止剤を含む。
Ｅ．製剤開発
本開示の一定の側面では、最初の（対照の）フューリン製剤を準備すること、および成分の濃度が所望されるレベルに達するように成分を加えることによって、高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を調製する。例えば、非イオン性界面活性剤を含まないフューリン組成物９に対して１の割合で７５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えることで、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む最終的な製剤が得られる。この過程は、最初の製剤への「添加」とも呼ばれる。
本開示の一定の側面では、最初の（対照の）フューリン製剤を準備すること、および成分の濃度が所望されるレベルに達するように成分を加えることによって、高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を調製する。例えば、非イオン性界面活性剤を含まないフューリン組成物９に対して１の割合で７５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を加えることで、７５ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む最終的な製剤が得られる。この過程は、最初の製剤への「添加」とも呼ばれる。
ある態様では、本開示の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤を生産するために、フューリンが最初の製剤に含められ、かつ、最初の製剤に緩衝液組成物が添加される。他の態様では、高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は、当該分野で知られている方法に従い、透析によって生成される。いくつかの態様では、調合方法は、最初のフューリン製剤に、濃縮された緩衝液組成物を添加することを伴う。一態様では、混合している間の撹拌からフューリンを保護するために、ポリソルベート８０を、他の成分（特にトレハロース）を最初の製剤に加える前に加える。
例示的な態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）の原薬（ＢＤＳ）は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、２３０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カルシウムを含み、ｐＨが６．０の最初の製剤に含まれる。一態様では、最初の製剤に１％のポリソルベート８０、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭの酢酸、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０およびトレハロース二水和物の粉末が添加され、これらの成分を添加した後の組成は、４６ｍＭのＨＥＰＥＳ、４５ｍＭの酢酸、１９０ｍＭのＮａＣｌ、０．９２ｍＭのＣａＣｌ２、７５ｐｐｍのポリソルベート８０、１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物、ｐＨ６．０となる。酢酸を増やすこととＨＥＰＥＳを加えることにより、ｐＨの安定性が向上する。酢酸とＨＥＰＥＳの緩衝能力は両方とも、ｐＨ６．０では最高ではないが、これらの化学物質を高濃度にすることで、高度に安定化された製剤の緩衝能力は大きく向上する。ある態様では、他の試薬を加えて混合している間の凝集と容器表面への吸着からフューリンを保護するために、最初の製剤に、ポリソルベート８０を、その他の成分を加える前に加える。ある態様では、最初の製剤中のフューリンを、ポリソルベート８０、および／または、トレハロース以外の任意の他の成分と混合する。トレハロースと残りの成分はいずれも、混合中の凝集と吸着からフューリンを保護するためにポリソルベート８０を加えた後に加えられる。
ある態様では、ｒＶＷＦ成熟過程などの方法において製剤を使用することができるように、安定化された製剤と希釈剤を併用する。さらなる態様では、最初の希釈剤（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）に７５ｐｐｍになるようにポリソルベート８０を添加することで、安定化された希釈剤を準備する。本開示の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤とこの安定化された希釈剤を併用することで、最初のフューリン製剤と希釈剤を使用する場合と比較して、ｒＶＷＦ成熟工程におけるフューリンの回収が３〜４倍に高まる。
ある態様では、本開示の高度に安定化されたフューリン製剤を凍結乾燥する。凍結乾燥している間に、製剤は水相から非晶質の固体の状態に変化し、このことによって、タンパク質が化学的な不安定性および／または構造的な不安定性から保護されると考えられる。さらなる態様では、凍結乾燥した製剤は、非晶質相だけでなく、凍結乾燥の間に結晶化した成分をも含む。
高度に安定化された製剤に含まれる１種または複数種の成分は、いくつかの態様では、凍結乾燥ケークの非晶質相中で分散していてもよい。加えて、凍結乾燥している間の非晶質相の見かけのガラス転移温度（Ｔｇ'）は相対的に高いことが好ましく、同様に、保存中の固形物のガラス転移温度（Ｔｇ）も高いことが好ましい。
ＩＶ．組換えフューリンの水性組成物を希釈する方法
一側面において、本開示は、フューリン（例えば、組換えフューリン）の水性組成物を希釈する方法を提供する。以下の態様は、フューリン（例えば、組換えフューリン）を希釈するのに使用する緩衝液に非イオン性界面活性剤を加えると、非イオン性界面活性剤を含まない緩衝液で希釈するのに比べ、フューリン活性の回収が３〜４倍になるという発見に部分的に基づく。
一側面において、本開示は、フューリン（例えば、組換えフューリン）の水性組成物を希釈する方法を提供する。以下の態様は、フューリン（例えば、組換えフューリン）を希釈するのに使用する緩衝液に非イオン性界面活性剤を加えると、非イオン性界面活性剤を含まない緩衝液で希釈するのに比べ、フューリン活性の回収が３〜４倍になるという発見に部分的に基づく。
一態様において、この方法は、非イオン性界面活性剤を含む希釈緩衝液をフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物に加え、希釈されたフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を生成することを含む。いくつかの態様では、希釈緩衝液は、１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜１，０００：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。別の態様では、希釈緩衝液は、１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜５００：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。別の態様では、希釈緩衝液は１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜２５０：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。別の態様では、希釈緩衝液は１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜２００：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。別の態様では、希釈緩衝液は１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜１００：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。別の態様では、希釈緩衝液は１：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）〜５０：１（希釈緩衝液：フューリン組成物）の比で加えられる。
一態様において、この方法は、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物に非イオン性界面活性剤を加える第一の工程と、非イオン性界面活性剤を含有するフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物に希釈緩衝液を加える第二の工程を含み、それによって、希釈されたフューリン組成物を生成する。一態様では、希釈されたフューリン組成物における所望の濃度のＸ倍の最終濃度の界面活性剤をフューリン組成物に加え、ここでＸは希釈係数である。例えば、１００倍に希釈されるフューリン組成物における所望の非イオン性界面活性剤の最終濃度が１０ｐｐｍである場合、最終濃度が１，０００ｐｐｍ（１０ｐｐｍ×１００倍希釈）の非イオン性界面活性剤を最初のフューリン組成物に加え、その後、最初の溶液（非イオン性界面活性剤を添加する際の容量を占める）１に対して９９の希釈緩衝液を加えることによって、この組成物を希釈する。
ある態様では、フューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を、１倍〜１，０００倍に、１倍〜５００倍に、１倍〜２５０倍に、１倍〜２００倍に、１倍〜１００倍に、１倍〜５０倍に、１倍〜１０倍に、１０倍〜１，０００倍に、１０倍〜５００倍に、１０倍〜２５０倍に、１０倍〜２００倍に、１０倍〜１００倍に、１０倍〜５０倍に、５０倍〜１，０００倍に、５０倍〜５００倍に、５０倍〜２５０倍に、５０倍〜２００倍に、５０倍〜１００倍に、１００倍〜１，０００倍に、１００倍〜５００倍に、１００倍〜２５０倍に、１００倍〜２００倍に、２００倍〜１，０００倍に、２００倍〜５００倍に、または２００倍〜２５０倍に希釈する。
Ａ．フューリン希釈緩衝液
一態様では、フューリン希釈緩衝液は、薬学的に許容される塩、非イオン性界面活性剤、および緩衝剤を含む。一態様では、希釈緩衝液はカルシウムをさらに含む。別の態様では、希釈緩衝液は糖および／または糖アルコールをさらに含む。
一態様では、フューリン希釈緩衝液は、薬学的に許容される塩、非イオン性界面活性剤、および緩衝剤を含む。一態様では、希釈緩衝液はカルシウムをさらに含む。別の態様では、希釈緩衝液は糖および／または糖アルコールをさらに含む。
一態様では、希釈緩衝液に含まれる薬学的に許容される塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭである。別の態様では、薬学的に許容される塩の濃度は１００ｍＭ〜３００ｍＭである。別の態様では、薬学的に許容される塩の濃度は１５０ｍＭ〜２５０ｍＭである。さらに他の態様では、フューリン希釈緩衝液中の薬学的に許容される塩の濃度は、表１０に見られるバリエーション６０３６〜６１８０から選択される。一態様では、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはその組み合わせである。具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムである。別の具体的な態様では、薬学的に許容される塩は塩化カリウムである。
一態様では、希釈緩衝液のｐＨは５．５〜７．５である。一態様では、希釈緩衝液のｐＨは５．５〜７．０である。別の態様では、希釈緩衝液のｐＨは５．５〜６．５である。別の態様では、希釈緩衝液のｐＨは６．０±０．２である。具体的な態様では、希釈緩衝液のｐＨは６．０である。他の態様では、希釈緩衝液は、表１１に見られるバリエーション６１８１〜６４０３から選択されるｐＨを有する。
一態様では、希釈緩衝液に含まれる緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜３００ｍＭである。別の態様では、希釈緩衝液中の緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜２００ｍＭである。他の態様では、希釈緩衝液中の緩衝剤の濃度は表１２に見られるバリエーション６４０４〜６４６９から選択される。一態様では、緩衝剤は、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはその組み合わせである。具体的な態様では、緩衝剤は酢酸塩とＨＥＰＥＳの組み合わせである。
いくつかの態様では、フューリン希釈緩衝液はカルシウムまたは別の二価の金属カチオンを含む。一態様では、二価のカチオンは塩として、好ましくは塩化物塩として加えられる。ある態様では、希釈緩衝液に含まれる二価のカチオン（例えばカルシウム）の濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜２ｍＭ、または約０．９２ｍＭである。その上さらなる態様では、希釈緩衝液中に、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、１ｍＭ〜８ｍＭ、１．５ｍＭ〜７ｍＭ、２ｍＭ〜６ｍＭ、２．５ｍＭ〜５ｍＭ、または３ｍＭ〜４．５ｍＭの二価のカチオンが使用される。カルシウム塩を使用する場合、使用するカルシウム塩は好ましくは塩化カルシウムであるが、グルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、またはグルセプト酸カルシウムなどの他のカルシウム塩も使用することができる。カルシウムなどの二価のカチオンを、本明細書で開示する、１種類以上の他の製剤成分と合わせて含めることができる。本明細書で提供する希釈緩衝剤に有用な二価の金属カチオンの非限定的な例としては、カルシウム、バリウム、マンガン、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル、および亜鉛が挙げられる。
いくつかの態様では、フューリン希釈緩衝液は糖および／または糖アルコールを含む。一態様では、希釈緩衝液は単糖を含む。特定の態様では、単糖は、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、および八炭糖からなる群より選択される。特定の態様では、糖は、五炭糖、六炭糖、またはその組み合わせである。具体的な態様では、糖は六炭糖である。
別の態様では、希釈緩衝液は二糖を含む。特定の態様では、二糖は、五炭糖および／または六炭糖から形成される二糖から選択される。別の特定の態様では、糖は、六炭糖から形成される二糖から選択される。一態様において糖は、スクロース、トレハロース、またはその組み合わせである。具体的な一態様では、糖はスクロースである。別の具体的な態様では、糖はトレハロースである。一態様では、糖はトレハロース二水和物として調合される。
別の態様では、希釈緩衝液は糖アルコールを含む。特定の態様では、糖アルコールは、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、リビトール、フシトール、イジトール、ボルミトール（ｖｏｌｍｉｔｏｌ）、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールから選択される。別の特定の態様では、糖アルコールはマンニトールである。
さらに別の態様では、希釈緩衝液は、糖と糖アルコールの混合物を含む。一態様では、この混合物は、単糖、二糖、および糖アルコールのうちの少なくとも２種類を含む。別の態様では、混合物は、五炭糖、六炭糖、五炭糖および／または六炭糖から形成される二糖、ならびに糖アルコールのうちの少なくとも２種類を含む。別の態様では、混合物は、スクロース、トレハロース、およびマンニトールのうちの少なくとも２種類を含む。
一態様では、希釈緩衝液に含まれる糖または糖アルコールの濃度は、２％〜２０％、２％〜１７．５％、２％〜１５％、２％〜１２．５％、２％〜１０％、２％〜９％、２％〜８％、２％〜７％、５％〜２０％、５％〜１７．５％、５％〜１５％、５％〜１２．５％、５％〜１０％、７．５％〜２０％、７．５％〜１７．５％、７．５％〜１５％、７．５％〜１２．５％、１０％〜２０％、１０％〜１７．５％、１０％〜１５％、４±２％、５±２％、６±２％、７±２％、８±２％、９±２％、１０±２％、１１±２％、１２±２％、１３±２％、１４±２％、１５±２％、１６±２％、１７±２％、１８±２％、３±１％、４±１％、５±１％、６±１％、７±１％、８±１％、９±１％、１０±１％、１１±１％、１２±１％、１３±１％、１４±１％、１５±１％、１６±１％、１７±１％、１８±１％、１９±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％である。一態様では、糖または糖アルコールは、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択される。具体的な態様では、糖または糖アルコールはトレハロースである。
一態様では、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、非イオン性で水溶性のジグリセリド、非イオン性で水溶性のトリグリセリド、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのモノ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのジ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、非イオン性ポリグリコール化グリセリド、非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体、およびそれらの組み合わせから選択される非イオン性界面活性剤を含む、保存安定性のあるフューリン（例えば、組換えフューリン）組成物を提供する。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
１．非イオン性界面活性剤
一態様では、フューリン希釈緩衝液、または希釈前に加えられる非イオン性界面活性剤の溶液は、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、非イオン性で水溶性のジグリセリド、非イオン性で水溶性のトリグリセリド、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのモノ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのジ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、非イオン性ポリグリコール化グリセリド、非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体、およびそれらの組み合わせから選択される非イオン性界面活性剤を含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、フューリン希釈緩衝液、または希釈前に加えられる非イオン性界面活性剤の溶液は、非イオン性で水溶性のモノグリセリド、非イオン性で水溶性のジグリセリド、非イオン性で水溶性のトリグリセリド、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのモノ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のポリエチレングリコールのジ脂肪酸エステル、非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステル、非イオン性ポリグリコール化グリセリド、非イオン性で水溶性のトリブロック共重合体、およびそれらの組み合わせから選択される非イオン性界面活性剤を含む。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、希釈緩衝液に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度は１０〜２００ｐｐｍ、１０〜１７５ｐｐｍ、１０〜１５０ｐｐｍ、１０〜１２５ｐｐｍ、１０〜１００ｐｐｍ、１０〜９０ｐｐｍ、１０〜８０ｐｐｍ、１０〜７５ｐｐｍ、１０〜７０ｐｐｍ、１０〜６０ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、１０〜２５ｐｐｍ、２５〜２００ｐｐｍ、２５〜１７５ｐｐｍ、２５〜１５０ｐｐｍ、２５〜１２５ｐｐｍ、２５〜１００ｐｐｍ、２５〜９０ｐｐｍ、２５〜８０ｐｐｍ、２５〜７０ｐｐｍ、２５〜６０ｐｐｍ、２５〜５０ｐｐｍ、５０〜２００ｐｐｍ、５０〜１７５ｐｐｍ、５０〜１５０ｐｐｍ、５０〜１２５ｐｐｍ、５０〜９０ｐｐｍ、５０〜８０ｐｐｍ、７５〜２００ｐｐｍ、７５〜１７５ｐｐｍ、７５〜１５０ｐｐｍ、１００〜２００ｐｐｍ、１００〜１７５ｐｐｍ、５０±２５ｐｐｍ、６０±２５ｐｐｍ、７０±２５ｐｐｍ、７５±２５ｐｐｍ、８０±２５ｐｐｍ、９０±２５ｐｐｍ、１００±２５ｐｐｍ、１２５±２５ｐｐｍ、１５０±２５ｐｐｍ、１７５±２５ｐｐｍ、３０±１０ｐｐｍ、４０±１０ｐｐｍ、５０±１０ｐｐｍ、６０±１０ｐｐｍ、７０±１０ｐｐｍ、７５±１０ｐｐｍ、８０±１０ｐｐｍ、９０±１０ｐｐｍ、１００±１０ｐｐｍ、１１０±１０ｐｐｍ、１２０±１０ｐｐｍ、１２５±１０ｐｐｍ、１３０±１０ｐｐｍ、１４０±１０ｐｐｍ、１５０±１０ｐｐｍ、１６０±１０ｐｐｍ、１７０±１０ｐｐｍ、１７５±１０ｐｐｍ、１８０±１０ｐｐｍ、１９０±１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、７５ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１１０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、１３０ｐｐｍ、１４０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ、１７０ｐｐｍ、１７５ｐｐｍ、１８０ｐｐｍ、１９０ｐｐｍ、または２００ｐｐｍである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、希釈後の非イオン性界面活性剤の標的濃度は、１０〜２００ｐｐｍ、１０〜１７５ｐｐｍ、１０〜１５０ｐｐｍ、１０〜１２５ｐｐｍ、１０〜１００ｐｐｍ、１０〜９０ｐｐｍ、１０〜８０ｐｐｍ、１０〜７５ｐｐｍ、１０〜７０ｐｐｍ、１０〜６０ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、１０〜２５ｐｐｍ、２５〜２００ｐｐｍ、２５〜１７５ｐｐｍ、２５〜１５０ｐｐｍ、２５〜１２５ｐｐｍ、２５〜１００ｐｐｍ、２５〜９０ｐｐｍ、２５〜８０ｐｐｍ、２５〜７０ｐｐｍ、２５〜６０ｐｐｍ、２５〜５０ｐｐｍ、５０〜２００ｐｐｍ、５０〜１７５ｐｐｍ、５０〜１５０ｐｐｍ、５０〜１２５ｐｐｍ、５０〜９０ｐｐｍ、５０〜８０ｐｐｍ、７５〜２００ｐｐｍ、７５〜１７５ｐｐｍ、７５〜１５０ｐｐｍ、１００〜２００ｐｐｍ、１００〜１７５ｐｐｍ、５０±２５ｐｐｍ、６０±２５ｐｐｍ、７０±２５ｐｐｍ、７５±２５ｐｐｍ、８０±２５ｐｐｍ、９０±２５ｐｐｍ、１００±２５ｐｐｍ、１２５±２５ｐｐｍ、１５０±２５ｐｐｍ、１７５±２５ｐｐｍ、３０±１０ｐｐｍ、４０±１０ｐｐｍ、５０±１０ｐｐｍ、６０±１０ｐｐｍ、７０±１０ｐｐｍ、７５±１０ｐｐｍ、８０±１０ｐｐｍ、９０±１０ｐｐｍ、１００±１０ｐｐｍ、１１０±１０ｐｐｍ、１２０±１０ｐｐｍ、１２５±１０ｐｐｍ、１３０±１０ｐｐｍ、１４０±１０ｐｐｍ、１５０±１０ｐｐｍ、１６０±１０ｐｐｍ、１７０±１０ｐｐｍ、１７５±１０ｐｐｍ、１８０±１０ｐｐｍ、１９０±１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、７５ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１１０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、１３０ｐｐｍ、１４０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ、１７０ｐｐｍ、１７５ｐｐｍ、１８０ｐｐｍ、１９０ｐｐｍ、または２００ｐｐｍである。一態様では、非イオン性界面活性剤は非イオン性で水溶性のソルビタン脂肪酸エステルである。具体的な態様では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）である。
一態様では、非イオン性界面活性剤をフューリン希釈緩衝液に含有させる、すなわち希釈前に加えることにより、希釈されたフューリン組成物でのフューリン活性の回収が、非イオン性界面活性剤を使用しないで希釈したまたはより低濃度の非イオン性界面活性剤を使用して希釈したフューリン組成物での活性の回収よりも、少なくとも１０％高まる。他の態様では、非イオン性界面活性剤を使用して希釈した後のフューリン活性の回収は、非イオン性界面活性剤を使用しないで希釈したまたはより低濃度の非イオン性界面活性剤を使用して希釈した後のフューリン活性よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれより高い。
Ｖ．安定性アッセイ
本明細書で議論しているように、本開示の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は、対照製剤と比較して、向上した安定性を示す。一態様では、向上した安定性には、様々な安定性アッセイにおける、対照製剤と比べて高いパーセンテージの活性の保持が含まれる。そのようなアッセイを使用して、その製剤が高度に安定化された製剤であるかを決定することができる。いくつかの態様では、本明細書で議論した安定性アッセイまたは当該分野で知られている安定性アッセイのいずれかで評価した場合に、高度に安定化された製剤は対照製剤よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高い活性を有する。
本明細書で議論しているように、本開示の高度に安定化されたフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤は、対照製剤と比較して、向上した安定性を示す。一態様では、向上した安定性には、様々な安定性アッセイにおける、対照製剤と比べて高いパーセンテージの活性の保持が含まれる。そのようなアッセイを使用して、その製剤が高度に安定化された製剤であるかを決定することができる。いくつかの態様では、本明細書で議論した安定性アッセイまたは当該分野で知られている安定性アッセイのいずれかで評価した場合に、高度に安定化された製剤は対照製剤よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高い活性を有する。
さらなる側面では、フューリン（例えば、組換えフューリン）製剤をストレスに曝した条件、例えば高温での保存、撹拌、凍結／融解サイクル、またはそれらのうちいくつかを組み合わせた条件で試験する。そのようなストレスをかけた後、本明細書に記載の方法または当該分野で知られている方法のいずれかを利用してこの製剤をアッセイし、このような条件下での安定性を決定する。
一側面では、フューリン活性アッセイを使用して製剤の安定性を評価する。いくつかの態様では、フューリン活性アッセイは基質の切断の測定を伴う。一態様では、基質はＢｏｃ‐Ａｒｇ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐ＡＭＣ（配列番号１；ＡＭＣ＝７‐アミノ‐４‐メトキシクマリン）であり、これはフューリンによって切断されると７‐アミノ‐４‐メトキシクマリンを遊離する。アッセイは、例えばＥＬＩＳＡプレートを使用して行われる。試料中のフューリン活性は、例えば品質が管理された（ＱＣ）フューリンの標準物質を使用して作成された検量線から決定する。活性の値は通常、２種類の希釈物（それぞれ２つ組み）の平均値として算出される。
別の側面では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してフューリン（例えば、組換えフューリン）製剤の安定性を評価する。このようなアッセイでは、安定性は、単量体のフューリンに相当するピークの高さによって示される。単量体のピークの高さの低下は産物が失われていることを（不安定であることを）意味し、高分子量のピークの発生は、凝集が生じていることを意味し、また、低分子量のピークの発生は産物が分解されていることを意味する。例示的な態様では、３７℃で４日間置いた後の対照フューリン製剤の相対的なピークの高さは５８．５％であったが、高度に安定化された製剤の相対的なピークの高さは７４．８％であった（図４８）。従って、より高い温度（３７℃）で４日間保存する前に見られたものと比較して、高度に安定化された製剤では、組成物に含まれるフューリンの安定性が維持され、かつ、より高いパーセンテージのピーク高が保持された。
別の側面では、ウェスタンブロット法などの定性的なアッセイを使用してフューリン製剤の安定性を評価する。例えば図２６では、３５℃に５日間置いた後の安定化された製剤（レーン１１）では、安定化されていない製剤（レーン５）と比較して、分解されたフューリン分子よりも完全なフューリン分子のシグナルのパーセンテージが高いことを示している。
さらに別の側面では、ＵＶスペクトルなどの定性的アッセイを使用して安定性を評価する。このようなアッセイは、使用されるストレス要因が撹拌である場合に特に有用である。ＵＶスペクトルは不安定性の指標である凝集物の存在を示すことができる。例えば図３６は、対照製剤を撹拌したときには、スペクトルの高さに大きな変化があることを示している（凝集を表している）。図４１および４２は高度に安定化された製剤の保護効果を示している。つまり、撹拌しても試料のスペクトルの高さは変化せずに撹拌していない試料のものと重なり、このことは、製剤を撹拌ストレスに曝しても凝集が形成されなかったことを表している。
本発明の実施には、別段の指定のない限り、有機化学、高分子技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の標準的な技術や記載を使用してもよく、このような技術や記載は当該分野の技術範囲内にある。このような標準的な技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適した技術の具体的な例を本明細書の以下に記載する実施例を参照することによって理解することができるが、当然のことながら、他の均等で標準的な方法も使用される。そのような標準的な技術や記載は、標準的な実験の手引き、例えばＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｖｏｌｓ． Ｉ−ＩＶ）、 Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 および Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （４ｔｈ Ｅｄ．） Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｙｏｒｋ、 Ｇａｉｔ， "Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ" １９８４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ、 Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ （２０００）， Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． ならびに Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．， Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．、の中に見ることができ、これらは全て、全目的のために、その全体が参照することにより本明細書に組み入れられる。
以降の記載では、具体的で詳細な説明を数多く示し、本発明のより完全な理解を促す。しかしながら、これらの具体的で詳細な説明のうちの１つまたは複数を省略しても本発明が実施できることは当業者にとっては明らかであろう。本発明が不明瞭になるのを避けるために、他の例では、よく知られている特徴や当業者であればよく知っている方法については記載しなかった。
本発明を主に具体的な態様との関連で記載するが、当業者であれば本開示を読むことで他の態様を理解することも予見され、また、そのような態様も本発明の方法に含まれることを意図するものである。
実施例１−水性組換えフューリン製剤の保存安定性
対照フューリン製剤の安定性を、室温（例えば、２５℃）、３７℃、および４５℃の３種類の温度で試験した。高い温度で行ったこれらの試験を使って、より低い温度で行う長期試験に匹敵する加速安定性を試験した。試料を、０時点で、その後１、２、３、４、および７日間インキュベートした後で試験した。解析には、フューリン活性アッセイ、ＳＥＣ、およびウェスタンブロット法を含めた。
対照フューリン製剤の安定性を、室温（例えば、２５℃）、３７℃、および４５℃の３種類の温度で試験した。高い温度で行ったこれらの試験を使って、より低い温度で行う長期試験に匹敵する加速安定性を試験した。試料を、０時点で、その後１、２、３、４、および７日間インキュベートした後で試験した。解析には、フューリン活性アッセイ、ＳＥＣ、およびウェスタンブロット法を含めた。
簡単に説明すると、５ｍＬのポリプロピレン製バイアルを数本、３ｍＬの組換えフューリンで満たし、３種類の温度、すなわち周囲温度（室温）、３７℃および４５℃でインキュベートした。それぞれの条件でインキュベートしたバイアルのうちの１本を０時点で、その後１、２、３、４、および７日後に取り出した。２００μＬの分割量を０．６５ｍＬのポリプロピレン製バイアルに入れ、−８０℃で冷凍し、分析まで保存した。
このような条件で、いくつかのフューリン製剤の安定性を決定した。それぞれの製剤の組成を表１７に示す。
（表１７）高温保存中の安定性を試験したフューリン製剤
安定性を評価するための方法の１つにフューリン活性アッセイによる方法がある。このアッセイでは、フューリンの活性を基質の切断速度から決定する。基質であるＢｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（配列番号１；ＡＭＣ＝７−アミノ‐４‐メトキシクマリン）がフューリンによって切断されると蛍光ＡＭＣが遊離する。このアッセイは、例えばＥＬＩＳＡプレートを使って実施される。試料のフューリン活性は検量線から決定され、例えば品質管理された組換えフューリンの標準物質を使って作成した検量線から決定する。活性値は２種類の希釈物（それぞれ２つ組み）の平均として算出した。
３７℃、高度に安定化された製剤中での組換えフューリンの安定性。 この実験では、７５ｐｐｍのポリソルベート８０を含む安定化された製剤中での組換えフューリンの安定性を試験することを目的とした。この試料では、トレハロース無水和物（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、ＦＷ３４２．３０）ではなくトレハロース二水和物（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１ ＊２Ｈ２Ｏ、ＦＷ３７８．３３）を使用したため、組成がやや変化した。トレハロース二水和物を使用したことで、試料はやや薄くなった。撹拌試験では、撹拌によって生じる組換えフューリンの変性を最も低く抑えるには、ポリソルベート８０の濃度を５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの間に維持すべきであることが示唆された。この試験では、試験製剤＃１に入れた組換えフューリンの試料に７５ｐｐｍになるようにポリソルベート８０を添加し、３７℃で４日間インキュベートした。対照製剤で調製した組換えフューリンの試料を対照とした。
フューリン活性アッセイによる解析（図１）は、対照製剤に入れ、３７℃および４５℃でインキュベートした試料では活性が失われることを示している。４５℃の試料は、僅か２日後に非常に分解され、凝集したため、それ以降、この試料については試験しなかった。室温でインキュベートした試料については、このアッセイでの変動量の最終的な結果は出なかったが、組換えフューリンの活性が比較的安定していたことがこのデータから示唆され、７日後の活性は、０時点での活性とほぼ同等であった。
対照製剤のデータと比較すると、フューリン活性アッセイによる解析（図４６）は、試験製剤＃１に入れた組換えフューリンがその活性を、対照製剤に入れたものよりも、より高く保持したことを示している。３７℃で４日間インキュベートした後の組換えフューリンの活性は、もとの活性の７６．７％に保持されていたが、対照製剤に入れたものでは、もとの活性の僅か５５．５％しか保たれていなかった（図４７）。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）も使用して様々なフューリン製剤の安定性を評価した。ＳＥＣ法では、以下の装置と材料を使用した：
・温度制御された自動回収装置と光ダイオードアレイ検出器を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１１００シリーズ
・自動回収装置用の１００μＬポリプロピレン製バイアル
・サイズ排除クロマトグラフィー用カラム、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫｇｅｌ
・Ｇ３０００ＳＷ×ｌ、７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ、５μｍ。
加えて、ＳＥＣ法は以下の条件で行った：
・移動相：５０ｍＭのＭＯＰＳ、２００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０
・流速：０．５ｍＬ／分
・実行時間：３０分
・試料容量：１００μＬ
・自動回収装置温度：４℃
・カラム温度：周囲温度。
・温度制御された自動回収装置と光ダイオードアレイ検出器を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１１００シリーズ
・自動回収装置用の１００μＬポリプロピレン製バイアル
・サイズ排除クロマトグラフィー用カラム、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫｇｅｌ
・Ｇ３０００ＳＷ×ｌ、７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ、５μｍ。
加えて、ＳＥＣ法は以下の条件で行った：
・移動相：５０ｍＭのＭＯＰＳ、２００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０
・流速：０．５ｍＬ／分
・実行時間：３０分
・試料容量：１００μＬ
・自動回収装置温度：４℃
・カラム温度：周囲温度。
２８０ｎｍでの単一の吸収波長（参照なし）を使用して、クロマトグラフを生成した。手動で統合した後、製剤に含まれる組換えフューリン含量に相当する、１９分に現れる主要なピークの高さを使用して、安定性を評価した。クロマトグラフのピークはベースラインで分離しないことが多く、大きな誤差が生じる可能性があるため、ピーク面積ではなくピークの高さを使用した。各試料につき、注入は１回だけ行った。組換えフューリンの対照製剤について繰り返し行った解析から、ピークの高さのばらつきは２％未満であることが分かった（データは示さない）。
ＳＥＣの結果と、上で報告したフューリン活性アッセイの結果には相関がある。ＳＥＣによる解析（図２）は、対照製剤の単量体組換えフューリンのピーク（保持時間１９分）の高さは、インキュベートした全ての温度で、時間を追うに従って低下したことを示している。室温でインキュベートした試料の単量体組換えフューリンのピークの低下率は相対的に低く、７日間インキュベートした後にもピークの高さの８２％が残っていた。しかしながら３７℃で７日間インキュベートした後の単量体組換えフューリンのピークの高さは、最初の高さの２１．６％に激減した。４５℃で２日間インキュベートした後には、主要なピークは１４．１％に低下した。単量体組換えフューリン含量の減少と同時に、時間が経つに連れて、凝集物（より早い時点で溶出される）および分解産物（より遅い時点で溶出される）に相当する他のピークもクロマトグラフ上に現れ始めた（図３）。このような新たに生じたピークは、対照製剤中の組換えフューリンの分解と凝集の両方を示している。室温での保存に比べて、３７℃では分解量が多いことを、ウェスタンブロット法でも確認した（図４）。組換えフューリンの分解は、組換えフューリンと一緒に精製されたプロテアーゼによって、または組換えフューリン自体の自己分解活性によって生じている可能性がある。
一方、ＳＥＣでの解析では、糖または糖アルコールを含まない対照製剤に比べて、トレハロースを含む試験製剤＃１の安定性が高いことが確認された（図４８）。図４８は、試験製剤＃１では、３７℃で４日間インキュベートした後も単量体組換えフューリンのピークの高さが最初の溶液の７４．８％に維持されたが、対照製剤では同じようにインキュベートした後には単量体組換えフューリンのピークの高さは最初の溶液の５８．５％しか維持されなかったことを示している。
実施例２−凍結／融解した際の水性組換えフューリン製剤の保存安定性
対照製剤と試験製剤＃２〜６の安定性を凍結／融解試験で調べた。凍結／融解サイクルを５回行った後、試料をフューリン活性アッセイとＳＥＣで解析した。この試験での組換えフューリン試料と組換えフューリンＢＤＳは凍結保存されるため、凍結／融解の影響を調べることが重要となる。対照製剤を使用した凍結／融解実験（ｎ＝４）では、合計で５回の凍結／融解サイクルを行った後には、少し（およそ７％）フューリン活性が失われることが認められた。活性の低下傾向が認められたが、これはタンパク質が実際に消失したためか、あるいはアッセイのばらつきを反映したものである可能性がある。いずれにしてもこのデータは、組換えフューリンを１回だけでなく複数回凍結および融解しても、活性がほとんどもしくは全く失われないことを支持するものである。同様に、対照製剤中の重合体状態のフューリンのＳＥＣ解析からも、凍結／融解実験を経ても単量体含量が低下しないことが示された（図６）。
対照製剤と試験製剤＃２〜６の安定性を凍結／融解試験で調べた。凍結／融解サイクルを５回行った後、試料をフューリン活性アッセイとＳＥＣで解析した。この試験での組換えフューリン試料と組換えフューリンＢＤＳは凍結保存されるため、凍結／融解の影響を調べることが重要となる。対照製剤を使用した凍結／融解実験（ｎ＝４）では、合計で５回の凍結／融解サイクルを行った後には、少し（およそ７％）フューリン活性が失われることが認められた。活性の低下傾向が認められたが、これはタンパク質が実際に消失したためか、あるいはアッセイのばらつきを反映したものである可能性がある。いずれにしてもこのデータは、組換えフューリンを１回だけでなく複数回凍結および融解しても、活性がほとんどもしくは全く失われないことを支持するものである。同様に、対照製剤中の重合体状態のフューリンのＳＥＣ解析からも、凍結／融解実験を経ても単量体含量が低下しないことが示された（図６）。
通常、組換えフューリンは凍結保存されるため、融解方法の影響についての評価を行った。活性アッセイによる解析（図）では、４℃で一晩融解する、または室温で２時間融解する、２種類の方法の間では有意な差は認められなかった。
総合するとこれらのデータは、対照製剤中の組換えフューリンは、室温で短時間、相対的に安定であることを示唆している。さらに、高温で保存した際の活性の消失は、組換えフューリンの分解と凝集の両方と関係している。加えて、対照製剤中の組換えフューリンは、凍結／融解サイクルを５回行った後もその活性を高く保持した。
高度に安定化された製剤中での組換えフューリンの凍結／融解試験。 前述した凍結／融解試験で使用したものと同じセットの試料を使用して凍結／融解試験を行った。つまり、試験製剤＃２（０ｐｐｍのポリソルベート８０）、＃３（１０ｐｐｍのポリソルベート８０）、＃４（２５ｐｐｍのポリソルベート８０）、＃５（５０ｐｐｍのポリソルベート８０）、および＃６（１００ｐｐｍのポリソルベート８０）中での組換えフューリンの安定性を評価した。対照製剤に入れたフューリンを対照とした。対照製剤に関する前記解析と一致して、フューリン活性の解析（図４３）では、いずれの試験製剤中でも、５回の凍結／融解サイクルの後に、活性の有意な消失は認められなかった。ＳＥＣによる組換えフューリン単量体含量の解析（図４４および４５）では、凍結／融解の後に、わずかに試料の質が劣化する傾向が認められた。凍結／融解サイクルを５回行った後でも、全ての試料はもとの活性の９５％を上回る活性を保持した。
実施例３−機械的ストレスに曝された場合の水性組換えフューリン製剤の保存安定性
理論に拘束されないが、撹拌が組換えフューリン試料に及ぼす影響の機構の１つとしては、撹拌が疎水性表面を露出させることで組換えフューリンの変性を引き起こしている可能性がある。この疎水性表面は、他の変性した組換えフューリンタンパク質などの他の疎水性表面に引きつけられ、それによって凝集や、または試料や材料の疎水性表面の吸着が引き起こされる。
理論に拘束されないが、撹拌が組換えフューリン試料に及ぼす影響の機構の１つとしては、撹拌が疎水性表面を露出させることで組換えフューリンの変性を引き起こしている可能性がある。この疎水性表面は、他の変性した組換えフューリンタンパク質などの他の疎水性表面に引きつけられ、それによって凝集や、または試料や材料の疎水性表面の吸着が引き起こされる。
撹拌試験は、組換えフューリンを使用する実際の過程を模倣するようには設計しなかったが、試料に過剰なストレスをかけた。組換えフューリンの製剤が少なくとも対照製剤と同程度の結果を示し、また、高度に安定化された製剤が対照製剤よりも良い結果を示せば、安定だと見なされる。
撹拌試験は、テフロン製の球が入った瓶に入れた組換えフューリン試料を撹拌することで行った。撹拌の２時間後と１７時間後に試料を取り、フューリン活性アッセイとＳＥＣで解析した。フューリン活性アッセイとＳＥＣ解析両方の結果から分かるように（それぞれ図７および８）、対照製剤中の組換えフューリンは撹拌に対して、限られた時間の間は、相当な耐性を示した。例えばダイアフィルトレーションの工程で生じ得るような、２時間の激しい撹拌の後でも、８５％を上回る組換えフューリンが対照製剤中でまだ活性であった。しかし、試料の輸送中に生じ得るような、１７時間の撹拌の後には、組換えフューリン含量のうちの１０％未満しか活性でなかった。
次に、フューリン試験製剤＃２〜６に及ぼす影響について試験した。フューリン試験製剤＃２〜６は、組換えフューリン試料９に対して、ＨＥＰＥＳ（５００ｍＭ）、酢酸（４００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ｐＨ６、および１０％（ｗ／ｗ）のトレハロースと様々な量のポリソルベート８０を１の割合で添加することで調製したものである。
この撹拌試験は、テフロン製の球の入った瓶に入れた試験組換えフューリン製剤および対照製剤を３時間撹拌することで行った。ポリソルベート８０が入っていない試験製剤、および１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、または１００ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する試験製剤について評価した。図３１に示すように、試験製剤にポリソルベート８０を加えることによって、組換えフューリンは撹拌している間も有意に保護された。３時間撹拌した後のポリソルベート８０を含有する試料中の組換えフューリンの活性は、３１，４９９±１，２１８Ｕ／ｍＬ〜３６，７８７±８４７Ｕ／ｍＬの範囲にあったが、ポリソルベート８０を含まない製剤中の試料のフューリン活性は１７，８３５±１，７０６Ｕ／ｍＬであった。対照製剤（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、２３０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中の試料の活性は２４，３６８±１，１３５Ｕ／ｍＬであった。
この試験でのポリソルベート８０の有益な効果を、ＳＥＣによる解析で確認した（図３２）。３時間撹拌した後の、ポリソルベート８０を含む試料中の組換えフューリンのピークの高さは３７．５ｍＡＵ〜３５．９ｍＡＵの範囲にあったが、ポリソルベート８０を含まない製剤中の組換えフューリンのピークの高さは２２．１ｍＡＵであった。対照製剤中の組換えフューリンのピークの高さは２９．９ｍＡＵであった。ポリソルベート８０の効果は、図３３および３４でも見られる。１０ｐｐｍおよび２５ｐｐｍのポリソルベート８０を加えると効果が小さいことは、１０ｐｐｍや２５ｐｐｍでも有益ではあるが、５０ｐｐｍまたは１００ｐｐｍのポリソルベート８０を使用するほど有効ではないことを示唆している。対照製剤中の試料のＳＥＣプロファイル（図３５）では、撹拌しなかった試料とは別のピークは全く見られない。このことは、活性の消失の主な原因は、表面への吸着であることを示唆している。しかしながら、撹拌した試料のＵＶ吸収スペクトル（図３６）は、凝集が存在することによって生じる光散乱や遮蔽の証拠である、傾いており、かつ、高いプロファイルを示している。光遮蔽は通常、より小さい分子よりも光を通さない非常に大きな凝集によって生じ、このことによって、ＵＶスペクトルは上昇する。検出器は試料を透過した光の量を測定するため、この現象は分光光度計による吸収では区別することができない。より少ない光が検出器に到達すると吸収として報告されるため、吸収プロファイルは上昇する。
光は凝集によって散乱もし、このことによっても検出器に到達する光の量は低下する。波長が短ければ短いほど、より多くの光が散乱する（散乱光の量は波長の４乗に反比例する）。このことは、波長は短いほど、検出器に到達する光が少なくなり、そのため、吸収プロファイルが傾くことを意味している。この試料中には凝集が存在したが、ＳＥＣ解析ではそれらを検出できなかった可能性がある。タンパク質の凝集はカラムを通過するには大き過ぎる、またはタンパク質の凝集がカラムの材料に吸収されることが多いため、ＳＥＣ解析に付随するこの種の問題は珍しいことではない。ポリソルベート８０を含まない製剤中の組換えフューリン試料のＵＶ吸収スペクトル（図３７）も同じような上昇したプロファイルを示している。ここでも、この試料のＳＥＣ解析では凝集は検出されなかった（図３８）。ＵＶ吸収スペクトルで解析すると、ポリソルベート８０と共に調合した試料は、ポリソルベート８０を含まないものよりも凝集が少ないことを示している（図３９〜４２）。ＵＶスペクトルでは凝集の量を定量することはできないが、ここでも、１０ｐｐｍまたは２５ｐｐｍのポリソルベート８０を加えた試料よりも、５０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍのポリソルベート８０を加えた試料の方が、組換えフューリンを凝集からより保護することを暗示する、弱い傾向を認めることができる。７５ｐｐｍの濃度が長いプラトー（５０〜１０ｐｐｍ）の中間値であることから、このデータは、ポリソルベート８０を７５ｐｐｍのレベルで製剤に含めることが有効であり、強固な条件となる可能性を示唆している。
ＵＶ分光光度測定は以下の装置および材料を使用して実施した：
・Ａｇｉｌｅｎｔ社の８４５３分光光度計
・光路長が１ｃｍの石英製キュベット。
・Ａｇｉｌｅｎｔ社の８４５３分光光度計
・光路長が１ｃｍの石英製キュベット。
分光光度測定は、まず、０．５ｍＬの適切な製剤をキュベットに入れてブランクとして測定し、次いで０．５ｍＬの組換えフューリン試料をキュベットに入れて２４０ｎｍ〜４００ｎｍをスキャンすることによって実施した。
実施例４−組換えフューリンの安定性に及ぼすｐＨ、スクロースおよびポリソルベート８０の影響
ｐＨを５．０、５．５、６．０、７．０および８．０に調整するために、組換えフューリン試料に様々な緩衝液を添加した。加えて、ｐＨが６．０、７．０および８．０の試料にはスクロースおよび／またはポリソルベート８０も加えた。試料を３７℃でインキュベートし、フューリン活性アッセイおよびＳＥＣで試験した。
ｐＨを５．０、５．５、６．０、７．０および８．０に調整するために、組換えフューリン試料に様々な緩衝液を添加した。加えて、ｐＨが６．０、７．０および８．０の試料にはスクロースおよび／またはポリソルベート８０も加えた。試料を３７℃でインキュベートし、フューリン活性アッセイおよびＳＥＣで試験した。
フューリン活性アッセイ（図１１）およびＳＥＣ（図１２）の両方から、３７℃では、組換えフューリンは、ｐＨ５．０または５．５よりもｐＨ６．０で安定であることが分かった。ＳＥＣで解析した場合、対照製剤（図１３）およびＭＥＳ（図１４）に入れた試料はｐＨが６．０の場合に、ｐＨ７．０または８．０に調合されたものよりも安定であった（図１５および１６）。ｐＨ６．０および７．０の試料にスクロースを加えると、組換えフューリンの安定性に有益な効果があった。ＳＥＣ解析（図１７）から、３７℃で４日間インキュベートした後の、スクロースを含む試料のピークの高さは、平均して０時点のものの７５％であったが、スクロースを含まないものでは５２％であったことが分かった。ＳＥＣ実験の結果をフューリン活性アッセイによる解析で確認した（図１８および１９）。スクロースを加えると、対照製剤およびＭＥＳ（ｐＨ６．０）に入れた組換えフューリンの安定性は共に向上し（図１８および１９）、どちらの緩衝液を使った場合でも同程度の安定性が見られた（図２０）。３７℃、スクロース含有製剤中での組換えフューリンの安定性に及ぼすポリソルベート８０の効果は、図１７、１８、および１９に示すように、あったとしてもごく僅かであった。
これらのデータは、３７℃で組換えフューリンは、ｐＨ５．０、５．５、７．０および８．０よりもｐＨ６．０の製剤中で最も安定なことを示唆している。このデータはさらに、スクロースは３７℃での組換えフューリンの安定性に有益な効果を及ぼしたことを示している。加えて、１０％スクロースを含むｐＨ６．０の対照緩衝液（酢酸塩）またはＭＥＳの間では、組換えフューリンの安定性に有意な差は認められなかった。最後に、３７℃、スクロースを含む製剤中の組換えフューリンの安定性にはポリソルベート８０は有意な効果を及ぼさなかった。
実施例５−スクロースおよびマンニトール中でのフューリン製剤の安定性の比較
実施例４で見られたように、スクロースを加えると、３７℃での組換えフューリンの分解および／または活性の消失が遅らされた。スクロースは以降の応用、例えばｒＶＷＦ過程では使用されないが、他の糖類および／または糖アルコール、例えばマンニトールは使用される。そのため、スクロースではなくマンニトールを組換えフューリン製剤に加えれば、ｖＷＦ過程に新しい原料を導入することにならない。そこで、この試験を実施し、マンニトールを加えることで組換えフューリンの安定性に有益な効果がもたらされるか否かを決定した。試験製剤にＨＥＰＥＳと酢酸を、それぞれの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ６．０になるように加えて試験製剤の緩衝能力も同様に向上させた。安定化された製剤は、組換えフューリン試料に１０％のＨＥＰＥＳ（５００ｍＭ）、酢酸（４００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ｐＨ６を添加し、次いでスクロースかマンニトールのいずれか、および／またはポリソルベート８０を加えた。フューリン活性アッセイ（図２１）およびＳＥＣ（図２２）を使った解析の両方から、マンニトールとスクロースは、３７℃で４日間インキュベートした後の組換えフューリン製剤に同程度の安定化効果を及ぼすことが分かった。ここでも、ポリソルベート８０がこれらの製剤に及ぼす影響は有意ではなかった。活性のデータ（図２１）は、３７℃で４日間インキュベートした後では、マンニトールとポリソルベート８０を含む試料の活性が他の試料と比べて高いことを示しているが、この試料はパターンの全体像を追ってないだけでなく、ＳＥＣ解析でもこのことを確認しなかった（図）。この結果は異常値である可能性がある。
実施例４で見られたように、スクロースを加えると、３７℃での組換えフューリンの分解および／または活性の消失が遅らされた。スクロースは以降の応用、例えばｒＶＷＦ過程では使用されないが、他の糖類および／または糖アルコール、例えばマンニトールは使用される。そのため、スクロースではなくマンニトールを組換えフューリン製剤に加えれば、ｖＷＦ過程に新しい原料を導入することにならない。そこで、この試験を実施し、マンニトールを加えることで組換えフューリンの安定性に有益な効果がもたらされるか否かを決定した。試験製剤にＨＥＰＥＳと酢酸を、それぞれの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ６．０になるように加えて試験製剤の緩衝能力も同様に向上させた。安定化された製剤は、組換えフューリン試料に１０％のＨＥＰＥＳ（５００ｍＭ）、酢酸（４００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ｐＨ６を添加し、次いでスクロースかマンニトールのいずれか、および／またはポリソルベート８０を加えた。フューリン活性アッセイ（図２１）およびＳＥＣ（図２２）を使った解析の両方から、マンニトールとスクロースは、３７℃で４日間インキュベートした後の組換えフューリン製剤に同程度の安定化効果を及ぼすことが分かった。ここでも、ポリソルベート８０がこれらの製剤に及ぼす影響は有意ではなかった。活性のデータ（図２１）は、３７℃で４日間インキュベートした後では、マンニトールとポリソルベート８０を含む試料の活性が他の試料と比べて高いことを示しているが、この試料はパターンの全体像を追ってないだけでなく、ＳＥＣ解析でもこのことを確認しなかった（図）。この結果は異常値である可能性がある。
実施例６−スクロースおよびトレハロース中でのフューリン製剤の安定性の比較
多くの出版物で、マンニトールが凍結中のタンパク質の変性を加速することが示されており、組換えフューリン製剤緩衝液にマンニトールを加えることについては懸念が生じた。ｒＶＷＦ製造過程の一環として既に使用されている別の糖であるトレハロースについては、このような問題は報告されていない。この試験を実施して、トレハロースを加えることで、組換えフューリンの安定性に有益な効果がもたらされるか否かを判断した。加えて、様々な濃度のポリソルベート８０についても評価を行った。フューリン活性アッセイを使った解析（図２３および２４）から、３７℃で５日間インキュベートした後には、１０％のスクロースを含む試料はもとの活性の６６．２％±２．９％を保持し、１０％のトレハロースを含む試料は６０．１％±４％を保持したことが分かった。これら試料間の差は有意でない。組換えフューリン活性の保持という点では、どちらの試料も、もとの活性の３７．５％±４．２％のみを保持した対照製剤より有意に優れていた。
多くの出版物で、マンニトールが凍結中のタンパク質の変性を加速することが示されており、組換えフューリン製剤緩衝液にマンニトールを加えることについては懸念が生じた。ｒＶＷＦ製造過程の一環として既に使用されている別の糖であるトレハロースについては、このような問題は報告されていない。この試験を実施して、トレハロースを加えることで、組換えフューリンの安定性に有益な効果がもたらされるか否かを判断した。加えて、様々な濃度のポリソルベート８０についても評価を行った。フューリン活性アッセイを使った解析（図２３および２４）から、３７℃で５日間インキュベートした後には、１０％のスクロースを含む試料はもとの活性の６６．２％±２．９％を保持し、１０％のトレハロースを含む試料は６０．１％±４％を保持したことが分かった。これら試料間の差は有意でない。組換えフューリン活性の保持という点では、どちらの試料も、もとの活性の３７．５％±４．２％のみを保持した対照製剤より有意に優れていた。
ＳＥＣによる解析（図２５）で活性解析を確認した。１０％のスクロース中の試料の組換えフューリンのピークは、その高さの７８．３％を保持していたが、対して、１０％のトレハロース中の試料は７５．１％、および対照製剤では４４．２％であった。また、ウェスタンブロット法による解析（図２６）は、１０％スクロースまたは１０％のトレハロースを含む試料では分解が最も少なかったことを示した。各製剤につき、０日目と次いで５日目を対で表していることに留意されたい。
フューリン活性アッセイ（図２７）とＳＥＣ（図２８）解析の両方は、３７℃での組換えフューリン活性の保持という点では、１０％のトレハロースが５％または２％よりも優れていたことを示している。これらの発見をウェスタンブロット法（図２６）でも確認した。フューリン活性アッセイおよびＳＥＣによる解析（それぞれ図２９および３０）では、３７℃での組換えフューリンの安定性に及ぼすポリソルベート８０の影響は最小限であった。
ＳＥＣおよびフューリン活性アッセイは上述したように実施した。ウェスタンブロット法は以下の装置および材料を使用して実施した：
・ヤギ抗フューリン（ペプチド）一次抗体（カタログ番号ＳＣ‐１２４８４）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ
・ウサギ抗ヤギＩｇＧ‐ＨＲＰ結合二次抗体（カタログ番号Ａ５４２０）、Ｓｉｇｍａ
・Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、１０×濃縮ＤＡＢ／金属含有、Ｐｉｅｒｃｅ（カタログ番号１８５６０９０）およびＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ（カタログ番号１８５５９１）
・４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシンゲル（カタログ番号ＥＣ６０２５ＢＯＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（０．５ＭのＤＴＴ、１０×、カタログ番号ＮＰ０００４）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・Ｎｏｎ‐Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×、カタログ番号８４７８８）、Ｔｈｅｒｍｏ
・ＰＢＳ（カタログ番号Ｐ４４１７）、Ｓｉｇｍａ
・Ｔｗｅｅｎ２０（カタログ番号９４８０）、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
・ＢＳＡ（カタログ番号Ａ７９０６）、Ｓｉｇｍａ
・ゲルトランスファー装置（ｉＢＬＯＴ、カタログ番号ＩＢ４０１００１）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ‐Ｐ、カタログ番号ＩＰＶＨ０７８５０）ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。
・ヤギ抗フューリン（ペプチド）一次抗体（カタログ番号ＳＣ‐１２４８４）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ
・ウサギ抗ヤギＩｇＧ‐ＨＲＰ結合二次抗体（カタログ番号Ａ５４２０）、Ｓｉｇｍａ
・Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、１０×濃縮ＤＡＢ／金属含有、Ｐｉｅｒｃｅ（カタログ番号１８５６０９０）およびＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ（カタログ番号１８５５９１）
・４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシンゲル（カタログ番号ＥＣ６０２５ＢＯＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（０．５ＭのＤＴＴ、１０×、カタログ番号ＮＰ０００４）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・Ｎｏｎ‐Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×、カタログ番号８４７８８）、Ｔｈｅｒｍｏ
・ＰＢＳ（カタログ番号Ｐ４４１７）、Ｓｉｇｍａ
・Ｔｗｅｅｎ２０（カタログ番号９４８０）、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
・ＢＳＡ（カタログ番号Ａ７９０６）、Ｓｉｇｍａ
・ゲルトランスファー装置（ｉＢＬＯＴ、カタログ番号ＩＢ４０１００１）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ‐Ｐ、カタログ番号ＩＰＶＨ０７８５０）ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。
組換えフューリン分解産物の検出感度を上げるために、この試験ではモノクローナル抗体の替わりにポリクローナル抗体を使用した。５μｌの試料を１μｌの１０×ＤＴＴ、４μｌの４×非還元色素と混合した。この試料を７０℃〜７５℃で１０分間加熱した。この試料のうち１０μｌを４‐２０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに負荷し、１５０Ｖで６０〜７０分間泳動した。タンパク質ゲルを、ｉＢＬＯＴを使用して２０Ｖで６分間かけてＰＶＤＦ膜に移した。このＰＶＤＦ膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ２０と３％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液中で１時間ブロッキングした。この膜を、同じ緩衝液で１２５倍に希釈した一次抗体中で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴ緩衝液で１回につき５分間、３回洗浄した。膜を一次抗体を希釈したのと同じ緩衝液で１０，０００倍に希釈した二次抗体中で１時間インキュベートした。インキュベート時間は１時間とした。ブロットをＰＢＳＴ緩衝液で、１回につき５分間、３回洗浄した。このブロットを１０ｍＬの予め混合しておいた発色基質中で展開し（１ｍｌの濃縮液と９ｍｌのＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、その後水で１０分間洗浄した。
実施例７−フューリン組成物の希釈に及ぼす安定化剤の効果
組換えフューリン希釈試験を行い、最初の製剤およびその希釈液と、安定化された製剤および安定化された希釈液とを比較した。この試験では、ｒＶＷＦ成熟過程で使用される希釈法を模倣した。簡単に説明すると、組換えフューリンＢＤＳをフィルターに通し、その後、２００倍量の希釈液を加えた。試験希釈法と最初の希釈法の主な違いは、（高度に安定化された）試験方法では組換えフューリンＢＤＳと希釈液の両方に７５ｐｐｍのポリソルベート８０が含まれているが、最初の方法では、組換えフューリンＢＤＳと希釈液のいずれにもポリソルベート８０が含まれていないということである。
組換えフューリン希釈試験を行い、最初の製剤およびその希釈液と、安定化された製剤および安定化された希釈液とを比較した。この試験では、ｒＶＷＦ成熟過程で使用される希釈法を模倣した。簡単に説明すると、組換えフューリンＢＤＳをフィルターに通し、その後、２００倍量の希釈液を加えた。試験希釈法と最初の希釈法の主な違いは、（高度に安定化された）試験方法では組換えフューリンＢＤＳと希釈液の両方に７５ｐｐｍのポリソルベート８０が含まれているが、最初の方法では、組換えフューリンＢＤＳと希釈液のいずれにもポリソルベート８０が含まれていないということである。
２回の希釈実験を行い、そのいずれもが、安定化された製剤とその安定化された希釈液の組み合わせが、最初のフューリンと希釈製剤よりも優れていたことを示した。最初の実験では、安定化された製剤を使用した試験方法は、期待された組換えフューリン活性の８３％〜８７％を回収したが、対照方法は２１％〜２２％しか回収しなかった（表１８）。この実験では、まず組換えフューリン試料をフィルターに通し、その後２００倍量の希釈液を加えた。濾液をバッグに回収し、その後シリンダーに移した。
（表１８）非イオン性界面活性剤を使用しておよび使用せずに行った組換えフューリン希釈実験の実験結果。
２回目の実験においては、試験方法は期待された組換えフューリン活性の８０％を回収したが、対照方法は２７％しか回収しなかった（表１９）。この実験では、組換えフューリン試料をフィルターに通し、次いで２００倍量の希釈液を加えた。濾液をシリンダーに回収した。安定化された組換えフューリン製剤と安定化された希釈液の組み合わせでは、対照方法に比べて組換えフューリンの回収が３〜４倍高まった。理論に拘束されないが、回収の向上はポリソルベート８０の存在と関連があった。
（表１９）非イオン性界面活性剤を使用しておよび使用せずに行った組換えフューリン希釈実験の実験結果。
実施例８−安定化された製剤用ストック緩衝液の特徴
安定化された組換えフューリン製剤用のストック緩衝液（５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭの酢酸、１ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）は、ばらつきなく調製することができる（表２０）。ｐＨと導電度のＲＳＤは＜０．３％であった。ｐＨと温度には、わずかに間接的な相関があり、１℃あたり０．０１４単位低下するが、導電度と温度には直接的な相関があり、１℃あたり０．４０ｍＳ／ｃｍ上昇する（図４９）。ｐＨと導電度を測定したときの試料の平均温度は２７．６℃であった。製造過程では、試料は２５±０．５℃で測定される。図４８の直線回帰を基にして、２５℃での期待されるｐＨと導電度を算出した。表２０からの相対標準偏差をこの値に適用して、期待される範囲（±３ｓｄ）を決定した。２５℃でのｐＨは６．０４（±０．０１）であると期待され、２５℃での導電度は１９．９±０．２ｍＳ／ｃｍであると期待される。これらの期待範囲は、制限環境で製造された３つのロットに基づくものである。緩衝液の仕様の範囲はこれほど厳密に設定する必要はない。ｐＨの仕様は最終的なＢＤＳのｐＨの仕様と同じで５．９０〜６．１０となる。導電度の範囲は先のＢＤＳ緩衝液に使ったものと同様であり、例えば、１５．９〜２３．９ｍＳ／ｃｍの仕様で±２０％の範囲となる。ｒＶＷＦ過程では組換えフューリンは２００倍に希釈されるため、ｒＶＷＦ過程の要件では、一般的に緩衝液の仕様の設定を問題にしない。表２１と表２２に示す実験データは図４９に示したグラフに相当するものである。
安定化された組換えフューリン製剤用のストック緩衝液（５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭの酢酸、１ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）は、ばらつきなく調製することができる（表２０）。ｐＨと導電度のＲＳＤは＜０．３％であった。ｐＨと温度には、わずかに間接的な相関があり、１℃あたり０．０１４単位低下するが、導電度と温度には直接的な相関があり、１℃あたり０．４０ｍＳ／ｃｍ上昇する（図４９）。ｐＨと導電度を測定したときの試料の平均温度は２７．６℃であった。製造過程では、試料は２５±０．５℃で測定される。図４８の直線回帰を基にして、２５℃での期待されるｐＨと導電度を算出した。表２０からの相対標準偏差をこの値に適用して、期待される範囲（±３ｓｄ）を決定した。２５℃でのｐＨは６．０４（±０．０１）であると期待され、２５℃での導電度は１９．９±０．２ｍＳ／ｃｍであると期待される。これらの期待範囲は、制限環境で製造された３つのロットに基づくものである。緩衝液の仕様の範囲はこれほど厳密に設定する必要はない。ｐＨの仕様は最終的なＢＤＳのｐＨの仕様と同じで５．９０〜６．１０となる。導電度の範囲は先のＢＤＳ緩衝液に使ったものと同様であり、例えば、１５．９〜２３．９ｍＳ／ｃｍの仕様で±２０％の範囲となる。ｒＶＷＦ過程では組換えフューリンは２００倍に希釈されるため、ｒＶＷＦ過程の要件では、一般的に緩衝液の仕様の設定を問題にしない。表２１と表２２に示す実験データは図４９に示したグラフに相当するものである。
（表２０）安定化された製剤用ストック緩衝液の特徴。
（表２１）ストック緩衝液の導電度と温度の関係。
（表２２）ストック緩衝液のｐＨと温度の関係。
参考文献
本明細書で引用した全ての参考文献は、あたかも個々の出版物または特許もしくは特許出願が具体的に、かつ、個別にその全体が全ての目的のために参照により組み込まれていることが示されるように、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用した全ての参考文献は、あたかも個々の出版物または特許もしくは特許出願が具体的に、かつ、個別にその全体が全ての目的のために参照により組み込まれていることが示されるように、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
当業者には明らかなように、本出願の精神および範囲から逸脱することなく、本出願の様々な修正形態や変更形態を構築することが可能である。本明細書に記載の具体的な態様は実施例を提供するためだけのものであり、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
Claims (23)
- 以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）１９０±１０ｍＭの薬学的に許容される塩；
（ｃ）０．５ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム；
（ｄ）２％〜２０％の糖または糖アルコール；
（ｅ）１０〜２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および
（ｆ）１０〜２００ｍＭの緩衝剤；および
（ｇ）５．５〜７．５のｐＨ。 - 前記薬学的に許容される塩が塩化ナトリウムである、請求項１記載の組成物。
- ０．９±０．２ｍＭのカルシウムを含む、請求項１記載の組成物。
- １０±２％の糖または糖アルコールを含む、請求項１記載の組成物。
- 前記糖または糖アルコールが、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
- ５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、請求項１記載の組成物。
- 前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１記載の組成物。
- ９０±１０ｍＭの緩衝剤を含む、請求項１記載の組成物。
- 前記緩衝剤が酢酸塩およびＨＥＰＥＳを含む、請求項１記載の組成物。
- ４５±５ｍＭの酢酸塩および４５±５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、請求項９記載の組成物。
- ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項１記載の組成物。
- 以下を含む、安定化された水性組換えフューリン（ｒフューリン）組成物：
（ａ）８，０００Ｕ／ｍＬ〜５００，０００Ｕ／ｍＬのｒフューリン；
（ｂ）１９０ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｃ）０．９２ｍＭのカルシウム；
（ｄ）１０％のトレハロース；
（ｅ）７５ｐｐｍのポリソルベート８０；
（ｆ）４５ｍＭの酢酸；
（ｇ）４６ｍＭのＨＥＰＥＳ；および
（ｇ）５．５〜７．５のｐＨ。 - ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項１２記載の組成物。
- １０±２％の糖または糖アルコールを含む、請求項３記載の組成物。
- ５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、請求項３記載の組成物。
- ５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤を含む、請求項４記載の組成物。
- ９０±１０ｍＭの緩衝剤を含む、請求項３記載の組成物。
- ９０±１０ｍＭの緩衝剤を含む、請求項４記載の組成物。
- ９０±１０ｍＭの緩衝剤を含む、請求項６記載の組成物。
- ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項３記載の組成物。
- ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項４記載の組成物。
- ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項６記載の組成物。
- ６．０±０．２のｐＨを有する、請求項８記載の組成物。
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