RU2610436C2

RU2610436C2 - Составы рекомбинантного фурина

Info

Publication number: RU2610436C2
Application number: RU2013157927A
Authority: RU
Inventors: Майнхард Хасслахер; Анджей ЦИТКОВИЧ; Кэтрин УАЙТ; Кен ФРАНКЕ
Original assignee: Баксалта Инкорпорейтед; Баксалта Гмбх
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2017-02-10
Also published as: US8877473B2; CA2837948A1; AR086672A1; WO2012167271A1; US20150079068A1; RU2013157927A; SG195261A1; JP6064007B2; BR112013030880B1; US20120329128A1; JP2016006106A; ES2715289T3; TWI586802B; KR20140050625A; AU2012261813B2; JP2014519506A; EP2714087A1; CN103889454A; JP5797837B2; BR112013030880A2

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается стабилизированных водных композиций рекомбинантного фурина, где композиции содержат рекомбинантный фурин, фармацевтически приемлемую соль, кальций, сахар или сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и буферные вещества. Группа изобретений обеспечивает сохранение большего количества активности фурина и содержания мономерного фурина, при одновременном снижении агрегации при хранении и/или воздействии механической нагрузки. 2 н. и 40 з.п. ф-лы, 49 ил., 22 табл., 8 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет Предварительной Заявки U.S. No. 61/492,712, поданной 2 июня 2011 года, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте и во всех смыслах.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ОПИСАНИЯ

[0002] Это описание, главным образом, относится к области протеиновых составов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Семейство протеолитических субтилизин-подобных протеиновых конвертаз млекопитающих (SPC или PC) являются гомологичными с бактериальными субтилизинами и дрожжами Кех2р. На сегодняшний день были определены семь различных членов семейств SPC, включая фурин, РС1 (также известный как РС3), РС2, РАСЕ4, РС4, РС5 (также известный как РС6), PC7 (LPC, РС8 или SPC7), каждый из которых проявляет уникальное распределение в тканях.

[0004] Фурин, также называемый РАСЕ (спаренный с щелочным аминокислотным расщепленным энзимом) повсеместно экспрессируется во всех тканях млекопитающих и клеточных линиях и способен обрабатывать широкий спектр биологически активных прекурсорных белков в секреторный путь, включая, в том числе, гормоны, факторы роста, рецепторы, вирусные и бактериальные белки и плазменные белки. Это кальций-зависимая серии ендопротеаза, структурно расположенная в нескольких доменах, а именно сигнальный пептид, пропептид, каталитический домен, средний домен, (также именуемый гомо-В или Р-домен), С-терминально расположенный цистеин-богатый домен, трансмембранный домен и внутриклеточный концевой сегмент. Сайт расщепления фурина протеазы содержит последовательность распознавания, которая характеризуется аминокислотной послдеовательностью Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka и др., J Biol Chem. 1991;266:12127-30).

[0005] Фурин принадлежит к семейству про-белковых конвертаз и зависит от кальция (Са²⁺). Фурин специфически расщепляет С-терминальную пептидную связь аргинина в определенной последовательности, содержащей аргинин в положениях -1 и -4. Эта последовательность может быть найдена в многочисленных белках человека, показывая, что фурин играет важную роль в созревании ряда про-белков человека. Соответственно, фурин представляет собой пропротеин конвертазу, которая перерабатывает латентные белки предшественники в их биологически активные продукты. Фурин представляет собой кальций-зависимую серии эндопротеазу, которая расщепляет белки предшественники на их парные основные аминокислотные сайты процессинга. Одним субстратом для фурина является фактор фон Виллебранда (vWF).

[0006] Фурин (к примеру, рфурин) является способным к превращению про-VWF (προ-фактор фон Виллебранда) в зрелый VWF посредством расщепления Arg741-Ser742 пептидной связи VWF. Этот этап созревания является частью, к примеру, процесса обработки rVWF, который обеспечивает лечение такой болезни фон Виллербанда Типа В. Производства активированных рекомбинантных белков имеет высокую клиническую и диагностическую важность. К примеру, активные или зрелые белки, такие как зрелый VWF, могут быть использованы для контроля сворачивания крови.

[0007] Составы фурина, в частности составы рекомбинантного фурина (рфурин), зачастую имеют малый срок годности (менее чем 6 месяцев) в связи с потерей активности рфурина от разрушения белка (зачастую от саморасщепления белка фурина). Кроме того, при использовании в определенных производственных процессах, таких как производство зрелого vWF, составы рфурина разбавляют, часто в 200 раз, и разбавленный рфурин, главным образом, показывает непропорциональное снижение активности. Соответственно, существует потребность в области способов и составов, которые стабилизируют композиции фурина (к примеру, рфурин), а также способы разбавления композиций коцентрированного фурина (к примеру, рфурин), не теряя значительную часть активности фурина.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Настоящее описание изобретения удовлетворяет эти и другие потребности в области состава фурина (к примеру, рфурина), хранения и обработки посредством предоставления способов и составов для стабилизации фурина (к примеру, композиций рфурина). Эти потребности удовлетворяются, по крайней мере, частично, посредством открытия того, что добавление сахара, сахарных спиртов и/или неионных поверхностно-активных веществ значительно повышает стабильность композиций фурина (к примеру, рфурина) во время хранения и механического воздействия.

[0009] Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает высокостабилизированные составы фурина, в частности высокостабилизированные составы рфурина, которые демонтрируют повышенную устойчивость в условиях повышенной температуры, перемешивания и различных рН по сравнению с начальными (контрольными) составами фурина.

[0010] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабилизированную водную композицию рекомбинантного фурина (рфурина), композиция содержит: от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина; от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта; от 10 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества; от 10 до 200 ммоль буферного вещества; и значение рН от 5.5 до 7.5.

[0011] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 150 ммоль до 250 ммоль фармацевтически приемлемой соли. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 190±10 ммоль фармацевтически приемлемой соли. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли.

[0012] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия.

[0013] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 0.9±0.2 ммоль кальция. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 0.92 ммоль кальция.

[0014] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 5% до 15% сахара или сахарного спирта. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 10% сахара или сахарного спирта.

[0015] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт выбран из группы, которая состоит из сахарозы, трегалозы, маннита и их комбинаций. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт представляет собой сахарозу.

[0016] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 50 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0017] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80.

[0018] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 50 ммоль до 150 ммоль буферного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 90±10 ммоль буферного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 91 ммоль буферного вещества.

[0019] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит ацетат.В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит HEPES. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит MES. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит ацетат и HEPES.

[0020] В одном воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают от 25 ммоль до 75 ммоль ацетата и от 25 до 75 ммоль HEPES. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 45±5 ммоль ацетата и 45±5 ммоль HEPES. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 45 ммоль ацетата и 46 ммоль HEPES.

[0021] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 7.0. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0±0.2. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0.

[0022] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0023] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет високий процент активности рфурина при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0024] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0025] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0026] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент активности фурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0027] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0028] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0029] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент активности рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0030] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0031] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабилизированные водные композиции рекомбинантного фурина (рфурина), композиция содержит: от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина; 190 ммоль хлорида натрия; 0.92 ммоль кальция; 10% трегалозы; 75 ppm полисорбата-80; 45 ммоль уксусной кислоты; 46 ммоль HEPES; и значение рН от 5.5 до 7.5.

[0032] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 7.0. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0±0.2. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0.

[0033] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает способ разбавления водной композиции рфурина, где способ включает добавление буфера разбавления, содержащего от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества в водную композицию рфурина, образуя при этом разбавленную композицию рфурина.

[0034] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит от 50 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0035] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН от 5.5 до 7.5. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН 6.0±0.2. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН 6.0.

[0036] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, разбавленная композиция рфурина содержит по крайней мере 50% активности рфурина в водной композиции рфурина до разбавления.

[0037] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, разбавленная композиция рфурина содержит по крайней мере 75% активности рфурина в водной композиции рфурина до разбавления.

[0038] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), указанный состав содержит: 8,000-52,000 Ед/мл рфурина; от 1 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; 0.1 ммоль до 2 ммоль хлорида кальция; от 1% до 20% сахара и/или дигидрата сахара; от 50 до 100 ppm поверхностно-активного вещества; и от 1 ммоль до 100 ммоль карбоновой кислоты, буферное вещество в концентрации, достаточной для поддержания значения рН 4.0-7.0, или оба указанную карбоновую кислоту и указанное буферное вещество.

[0039] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 180-200 ммоль соли.

[0040] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, соль представляет собой хлорид натрия.

[0041] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 0.5-1.0 ммоль кальция.

[0042] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 5-15% сахара или дигидрат сахара.

[0043] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, сахар или дигидрат сахара является выбранным из группы, которая состоит из сахарозы, трегалозы, маннита и их комбинаций.

[0044] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80.

[0045] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от около 65 до около 85 ppm.

[0046] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, карбоновая кислота представляет собой уксусную кислоту.

[0047] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, карбоновая кислота находится в концентрации 35-55 ммоль.

[0048] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, буферное вещество представляет собой HEPES.

[0049] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, буферное вещество находится в концентрации от около 20 до около 100 ммоль.

[0050] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, состав демонстрирует улучшенную стабильность после хранения при 37°С по сравнению с составом, который не содержит сахар или дигидрат сахара.

[0051] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, состав получают путем добавления рфурина в композицию, которая содержит 1% полисорбата-80, 500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль хлорида кальция и порошка дигидрата трегалозы, в котором указанный состав имеет значение рН 6.0 перед добавлением в указанный рфурин.

[0052] В одном аспекте настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), указанный состав содержит: 8,000-57,000 Ед/мл рфурина; 190 ммоль хлорида натрия; 0.92 ммоль хлорида кальция; 10% вес/вес дигидрата трегалозы; 75 ppm полисорбата-80; 45 ммоль уксусной кислоты и 46 ммоль HEPES.

[0053] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), который содержит: (а) 8,000-52,000 Ед/мл рфурина; (b) от 1 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; (с) от 0.1 ммоль до 2 ммоль хлорида кальция; (d) от 1% до 20% сахара и/или дигидрата сахара; (е) от 50 до 100 ppm поверхностно-активного вещества; и (f) от 1 ммоль до 100 ммоль карбоновой кислоты или буферного вещества в концентрации, достаточной для поддержания значения рН 4.0-7.0 или оба, и карбоновую кислоту, и буферное вещество.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0054] Фигура 1. рФурин в контрольном составе - исследование температуры, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в контрольном составе были инкубированы при: комнатной температуре, 37°С или 45°С на период до семи дней. Активность образцов рфурина проиллюстрирована в зависимости от количества дней инкубации. Величины погрешностей составляют ±1 стандартной девиации; n=4.

[0055] Фигура 2. рФурин в контрольном составе - исследование температуры, проанализированное с использованием SEC. Те же образцы, как на ФИГ. 1, были проанализированы с использованием SEC. Относительные пиковые значения рфурина проиллюстрированы в зависимости от количества дней инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентное содержание пиков рфурина в нулевой момент времени.

[0056] Фигура 3. рФурин в контрольном составе, инкубированном при 37°С, проанализирован с использованием SEC. Образцы рфурина в контрольном составе были инкубированы при 37°С в течение семи дней. Фигура 3 иллюстрирует наложение профилей поглощения SEC при 280 нм в шести моментах времени. Такое же исследование как на ФИГ. 1.

[0057] Фигура 4. рФурин в контрольном составе, инкубированном при комнатной температуре и 37°С, проанализирован с использованием Вестерн-блоттинга. Такие же исследования, как на ФИГ. 1. Полоса: (1) MWM маркер; (2) Τ=0; (3) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 1 дня; (4) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 2 дней; (5) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 3 дней; (6) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 7 дней; (7) MWM маркер; (8) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 1 дня; (9) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 2 дней; (10) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 3 дней; и (11) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 7 дней.

[0058] Фигура 5. рФурин в контрольном составе - исследования замораживания/оттаивания, проанализированные с использованием теста активности фурина. Активность рфурина показана в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0059] Фигура 6. рФурин в контрольном составе - исследования замораживания/оттаивания, проанализированные с использованием SEC. Пиковые значения рфурина показаны в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания.

[0060] Фигура 7. рФурин в контрольном составе - стадия перемешивания, проанализированная с использованием теста активности. Активность рфурина показана в зависимости от времени перемешиваниия. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0061] Фигура 8. рФурин в контрольном составе - стадия перемешивания, проанализированная с использованием SEC. Пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени перемешиваниия.

[0062] Фигура 9. Сравнение различных долей рфурина с использованием способа Вестерна-блоттинга. Различные доли рфурина были проанализированы с использованием способа Вестерна-блоттинга. Порядок представления обозначается по алфавиту. Полоса: (1) MWM маркер; (2) пример фурина; (3) 03-04-09 (партия 018342, 2 мл сосуд); (4) 03-08-09 (партия 018365, 2 мл сосуд); (5) 03-15-09 (партия 018366, 2 мл сосуд); (6) 03-01-09 (партия 018315, 2 мл сосуд); (7) 07-26-10 (партия Х572, 200 мл бутылка); (8) 03-06-09 (партия 018365, 200 мл бутылка); (9) 08-01-10 (партия Х576, 200 мл бутылка); (10) 03-09-09 (партия 018366, 200 мл бутылка); (11) MWM маркер; (12) пример фурина; (13) 08-03-10 (партия Х577, 200 мл бутылка); (14) 07-24-10 (партия Х573, 200 мл бутылка); (15) 07-30-10 (партия Х575, 200 мл бутылка); (16) 018346 (QC Стабильность при -80°С); (17) 018346 (QC Стабильность при -25°С); (18) 018315 (QC Стабильность при -80°С); и (19) 018315 (QC Стабильность при -25°С).

[0063] Фигура 10. Влияние способа оттаивания на активность рфурина, проанализированное с использованием теста активности фурина. Активность образцов рфурина показана в виде столбиков для различных партий рфурина расстаявшего при: или 4°С (левый) или комнатной температуре (RT; правый). Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0064] Фигура 11. Воздействие значения рН 5 и 5.5 на активность рфурина, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина были инкубированы при 37°С при любом рН: 5.0, 5.5, или 6.0 (контрольный состав) в течение периода до семи дней. Активность образцов рфурина показана в зависимости от количества дней инкубации. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0065] Фигура 12. Воздействие значения рН 5 и 5.5 на активность рфурина, проанализированное с использованием SEC. Образцы рфурина были инкубированы при 37°С при любом рН: 5.0, 5.5 или 6.0 (контрольный состав). Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации. Относительные пиковые значения были рассчитаны как процентное значение пикового значения фурина в нулевые моменты времени.

[0066] Фигура 13. Стабильность рфурина при 37°С в контрольном составе, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина в контрольном составе был инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0067] Фигура 14. Стабильность рфурина в MES рН 6.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0068] Фигура 15. Стабильность рфурина в HEPES рН 7.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан HEPES (конечные С=100 ммоль, рН 7.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0069] Фигура 16. Стабильность рфурина в HEPES рН 8.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан HEPES (конечные С=100 ммоль, рН 8.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0070] Фигура 17. Воздействие добавок сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием SEC. Образцы были инкубированы при 37°С в течение четырех дней. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентные значения от высоты пиков рфурина в нулевой момент времени.

[0071] Фигура 18. Воздействия добавок сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, контрольный состав плюс 10% сахароза, и контрольный состав плюс 10% сахароза плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения = 4.

[0072] Фигура 19. Воздействие сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина в MES буфере при 37°С, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0), обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6. плюс 10% сахароза, и обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) плюс 10% сахароза плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0073] Фигура 20. Сравнение стабильности рфурина при 37°С в контрольном составе с составом в MES буфере, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, контрольный состав плюс 10% сахарозы, и обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) плюс 10% сахарозы. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0074] Фигура 21. Сравнение стабильности рфурина при 37°С в сахарозе с маннитом, проанализированное с использованием теста активности фурина. Все образцы были обработаны HEPES/уксусной кислотой, рН 6.0. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: без добавок, 10% сахарозы, 10% маннита, 10% сахарозы плюс 25 ppm полисорбата-80 и 10% маннита плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0075] Фигура 22. Стабильность рфурина при 37°С: Сахароза в сравнении с маннитом, проанализированная с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 21, были проанализированы с использованием SEC. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентные значения от высоты пиков фурина в нулевой временной точке.

[0076] Фигура 23. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С, проанализированная посредством теста активности фурина. Воздействия различных количеств трегалозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С были изучены с использованием теста активности фурина. Сначала все образцы были обработаны HEPES и уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0) затем, или 10% сахарозы или различные коллличества трегалозы и/или полисорбата-80 были добавлены. Образец рфурина в контрольный состав также включен. Данные сортируются от высших до низжих значений активности после 5 дней инкубации при 37°С (правая черта в каждой паре). Левая черта в каждой паре изображает значения активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0077] Фигура 24. Активность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С.Такие же образцы как на ФИГ. 23 отображаются после перерасчета, чтобы показать какой процент от первоначальной активности каждого образца остался после пяти дней инкубации при 37°С. Образец рфурина в контрольный состав также включен. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0078] Фигура 25. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С проанализированная с использованием SEC. Такие же образцы как на ФИГ. 24. График показывает, какой процент от начального пика фурина каждого образца остался после пяти дней инкубации при 37°С. Образец рфурина в контрольный состав также включен.

[0079] Фигура 26. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 35°С, проанализированная с использованием способа Вестерна-блоттинга. Такие же образцы, как на ФИГ. 24. Образцы взяты парами: первый образец - в начале отсчета времени, второй образец - инкубирован при 37°С в течение 5 дней. Линии: (1) MWM маркер; (2) источник фурина, (3) контроль; (4) контрольный состав, Т=0; (5) контрольный состав, 5 дней; (6) 10% сахароза, Τ=0; (7) 10% сахароза, 5 дней; (8) 2% трегалоза, Т=0; (9) 2% трегалоза, 5 дней; (10) 10% трегалоза, Т=0; (11) 10% трегалоза, 5 дней; (12) MWM маркер; (13) источник фурина; (14) контроль; (15) 5% трегалоза, Т=0; (16) 5% трегалоза, 5 дней; (17) 5% трегалоза, +10 ppm Твин 80, Т=0; (18) 5% трегалоза,+10 ppm Твин 80, 5 дней; (19) 5% трегалоза, +25 ppm Твин 80, Т=0; (20) 5% трегалоза,+25 ppm Твин 80, 5 дней; (21) 5% трегалоза, +100 ppm Твин 80, Т=0; и (22) 5% трегалоза, +100 ppm Твин 80, 5 дней.

[0080] Фигура 27. Воздействие содержания трегалозы на активность рфурина протестированная после 5 дней инкубации при 37°С.Такой же эксперимент как на ФИГ. 24. Сначала, все образцы были обработаны HEPES и уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0) затем, различные количества трегалозы были добавлены. Активность фурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от процентного значения трегалозы, добавленной в образцы. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0081] Фигура 28. Воздействие содержания трегалозы на стабильность рфурина при 37°С проанализировано с использованием SEC после 5 дней инкубации. Такой же эксперимент, как на ФИГ. 27. Высота пиков рфурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от процентного значения трегалозы добавленной к образцам.

[0082] Фигура 29. Воздействие содержания полисорбата-80 на активность рфурина, протестированное после 5 дней инкубации при 37°С.Такой же эксперимент, как на ФИГ. 24. Сначала все образцы были обработаны HEPES, уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0), и 5% трегалозой затем различные количества полисорбата-80 были добавлены. Активность фуриана после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от количества полисорбата-80, добавленного к образцам. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0083] Фигура 30. Воздействие содержания Полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием SEC после 5 дней инкубации. Такие же образцы, как на ФИГ. 29. Высота пиков рфурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от количества полисорбата-80, добавленного к образцам.

[0084] Фигура 31. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в высокостабилизированном составе были обработаны различными колличествами полисорбата-80. График показывает значения активности фурина до и после трех часов перемешиваниия. Значения отсортированы от наибольшей до наименьшей активности. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4. Левые черты в каждой паре показывают активность при времени 0, правые черты в каждой паре показывают активность после перемешиваниия.

[0085] Фигура 32. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Такой же эксперимент как на ФИГ. 31. График показывает высоты пиков фурина до и после трех часов перемешиваниия. Значения отсортированы от наибольшего до наименьшего. Левые черты в каждой паре показывают активность при времени 0, правые черты в каждой паре показывают активность после перемешиваниия.

[0086] Фигура 33. рФурин в высокостабилизированном составе - воздействие содержания полисорбата в исследовании перемешивания, проанализированное с использованием теста активности фурина. Такие же образцы, как на ФИГ. 32. Активность фурина после трех часов перемешивания показана в зависимости от содержания полисорбата-80. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0087] Фигура 34. рФурин в высокостабилизированном составе - воздействие полисорбата-80 в исследовании перемешивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 32. Высоты пиков рфурина после трех часов перемешивания показаны в зависимости от содержания полисорбата-80.

[0088] Фигура 35. рФурин в контрольном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Хроматограмма показывает наложение SEC профилей поглощения при 280 нм сравнении образцов рфурина в контрольном составе до и после трех часов перемешивания. Пик рфурина перемешанного образца значительно меньше, чем в контрольном образце. Наблюдается отсутствие высоких пиков молекулярных масс в перемешанном образце (см. параграф 3.5.1 для пояснения).

[0089] Фигура 36. УФ спектр рфурина в контрольном составе (такие же образцы, как на ФИГ. 35). УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает наклоненный и чрезвычайно повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие значительного уровня агрегатов в возбужденном образце.

[0090] Фигура 37. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе без полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие значительного уровня агрегатов в перемешанном образце.

[0091] Фигура 38. рФурин в высокостабилизированном составе без полисорбата-80 - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Хроматограмма показывает наложение SEC профилей поглощения при 280 нм, сравнивая образцы рфурина в высокостабилизированном составе без полисорбата-80 до и после трех часов перемешивания. Пик рфурина перемешанного образца значительно ниже, чем у контрольного образца. Наблюдается отсутствие высоких пиков молекулярных масс.

[0092] Фигура 39. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 10 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает слегка повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие агрегатов в возбужденном образце. Спектр состояния 'перемешивания' ближе к спектру состояния 'перед перемешиванием', по отношению к тем, которые наблюдаются в образцах без полисорбата (Фигуры 36 и 37), которые показывают, что уровень агрегации меньше, чем тот, который виден в образцах без полисорбата.

[0093] Фигура 40. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 25 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает слегка повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие небольшого количества агрегатов в перемешанном образце.

[0094] Фигура 41. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 50 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает очень схожий профиль с образцом до перемешиваниия. Спектр ни наклонен, ни повышен, что свидетельствует о том, что ни один образец не содержит значительное количество крупных агрегатов.

[0095] Фигура 42. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 100 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает очень схожий профиль с образцом до перемешиваниия. Спектр ни наклонен, ни повышен, что свидетельствует о том, что ни один образец не содержит значительное количество крупных агрегатов.

[0096] Фигура 43. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в высокостабилизированном составе были обработаны различными количествами полисорбата-80. Данные показывают активность рфурина в образцах до и после 5 циклов замораживания/оттаивания. Данные отсортированы от наибольшего до наименьшего. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0097] Фигура 44. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы как на Фигуре 43. Данные показывают высоты пиков рфурина до и после 5 циклов замораживания/оттаивания. Данные отсортированы от наибольшего до наименьшего.

[0098] Фигура 45. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 44. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания. Относительные пиковые значения были рассчитаны как процентные значения высот от пиков рфурина перед первым циклом замораживания/оттаивания.

[0099] Фигура 46. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С, проанализированная с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в либо контрольном составе, либо в высокостабилизированном составе были инкубированы при 37°С в течение 4 дней. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0100] Фигура 47. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С, проанализированная с использованием теста активности фурина. Такие же образцы, как на ФИГ. 46 перерассчитаны. Относительная активность каждого образца была рассчитана как процент от начальной активности. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0101] Фигура 48. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С проанализирована с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 46. Относительная высота пика рфурина для каждого образца была рассчитана как процент от начальной высоты пика. Величины погрешностей составляют±1 стандартного отклонения; n=4.

[0102] Фигура 49. Воздействие температуры на рН (В) и электропроводность (А) высокостабилизированного состава буферного раствора (500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль CaCl₂, рН 6.0).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Введение

[0103] Настоящее изобретение частично основано на открытии, что водные композиции фурина могут быть стабилизированы против различных химических и механических напряжений путем добавления сахаров, сахарных спиртов и неионных поверхностно-активных веществ. Водные композиции фурина, описанные здесь, являются значительно более стабильными при хранении при или выше комнатной температуры, а также при воздействии механических нагрузок по сравнению с аналогичными композициями фурина, которые не имеют сахаров, сахарных спиртов и неионных поверхностно-активных веществ. Настоящее изобретение также частично основано на открытии того, что добавление неионных поверхностно-активных веществ к буферам для разбавления фурина позволяет большее восстановление активности фурина, когда энзим является разбавленным до более низких концентраций, используемых при производстве различных рекомбинантных препаратов, таких как VWF.

[0104] Предпочтительно, чтобы исследования, описанные здесь, показывали, что добавление сахара или сахарных спиртов к композиции фурина улучшает стабильность композиции при хранении в течение определенного периода времени. К примеру, здесь показано, что добавление небольшого количества как 2% сахара или сахарного спирта в водную композицию фурина может увеличить стабильность композиции больше чем на 10%. Кроме того, показано, что добавление 10% сахара или сахарного спирта в водную композицию фурина может увеличить стабильность композиции больше чем на 75%.

[0105] Предпочтительно, чтобы исследования, описанные здесь, также показывали, что добавление неионного поверхностно-активного вещества к композиции фурина улучшает стабильность композиции при воздействии механических нагрузок. К примеру, показано здесь, что добавление небольшого количества как 10 ppm неионного поверхностно-активного вещества в водную композицию фурина может увеличить стабильность композиции больше чем на 75%.

[0106] Предпочтительно, чтобы исследования, описанные здесь, также показывали, что добавление неионного поверхностно-активного вещества к буферу для разбавления фурина, увеличивает восстановление активности фурина после разбавления. К примеру, здесь показано, что добавление 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества в буфере для разбавления фурина увеличивает восстановление активности фурина после разбавления в 3-4-раза.

[0107] Соответственно, настоящее описание обеспечивает композиции высокостабилизированных составов. Хотя большинство обсуждений здесь представлено в терминах высокостабилизированных составов рекомбинантного фурина (рфурин), следует иметь ввиду, что любой белок фурина, в том числе фурин, изолированный от объекта или любых производных или мутантов фурина, может быть включен в композиции настоящего изобретения.

[0108] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает высокостабилизированные составы фурина, которые показывают улучшенную стабильность по сравнению с контрольными составами, когда анализировали после того, как подвергали состав одному или более нагрузкам, включая, без ограничения, воздействие на лекарственные формы в диапазоне температур, до нескольких циклов замораживания/оттаивания, и/или перемешивания. Улучшенную активность, как правило, оценивали по уровню активности фурина - к примеру, после хранения при высшей температуре, чем среда комнатной температуры, высокостабилизированный состав фурина будет показывать более высокий уровень активности, чем контрольный состав, сохраненный при одинаковых условиях по сравнению с активностью каждого перед хранением (к примеру, при времени = 0). Способы оценки устойчивости состава фурина описаны здесь.

[0109] В других аспектах, настоящее описание обеспечивает способы для формирования высокостабилизированных составов фурина настоящего изобретения. Такие способы включают способы для стабилизации состава фурина для хранения, включая хранение при замораживании, хранение при температуре среды комнаты или выше или лиофилизацию.

[0110] В других аспектах, настоящее описание обеспечивает способы разбавления концентрированных растворов фурина, которые приводят к увеличению удержания активности фурина после разбавления. По сравнению с разбавленными композициями фурина с растворами, в которых отсутсвует неионное поверхностно-активное вещество, водные композиции фурина разводили в соответствии со способами, представленными здесь, удерживали в 3-4 раза больше ферментативной активности.

II. Определения

[0111] Как здесь используется, термин "фурин" относится к любому белку или полипептиду с активностью фурина, в частности, способостью к разрыву пептидной связи между остатками Arg-763 и Ser-764 полипептида до-Фактора фон Виллебранда (до-VWF). В примерном воплощении, фурин относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную или в высшей степени идентичную к такой NP_002560.1 (человеческий фуриновый препробелок). В примерном воплощении, фурин относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную или в высшей степени идентичную к аминокислотам 25-794 NP_002560.1 (человеческий фуриновый пробелок). В примерном воплощении, фурин относится к полипептиду, который содержит аминоксилотную последовательность, идентичную или в высшей степени идентичную к аминокислотам 108-794 NP_002560.1 (человеческий зрелый фуриновый белок). Как здесь используется, полипептиды фурина также включают природные варианты фурина с VWF расщепляющей активностью, также как и модифицированные фуриновые компоненты структуры с VWF расщепляющей активностью. Как здесь используется, фурин охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые сохраняют некоторую базальную активность (к примеру, по крайней мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или большей активностью по сравнению с активностью немутатного типа фурина). Примеры мутаций фурина, указанных в популяции человека включают, без ограничений, А43Е, A43G, A43V, R50W, Y64C, L77P, R81C, Е97А, E97V, V109M, V109L, R130W, A139V, Р169Т, N245S, Е271К, Q339R, N407S, E457Q, R464W, K469R, S524Y, T536S, L570F, D624N, А642Т, S685P, V728I, V735I, R745Q, P772L и А793Т. Полипептиды фурина также включают полипептиды, содержащие посттрансляционную модификацию. К примеру, было показано, что фурин фосфорилируется по остаткам S773 и S775 и предсказано, что фурин гликолизируется по остаткам N387, N440 и N553.

[0112] В контексте настоящего описания, протеины фурина включают рекомбинантные полипептиды фурина, а также родные плипептиды фурина, выделенные из исходного материала (к примеру, ткани или крови). Полипептиды фурина (рекомбинантные или исходные очищенные) могут быть производными от любого подходящего организма, к примеру, млекопитающего, такого как примат, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызун, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собака, кошка и их биологически активные производные. Мутант и вариант полипептидов фурина, имеющих VWF расчепляющую активность, являются также выбранными, как функциональные фрагменты и слитные белки, содержащие полипептиды фурина. Кроме того, полипептиды фурина, описанные здесь, могут дополнительно содержать метки, которые облегчают очистку, обнаружение или оба. Полипептиды фурина, описанные здесь, могут дополнительно быть модифицированы терапевтическим компонентом или компонентом, подходящим для создания изображения in vitro или in vivo.

[0113] Протеолитически активный рекомбинантный фурин может быть получен путем экспрессии в культуре клеток (к примеру, культуры клеток млекопитающих). Неограничивающими примерами способов экспрессии и очищения для приготовления рекомбинантного фурина являются описанные в WO 1991/06314, WO 1992/09698, Патенте США Ном.6,210,929 и 6,596,526, также как в Опубликованной патентной заявке U.S. No. 2009/0181423 и 2009/0304669, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей.

[0114] Как используется здесь, "активность" относится к функциональной активности или активностям фурина или его части, связанной с полной длиной (полного) белка. Функциональная активность включает, но не ограничивается ими, биологическую активность, включая участие в протеолитическом созревании субстратов пробелка и расщепление тестовых субстратов, таких как Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID N0:1; АМС=7-амино-4-метокси кумарин). Субстраты для фурина включают фактор Виллебранда, пропаратироидный гормон, прекурсор трансформирующего ростового фактора бета 1, проальбумин, про-бета-секретазу, мембранный тип-1 матрицу металлопротеинкиназу, и бета субединица про-фактора роста нервов. В одном воплощении, одна единаца (Ед) активности фурина является определенной как количество фурина, который высвобождает 1 пмоль АМС из Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID ΝΟ:1) в минуту.

[0115] Как используется здесь, термин "стабильность" (такая как стабильность фурина или стабильность состава фурина) используется в структурном контексте, к примеру, относится к структурной целостности белка, или в функциональном контексте, к примеру, относится к стабильности белков, чтбы сохранить свою функцию и/или активность с течением времени. Как будет понятно, белок, который обсуждается, может содержаться в фармацевтической композиции в соответствии со способами и композициями, которые описаны здесь, и стабильность этого белка относится к его стабильности в этом составе. В одном из вариантов, стабильность композиции фурина определена путем измерения активности композиции фурина. К примеру, с помощью определяемой подложки фурина, такой как Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1; к примеру, ALX-260-040-M001 продано Enzo Life Sciences), к примеру, в анализе, как описано в Malloy SS, et ai, J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402, содержание которого включено сюда посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В одном варианте осуществления, стабильность композиции фурина сформированной с сахаром, сахарным спиртом и/или неионным поверхностно-активным веществом, как описано здесь, сравнивается с композицией фурина, сформированной без сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества.

[0116] Используемый здесь термин "стабильная при хранении" водная композиция фурина относится к полипептидному раствору фурина (к примеру, полипептидному раствору рфурина), который был разработан для повышения стабильности белка в растворе, к примеру, по меньшей мере, 10% сверх заданного периода хранения. В контексте настоящего описания, полипептидный раствор фурина (к примеру, полипептидный раствор рфурина) может быть сделан "стабильным при хранении" путем добавления сахара, сахарного спирта, или неионного поверхностно-активного вещества как стабилизирующего агента. В некоторых воплощениях, стабильность полипептидов фурина в любом данном составе может быть измерена, к примеру, путем мониторинга образования агрегатов, потери объемной ферментативной активности или образованием продуктов распада в течение определенного периода времени. Абсолютная стабильность препарата и стабилизирующий эффект сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества, будет варьироваться в зависимости от конкретного состава, который является стабилизированным. В одном варианте, стабильность композиции фурина определяется путем измерения активности композиции фурина. К примеру, с использованием определяемого субстрата фурина, такого как Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; к примеру, ALX-260-040-M001 проданного Enzo Life Sciences), в анализе, к примеру, как описано в Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23): 16396-402, содержание которого включено здесь в качестве ссылки во всей полноте для всех целей. В одном из вариантов, стабильность композиции фурина составленной с сахаром, сахарным спиртом и/или неионным поверхностно-активным веществом, как описано здесь, сравнивается с композицией фурина, составленной без сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества.

[0117] Как используется здесь, "срок годности" относится к периоду времени, когда состав поддерживает заданный уровень стабильности при заданной температуре. В конкретных вариантах осуществления, заданная температура относится к заморозке (к примеру, -80°С, -25°С, 0°С), в холодильнике (к примеру, от 0°С до 10°С), или комнатной температуре (к примеру, от 18°С до 32°С) хранения.

[0118] Как используется здесь, термин "время стабильности" относится к продолжительности времени, когда состав считают стабильным. К примеру, время устойчивости препарата может относиться к продолжительности времени, в течение которого уровень агрегации белка и/или деградации в композиции остается ниже определенного порога (к примеру, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, и т.д.), и/или продолжительность времени, когда композиция сохраняет биологическую активность выше определенного порога (к примеру, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, и т.д.) от количества активности, присутствующей в препарате в начале периода хранения.

[0119] В контексте настоящего описания, устойчивая при хранении водная композиция полипептида фурина (к примеру, полипептида рфурина) сформированного с сахаром, сахарным спиртом и/или неионным поверхностно-активным веществом будет иметь больше времени, чем стабильность композиции того же полипептида фурина, составленного без сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества. В некоторых воплощениях, стабильная при хранении водная композиция полипептида фурина будет иметь время стабильности, которое, к примеру, по крайней мере на 10% больше, чем время стабильности для той же самой композиции, составленной в отсутствии сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества, или по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% больше, или по крайней мере в 2 раза больше, или по крайней мере в 2.5 раза, 3.0 раза, 3.5 раза, 4.0 раза, 4.5 раза, 5.0 раза, 5.5 раза, 6.0 раза, 6.5 раза, 7.0 раза, 7.5 раза, 8.0 раза, 8.5 раза, 9.0 раза, 9.5 раза, 10 раза, или больше раз больше, чем время стабильности для той же композиции, составленной в отсутствие сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества.

[0120] Как здесь используется, "хранение" означает, что состав не сразу вводят субъекту или использован в процессе производства один раз, но выдерживают в течение определенного периода времени в определенных условиях (к примеру, определенной температуре) перед использованием. К примеру, состав фурина может храниться в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, перед введением субъекту при различных температурах таких как замораживание (к примеру, -80°С, -25°С, 0°С), в холодильнике (к примеру, от 0°С до 10°С), или комнатной температуре (к примеру, от 18°С до 32°С). Как будет понятно, такие составы могут быть жидкими или лиофилизированными составами.

[0121] Как здесь используется, термин "около" означает приблизительный диапазон плюс или минус 10% от конкретного значения. К примеру, язык "около 20%" включает в себя диапазон 18-22%.

[0122] Как здесь используется, когда речь идет о концентрации отдельного компонента композиции, фразы "не более, чем X" и "от 0 до X" являются эквивалентными и относятся к любой концентрации между и включая 0 и X. К примеру, фразы "концентрация не больше чем 2%" и "концентрация не более чем от 0% до 2%" является эквивалентной и включает 0%, 1% и 2%.

[0123] Как здесь используется, когда речь идет о концентрации отдельного компонента композиции, фразы "не меньше, чем X" относятся к любой концентрации X или выше. К примеру, фраза "концентрация не меньше чем 98%" включает 98%, 99% и 100%.

[0124] Как здесь используется, когда речь идет о концентрации индивидуального компонента композиции, фразы "между X и Y" и "от X до X" являются эквивалентными и относятся к любой концентрации между и включая X и Y. К примеру, фразы "концентрация между 49% и 51%" и "концентрация от 49% до 51%" являются эквивалентными и включают 49%, 50% и 51%.

[0125] Как здесь используется, "сахар" относится к моносахаридам, которые имеют общую формулу С_хН_2уО_у (линейный) или C_xH_(2y-1)O_y (циклический), и дисахариды состоят из двух моносахаридных звеньев, образованных путем реакции дегидратации. Моносахариды могут быть классифицированы по числу атомов углерода, которые они содержат: диоза (2), триоза (3), тетроза (4), пентоза (5), гексоза (6), гептоза (7) и т.д. Соответственно, как здесь используется, С(Х) сахар относится к сахару, содержащему X-число углеродных молекул. К примеру, С(5) сахар относится к сахару пентоза, в то время как С(6) сахар относится к гексоза сахару. Неограничивающие примеры сахаров, которые могут быть использованы в составах, представленных здесь, включают: диозу сахар гликольальдегид, триозу сахара глицеральдегид и дигидроксиацетон; тетрозу сахар эритрозу, треозу, и эритрулозу; сахара пентоза арабиноза, ликсоза, рибоза, ксилоза, рибулоза, и ксилулоза; гексоза сахара аллоза, альтроза, глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, талоза, псикоза, фруктоза, сорбоза, и тагатоза; гептоза сахара седогептулоза, манногептулоза, и L-глицеро-D-манно-гептоза; и все возможные комбинации дисахаридов сахара, образованных из них, включая без ограничения сахарозу, лактулозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, койибиозу, нигерозу, изомальтозу, β,β-трегалозу, α,β-трегалозу, софорозу, ламинарибиозу, гентиобиозу, туранозу, мальтулозу, палатинозу, гентиобиулозу, маннобиозу, мелибиозу, мелибиулозу, рутинозу, рутинулозу и ксилобиозу.

[0126] Как здесь используется, "сахарный спирт" относится к гидрогенизированной форме моно- или дисахарида, чья карбонильная группа была снижена, чтобы сформировать первичный или вторичный гидроксил. В одном воплощении, сахарный спирт имеет между около 4 и около 8 атомов углерода. Неограничивающие примеры сахарных спиртов, которые могут быть использованы в составах, представленных здесь, включают гликоль, глицерин, эритритол, треит, рибит, фуцитол, идит, волмитол, изомальт, мальтит, лактит, маннита, сорбит, инозитол, галактит, дульцит, ксилит, и арабит.

[0127] Как здесь используется, "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая является безопасной для введения субъекту (к примеру, человеку) в лекарственной форме. Выбор и применение фармацевтически приемлемых солей хорошо известен в уровне техники, к примеру, смотри Stahl and Wermuth, Pharmaceutical Salts: Properties. Selection, and Use, 2nd Revised edition. Wiley, Hoboken, New Jersey. В конкретных воплощениях, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию.

[0128] Как здесь используется, термин "неионное поверхностно-активное вещество" относится к поверхностно-активному агенту, который является неионизированным при физиологически соответствующих условиях. Неограничивающие примеры неионных поверхностно-активных веществ, полезных для стабилизации водных композиций фурина, представленные здесь, включают: неионные растворимые в воде moho-, ди-, и три- глицериды (к примеру, пропилен гликоля дикарпилат/дикарпат (к примеру, MIGLYOL^® 840), моно- и диглицериды со средней цепью (к примеру, CAPMUL^® и IMWITOR^® 72), триглицериды со средней цепью (к примеру, каприловые и каприевые триглицериды, такие как LAVRAFAC, MIGLYOL^® 810 или 812, CRODAMOL^® GTCC-PN, и SOFTISON 378), моноглицериды с длинной цепью (к примеру, глицерил моноолеаты, такие как PECEOL^®, и глицерила монолинолеаты, такие как MAISINE^®), полиоксил касторовое масло (к примеру, макроголглицерин рицинолеат, макроголглицерин гидроксистеарат, макрогол цетостеариловый эфир)); неионные растворимые в воде моно- и ди-жирно кислотные сложные эфиры полиэтиленгликоля; неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирных кислот (к примеру, сорбитан монолаураты, такие как полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (TWEEN 20) и сорбитан монолаурат (SPAN 20); сорбитан монопальмитаты, такие как полиоксиэтилен (20) сорбитан монопальмитаты (TWEEN 40) и сорбитан монопалмитат (SPAN 40); сорбитан моностеараты, такие как полиоксиэтилен (20) сорбитан моностеарат (TWEEN 60) и сорбитан моностеарат (SPAN 60); сорбитанмоноолеаты, такие как полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат (TWEEN 80) и сорбитанмоноолеат (SPAN 80); сорбитан триолеаты, такие как сорбитан триолеат (SPAN 85); и сорбитан тристеараты, такие как сорбитан тристеарат (SPAN65)); полигликолизированные глицериды (к примеру, лауроил макрогол-6 глицериды (Labrafil^® M2130CS); d-α-токоферил полиэтиленгликоль 1000 сукцинат (TPGS), полиэтиленгликоль 660 12-гидроксистеарат (SOLUTOL® HS 15), полиоксил олеат и стеарат (к примеру PEG 400 моностеарат и PEG 1750 моностеарат)); неионные растворимые в воде триблоксополимеры (к примеру, поли(этиленоскид)/поли-(пропиленоксид)/поли(этиленоксид) триблоксополимеры, такие как метил-оксиран полимер с оксиран ВНТ (PLURONIC^® F-127)).

[0129] В одном воплощении, устойчивые к хранению композиции фурина (к примеру, рфурин) являются обеспеченными, которые содержат неионное поверхностно-активное вещество, выбранное из неионного растворимого в воде моноглицерида, неионного растворимого в воде диглицерида, неионного растворимого в воде триглицерида, неионных растворимых в воде моноэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионных растворимых в воде диэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, неионного полигликолизированного глицерида, неионного растворимого в воде триблоксополимера, и их комбинации.

[0130] Как здесь используется, термин "биологически активное производное", когда применяется в контексте полипептида фурина, также охватывает полипептиды, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Это может включать любой способ, известный в уровне техники для (i) получения рекомбинантной ДНК способом генной инженерии, к примеру, через обратную транскрипцию РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введением рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки по трансфекции, к примеру, через электропорацию или микроинъекции, (iii) культивирование указанных трансформированных клеток, к примеру, в непрерывном или периодическом режиме, (iv) экспрессией белка фурина, к примеру, постоянно или при индукции, и (v) выделение указанного белка фурина, к примеру, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для того, чтобы (vi) получать по существу очищенный рекомбинантный белок фурина, к примеру, через ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию размеров, аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию и тому подобное. Термин "биологически активное производное" включает также химерные молекулы, такие как, к примеру, белок фурина, или их функциональный фрагмент, в комбинации со вторым полипептидом, к примеру, доменом иммуноглобулина Fe или доменом альбумина, с целью улучшения биологических/фармакологических свойств таких как, к примеру, полураспад фуринового белка в циркуляционной системе млекопитающего, в частности человека.

[0131] Как здесь используется и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа "a," "an," и "the" включают множество ссылок на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Так, к примеру, ссылка на "буферное вещество" относится к одному агенту или смеси таких агентов, и ссылка на "способ" включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные специалисту в данной области техники, и тому подобные.

[0132] Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Все публикации, упомянутые здесь, упомянуты здесь в качестве ссылки с целью описания и раскрытия устройств, композиций, составов и способий, которые описаны в публикации и которые могут быть использованы в связи с описываемым здесь изобретением.

[0133] Если диапазон значений установленный, это следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное, между верхней и нижней границы этого диапазона и любого другого указанного или промежуточного значения в этом установленном диапазоне охватывается настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, также входят в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Где указанный диапазон включает один или более пределов, диапазоны, исключающие любой из обеих включенных пределов также включены в изобретения.

[0134] Как здесь используется, "BDS" относится к "Bulk Drug Substance."

III. Стабилизированные водные композиции рекомбинантного фурина

[0135] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабильные водные составы фурина, к примеру, рфурин. Следующие варианты частично основаны на том открытии, что добавление сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества стабилизируют водные композиции фурина, по сравнению с композициями, которые не содержат сахара, сахарного спирта и/или неионного поверхностно-активного вещества.

[0136] Как будет признано специалистом в данной области техники, композиции фурина {к примеру, рфурина композиции), составленные в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, могут содержать, в дополнение к компонентам ясно описанным, противоионы, которые вносят вклад добавлением компонентов раствора или рН модифицирующие агенты, к примеру, натрий или калий предоставленный из соли ацетата, гидроксида натрия или гидроксида калия или хлорида, предоставленного посредством хлорида кальция или соляной кислоты. В контексте настоящего описания, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурина), состоящая или содержащая, по существу, состав может дополнительно содержать один или больше противоионов, как обусловлено посредством процессом образования при конкретном рН.

[0137] В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, композиция рфурина) обеспеченная тут, будет стабильной при комнатной температуре (к примеру, между18°С и 32°С) в течение периода времени. К примеру, в одном воплощении, стабильная при хранении, водная композиция иммуноглобулина будет стабильной при хранении при комнатной температуре в течение по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 или больше дней. В другом воплощении, композиция будет стабильной, на протяжении по крайней мере 1 месяца. В еще другом воплощении, композиция будет стабильной на протяжении по крайней мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29,30,31,32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или больше месяцев. В конкретных воплощениях, комнатная температура относится к между 20°С и 30°С, между 21°С и 29°С, между 22°С и 28°С, между 23°С и 27°С, между 24°С и 26°С, или около 25°С. В конкретном варианте, композиция будет стабильной в течение продолжительного периода времени при хранении при температуре между 20°С и 25°С.

[0138] В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, композиция рфурина), обеспеченная тут, будет стабильной при температуре охлаждения (к примеру, между 2°С и 10°С) в течение периода времени. К примеру, в одном воплощении стабильная при хранении водная композиция иммуноглобулина будет стабильной, когда сохраняется при температуре охлаждения на протяжении по крайней мере 4 дней. В другом воплощении, композиция будет стабильной при температуре охлаждения, на протяжении по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 или больше дней. В другом воплощении, композиция будет стабильной, на протяжении по крайней мере 1 месяца. В еще другом воплощении, композиция будет стабильной, на протяжении по крайней мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или больше месяцев. В конкретном варианте, композиция будет стабильной в течение продолжительного периода времени при хранении при температуре между 2°С и 8°С.

[0139] В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, композиция рфурина) обеспеченная тут, будет стабильной при повышенной температуре (к примеру, между 32°С и 42°С) в течение периода времени. К примеру, в одном воплощении, стабильная при хранении, водная композиция иммуноглобулина будет стабильной, когда сохраняется при повышенной температуре на протяжении по крайней мере 4 дней. В другом воплощении, композиция будет стабильной при повышенной температуре на протяжении по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 или больше дней. В другом воплощении, композиция будет стабильной, на протяжении по крайней мере 1 месяца. В еще другом воплощении, композиция будет стабильной, на протяжении по крайней мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или больше месяцев. В конкретном варианте, композиция будет стабильной в течение продолжительного периода времени при хранении при температуре между 35°С и 40°С.

[0140] В одном воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабильной при хранении так долго, пока композиция удерживает по крайней мере 40% активности фурина, представленной в начале периода хранения (к примеру, при времени = 0). В другом воплощении, сохраняемая композиция считается стабильной при условии, что композиция содержит по крайней мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше активности фурина, представленной на старте периода хранения (к примеру, при времени = 0). В одном воплощении, активность фурина измерена в анализе, как описано в Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23): 16396-402.

[0141] В одном воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере 10% больше активности фурина после хранения в течение периода времени, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующего агента или содержащая меньшее количество стабилизирующего агента. В другом воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества) когда композиция содержит по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%. или больший процент активности фурина после хранения в течение периода времени, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующего агента или содержащая меньшее количество стабилизирующего агента.

[0142] В одном воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабилизированной при условии, что процент фурина, присутствующего в агрегированном состоянии, остается не более чем 50%. В другом воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабильной при условии, что процент фурина присутствующий в агрегированном состоянии, остается не более чем 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше.

[0143] В одном воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере меньше 10% присутствующего фурина в агрегированном состоянии после хранения в течение периода времени, по сравнению с композицией фурина, не содержащей стабилизирующий агент или содержащий меньшее количество стабилизирующего агента. В другом воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%) или больший процент меньшего количетсва фурина, представленного в агрегированном состоянии после хранения в течение периода времени, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующий агент или содержит меньшее количество стабилизирующего агента.

[0144] В одном воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабильной, пока композиция сохраняет по крайней мере 40% исходной активности фурина (к примеру, при времени=0) после воздействия на них механических нагрузок. В другом воплощении, сохраняемая композиция считается стабильной при условии, что композиция сохраняет 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше исходной активности фурина (к примеру, при времени=0) после воздействия на нее механических нагрузок. В конкретном варианте, механической нагрузкой является перемешивание (к примеру, взбалтывание).

[0145] В одном воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере больше 10% акитвности фурина после воздействия на них механических нагрузок, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующий агент или содержит меньшее количество стабилизирующего агента. В другом воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или больший процент большей активности фурина после воздействия на нее механических нагрузок, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующий агент или содержит меньшее количество стабилизирующего агента. В конкретном варианте, механической нагрузкой является перемешивание (к примеру, взбалтывание).

[0146] В одном воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабильной при условии, что процент фурина, присутствующего в агрегированном состоянии, остается не более чем 50% после воздействия на них механических нагрузок. В другом воплощении, сохраняемая композиция фурина считается стабильной при условии, что процент фурина, присутствующий в агрегированном состоянии, остается не более чем 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше после воздействия на нее механических нагрузок. В конкретном варианте, механической нагрузкой является перемешивание {к примеру, взбалтывание).

[0147] В одном воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества), когда композиция содержит по крайней мере меньше 10%) фурина, который присутствует в агрегированном состоянии после воздействия на нее механических нагрузок, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующий агент или содержит меньшее количество стабилизирующего агента. В другом воплощении, композиция фурина считается стабилизированной путем добавления стабилизирующего агента (к примеру, сахара, сахарного спирта или неионного поверхностно-активного вещества) когда композиция содержит по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%о или больший процент меньшего количества присутствующего фурина, представленного в агрегированном состоянии после воздействия на нее механических нагрузок, по сравнению с композицией фурина, которая не содержит стабилизирующий агент или содержит меньшее количество стабилизирующего агента. В конкретном варианте, механической нагрузкой является перемешивание (к примеру, взбалтывание).

[0148] В то время как составы фурина (к примеру, рфурин), описанные в этой заявке, могут быть лиофилизированными и восстановленными в указанных концентрациях, следует иметь ввиду, что эти препараты также могут быть воссозданы в более разбавленной форме. К примеру, приготовление согласно настоящему изобретению, которое является лиофилизованным и/или обычно воссоздано в 2 мл растворе, может также быть воспроизведено в большем объеме растворителя, таком как 5 мл. Кроме того, состав лиофилизированного фурина (к примеру, рфурин) может также быть воссозданным в более концентрированной форме. К примеру, приготовление согласно настоящему описанию, которое является лиофилизированным и/или обычно воспроизведенном в 2 мл растворе, может также быть воспроизведенным в меньшем объеме, таком как 1 мл.

[0149] Предпочтительно, в одном аспекте, состав высокостабилизированного фурина (к примеру, рфурина) настоящего изоберетения является комбинированным с разбавителем, который придает повышенное восстановление фурину, когда полученную композицию используют в способе производства, к примеру, в созревании rVWF (также называемый здесь как "rVWF способ созревания"). Созревание προ-фактора фон Виллебранда (vWF) до его активной формы требует протеолитический процессинг после пары двухосновных аминокислот (- Lys-Arg-) в остатке 763. Это показало, что vWF преимущественно обработан посредством фуринового энзима, расщепляемого спаренной двухосноной аминокислотой. Производственные процессы для vWF, таким образом, включают использование фурина, предпочтительно в высокостабилизированном составе. В дополнительном аспекте, высокостабилизированный состав в этом разбавителе увеличивает скорость восстановления активности фурина на этапе созревания rVWF от трех до четырех раз по сравнению с контрольными составами, помещенными в контрольные разбавители.

[0150] В некоторых аспектах, высокостабилизированные составы изобретения имеют срок хранения по крайней мере 6 месяцев. Как будет понятно, этот срок годности может быть при температурах замерзания (к примеру, -80°С, -25°С, 0°С), охлаждающих (от 0°С до 10°С), или комнатной температуре (от 20°С до 32°С) в жидкой или лиофилизированной форме. В дополнительных аспектах, высокостабилизированные составы изобретения имеют срок хранения по крайней мере 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 или 60 месяцев.

[0151] В дополнительных аспектах и в соответствии с вышеизложенным, срок годности определен процентом активности, оставшейся после хранения при любой из вышеуказанных температур для любого из вышеперечисленных периодов времени. В конкретных воплощениях, срок годности означает, что состав удерживает по крайней мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% активности фурина, как измерено любым анализом, описанным здесь или известным в уровне техники по сравнению с активностью до хранения для любого из вышеуказанных количеств времени при любой из указанных выше температур.

[0152] В одном аспекте, высокостабилизированный состав фурина (к примеру, рфурин) в соответствии с настоящим описанием включает: (а) 8,000 Ед/мл - 57,000 Ед/мл фурина (к примеру, рфурин); (b) 190 ммоль хлорида натрия; (с) 0.92 ммоль хлорида кальция; (d) 10% вес/вес дигидрата трегалозы; (е) 75 ppm полисорбата-80; (f) 45 ммоль уксусной кислоты; и (г) 46 ммоль HEPES.

[0153] В некоторых аспектах, высокостабилизированные составы настоящего описания включают следующие компоненты: 47 ммоль HEPES, 46 ммоль уксусной кислоты, 195 ммоль хлорида натрия, 0.094 ммоль хлорида кальция, 0.0075% полисорбата-80, 10% вес/вес дигидрата трегалозы, рН 6.0.

[0154] В дополнительных аспектах, высокостабилизированные составы фурина, включая рфурин, в соответствии с настоящим описанием включают (а) от около 5,500 Ед/мл до 55,000 Ед/мл; от 6,000 Ед/мл до 50,000 Ед/мл; от 6,500 Ед/мл до 45,000 Ед/мл; от 7,000 Ед/мл до 40,000 Ед/мл; от 7,500 Ед/мл до 35,000 Ед/мл; от 8,000 Ед/мл до 30,000 Ед/мл; от 8,500 Ед/мл до 25,000 Ед/мл; от 9,000 Ед/мл до 20,000 Ед/мл; от 9,500 Ед/мл до 15,000 Ед/мл; или 10,000 Ед/мл фурина; (b) от около 100 мМ до 300 мМ, от 110 ммоль до 280 ммоль, от 120 ммоль до 260 ммоль, от 130 ммоль до 240 ммоль, от 140 ммоль до 220 ммоль, от 150 ммоль до 200 ммоль, или от 160 ммоль до 180 ммоль хлорида натрия; (с) от около 0.5 ммоль до 9 ммоль, от 1 ммоль до 8 ммоль, от 1.5 ммоль до 7 ммоль, от 2 ммоль до 6 ммоль, от 2.5 ммоль до 5 ммоль, или от 3 ммоль до 4.5 ммоль хлорида кальция; (d) от около 0.5% до 19%, от 1% до 18%, от 1.5% до 17%, от 2.0% до 16%, от 2.5% до 15%, от 3.0% до 14%, от 3.5% до 13%, от 4.0% до 12%, от 4.5% до 11%, от 5.0% до 10%, от 5.5% до 9%, или от 6.0% до 8%о дигидрата трегалозы; (е) от около 0.5 ppm до 140 ppm, от 1.0 ppm до 130 ppm, от 10 ppm до 120 ppm, от 20 ppm до 110 ppm, от 30 ppm до 100 ppm, от 40 ppm до 95 ppm, от 50 ppm до 90 ppm, от 55 ppm до 85 ppm, от 60 ppm до 80 ppm, или от 70 ppm до 75 ppm полисорбата-80; (f) от около 25 ммоль до 90 ммоль, от 30 ммоль до 80 ммоль, от 35 ммоль до 70 ммоль, от 40 ммоль до 60 ммоль, или от 45 ммоль до 50 ммоль уксусной кислоты, и (g) от 15 ммоль до 95 ммоль, от 20 ммоль до 90 ммоль, от 25 ммоль до 85 ммоль, от 30 ммоль до 80 ммоль, от 35 ммоль до 75 ммоль, от 40 ммоль до 70 ммоль, от 45 ммоль до 65 ммоль, или от 50 ммоль до 60 ммоль HEPES.

[0155] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабилизированную водную композицию фурина (к примеру, рфурин) содержащего: фурин (к примеру, рфурин), от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно активного вещества, от 50 ммоль до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 10 ммоль кальция, буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар представляет собой сахар пентозы или гексозы.

[0156] В одном воплощении, стабилизированная водная композиция фурина (к примеру, рфурин) включает: фурин (к примеру, рфурин), от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта; от 100 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества; от 10 до 200 ммоль буферного вещества; и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар представляет собой сахар пентозы или гексозы.

[0157] В конкретном варианте, высокостабилизированные составы изобретения включают следующие компоненты: 47 ммоль HEPES, 46 ммоль уксусной кислоты, 195 ммоль хлорида натрия, 0.094 ммоль хлорида кальция, 0.0075% полисорбата-80, 10% вес/вес дигидрата трегалозы, рН 6.0.

[0158] В другом конкретном воплощении, высокостабилизированный состав фурина (к примеру, рфурин) в соответствии с настоящим описанием включает: (а) 8,000-57,000 Ед/мл фурина; (b) 190 ммоль хлорида натрия; (с) 0.92 ммоль хлорида кальция; (d) 10% вес/вес дигидрата трегалозы; (е) 75 ppm полисорбата-80; (f) 45 ммоль уксусной кислоты; и (g) 46 ммоль HEPES.

А. Стабилизирующие агенты

[0159] Преимущественно, было найдено, что добавление сахаров, сахарных спиртов и неионных поверхностно-активных веществ, стабилизирует композиции водного фурина (к примеру, рфурин). Эти эффекты показаны в примерах, которые здесь обеспечены. К примеру, добавление этих агентов увеличивает сохранение активности фурина при жидком хранении, снижает агрегацию полипептидов фурина при жидком хранении, снижает деградацию полипептидов фурина при жидком хранении, снижает потери активности фурина при перемешивании водной композиции фурина и уменьшает агрегацию, вызванную перемешиванием водной композиции фурина.

[0160] Соответственно, в одном воплощении, настоящее описание обеспечивает водную композицию фурина (к примеру, а композиция рфурина), содержащую от 2% до 20% сахара или сахарного спирта и от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении, композиция содержит от 2% до 10% сахара или сахарного спирта и от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении, композиция содержит 10±2% сахара или сахарного спирта и 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В конкретном варианте, композиция содержит 10% сахара или сахарного спирта и 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В еще другом воплощении, композиция содержит комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активногое вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, находящихся в Таблице 1 до Таблицы 9.

Таблица 1. Примерные воплощения комбинаций концентраций сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, полезных для стабилизации композиций фурина (к примеру, рфурина)

1. Сахар и Сахарные спирты

[0161] Преимущественно, было найдено, что добавление сахара и/или сахарного спирта к композиции фурина {к примеру, композиции рфурина) увеличивают стабильность композиции при хранении. К примеру, как показано на Фигурах от 17 до 20 и от 22 до 25, добавление небольшого количества, такого как 2% сахара и/или сахарного спирта может увеличить стабильность при хранении композиции фурина на по крайней мере 20%. И добавление 10% сахара и/или сахарного спирта может увеличить стабильность при хранении композиция фурина на по крайней мере 75%. Соответственно, в одном аспекте настоящего описания, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит стабилизационное количество сахара и/или сахарного спирта.

[0162] В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит моносахаридный сахар. В конкретном воплощении, моносахаридный сахар является выбранным из группы, которая состоит из диозы сахара, триозы сахара, сахара тетрозы, сахара пентозы, сахара гексозы, сахара гептозы, и сахара октозы. В конкретном воплощении, сахар представляет собой пентозу сахар, сахар гексозу, или их комбинацию. В конкретном варианте, сахар представляет собой гексозу сахара.

[0163] В другом воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит дисахаридный сахар. В конкретном воплощении, дисахаридный сахар является выбранным из дисахаридных сахаров, состоящих из моносахаридов пентозы и/или гексозы. В другом конкретном воплощении, сахар является выбранным из дисахарида сахаров, сформированных из моносахаридов гексозы. В одном воплощении, сахар представляет из себя цукрозу, трегалозу или их комбинацию. В одном особом воплощении, сахар представляет из себя цукрозу. В другом конкретном воплощении, сахар представляет собой трегалозу. В одном воплощении, сахар является сформированным как дигидрат трегалозы.

[0164] В другом воплощении, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит сахарный спирт.В конкретном воплощении, сахарный спирт является выбранным из гликоля, глицерина, эритритола, треита, рибита, фуцитола, идита, волмитола, изомальта, мальтита, лактита, маннита, сорбита, инозитола, галактита, дульцита, ксилита, и арабита. В другом конкретном воплощении, сахарный спирт представляет собой маннит.

[0165] В еще одном воплощении, стабильная композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит смесь сахара и сахарного спирта. В одном воплощении, смесь содержит по крайней мере два моносахарида, дисахарид и сахарный спирт. В другом воплощении, смесь содержит по крайней мере два сахара пентозы, сахар гексозы, дисахарид сформирован из моносахаридов пентозы и/или гексозы, и сахарный спирт. В другом воплощении, смесь содержит по крайней мере две цукрозы, трегалозы и маннит.

[0166] В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является представленным в концентрации от 2% до 20%, 2% до 17.5%, 2% до 15%, 2% до 12.5%, 2% до 10%, 2% до 9%, 2% до 8%, 2% до 7%, 5% до 20%, 5% до 17.5%, 5% до 15%, 5% до 12.5%, 5% до 10%, 7.5% до 20%, 7.5% до 17.5%, 7.5% до 15%, 7.5% до 12.5%, 10% до 20%, 10% до 17.5%, 10% до 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5±1%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, или 20%. В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу.

[0167] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 ммоль до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0168] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0169] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 2% до 20% трегалозы, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0170] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, найденных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита, и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0171] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; комбинацию трегалозы и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, находящихся в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0172] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0173] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0174] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% трегалозы, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0175] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0176] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию трегалозы и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0177] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; 10±5% сахара или сахарного спирта, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% сахара или сахарного спирта.

[0178] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; 10±5% сахара или сахарного спирта, от 10 до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% сахара или сахарного спирта.

[0179] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; 10±5% трегалозы, от 10 до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% трегалозы. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% трегалозы. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% трегалозы.

[0180] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0181] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию трегалозы и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0182] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 10±5% сахара или сахарного спирта, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% сахара или сахарного спирта.

[0183] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 10±5% сахара или сахарного спирта, 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% сахара или сахарного спирта. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% сахара или сахарного спирта.

[0184] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 10±5% трегалозы, 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±2% трегалозы. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10±1% трегалозы. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 10% трегалозы.

[0185] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0186] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; комбинацию трегалозы и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0187] В некоторых воплощениях, стабилизирующие агенты, используемые в составах настоящего описания, являются выбранными из группы, которая включает, без ограничения: сахарозу, трегалозу, маннит, раффинозу и аргинин. Эти агенты являются представленными в составах настоящего изобретения в количестве от 0.1% до 20%. В конкретных воплощениях, стабилизирующий агент присутствует в количестве около 5% до 15%, или около 10%. В дополнительных воплощениях, составы настоящего описания включают стабилизирующие агенты в количестве от 0.5% до 19%, от 1% до 18%, от 1.5% до 17%, от 2.0% до 16%, от 2.5% до 15%, от 3.0%до 14%,от 3.5%до 13%,от 4.0%до 12%, от 4.5% до 11%, от 5.0% до 10%, от 5.5% до 9%, или от 6.0% до 8%. Конкретные составы включают маннит, сахарозу и/или трегалозу в комбинации с одним или больше любых других компонентов состава, описанных тут.

2. Неионные поверхностно-активные вещества

[0188] Предпочтительно, было обнаружено, что добавление сахара неионно поверхностно-активного вещества к композиции фурина {к примеру, композициям рфурина) увеличивает стабильность композиции к механической нагрузке. К примеру, как показано на Фигурах 31 до 42, добавление небольшого количества как 10 ppm неионного поверхностно-активного вещества может увеличить стабильность композиция фурина, подвергнутой механической нагрузке на по крайней мере 25%. И добавление 50 ppm неионного поверхностно-активного вещества может увеличить стабильность композиции фурина, подвергнутой механической нагрузке на по крайней мере 40%. Соответственно, в одном аспекте настоящего описания, стабильная при хранении композиция фурина (к примеру, рфурин) содержит стабилизирующее количество неионного поверхностно-активного вещества.

[0189] В одном воплощении являются обеспеченные устойчивые к хранению композиции фурина (к примеру, рфурин), которые содержат неионное поверхностно-активное вещество, выбранное из неионного растворимого в воде моноглицерида, неионного растворимый в воде диглицерида, неионного растворимого в воде триглицерида, неионных растворимых в воде моноэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионных растворимых в воде диэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, неионного полигликолизированного глицерида, неионного растворимого в воде триблоксополимера, и их комбинации. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

[0190] В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество является присутствующим при концентрации от 10 до 200 ppm, от 10 до 175 ppm, от 10 до 150 ppm, от 10 до 125 ppm, от 10 до 100 ppm, от 10 до 90 ppm, от 10 до 80 ppm, от 10 до 75 ppm, от 10 до 70 ppm, от 10 до 60 ppm, от 10 до 50 ppm, от 10 до 25 ppm, от 25 до 200 ppm, от 25 до 175 ppm, от 25 до 150 ppm, от 25 до 125 ppm, от 25 до 100 ppm, от 25 до 90 ppm, от 25 до 80 ppm, от 25 до 70 ppm, от 25 до 60 ppm, от 25 до 50 ppm, от 50 до 200 ppm, от 50 до 175 ppm, от 50 до 150 ppm, от 50 до 125 ppm, от 50 до 90 ppm, от 50 до 80 ppm, от 75 до 200 ppm, от 75 до 175 ppm, от 75 до 150 ppm, от 100 до 200 ppm, от 100 до 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm или 200 ppm. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

[0191] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 ммоль до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном особом воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0192] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном особом воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0193] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0194] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В еще другом конкретном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты и сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0195] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, выбранную из вариантов от 1 до 6035 указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0196] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0197] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0198] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного растворимого в воде эфир сорбита и жирной кислоты, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0199] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов от 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В еще другом конкретном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты и сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0200] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 100 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 10 ммоль до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0201] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; 75±25% неионного поверхностно-активного вещества, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0202] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0203] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты.

[0204] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионное поверхностно-активное вещество, выбранную из вариантов 1 до 6035 указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В еще другом конкретном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты и сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0205] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, от 90±25 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0206] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 75±25% неионного поверхностно-активного вещества, 91 ммоль буферного вещества, и рН 6.0±0.2. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 10% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0207] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 10% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 91 ммоль буферного вещества, и рН от 6.0±0.2. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0208] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; 10% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина. В одном особом воплощении, композиция содержит 75±15 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75±5 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, композиция содержит 75 ppm неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты.

[0209] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В еще другом конкретном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты и сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0210] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция; комбинацию сахара или сахарного спирта и неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, выбранную из вариантов 1 до 6035, указанных в Таблице 1 до Таблицы 9, 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В конкретном варианте, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В другом конкретном воплощении, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В еще другом конкретном воплощении, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0211] Композиция фурина (к примеру, рфурина) настоящего изобретения также предпочтительно включает поверхностно-активное вещество, предпочтительно неионное поверхностно-активное вещество, и предпочтительно в количестве от 0.1 ppm до 150 ppm, или от 65 ppm до 80 ppm, или около 75 ppm. В дополнительных воплощениях, композиции фурина (к примеру, рфурина) включают поверхностно-активное вещество в количестве от 0.5 ppm до 140 ppm, от 1.0 ppm до 130 ppm, от 10 ppm до 120 ppm, от 20 ppm до 110 ppm, от 30 ppm до 100 ppm, от 40 ppm до 95 ppm, от 50 ppm до 90 ppm, от 55 ppm до 85 ppm, от 60 ppm до 80 ppm, или от 70 ppm до 75 ppm. В конкретных воплощениях, поверхностно-активное вещество является выбранным из группы, которая включает полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат-80, плюроновые полиолы, глицерин, глюкамиды (такие как Mega 8), тринитротолуолы, и Brij 35 (полиоксиэтилен 23 лауриловый эфир). Несколько видов плюроновых полиолов (продается под торговым названием Pluronic, производится компанией BASF Wyandotte Corporation) являются доступными. Эти полиолы, с разнообразными молекулярными массами (от 1,000 до более чем 16,000) и физикохимическими свойствами были использованы в качестве поверхностно-активных веществ. Pluronic F-38, с молекулярным весом 5,000 и Pluronic F-68, с молекулярным весом 9,000, оба содержат (по массе) 80 процентов гидрофильных полиоксиэтиленовых групп и 20 процентов гидрофобных полиоксипропиленовых групп.В одном воплощении, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80. В конкретном воплощении, полисорбат-80 представляет собой растительного происхождения полисорбат-80.

В. Фармацевтически приемлемые соли

[0212] Стабилизированные композиции фурина (к примеру, рфурин), обеспеченные здесь, в общем включают фармацевтически приемлемую соль при концентрации, допустимой полипептидом фурина во время хранения. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлористую соль. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой моновалентную хлористую соль. В более конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию.

[0213] В одном воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли в композиции стабилизированного фурина (к примеру, рфурина), обеспеченной тут, составляет от 10 ммоль до 500 ммоль. В другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли составляет от 100 ммоль до 300 ммоль. В другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли составляет от 150 ммоль до 250 ммоль. В еще другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли в композициях стабилизированного фурина (к примеру, рфурина), обеспеченных здесь, представляет собой выбранную из вариантов от 6036 до 6180, указанных в Таблице 10.

[0214] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов от 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0215] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов от 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0216] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирта является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0217] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия, или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0218] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, 10±5% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирта является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия, или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В одном воплощении, концентрация буферного вещества составляет 90±25 ммоль. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0219] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит фармацевтически приемлемую соль при концентрации, выбранной из вариантов 6036 до 6180, указанных в Таблице 10, от 0.9 ммоль кальция, 10% сахара или сахарного спирта, 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 91 ммоль буферного вещества, и рН около 6.0±0.2. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0220] В некоторых воплощениях, моновалентные хлористые соли, такие как хлорид натрия и хлорид калия, являются полезными в составах настоящего описания. Хотя состав, содержащий компонент моновалентных хлористых солей является описанным в первую очередь с точки зрения хлорида натрия, следует иметь ввиду, что любая одновалентная хлористая соль, включая хлорид калия, может быть применена в соответствии с описаниями в настоящем документе для хлорида натрия. В конкретных воплощениях, хлорид натрия является включенным в настоящие составы в количестве от 50 до 500 ммоль. В другом воплощении, хлорид натрия является включенным в составы в количестве от 100 до 300 ммоль, от 150 до 250 ммоль, или при около 190 ммоль. В дополнительных воплощениях, хлорид натрия является включенным в составы в количестве от 100 до 300 ммоль, от 110 до 280 ммоль, от 120 до 260 ммоль, от 130 до 240 ммоль, от 140 до 220 ммоль, от 150 до 200 ммоль или от 160 до 180 ммоль. В конкретном варианте, составы включают 190 ммоль хлорида натрия в комбинации с одним или больше из любых других компонентов состава, описанных здесь.

С. Буферные вещества

[0221] Предпочтительно было найдено, что композиции фурина (к примеру, рфурина) являются стабилизированными при рН 6.0 до 7.0. К примеру, показано на Фигурах 11 и 12, что композиции фурина, составленные при рН 5.5 являются стабилизированными по сравнению с композициями фурина, составленными при рН 5.0. Также показано, что композиции фурина, составленные при рН 6.0 являются дополнительно стабилизированными по сравнению к композициям, составленнм при рН 5.5. Кроме того, как показано на Фигуре 17, композиции фурина (к примеру, рфурин), составленные при рН 7.0 имеют подобную стабильность композиций, составленных при рН 6.0.

[0222] Соответственно, в конкретных воплощениях, композиции стабилизированного фурина (к примеру, рфурина), обеспеченные здесь, являются составленными при рН от 5.5 до 7.5. В конкретном варианте, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) является составленной при рН от 6.0 до 7.0. В другом конкретном воплощении, стабилизированная композиция фурина является составленной при рН 6.0±0.2. В более конкретном воплощении, стабилизированная композиция фурина является составленной при рН 6.0. В еще другом воплощении, стабилизированная композиция фурина является составленной при рН, выбранном из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11.

[0223] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН, выбранного из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0224] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН, выбранное из вариантов от 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0225] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферноего вещества, и рН, выбранное из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0226] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН выбранную из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0227] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН выбранное из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0228] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, 10±5% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 10 до 200 ммоль буферного вещества, и рН выбранное из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0229] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурин) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, 10±5% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, от 90±25 ммоль буферного вещества, и рН выбранное из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0230] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит 191 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция, 10% сахара или сахарного спирта, 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества, 91 ммоль буферного вещества, и рН выбранное из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0231] В одном воплощении, стабилизированные композиции фурина (к примеру, рфурин), обеспеченные здесь, являются сформированными при соответствующем рН с применением одного или больше буферных веществ. В одном воплощении, одно или больше буферное вещество является выбранным из гистидина, имидазола, фосфата, цитрата, Tris, ацетата (к примеру, уксусная кислота), BIS-Tris Propane, PIPES, MOPS, HEPES, MES, ACES, и их комбинации. В конкретном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES.

[0232] Буферное вещество присутствует в стабилизированных композициях фурина (к примеру, рфурина) при концентрации, подходящей для поддержания рН композиции во время хранения в течение определенного времени (к примеру, недель, месяцев или лет). В одном воплощении, концентрация буферного вещества в составе составляет от 10 ммоль до 300 ммоль. В другом воплощении, концентрация буферного вещества в составе составляет между 10 ммоль до 200 ммоль. В конкретном варианте, концентрация буферного вещества в составе составляет 90±25 ммоль. В еще другом воплощении, концентрации буферного вещества в композициях являются выбранными из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12.

Таблица 12

Примерные концентрации буферного вещества (ммоль), полезные для стабилизации композиций фурина (к примеру, рфурина).

[0233] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469 указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 2% до 20% сахара или сахарного спирта. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, НЕРЕ8 или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0234] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, стабильная при хранении композиция фурина дополнительно содержит от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0235] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 20% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469 указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES, или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0236] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 500 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 5 ммоль кальция, от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469 указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES, или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0237] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, от 2% до 10% сахара или сахарного спирта, от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0238] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит от 50 до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, 10±5% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0239] В одном воплощении, композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит 190±50 ммоль фармацевтически приемлемой соли, от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция, 10±5% сахара или сахарного спирта, 75±25 ppm неионного поверхностно-активного вещества, буферного вещества при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0240] В одном воплощении композиция стабилизированного фурина (к примеру, рфурина) содержит 191 ммоль фармацевтически приемлемой соли, 0.9 ммоль кальция, 10% сахара или сахарного спирта, 75 ppm неионного поверхностно-активного вещество, буферное вещество при концентрации, выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12, и рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат) и сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES. В одном воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН композиции составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН композиции составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН композиции составляет 6.0. В конкретном варианте, композиция содержит от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина.

[0241] Буферные вещества могут также присутствовать в составах изобретения в комбинации с одним или более из любых других компонентов состава, описанных здесь. Как показано в Примерах, высокостабилизированные составы настоящего изобретения показывают повышенную устойчивость при рН 6.0. В конкретных воплощениях, рН высокостабилизированных составов должны предпочтительно быть в диапазоне от 6.0 до 8.0, или при рН около 6.0. Буферное вещество может быть любым физиологически приемлемым химическим объектом или комбинацией химических объектов, которые имеют способность действовать в качестве буферов, включая, без ограничения: гистидин, имидазол, фосфат, цитрат, Tris, ацетат, BIS-Tris Propane, PIPES, MOPS, HEPES, MES, и ACES. Полные химические обозначения многих из этих буферных веществ перечислены в Таблице 1 ниже. В конкретных воплощениях, если кальций присутствует в составе при концентрации выше около 5 ммоль, фосфат не используется как буферное вещество. В некоторых воплощениях, буферное вещество является включенным в концентрации от 10 ммоль до 200 ммоль, или от 10 до 100 ммоль, или 30-60 ммоль, или около 46 ммоль. В дополнительных воплощениях, индивидуальное буферное вещество является включенным в концентрации от 15 до 95 ммоль, от 20 до 90 ммоль, от 25 до 85 ммоль, от 30 до 80 ммоль, от 35 до 75 ммоль, от 40 до 70 ммоль, от 45 до 65 ммоль, или от 50 до 60 ммоль. В конкретных воплощениях, состав содержит два буферных вещества.

[0242] В некоторых аспектах настоящие составы включают карбоновую кислоту в комбинации с одним или больше компонентами состава, описанными здесь. В дополнительных аспектах, карбоновая кислота представляет собой предпочтительно уксусную кислоту (к примеру, ацетат). В конкретных воплощениях, состав включает от 20 ммоль до 100 ммоль уксусной кислоты, или от 30 ммоль до 50 ммоль, или около 45 ммоль уксусной кислотаы или любой другой карбоновой кислоты. В дополнительных воплощениях, состав включает от 25 ммоль до 90 ммоль, от 30 ммоль до 80 ммоль, от 35 ммоль до 70 ммоль, от 40 ммоль до 60 ммоль, или от 45 ммоль до 50 ммоль уксусной кислоты или любой другой карбоновой кислоты.

D. Дополнительные компоненты состава

[0243] Высокостабилизированные составы настоящего описания включают фурин, к примеру, рфурин, и один или больше стабилизирующих агентов, буферных веществ, хлорид натрия, соли и другие вспомогательные вещества. Такие компоненты описаны более подробно ниже. Как будет понятно, любой из компонентов состава, описанный здесь, может быть использован отдельно или в любой комбинации.

[0244] Высокостабилизированные составы фурина настоящего описания показывает повышенную устойчивость в отношении нагрузок сдвига (перемешивания), лиофилизации и замораживани/оттаивания, а также сопротивления продуктов к потере или денатурации при поверхностях контейнера по сравнению с контольными или начальными составами.

[0245] Фурин включен в составы настоящего описания в концентрациях от 5,000 до 500,000 Ед/мл. В конкретных воплощениях, фурин включен в концентрациях от 5,500 до 55,000, от 6,000 до 50,000, от 6,500 до 45,000, от 7,000 до 40,000, от 7,500 до 35,000, от 8,000 до 30,000, от 8,500 до 25,000, от 9,000 до 20,000, от 9,500 до 15,000, и около 10,000 Ед/мл. В еще другом воплощении, фурин включен в составы настоящего описания при концентрации, выбранной из вариантов 6470 до 6533, указанных в Таблице 14,указанных в тысячных единицах активности фурина на мл. В конкретных воплощениях, фурином, содержащимся в высокостабилизированных составах настоящего описания является рфурин.

[0246] В другом воплощении, концентрация фурина (к примеру, рфурина) стабилизированной композиции, обеспеченной здесь, может быть выражена как масса фурина, присутствующего в композиции. В одном воплощении, фурин (к примеру, рфурин) присутствует в стабилизированной композиции, как описано здесь при концентрации от 100 нг/мл до 100 мг/мл. В другом воплощении, фурин (к примеру, рфурин) присутствует в стабилизированной композиции как описано здесь при концентрации от 1 мкг/мл до 10 мг/мл. В другом воплощении, фурин (к примеру, рфурин) присутствует в стабилизированной композиции как описано здесь при концентрации от 1 мкг/мл до 1 мг/мл. В еще другом воплощении, фурин (к примеру, рфурин) присутствует в стабилизированной композиции как описано здесь при концентрации, выбранной из вариантов 6534 до 6638, указанных в Таблице 15. В конкретных воплощениях, фурин, содержащийся в высокостабилизированных составах настоящего описания представляет собой рфурин.

[0247] В некоторых аспектах настоящего описания, составы фурина (к примеру, рфурина) содержат кальций или другие катионы двухвалентного металла. В дополнительных аспектах, двухвалентный катион представлен как соль, предпочтительно хлористая соль. В конкретных воплощениях, от 0.1 ммоль до 10 ммоль соли двухвалентного катиона могут быт использованы, или от 0.5 ммоль до 2 ммоль, или около 0.92 ммоль. В еще дугих воплощениях, от 0.5 ммоль до 9 ммоль, от 1 ммоль до 8 ммоль, от 1.5 ммоль до 7 ммоль, от 2 ммоль до 6 ммоль, от 2.5 ммоль до 5 ммоль, или от 3 ммоль до 4.5 ммоль соль двухвалентного катиона используется в составах изобретениях. Когда применяется соль кальция, она представляет собой предпочтительно хлорид кальция, но могут также быть другие соли кальция, такие как кальция поконат, кальция глубионат, или кальция глюцептат.Двухвалентные катионы, включая кальций, могут быть включенными в комбинации с одним или больше другими компонентами состава, описанными здесь. Неограничивающие примеры двухвалентных катионов металлов, используемых в составах, представленных здесь, включают кальций, барий, марганец, магний, кобальт, медь, никель и цинк.

[0248] В некоторых воплощениях, составы фурина включают (к примеру, рфурин) антиоксидант.Было обнаружено, что добавление антиокисдантов и лиофилизированных составов улучшает стабильность этих составов, и, таким образом, увеличивает их срок годности. Используемые антиоксиданты должны быть совместимы для использования с фармацевтическими препаратами и, в дополнение, являются предпочтительно растворимыми в воде. При добавлении антиоксидантов к составу, предпочтительным является добавлять такие антиоксиданты как в конце процесса перед лиофилизацией, насколько это возможно, для того, чтобы избежать спонтанное окисление антиоксиданта. В Таблице 2 ниже перечислены подходящие антиоксиданты, которые являются коммерчески доступными через такие компании, как Calbiochem и Sigma.

[0249] Концентрации в диапазоне около 0.05 мг/мл до более чем 1.0 мг/мл антиоксидантов могут применяться, и считается, что более высокие концентрации являются также полезными (до точки каких-либо токсических эффектов или неблагоприятных эффектов, таких как понижение температуры стеклования лиофилизированного продукта). Соответственно, в одном воплощении, композиция фурина (к примеру, рфурина) содержит от 0.05 мг/мл до 1.0 мг/мл антиоксиданта. В другом воплощении, композиция фурина (к примеру, рфурина) содержит от 0.05 до 0.5 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.9 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.8 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.7 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.6 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.5 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.4 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.3 мг/мл, от 0.1 мг/мл до 0.2 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.9 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.8 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.7 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.6 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.5 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.4 мг/мл, от 0.2 мг/мл до 0.3 мг/мл, от 0.3 мг/мл до 0.7 мг/мл, от 0.4 мг/мл до 0.6 мг/мл антиоксиданта.

Е. Разработка состава

[0250] В некоторых аспектах настоящего описания, высокостабилизированные составы фурина (к примеру, рфурина) являются приготовленными путем обеспечения исходного (контрольного) состава фурина и добавлением компонентов до достижения желаемого уровня концентраций компонента. К примеру, добавление одной части 750 ppm неионного поверхностно-активного вещества к 9 частям композиции фурина является недостаточным неионного поверхностно-активного вещества для обеспечения конечного состава, содержащего 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества. Этот процесс также называется "добавление" к исходному составу.

[0251] В конкретных воплощениях, для производства составов высокостабилизированного фурина (к примеру, рфурина) настоящего описания, фурин содержится в исходном составе и буферная композиция является добавленной в исходный состав. В другом воплощении, состав высокостабилизированного фурина (к примеру, рфурина) формируют с использованием диализа согласно способам, известным в уровне техники. В некоторых воплощениях, способ образования включает добавление концентрированной буферной композиции в исходный состав фурина. В одном воплощении, полисорбат-80 является добавленным до исходного состава перед добавлением других компонентов, особенно перед добавлением трегалозы, в порядке защиты фурина против перемешивания во время смешивания.

[0252] В примерном воплощении, фуриновое (к примеру, рфуриновое) вещество нерасфасованной лекарственной формы (BDS) содержит в исходном составе 10 ммоль ацетата натрия, 230 ммоль хлорида натрия, 1 ммоль хлорида кальция, рН 6.0. В одном воплощении, следующие компоненты являются добавленными в исходный состав: 1% полисорбата-80, 500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль CaCl₂, рН 6.0 и порошок дигидрата трегалозы до достижения следующей композиции: 46 ммоль HEPES, 45 ммоль уксусной кислоты, 190 ммоль NaCl, 0.92 ммоль CaCl₂, 75 ppm полисорбата-80, 10% вес/вес дигидрата трегалозы, рН 6.0. Увеличение уксусной кислоты и добавление HEPES приводит к большей стабильности рН. Хотя при рН 6.0 оба уксусная кислота и HEPES находятся за пределами самой высокой буферной емкости, высокая концентрация этих химических веществ значительно увеличивает буферную емкость высокостабилизированного состава. В конкретных воплощениях, полисорбат-80 является добавленным до исходного состава к другим компонентам для защиты фурина от агрегации и адсорбции до поверхности контейнера во время смешивания, когда добавлены другие компоненты. В конкретных воплощениях, фурин в стартовом составе смешивается с полисорбатом-80 и/или любыми другими компонентами, кроме трегалозы. Трегалозу и все оставшиеся компоненты добавляют после добавления полисорбата-80 для защиты фурина от агрегации и адсорбции во время смешивания.

[0253] В конкретных воплощениях, стабилизированный состав является комбинированным с разбавителем таким образом, что состав может быть использован в способах, таких как rVWF процесс вызревания. В дополнительных воплощениях, стабилизированный разбавитель получают путем добавления исходного разбавителя (50 ммоль HEPES, 150 ммоль NaCl, 1 ммоль CaCl₂, рН 7.0) с полисорбатом-80 до 75 ppm. Комбинация состава высокостабилизированного фурина (к примеру, рфурина) настоящего описания с этим стабилизирующим разбавителем увеличивает восстановление фурина в rVWF процессе созревания от трех до четырех раз по сравнению с исходным фурином и составами разбавителей.

[0254] В конкретных воплощениях, высокостабилизированные составы фурина настоящего описания являются лиофилизированными. Во время лиофилизации, состав преобразуется из водной фазы в аморфную твердую фазу, которая, как полагают, защищает белок от химической и/или конформационной неустойчивости. В дополнительных воплощениях, лиофилизированное приготовление содержит не только аморфную фазу, но также включает компонент, который кристаллизуется во время лиофилизации.

[0255] Один или больше компонентов высокостабилизированных составов могут в некоторых воплощениях быть диспергированы в аморфную фазу лиофилизированной таблетки. Кроме того, очевидная температура стеклования (Tg') предпочтительно относительно высокая в процессе замораживания-высушивания, и температура cTeioiOBaHHfl(Tg) твердого вещества является также предпочтительно высокой во время хранения.

IV. Способы разбавления водных композиций рекомбинантного фурина

[0256] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает способы разбавления водных композиций фурина (к примеру, рфурина). Следующие варианты частично основываются на открытии, что добавление неионного поверхностно-активного вещества в буфер используется для того, чтобы разбавить фурин (к примеру, рфурин), получающийся в результате восстановления 3-4 раз имеет больше активности фурина по сравнению до разбавления буфера, не имеющего неионного поверхностно-активного вещества.

[0257] В одном воплощении, способ включает добавление разбавляющего буфера, содержащего неионное поверхностно-активное вещество, к композции фурина (к примеру, рфурина), до образования разбавленной композиции фурина (к примеру, рфурина). В некоторых воплощениях, буфер для разбавления добавляется при соотношении от 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 1,000:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина). В другом воплощении, буфер для разбавления добавляют при соотношении 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 500:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина). В другом воплощении, буфер для разбавления добавляют при соотношении 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 250:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина). В другом воплощении, буфер для разбавления добавляют при соотношении 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 200:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина). В другом воплощении, буфер для разбавления добавляют при соотношении 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 100:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина). В другом воплощении, буфер для разбавления добавляют при соотношении 1:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина) до 50:1 (буфер для разбавленияжомпозиция фурина).

[0258] В одном воплощении, способ включает первый этап добавления неионного поверхностно-активного вещества к композиции фурина (к примеру, рфурина) и второй этап добавления буфера для разбавления к композиции фурина (к примеру, рфурина), содержащей неионное поверхностно-активное вещество, для формирования разбавленной композиции фурина. В одном воплощении, поверхностно-активное вещество будет добавлено к композиции фурина при конечной концентрации Х-кратной желаемой концентрации в разбавленной композиции фурина, где X представляет собой коэффициент разбавления. К примеру, конечная концентрация 10 ppm неионного поверхностно-активного вещества является желаемой в композиции фурина разбавленного 100-кратно, неионное поверхностно-активное вещество является добавленным до исходной композиции фурина при окончательной концентрации 1,000 ppm (10 ppm × 100-кратное разбавление), и композицию впоследствии разбавленную добавлением 99 частей буфера для разбавления на 1 часть исходного раствора (с учетом объема добавленной во время добавления неионного поверхностно-активного вещества).

[0259] В конкретных воплощениях, композиция фурина (к примеру, рфурина) является разбавленной от 1-кратного до 1,000-кратного, от 1-кратного до 500-кратного, от 1-кратного до 250-кратного, от 1-кратного до 200-кратного, от 1-кратного до 100-кратного, от 1-кратного до 50-кратного, от 1-кратного до 10-кратного, от 10-кратного до 1,000-кратного, от 10-кратного до 500-кратного, от 10-кратного до 250-кратного, от 10-кратного до 200-кратного, от 10-кратного до 100-кратного, от 10-кратного до 50-кратного, от 50-кратного до 1,000-кратного, от 50-кратного до 500-кратного, от 50-кратного до 250-кратного, от 50-кратного до 200-кратного, от 50-кратного до 100-кратного, от 100-кратного до 1,000-кратного, от 100-кратного до 500-кратного, от 100-кратного до 250-кратного, от 100-кратного до 200-кратного, от 200-кратного до 1,000-кратного, от 200-кратного до 500-кратного, или от 200-кратного до 250-кратного.

А. Буфер для разбавления фурина

[0260] В одном воплощении, буфер для разбавления фурина будет включать фармацевтически приемлемую соль, неионное поверхностно-активное вещество и буферное вещество. В одном воплощении, буфер для разбавления дополнительно включает кальций. В другом воплощении, буфер для разбавления дополнительно включает сахар и/или сахарный спирт.

[0261] В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль присутствует в буфере для разбавления при концентрации от 10 ммоль до 500 ммоль. В другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли составляет от 100 ммоль до 300 ммоль. В другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли составляет от 150 ммоль до 250 ммоль. В еще другом воплощении, концентрация фармацевтически приемлемой соли в буфере для разбавления фурина является выбранной из вариантов 6036 до 6180, указанных в Таблице 10. В одном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или их комбинацию. В конкретном варианте, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом конкретном воплощении, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия.

[0262] В одном воплощении, буфер для разбавления имеет рН от 5.5 до 7.5. В одном воплощении, рН буфера для разбавления составляет от 5.5 до 7.0. В другом воплощении, рН буфера для разбавления составляет от 5.5 до 6.5. В другом воплощении, рН буфера для разбавления составляет 6.0±0.2. В конкретном варианте, рН буфера для разбавления составляет 6.0. В другом воплощении, буфер для разбавления имеет рН выбранный из вариантов 6181 до 6403, указанных в Таблице 11.

[0263] В одном воплощении, буферное вещество присутствует в буфере для разбавления при концентрации от 10 ммоль до 300 ммоль. В другом воплощении, концентрация буферного вещества в буфере для разбавления находится между 10 ммоль до 200 ммоль. В другом воплощении, концентрация буферного вещества в буфере для разбавления является выбранной из вариантов 6404 до 6469, указанных в Таблице 12. В одном воплощении, буферное вещество представляет собой ацетат, HEPES или их комбинацию. В конкретном варианте, буферное вещество представляет собой комбинацию ацетата и HEPES.

[0264] В некоторых воплощениях, буфер для разбавления фурина включает кальций или другой катион двухвалентного металла. В одном воплощении, двухвалентный катион является добавленным как соль, предпочтительно хлористая соль. В конкретных воплощениях, концентрация двухвалентного катиона (к примеру, кальция) в буфере для разбавления составляет от 0.1 ммоль до 10 ммоль, от 0.5 ммоль до 2 ммоль, или около 0.92 ммоль. В еще других воплощениях, от 0.5 ммоль до 9 ммоль, от 1 ммоль до 8 ммоль, от 1.5 ммоль до 7 ммоль, от 2 ммоль до 6 ммоль, от 2.5 ммоль до 5 ммоль, или от 3 ммоль до 4.5 ммоль двухвалентного катиона применяется в буфере для разбавления. Когда применяют соль кальция, это является предпочтительно хлоридом кальция, но может также быть другими солями кальция, такими как кальция гюконат, кальция глубионат, или кальция глюцептат.Двухвалентные катионы, включая кальций, могут быть включенными в комбинацию с одним или больше компонентами состава, описанными здесь. Не ограничивающие примеры катионов двухвалентного металла, полезные в буферах для разбавления, обеспеченные здесь, включают кальций, барий, марганец, магний, кобальт, медь, никель и цинк.

[0265] В некоторых воплощениях, буфер для разбавления фурина включает сахар и/или сахарный спирт.В одном воплощении, буфер для разбавления содержит моносахаридный сахар. В конкретном воплощении, моносахаридный сахар является выбранным из группы, которая состоит из сахара диозы, сахара триозы, сахара тетрозы, сахара пентозы, сахара гексозы, сахара гептозы и сахара октозы. В конкретном воплощении, сахар представляет собой сахар пентозы, сахар гексозы или их комбинацию. В конкретном варианте, сахар представляет собой сахар гексозы.

[0266] В другом воплощении, буфер для разбавления содержит дисахаридный сахар. В конкретном воплощении, дисахаридный сахар является выбранным из дисахаридного сахара, сформированного из моносахаридов пентозы и/или гексозы. В другом конкретном воплощении, сахар является выбранным из дисахаридных сахаров, сформированных из моносахаридов гексозы. В одном воплощении, сахар представляет собой сахарозу, трегалозу или их комбинацию. В одном особом воплощении, сахар представляет собой сахарозу. В другом конкретном воплощении, сахар представляет собой трегалозу. В одном воплощении, сахар сформулирован как дигидрат трегалозы.

[0267] В другом воплощении, буфер для разбавления содержит сахарный спирт.В конкретном воплощении, сахарный спирт является выбранным из гликоля, глицерина, эритритола, треита, рибита, фуцитола, идита, волмитола, изомальта, мальтита, лактита, маннита, сорбита, инозитола, галактита, дульцита, ксилита и арабита. В другом конкретном воплощении, сахарный спирт представляет собой маннит.

[0268] В еще одном воплощении, буфер для разбавления содержит смесь сахара и сахарного спирта. В одном воплощении, смесь содержит по крайней мере два моносахарида, дисахарида и сахарный спирт.В другом воплощении, смесь содержит по крайней мере два сахара пентозы, сахара гексозы, дисахарид, образованный из пентозы и/или гексоза моносахарида, и сахарного спирта. В другом воплощении, смесь содержит по крайней мере два из сахарозы, трегалозы и маннита.

[0269] В одном воплощении, сахар или сахарный спирт присутствует в буфере для разбавления при концентрации от 2% до 20%, от 2% до 17.5%, от 2% до 15%, от 2% до 12.5%, от 2% до 10%, от 2% до 9%, от 2% до 8%, от 2% до 7%, от 5% до 20%, от 5% до 17.5%, от 5% до 15%, от 5% до 12.5%, от 5% до 10%, от 7.5% до 20%, от 7.5% до 17.5%, от 7.5% до 15%, от 7.5% до 12.5%, от 10% до 20%, от 10% до 17.5%, от 10% до 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5±1%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%. В одном воплощении, сахар или сахарный спирт является выбранным из цукрозы, трегалозы, маннита и их комбинации. В конкретном варианте, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу.

[0270] В одном воплощении, являются обеспеченными устойчивые к хранению композиции фурина (к примеру, рфурин), которые содержат неионное поверхностно-активное вещество, выбранное из неионного растворимого в воде моноглицерида, неионного растворимого в воде диглицерида, неионного растворимого в воде триглицерида, неионных растворимых в воде моноэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионньгх растворимых в воде диэфиров жирных кислот полиэтиленгликоля, неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты, неионного полигликолизированного глицерида, неионного растворимого в воде триблоксополимера и их комбинации. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

1. Неионные поверхностно-активные вещества

[0271] В одном воплощении, буфер для разбавления фурина или раствор неионного поверхностно-активного вещества, добавленный до разбавления, содержит неионное поверхностно-активное вещество, выбранное из неионного растворимого в воде моноглицерида, неионного растворимого в воде диглицерида, неионного растворимого в воде триглицерида, неионные растворимые в воде моноэфиры жирных кислот полиэтиленгликоля, неионные растворимые в воде диэфиры жирных кислот полиэтиленгликоля, неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты, неионный полигликолизированный глицерид. неионный растворимый в воде триблоксополимер и их комбинации. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество является выбранным из неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

[0272] В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество присутствует в буфере для разбавления при концентрации от 10 до 200 ppm, от 10 до 175 ppm, от 10 до 150 ppm, от 10 до 125 ppm, от 10 до 100 ppm, от 10 до 90 ppm, от 10 до 80 ppm, от 10 до 75 ppm, от 10 до 70 ppm, от 10 до 60 ppm, от 10 до 50 ppm, от 10 до 25 ppm, от 25 до 200 ppm, от 25 до 175 ppm, от 25 до 150 ppm, от 25 до 125 ppm, от 25 до 100 ppm, от 25 до 90 ppm, от 25 до 80 ppm, от 25 до 70 ppm, от 25 до 60 ppm, от 25 до 50 ppm, от 50 до 200 ppm, от 50 до 175 ppm, от 50 до 150 ppm, от 50 до 125 ppm, от 50 до 90 ppm, от 50 до 80 ppm, от 75 до 200 ppm, от 75 до 175 ppm, от 75 до 150 ppm, от 100 до 200 ppm, от 100 до 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm или 200 ppm. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество является выбранным из неионного растворимого в воде эфира сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

[0273] В одном воплощении, целевая концентрация неионного поверхностно-активного вещества после разбавления составляет от 10 до 200 ppm, от 10 до 175 ppm, от 10 до 150 ppm, от 10 до 125 ppm, от 10 до 100 ppm, от 10 до 90 ppm, от 10 до 80 ppm, от 10 до 75 ppm, от 10 до 70 ppm, от 10 до 60 ppm, от 10 до 50 ppm, от 10 до 25 ppm, от 25 до 200 ppm, от 25 до 175 ppm, от 25 до 150 ppm, от 25 до 125 ppm, от 25 до 100 ppm, от 25 до 90 ppm, от 25 до 80 ppm, от 25 до 70 ppm, от 25 до 60 ppm, от 25 до 50 ppm, от 50 до 200 ppm, от 50 до 175 ppm, от 50 до 150 ppm, от 50 до 125 ppm, от 50 до 90 ppm, от 50 до 80 ppm, от 75 до 200 ppm, от 75 до 175 ppm, от 75 до 150 ppm, от 100 до 200 ppm, от 100 до 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±Ю ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, ПО ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm или 200 ppm. В одном воплощении, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионный растворимый в воде эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретном варианте, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат).

[0274] В одном воплощении, добавление неионного поверхностно-активного вещества в буфер для разбавления фурина, или добавление перед разбавлением, увеличивает активность фурина, восстановленного в разбавленной композиции фурина на по крайней мере 10%, по сравнению с активностью, полученной в композиции фурина, разбавленной без применения неионного поверхностно-активного вещества, или с применением неионного поверхностно-активного вещества при пониженной концентрации. В другом воплощении, активность фурина, восстановленного после разбавления с применением неионного поверхностно-активного вещества составляет по крайней мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 2-кратного, 3-кратного, 4-кратного, 5-кратного или намного больше, чем активность фурина, восставновленного после разбавления без неионного поверхностно-активного вещества или с применением более низких концентраций неионного поверхностно-активного вещества.

V. Анализы стабильности

[0275] Как обсуждалось здесь, составы высокостабилизированного фурина (к примеру, рфурина) настоящего описания показывают улучшенную стабильность по сравнению с контрольными составами. В одном воплощении, улучшенная стабильность включает удержание более высокого процента активности, чем контрольные составы в различных анализах стабильности. Такие анализы могут быть использованы для определения является ли состав высокостабилизированным составом. В некоторых воплощениях, высокостабилизированный состав имеет по крайней мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую активность, чем контольный состав при оценке с помощью любого из анализов, описанных здесь или известных в уровне техники.

[0276] В дополнительных аспектах, составы фурина (к примеру, рфурин) являются протестированными в стрессовых условиях, таких как хранение при повышенной температуре, перемешивание, циклы замораживания/оттаивания, или некоторые их комбинации. После таких факторов стресса, составы анализировали с применением любых способов, описанных здесь или известных в уровне техники для определения стабильности при таких условиях.

[0277] В одном аспекте, анализы активности фурина применяются для оценки стабильности состава. В некоторых воплощениях, анализы активности фурина включают измерение разложения подложки. В одном воплощении, подложка представляет собой Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1; АМС = 7-амино-4-метокси кумарин), которая расчеплена фурином, освобождая 7-амино-4-метокси кумарин. Анализ проводят, к примеру, на пластине ELISA. Активность фурина на образце определяется из стандартной созданной кривой, к примеру, из контроля качества (QC) стандарта фурина. Значение активности, как правило, рассчитывается как среднее значение из двух разведений, каждый в двух экземплярах.

[0278] В другом аспекте, эксклюзионная хроматография размеров (SEC) используется для оценки стабильности состава фурина (к примеру, рфурина). В таких анализах, стабильность указывает на высоту пика, соответствующего мономерному фурину. Снижение в мономере высоты пика означает, что продукт теряется (неустойчивый) и генерация высших пиков молекулярной массы означает, что происходит агрегация и нижние пики молекулярной массы означают, что продукт ухудшается. В примерном воплощении, после 4 дней при 37°С, относительная высота пика контрольного состава фурина была 58.5%, а в высокостабилизированном составе относительная высота пика была 74.8% (Фиг.48). Таким образом, высокостабилизированный состав поддерживает стабильность фурина в композции и сохраняет большой процент высоты пика по сравнению с увиденным до этого для хранения до четырех дней при более высокой (37°С) температуре.

[0279] В другом аспекте качественные анализы, такие как анализы Western Blot, являются используемыми для оценки стабильности состава фурина. К примеру, Фигура 26 иллюстрирует, что после 5 дней при 35°С, больший процент сигнала присутствует в виде интактной молекулы фурина, а не деградированных видов в стабилизированной композцииц (дорожка 11), по сравнению с не стабилизированным составом (дорожка 5).

[0280] В еще одном аспекте, качественные анализы, такие как УФ-спектры используются для оценки стабильности. Такие анализы особенно полезны, когда как стресс используется перемешивание. УФ-спектры могут указывать на наличие агрегата-присутствие агрегата является показателем нестабильности. К примеру, Фигура 36 показывает основное смещение спектров вверх (с указанием агрегации), где контрольный состав перемешивают.Фигуры 41 и 42 показывают защитную силу высокостабилизированного состава в том, что при перемешивании, спектр перемешиваемого образца не смещается вверх, но перекрывает неперемешиваемый образец, что указывает на то, что агрегация не была образована, когда состав был помещен под напряжение через перемешиваниие.

[0281] При практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать, если не указано иное, ообычные способы и описания органической химии, технологии полимеров, молекулярную биологию (в том числе рекомбинантные способы), клеточную биологию, биохимию и иммунологию, которые известны в данной области техники. Такие обычные способы включают матричный синтез полимера, гибридизацию, лигирование и обнаружение гибридизации с использованием меток. Конкретные иллюстрации пригодных способов могут быть изучены со ссылкой на пример здесь ниже. Тем не менее, другие эквивалентные обычно применяемые процедуры, конечно, также могут быть использованы. Такие традиционные способы и описания могут быть указаны в стандартных лабораторны руководствах, таких как Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y., все из которых включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки для всех целей.

[0282] В последующем описании, многочисленные конкретные детали изложены для того, чтобы обеспечить более глубокое понимание настоящего изобретения. Тем не менее, для квалифицированного специалиста в данной области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено на практике без одной или нескольких из этих конкретных деталей. В других случаях, хорошо известные признаки и способы, известные для квалифицированного специалиста в данной области техники не были описаны с целью не допустить затруднение понимания изобретения.

[0283] Хотя настоящее изобретение описано, главным образом, со ссылкой на конкретные варианты воплощений, предполагается также, что другие варианты осуществления станут очевидными для квалифицированного специалиста в данной области техники после прочтения настоящего описания, и подразумевается, что такие варианты содержатся в способах настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Хранение стабильных водных составов фурина

[0284] Стабильность контрольного состава фурина была измерена при трех различных температурах: комнатной температуре (к примеру, 25°С), 37°С и 45°С.Эти исследования при повышенных температурах использовались для изучения ускоренной стабильности, которую сравнивают с долгосрочными исследованиями устойчивости при более низких температурах. Образцы были испытаны в нулевой момент времени, затем после 1, 2, 3, 4 и 7 дней инкубации. Анализ включает анализ исследования фурина, SEC и вестерн-блоттинг.

[0285] Кратко, несколько 5 мл полипропиленовых пробирок были заполнены 3 мл рфурина и инкубировали при трех различных температрурах: обычной (комнатной), 37°С и 45°С.Один флакон от каждого условия был вынут в нулевой момент времени, затем после 1, 2, 3, 4 и 7 дней. 200 мкл аликвоты были сделаны в 0.65 мл полипропиленовых пробирках и заморожены при -80°С в ожидании анализов.

[0286] Стабильность нескольких составов фурина была определена в этих условиях. Особенности различных составов приведены в Таблице 17.

[0287] Один способ оценки стабильности является анализом активности фурина. В этом анализе, активность фурина определяется по скорости разложения подложки. Подложка Вос-Arg-Val-Arg-Arg-АМС (SEQ ID NO:1; АМС = 7-амино-4-метокси кумарин), разлагается фурином и флуоресцентный АМС освобождается. Анализ проводят, к примеру, на пластине ELISA. Активность фурина в образце определяется из стандартной кривой, к примеру, из стандартной кривой качества фурина. Значения активности были рассчитаны как средние значения из двух разведений, каждый в двух экземплярах.

[0288] Стабильность рфурина при 37°С в высокостабилизированном составе. Цель этого эксперимента заключалась в проверке стабильности рфурин в стабилизированных составах, содержащих 75 ppm полисорбата-80. Там были небольшие изменения в композиции этого образца, потому что был использован дигидрат трегалозы (C₁₂H₂₂O₁₁*2H₂O, FW 378.33), а не негидратируемая трегалоза (С₁₂Н₂₂О₁₁, FW 342.30). Использование дигидрата трегалозы создает чуть более разведенный образец. Исследования перемешивания показали, что концентрация полисорбата-80 должна храниться между 50 ppm и 100 ppm, чтобы обеспечить лучшую защиту рфурина против денатурирования, вызванной перемешиванием. В этом исследовании образец рфурина в тестовом составе #1 был добавлен с полисорбатом-80 до 75 ppm и инкубированным при 37°С на протяжении четырех дней. Образец рфурина, составленный с контрольным составом, служил в качестве контроля.

[0289] Анализы исследования активности фурина (Фигура 1) показывают потерю активности в образцах в контрольном составе, который был инкубирован при 37°С и 45°С.Поскольку образец при 45°С был высокой степени деструкции и агрегирован всего после 2-ух дней, образец не был испытан после этого времени. Для образцов, инкубированных при комнатной температуре, данные были не убедительные в результате количества изменчивости в анализе, но данные предположили, что активность рфурина была относительно стабильна, с активностью после 7 дней примерное соответствует до Т=0.

[0290] В отличие от данных в контрольном составе, анализы исследования активности фурина (Фигура 46) показывают, что рфурин в тестовом составе #1 сохранил более его активности, чем в контрольном составе. После четырех дней инкубации при 37°С, рфурин удерживает 76.7% его первоначальной активности, тогда как контрольный состав сохраняет только 55.5% его первоначальной активности (Фигура 47).

[0291] Размер эксклюзионной хроматографии (SEC) также использовался для оценки стабильности различных составов фурина. Для способов SEC, были использованы следующие оборудования и материалы:

- Agilent HPLC 1100 Series оборудованный контролируемым температуру автоматически пробоотборником и детектором с фотодиодной матрицей

- Автоматический пробоотборник 100 мкл с полипропиленовыми пробирками

- Колонки для эксклюзионной хроматографии размеров от TOSOH Bioscience, TSKgel

- G3000SWxl, 7.8 ммоль ID × 30 см, 5 мкм

В дополнение, следующие условия были использованы для SEC способа:

- Mobile Phase: 50 ммоль MOPS, 200 ммоль натрия сульфат, 0.02% натрия азид, рН 7.0

- расход: 0.5 мл /мин

- время выполнения: 30 мин

- объем образца: 100 мкл

- температура автоматического пробоотборника: 4°С

- температура колонки: температура окружающей среды

[0292] Одночастотная абсорбция при 280 нм (ссылка выкл) была использована для создания хроматографов. После ручного интегрирования, высота главного пика при 19 мин, соответствует содержанию рфурина состава, был использован для оценки стабильности. Причиной для использования высоты пика вместо площади пика было то, что хроматографические пики были часто разделены не по базовой линии, что может привести к большим ошибкам. Проводился только один впрыск каждого образца. Повторные анализы контрольного состава фурина показали менее чем 2% вариант в высоте пика (данные не показаны).

[0293] Результаты SEC коррелировали с исследованиями активности фурина, изложенными выше. Анализы по SEC (Фигура 2) показывают, что высота пика мономера рфурина (время задержки 19 мин) контрольной композции уменьшилась со временем инкубации при всех температурах. Отношение уменьшения мономерного пика рфурина было относительно низким в образцах, инкубированных при комнатной температуре, как 82% высоты пика осталось после 7 дней инкубации. Тем не менее, при 37°С, высота мономерного пика фурина снизилась до 21.6%, от первоначальной высоты, после семи дней инкубации. При 45°С, после двух дней инкубации, основной пик снизился до 14.1%. В соответствии с потерей содержания мономера рфурина, стали появляться другие хроматографические пики с течением времени (Фигура 3), что соответствует агрегатам (элюирование на более ранних временных точках) и продуктам распада (элюирование на более поздних временных точках). Эти дополнительные пики обозначают оба -деструкцию и агрегацию рфурина в контрольном составе. Увеличение деструкции при 37°С по сравнению с хранением при комнатной температуре было также подтверждено с помощью вестерн-блоттинга (Фигура 4). Деструкция рфурина может быть вызвана протеазами, которые совместно очищались с рфурином, или автокаталитической активностью самого рфурина.

[0294] В противоположность этому, анализ SEC подтвердил повышенную стабильность тестового состава #1 (Фигура 48), содержащего трегалозу, по сравнению с контрольным составом, который не содержит сахара или сахарного спирта. Фигура 48 показывает, что тестовый состав #1 содержит 74.8% высоты мономерного пика рфурина от исходного раствора После инкубации при 37°С на протяжении 4 дней, по сравнению с контрольным составом, который содержит только 58.5%) высоты мономерного пика рфурина исходного раствора в течение того же периода инкубации.

Пример 2 - Стабильность при хранении водных составов рфурина при замораживании/оттаивании

[0295] Стабильность контрольного состава и тестовых составов #2-6 была испытана при исследовании на замораживание/оттаивание. Пять циклов замораживания/оттаивания были завершены и образцы были проанализированы на активность фурина исследованиями и SEC. Исследование влияния замораживания/оттаивания важно, потому что образцы рфурина в этом исследовании и рфурин BDS хранятся в замороженном виде. Эксперименты замораживания/оттаивания с применением контрольного состава (n=4) демонстрируют незначительную потерю активности фурина (приблизительно 7%) после, в общей сложности, пяти циклов замораживания/оттаивания. Хотя, как представляется, тенденция к снижению, это может быть связано с истинной потерей белка или отражать изменчивость анализа. Несмотря на это, эти данные поддерживают возможность при замораживании и оттаивании рфурина, не только один раз, но и много раз с практически отсутствием потери активности. Кроме того, SEC анализ олигомерного состояния фурина в контрольной композиции показал отсутствие потерь в мономерном содержании при протекании эксперимента замораживания/оттаивания (Фигура 6).

[0296] С тех пор, как рфурин, в общем, хранят в замороженном виде, оценивали воздействие способом размораживания. Анализ исследования активности (Фигура) демонстрирует не существенное отличие между двумя способами размораживания: оттаивание при 4°С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 часов.

[0297] Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что рфурин в контрольном составе является относительно стабильным в течение коротких периодов при комнатной температуре. Кроме того, потеря активности при хранении при повышенных темепературах коррелирует и с разрушением и агрегацией рфурина. Кроме того, рфурин в контрольном составе сохраняет свою активность хорошо даже после пяти циклов замораживания/оттаивания.

[0298] Исследование замораживания/оттаивания высокостабилизированного состава фурина. Исследование замораживания/оттаивания_проводили с использованием того же набора образцов, как и предыдущее исследование замораживания/оттаивания; стабильность рфурина в тестовых составах #2 (0 ppm полисорбат-80), #3 (10 ppm полисорбат-80), #4 (25 ppm полисорбат-80), #5 (50 ppm полисорбат-80), и #6 (100 ppm полисорбат-80) была оценена. Фурин в контрольном составе служит как контроль. В соответствии с предварительным анализом контрольного состава, анализ активности фурина (Фигура 43) не выявил значительную потерю активности после пяти циклов замораживания/оттаивания в любом из протестированных составов. Анализы содержания мономера рфурина по SEC (Фигуры 44 и 45) продемонстировали только небольшую тенденцию к ухудшению образца после замораживания/оттаивания. Даже после пяти циклов замораживания/оттаивания, все образцы сохранили более чем 95% их исходной активности.

Пример 3 - Стабильность при хранении водных составов рфурина при механической нагрузке

[0299] Не ограничиваясь теорией, один потенциальный механизм перемешивания влияет на образцы рфурина в том, что он вызывает денатурацию рфурина, воздействуя на гидрофобные поверхности. Гидрофобные поверхности притягиваются к другим гидрофобным поверхностям, таким как другие денатурированные протеины рфурина, которые индуцируют агрегацию, или вызывая адсорбцию на гидрофобных поверхностях образца и материалов.

[0300] Исследование перемешивания не было разработано, чтобы имитировать истинный процесс использования рфурина, но превышало допустимые напряжения образца. Состав рфурина будет считаться стабилизированным, если имеет эксплуатационные качества по крайней мере такие же, как у контрольного состава, а высокостабилизированный состав имеет эксплуатационные качества лучше, чем у контрольного состава.

[0301] Исследование перемешивания проводилось путем взбалтывания образца рфурина в бутылке, содержащей тефлоновые шары. Образцы отбирали через 2 и 17 часов перемешивания и анализировали с помощью анализа активности фурина и SEC. Как показано в результатах для обоих анализов активности фурина и анализа SEC (Фигуры 7 и 8 соответственно), рфурин в контрольном составе достаточно устойчивый к перемешиванию в течение ограниченного периода времени. После двух часов интенсивного перемешивания, такого, которое может происходить во время стадии диафильтрации, более чем 85% рфурина является до сих пор активным в контрольном составе. Тем не менее, после 17 часов перемешивания, такого, которое может происходить во время транспортировки образца, менее чем 10% содержания рфурина остается активным.

[0302] Затем эффект был исследован на тестовых составах #2 до 6, которые были созданы добавлением девяти частей образца рфурина с одной частью 500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль СаСЬ, рН 6 плюс 10% вес/вес трегалозы плюс различные составы полисорбата-80.

[0303] Это исследование перемешивания проводилось взбалтыванием тестовых составов рфурина и контрольного состава, содержащего бутылки с тефлоновими шариками в течение трех часов. Тестовые составы, содержащие следующие уровни полисорбата-80 были оценены: отсутствует, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm или 100 ppm. Как проиллюстрировано на Фигуре 31, полисорбат-80 в тестовых составах обеспечивает значительную защиту для рфурина во время перемешивания. После трех часов перемешивания, активность рфурина в образцах, содержащих полисорбат-80 колеблется от 31,499±1,218 Ед/мл до 36,787±847 U/мл, в то время как образец в составах без полисорбата-80 была 17,835±1,706 Ед/мл активности фурина. Образец в контрольном составе (10 ммоль ацетата натрия, 230 ммоль хлорида натрия, 1 ммоль хлорида кальция, рН 6.0) имеет активность 24,368±1,135 Ед/мл.

[0304] Анализ SEC подтвердили благотворное влияние полисорбата-80 в этом исследовании (Фигура 32). После трех часов перемешивания, пиковые высоты рфурина в образцах, содержащих полисорбат-80 колеблется от 37.5 мОЕ до 35.9 мОЕ, в то время как высота пика рфурина в составе без полисорбата-80 была 22.1 мОЕ. Высота пика рфурина в контрольном составе была 29.9 мОЕ. Эффект полисорбата-80 также проиллюстрирована на Фигурах 33 и 34. Небольшая тенденция предполагает, что добавление 10 ppm и 25 ppm полисорбата-80, является также выгодной, но не так эффективна как применение 50 ppm или 100 ppm полисорбата-80. Профиль SEC для перемешивания в контрольном составе (Фигура 35) не показывает никаких дополнительных пиков по сравнению с не перемешиваемым образцом. Это предполагает, что поверхность адсорбции было главной причиной для потери активности. Тем не менее, спектр поглощения УФ (Фигура 36), показывает, что образец перемешивания имеет наклонный и повышенный профиль, который является признаком рассеивания света и затемнения, вызванного наличием агрегатов. Световой поток, как правило, обусловлен варьированием крупных агрегатов, которые являются более непрозрачными, чем меньшие молекулы, которые вызывают повышение УФ спектров. Это явление не может быть отделено от поглощения с помощью спектрофотометра, так как его детектор измеряет количество света, проходящего через образец. Так как меньше света попадает на детектор, это сообщается, как поглощение, поэтому профиль поглощения повышается.

[0305] Свет также может быть разбросан агрегатами, которые могли бы также уменьшить количество света, который попадает в детектор. Чем короче длина волны, тем больше света рассеивается (количество рассеянного света обратно пропорционально четвертой степени от длины волны). Это означает, что чем короче длина волны, тем меньше света доходит до детектора и поэтому профиль поглощения наклонен. Вполне вероятно, что агрегаты присутствуют в данном образце, но анализ SEC не смог их обнаружить. Эти виды проблем анализов SEC не редки, так как агрегаты протеина являются часто слишком большими, чтобы пройти через колонку или абсорбируются матрицей колонны. Спектр поглощения УФ образца рфурина в составе без полисорбата-80 (Фигура 37) показывает аналогичный повышенный профиль. Опять же, отсутствие агрегатов было обнаружено при анализе SEC этого образца (Фигура 38). Образцы, составленные с полисорбатом-80, показывают меньшую агрегацию, чем без полисорбата 80 при анализе УФ спектров поглощения (Фигуры 39 до 42). Хотя УФ-спектр не может определить количество агрегатов, опять же, небольшая тенденция, которая наблюдается, намекает, что образцы с полисорбатом-80 при 50 ppm и 100 ppm были лучше в защите рфурина от перемешивания, чем 10 ppm или 25 ppm. Эти данные свидетельствуют о том, что полисорбат-80 включенный в композицию на уровне 75 ppm будет эффективным, поскольку эта концентрация находится в середине широкого плато (50-10 ppm) и будет представлять собой надежное состояние.

[0306] Анализ спектрофотометрии УФ проводился с использованием следующего оборудования и материалов:

- Agilent 8453 спектрофотометр

- Кварцевая кювета с 1 см световым путем

[0307] Анализ спектрофотометрии был проведен первым размещением 0.5 мл соответствующего препарата в кювете и измерялся как пустой. Затем, 0.5 мл образца рфурина помещали на кювету и сканирование было принято от 240 нм до 400 нм.

Пример 4 - Влияние рН, сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина

[0308] В образцы рфурина вносили различные буферы для того, чтобы довести рН до 5.0, 5.5, 6.0, 7.0 и 8.0. Кроме того, сахароза и/или полисорбат-80 были добавлены до образцов при рН 6.0, 7.0 и 8.0. Образцы инкубировали при 37°С и проводили анализы на активность фурина и SEC.

[0309] Оба анализ активности фурина (Фигура 11) и SEC (Фигура 12) показали, что при 37°С рфурин был более стабильным при рН 6.0, чем при рН 5.0 или 5.5. Образцы при рН 6.0, в обоих контрольных составах (Фигура 13) и в MES (Фигура 14), были более стабильны, чем те, что составлены при рН 7.0 или 8.0 (Фигуры 15 и 16) когда анализировались с помощью SEC. Добавление сахарозы до образцов при рН 6.0 и 7.0 показало благотворное влияние на стабильность рфурина. Анализ SEC (Фигура 17) показывает, что после четырех дней инкубации при 37°С, высоты пиков образцов, содержащих сахарозу были в среднем при 75% Τ=0, по сравнению с 52% без сахарозы. Анализы исследования активности фурина подтвердили результаты SEC экспериментов (Фигуры 18 и 19). Добавление сахарозы улучшает стабильность рфурина в обоих контрольных составах и в MES рН 6.0 (Фигуры 18 и 19), с похожей стабильностью, которую видели при использовании обоих буферов (Фигура 20). Действие полисорбата-80 на стабильность рфурина в сахарозосодержащем составе при 37°С было минимальным, если таковое имеется, как показано на Фигурах 17, 18 и 19.

[0310] Эти данные показывают, что при 37°С рфурин наиболее стабилен при составах с рН 6.0 по сравнению с рН 5.0, 5.5, 7.0 и 8.0. Данные также показывают, что сахароза оказала благотворное влияние на стабильность рфурина при 37°С.Кроме того, не было замечено существенной разницы в стабильности рфурина между контрольным буфером (ацетатом) или MES при рН 6.0 в присутствии 10% сахарозы. Наконец, не было обнаружено существенного влияния полисорбата-80 на стабильность рфурина в составе сахарозы при 37°С.

Пример 5 - Сравнение стабильности состава фурина в сахарозе и манните

[0311] Как видно в Примере 4, добавление сахарозы замедляет деструкцию рфурина и/или потерю активности при 37°С. В то время как сахароза не используется в последовательных применениях, таких как rVWF процесс, другие сахара и/или сахарные спирты являются такими, как маннит. Добавление маннита к составу рфурина, а не сахарозы, не будет таким образом вводить новое сырье к vWF процессу. Данное исследование было проведено для определения, будет ли добавление маннита иметь благотворное влияние на стабильность рфурина. Тестовый состав также обладал улучшенной буферной емкостью добавлением HEPES и уксусной кислоты к финальным концентрациям 50 ммоль каждый при рН 6.0. Стабилизированный состав был создан добавление образца рфурина с 10% 500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль CaCl₂, рН 6, и затем добавляли либо сахарозу, маннит, и/или полисорбат-80. Анализы обоих исследований активности фурина (Фигура 21) и SEC (Фигура 22) показывают, что после четырех дней инкубации при 37°С, маннит и сахароза имели подобное стабилизирующее действие составов фурина. Опять же, эффект полисорбата-80 на эти составы не был значительным. Хотя данные активности (Фигура 21) показывают, что образец, содержащий манит и полисорбат-80 после 4 дневной инкубации при 37°С был лучше, чем другие образцы, не только этот образец не показывает общую картину, а и анализы SEC (Фигура) не подтверждают этого. Вполне вероятно, что этот результат был особняком.

Пример 6 - Сравнение стабильности состава фурина в сахарозе и трегалозе

[0312] Различные публикации показали, что маннит ускоряет денатруцию белков во время замораживания, которые подняли некоторые проблемы вокруг его добавления в буферный состав рфурина. Таких проблем не было зарегистрировано с трегалозой, другим сахаром, являющимся уже частью rVWF производственного процесса. Данное исследование было проведено для определения добавления трегалозы, которая будет иметь благотворное влияние на стабильность рфурина. Кроме того, различные концентрации полисорбата-80 были оценены. Анализы, использующие исследования активности фурина (Фигуры 23 и 24) показывают, что после 5 дней инкубации при 37°С, образец, содержащий 10% сахарозы, сохранил 66.2%±2.9% его первоначальной активности, в то время как образец, содержащий 10% трегалозы сохранил 60.1%±4%. Разница между этими образцами не имеет существенного значения. Оба образца были значительно лучше в сохранении активности рфурина, чем контрольный состав, который сохраняет только 37.5%±4.2% его первоначальной активности.

[0313] Анализы SEC (Фигура 25) подтвердили анализы активности. Пик рфурина для образца в 10% сахарозе сохранил 78.3%) его высоты по сравнению с 75.1% для примера с 10% трегалозы и 44.2% для контрольного состава. Кроме того, анализы с помощью вестерн-блоттинга (Фигура 26) показали наименьшее разрушение в образцах, содержащих 10% сахарозы или 10% трегалозы. Следует отметить, что образцы представлены в виде пар, с 0 днем затем до 5 дня для каждого состава.

[0314] Оба анализа активности фурина (Фигура 27) и SEC (Фигура 28) анализы показывают, что 10% трегалозы были лучше, чем 5% или 2% в сохранении активности рфурина при 37°С.Эти выводы были подтверждены вестерн-блоттингом (Фигура 26). Воздействие полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С была минимальной в соответствии с анализами на активность фурина и SEC (Фигуры 29 и 30 соответственно).

[0315] SEC и исследования активности фурина проводили, как описано выше. Вестерн-блоттинг проводили с использованием следующего оборудования и материалов:

- козье анти-Фуриновое (пептидное) первичное антитело (Cat# SC-12484) от Santa Cruz Biotechnology, Inc.

- Кроличье анти-козъе IgG-HRP сопряженное вторичное антитело (Cat# А5420) от Sigma

- Pierce Metal Enhanced Substrate Kit содержащий DAB/метал концентрат 10X,

- Pierce (Cat# 1856090) и 5 Таблица буфера пероксидазы, Pierce (Cat# 185591)

- 4-20% трис-глициновый гель (Cat# ЕС6025 ВОХ) от Invitrogen

- NuPAGE® образец восстановительного агента (0.5М DTT, 10х, Cat# NP0004) от Invitrogen

- образец не-восстановительного буфера (4Х, Cat# 84788) от Thermo

- PBS (Cat# Р4417) от Sigma

- Tween 20 (Cat# 9480) от EMD Chemicals

- BSA (Cat# A7906) от Sigma

- Устройство подачи геля (iBLOT Cat# IB401001) от Invitrogen

- PVDF (Immolobilon-P, Cat# IPVH07850) блоттинг-мембрана от Millipore

[0316] Поликлональные тела были использованы в этом исследовании вместо моноклонального до обнаружения продуктов распада рфурина. 5 мкл образца было совмещено с 1 мкл 10x DTT, и 4 мкл 4х не восстанавливающего красителя. Образец был нагрет при 70°С до 75°С в течение 10 минут.10 мкл образца наносили на 4-20% SDS-PAGE гель, и работал при 150 В в течение от 60 до 70 минут. Протеиновый гель был перенесен на PVDF мембрану с применением iBLOT при 20 В в течение 6 минут.PVDF мембрана была затем блокирована PBS буфером, содержащим 0.1% TWEEN 20 и 3% BSA в течение 1 часа. Мембрану инкубируют на протяжении одного часа в первичном антителе, разбавленном 125 кратно тем же самым буфером. Мембрану промывали PBST буфером в течение пяти минут, три раза каждый. Мембрану инкубируют в течение одного часа во вторичном антителе, разбавленном 10,000 кратно тем же самым буфером как и первичное антитело. Инкубационный период составляет 1 час.Пятно промывали с применением буфера PBST в течение пяти минут, три раза каждый. Пятно было разработано в 10 мл предварительно смешанного хромогенного субстрата (1 мл концентрата плюс 9 мл стабильного буфера пероксидазы) с последующим промыванием водой в течение 10 минут.

Пример 7 - Действие стабилизирующих агентов при разбавлении композиций фурина

[0317] Исследование разбавления рфурина проводилось для сравнения исходного состава и разбавителя для стабилизированного состава и стабилизированного разбавителя. Исследование имитировало способ разбавления, который используется в rVWF процессе вызревания. Вкратце, рфурин BDS был пропущен через фильтр с последующим добавлением 200-кратного объема разбавителя. Основное отличие между способом испытания разбавления и исходным способом разбавления в том, что в тесте (высокостабилизированного) способа, 75 ppm полисорбата-80 присутствует в обоих рфурине BDS и разбавителе, в то время как в стартовом способе нет полисорбата-80 либо в рфурине BDS или разбавителе.

[0318] Два эксперимента разбавления были проведены и оба показали, что комбинация стабилизированного состава с его стабилизированным разбавителем была выше исходного фурина и составов разбавителей. В первом эксперименте, способ испытания стабилизированных составов восстановил от 83% до 87% ожидаемой активности рфурина в то время как контрольные способы восстанавливают только от 21% до 22% (Таблица 18). В этом эксперименте, образец рфурина пропускают через фильтр и последующий 200-кратный объем разбавителя. Фильтрат собирают в пакет, а затем передают в гардуированный цилиндр.

[0319] Во втором эксперименте, метод испытания восстановил 80% от ожидаемой активности рфурина, в то время как контрольный способ восстановил только 27% (Таблица 19). В этом эксперименте, образец рфурина был пропущен через фильтр и последующий 200-кратный объем разбавителя. Фильтрат собирали в цилиндр. Комбинация состава стабилизированного рфурина и стабилизированного разбавителя увеличивает воостановление рфурина в три -четыре раза по сравнению с контрольным способом. Улучшенное восстановление связано, без ограничения теорией, с присутствием полисорбата-80.

Пример 8 - Характеристики стабилизированного маточного буферного раствора

[0320] Маточный буферный раствор для состава стабилизированного рфурина (500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусная кислота, 1 ммоль CaCl₂, рН 6.0) может быть сделан последовательно (Таблица 20). RSD's для рН и проводимости были <0.3%. РН был слегка и косвенно откоррелирован с температурой, с понижением 0.014 единиц на градус Цельсия, в то же время проводимость была непосредственно откоррелирована с температурой, поднимая 0.40 мСм/см на градус С (Фигура 49). Средняя температура образцов при измерении рН и проводимости была 27.6°С. В промышленном производстве, образцы готовятся при 25±0.5°С.На основе линейной регрессии в Фигуре 48, были рассчитаны вероятные рН и проводимость при 25°С.Относительное стандартное отклонение из Таблицы 20 было применено к этому значению для определения ожидаемого диапазона (±3 со). рН при 25°С, как ожидается, будет 6.04 (±0.01). Проводимость при 25°С как ожидается будет 19.9±0.2 мСм/см. Эти ожидаемые диапазоны основаны на трех лотах, сделанных при ограниченных обстоятельствах. Нормативные пределы для буфера не строго уставнавливаются. Уровень рН будет таким же, как окончательные уровни рН BDS, 5.90-6.10. Диапазон проводимости будет похож на тот, который используется для предыдущего BDS буффера, к примеру, с диапазоном ±20%, для уточнения 15.9-23.9 мСм/см. Требования rVWF процесса, как правило, не вызывает беспокойства в создании спецификаций буфера, потому что рфурин будет разбавляться в 200 раз в rVWF процессе. Экспериментальные данные в Таблице 21 и Таблице 22 соответствуют графикам представленным на Фигуре 49.

°

ССЫЛКИ

[0321] Все ссылки, приведенные здесь, включены здесь в качестве ссылки во всей их полноте и для всех целей до такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патент или заявка на патент были бы конкретно и отдельно указаны чтобы быть включенными в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[0322] Многие модификации и варианты этого приложения могут быть сделаны без отступления от его сущности и объема, как это будет очевидно для квалифицированного специалиста в данной области техники. Конкретные варианты осуществления, описанные в данном документе, предлагаются только в качестве примера, и применение должно быть ограничено только терминами прилагаемой формулы изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов, на которые формула изобретения имеет право.

Claims

1. Стабилизированная водная композиция рекомбинантного фурина (рфурина), где композиция содержит:

(a) от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина;

(b) от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли;

(c) от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция;

(d) от 2% до 20% сахара или сахарного спирта;

(e) от 10 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества;

(f) от 10 до 200 ммоль буферного вещества; и

(g) рН от 5.5 до 7.5.

2. Композиция по п. 1, содержащая от 150 ммоль до 250 ммоль фармацевтически приемлемой соли.

3. Композиция по п. 2, содержащая 190±10 ммоль фармацевтически приемлемой соли.

4. Композиция по п. 3, содержащая 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли.

5. Композиция по п. 1, в которой фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия.

6. Композиция по п. 1, в которой фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия.

7. Композиция по п. 1, содержащая 0.9±0.2 ммоль кальция.

8. Композиция по п. 7, содержащая 0.92 ммоль кальция.

9. Композиция по п. 1, содержащая от 5% до 15% сахара или сахарного спирта.

10. Композиция по п. 9, содержащая 10±2% сахара или сахарного спирта.

11. Композиция по п. 10, содержащая 10% сахара или сахарного спирта.

12. Композиция по п. 1, в которой сахар или сахарный спирт являются выбранными из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита и их комбинации.

13. Композиция по п. 1, в которой сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу.

14. Композиция по п. 1, в которой сахар или сахарный спирт представляет собой сахарозу.

15. Композиция по п. 1, содержащая от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

16. Композиция по п. 15, содержащая от 50 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

17. Композиция по п. 16, содержащая 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

18. Композиция по п. 1, в которой неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80.

19. Композиция по п. 1, содержащая от 50 ммоль до 150 ммоль буферного вещества.

20. Композиция по п. 19, содержащая 90±10 ммоль буферного вещества.

21. Композиция по п. 20, содержащая 91 ммоль буферного вещества.

22. Композиция по п. 1, в которой буферное вещество содержит ацетат.

23. Композиция по п. 1, в которой буферное вещество содержит HEPES.

24. Композиция по п. 1, в которой буферное вещество содержит MES.

25. Композиция по п. 1, в которой буферное вещество содержит ацетат и HEPES.

26. Композиция по п. 25, содержащая от 25 ммоль до 75 ммоль ацетата и от 25 до 75 ммоль HEPES.

27. Композиция по п. 26, содержащая 45±5 ммоль ацетата и 45±5 ммоль HEPES.

28. Композиция по п. 27, содержащая 45 ммоль ацетата и 46 ммоль HEPES.

29. Композиция по п. 1, которая имеет рН от 5.5 до 7.0.

30. Композиция по п. 29, которая имеет рН от 5.5 до 6.5.

31. Композиция по п. 30, которая имеет рН 6.0±0.2.

32. Композиция по п. 31, которая имеет рН 6.0.

33. Композиция по п. 1, в которой композиция имеет повышенную стабильность при хранении при 37°C по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахар или сахарный спирт.

34. Композиция по п. 33, в которой композиция сохраняет повышенный процент активности рфурина при хранении при 37°C по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахар или сахарный спирт.

35. Композиция по п. 33 или 34, в которой композиция сохраняет высокий процент содержания рфурина при хранении при 37°C по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахар или сахарный спирт.

36. Композиция по п. 1, в которой композиция имеет повышенную стабильность при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

37. Композиция по п. 36, в которой композиция сохраняет более высокий процент активности рфурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

38. Композиция по п. 36 или 37, в которой композиция содержит более высокий процент содержания мономера рфурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, который не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

39. Композиция по п. 1, в которой композиция имеет повышенную стабильность при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

40. Композиция по п. 39, в которой композиция сохраняет более высокий процент активности рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

41. Композиция по п. 39 или 40, в которой композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

42. Стабилизированная водная композиция рекомбинантного фурина (рфурина), где композиция содержит:

(a) от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина;

(b) 190 ммоль хлорида натрия;

(c) 0.92 ммоль кальция;

(d) 10% трегалозы;

(e) 75 ppm полисорбата-80;

(f) 45 ммоль уксусной кислоты; и

(g) 46 ммоль HEPES.