TWI586802B - 重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之調配物 - Google Patents

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Description

重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之調配物 【相關申請案之交叉參考】
本申請案主張2012年6月2日申請之美國臨時申請案第61/492,712號之權利，為了所有目的，該案內容明確地以全文引用之方式併入本文中。
本申請案一般係關於蛋白質調配物之領域。
蛋白水解哺乳動物枯草桿菌蛋白樣原蛋白轉化酶(subtilisin-like proprotein convertases，SPC或PC)家族與細菌枯草桿菌蛋白及酵母Kex2p同源。迄今為止，已鑑別出SPC家族之七個不同成員，包括成對鹼性胺基酸蛋白酶(furin)、PC1(亦稱為PC3)、PC2、PACE4、PC4、PC5(亦稱為PC6)、PC7(LPC、PC8或SPC7)，其各自展現出獨特的組織分佈。
成對鹼性胺基酸蛋白酶，亦稱為PACE(成對鹼性胺基酸裂解酶)普遍表現於所有哺乳動物組織及細胞系中，且能夠處理分泌路徑中之多種生物活性前驅蛋白質，亦包括激素、生長因子、受體、病毒及細菌蛋白質以及血漿蛋白質。其為一種鈣依賴性絲胺酸內切蛋白酶，結構上配置成數個域，亦即信號肽、前肽、催化域、中間域(亦稱為homo-B域或P域)、C末端定位之半胱胺酸富集域、跨膜域及細胞 質尾。成對鹼性胺基酸蛋白酶之蛋白酶裂解位點包含識別序列，其特性在於胺基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg(Hosaka等人，J Biol Chem.1991；266：12127-30)。
成對鹼性胺基酸蛋白酶屬於原蛋白轉化酶家族且依賴於鈣(Ca2+)。成對鹼性胺基酸蛋白酶特異性裂解1位及4位含有精胺酸之特定序列中C末端之精胺酸肽鍵。在許多人類蛋白質中均可發現此序列，表明成對鹼性胺基酸蛋白酶在許多人類原蛋白之成熟過程中起著重要作用。因此，成對鹼性胺基酸蛋白酶為一種原蛋白轉化酶，其將潛在的前驅蛋白質處理成其生物學活性產物。成對鹼性胺基酸蛋白酶為一種鈣依賴性絲胺酸內切蛋白酶，其使前驅蛋白質在其成對鹼性胺基酸處理位點處裂解。成對鹼性胺基酸蛋白酶之一種受質為馮威里因子(von Willebrand Factor，vWF)。
成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如重組成對鹼性胺基酸蛋白酶)能夠藉由裂解VWF之Arg741-Ser742肽鍵，將原VWF(原馮威里因子)轉化為成熟VWF。此成熟步驟為例如提供馮威里氏病B型(von Willebrand Disease Type B)之療法的rVWF產生製程之一部分。活化重組蛋白質之產生具有高度的臨床及診斷重要性。舉例而言，活性或成熟蛋白質(如成熟VWF)可用於控制凝血。
成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物，尤其重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物通常因蛋白質降解(通常成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質之自身裂解) 所致之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性損失而具有較短的保存期限(少於6個月)。此外，當用於某些產生製程(諸如產生成熟vWF)時，r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物通常被稀釋200倍，且經稀釋之r成對鹼性胺基酸蛋白酶一般顯示不成比例的活性損失。因此，在此領域中需要使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物穩定化之方法及調配物，以及用於稀釋濃成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物而不損失大部分成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之方法。
藉由提供使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)穩定化之方法及調配物，本發明實現了成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配、儲存及操作領域中之此等需求及其他需求。藉由添加糖、糖醇及/或非離子界面活性劑能顯著增強成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物在儲存及機械應力期間之穩定性的發現，使此等需求至少部分得到滿足。
因此，本發明提供高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物，尤其提供高度穩定化r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物，其與起始(對照)成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物相比在高溫、攪拌及不同pH值條件下顯示出較強穩定性。
在一個態樣中，本發明提供一種重組成對鹼性胺基酸 蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之穩定化水性組成物，該組成物包含：8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶、100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括150 mM至250 mM醫藥學上可接受之鹽。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括190±10 mM醫藥學上可接受之鹽。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括190 mM醫藥學上可接受之鹽。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在以上所提供之組成物之另一具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括0.9±0.2 mM鈣。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括0.92 mM鈣。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括5%至15%糖或糖醇。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括10±2%糖或糖醇。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括10%糖或糖醇。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，糖或糖醇係選自由以下各物所組成之群組：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在以上所提供之組成物之另一具體實例中， 糖或糖醇為海藻糖。在以上所提供之組成物之另一具體實例中，糖或糖醇為蔗糖。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括50 ppm至100 ppm非離子界面活性劑。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括75 ppm非離子界面活性劑。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括50 mM至150 mM緩衝劑。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括90±10 mM緩衝劑。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括91 mM緩衝劑。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，緩衝劑包含乙酸鹽。在以上所提供之組成物之另一具體實例中，緩衝劑包含HEPES。在以上所提供之組成物之另一具體實例中，緩衝劑包含MES。在以上所提供之組成物之另一具體實例中，緩衝劑包含乙酸鹽及HEPES。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物包括25 mM至75 mM乙酸鹽及25 mM至75 mM HEPES。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括45±5 mM乙酸鹽及45±5 mM HEPES。在另一具體實例中，以上所提供之組成物包括45 mM乙酸鹽及46 mM HEPES。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物具有5.5至 7.0之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有5.5至6.5之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有6.0±0.2之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有6.0之pH值。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在於37℃下儲存時具有較強穩定性。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在於37℃下儲存時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在於37℃下儲存時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在攪拌時具有較強穩定性。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在攪拌時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物 相比在攪拌時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在稀釋時具有較強穩定性。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在稀釋時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供之組成物之一個具體實例中，組成物與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比在稀釋時維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
在一個態樣中，本發明提供一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之穩定化水性組成物，該組成物包含：8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶、190 mM氯化鈉、0.92 mM鈣、10%海藻糖、75 ppm聚山梨醇酯80、45 mM乙酸、46 mM HEPES，及5.5至7.5之pH值。
在一個具體實例中，以上所提供之組成物具有5.5至7.0之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有5.5至6.5之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有6.0±0.2之pH值。在另一具體實例中，以上所提供之組成物具有6.0之pH值。
在一個態樣中，本發明提供一種用於稀釋r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物之方法，該方法包含向r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物中添加包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑之稀釋緩衝液，從而形成經稀釋之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物。
在以上所提供之方法之一個具體實例中，稀釋緩衝液包含10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑。在以上所提供之方法之另一具體實例中，稀釋緩衝液包含50 ppm至100 Ppm非離子界面活性劑。在以上所提供之方法之另一具體實例中，稀釋緩衝液包含75 ppm非離子界面活性劑。
在以上所提供之方法之一個具體實例中，稀釋緩衝液具有5.5至7.5之pH值。在以上所提供之方法之另一具體實例中，稀釋緩衝液具有5.5至6.5之pH值。在以上所提供之方法之另一具體實例中，稀釋緩衝液具有6.0±0.2之pH值。在以上所提供之方法之另一具體實例中，稀釋緩衝液具有6.0之pH值。
在以上所提供之方法之一個具體實例中，經稀釋之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物包含至少50%存在於稀釋前之r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。
在以上所提供之方法之一個具體實例中，經稀釋之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物包含至少75%存在於稀釋前之r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。
在一個態樣中，本發明提供一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物，該調配物包含：8,000 U/mL至52,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶；1 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽；0.1 mM至2 mM氯化鈣；1%至20%糖及/或糖二水合物；50 ppm至100 ppm界面活性劑：及1 mM至100 mM羧酸、濃度足以維持4.0至7.0之pH值之緩衝劑、或該羧酸及該緩衝劑。
在一個具體實例中，以上所提供之調配物包括180 mM至200 mM鹽。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，鹽為氯化鈉。
在一個具體實例中，以上所提供之調配物包括0.5 mM至1.0 mM鈣。
在一個具體實例中，以上所提供之調配物包括5%至15%糖或糖二水合物。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，糖或糖二水合物係選自由以下各物所組成之群組：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，界面活性劑為聚山梨醇酯80。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，界面活性劑以約65 ppm至約85 ppm之濃度存在。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，羧酸為乙酸。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，羧酸之濃度為35 mM至55 mM。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，緩衝劑為HEPES。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，緩衝劑之濃度為約20 mM至約100 mM。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，調配物與不含糖或糖二水合物之調配物相比在於37℃下儲存之後顯示出改良之穩定性。
在以上所提供之調配物之一個具體實例中，藉由向包含1%聚山梨醇酯80、500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM氯化鈣及海藻糖二水合物粉末之組成物中添加r成對鹼性胺基酸蛋白酶來製備調配物，其中該組成物在添加至該r成對鹼性胺基酸蛋白酶中之前具有6.0之pH值。
在一個態樣中，本發明提供一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物，該調配物包含：8,000 U/mL至57,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶、190 mM氯化鈉、0.92 mM氯化鈣、10% w/w海藻糖二水合物、75 ppm聚山梨醇酯80、45 mM乙酸及46 mM HEPES。
在一個態樣中，本發明提供一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物，其包括：(a)8,000 U/mL至52,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(b)1 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽；(c) 0.1 mM至2 mM氯化鈣；(d)1%至20%糖及/或糖二水合物；(e)50 ppm至100 ppm界面活性劑；及(f)1 mM至100 mM羧酸、或濃度足以維持4.0至7.0之pH值之緩衝劑、或該羧酸及該緩衝劑。
I.前言
本發明係部分基於以下發現：成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物可藉由添加糖、糖醇及非離子界面活性劑針對各種化學及機械應力穩定化。與缺乏糖、糖醇及非離子界面活性劑之類似成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比，本文所述之成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物在儲存於室溫或高於室溫下時以及在經受機械應力時顯著更穩定。本發明亦部分基於以下發現；向成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液中添加非離子界面活性劑能夠在該酶稀釋至製造各種重組生物製品(諸如VWF)期間所用之較低濃度時實現成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之較大恢復。
有利的是，本文所述之研究顯示向成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中添加糖或糖醇使組成物在經一段時間儲存時之穩定性增強。舉例而言，本文中顯示成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物中納入僅2%糖或糖醇即可使組成物之穩定性增強10%以上。另外顯示成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物中納入10%糖或糖醇可使組成物之穩定性增強75%以上。
有利的是，本文所述之研究亦顯示向成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中添加非離子界面活性劑使組成物在經受機械應力時之穩定性增強。舉例而言，本文中顯示成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物中納入僅10 ppm非離子界面活性劑即可使組成物之穩定性增強75%以上。
有利的是，本文所述之研究亦顯示向成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液中納入非離子界面活性劑使成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋後之活性恢復增強。舉例而言，本文中顯示成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液納入75 ppm非離子界面活性劑使成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋後之活性恢復增強3至4倍。
因此，本發明提供高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之組成物。儘管本文中之大部分討論係依據重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物，但應理解任何成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質(包括自個體分離之成對鹼性胺基酸蛋白酶或成對鹼性胺基酸蛋白酶之任何衍生物或突變體)均可包括於本發明之調配物中。
在一個態樣中，本發明提供高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物，其在使調配物經受一或多種應激子後檢定時顯示出與對照調配物相比改良之穩定性，該等應激子包括(但不限於)使調配物曝露於多種溫度、數個冷凍/解凍循環、及/或攪拌。一般利用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性水準分析改良之穩定性--舉例而言，在高於環境室溫下 儲存之後，與各自儲存前(亦即在時間=0時)之活性相比，高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物將顯示出高於在相同條件下儲存之對照調配物的活性水準。本文中描述用於分析成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物的穩定性之方法。
在其他態樣中，本發明提供用於形成本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之方法。該等方法包括針對儲存(包括冷凍儲存、在環境室溫或高於環境室溫下儲存、或凍乾)使成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物穩定化之方法。
在其他態樣中，本發明提供用於稀釋濃成對鹼性胺基酸蛋白酶溶液之方法，該等方法在稀釋之後引起成對鹼性胺基酸蛋白酶活性保留率增高。與經缺乏非離子界面活性劑之溶液稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比，根據本文中所提供之方法稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物保留3至4倍之酶活性。
II.定義
如本文中所用，術語「成對鹼性胺基酸蛋白酶(成對鹼性胺基酸蛋白酶)」係指具有成對鹼性胺基酸蛋白酶活性(尤其裂解原馮威里因子(原VWF)多肽之殘基Arg-763與Ser-764之間的肽鍵之能力)之任何蛋白質或多肽。在一例示性具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶係指包含與NP_002560.1(人類成對鹼性胺基酸蛋白酶前原蛋白)之胺 基酸序列相同或高度相同之胺基酸序列之多肽。在一例示性具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶係指包含與NP_002560.1之胺基酸25-794(人類成對鹼性胺基酸蛋白酶原蛋白)相同或高度相同之胺基酸序列之多肽。在一例示性具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶係指包含與NP_002560.1之胺基酸108-794(人類成熟成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質)相同或高度相同之胺基酸序列之多肽。如本文中所用，成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽亦包括具有VWF裂解活性之成對鹼性胺基酸蛋白酶天然變異體以及具有VWF裂解活性之經修飾的成對鹼性胺基酸蛋白酶構築體。如本文中所用，成對鹼性胺基酸蛋白酶包涵保留一些基本活性(例如與野生型成對鹼性胺基酸蛋白酶之活性相比至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)之任何天然變異體、替代性序列、同功異構物或突變體蛋白質。人群中可見之成對鹼性胺基酸蛋白酶突變之實例包括(但不限於)A43E、A43G、A43V、R50W、Y64C、L77P、R81C、E97A、E97V、V109M、V109L、R130W、A139V、P169T、N245S、E271K、Q339R、N407S、E457Q、R464W、K469R、S524Y、T536S、L570F、D624N、A642T、S685P、V728I、V735I、R745Q、P772L及A793T。成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽亦包括含有翻譯後修飾之多肽。舉例而言，已顯示成對鹼性胺基酸蛋白酶在殘基S773及S775處磷酸化且預測成對鹼性胺基酸蛋白酶在殘基N387、N440及N553處糖基 化。
在本發明之情形下，成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質包括重組成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽以及自源材料(例如組織或血液)分離之天然成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽。成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽(重組及來源純化之)及其生物學活性衍生物可衍生自任何適合之生物體，例如哺乳動物，諸如靈長類動物、人類、猴子、兔、豬、齧齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓。亦包涵具有VWF裂解活性之突變及變異成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽以及功能性片段及包含成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽之融合蛋白質。另外，本文所述之成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽可另外包含有利於純化、偵測或兩方面之標籤。本文所述之成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽可另外經治療性部分或適於試管內或活體內成像之部分修飾。
可藉由在細胞培養(例如哺乳動物細胞培養)中表現來製備蛋白水解活性重組成對鹼性胺基酸蛋白酶。用於製備重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之表現及純化方法之非限制性實例描述於WO 1991/06314、WO 1992/09698、美國專利第6,210,929號及第6,596,526號以及美國專利申請公開案第2009/0181423號及第2009/0304669號中，為了所有目的，該等案之內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文中所用，「活性(activity)」係指成對鹼性胺基酸蛋白酶或其部分之與全長(完整)蛋白質有關之功能活性。功能活性包括(但不限於)生物活性，包括參與原 蛋白受質之蛋白水解成熟過程及測試受質(諸如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1；AMC=7-胺基-4-甲氧基香豆素))之裂解。成對鹼性胺基酸蛋白酶之受質包括馮威里因子、原副甲狀腺素(proparathyroid hormone)、轉型生長因子β 1前驅體、原白蛋白(proalbumin)、原β-分泌酶、膜1型基質金屬蛋白酶、及原神經生長因子之β亞單元。在一個具體實例中，一個單位(U)之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性定義為每分鐘使1 pmol AMC自Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1)釋放之成對鹼性胺基酸蛋白酶之量。
如本文中所用，術語「穩定性(stability)」(諸如成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性或成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物穩定性)用於結構情形(例如與蛋白質之結構完整性有關)或功能情形(例如與蛋白質隨時間推移保留其功能及/或活性之能力有關)。應理解，根據本文所述之方法及組成物之調配物內可含有所討論之蛋白質，且該蛋白質之穩定性係指其在該調配物中之穩定性。在一個具體實例中，藉由量測組成物之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性來測定成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之穩定性。舉例而言，藉由使用可偵測之成對鹼性胺基酸蛋白酶受質，諸如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1；例如由Enzo Life Sciences銷售之ALX-260-040-M001)，例如在如Malloy SS等人，J Biol Chem.1992年8月15日；267(23)：16396-402(為了所有目的，該案內容在此以全文引用之方式併入本文中) 中所述之檢定中。在一個具體實例中，將如本文所述用糖、糖醇及/或非離子界面活性劑調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之穩定性與未用糖、糖醇及/或非離子界面活性劑調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比較。
如本文中所用，「儲存穩定(storage stable)」之成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物係指經調配以使蛋白質在既定儲存時間內在溶液中之穩定性增強例如至少10%之成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽溶液(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽溶液)。在本發明之情形下，可藉由添加糖、糖醇或非離子界面活性劑作為穩定劑來使成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽溶液(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽溶液)「儲存穩定」。在一些具體實例中，可例如藉由監測一段時間內聚集體之形成、整體酶活性之損失或降解產物之形成來量測成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽在任何既定調配物中的穩定性。調配物之絕對穩定性及糖、糖醇或非離子界面活性劑之穩定作用將視正穩定化之特定組成物而變化。在一個具體實例中，藉由量測成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性來測定組成物之穩定性。舉例而言，藉由使用可偵測之成對鹼性胺基酸蛋白酶受質，諸如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1；例如由Enzo Life Sciences銷售之ALX-260-040-M001)，例如在如Malloy SS等人，J Biol Chem.1992年8月15日；267(23)：16396-402(為了所有目的，該案內容在此以全文引用之方式併入本文中)中所述之檢定中。在一個具體實例中，將如本文所述用糖、 糖醇及/或非離子界面活性劑調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之穩定性與未用糖、糖醇及/或非離子界面活性劑調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比較。
如本文中所用，「保存期限(shelf-life)」係指調配物在預定溫度下維持預定穩定性水準之一段時間。在特定具體實例中，預定溫度係指冷凍(例如-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(例如0℃至10℃)或室溫(例如18℃至32℃)儲存。
如本文中所用，術語「穩定性時間(time of stability)」係指調配物被視為穩定之持續時間。舉例而言，調配物之穩定性時間可指調配物中之蛋白質聚集及/或降解水準保持在某一臨限值(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%等)以下之持續時間，及/或調配物維持生物活性在某一臨限值(例如100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%等)以上之持續時間，該臨限值為在儲存期開始時調配物中所存在之活性之量的臨限值。
在本發明之情形下，與未經糖、糖醇及/或非離子界面活性劑調配之相同成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽之組成物相比，經糖、糖醇及/或非離子界面活性劑調配之儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽)之水性組成物將具有較長的穩定性時間。在一些具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽水性組成物將具有比在缺乏糖、糖醇及/或非離子界面活性劑之情 況下調配之相同組成物的穩定性時間高例如至少10%的穩定性時間，或具有比在缺乏糖、糖醇及/或非離子界面活性劑之情況下調配之相同組成物的穩定性時間高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、1l0%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或至少2倍、或至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10倍或更多倍的穩定性時間。
如本文中所用，「儲存(storage)」意謂調配物在製備後不即刻投予個體或用於產生製程，而在使用前在特定條件(例如特定溫度)下維持一段時間。舉例而言，成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物可在投予個體之前在不同溫度(諸如冷凍(例如-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(例如0℃至10℃)或室溫(例如18℃至32℃))下維持數天、數週、數月或數年。應理解，該等調配物可為液體或凍乾調配物。
如本文中所用，術語「約(about)」表示指定值加10%或減10%之近似範圍。舉例而言，措辭「約20%(about 20%)」包涵18%至22%之範圍。
如本文中所用，在提及組成物之個別組分之濃度時，短語「不大於X(no more than X)」及「0至X(from 0 to X)」等效且係指0與X之間且包括0及X的任何濃度。舉例而言，短語「不大於2%之濃度(a concentration of no more than 2%)」及「0%至2%之濃度(a concentration of from 0% to 2%)」等效且包括0%、1%及2%。
如本文中所用，在提及組成物之個別組分之濃度時，短語「不低於X(no less than X)」係指X或X以上之任何濃度。舉例而言，短語「不低於98%之濃度(a concentration of no less than 98%)」包括98%、99%及100%。
如本文中所用，在提及組成物之個別組分之濃度時，短語「X與Y之間(between X and Y)」及「X至X(from X to X)」等效且係指X與Y之間且包括X及Y的任何濃度。舉例而言，短語「49%與51%之間的濃度(a concentration of between 49% and 51%)」及「49%至51%之濃度(a concentration of from 49% to 51%)」等效且包括49%、50%及51%。
如本文中所用，「糖(sugar)」係指具有通式CxH2yOy(直鏈)或CxH(2y-1)Oy(環狀)之單醣以及經脫水反應形成之由兩個單醣單元組成的雙醣。單醣可根據其所含有之碳原子數目分為：乙醣(2)、丙醣(3)、丁醣(4)、戊醣(5)、己醣(6)、庚醣(7)等。因此，如本文中所用，C(X)糖係指含有X數目之碳分子之糖。舉例而言，C(5)糖係指戊醣，而C(6)糖係指己醣。可用於本文中所提供之調配物中之糖之非限制性實例包括：乙醣，乙醇醛；丙醣，甘油醛及二羥基丙酮；丁醣，赤藻糖(erythrose)，蘇糖(threose)及赤蘚酮糖(erythrulose)；戊醣，阿拉伯糖(arabinose)，來蘇糖(lyxose)，核糖，木糖(xylose)，核酮糖及木酮糖(xylulose)；己醣，阿洛糖(allose)、 阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖、塔羅糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖、山梨糖(sorbose)及塔格糖(tagatose)；庚醣，景天庚酮糖(sedoheptulose)、甘露庚酮糖(mannoheptulose)及L-甘油-D-甘露-庚醣；及自其中形成之所有可能的雙醣組合，包括(但不限於)蔗糖、乳酮糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、麴二糖(kojibiose)、黑麯黴糖(nigerose)、異麥芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐二糖(sophorose)、海帶二糖(laminaribiose)、龍膽二糖(gentiobiose)、松二糖(turanose)、麥芽酮糖(maltulose)、巴拉金糖(palatinose)、gentiobiulose、甘露二糖(mannobiose)、蜜二糖(melibiose)、車前二糖(melibiulose)、芸香糖(rutinose)、rutinulose及木二糖(xylobiose)。
如本文中所用，「糖醇(sugar alcohol)」係指單醣或雙醣之氫化形式，該單醣或雙醣之羰基已經還原以形成一級羥基或二級羥基。在一個具體實例中，糖醇具有約4至約8個碳原子。可用於本文中所提供之調配物中之糖醇之非限制性實例包括乙二醇、甘油、赤藻糖醇、蘇糖醇、核糖醇、海藻醇(fucitol)、艾杜糖醇、倭勒米糖醇(volmitol)、異麥芽糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇(galactitol)、甜醇(dulcitol)、木糖醇及阿拉伯糖醇。
如本文中所用，「醫藥學上可接受之鹽 (pharmaceutically acceptable salt)」係指藥物調配物中安全投予個體(例如人類)之鹽。醫藥學上可接受之鹽之選擇及使用為此項技術中所熟知，例如參見Stahl and Wermuth,Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use，第二修訂版，Wiley,Hoboken,New Jersey。在某些具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。
如本文中所用，術語「非離子界面活性劑(non-ionic surfactant)」係指在生理相關條件下非離子化之界面活性劑。適用於本文中所提供之穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物之非離子界面活性劑的非限制性實例包括：非離子水溶性單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯(例如丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯(MIGLYOL® 840)、中鏈單酸甘油酯及二酸甘油酯(例如CAPMUL®及IMWITOR® 72)、中鏈三酸甘油酯(例如辛酸甘油三酯及癸酸甘油三酯，諸如LAVRAFAC、MIGLYOL® 810或812、CRODAMOL® GTCC-PN及SOFTISON 378)、長鏈單酸甘油酯(例如單油酸甘油酯，諸如PECEOL®；及單亞油酸甘油酯，諸如MAISINE®)、聚乙二醇蓖麻油(例如聚乙二醇蓖麻油酸酯、聚乙二醇羥基硬脂酸酯、聚乙二醇十六基十八基醚))；聚乙二醇之非離子水溶性單脂肪酸酯及二脂肪酸酯；非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脫水山梨糖醇單月桂酸酯，諸如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯(TWEEN 20)及脫水山梨糖醇單月桂酸酯(SPAN 20)；脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯，諸如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇 單棕櫚酸酯(TWEEN 40)及脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(SPAN 40)；脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，諸如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(TWEEN 60)及脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(SPAN 60)；脫水山梨糖醇單油酸酯，諸如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN 80)及脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN 80)；脫水山梨糖醇三油酸酯，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯(SPAN 85)；及脫水山梨糖醇三硬脂酸酯，諸如脫水山梨糖醇三硬脂酸酯(SPAN65))；聚乙二醇甘油酯(例如聚乙二醇-6甘油月桂醯酯(Labrafil® M2130CS)；聚乙二醇1000丁二酸d-α-生育酚酯(TPGS)、聚乙二醇660 12-羥基硬脂酸酯(SOLUTOL® HS 15)、聚乙二醇油酸酯及硬脂酸酯(例如PEG 400單硬脂酸酯及PEG 1750單硬脂酸酯))；非離子水溶性三嵌段共聚物(例如聚(氧化乙烯)/聚(氧化丙烯)/聚(氧化乙烯)三嵌段共聚物，諸如甲基環氧乙烷與環氧乙烷之聚合物BHT(PLURONIC® F-127))。
在一個具體實例中，提供儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物，其含有選自以下各物之非離子界面活性劑：非離子水溶性單酸甘油酯、非離子水溶性二酸甘油酯、非離子水溶性三酸甘油酯、聚乙二醇之非離子水溶性單脂肪酸酯、聚乙二醇之非離子水溶性二脂肪酸酯、非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、非離子聚乙二醇甘油酯、非離子水溶性三嵌段共聚物及其組合。
如本文中所用，術語「生物學活性衍生物(biologically active derivative)」在成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽之情形下使用時亦包涵經由重組DNA技術獲得之多肽。此技術可包括在以下技術中已知之任何方法：(i)藉由遺傳工程產生重組DNA，例如經由反轉錄RNA及/或擴增DNA產生；(ii)藉由轉染將重組DNA引入原核或真核細胞中，例如經由電穿孔或顯微注射引入；(iii)培養該等轉型細胞，例如以連續或分批方式培養；(iv)表現成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質，例如組成性表現或在誘導後表現；及(v)分離該成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質，例如自培養基或藉由收穫轉型細胞分離；以便(vi)獲得實質上純化之重組成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質，例如經由離子交換層析法、尺寸排阻層析法、親和層析法、疏水性相互作用層析法及其類似方法獲得。術語「生物學活性衍生物」亦包括嵌合分子，諸如成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質或其功能片段與第二多肽(例如免疫球蛋白Fc域或白蛋白域)之組合以便改良生物學/藥理學性質，諸如成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質在哺乳動物(尤其人類)循環系統中之半衰期。
除非上下文中另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「緩衝劑(a buffering agent)」係指一種試劑或該等試劑之混合物，且提及「方法(the method)」包括提及熟習此項技術者已知之等效步驟及方法，諸如此類。
除非另作定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。為了描述及揭示描述於公開案中且可能用於目前所述之發明方面之裝置、組成物、調配物及方法學的目的，本文中所提及之所有公開案均以引用之方式併入本文中。
若提供一定範圍之值，則應理解除非上下文另外明確規定，否則本發明中包涵該範圍之上限與下限之間的各插入值(至下限單位之十分之一)及在該所述範圍中之任何其他所述值或插入值。本發明中亦包涵可獨立包括於此等較小範圍中之該等較小範圍之上限與下限，服從所述範圍之任何特定排除界限。若所述範圍包括一或兩個界限，則排除任一個或兩個所包括界限之範圍亦包括於本發明內。
如本文中所用，「BDS」係指「散裝原料藥(Bulk Drug Substance)」
III.重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之穩定化水性組成物
在一個態樣中，本發明提供成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之穩定化水性調配物。以下具體實例係部分基於以下發現：與缺乏糖、糖醇及/或非離子界面活性劑之組成物相比，糖、糖醇及/或非離子界面活性劑之納入使成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物穩定化。
如熟習此項技術者將認識到，除明確揭示之組分以外，根據本文中所提供之具體實例調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)亦可 含有藉由納入溶液組分或pH值調節劑貢獻之相對離子，例如由乙酸鹽、氫氧化鈉或氫氧化鉀貢獻之鈉或鉀，或由氯化鈣或鹽酸貢獻之氯。在本發明之情形下，如在特定pH值下之調配製程所要求，由既定調配物組成或基本上由既定調配物組成之儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)可另外包含一或多種相對離子。
在一個具體實例中，本文中所提供之儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)將在室溫(亦即18℃與32℃之間)下穩定一段時間。舉例而言，在一個具體實例中，儲存穩定之免疫球蛋白水性組成物將在於室溫下儲存時穩定至少4天。在其他具體實例中，組成物將在室溫下穩定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或28天以上。在其他具體實例中，組成物將穩定至少1個月。在其他具體實例中，組成物將穩定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或48個月以上。在某些具體實例中，室溫係指在20℃與30℃之間、在21℃與29℃之間、在22℃與28℃之間、在23℃與27℃之間、在24℃與26℃之間、或約25℃。在一特定具體實例中，組成物將在於20℃與25℃之間的溫度下儲存時穩定較長的一段時間。
在一個具體實例中，本文中所提供之儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)將在冷藏溫度(亦即2℃與10℃之間)下穩定一段時間。舉例而言，在一個具體實例中，儲存穩定之免疫球蛋白水性組成物將在於冷藏溫度下儲存時穩定至少4天。在其他具體實例中，組成物將在冷藏溫度下穩定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或28天以上。在其他具體實例中，組成物將穩定至少1個月。在其他具體實例中，組成物將穩定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或48個月以上。在一特定具體實例中，組成物將在於2℃與8℃之間的溫度下儲存時穩定較長的一段時間。
在一個具體實例中，本文中所提供之儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)將在高溫(亦即32℃與42℃之間)下穩定一段時間。舉例而言，在一個具體實例中，儲存穩定之免疫球蛋白水性組成物將在於高溫下儲存時穩定至少4天。在其他具體實例中，組成物將在高溫下穩定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或28天以上。在其他具體實例中，組成物將穩定至少1個月。在其他具體實例中，組成物將穩定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或48個月以上。在一特定具體實例中，組成物將在於35℃與40℃之間的溫度下儲存時穩定較長的一段時間。
在一個具體實例中，只要儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物維持至少40%在儲存期開始時(例如在時間=0時)所存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性，組成物即被視為儲存穩定的。在另一具體實例中，只要儲存之組成物維持至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上在儲存期開始時(例如在時間=0時)所存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性，組成物即被視為穩定的。在一個具體實例中，在如Malloy SS等人，J Biol Chem.1992年8月15日；267(23)：16396-402中所述之檢定中量測成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。
在一個具體實例中，當在儲存一段時間後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物多至少10%之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在其他具體實例中，當在儲存一段時間後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物多至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、100%或100%以上之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。
在一個具體實例中，只要以聚集態存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶之百分比保持不大於50%，儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物即被視為穩定的。在其他具體實例中，只要以聚集態存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶之百分比保持不大於45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或1%以下，儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物即被視為穩定的。
在一個具體實例中，當在儲存一段時間後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物少至少10%之以聚集態存在的成對鹼性胺基酸蛋白酶時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在其他具體實例中，當在儲存一段時間後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或100以上之以聚集態存在的成對鹼性胺基酸蛋白酶時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。
在一個具體實例中，只要儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物在經受機械應力之後維持至少40%起始成對鹼性胺基酸蛋白酶活性(例如在時間=0時)，組成物即被視為穩定的。在另一具體實例中，只要儲存之組成物在經受機械應力之後維持45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上起始成對鹼性胺基酸蛋白酶活性(例如在時間=0時)，組成物即被視為穩定的。在一特定具體實例中，機械應力為攪拌(例如振動)。
在一個具體實例中，當在經受機械應力之後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物多至少10%之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在其他具體實例中，當在經受機械應力之後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含有穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物多至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或100%以上之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在一特定具體實例中，機械應力為攪拌(例如振動)。
在一個具體實例中，只要以聚集態存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶之百分比在經受機械應力之後保持不大於50%，儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物即被視為穩定 的。在其他具體實例中，只要以聚集態存在之成對鹼性胺基酸蛋白酶之百分比在經受機械應力之後保持不大於45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或1%以下，儲存之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物即被視為穩定的。在一特定具體實例中，機械應力為攪拌(例如振動)。
在一個具體實例中，當在經受機械應力之後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物少至少10%之以聚集態存在的成對鹼性胺基酸蛋白酶時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在其他具體實例中，在經受機械應力之後，成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物含有比不含穩定劑或含有較低量穩定劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或100以上之以聚集態存在的成對鹼性胺基酸蛋白酶時，組成物被視為已藉由添加穩定劑(例如糖、糖醇或非離子界面活性劑)而穩定化。在一特定具體實例中，機械應力為攪拌(例如振動)。
雖然本申請案中所描述之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物可以指定濃度凍乾及復原，但應理解此等製劑亦可以較稀的形式復原。舉例而言，經凍乾及/或通常以2 mL溶液復原之本發明製劑亦可以較 大體積之稀釋劑(諸如5 mL)復原。同樣地，經凍乾之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物亦可以較濃的形式復原。舉例而言，經凍乾及/或通常以2 mL溶液復原之本發明製劑亦可以較小體積之稀釋劑(諸如1 mL)復原。
有利的是，在一個態樣中，本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物與稀釋劑組合，在所得組成物用於產生方法，例如用於rVWF之成熟過程(本文中亦稱為「rVWF成熟方法(rVWF maturation method)」)時，該稀釋劑使成對鹼性胺基酸蛋白酶恢復增強。原馮威里因子(vWF)成熟至其活性形式需要在殘基763處之胺基二羧酸對(-Lys-Arg-)之後進行蛋白水解處理。已顯示較佳藉由成對胺基二羧酸裂解酶成對鹼性胺基酸蛋白酶處理vWF。因此，vWF之產生製程包括使用成對鹼性胺基酸蛋白酶，較佳於高度穩定化調配物中。在另一態樣中，與置於對照稀釋劑中之對照調配物相比，於此稀釋劑中之高度穩定化調配物使成對鹼性胺基酸蛋白酶在rVWF成熟步驟中之活性恢復增強至3至4倍。
在某些態樣中，本發明之高度穩定化調配物具有至少6個月之保存期限。應理解，此保存期限可為在冷凍溫度(亦即-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(0℃至10℃)或室溫(20℃至32℃)下呈液體或凍乾形式。在其他態樣中，本發明之高度穩定化調配物具有至少12、18、24、30、36、42、48、54或60個月之保存期限。
在其他態樣中且根據上述態樣，利用在於任何上述溫度下儲存任何上述時間段之後剩餘之活性百分比測定保存期限。在某些具體實例中，保存期限意謂與在於任何上述溫度下儲存任何上述時間量之前的活性相比，如由本文所述或此項技術中已知之任何檢定所量測，調配物保留至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。
在一個態樣中，根據本發明之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物包括：(a)8,000 U/mL至57,000 U/mL成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)、(b)190 mM氯化鈉、(c)0.92 mM氯化鈣、(d)10% w/w海藻糖二水合物、(e)75 ppm聚山梨醇酯80、(f)45 mM乙酸及(g)46 mM HEPES。
在某些態樣中，本發明之高度穩定化調配物包括以下組分：47 mM HEPES、46 mM乙酸、195 mM氯化鈉、0.094 mM氯化鈣、0.0075%聚山梨醇酯80、10% w/w海藻糖二水合物，pH 6.0。
在其他態樣中，根據本發明之成對鹼性胺基酸蛋白酶(包括r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物包括：(a)約5,500 U/mL至55,000 U/mL、6,000 U/mL至50,000 U/mL、6,500 U/mL至45,000 U/mL、7,000 U/mL至40,000 U/mL、7,500 U/mL至35,000 U/mL、8,000 U/mL至30,000 U/mL、8,500 U/mL至25,000 U/mL、9,000 U/mL至20,000 U/mL、9,500 U/mL至15,000 U/mL、或10,000 U/mL成對鹼性胺基酸蛋白酶；(b)約100 mM至300 mM、110 mM至280 mM、120 mM至260 mM、130 mM至240 mM、140 mM至220 mM、150 mM至200 mM、或160 mM至180 mM氯化鈉；(c)約0.5 mM至9 mM、1 mM至8 mM、1.5 mM至7 mM、2 mM至6 mM、2.5 mM至5 mM、或3 mM至4.5 mM氯化鈣；(d)約0.5%至19%、1%至18%、1.5%至17%、2.0%至16%、2.5%至15%、3.0%至14%、3.5%至13%、4.0%至12%、4.5%至11%、5.0%至10%、5.5%至9%、或6.0%至8%海藻糖二水合物；(e)約0.5 ppm至140 ppm、1.0 ppm至130 ppm、10 ppm至120 ppm、20 ppm至110 ppm、30 ppm至100 ppm、40 ppm至95 ppm、50 ppm至90 ppm、55 ppm至85 ppm、60 ppm至80 ppm、或70 ppm至75 ppm聚山梨醇酯80；(f)約25 mM至90 mM、30 mM至80 mM、35 mM至70 mM、40 mM至60 mM、或45 mM至50 mM乙酸；及(g)15 mM至95 mM、20 mM至90 mM、25 mM至85 mM、30 mM至80 mM、35 mM至75 mM、40 mM至70 mM、45 mM至65 mM、或50 mM至60 mM HEPES。
在一個態樣中，本發明提供一種穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)，其包含：成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至10 mM鈣、緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具 體實例中，糖為戊醣或己醣。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)包含：成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)、100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、100 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖為戊醣或己醣。
在一特定具體實例中，本發明之高度穩定化調配物包括以下組分：47 mM HEPES、46 mM乙酸、195 mM氯化鈉、0.094 mM氯化鈣、0.0075%聚山梨醇酯80、10% w/w海藻糖二水合物，pH 6.0。
在另一特定具體實例中，根據本發明之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物包括：(a)8,000 U/mL至57,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶、(b)190 mM氯化鈉、(c)0.92 mM氯化鈣、(d)10% w/w海藻糖二水合物、(e)75 ppm聚山梨醇酯80、(f)45 mM乙酸及(g)46 mM HEPES。
A.穩定劑
有利的是，已發現納入糖、糖醇及非離子界面活性劑使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)水性組成物穩定化。本文中所提供之實施例中說明此等作用。舉例而言，添加此等試劑使液體儲存後成對鹼性胺基 酸蛋白酶活性保留率增加、液體儲存後成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽聚集減少、液體儲存後成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽降解減少、成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物攪拌後成對鹼性胺基酸蛋白酶活性損失降低且使由攪拌成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物引起之聚集減少。
因此，在一個具體實例中，本發明提供一種成對鹼性胺基酸蛋白酶水性組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)，其包含2%至20%糖或糖醇及10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在另一具體實例中，組成物包含2%至10%糖或糖醇及10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑。在另一具體實例中，組成物包含10±2%糖或糖醇及75±25 ppm非離子界面活性劑。在一特定具體實例中，組成物包含10%糖或糖醇及75 ppm非離子界面活性劑。在其他具體實例中，組成物包含糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合，該組合係選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035。
表1.適用於使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物穩定化之糖或糖醇與非離子界面活性劑濃度之組合的例示性具體實例。 Var.=變化形式
表3.適用於使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物穩定化之糖或糖醇與非離子界面活性劑濃度之組合的例示性具體實例。
表4.適用於使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物穩定化之糖或糖醇與非離子界面活性劑濃度之組合的例示性具體實例。
表7.適用於使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物穩定化之糖或糖醇與非離子界面活性劑 濃度之組合的例示性具體實例。
1.糖及糖醇
有利的是，已發現向成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)中添加糖及/或糖醇使組成物之儲存穩定性增強。舉例而言，如圖17至圖20及圖22至圖25中所示，納入僅2%糖及/或糖醇即可使成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之儲存穩定性增強至少20%。且納入10%糖及/或糖醇可使成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之儲存穩定性增強至少75%。因此，在本發明之一個態樣中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有穩定化量之糖及/或糖醇。
在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有單醣。在一特定具體實例中，單醣係選自由以下各物所組成之群組：乙醣、丙醣、丁醣、戊醣、己醣、庚醣及辛醣。在一 特定具體實例中，糖為戊醣、己醣或其組合。在一特定具體實例中，糖為己醣。
在另一具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有雙醣。在一特定具體實例中，雙醣係選自由戊醣及/或己醣單醣形成之雙醣。在另一特定具體實例中，糖係選自由己醣單醣形成之雙醣。在一個具體實例中，糖為蔗糖、海藻糖或其組合。在一個特定具體實例中，糖為蔗糖。在另一特定具體實例中，糖為海藻糖。在一個具體實例中，糖以海藻糖二水合物之形式調配。
在另一具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有糖醇。在一特定具體實例中，糖醇係選自乙二醇、甘油、赤藻糖醇、蘇糖醇、核糖醇、海藻醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、異麥芽糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇及阿拉伯糖醇。在另一特定具體實例中，糖醇為甘露糖醇。
在另一具體實例中，穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有糖與糖醇之混合物。在一個具體實例中，混合物含有單醣、雙醣及糖醇中之至少兩者。在另一具體實例中，混合物含有戊醣、己醣、由戊醣及/或己醣單醣形成之雙醣以及糖醇中之至少兩者。在另一具體實例中，混合物含有蔗糖、海藻糖及甘露糖醇中之至少兩者。
在一個具體實例中、糖或糖醇以下列濃度存在：2%至20%、2%至17.5%、2%至15%、2%至12.5%、2%至10%、2%至9%、2%至8%、2%至7%、5%至20%、5%至17.5%、5%至15%、5%至12.5%、5%至10%、7.5%至20%、7.5%至17.5%、7.5%至15%、7.5%至12.5%、10%至20%、10%至17.5%、10%至15%、4±2%、5±2%、6±2%、7±2%、8±2%、9±2%、10±2%、11±2%、12±2%、13±2%、14±2%、15±2%、16±2%、17±2%、18±2%、3±1%、4±1%、5±1%、6±1%、7±1%、8±1%、9±1%、10±1%、11±1%、12±1%、13±1%、14±1%、15±1%、16±1%、17±1%、18±1%、19±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具 體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%海藻糖、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之海藻糖與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例 如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例 如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至20%海藻糖、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1 至表9中之變化形式1至變化形式6035之海藻糖與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之PH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10%糖或糖醇。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例 如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10%糖或糖醇。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%海藻糖、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之PH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%海藻糖。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%海藻糖。 在另一特定具體實例中，組成物含有10%海藻糖。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之海藻糖與非離子界面活性劑之組合、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例 如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10±5%糖或糖醇、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10%糖或糖醇。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75 ppm非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%糖或糖醇。在另一特定具體實例中，組成物含有10%糖或糖醇。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上 可接受之鹽、0.9 mM鈣、10±5%海藻糖、75 ppm非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在另一特定具體實例中，組成物含有10±2%海藻糖。在另一特定具體實例中，組成物含有10±1%海藻糖。在另一特定具體實例中，組成物含有10%海藻糖。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之海藻糖與非離子界面活性劑之組合、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一些具體實例中，用於本發明之調配物中之穩定劑 係選自包括(但不限於)以下各物之群組：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖(raffinose)及精胺酸。此等試劑以0.1%至20%之量存在於本發明之調配物中。在某些具體實例中，穩定劑係以5%至15%、或約10%之量存在。在其他具體實例中，本發明之調配物包括以下量之穩定劑：0.5%至19%、1%至18%、1.5%至17%、2.0%至16%、2.5%至15%、3.0%至14%、3.5%至13%、4.0%至12%、4.5%至11%、5.0%至10%、5.5%至9%、或6.0%至8%。某些調配物包括甘露糖醇、蔗糖及/或海藻糖與一或多種本文所揭示之任何其他調配物組分之組合。
2.非離子界面活性劑
有利的是，已發現向成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)中添加糖非離子界面活性劑使組成物對機械應力之穩定性增強。舉例而言，如圖31至圖42中所示，納入僅10 ppm非離子界面活性劑即可使經受機械應力之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之穩定性增強至少25%。且納入50 ppm非離子界面活性劑可使經受機械應力之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物之穩定性增強至少40%。因此，在本發明之一個態樣中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物含有穩定化量之非離子界面活性劑。
在一個具體實例中，提供儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物，其含有 選自以下各物之非離子界面活性劑：非離子水溶性單酸甘油酯、非離子水溶性二酸甘油酯、非離子水溶性三酸甘油酯、聚乙二醇之非離子水溶性單脂肪酸酯、聚乙二醇之非離子水溶性二脂肪酸酯、非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、非離子聚乙二醇甘油酯、非離子水溶性三嵌段共聚物及其組合。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
在一個具體實例中，非離子界面活性劑以下列濃度存在：10 ppm至200 ppm、10 ppm至175 ppm、10 ppm至150 ppm、10 ppm至125 ppm、10 ppm至100 ppm、10 ppm至90 ppm、10 ppm至80 ppm、10 ppm至75 ppm、10 ppm至70 ppm、10 ppm至60 ppm、10 ppm至50 ppm、10 ppm至25 ppm、25 ppm至200 ppm、25 ppm至175 ppm、25 ppm至150 ppm、25 ppm至125 ppm、25 ppm至100 ppm、25 ppm至90 ppm、25 ppm至80 ppm、25 ppm至70 ppm、25 ppm至60 ppm、25 ppm至50 ppm、50 ppm至200 ppm、50 ppm至175 ppm、50 ppm至150 ppm、50 ppm至125 ppm、50 ppm至90 ppm、50 ppm至80 ppm、75 ppm至200 ppm、75 ppm至175 ppm、75 ppm至150 ppm、100 ppm至200 ppm、100 ppm至175 ppm、50±25 ppm、60±25 ppm、70±25 ppm、75±25 ppm、80±25 ppm、90±25 ppm、100±25 ppm、125±25 ppm、150±25 ppm、175±25 ppm、30±10 ppm、40±10 ppm、50±10 ppm、60±10 ppm、70±10 ppm、75±10 ppm、80±10 ppm、90±10 ppm、100±10 ppm、110±10 ppm、120±10 ppm、125±10 ppm、130±10 ppm、140±10 ppm、150±10 ppm、160±10 ppm、170±10 ppm、175±10 ppm、180±10 ppm、190±10 ppm、25 ppm、30 ppm、40 ppm、50 ppm、60 ppm、70 ppm、75 ppm、80 ppm、90 ppm、100 ppm、110 ppm、120 ppm、125 ppm、130 ppm、140 ppm、150 ppm、160 ppm、170 ppm、175 ppm、180 ppm、190 ppm或200 ppm。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有 8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實 例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在另一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯，且糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯之組合、10 mM至200 mM 緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實 例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在另一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯，且糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含100 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯之組合、10 mM至200 mM 緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、75±25%非離子界面活性劑、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75±15 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子界面活性劑。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75±15 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子界面活性劑。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、75±25 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、90±25 mM 緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75±15 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之組合、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在另一 特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯，且糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯之組合、90±25 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、75±25%非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至10%糖或糖醇。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75±15 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子界面活性劑。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75 ±15 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子界面活性劑。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子界面活性劑。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10%糖或糖醇、75±25 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，組成物之PH值為6.0。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。在一個特定具體實例中，組成物含有75±15 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，組成物含有75±5 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，組成物含有75 ppm非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子界面活性劑之 組合、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一特定具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在另一特定具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯，且糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、選自可見於表1至表9中之變化形式1至變化形式6035之糖或糖醇與非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯之組合、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在另一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在另一特定具體實例中，非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
本發明之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物亦較佳包括界面活性劑，較佳為非離子 界面活性劑，且其量較佳為0.1 ppm至150 ppm、或65 ppm至80 ppm、或約75 ppm。在其他具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包括以下量之界面活性劑：0.5 ppm至140 ppm、1.0 ppm至130 ppm、10 ppm至120 ppm、20 ppm至110 ppm、30 ppm至100 ppm、40 ppm至95 ppm、50 ppm至90 ppm、55 ppm至85 ppm、60 ppm至80 ppm或70 ppm至75 ppm。在某些具體實例中，界面活性劑係選自由以下各物所組成之群組：聚山梨醇酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、甘油、葡糖醯胺(諸如Mega 8)、曲拉通(triton)及Brij 35(聚氧乙烯23月桂基醚)。可利用數種等級之普洛尼克多元醇(以商標名Pluronic銷售，由BASF Wyandotte公司製造)。具有不同分子量(1,000至16,000以上)及物理化學性質之此等多元醇已用作界面活性劑。分子量為5,000之Pluronic F-38及分子量為9,000之Pluronic F-68均含有(以重量計)80%親水性聚氧乙烯基團及20%疏水性聚氧丙烯基團。在一個具體實例中，界面活性劑為聚山梨醇酯80。在一特定具體實例中，聚山梨醇酯80為源自植物之聚山梨醇酯80。
B.醫藥學上可接受之鹽
本文中所提供之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)的穩定化組成物一般包括在於儲存期間成對鹼性胺基酸蛋白酶多肽可耐受濃度下的醫藥學上可接 受之鹽。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化物鹽。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為單價氯化物鹽。在一更特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。
在一個具體實例中，本文中所提供之穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物中醫藥學上可接受之鹽的濃度為10 mM至500 mM。在另一具體實例中，醫藥學上可接受之鹽之濃度為100 mM至300 mM。在另一具體實例中，醫藥學上可接受之鹽之濃度為150 mM至250 mM。在其他具體實例中，本文中所提供之穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物中醫藥學上可接受之鹽的濃度係選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表 10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一個具體 實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組 合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一 具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一個具體實例中，緩衝劑之濃度為90±25 mM。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。 在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含在選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180之濃度下的醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10%糖或糖醇、75 ppm非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及6.0±0.2之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一些具體實例中，單價氯化物鹽(諸如氯化鈉及氯化鉀)用於本發明之調配物中。儘管包含單價氯化物鹽之調配物組分主要依據氯化鈉描述，但應理解任何單價氯化物鹽(包括氯化鉀)均可根據本文中針對氯化鈉之描述使 用。在某些具體實例中，氯化鈉以50 mM至500 mM之量包括於本發明調配物中。在其他具體實例中，氯化鈉以100 mM至300 mM、150 mM至250 mM或約190 mM之量包括於調配物中。在其他具體實例中，氯化鈉以下列量包括於本發明調配物中：100 mM至300 mM、110 mM至280 mM、120 mM至260 mM、130 mM至240 mM、140 mM至220 mM、150 mM至200 mM或160 mM至180 mM。在一特定具體實例中，調配物包括190 mM氯化鈉與一或多種本文所揭示之任何其他調配物組分之組合。
C.緩衝劑
有利的是，已發現成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物在pH 6.0至pH 7.0下穩定。舉例而言，圖11及圖12中顯示在pH 5.5下調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物比在pH 5.0下調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物穩定。亦顯示在pH 6.0下調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物比在pH 5.5下調配之組成物穩定。另外，如圖17中所示，在pH 7.0下調配之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物具有與在pH 6.0下調配之組成物類似的穩定性。
因此，在某些具體實例中，本文中所提供之穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物係在5.5至7.5之pH值下調配。在一特定具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白 酶)組成物係在6.0至7.0之pH值下調配。在另一特定具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物係在pH 6.0±0.2下調配。在一更特定具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物係在pH 6.0下調配。在其他具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物係在選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值下調配。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在 一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇 係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或 糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、10 mM至200 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸 酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、90±25 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含191 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10%糖或糖醇、75 ppm非離子界面活性劑、91 mM緩衝劑，及選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，使用一或多種緩衝劑在適當pH值下調配本文中所提供之穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物。在一個具體實例中，一或多種緩衝劑係選自組胺酸、咪唑、磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、乙酸鹽(例如乙酸)、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES、MES、ACES及其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。
緩衝劑以在經一段時間(例如数週、數月或數年)儲存期間適於維持組成物之pH值之濃度存在於穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物中。在一個具體實例中，調配物中緩衝劑之濃度為10 mM至300 mM。在另一具體實例中，調配物中緩衝劑之濃度係在10 mM至200 mM之間。在一特定具體實例中，調配物中緩衝劑之濃度為90±25 mM。在其他具體實例中，組成物中緩衝劑之濃度係選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含2%至20%糖或糖醇。在一個具體實例中，非 離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物另外包含10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值 為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至20%糖或糖醇、10 ppm至200 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至500 mM 醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至5 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、2%至10%糖或糖醇、10 ppm至100 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子 界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含50 mM至300 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體 實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含190±50 mM醫藥學上可接受之鹽、0.5 mM至2 mM鈣、10±5%糖或糖醇、75±25 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中， 緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一個具體實例中，穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含191 mM醫藥學上可接受之鹽、0.9 mM鈣、10%糖或糖醇、75 ppm非離子界面活性劑、在選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469之濃度下的緩衝劑，及5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)，且糖或糖醇為海藻糖。在一個具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。在一個具體實例中，組成物之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，組成物之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，組成物之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，組成物之pH值為6.0。在一特定具體實例中，組成 物含有8,000 U/mL至500,000 U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
緩衝液亦可與一或多種本文所述之任何其他調配物組分組合存在於本發明之調配物中。如實施例中所示，本發明之高度穩定化調配物在pH 6.0下顯示較強穩定性。在某些具體實例中，高度穩定化調配物之pH值較佳應維持在6.0至8.0範圍內或維持在約6.0之pH值下。緩衝劑可為具有充當緩衝液的能力之任何生理學上可接受之化學實體或化學實體之組合，包括(但不限於)：組胺酸、咪唑、磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、乙酸鹽、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES、MES及ACES。許多此等緩衝劑之完整化學名稱列於下表1中。在某些具體實例中，若鈣以高於約5 mM之濃度存在於調配物中，則磷酸鹽不用作緩衝劑。在一些具體實例中，包括以下濃度之緩衝劑：10 mM至200 mM、或10 mM至100 mM、或30 mM至60 mM或約46 mM。在其他具體實例中，包括以下濃度之個別緩衝劑：15 mM至95 mM、20 mM至90 mM、25 mM至85 mM、30 mM至80 mM、35 mM至75 mM、40 mM至70 mM、45 mM至65 mM或50 mM至60 mM。在某些具體實例中，調配物含有兩種緩衝劑。
在某些態樣中，本發明調配物包括羧酸與一或多種本文所述之調配物組分之組合。在其他態樣中，羧酸較佳為乙酸(例如乙酸鹽)。在某些具體實例中，調配物包括20 mM至100 mM乙酸、或30 mM至50 mM、或約45 mM乙酸或任何其他羧酸。在其他具體實例中，調配物包括25 mM至90 mM、30 mM至80 mM、35 mM至70 mM、40 mM至60 mM或45 mM至50 mM乙酸或任何其他羧酸。
D.其他調配物組分
本發明之高度穩定化調配物包括成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)，以及穩定劑、緩衝劑、氯化鈉、鹽及其他賦形劑中之一或多者。下文更詳細地描述該等組分。應理解，任何本文所述之調配物組分均可單獨使用或以任何組合形式使用。
與對照或起始調配物相比，本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物顯示出對剪切(攪拌)、凍乾及冷凍/解凍壓力之穩定性增強以及對在容器表面處之產品損失或變性的抗性增強。
成對鹼性胺基酸蛋白酶以5,000 U/mL至500,000 U/mL之濃度包括於本發明之調配物中。在某些具體實例中，包括以下濃度之成對鹼性胺基酸蛋白酶：5,500 U/mL至55,000 U/mL、6,000 U/mL至50,000 U/mL、6,500 U/mL至45,000 U/mL、7,000 U/mL至40,000 U/mL、7,500 U/mL至35,000 U/mL、8,000 U/mL至30,000 U/mL、8,500 U/mL至25,000 U/mL、9,000 U/mL至20,000 U/mL、9,500 U/mL至15,000 U/mL及約10,000 U/mL。在其他具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶以選自可見於表14中之變化形式6470至變化形式6533之濃度(以每毫升數千單位成對鹼性胺基酸蛋白酶活性報導)包括於本發明之調配物中。在特定具體實例中，本發明之高度穩定化調配物中所含之成對鹼性胺基酸蛋白酶為r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在另一具體實例中，本文中所提供之穩定化組成物之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)濃度可表示為存在於組成物中的成對鹼性胺基酸蛋白酶質量。在一個具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)以100 ng/mL至100 mg/mL之濃度存在於如本文所述的穩定化組成物中。在另一具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)以1 μg/mL至10 mg/mL之濃度存在於如本文所述的穩定化組成物中。在另一具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)以1 μg/mL至1 mg/mL之濃度存在於如本文所述的穩定化組成物中。在其他具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)以選自可見於表15中之變化形式6534至變化形式6638之濃度存在於如本文所述的穩定化組成物中。在特定具體實例中，本發明之高度穩定化調配物中所含有之成對鹼性胺基酸蛋白酶為r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在本發明之一些態樣中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物包括鈣或其他二價金屬陽離子。在其他態樣中，二階陽離子以鹽、較佳氯化物鹽之形式存在。在某些具體實例中，可使用0.1 mM至10 mM、或0.5 mM至2 mM、或約0.92 mM二階陽離子鹽。在其他具體實例中，本發明之調配物中使用0.5 mM至9 mM、1 mM至8 mM、1.5 mM至7 mM、2 mM至6 mM、2.5 mM至5 mM或3 mM至4.5 mM二階陽離子鹽。若使用鈣鹽，則較佳為氯化鈣，但亦可為其他鈣鹽，諸如葡糖酸鈣、葡乳醛酸鈣或葡庚糖酸鈣。可包括二價陽離子(包括鈣)與一或多種本文所揭示之其他調配物組分之組合。適用於本文中所提供之調配物之二價金屬陽離子之非限制性實例包括鈣、鋇、錳、鎂、鈷、銅、鎳及鋅。
在一些具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物包括抗氧化劑。已發現向調配物水溶液及凍乾調配物中添加抗氧化劑使此等調配物之穩定性改良，且因此延長其保存期限。所用抗氧化劑必須與藥物製劑可相容使用，且此外較佳為水溶性的。當向 調配物中添加抗氧化劑時，較佳在凍乾前之製程中儘可能遲地添加該等抗氧化劑，以避免抗氧化劑之自發氧化。下表2列出適合之抗氧化劑，其可經由公司(諸如Calbiochem及Sigma)以市售形式獲得。
可使用濃度在約0.05 mg/mL至1.0 mg/ml以上範圍內之抗氧化劑，且咸信較高濃度亦將適用(在一定程度上產生任何毒性效應或不良製造效應(諸如凍乾製品之玻璃轉移溫度降低))。因此，在一個具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含0.05 mg/mL至1.0 mg/mL抗氧化劑。在其他具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物包含0.05 mg/mL至0.5 mg/mL、0.1 mg/mL至0.9 mg/mL、0.1 mg/mL至0.8 mg/mL、0.1 mg/mL至0.7 mg/mL、0.1 mg/mL至0.6 mg/mL、0.1 mg/mL至0.5 mg/mL、0.1 mg/mL至0.4 mg/mL、0.1 mg/mL至0.3 mg/mL、0.1 mg/mL 至0.2 mg/mL、0.2 mg/mL至0.9 mg/mL、0.2 mg/mL至0.8 mg/mL、0.2 mg/mL至0.7 mg/mL、0.2 mg/mL至0.6 mg/mL、0.2 mg/mL至0.5 mg/mL、0.2 mg/mL至0.4 mg/mL、0.2 mg/mL至0.3 mg/mL、0.3 mg/mL至0.7 mg/mL、0.4 mg/mL至0.6 mg/mL抗氧化劑。
E.調配物開發
在本發明之某些態樣中，藉由提供起始(對照)成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物且添加組分以實現所需組分濃度水準來製備成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之高度穩定化調配物。舉例而言，向9份缺乏非離子界面活性劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中添加1份750 ppm非離子界面活性劑，得到包含75 ppm非離子界面活性劑之最終調配物。此製程亦稱為向起始調配物中「摻入(spiking in)」。
在某些具體實例中，為了製備本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物，使起始調配物中含有成對鹼性胺基酸蛋白酶且將緩衝液組成物摻入起始調配物中。在其他具體實例中，根據此項技術已知之方法利用透析形成高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物。在一些具體實例中，調配方法涉及將濃緩衝液組成物摻入成對鹼性胺基酸蛋白酶之起始調配物中。在一個具體實例中，在添加其他組分之前、尤其在添加海藻糖之前，向起始調配 物中添加聚山梨醇酯80，以免於在混合期間攪拌成對鹼性胺基酸蛋白酶。
在一例示性具體實例中，使成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)散裝原料藥(BDS)含於具有10 mM乙酸鈉、230 mM氯化鈉、1 mM氯化鈣、pH 6.0之起始調配物中。在一個具體實例中，將以下組分摻入起始調配物中：1%聚山梨醇酯80、500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM CaCl2、pH 6.0及海藻糖二水合物粉末，獲得以下組成物：46 mM HEPES、45 mM乙酸、190 mM NaCl、0.92 mM CaCl2、75 ppm聚山梨醇酯80、10% w/w海藻糖二水合物、pH 6.0。增加乙酸及添加HEPES使pH值穩定性增大。儘管在pH 6.0下乙酸及HEPES均超出其最高緩衝能力範圍，但高濃度之此等化學物使高度穩定化調配物之緩衝能力大大增強。在某些具體實例中，在添加其他組分之前向起始調配物中添加聚山梨醇酯80，以在混合期間在添加其他試劑時使成對鹼性胺基酸蛋白酶免於聚集及吸附至容器表面。在某些具體實例中，起始調配物中之成對鹼性胺基酸蛋白酶與聚山梨醇酯80及/或除海藻糖之外的任何其他組分混合。在添加聚山梨醇酯80之後添加海藻糖及任何其餘組分，以在混合期間使成對鹼性胺基酸蛋白酶免於聚集及吸附。
在某些具體實例中，穩定化調配物與稀釋劑組合以便調配物可用於方法(諸如rVWF成熟製程)中。在其他具體實例中，藉由起始稀釋劑(50 mM HEPES、150 mM NaCl、 1 mM CaCl2，pH 7.0)摻以聚山梨醇酯80至75 ppm來製備穩定化稀釋劑。與使用起始成對鹼性胺基酸蛋白酶及稀釋劑調配物相比，本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物與此穩定化稀釋劑的組合使rVWF成熟步驟中的成對鹼性胺基酸蛋白酶恢復增強至3至4倍。
在某些具體實例中，凍乾本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物。在凍乾期間，調配物自水相轉變為非晶形固相，認為該過程使蛋白質免於化學及/或構形不穩定。在其他具體實例中，凍乾之製劑不僅含有非晶相，而且亦包括在凍乾期間結晶之組分。
在一些具體實例中，高度穩定化調配物之一或多種組分可分散於凍乾粉塊之非晶相中。此外，非晶相之表觀玻璃轉移溫度(Tg')在凍乾期間較佳相對較高，且固體之玻璃轉移溫度(Tg)在儲存期間同樣地較佳較高。
IV.稀釋重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之水性組成物之方法
在一個態樣中，本發明提供稀釋成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之水性組成物之方法。以下具體實例係部分基於以下發現：與用缺乏非離子界面活性劑之緩衝液稀釋相比，在用於稀釋成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之緩衝液中納入非離子界面活性劑引起3至4倍的成對鹼性胺基酸蛋白酶活性恢復。
在一個具體實例中，該方法包括向成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物中添加含有非離子界面活性劑之稀釋緩衝液，形成經稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物。在一些具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至1,000：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。在另一具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至500：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。在另一具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至250：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。在另一具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至200：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。在另一具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至100：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。在另一具體實例中，以1：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)至50：1(稀釋緩衝液：成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物)之比率添加稀釋緩衝液。
在一個具體實例中，該方法包含向成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物中添加非離子界面活性劑之第一步驟及向含有非離子界面活性劑之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物 中添加稀釋緩衝液之第二步驟，形成經稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物。在一個具體實例中，界面活性劑將以經稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中所需濃度之X倍的最終濃度添加至成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中，其中X為稀釋因數。舉例而言，若欲稀釋100倍之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中需要10 ppm非離子界面活性劑之最終濃度，則非離子界面活性劑以1,000 ppm(10 ppm×100倍稀釋度)之最終濃度添加至起始成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中，且隨後藉由每1份起始溶液(顧及在添加非離子界面活性劑期間所添加之體積)添加99份稀釋緩衝液來稀釋組成物。
在某些具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)組成物稀釋1倍至1,000倍、1倍至500倍、1倍至250倍、1倍至200倍、1倍至100倍、1倍至50倍、1倍至10倍、10倍至1,000倍、10倍至500倍、10倍至250倍、10倍至200倍、10倍至100倍、10倍至50倍、50倍至1,000倍、50倍至500倍、50倍至250倍、50倍至200倍、50倍至100倍、100倍至1,000倍、100倍至500倍、100倍至250倍、100倍至200倍、200倍至1,000倍、200倍至500倍或200倍至250倍。
A.成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液
在一個具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液將包括醫藥學上可接受之鹽、非離子界面活性劑及緩衝 劑。在一個具體實例中，稀釋緩衝液另外包括鈣。在另一具體實例中，稀釋緩衝液另外包括糖及/或糖醇。
在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽以10 mM至500 mM之濃度存在於稀釋緩衝液中。在另一具體實例中，醫藥學上可接受之鹽之濃度為100 mM至300 mM。在另一具體實例中，醫藥學上可接受之鹽之濃度為150 mM至250 mM。在其他具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液中醫藥學上可接受之鹽之濃度係選自可見於表10中的變化形式6036至變化形式6180。在一個具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉、氯化鉀或其組合。在一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。在另一特定具體實例中，醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。
在一個具體實例中，稀釋緩衝液具有5.5至7.5之pH值。在一個具體實例中，稀釋緩衝液之pH值為5.5至7.0。在另一具體實例中，稀釋緩衝液之pH值為5.5至6.5。在另一具體實例中，稀釋緩衝液之pH值為6.0±0.2。在一特定具體實例中，稀釋緩衝液之pH值為6.0。在其他具體實例中，稀釋緩衝液具有選自可見於表11中之變化形式6181至變化形式6403之pH值。
在一個具體實例中，緩衝劑以10 mM至300 mM之濃度存在於稀釋緩衝液中。在另一具體實例中，稀釋緩衝液中緩衝劑之濃度在10 mM至200 mM之間。在其他具體實例中，稀釋緩衝液中緩衝劑之濃度係選自可見於表12中之變化形式6404至變化形式6469。在一個具體實例中，緩衝 劑為乙酸鹽、HEPES或其組合。在一特定具體實例中，緩衝劑為乙酸鹽與HEPES之組合。
在一些具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液包括鈣或其他二價金屬陽離子。在一個具體實例中，二階陽離子以鹽、較佳氯化物鹽之形式添加。在某些具體實例中，稀釋緩衝液中二階陽離子(例如鈣)之濃度為0.1 mM至10 mM、0.5 mM至2 mM或約0.92 mM。在其他具體實例中，稀釋緩衝液中使用0.5 mM至9 mM、1 mM至8 mM、1.5 mM至7 mM、2 mM至6 mM、2.5 mM至5 mM或3 mM至4.5 mM二階陽離子。若使用鈣鹽，則較佳為氯化鈣，但亦可為其他鈣鹽，諸如葡糖酸鈣、葡乳醛酸鈣或葡庚糖酸鈣。可包括二價陽離子(包括鈣)與一或多種本文所揭示之其他調配物組分之組合。適用於本文中所提供之稀釋緩衝液之二價金屬陽離子之非限制性實例包括鈣、鋇、錳、鎂、鈷、銅、鎳及鋅。
在一些具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液包括糖及/或糖醇。在一個具體實例中，稀釋緩衝液含有單醣。在一特定具體實例中，單醣係選自由以下各物所組成之群組：乙醣、丙醣、丁醣、戊醣、己醣、庚醣及辛醣。在一特定具體實例中，糖為戊醣、己醣或其組合。在一特定具體實例中，糖為己醣。
在另一具體實例中，稀釋緩衝液含有雙醣。在一特定具體實例中，雙醣係選自由戊醣及/或己醣單醣形成之雙醣。在另一特定具體實例中，糖係選自由己醣單醣形成之 雙醣。在一個具體實例中，糖為蔗糖、海藻糖或其組合。在一個特定具體實例中，糖為蔗糖。在另一特定具體實例中，糖為海藻糖。在一個具體實例中，糖以海藻糖二水合物之形式調配。
在另一具體實例中，稀釋緩衝液含有糖醇。在一特定具體實例中，糖醇係選自乙二醇、甘油、赤藻糖醇、蘇糖醇、核糖醇、海藻醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、異麥芽糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇及阿拉伯糖醇。在另一特定具體實例中，糖醇為甘露糖醇。
在另一具體實例中，稀釋緩衝液含有糖與糖醇之混合物。在一個具體實例中，混合物含有單醣、雙醣及糖醇中之至少兩者。在另一具體實例中，混合物含有戊醣、己醣、由戊醣及/或己醣單醣形成之雙醣以及糖醇中之至少兩者。在另一具體實例中，混合物含有蔗糖、海藻糖及甘露糖醇中之至少兩者。
在一個具體實例中、糖或糖醇以下列濃度存在於稀釋緩衝液中：2%至20%、2%至17.5%、2%至15%、2%至12.5%、2%至10%、2%至9%、2%至8%、2%至7%、5%至20%、5%至17.5%、5%至15%、5%至12.5%、5%至10%、7.5%至20%、7.5%至17.5%、7.5%至15%、7.5%至12.5%、10%至20%、10%至17.5%、10%至15%、4±2%、5±2%、6±2%、7±2%、8±2%、9±2%、10±2%、11±2%、12±2%、13±2%、14±2%、15±2%、16±2%、17±2%、18±2%、3±1%、4±1%、5±1%、6±1%、 7±1%、8±1%、9±1%、10±1%、11±1%、12±1%、13±1%、14±1%、15±1%、16±1%、17±1%、18±1%、19±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一個具體實例中，糖或糖醇係選自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及其組合。在一特定具體實例中，糖或糖醇為海藻糖。
在一個具體實例中，提供儲存穩定之成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之組成物，其含有選自以下各物之非離子界面活性劑：非離子水溶性單酸甘油酯、非離子水溶性二酸甘油酯、非離子水溶性三酸甘油酯、聚乙二醇之非離子水溶性單脂肪酸酯、聚乙二醇之非離子水溶性二脂肪酸酯、非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、非離子聚乙二醇甘油酯、非離子水溶性三嵌段共聚物及其組合。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
1.非離子界面活性劑
在一個具體實例中，在稀釋之前所添加之成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液或非離子界面活性劑溶液含有選自以下各物之非離子界面活性劑：非離子水溶性單酸甘油酯、非離子水溶性二酸甘油酯、非離子水溶性三酸甘油酯、聚乙二醇之非離子水溶性單脂肪酸酯、聚乙二醇之非離子 水溶性二脂肪酸酯、非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、非離子聚乙二醇甘油酯、非離子水溶性三嵌段共聚物及其組合。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
在一個具體實例中，非離子界面活性劑以下列濃度存在於稀釋緩衝液中：10 ppm至200 ppm、10 ppm至175 ppm、10 ppm至150 ppm、10 ppm至125 ppm、10 ppm至100 ppm、10 ppm至90 ppm、10 ppm至80 ppm、10 ppm至75 ppm、10 ppm至70 ppm、10 ppm至60 ppm、10 ppm至50 ppm、10 ppm至25 ppm、25 ppm至200 ppm、25 ppm至175 ppm、25 ppm至150 ppm、25 ppm至125 ppm、25 ppm至100 ppm、25 ppm至90 ppm、25 ppm至80 ppm、25 ppm至70 ppm、25 ppm至60 ppm、25 ppm至50 ppm、50 ppm至200 ppm、50 ppm至175 ppm、50 ppm至150 ppm、50 ppm至125 ppm、50 ppm至90 ppm、50 ppm至80 ppm、75 ppm至200 ppm、75 ppm至175 ppm、75 ppm至150 ppm、100 ppm至200 ppm、100 ppm至175 ppm、50±25 ppm、60±25 ppm、70±25 ppm、75±25 ppm、80±25 ppm、90±25 ppm、100±25 ppm、125±25 ppm、150±25 ppm、175±25 ppm、30±10 ppm、40±10 ppm、50±10 ppm、60±10 ppm、70±10 ppm、75±10 ppm、80±10 ppm、90±10 ppm、100±10 ppm、110±10 ppm、120±10 ppm、125±10 ppm、130±10 ppm、140±10 ppm、150±10 ppm、160±10 ppm、170±10 ppm、175±10 ppm、180±10 ppm、190±10 ppm、25 ppm、30 ppm、40 ppm、50 ppm、60 ppm、70 ppm、75 ppm、80 ppm、90 ppm、100 ppm、110 ppm、120 ppm、125 ppm、130 ppm、140 ppm、150 ppm、160 ppm、170 ppm、175 ppm、180 ppm、190 ppm或200 ppm。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
在一個具體實例中，稀釋之後非離子界面活性劑之目標濃度為：10 ppm至200 ppm、10 ppm至175 ppm、10 ppm至150 ppm、10 ppm至125 ppm、10 ppm至100 ppm、10 ppm至90 ppm、10 ppm至80 ppm、10 ppm至75 ppm、10 ppm至70 ppm、10 ppm至60 ppm、10 ppm至50 ppm、10 ppm至25 ppm、25 ppm至200 ppm、25 ppm至175 ppm、25 ppm至150 ppm、25 ppm至125 ppm、25 ppm至100 ppm、25 ppm至90 ppm、25 ppm至80 ppm、25 ppm至70 ppm、25 ppm至60 ppm、25 ppm至50 ppm、50 ppm至200 ppm、50 ppm至175 ppm、50 ppm至150 ppm、50 ppm至125 ppm、50 ppm至90 ppm、50 ppm至80 ppm、75 ppm至200 ppm、75 ppm至175 ppm、75 ppm至150 ppm、100 ppm至200 ppm、100 ppm至175 ppm、50±25 ppm、60±25 ppm、70±25 ppm、75 ±25 ppm、80±25 ppm、90±25 ppm、100±25 ppm、125±25 ppm、150±25 ppm、175±25 ppm、30±10 ppm、40±10 ppm、50±10 ppm、60±10 ppm、70±10 ppm、75±10 ppm、80±10 ppm、90 ±10 ppm、100±10 ppm、110±10 ppm、120±10 ppm、125±10 ppm、130±10 ppm、140±10 ppm、150±10 ppm、160±10 ppm、170±10 ppm、175±10 ppm、180±10 ppm、190±10 ppm、25 ppm、30 ppm、40 ppm、50 ppm、60 ppm、70 ppm、75 ppm、80 ppm、90 ppm、100 ppm、110 ppm、120 ppm、125 ppm、130 ppm、140 ppm、150 ppm、160 ppm、170 ppm、175 ppm、180 ppm、190 ppm或200 ppm。在一個具體實例中，非離子界面活性劑為非離子水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一特定具體實例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)。
在一個具體實例中，與未使用非離子界面活性劑稀釋或藉助於較低濃度非離子界面活性劑稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中所恢復之活性相比，在成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋緩衝液中納入非離子界面活性劑、或在稀釋之前添加非離子界面活性劑使經稀釋之成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物中所恢復之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性增強至少10%。在其他具體實例中，與無非離子界面活性劑之情況下稀釋或使用較低濃度非離子界面活性劑稀釋之後所恢復的成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相比，使用非離子界面活性劑稀釋之後所恢復的成對鹼性胺基酸蛋白酶活性高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、2倍、3倍、4倍、5倍或5倍以上。
V.穩定性檢定
如本文中所論述，本發明之高度穩定化成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物與對照調配物相比顯示改良之穩定性。在一個具體實例中，改良之穩定性包括在各種穩定性檢定中與對照調配物相比保留較高百分比之活性。該等檢定可用於確定調配物是否為高度穩定化調配物。在一些具體實例中，在利用本文中所論述或此項技術已知之任何穩定性檢定分析時，高度穩定化調配物具有比對照調配物高至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之活性。
在其他態樣中，在應激子條件(諸如在高溫下儲存、攪拌、冷凍/解凍循環或其某些組合)下測試成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物。在該等應激子之後，使用本文所述或此項技術已知之任何方法檢定調配物以測定在此等條件下之穩定性。
在一個態樣中，成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定用於分析調配物之穩定性。在一些具體實例中，成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定涉及量測受質裂解。在一個具體實例中，受質為Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1；AMC=7-胺基-4-甲氧基香豆素)，其由成對鹼性胺基酸蛋白酶裂解，釋放7-胺基-4-甲氧基香豆素。例如在ELISA盤上進行檢定。根據例如由品質管制(QC)成對鹼性胺基酸蛋白酶標準品建立之標準曲線測定樣品中的成對鹼性胺基酸蛋白 酶活性。活性值一般計算為兩種稀釋物(各一式兩份)之平均值。
在另一態樣中，尺寸排阻層析法(SEC)用於分析成對鹼性胺基酸蛋白酶(例如r成對鹼性胺基酸蛋白酶)調配物之穩定性。在該等檢定中，穩定性由對應於單體成對鹼性胺基酸蛋白酶之峰高指示。單體峰高降低意謂產品損失(不穩定)，且生成較高分子量峰表明出現聚集，且較低分子量峰意謂產品降解。在一例示性具體實例中，在37℃下4天之後，對照成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之相對峰高為58.5%，但在高度穩定化調配物中相對峰高為74.8%(圖48)。因此，高度穩定化調配物維持了組成物中成對鹼性胺基酸蛋白酶之穩定性，且與在較高(37℃)溫度下儲存4天之前所見之峰高相比保留較大百分比峰高。
在另一態樣中，定性檢定(諸如西方墨點分析(Western Blot analyses))用於評估成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之穩定性。舉例而言，圖26顯示在35℃下5天之後，與非穩定化調配物(泳道5)相比，穩定化調配物(泳道11)中完整成對鹼性胺基酸蛋白酶分子而非降解物質之信號百分比較大。
在另一態樣中，定性檢定(諸如UV光譜)用於分析穩定性。在所用應激子為攪拌時，該等檢定尤其適用。UV光譜可指示存在聚集體--聚集體之存在為不穩定之指示。舉例而言，圖36顯示在攪拌對照調配物時光譜向上(指示聚集)之主要位移。圖41及圖42顯示高度穩定化調配物 在以下方面之保護能力：在攪拌之情況下，經攪拌之樣品之光譜不向上位移，而是覆蓋未經攪拌之樣品，其指示在調配物經由攪拌受力置放時不形成聚集。
除非另作指示，否則可採用在此項技術之內的有機化學、聚合物技術、分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術及描述來實施本發明。該等習知技術包括聚合物陣列合成、雜交、接合及使用標記之雜交偵測。適用技術之具體說明可參考本文中以下實施例。然而，當然亦可使用其他等效習知程序。該等習知技術及描述可見於標準實驗手冊，諸如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(第I卷至第IV卷)；Using Antibodies：A Laboratory Manual；Cells：A Laboratory Manual；PCR Primer：A Laboratory Manual；及Molecular Cloning：A Laboratory Manual(均來自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman,Highly stabilized York；Gait,「Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach」1984,IRL Press,London；Nelson及Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry第三版，W.H.Freeman Pub.,Highly stabilized York,N.Y.；及Berg等人(2002)Biochemistry，第五版，W.H.Freeman Pub.,Highly stabilized York,N.Y.，為了所有目的，均以全文引用之方式併入本文中。
在以下描述中，闡述大量特定細節以更詳盡理解本發明。然而，熟習此項技術者將顯而易知可在無一或多種此 等特定細節之情況下實施本發明。在其他情況下，並未描述熟習此項技術者所熟知之熟知特徵及程序，以免混淆本發明。
儘管主要參照特定具體實例描述本發明，但亦預見熟習此項技術者在閱讀本發明後將顯而易知其他具體實例，且本發明之方法中意欲含有該等具體實例。
實施例 實施例1-r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物之儲存穩定性
在以下三種不同溫度下測試對照成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之穩定性：室溫(例如25℃)、37℃及45℃。在高溫下進行之此等研究用於研究加速穩定性，其類似於在較低溫度下進行之長期穩定性研究。樣品在時間零點測試，隨後在培育1、2、3、4及7天之後測試。分析包括成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定、SEC及西方墨點法。
簡言之，數個5 mL聚丙烯小瓶裝有3 mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶且在以下三種不同溫度下培育：環境溫度(室溫)、37℃及45℃。來自各培育條件之一個小瓶在時間零點取出，隨後在1、2、3、4及7天之後取出。在0.65 mL聚丙烯小瓶中準備200 μL等分試樣且在-80℃下冷凍以待分析。
在此等條件下測定數種成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之穩定性。表17中給出各種調配物之細節。
一種分析穩定性之方法為經由成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定。在此檢定中，根據受質裂解之速率測定成對鹼性胺基酸蛋白酶之活性。受質Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO：1；AMC=7-胺基-4-甲氧基香豆素)由成對鹼性胺基酸蛋白酶裂解且釋放螢光AMC。例如在ELISA盤上進行檢定。根據例如由品質管制r成對鹼性胺基酸蛋白酶標準品建立之標準曲線測定樣品中的成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。活性值計算為兩種稀釋物(各一式兩份)之平均值。
在37℃下高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。
此實驗之目的為測試含有75 ppm聚山梨醇酯80之穩定化調配物中的r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。此樣品之組成物中因使用海藻糖二水合物(C12H22O11．2H2O，FW 378.33)而非非水合海藻糖(C12H22O11，FW 342.30)而存在較小變化。使用海藻糖二水合物產生稍稀的樣品。攪拌研究表明聚山梨醇酯80濃度應維持在50 ppm與100 ppm之間以提供針對攪拌所致之r成對鹼性胺基酸蛋白酶變性 的最佳保護。在此研究中，測試調配物#1中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以聚山梨醇酯80至75 ppm且在37℃下培育4天。用對照調配物調配之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品用作對照。
成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析(圖1)顯示在37℃及45℃下培育之對照調配物中之樣品中的活性損失。由於45℃樣品僅在兩天之後即高度降解且聚集，故此後不對該樣品進行測試。對於在室溫下培育之樣品，資料由於檢定中變化性之量而為非決定性的，但資料表明r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相對穩定，其中7天後之活性約相當於T=0。
與對照調配物中之資料形成對比，成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析(圖46)顯示與對照調配物中相比，測試調配物#1中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶保留其較多的活性。在37℃下培育4天之後，r成對鹼性胺基酸蛋白酶保留其初始活性之76.7%，而對照調配物僅保留其初始活性之55.5%(圖47)。
尺寸排阻層析(SEC)亦用於分析各種成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之穩定性。在SEC方法中，使用以下設備及材料：
‧配備有溫度控制自動取樣器及光電二極體陣列偵測器之Agilent HPLC 1100系列
‧自動取樣器100 μL聚丙烯小瓶
‧尺寸排阻層析管柱，來自TOSOH Bioscience,TSKgel
‧G3000SWxl，7.8 mm ID×30 cm，5 μm
此外，在SEC方法中使用以下條件：
‧移動相：50 mM MOPS，200 mM硫酸鈉，0.02%疊氮化鈉，pH 7.0
‧流動速率：0.5 mL/min
‧運作時間：30分鐘
‧樣品體積：100 μL
‧自動取樣器溫度：4℃
‧管柱溫度：環境溫度
使用在280 nm下之單波長吸收(參考關)來建立層析圖。在手動積分之後，使用與調配物之r成對鹼性胺基酸蛋白酶含量對應之在19分鐘下之主峰高度來分析穩定性。使用峰高代替峰面積之原因在於層析峰通常未進行基線分離(其可能引起較大誤差)。各樣品僅進行一次注射。r成對鹼性胺基酸蛋白酶對照調配物之重複分析顯示峰高變化低於2%(資料圖中未示)。
SEC結果與以上所報導之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定結果相關。SEC分析(圖2)顯示在所有溫度中對照調配物之r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體峰高(滯留時間19分鐘)隨培育時間增加而減少。在室溫下培育之樣品中，r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體峰降低比率相對較小，在7天培育之後保持82%峰高。然而，在37℃下，在培育7天之後，r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體峰高降低至初始高度之21.6%。在45℃下，在培育兩天之後，主峰降低至14.1%。 與r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量損失一致，隨時間推移開始出現其他對應於聚集體(在較早時間點洗提)及降解產物(在較晚時間點洗提)之層析峰(圖3)。此等附加峰指示對照調配物中r成對鹼性胺基酸蛋白酶之降解及聚集。與室溫儲存相比，在37℃下之降解增多亦由西方墨點法證實(圖4)。r成對鹼性胺基酸蛋白酶降解可由與r成對鹼性胺基酸蛋白酶共純化之蛋白酶引起或由r成對鹼性胺基酸蛋白酶自身之自催化活性引起。
相比之下，SEC分析證實與不含糖或糖醇之對照調配物相比，含有海藻糖之測試調配物#1之穩定性增強(圖48)。圖48顯示在於37℃下培育4天之後，與在相同培育期間僅維持初始溶液之r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體峰高之58.5%的對照調配物相比，測試調配物#1維持初始溶液之r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體峰高之74.8%。
實施例2-r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物在冷凍/解凍後之儲存穩定性
利用冷凍/解凍研究測試對照調配物及測試調配物#2至#6之穩定性。完成5個冷凍/解凍循環，且利用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定及SEC分析樣品。研究冷凍/解凍之影響很重要，此係因為在此研究中r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品及r成對鹼性胺基酸蛋白酶BDS係冷凍儲存。使用對照調配物(n=4)之冷凍/解凍實驗表明在總共5個冷凍/解凍循環之後成對鹼性胺基酸蛋白酶活性損失較小(約7%)。 雖然似乎有下降趨勢，但此可歸因於蛋白質之真正損失、或檢定變化性之反映。無論如何，此資料支持不僅一次而是多次冷凍及解凍r成對鹼性胺基酸蛋白酶且幾乎不損失活性之能力。同樣地，對照調配物中成對鹼性胺基酸蛋白酶之寡聚狀態之SEC分析顯示在冷凍/解凍實驗過程中單體含量無損失(圖6)。
由於r成對鹼性胺基酸蛋白酶一般冷凍儲存，故分析解凍方法之影響。活性檢定分析(圖)表明以下兩種解凍方法之間無顯著差異：在4℃下解凍隔夜，或在室溫下解凍2小時。
總而言之，此等資料表明對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶在室溫下相對穩定較短時間。另外，在高溫下儲存後之活性損失與r成對鹼性胺基酸蛋白酶降解及聚集相關。此外，對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶即使在5個冷凍/解凍循環之後亦較好地保持其活性。
高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶之冷凍/解凍研究。
使用與先前冷凍/解凍研究相同的一組樣品進行冷凍/解凍研究；分析測試調配物#2(0 ppm聚山梨醇酯80)、#3(10 ppm聚山梨醇酯80)、#4(25 ppm聚山梨醇酯80)、#5(50 ppm聚山梨醇酯80)及#6(100 ppm聚山梨醇酯80)中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶之穩定性。對照調配物中之成對鹼性胺基酸蛋白酶用作對照。與對照調配物之先前分析 一致，成對鹼性胺基酸蛋白酶活性分析(圖43)表明在5個冷凍/解凍循環之後任何測試調配物中之活性均無顯著損失。SEC對r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量之分析(圖44及圖45)表明在冷凍/解凍之後僅有較小的樣品劣化趨勢。即使在5個冷凍/解凍循環之後，所有樣品均亦保留其初始活性之95%以上。
實施例3-r成對鹼性胺基酸蛋白酶水性調配物在機械應力後之儲存穩定性
在不受理論限制之情況下，攪拌影響r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之一種潛在機制為其引起r成對鹼性胺基酸蛋白酶變性，曝露疏水表面。疏水表面被其他疏水表面(諸如其他變性r成對鹼性胺基酸蛋白酶蛋白質)吸引，其引起聚集或造成對樣品試管及材料上之疏水表面的吸附。
攪拌研究並非設計用於模擬r成對鹼性胺基酸蛋白酶使用之真實製程，而是使樣品過度受力。為了被視為穩定化，r成對鹼性胺基酸蛋白酶之調配物表現至少與對照調配物一樣，且高度穩定化調配物表現優於對照調配物。
藉由在含有聚四氟乙烯(Teflon)球之瓶子中振動r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品來進行攪拌研究。在攪拌2小時及17小時之後採集樣品，且藉由成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定及SEC進行分析。如成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定及SEC分析之結果(分別為圖7及圖8)中所示，對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶在有限時間段中相當 耐攪拌。在劇烈攪拌2小時之後，諸如可出現在透濾步驟期間，對照調配物中85%以上r成對鹼性胺基酸蛋白酶仍有活性。然而，在攪拌17小時之後，如可出現在樣品運輸期間，低於10%含量之r成對鹼性胺基酸蛋白酶保持活性。
隨後，測試對成對鹼性胺基酸蛋白酶測試調配物#2至#6之影響，該等調配物係藉由九份r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以1份500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM CaCl2、pH 6加10% w/w海藻糖加不同量之聚山梨醇酯80而製備。
藉由將含有測試r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物及對照調配物之具有聚四氟乙烯球之瓶子振動3小時來進行此攪拌研究。分析含有以下含量之聚山梨醇酯80之測試調配物：無、10 ppm、25 ppm、50 ppm或100 ppm。如圖31中所示，測試調配物中之聚山梨醇酯80在攪拌期間對r成對鹼性胺基酸蛋白酶提供顯著保護。攪拌3小時之後，含有聚山梨醇酯80之樣品中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性在31,499±1,218 U/mL至36,787±847 U/mL範圍內，而不具有聚山梨醇酯80之調配物中之樣品具有17,835±1,706 U/mL成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。對照調配物(10 mM乙酸鈉、230 mM氯化鈉、1 mM氯化鈣，pH 6.0)中之樣品具有24,368±1,135 U/mL之活性。
SEC分析證實聚山梨醇酯80在此研究中之有益影響(圖32)。攪拌3小時後，含有聚山梨醇酯80之樣品中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高在37.5 mAU至35.9 mAU範圍 內，而不具有聚山梨醇酯80之調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高為22.1 mAU。對照調配物中r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高為29.9 mAU。聚山梨醇酯80之影響亦顯示於圖33及圖34中。較小趨勢表明添加10 ppm及25聚山梨醇酯80雖然仍然有益，但不如使用50 ppm或100 ppm聚山梨醇酯80有效。對照調配物中經攪拌之樣品之SEC特徵(圖35)與未經攪拌之樣品相比並未顯示任何附加峰。此將表明表面吸附為活性損失之主要原因。然而，UV吸收光譜(圖36)顯示經攪拌之樣品具有傾斜且升高之特徵，其為由存在聚集體引起之光散射及遮蔽之標誌。光遮蔽一般由不同較大聚集體引起，該等聚集體與較小分子相比較不透明，其引起UV光譜升高。分光光度計因其偵測器量測通過樣品之光的量而無法將此現象與吸收區分。由於進入偵測器之光較少，故將其作為吸收報導；因此吸收特徵升高。
聚集體亦可散射光，其亦將降低進入偵測器之光的量。波長愈短，則愈多光散射(散射光之量與波長之四次方成反比)。此意謂波長愈短，進入偵測器之光愈少；因此吸收特徵傾斜。很可能聚集體存在於此樣品中，但SEC分析不能偵測出該等聚集體。關於SEC分析之此等類型問題並不常見，因為蛋白質聚集體通常過大而不能通過管柱、或被管柱基質吸附。不具有聚山梨醇酯80之調配物中r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV吸收光譜(圖37)顯示類似的升高特徵。此外，在此樣品之SEC分析中未偵測到聚集體(圖38)。與未用聚山梨醇酯80調配之樣品相比， 用聚山梨醇酯80調配之樣品在利用UV吸收光譜分析時顯示出較少聚集(圖39至圖42)。儘管UV光譜無法將聚集體之量定量，但可再次觀察到較小趨勢，暗示與具有10 ppm或25 ppm聚山梨醇酯80之樣品相比，具有50 ppm及100 ppm聚山梨醇酯80之樣品在保護r成對鹼性胺基酸蛋白酶免於聚集方面較佳。資料表明以75 ppm含量包括於調配物中之聚山梨醇酯80將有效，因為此濃度處於寬平台(50 ppm至10 ppm)之中間且將表示穩定條件。
使用以下設備及材料進行UV分光光度法分析：
‧Agilent 8453分光光度計
‧石英比色管1 cm光路徑
藉由首先在比色管中置放0.5 mL適當調配物且作為空白量測來進行分光光度法分析。隨後，在比色管中置放0.5 mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品，且採用240 nm至400 nm掃描。
實施例4-pH值、蔗糖及聚山梨醇酯80對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響
r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以各種緩衝液以便將pH值調節至5.0、5.5、6.0、7.0及8.0。此外，在pH 6.0、pH 7.0及pH 8.0下向樣品中添加蔗糖及/或聚山梨醇酯80。樣品在37℃下培育且藉由成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定及SEC進行測試。
成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定(圖11)及SEC(圖 12)均顯示在37℃下r成對鹼性胺基酸蛋白酶在pH 6.0下比在pH 5.0或pH 5.5下穩定。在利用SEC分析時，在pH 6.0下對照調配物(圖13)及MES(圖14)中之樣品比在pH 7.0或pH 8.0中調配之樣品(圖15及圖16)穩定。向pH 6.0及pH 7.0之樣品中添加蔗糖對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性具有有益影響。SEC分析(圖17)顯示在於37℃下培育4天之後，與在無蔗糖情況下之52%相比，含有蔗糖之樣品之峰高平均為T=0之75%。成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析證實SEC實驗之結果(圖18及圖19)。添加蔗糖使對照調配物及MES(pH 6.0)中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性均得以改良(圖18及圖19)，且使用任一緩衝液均可見類似穩定性(圖20)。如圖17、圖18及圖19中所示，在37℃下聚山梨醇酯80對含有蔗糖之調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性若有影響，則最小。
此等資料表明在37℃下，與pH 5.0、pH 5.5、pH 7.0及pH 8.0相比，r成對鹼性胺基酸蛋白酶在pH 6.0調配物中最穩定。資料進一步顯示在37℃下蔗糖對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性具有有益影響。此外，在pH 6.0下在10%蔗糖存在下對照緩衝液(乙酸鹽)或MES之間的r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性未見顯著差異。最後，在37℃下聚山梨醇酯80對蔗糖調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性無顯著影響。
實施例5-比較蔗糖與甘露糖醇中之成對鹼性胺基酸蛋白酶 調配物穩定性
如實施例4所示，添加蔗糖使r成對鹼性胺基酸蛋白酶在37℃下之降解及/或活性損失減緩。在下游應用(諸如rVWF製程)中未使用蔗糖時，其他糖及/或糖醇為諸如甘露糖醇。向r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物中添加甘露糖醇而非蔗糖將因此不向vWF製程中引入新的原料。進行此研究以確定添加甘露糖醇是否將對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性具有有益影響。測試調配物亦藉由在pH 6.0下添加HEPES及乙酸至各50 mM之最終濃度而具有改良之緩衝能力。藉由r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以10%之500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM CaCl2、pH 6，且隨後添加蔗糖、甘露糖醇及/或聚山梨醇酯80來製備穩定化調配物。成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定(圖21)及SEC(圖22)分析顯示在於37℃下培育4天之後，甘露糖醇及蔗糖對r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物具有類似的穩定作用。此外，聚山梨醇酯80對此等調配物之影響不顯著。儘管活性資料(圖21)顯示在於37℃下培育4天之後含有甘露糖醇及聚山梨醇酯80之樣品優於其他樣品，但此樣品不僅不遵循整體模式，而且其亦未得到SEC分析(圖)證實。此結果很可能為離群值。
實施例6-比較蔗糖與海藻糖中之成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物穩定性
多個公開案已顯示在冷凍期間甘露糖醇加速蛋白質變 性，引起關於其納入r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物緩衝液中之一些顧慮。尚未報導關於海藻糖(已為rVWF產生製程之一部分的另一糖)之該等問題。進行此研究以確定添加海藻糖是否將對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性具有有益影響。此外，分析不同濃度之聚山梨醇酯80。使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定之分析(圖23及圖24)顯示在37℃下培育5天後含有10%蔗糖之樣品保留其初始活性之66.2%±2.9%，而含有10%海藻糖之樣品保留60.1%±4%。此等樣品之間的差異不顯著。兩種樣品在保留r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性方面與對照調配物相比均顯著較佳，對照調配物僅保留其初始活性之37.5%±4.2%。
SEC分析(圖25)證實該等活性分析。與針對10%海藻糖中之樣品之75.1%及針對對照調配物之44.2%相比，10%蔗糖中之樣品之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰值保留其高度之78.3%。此外，西方墨點法分析(圖26)顯示含有10%蔗糖或10%海藻糖之樣品中的降解最少。應注意樣品成對呈現，其中對於各調配物而言第0天後面為第5天。
成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定(圖27)及SEC(圖28)分析均顯示在於37℃下保留r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性方面10%海藻糖優於5%或2%海藻糖。此等發現亦由西方墨點法證實(圖26)。根據成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定及SEC分析(分別為圖29及圖30)，在37℃下聚山梨醇酯80對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響最小。
如上所述進行SEC及成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢 定。使用以下設備及材料進行西方墨點法：
‧山羊抗成對鹼性胺基酸蛋白酶(肽)一級抗體(目錄號SC-12484)，來自Santa Cruz Biotechnology公司
‧兔抗山羊IgG-HRP結合物二級抗體(目錄號A5420)，來自Sigma
‧Pierce金屬增強之受質套組，含有DAB/金屬濃縮物10×，
‧Pierce(目錄號1856090)及穩定過氧化酶緩衝液，Pierce(目錄號185591)
‧4%至20% Tris-甘胺酸凝膠(目錄號EC6025BOX)，來自Invitrogen
‧NuPAGE®樣品還原劑(0.5 M DTT，10×，目錄號NP0004)，來自Invitrogen
‧非還原性樣品緩衝液(4×，目錄號84788)，來自Thermo
‧PBS(目錄號P4417)，來自Sigma
‧Tween 20(目錄號9480)，來自EMD Chemicals
‧BSA(目錄號A7906)，來自Sigma
‧凝膠轉移裝置(iBLOT目錄號IB401001)，來自Invitrogen
‧PVDF(Immobilon-P，目錄號IPVH07850)轉移膜，來自Millipore
在此研究中使用多株抗體代替單株抗體以增強對r成對鹼性胺基酸蛋白酶降解產物之偵測。5 μl樣品與1 μl 10×DTT及4μl 4×非還原性染料組合。在70℃下將樣品加熱至75℃後持續10分鐘。將10 μl樣品裝載至4%至20% SDS-PAGE凝膠，且在150 V下操作60分鐘至70分鐘。使用iBLOT在20 V下持續6分鐘將蛋白凝膠轉移至PVDF膜。隨後，用含有0.1% TWEEN 20及3% BSA之PBS緩衝液阻斷PVDF膜1小時。膜在經相同緩衝液稀釋125倍之一級抗體中培育1小時。用PBST緩衝液洗滌膜5分鐘，各3次。膜在經與一級抗體相同之緩衝液稀釋10,000倍之二級抗體中培育1小時。培育時間為1小時。使用PBST緩衝液洗滌墨點5分鐘，各3次。墨點在10 mL預混之顯色受質(1 ml濃縮物加9 ml穩定過氧化酶緩衝液)中顯影，隨後用水洗滌10分鐘。
實施例7-穩定劑對成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物稀釋之影響
進行r成對鹼性胺基酸蛋白酶稀釋研究以比較起始調配物及其稀釋劑與穩定化調配物及穩定化稀釋劑。研究模擬rVWF成熟製程中所用之稀釋方法。簡言之，r成對鹼性胺基酸蛋白酶BDS通過過濾器，隨後添加200倍體積稀釋劑。測試稀釋方法與起始稀釋方法之間的主要區別在於在測試(高度穩定化)方法中，75 ppm聚山梨醇酯80存在於r成對鹼性胺基酸蛋白酶BDS及稀釋劑中，而在起始方法中，r成對鹼性胺基酸蛋白酶BDS或稀釋劑中均不存在聚山梨醇酯80。
進行兩種稀釋實驗，且兩者均顯示穩定化調配物與其穩定化稀釋劑之組合優於起始成對鹼性胺基酸蛋白酶及稀釋劑調配物。在第一實驗中，使用穩定化調配物之測試方法恢復預期r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之83%至87%，而對照方法僅恢復21%至22%(表18)。在此實驗中，r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品通過過濾器且隨後添加200倍體積稀釋劑。濾液收集至袋子中且隨後轉移至量筒中。
在第二實驗中，測試方法恢復預期r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之80%，而對照方法僅恢復27%(表19)。在此實驗中，r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品通過過濾器且隨後添加200倍體積稀釋劑。濾液收集至圓筒中。與對照方法相比，穩定化r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物與穩定化稀釋劑之組合使r成對鹼性胺基酸蛋白酶恢復增強至3至4倍。在不受理論限制之情況下，改良之恢復與存在聚山梨醇酯80有關。
實施例8-穩定化調配物儲備緩衝液之特性
可一致地製得穩定化r成對鹼性胺基酸蛋白酶調配物之儲備緩衝液(500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM CaCl2、pH 6.0)(表20)。pH值及導電率之RSD小於0.3%。pH值與溫度略微且間接相關，每攝氏度下降0.014單位，而導電率與溫度直接相關，每攝氏度上升0.40 mS/cm(圖49)。在量測pH值及導電率時，樣品之平均溫度為27.6℃。在製造中，在25±0.5℃下讀取樣品。基於圖48中之線性回歸，計算在25℃下之預期pH值及導電率。向此值應用來自表20之相對標準差以確定預期範圍(±3 sd)。在25℃下，pH值預期為6.04(±0.01)。在25℃下，導電率預期為19.9±0.2 mS/cm。此等預期範圍係基於在限定環境下製得之三個批次。緩衝液之規格範圍無需設置如此嚴格。pH值規格將與最終BDS pH值規格相同，為5.90至6.10。導電率範圍將與先前BDS緩衝液所用之導電率範圍相似，例如對於15.9 mS/cm至23.9 mS/cm之規格，範圍為±20%。rVWF製程之要求一般在設置緩衝液規格方面不具有意義，其原因在於r 成對鹼性胺基酸蛋白酶將在rVWF製程中稀釋200倍。表21及表22中之實驗資料對應於圖49中所呈現之圖式。
參考文獻
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如熟習此項技術者將顯而易知，本申請案之許多修改及變化可在不背離其精神及範圍之情況下進行。本文所述之特定具體實例僅以舉例之方式提供，且申請案應僅受隨附申請專利範圍之術語以及申請專利範圍授權之等效物之全部範圍限制。
圖1.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之溫度研究。對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在室溫、37℃或45℃下培育至多7天。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之活性相對於培育天數作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖2.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之溫度研究。使用SEC分析與圖1中相同之樣品。相對r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於培育天數作圖。相對峰高以時間零點之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高之百分比之形式計算。
圖3.使用SEC分析在37℃下培育之對照調配物中之r 成對鹼性胺基酸蛋白酶。對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在37℃下培育至多7天。圖3展示在280 nm下六個時間點之SEC吸收特徵之疊合圖。與圖1中相同之研究。
圖4.使用西方墨點法分析在室溫及37℃下培育之對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶。與圖1中相同之研究。泳道：(1)MWM標記；(2)T=0；(3)在室溫下培育1天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(4)在室溫下培育2天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(5)在室溫下培育3天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(6)在室溫下培育7天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(7)MWM標記；(8)在37℃下培育1天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(9)在37℃下培育2天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(10)在37℃下培育3天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶；及(11)在37℃下培育7天之r成對鹼性胺基酸蛋白酶。
圖5.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之冷凍/解凍研究。r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相對於冷凍/解凍循環次數作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖6.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之冷凍/解凍研究。r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於冷凍/解凍循環次數作圖。
圖7.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用活性檢定分析之攪拌研究。r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性 相對於攪拌時間作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖8.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之攪拌研究。r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於攪拌時間作圖。
圖9.使用西方墨點法比較不同批次之r成對鹼性胺基酸蛋白酶。使用西方墨點法分析不同批次之r成對鹼性胺基酸蛋白酶。產生次序按字母順序表示。泳道：(1)MWM標記；(2)成對鹼性胺基酸蛋白酶參考；(3)03-04-09(批次018342，2 mL小瓶)；(4)03-08-09(批次018365，2 mL小瓶)；(5)03-15-09(批次018366，2 mL小瓶)；(6)03-01-09(批次018315，2 mL小瓶)；(7)07-26-10(批次X572，200 mL瓶子)；(8)03-06-09(批次018365，200 mL瓶子)；(9)08-01-10(批次X576，200 mL瓶子)；(10)03-09-09(批次018366，200 mL瓶子)；(11)MWM標記；(12)成對鹼性胺基酸蛋白酶參考；(13)08-03-10(批次X577，200 mL瓶子)；(14)07-24-10(批次X573，200 mL瓶子)；(15)07-30-10(批次X575，200 mL瓶子)；(16)018346(在-80℃下QC穩定)；(17)018346(在-25℃下QC穩定)；(18)018315(在-80℃下QC穩定)及(19)018315(在-25℃下QC穩定)。
圖10.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之解凍方法對r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之影響。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品活性以在4℃(左)或室溫(室溫；右)下解凍之不同批次之r成對鹼性胺基酸蛋白酶之條形圖的形 式展示。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖11.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之pH 5及pH 5.5對r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之影響。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在37℃下在pH 5.0、pH 5.5或pH 6.0(對照調配物)下培育至多7天。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之活性相對於培育天數作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖12.使用SEC分析之pH 5及pH 5.5對r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之影響。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在37℃下在pH 5.0、pH 5.5或pH 6.0(對照調配物)下培育。r成對鹼性胺基酸蛋白酶之相對峰高相對於培育天數作圖。相對峰高以時間零點之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高之百分比之形式計算。
圖13.使用SEC分析之在37℃下對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在37℃下培育四天。280 nm吸收特徵之疊合圖展示三個時間點：T=0、培育1天及4天。
圖14.使用SEC分析之MES(pH 6.0)中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以MES(最終C=100 mM，pH 6.0)且在37℃下培育四天。280 nm吸收特徵之疊合圖展示三個時間點：T=0、培育1天及4天。
圖15.使用SEC分析之HEPES(pH 7.0)中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以 HEPES(最終C=100 mM，pH 7.0)且在37℃下培育四天。280 nm吸收特徵之疊合圖展示三個時間點：T=0、培育1天及4天。
圖16.使用SEC分析之HEPES(pH 8.0)中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以HEPES(最終C=100 mM，pH 8.0)且在37℃下培育四天。280 nm吸收特徵之疊合圖展示三個時間點：T=0、培育1天及4天。
圖17.使用SEC分析之在37℃下蔗糖及聚山梨醇酯80添加劑對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。樣品在37℃下培育四天。r成對鹼性胺基酸蛋白酶之相對峰高相對於培育時間作圖。相對峰高以時間零點之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高之百分比之形式計算。
圖18.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下蔗糖及聚山梨醇酯80對對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之相對活性相對於培育天數作圖以比較以下樣品：不具有添加劑之對照調配物、對照調配物加10%蔗糖、及對照調配物加10%蔗糖加25 ppm聚山梨醇酯80。相對活性值以時間零點之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之百分比之形式計算。誤差杠為±1標準差=4。
圖19.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下蔗糖及聚山梨醇酯80對MES緩衝液中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品 之相對活性相對於培育天數作圖以比較以下樣品：不具有添加劑之對照調配物、摻以MES(最終C=100 mM，pH 6.0)、摻以MES(最終C=100 mM，pH 6)加10%蔗糖、及摻以MES(最終C=100 mM，pH 6)加10%蔗糖加25 ppm聚山梨醇酯80。相對活性值以時間零點之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之百分比之形式計算。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖20.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下對照調配物與MES緩衝液中之調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性的比較。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之相對活性相對於培育天數作圖以比較以下樣品：不具有添加劑之對照調配物、對照調配物加10%蔗糖、及摻以MES(最終C=100 mM，pH 6)加10%蔗糖。相對活性值以時間零點之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之百分比之形式計算。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖21.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下蔗糖與甘露糖醇中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性的比較。所有樣品均摻以HEPES/乙酸，pH 6.0。r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之相對活性相對於培育天數作圖以比較以下樣品：無添加劑、10%蔗糖、10%甘露糖醇、10%蔗糖加25 ppm聚山梨醇酯80、及10%甘露糖醇加25 ppm聚山梨醇酯80。相對活性值以時間零點之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之百分比之形式計算。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖22.在37℃下之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性：使 用SEC分析之蔗糖相對於甘露糖醇。使用SEC分析與圖21中相同之樣品。相對r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於培育時間作圖。相對峰高以時間零點之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高之百分比之形式計算。
圖23.由成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下培育5天後海藻糖中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定檢驗在37℃下不同量之海藻糖及聚山梨醇酯80對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。首先，所有樣品均摻以HEPES及乙酸(最終濃度：HEPES為50 mM，乙酸為50 mM，pH 6.0)，隨後添加10%蔗糖或不同量之海藻糖及/或聚山梨醇酯80。亦包括對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品。資料自在37℃下培育5天後之最高活性值至最低活性值排序(各對中之右側條)。各對中之左側條描繪在時間零點之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性值。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖24.在37℃下培育5天後海藻糖中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。重算後展示與圖23中相同之樣品以顯示在37℃下培育5天後各樣品剩餘之初始活性之百分比。亦包括對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖25.使用SEC分析之在37℃下培育5天後海藻糖中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。與圖24中相同之樣品。圖式顯示在37℃下培育5天後各樣品剩餘之初始r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰值之百分比。亦包括對照調配物中之r 成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品。
圖26.使用西方墨點法分析之在35℃下培育5天後海藻糖中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。與圖24中相同之樣品。樣品成對：第一樣品--時間零點，第二樣品--在37℃下培育5天。泳道：(1)MWM標記；(2)成對鹼性胺基酸蛋白酶參考，(3)對照；(4)對照調配物，T=0；(5)對照調配物，5天；(6)10%蔗糖，T=0；(7)10%蔗糖，5天；(8)2%海藻糖，T=0；(9)2%海藻糖，5天；(10)10%海藻糖，T=0；(11)10%海藻糖，5天；(12)MWM標記；(13)成對鹼性胺基酸蛋白酶參考；(14)對照；(15)5%海藻糖，T=0；(16)5%海藻糖，5天；(17)5%海藻糖+10 ppm Tween80，T=0；(18)5%海藻糖+10 ppm Tween80，5天；(19)5%海藻糖+25 ppm Tween80，T=0；(20)5%海藻糖+25 ppm Tween80，5天；(21)5%海藻糖+100 ppm Tween80，T=0；及(22)5%海藻糖+100 ppm Tween80，5天。
圖27.在37℃下培育5天後測試之海藻糖含量對r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之影響。與圖24中相同之實驗。首先，所有樣品均摻以HEPES及乙酸(最終濃度：HEPES為50 mM，乙酸為50 mM，pH 6.0)，隨後添加不同量之海藻糖。在37℃下培育5天後之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相對於添加至樣品中之海藻糖之百分比作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖28.培育5天後使用SEC分析之在37℃下海藻糖含 量對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。與圖27中相同之實驗。在37℃下培育5天後之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於添加至樣品中之海藻糖之百分比作圖。
圖29.在37℃下培育5天後測試之聚山梨醇酯80含量對r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性之影響。與圖24中相同之實驗。首先，所有樣品均摻以HEPES、乙酸(最終濃度：HEPES為50 mM，乙酸為50 mM，pH 6.0)及5%海藻糖，隨後添加不同量之聚山梨醇酯80。在37℃下培育5天後之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相對於添加至樣品中之聚山梨醇酯80之量作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖30.培育5天後使用SEC分析之在37℃下聚山梨醇酯80含量對r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性之影響。與圖29中相同之樣品。在37℃下培育5天後之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於添加至樣品中之聚山梨醇酯80之量作圖。
圖31.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之攪拌研究。高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以不同量之聚山梨醇酯80。圖式展示攪拌三小時之前及之後之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性值。資料自最高活性至最低活性排序。誤差杠為±1標準差；n=4。各對中之左側條展示在時間0之活性，各對中之右側條展示攪拌後之活性。
圖32.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之攪拌研究。與圖31中相同之實驗。 圖式展示攪拌三個小時之前及之後之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高。資料自最高至最低排序。各對中之左側條展示在時間0之活性，各對中之右側條展示攪拌後之活性。
圖33.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之攪拌研究中聚山梨醇酯含量的影響。與圖32中相同之樣品。攪拌三小時後之成對鹼性胺基酸蛋白酶活性相對於聚山梨醇酯80含量作圖。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖34.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之攪拌研究中聚山梨醇酯80的影響。與圖32中相同之樣品。攪拌三小時後之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高相對於聚山梨醇酯80含量作圖。
圖35.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之攪拌研究。層析圖展示在280 nm下SEC吸收特徵之疊合圖，比較攪拌三小時之前及之後對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品。經攪拌之樣品之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰值顯著小於對照樣品。觀察到經攪拌之樣品中缺少高分子質量峰(參見用於說明之第3.5.1段)。
圖36.對照調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶之UV光譜(與圖35中相同之樣品)。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜與攪拌前之樣品相比展示傾斜且極度升高的特徵，其表明經攪拌之樣品中存在顯著含量之聚集體。
圖37.不具有聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r 成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜與攪拌前之樣品相比展示較高的特徵，其表明經攪拌之樣品中存在顯著含量之聚集體。
圖38.不具有聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析的攪拌研究。層析圖展示在280 nm下SEC吸收特徵之疊合圖，比較攪拌三小時之前及之後不具有聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中的r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品。經攪拌之樣品之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰值顯著小於對照樣品。觀察到缺少高分子質量峰。
圖39.含有10 ppm聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜與攪拌前之樣品相比展示稍微升高之特徵，其表明經攪拌之樣品中存在聚集體。相對於見於不具有聚山梨醇酯之樣品中之光譜(圖36及圖37)，『經攪拌』之光譜與『攪拌前』之光譜接近，其指示聚集程度低於見於不具有聚山梨醇酯之樣品中之聚集程度。
圖40.含有25 ppm聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜與攪拌前之樣品相比展示稍微升高的特徵，其表明經攪拌之樣品中存在少量聚集體。
圖41.含有50 ppm聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜展示與攪拌前之樣品極其類似的特徵。光譜既不傾斜亦不升高，其表明樣品均不含有大量較大聚集體。
圖42.含有100 ppm聚山梨醇酯80之高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時後r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品之UV光譜展示與攪拌前之樣品極其類似的特徵。光譜既不傾斜亦不升高，其表明樣品均不含有大量較大聚集體。
圖43.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之冷凍/解凍研究。高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品摻以不同量之聚山梨醇酯80。資料展示5個冷凍/解凍循環之前及之後樣品中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性。資料自最高至最低排序。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖44.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之冷凍/解凍研究。與圖43中相同之樣品。資料展示5個冷凍/解凍循環之前及之後之r成對鹼性胺基酸蛋白酶峰高。資料自最高至最低排序。
圖45.高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶--使用SEC分析之冷凍/解凍研究。與圖44中相同之樣品。r成對鹼性胺基酸蛋白酶之相對峰高相對於冷凍/解凍循環次數作圖。相對峰高以第一個冷凍/解凍循環前r成對 鹼性胺基酸蛋白酶峰高之百分比之形式計算。
圖46.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。對照調配物或高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶樣品在37℃下培育4天。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖47.使用成對鹼性胺基酸蛋白酶活性檢定分析之在37℃下高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。重算與圖46中相同之樣品。各樣品之相對活性以其初始活性之百分比之形式計算。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖48.使用SEC分析之在37℃下高度穩定化調配物中之r成對鹼性胺基酸蛋白酶穩定性。與圖46中相同之樣品。各樣品之r成對鹼性胺基酸蛋白酶之相對峰高以其初始峰高之百分比的形式計算。誤差杠為±1標準差；n=4。
圖49.溫度對高度穩定化調配物儲備緩衝液(500 mM HEPES、400 mM乙酸、1 mM CaCl2，pH 6.0)之pH值及導電率之影響。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成對鹼性胺基酸蛋白酶裂解受質
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 在N末端由第三丁氧基羰基修飾
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 在C末端由7-胺基-4-甲氧基香豆素修飾
<400> 1

Claims (46)

  1. 一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶，rfurin)之穩定化水性組成物，該組成物包含：(a)8,000U/mL至500,000U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(b)110mM至280mM醫藥學上可接受之鹽；(c)0.5mM至2mM鈣；(d)2%至20%糖或糖醇；(e)10ppm至200ppm非離子界面活性劑；(f)10mM至200mM緩衝劑；及(g)5.5至7.5之pH值。
  2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含150mM至250mM醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如申請專利範圍第2項之組成物，其包含190±10mM醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其包含190mM醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物，其中該醫藥學上可接受之鹽為氯化鈉。
  6. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該醫藥學上可接受之鹽為氯化鉀。
  7. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含0.9±0.2mM鈣。
  8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其包含0.92mM鈣。
  9. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含5%至15%糖或糖醇。
  10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其包含10±2%糖或糖醇。
  11. 如申請專利範圍第10項之組成物，其包含10%糖或糖醇。
  12. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該糖或糖醇係選自由以下各物所組成之群組：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、及其組合。
  13. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該糖或糖醇為海藻糖。
  14. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該糖或糖醇為蔗糖。
  15. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含10ppm至100ppm非離子界面活性劑。
  16. 如申請專利範圍第15項之組成物，其包含50ppm至100ppm非離子界面活性劑。
  17. 如申請專利範圍第16項之組成物，其包含75ppm非離子界面活性劑。
  18. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80。
  19. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含50mM至150mM緩衝劑。
  20. 如申請專利範圍第19項之組成物，其包含90±10mM 緩衝劑。
  21. 如申請專利範圍第20項之組成物，其包含91mM緩衝劑。
  22. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該緩衝劑包含乙酸鹽。
  23. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該緩衝劑包含HEPES。
  24. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該緩衝劑包含MES。
  25. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該緩衝劑包含乙酸鹽及HEPES。
  26. 如申請專利範圍第25項之組成物，其包含25mM至75mM乙酸鹽及25mM至75mM HEPES。
  27. 如申請專利範圍第26項之組成物，其包含45±5mM乙酸鹽及45±5mM HEPES。
  28. 如申請專利範圍第27項之組成物，其包含45mM乙酸鹽及46mM HEPES。
  29. 如申請專利範圍第1項之組成物，其具有5.5至7.0之pH值。
  30. 如申請專利範圍第29項之組成物，其具有5.5至6.5之pH值。
  31. 如申請專利範圍第30項之組成物，其具有6.0±0.2之pH值。
  32. 如申請專利範圍第31項之組成物，其具有6.0之pH 值。
  33. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物在於37℃下儲存時與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比具有較強穩定性。
  34. 如申請專利範圍第33項之組成物，其中該組成物在於37℃下儲存時與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
  35. 如申請專利範圍第33項之組成物，其中該組成物在於37℃下儲存時與不含糖或糖醇之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
  36. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物在攪拌時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比具有較強穩定性。
  37. 如申請專利範圍第36項之組成物，其中該組成物在攪拌時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
  38. 如申請專利範圍第36項之組成物，其中該組成物在攪拌時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
  39. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物在 稀釋時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比具有較強穩定性。
  40. 如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物在稀釋時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶活性百分比。
  41. 如申請專利範圍第39項之組成物，其中該組成物在稀釋時與不含非離子界面活性劑之r成對鹼性胺基酸蛋白酶組成物相比維持較高的r成對鹼性胺基酸蛋白酶單體含量百分比。
  42. 一種重組成對鹼性胺基酸蛋白酶(r成對鹼性胺基酸蛋白酶)之穩定化水性組成物，該組成物包含：(a)8,000U/mL至500,000U/mL r成對鹼性胺基酸蛋白酶；(b)190mM氯化鈉；(c)0.92mM鈣；(d)10%海藻糖；(e)75ppm聚山梨醇酯80；(f)45mM乙酸；(g)46mM HEPES；及(h)5.5至7.5之pH值。
  43. 如申請專利範圍第42項之組成物，其具有5.5至7.0之pH值。
  44. 如申請專利範圍第42項之組成物，其具有5.5至6.5 之pH值。
  45. 如申請專利範圍第42項之組成物，其具有6.0±0.2之pH值。
  46. 如申請專利範圍第42項之組成物，其具有6.0之pH值。
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