KR20140050625A - 재조합 퓨린의 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제를 함유하는 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 안정화된 제형을 제공한다. 비안정화된 조성물에 비해, 본 명세서에 개시된 퓨린 제형은 더 큰 양의 퓨린 활성 및 모노머 퓨린 함량을 보유하지만, 저장되고/되거나 기계적 스트레를 받을 때, 퓨린은 감소되었다. 또한 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물을 안정하게 희석시키기 위한 방법이 제공된다.

Description

재조합 퓨린의 제형{FORMULATIONS OF RECOMBINANT FURIN}
관련 출원과의 상호 참조
본 발명은 2011년 6월 2일 출원된 미국 가특허 출원 제61/492,712호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 모든 목적을 위하여 그의 전문이 본 명세서에 참조로 명백하게 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 출원은 일반적으로 단백질 제형의 분야에 관한 것이다.
단백질 가수분해 포유류 서브틸리신-유사 프로단백질 전환효소(subtilisin-like proprotein convertase: SPC 또는 PC)의 패밀리는 박테리아 서브틸리신 및 효모 Kex2p와 상동성이다. 지금까지 퓨린(furin), PC1(또한 PC3로서 알려짐), PC2, PACE4, PC4, PC5(또한 PC6으로서 알려짐), PC7(LPC, PC8 또는 SPC7)을 포함하는, SPC 패밀리의 7종의 별개의 구성원이 확인되었으며, 이들 각각은 독특한 조직 분포를 나타낸다.
PACE(짝지어진 염기성 아미노산 절단효소(paired basic amino acid cleavage enzyme))로도 칭해지는 퓨린은 모든 포유류 조직 및 세포주에서 흔하게 발현되며, 또한 호르몬, 성장인자, 수용체, 바이러스 및 박테리아 단백질 및 혈장 단백질을 포함하는 분비 경로에서 넓은 범위의 생활성 전구체 단백질을 소유할 수 있다. 그것은 몇몇 도메인, 즉, 신호 펩타이드, 프로펩타이드, 촉매적 도메인, 중간 도메인, (또한 호모-B 또는 P-도메인으로 칭해짐), C-말단에 위치된 시스테인 풍부 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 내에 구조적으로 배열된 칼슘-의존적 세린 엔도프로테아제이다. 퓨린 프로테아제 절단 부위는 아미노산 서열 Arg-X-Lys/Arg-Arg을 특징으로 하는 인식 서열을 포함한다(Hosaka et al., J Biol Chem. 1991; 266:12127-30).
퓨린은 프로단백질 전환효소의 패밀리에 속하며, 칼슘(Ca2 +)에 의존적이다. 퓨린은 위치 -1 및 -4에서 아르기닌을 함유하는 특이적 서열 내에서 아르기닌의 C-말단 펩타이드 결합을 특이적으로 절단한다. 이 서열은 수많은 인간 단백질에서 발견될 수 있는데, 이는 퓨린이 다수의 인간 프로단백질의 성숙에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 퓨린은 잠재적 전구체 단백질을 그것의 생물학적으로 활성인 생성물로 처리하는 프로단백질 전환효소이다. 퓨린은 그것의 짝지어진 아미노산 처리 부위에서 전구체 단백질을 절단하는 칼슘 의존적 세린 엔도프로테아제이다. 퓨린에 대한 하나의 기질은 폰빌레브란트 인자(von Willebrand Factor: vWF)이다.
퓨린(예를 들어, r퓨린)은 VWF의 Arg741-Ser742 펩타이드 결합을 절단함으로써 프로-VWF(프로-폰빌레브란트 인자)를 성숙 VWF로 전환시킬 수 있다. 이 성숙 단계는, 예를 들어 폰빌레브란트병 B형에 대한 치료를 제공하는 rVWF 생성 과정의 일부이다. 활성화된 재조합 단백질의 생성은 높은 임상적 및 진단적 중요성을 가진다. 예를 들어, 성숙 VWF와 같은 활성 또는 성숙 단백질은 혈액 응고를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
퓨린 제형, 특히 재조합 퓨린(recombinant furin: r퓨린) 제형은 종종 단백질 분해로부터 r퓨린 활성의 손실에 기인하여 낮은 보관 수명(6개월 미만)을 가진다. 추가로, 특정 생성 과정, 예컨대 성숙 vWF의 생성에서 사용될 때, r퓨린 제형은 종종 200배만큼 희석되고, 희석된 r퓨린은 일반적으로 활성의 불균형 손실을 나타낸다. 따라서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물을 안정화시키는 방법 및 제형뿐만 아니라 퓨린 활성의 실질적인 분획을 상실하는 일 없이 농축된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물을 희석시키기 위한 방법에 대한 해당 분야의 필요가 있다.
본 개시내용은 퓨린(예를 들어, r퓨린 조성물)을 안정화시키는 방법 및 제형을 제공함으로써 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형, 저장 및 조작 분야에서 이들 및 다른 필요를 충족시킨다. 이들 필요, 적어도 부분적으로 당, 당 알코올 및/또는 비이온성 계면활성제의 첨가가 저장 및 기계적 스트레스 동안 퓨린(예를 들어, r퓨린)조성물의 안정성을 상당히 증가시킨다는 발견에 의해 충족된다.
따라서, 본 발명은 출발(대조군) 퓨린 제형에 비해 고온, 교반 및 다양한 PH 조건 하에서 증가된 안정성을 나타내는 고도로 안정화된 퓨린 제형, 특히 고도로 안정화된 r퓨린 제형을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 퓨린(r퓨린)의 안정화된 수성 조성물을 제공하되, 해당 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린; 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염; 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올; 10 내지 200ppm 비이온성 계면활성제; 10 내지 200mM 완충제; 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 150mM 내지 250mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 190±10mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 0.9±0.2mM 칼슘을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 0.92mM 칼슘을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 5% 내지 15% 당 또는 당 알코올을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 10% 당 또는 당 알코올을 포함한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스이다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 10ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 50ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 75ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트-80이다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 50mM 내지 150mM 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 90±10mM 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 91mM 완충제를 포함한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트를 포함한다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 완충제는 HEPES를 포함한다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 완충제는 MES를 포함한다. 상기 제공된 조성물의 다른 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 25mM 내지 75mM 아세테이트 및 25 내지 75mM HEPES를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 45±5mM 아세테이트 및 45±5mM HEPES를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 45mM 아세테이트 및 46mM HEPES를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 5.5 내지 7.0의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 6.0±0.2의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 6.0의 pH를 가진다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 37℃에서 저장될 때, 증가된 안정성을 가진다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 37℃에서 저장될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 활성을 유지한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 37℃에서 저장될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체 함량을 유지한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 교반될 때, 증가된 안정성을 가진다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 교반될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 활성을 유지한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 교반될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체를 유지한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 희석될 때, 증가된 안정성을 가진다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 희석될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 활성을 유지한다.
상기 제공된 조성물의 일 실시형태에서, 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해 희석될 때, 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체를 유지한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 퓨린(r퓨린)의 안정화된 수성 조성물을 제공하되, 해당 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린; 190mM 염화나트륨; 0.92mM 칼슘; 10% 트레할로스; 75ppm 폴리솔베이트 80; 45mM 아세트산; 46mM HEPES; 및 5.5 내지 7.5의 pH를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 5.5 내지 7.0의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 6.0±0.2의 pH를 가진다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 조성물은 6.0의 pH를 가진다.
일 양태에서, 본 개시내용은 수성 r퓨린 조성물을 희석하기 위한 방법을 제공하되, 해당 방법은 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 희석 완충제를 수성 r퓨린 조성물에 첨가하는 단계, 이에 의해 희석된 r퓨린 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시형태에서, 희석 완충제는 10ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 50ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 75ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시형태에서, 희석 완충제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가진다. 상기 제공된 방법의 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다. 상기 제공된 방법의 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 6.0±0.2의 pH를 가진다. 상기 제공된 방법의 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 6.0의 pH를 가진다.
상기 제공된 방법의 일 실시형태에서, 희석된 r퓨린 조성물은 희석 전 수성 r퓨린 조성물 내에 존재하는 r퓨린 활성의 적어도 50%를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시형태에서, 희석된 r퓨린 조성물은 희석 전 수성 r퓨린 조성물 내에 존재하는 r퓨린 활성의 적어도 75%를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 퓨린(r퓨린)의 고도로 안정화된 제형을 제공하되, 상기 제형은 8,000 내지 52,000 U/㎖ r퓨린; 1mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염; 0.1mM 내지 2mM 염화칼슘; 1% 내지 20% 당 및/또는 당 2수화물; 50 내지 100ppm의 계면활성제; 및 1mM 내지 100mM의 카복실산, 4.0 내지 7.0의 pH를 유지하기 위한 충분한 농도의 완충제, 또는 상기 카복실산과 상기 완충제 둘 다를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 제형은 180 내지 200mM 염을 포함한다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 염은 염화나트륨이다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 제형 0.5 내지 1.0mM 칼슘을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 제형은 5 내지 15% 당 또는 당 2수화물을 포함한다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 당 또는 당 2수화물은 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 80이다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 계면활성제는 약 65 내지 약 85ppm의 농도로 존재한다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 카복실산은 아세트산이다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 카복실산은 35 내지 55mM의 농도로 존재한다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 완충제는 HEPES이다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 완충제는 약 20 내지 약 100mM의 농도로 존재한다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 제형은 당 또는 당 2수화물을 함유하지 않는 제형에 비해 37℃에서 저장 후 개선된 안정성을 나타낸다.
상기 제공된 제형의 일 실시형태에서, 제형은 1% 폴리솔베이트 80, 500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM 염화칼슘 및 트레할로스 2수화물 분말을 포함하는 조성물에 r퓨린을 첨가하는 단계에 의해 제조되되, 상기 조성물은 상기 r퓨린에 첨가 전 6.0의 pH를 가진다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 퓨린(r퓨린)의 고도로 안정화된 제형을 제공하되, 상기 제형은 8,000 내지 57,000 U/㎖ r퓨린; 190mM 염화나트륨; 0.92mM 염화칼슘; 10% w/w 트레할로스 2수화물; 75ppm 폴리솔베이트 80; 45mM 아세트산; 및 46mM HEPES를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 재조합 퓨린(r퓨린)의 고도로 안정화된 제형을 제공한다: (a) 8,000 내지 52,000 U/㎖ r퓨린; (b) 1mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염; (c) 0.1mM 내지 2mM 염화칼슘; (d) 1% 내지 20% 당 및/또는 당 2수화물; (e) 50 내지 100ppm의 계면활성제; 및 (f) 4.0 내지 7.0의 pH를 유지하는데 충분한 농도의 1mM 내지 100mM의 카복실산 또는 완충제 또는 카복실산과 완충제 둘 다.
도 1. 대조군 제형의 r퓨린 - 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 온도 연구를 도시한 도면. 대조군 제형 내 r퓨린 샘플을 실온, 37℃ 또는 45℃에서 7일까지 인큐베이션시켰다. r퓨린 샘플의 활성을 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준편차이다; n=4.
도 2. 대조군 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 온도 연구를 도시한 도면. 도 1과 동일한 샘플을 SEC를 사용하여 분석하였다. 상대적 r퓨린 피크 높이를 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다. 상대적 피크 높이를 0시점에 r퓨린 피크 높이의 백분율로서 계산하였다.
도 3. 대조군 제형의 r퓨린을 37℃에서 인큐베이션시키고 SEC를 사용하여 분석한 도면. 대조군 제형의 r퓨린 샘플을 37℃에서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 도 3은 6회 시점의 280㎚에서 SEC 흡수 프로파일의 오버레이를 나타낸다. 도 1에서와 동일한 연구.
도 4. 대조군 제형의 r퓨린을 실온 및 37℃에서 인큐베이션시키고, 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다. 도 1에서와 동일한 연구. 레인: (1) MWM 마커; (2) T = 0; (3) 실온에서 1일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (4) 실온에서 2일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (5) 실온에서 3일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (6) 실온에서 7일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (7) MWM 마커; (8) 37℃에서 1일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (9) 37℃에서 2일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; (10) 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린; 및 (11) 37℃에서 7일 동안 인큐베이션시킨 r퓨린.
도 5. 대조군 제형의 r퓨린 - 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 냉동/해동 연구를 도시한 도면. r퓨린 활성을 냉동/해동 주기의 수에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 6. 대조군 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 냉동/해동 연구를 도시한 도면. r퓨린 피크 높이를 냉동/해동 주기의 수에 대해 플롯팅한다.
도 7. 대조군 제형의 r퓨린 - 활성 분석을 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. r퓨린 활성을 교반 시간에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 8. 대조군 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. r퓨린 피크 높이를 교반 시간에 대해 플롯팅한다.
도 9. 웨스턴 블롯팅을 사용하는 r퓨린의 상이한 로트의 비교. r퓨린의 다양한 로트를 웨스턴 블롯팅을 사용하여 분석하였다. 생성 순서를 알파벳순으로 나타낸다. 레인: (1) MWM 마커; (2) 퓨린 기준; (3) 03-04-09(로트 018342, 2㎖ 바이알); (4) 03-08-09(로트 018365, 2㎖ 바이알); (5) 03-15-09(로트 018366, 2㎖ 바이알); (6) 03-01-09(로트 018315, 2㎖ 바이알); (7) 07-26-10(로트 X572, 200㎖ 보틀); (8) 03-06-09(로트 018365, 200㎖ 보틀); (9) 08-01-10 (로트 X576, 200㎖ 보틀); (10) 03-09-09(로트 018366, 200㎖ 보틀); (11) MWM 마커; (12) 퓨린 기준; (13) 08-03-10(로트 X577, 200㎖ 보틀); (14) 07-24-10(로트 X573, 200㎖ 보틀); (15) 07-30-10(로트 X575, 200㎖ 보틀); (16) 018346(-80℃에서 QC 안정성); (17) 018346(-25℃에서 QC 안정성); (18) 018315(-80℃에서 QC 안정성); 및 (19) 018315(-25℃에서 QC 안정성).
도 10. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 r퓨린 활성에 대한 해당 방법의 영향을 도시한 도면. r퓨린 샘플 활성을 4℃(좌측) 또는 실온(RT; 우측) 중 하나에서 해동된 r퓨린의 다양하나 로트에 대해 막대로 나타낸다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 11. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 r퓨린 활성에 대한 pH 5 및 5.5의 효과를 도시한 도면. r퓨린 샘플을 pH: 5.0, 5.5 또는 6.0(대조군 제형)로 37℃에서 7일까지 동안 인큐베이션시켰다. r퓨린 샘플의 활성을 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 12. SEC를 사용하여 분석한 r퓨린 활성에 대한 pH 5 및 5.5의 효과를 도시한 도면. r퓨린 샘플을 pH: 5.0, 5.5 또는 6.0(대조군 제형) 중 하나에서 37℃에서 인큐베이션시켰다. r퓨린의 상대적 피크 높이를 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다. 상대적 피크 높이를 0시간에 r퓨린 피크 높이의 백분율로서 계산하였다.
도 13. SEC를 사용하여 분석한 대조군 제형에서 37℃에서 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 대조군 제형의 r퓨린 샘플을 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 280㎚ 흡수 프로파일의 오버레이는 3개의 시점을 나타낸다: 인큐베이션의 T=0, 제1일 및 제4일.
도 14. SEC를 사용하여 분석한 MES pH 6.0에서 r퓨린 안정성을 도시한 도면. r퓨린 샘플에 MES를 첨가하였고(최종 C=100mM, pH 6.0), 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 280㎚ 흡수 프로파일의 오버레이는 3개의 시점을 나타낸다: T=0, 제1일 및 제4일의 인큐베이션.
도 15. SEC를 사용하여 분석한 MES pH 7.0에서 r퓨린 안정성을 도시한 도면. r퓨린 샘플에 HEPES를 첨가하였고(최종 C=100mM, pH 7.0), 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 280㎚ 흡수 프로파일의 오버레이는 3개의 시점을 나타낸다: T=0, 제1일 및 제4일의 인큐베이션.
도 16. SEC을 사용하여 분석한 HEPES pH 8.0에서 r퓨린 안정성을 도시한 도면. r퓨린 샘플에 HEPES(최종 C=100mM, pH 8.0)를 첨가하였고, 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 280㎚ 흡수 프로파일의 오버레이는 3개의 시점을 나타낸다: T=0, 제1일 및 제4일의 인큐베이션.
도 17. SEC을 사용하여 분석한 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 수크로스 및 폴리솔베이트 80 첨가제의 효과를 도시한 도면. 샘플을 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. r퓨린의 상대적 피크 높이를 인큐베이션의 시간에 대해 플롯팅한다. 상대적 피크 높이를 0 시간에 r퓨린 피크 높이의 백분율로서 계산하였다.
도 18. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 37℃에서 대조군 제형의 r퓨린 안정성에 대한 수크로스 및 폴리솔베이트 80의 효과를 도시한 도면. r퓨린 샘플의 상대적 활성을 다음의 샘플과 비교하여 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다: 첨가제가 없는 대조군 제형, 대조군 제형 + 10% 수크로스 및 대조군 제형 + 10% 수크로스 + 25ppm 폴리솔베이트 80. 0 시간에 퓨린 활성의 백분율로서 상대적 활성 값을 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다=4.
도 19. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 MES 완충제 중의 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 수크로스 및 폴리솔베이트 80의 효과를 도시한 도면. r퓨린 샘플의 상대적 활성을 다음의 샘플과 비교하여 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다: 첨가제가 없는 대조군 제형에 MES(최종 C=100mM, pH 6.0)를 첨가하였고, MES(최종 C=100mM, pH 6. + 10% 수크로스을 첨가하였으며, MES(최종 C=100mM, pH 6.0) + 10% 수크로스 + 25ppm 폴리솔베이트 80을 첨가하였다. 상대적 활성 값을 0 시간에 퓨린 활성의 백분율로서 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 20. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 대조군 제형의 37℃에서 r퓨린 안정성과 MES 완충제의 형성의 비교를 도시한 도면. r퓨린 샘플의 상대적 활성을 다음의 샘플과 비교하여 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다: 첨가제가 없는 대조군 제형, 대조군 제형 + 10% 수크로스, 및 MES(최종 C=100mM, pH 6.0) + 10% 수크로스를 첨가함. 0시간에 퓨린 활성의 백분율로서 상대적 값을 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 21. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 수크로스의 37℃에서 r퓨린 안정성과 만니톨의 비교를 도시한 도면. 모든 샘플에 HEPES/아세트산, pH 6.0을 첨가하였다. 다음의 샘플과 비교하여 r퓨린 샘플의 상대적 활성을 인큐베이션의 일 수에 대해 플롯팅한다: 첨가제 없음, 10% 수크로스, 10% 만니톨, 10% 수크로스 + 25ppm의 폴리솔베이트 80, 및 10% 만니톨 + 25ppm의 폴리솔베이트 80. 상대적 활성 값을 0 시간에 퓨린 활성의 백분율로서 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 22. SEC를 사용하여 분석한 37℃: 수크로스 대 만니톨에서 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 도 21과 동일한 샘플을 SEC를 사용하여 분석하였다. 상대적 r퓨린 피크 높이를 인큐베이션 시간에 대해 플롯팅한다. 상대적 피크 높이를 시간 0에 r퓨린 피크 높이의 백분율로서 계산하였다.
도 23. 퓨린 활성 분석에 의해 분석한 37℃에서 인큐베이션의 5일 후 트레할로스에서 r퓨린 안정성. 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 트레할로스 및 폴리솔베이트 80의 다양한 양의 효과를 퓨린 활성 분석을 사용하여 시험하였다. 우선, 모든 샘플에 HEPES 및 아세트산(최종 농도:HEPES - 50mM, 아세트산 - 50mM, pH 6.0)을 첨가한 다음, 10% 수크로스 또는 다양한 양의 트레할로스 및/또는 폴리솔베이트 80 중 하나를 첨가하였다. 대조군 제형 내 r퓨린 샘플을 또한 포함한다. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 데이터를 가장 높은 활성 값으로부터 가장 낮은 활성 값으로 분류한다(각 쌍에서 우측 막대). 각 쌍의 좌측 막대는 0시간에 퓨린 활성 값을 도시한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 24. 37℃에서 인큐베이션 5일 후 트레할로스의 r퓨린 활성을 도시한 도면. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 남은 각 샘플의 초기 활성의 백분율을 나타내기 위한 재계산 후 도 23에서와 같은 동일한 샘플을 나타낸다. 대조군 제형의 r퓨린 샘플이 또한 포함된다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 25. SEC를 사용하여 분석한 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 트레할로스의 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 도 24에서와 동일한 샘플. 그래프는 37℃에서 5일의 인큐베이션 후, 남은 각 샘플의 초기 r퓨린 피크의 백분율을 나타낸다. 대조군 제형의 r퓨린 샘플이 또한 포함된다.
도 26. 웨스턴 블롯팅을 사용하여 분석한 35℃에서 5일의 인큐베이션 후 트레할로스의 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 도 24에서와 동일한 샘플. 샘플을 짝짓는다: 제1 샘플 - 시간 0, 제2 샘플 - 5일 동안 37℃에서 인큐베이션함. 레인: (1) MWM 마커; (2) 퓨린 기준, (3) 대조군; (4) 대조군 제형, T=0; (5) 대조군 제형, 제5일; (6) 10% 수크로스, T = 0; (7) 10% 수크로스, 제5일; (8) 2% 트레할로스, T=0; (9) 2% 트레할로스, 제5일; (10) 10% 트레할로스, T=0; (11) 10% 트레할로스, 제5일; (12) MWM 마커; (13) 퓨린 기준; (14) 대조군; (15) 5% 트레할로스, T=0; (16) 5% 트레할로스, 제5일; (17) 5% 트레할로스, + 10ppm 트윈(Tween)80, T=0; (18) 5% 트레할로스, + 10ppm 트윈(Tween)80, 제5일; (19) 5% 트레할로스, + 25ppm 트윈(Tween)80, T=0; (20) 5% 트레할로스, + 25ppm 트윈(Tween)80, 제5일; (21) 5% 트레할로스, + 100ppm 트윈(Tween)80, T=0; 및 (22) 5% 트레할로스, + 100ppm 트윈(Tween)80, 제5일.
도 27. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 시험한 r퓨린 활성에 대한 트레할로스 함량의 효과를 도시한 도면. 도 24에서와 동일한 샘플. 우선, 모든 샘플에 HEPES 및 아세트산(최종 농도: HEPES - 50mM, 아세트산 - 50mM, pH 6.0)을 첨가한 다음, 다양한 양의 트레할로스를 첨가하였다. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 퓨린 활성을 샘플에 첨가한 트레할로스의 백분율에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 28. 5일의 인큐베이션 후 SEC를 사용하여 분석한 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 트레할로스 함량의 효과를 도시한 도면. 도 27에서와 동일한 샘플. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 r퓨린 피크 높이를 샘플에 첨가한 트레할로스의 백분율에 대해 플롯팅한다.
도 29. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 시험한 r퓨린 활성에 대한 폴리솔베이트 80 함량의 효과를 도시한 도면. 도 24에서와 동일한 실험. 우선, 모든 샘플에 HEPES, 아세트산(최종 농도: HEPES - 50mM, 아세트산 - 50mM, pH 6.0) 및 5% 트레할로스를 첨가한 다음, 다양한 양의 폴리솔베이트 80을 첨가하였다. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 퓨린 활성을 샘플에 첨가한 폴리솔베이트 80의 양에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 30. 5일의 인큐베이션 후 SEC를 사용하여 분석한 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 폴리솔베이트 80 함량의 효과. 도 29에서와 동일한 샘플을 도시한 도면. 37℃에서 5일의 인큐베이션 후 r퓨린 피크 높이를 샘플에 첨가한 폴리솔베이트 80의 양에 대해 플롯팅한다.
도 31. 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 - 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 샘플에 다양한 양의 폴리솔베이트 80을 첨가하였다. 그래프는 교반 전 및 3시간 교반 후 퓨린 활성 값을 나타낸다. 데이터를 가장 높은 활성으로부터 가장 낮은 활성으로 분류한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4. 각 쌍의 좌측 막대는 0시간의 활성을 나타내며, 각 쌍의 우측 막대는 교반 후 활성을 나타낸다.
도 32. 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. 도 31에서와 동일한 실험을 도시한 도면. 그래프는 교반 전 및 3시간 교반 후 r퓨린 피크 높이를 나타낸다. 가장 높은 데이터로부터 가장 낮은 데이터로 분류한다. 각 쌍의 좌측 막대는 0시간의 활성을 나타내며, 각 쌍의 우측 막대는 교반 후 활성을 나타낸다.
도 33. 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 - 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 교반 연구에서 폴리솔베이트 함량의 효과를 도시한 도면. 도 32에서와 동일한 샘플. 3시간 교반 후 퓨린 활성을 폴리솔베이트 80의 함량에 대해 플롯팅한다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 34. 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 교반 연구에서 폴리솔베이트 80의 효과를 도시한 도면. 도 32에서와 동일한 샘플. 3시간 교반 후 r퓨린 피크 높이를 폴리솔베이트 80의 함량에 대해 플롯팅한다.
도 35. 대조군 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. 크로마토그램은 교반 전 및 3시간 교반 후 대조군 제형의 r퓨린 샘플과 비교하여 280㎚에서 SEC 흡수 프로파일의 오버레이를 나타낸다. 교반 샘플의 r퓨린 피크는 대조군 샘플보다 상당히 더 작다. 교반 샘플에서 고분자량 피크의 부재가 관찰된다(설명을 위해 단락 3.5.1 참조).
도 36. 대조군 제형의 r퓨린의 UV 스펙트럼(도 35에서와 동일한 샘플)을 도시한 도면. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플과 비교하여 편향되고, 극도로 상승된 프로파일을 나타내는데, 이는 교반 샘플 내 유의한 수준의 응집물 존재를 나타낸다.
도 37. 폴리솔베이트 80 없이 고도로 안정화된 제형에서 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼을 도시한 도면. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플과 비교하여 상승된 프로파일을 나타내는데, 이는 교반 샘플 내 유의한 수준의 응집물 존재를 나타낸다.
도 38. 폴리솔베이트 80이 없는 고도로 안정화된 제형의 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 교반 연구를 도시한 도면. 크로마토그램은 교반 전 및 3시간 교반 후 폴리솔베이트 80이 없는 고도로 안정화된 제형에서 r퓨린 샘플과 비교하여 280㎚에서 SEC 흡수 프로파일의 오버레이를 나타낸다. 교반된 샘플의 r퓨린 피크는 대조군 샘플보다 유의하게 더 작다. 고분자량 피크의 부재가 관찰된다.
도 39. 10ppm 폴리솔베이트 80을 함유하는 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플에 비해 약간 상승된 프로파일을 나타내는데, 이는 교반된 샘플 내 응집물의 존재를 나타낸다. 폴리솔베이트가 없는 샘플에서 알 수 있는 것에 대해 '교반된' 범위는 '교반 전' 범위에 더 가까운데(도 36 및 37), 이는 교반 수준이 폴리솔베이트가 없는 샘플에서 보이는 것 미만이라는 것을 나타낸다.
도 40. 25ppm 폴리솔베이트 80을 함유하는 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼을 도시한 도면. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플에 비해 약간 상승된 프로파일을 나타내는데, 이는 교반된 샘플 내 소량의 응집물의 존재를 나타낸다.
도 41. 50ppm 폴리솔베이트 80을 함유하는 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼을 도시한 도면. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플과 매우 유사한 프로파일을 나타낸다. 스펙트럼 중 어떤 것도 편향되거나 또는 상승되지 않는데, 이는 샘플 중 어떤 것도 상당한 양의 거대 응집물을 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 42. 100ppm 폴리솔베이트 80을 함유하는 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼을 도시한 도면. 3시간 교반 후 r퓨린 샘플의 UV 스펙트럼은 교반 전 샘플과 매우 유사한 프로파일을 나타낸다. 스펙트럼 중 어떤 것도 편향되거나 또는 상승되지 않는데, 이는 샘플 중 어떤 것도 상당한 양의 거대 응집물을 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 43. 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 - 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 냉동/해동 연구를 도시한 도면. 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플에 상이한 양의 폴리솔베이트 80을 첨가하였다. 데이터는 5회의 냉동/해동 주기 전 및 후 샘플 내 r퓨린 활성을 나타낸다. 가장 높은 데이터로부터 가장 낮은 데이터로 정렬된다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 44. 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 냉동/해동 연구를 도시한 도면. 도 43에서와 동일한 샘플. 데이터는 5회의 냉동/해동 주기 전 및 후 샘플 내 r퓨린 활성을 나타낸다. 가장 높은 데이터로부터 가장 낮은 데이터로 정렬된다.
도 45. 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 - SEC를 사용하여 분석한 냉동/해동 연구를 도시한 도면. 도 44에서와 동일한 샘플. r퓨린의 상대적 피크 높이를 냉동/해동 주기의 수에 대해 플롯팅한다. 제1 냉동/해동 주기 전 r퓨린 피크 높이의 백분율로서 상대적 피크 높이를 계산하였다.
도 46. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 37℃에서 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 대조군 제형 내 또는 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 샘플을 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 47. 퓨린 활성 분석을 사용하여 분석한 37℃에서 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 도 46에서와 동일한 샘플을 재계산하였다. 각 샘플의 상대적 활성을 그것의 초기 활성의 백분율로서 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 48. SEC를 사용하여 분석한 37℃에서 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 안정성을 도시한 도면. 도 46에서와 동일한 샘플. 모든 샘플에 대해 r퓨린의 상대적 피크 높이를 그것의 초기 피크 높이의 백분율로서 계산하였다. 에러바는 ± 1 표준 편차이다; n=4.
도 49. 고도로 안정화된 제형 저장 완충제의 pH(B) 및 전도성(A)에 대한 온도 효과(500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM CaCl2, pH 6.0).
I. 도입
본 개시내용은 수성 퓨린 조성물이 추가적인 당, 당 알코올 및 비이온성 계면활성제에 의해 다양한 화학적 및 기계적 스트레스에 대해 안정화될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 본 명세서에 기재된 수성 퓨린 조성물은 실온 이상에서 저장될 때뿐만 아니라 기계적 스트레스를 받을 때, 당, 당 알코올 및 비이온성 계면활성제가 없는 유사한 퓨린 조성물에 비해 상당히 더 안정하다. 본 개시내용은 또한 VWF와 같은 다양한 재조합 생물의 제조 동안 사용된 더 낮은 농도로 효소가 희석될 때, 퓨린 희석 완충제에 비이온성 계면활성제의 첨가가 퓨린 활성의 더 큰 회복을 가능하게 한다는 발견에 부분적으로 기초한다.
유리하게는, 본 명세서에 기재된 연구는 퓨린 조성물에 당 또는 당 알코올의 첨가가 시간 기간에 걸쳐 저장될 때, 조성물의 안정성을 향상시킨다는 것을 입증한다. 예를 들어, 수성 퓨린 제형 내에 2% 당 또는 당 알코올만큼 적은 포함은 10% 초과만큼 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다는 것이 본 명세서에서 나타난다. 수성 퓨린 제형 내에 10% 당 또는 당 알코올의 포함은 75% 초과만큼 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있는 것으로 추가로 나타난다.
유리하게는, 본 명세서에 기재된 연구는 또한 기계적 스트레스를 받을 때 퓨린 조성물에 비이온성 계면활성제의 첨가가 조성물의 안정성을 향상시킨다는 것을 입증한다. 예를 들어, 수성 퓨린 제형 내 비이온성 계면활성제의 10ppm만큼 적은 포함은 75% 초과만큼 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다는 것이 본 명세서에서 나타난다.
유리하게는, 본 명세서에 기재된 연구는 또한 퓨린 희석 완충제에 비이온성 계면활성제의 포함이 희석 후 퓨린 활성의 회복을 증가시킨다는 것을 증명한다. 예를 들어, 퓨린 희석 완충제 내 비이온성 계면활성제의 75ppm의 포함은 3 내지 4배 만큼 희석 후 퓨린 활성의 회복을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 개시내용은 고도로 안정화된 퓨린 제형의 조성물을 제공한다. 본 명세서의 대다수의 논의는 재조합 퓨린(r퓨린)의 고도로 안정화된 제형에 대한 것이지만, 피험체로부터 단리된 퓨린 또는 퓨린의 임의의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 임의의 퓨린 단백질은 본 발명의 제형에 포함될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 제형의 온도 범위에, 몇몇 냉동/해동 주기에 및/또는 교반에 제형의 노출을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 스트레스원에 제형이 노출된 후 분석될 때, 대조군 제형 이상으로 개선된 안정성을 나타내는 고도로 안정화된 퓨린 제형을 제공한다. 개선된 안정성은 일반적으로 퓨린 활성 수준에 의해 평가되며 - 예를 들어, 주위 실온보다 높은 온도에서 저장된 후, 고도로 안정화된 퓨린 제형은 저장 전(즉, 시간 = 0에서) 각각의 활성에 비해 동일한 조건 하에서 저장된 대조군 제형보다 더 큰 수준의 활성을 나타낼 것이다. 퓨린 제형의 안정성을 평가하기 위한 방법은 본 명세서에 기재된다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 발명의 고도로 안정화된 퓨린 제형을 형성하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 냉동 저장, 주위 실온 이상의 온도에서 저장 또는 동결건조를 포함하는 저장을 위한 퓨린의 제형을 안정화하기 위한 방법을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 희석 후 퓨린 활성의 증가된 보유를 야기하는 농축된 퓨린 용액을 희석하기 위한 방법을 제공한다. 비이온성 계면활성제가 없는 용액으로 희석시킨 퓨린 조성물과 비교하면, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 희석된 퓨린의 수성 조성물은 3 내지 4배 더 큰 효소적 활성을 보유한다.
II . 정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "퓨린"은 퓨린 활성, 특히 프로-폰빌레브란트 인자(프로-VWF) 폴리펩타이드의 잔기 Arg-763과 Ser-764 사이의 펩타이드 결합을 절단하는 능력을 지니는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 대표적인 실시형태에서, 퓨린은 NP_002560.1(인간 퓨린 프레프로단백질)의 서열과 동일하거나 또는 고도로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 대표적인 실시형태에서, 퓨린은 NP_002560.1(인간 퓨린 프로단백질)의 아미노산 25 내지 794와 동일하거나 또는 고도로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 대표적인 실시형태에서, 퓨린은 NP_002560.1(인간 성숙 퓨린 단백질)의 아미노산 108 내지 794와 동일하거나 또는 고도로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 퓨린 폴리펩타이드는 또한 VWF 절단 활성을 지니는 퓨린의 천연 변이체뿐만 아니라 VWF 절단 활성을 지니는 변형된 퓨린 작제물을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 퓨린은 일부 기본적 활성(예를 들어, 야생형 퓨린의 활성에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 활성)을 보유하는 임의의 천연 변이체, 대안의 서열, 아이소폼 또는 돌연변이체 단백질을 포함한다. 인간 집단에서 발견되는 퓨린 돌연변이의 예는, A43E, A43G, A43V, R50W, Y64C, L77P, R81C, E97A, E97V, V109M, V109L, R130W, A139V, P169T, N245S, E271K, Q339R, N407S, E457Q, R464W, K469R, S524Y, T536S, L570F, D624N, A642T, S685P, V728I, V735I, R745Q, P772L 및 A793T를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 퓨린 폴리펩타이드는 또한 번역후 변형을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 퓨린은 잔기 S773 및 S775에서 인산화되는 것으로 나타났고, 퓨린은 잔기 N387, N440 및 N553에서 글라이코실화되는 것으로 예측되었다.
본 개시내용의 내용에서, 퓨린 단백질은 재조합 퓨린 폴리펩타이드뿐만 아니라 공급 물질(예를 들어, 조직 또는 혈액)로부터 단리된 천연 퓨린 폴리펩타이드를 포함한다. 퓨린 폴리펩타이드(재조합체 및 공급원 정제됨)는 임의의 적합한 유기체, 예를 들어 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이와 같은 포유류 및 이들의 생물학적으로 활성인 유도체로부터 유래될 수 있다. VWF 절단 활성을 갖는 돌연변이체 및 변이체 퓨린 폴리펩타이드가 또한 기능적 단편 및 퓨린 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 포함된다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 퓨린 폴리펩타이드는 정제, 검출 또는 둘 다를 가능하게 하는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 퓨린 폴리펩타이드는 시험관내 또는 생체내 영상화를 위해 적합한 치료적 모이어티 또는 모이어티에 의해 추가로 변형될 수 있다.
단백질 가수 분해적으로 활성인 재조합 퓨린은 세포 배양물(예를 들어, 포유류 세포 배양물) 내 발현에 의해 제조될 수 있다. 재조합 퓨린을 제조하기 위한 발현 및 정제 방법의 비제한적 예는 WO 1991/06314호, WO 1992/09698로, 미국특허 제6,210,929호 및 제6,596,526호뿐만 아니라 미국특허출원 공개 제2009/0181423호 및 제2009/0304669호에 기재되며, 이들의 내용은 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "활성"은 전장(완전한) 단백질과 관련된 퓨린 또는 이의 일부의 기능적 활성 또는 활성들을 지칭한다. 기능적 활성은 프로단백질 기질의 단백질 가수 분해 성숙 및 시험 기질, 예컨대 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1; AMC = 7-아미노-4-메톡시 쿠마린)의 절단에 참여를 포함하는, 생물학적 활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 퓨린에 대한 기질은 폰빌레브란트 인자, 프로부갑상선 호르몬, 형질전환생장인자 베타 1 전구체, 프로알부민, 프로-베타-세크레타제, 막 유형-1 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 프로-신경 성장 인자의 베타 서브유닛을 포함한다. 일 실시형태에서, 퓨린 활성의 한 유닛(unit: U)은 분 당 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1)로부터 AMC의 1p㏖을 방출시키는 퓨린의 양으로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "안정성"(예컨대, 퓨린 안정성 또는 퓨린 제형 안정성)은 구조적 맥락에서, 예를 들어 단백질의 구조적 완전함에 대해 또는 기능적 맥락에서, 예를 들어 시간에 따라 그것의 기능 및/또는 활성을 보유하는 단백질 능력에 대해 사용된다. 인식될 바와 같이, 논의 하의 단백질은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제형 내에 함유될 수 있고, 해당 단백질의 안정성은 해당 제형 내 그것의 안정성을 지칭한다. 일 실시형태에서, 퓨린 조성물의 안정성은 조성물의 퓨린 활성을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1; 예를 들어, 엔조 라이프 사이언스(Enzo Life Sciences)에 의해 시판되는 ALX-260-040-M001)와 같은 검출가능한 퓨린 기질을 사용함으로써, 예를 들어, 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조로서 포함되는 문헌[Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402]에 기재된 바와 같은 분석에서 결정된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제와 함께 제형화된 퓨린 조성물의 안정성은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없이 제형화된 퓨린 조성물과 비교된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "저장 안정적인" 수성 퓨린 조성물은 주어진 저장 시간에 걸쳐 적어도 10%만큼 용액 내 단백질의 안정성을 증가시키기 위해 제형화된 퓨린 폴리펩타이드 용액(예를 들어, r퓨린 폴리펩타이드 용액)을 지칭한다. 본 개시내용의 내용에서, 퓨린 폴리펩타이드 용액(예를 들어, r퓨린 폴리펩타이드 용액)은 안정제로서 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제의 첨가에 의해 "저장 안정적"으로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 주어진 제형 내에서 퓨린 폴리펩타이드의 안정성은, 예를 들어 시간 기간에 걸쳐 응집물 형성, 벌크 효소 활성의 손실 또는 분해 산물의 형성을 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 제형의 절대적 안정성 및 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제의 안정화 효과는 안정화되는 특정 조성물에 의존하여 다를 것이다. 일 실시형태에서, 퓨린 조성물의 안정성은 조성물의 퓨린 활성을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 분석에서 검출가능한 퓨린 기질, 예컨대 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1; 예를 들어, 엔조 라이프 사이언스(Enzo Life Sciences)에 의해 시판되는 ALX-260-040-M001)을 사용함으로써, 예를 들어, 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조로서 포함되는 문헌[Malloy SS, et al ., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402]에 기재된 바와 같이 결정된다. 일 실시형태에서, 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제와 함께 제형화된 퓨린 조성물의 안정성은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없이 제형화된 퓨린 조성물과 비교된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "저장 수명"은 사전결정된 온도에서 사전 결정된 안정성 수준을 유지하는 시간 기간을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 사전결정된 온도는 냉동(예를 들어, -80 ℃, -25℃, 0℃), 냉장(예를 들어, 0℃ 내지 10℃), 또는 실온(예를 들어, 18℃ 내지 32℃) 저장을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "안정성의 시간"은 제형이 안정한 것으로 고려되는 시간의 길이를 지칭한다. 예를 들어, 제형에 대한 안정성의 시간은 제형 내 단백질 응집물 및/또는 분해 수준이 특정 역치 미만(예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 등)으로 남아있는 시간 길이 및/또는 제형이 저장 기간의 시작 시 제형 내에 존재하는 활성의 양의 특정 역치 초과(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% 등)의 생물학적 활성을 유지하는 시간 길이를 지칭할 수 있다.
본 개시내용의 내용에서, 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제와 함께 제형화된 퓨린 폴리펩타이드(예를 들어, r퓨린 폴리펩타이드)의 저장 안정적인 수성 조성물은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없이 제형화된 동일 퓨린 폴리펩타이드의 조성물보다 더 긴 안정성의 시간을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 퓨린 폴리펩타이드의 저장 안정적인 수성 조성물은은 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없이 제형화된 동일 조성물에 대한 안정성의 시간보다, 예를 들어 적어도 10% 초과, 또는 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 초과 또는 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없이 제형화된 동일 조성물에 대한 안정성의 시간보다 적어도 2배 초과, 또는 적어도 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10배 이상인 안정성의 시간을 가질 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "저장"은 일단 제조되면 제형이 피험체에게 즉시 투여되지 않거나 또는 생산 공정 중에 이용되지 않지만, 사용 전 특정 조건(예를 들어, 특정 온도) 하에서 시간 기간 동안 유지된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 퓨린 제형은 냉동(예를 들어, -80℃, -25℃, 0℃), 냉장(예를 들어, 0℃ 내지 10℃), 또는 실온(예를 들어, 18℃ 내지 32℃)와 같은 상이한 온도 하에서 피험체에 투여 전 며칠, 몇 주, 몇 개월 또는 몇 년 동안 유지될 수 있다. 인식될 바와 같이, 이러한 제형은 액체이거나 또는 동결건조된 제형일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "약"은 구체화된 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10%의 대략의 범위를 의미한다. 예를 들어, 언어 "약 20%"는 18 내지 22%의 범위를 포함한다.
조성물의 개개 성분의 농도를 지칭할 때, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 어구 "X 이하" 및 "0 내지 X"는 동일하며, 0과 X를 포함하여 0 내지 X의 임의의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 어구 "2% 이하의 농도" 및 "0% 내지 2%의 농도"는 동일하며, 0%, 1% 및 2%를 포함한다.
조성물의 개개의 성분의 농도를 지칭할 때, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 어구 "X 이하"는 X 이상의 임의의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 어구 "98% 이하의 농도"는 98%, 99% 및 100%를 포함한다.
조성물의 개개 성분의 농도를 지칭할 때, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 어구 "X 내지 Y" 및 "X로부터 X의"는 동일하며, X 및 Y를 포함하여 X와 Y 사이의 임의의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 어구 "49% 내지 51%의 농도" 및 "49%로부터 51%의 농도"는 동일하며, 49%, 50% 및 51%를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "당"은 화학식 CxH2yOy(선형) 또는 CxH(2y-1)Oy(사이클릭)을 갖는 단당류 및 탈수 반응을 통해 형성된 2개의 단당류 단위로 이루어진 이당류를 지칭한다. 단당류는 그것들이 함유하는 탄소 원자의 수에 의해 분류될 수 있으며, 그것들은 이탄당(2), 트라이오스(3), 테트로오스(4), 펜토스(5), 헥소스(6), 헵토스(7) 등을 함유한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, C(X) 당은 X개-탄소 분자의 수를 함유하는 당을 지칭한다. 예를 들어, C(5) 당은 펜토스 당을 지칭하는 한편, C(6) 당은 헥소스 당을 지칭한다. 본 명세서에 제공되는 제형에 사용될 수 있는 당의 비제한적 예는 이탄당 당 글라이코알데하이드, 트라이오스 당 글라이세르알데하이드 및 다이하이드록시아세톤; 테트로오스 당 에리트로스, 트레오스 및 에리트룰로스; 펜토스 당 아라비노스, 릭소스, 리보스, 자일로스, 리불로스 및 자일로스; 헥소스 당 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 사이코스, 프럭토스, 솔보스 및 타가토스; 헵토스 당 세도헵툴로스, 만노헵툴로스 및 L-글라이세로-D-만노-헵토스; 및 이들로부터 형성된 이당류 당의 모든 가능한 조함물, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 수크로스, 락툴로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 코지비오스, 니게로스, 아이소말토스, β,β-트레할로스, α,β-트레할로스, 소포로스, 라미나리비오스, 겐티오비오스, 투라노스, 말툴로스, 팔라티노스, 겐티오비울로스, 만노비오스, 멜리비오스, 멜리비울로스, 루티노스, 루티눌로스 및 자일로비오스를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "당 알코올"은 단당류 또는 이당류의 수화된 형태를 지칭하며, 이것의 카보닐기는 환원되어 1차 또는 2차 하이드록실을 형성하였다. 일 실시형태에서, 당 알코올은 약 4개 내지 약 8개의 탄소 원자를 가진다. 본 명세서에 제공되는 제형에서 사용될 수 있는 당 알코올의 비제한적 예는 글라이콜, 글라이세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 리비톨, 푸시톨, 이디톨, 볼미톨, 아이소말트, 말티톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "약제학적으로 허용가능한 염"은 약물 제형에서 피험체(예를 들어, 인간)에 투여를 위하 안전한 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 선택 및 사용은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Stahl and Wermuth, Pharmaceutical Salts : Properties , Selection , and Use , 2nd Revised edition, Wiley, Hoboken, New Jersey]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "비이온성 계면활성제"는 생리적으로 적절한 조건 하에서 비이온화된 표면 활성제를 지칭한다. 본 명세서에 제공된 안정화된 수성 퓨린 조성물에 대해 유용한 비이온성 계면활성제의 비제한적 예는: 비이온성 수용성 모노-, 다이- 및 트라이-글라이세라이드(예를 들어, 프로필렌 글라이콜 다이카필레이트/다이카프레이트(예를 들어 미글라이올(MIGLYOL)(등록상표) 840), 중간 쇄 모노- 및 다이글라이세라이드(예를 들어 캡뮬(CAPMUL)(등록상표) 및 임위토르(IMWITOR)(등록상표) 72), 중간쇄 트라이글라이세라이드(예를 들어 카프릴 및 카프릭 트라이글라이세라이드, 예컨대 LAVRAFAC, 미글라이올(등록상표) 810 또는 812, 크로다몰(CRODAMOL)(등록상표) GTCC-PN 및 SOFTISON 378), 장쇄 모노글라이세라이드(예를 들어 글라이세릴 모노올레이트, 예컨대 페세올(PECEOL)(등록상표) 및 글라이세릴 모노리놀리에이트, 예컨대 메이신(MAISINE)(등록상표)), 폴리옥실 피마자 오일(예를 들어, 마크로골글라이세롤 리시놀리에이트, 마크로골글라이세롤 하이드록시스테아레이트, 마크로골 세토스테아릴 에터)); 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 모노- 및 다이-지방산 에스터; 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터(예를 들어, 솔비탄 모노라우레이트, 예컨대 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노라우레이트(트윈(TWEEN) 20) 및 솔비탄 모노라우레이트(스팬(SPAN) 20); 솔비탄 모노팔미테이트, 예컨대 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노팔미테이트(트윈(TWEEN) 40) 및 솔비탄 모노팔미테이트(스팬(SPAN) 40); 솔비탄 모노스테아레이트, 예컨대 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노스테아레이트(트윈(TWEEN) 60) 및 솔비탄 모노스테아레이트(스팬(SPAN) 60); 솔비탄 모노올레이트, 예컨대 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트(트윈(TWEEN) 80) 및 솔비탄 모노올레이트(스팬(SPAN) 80); 솔비탄 트라이올레이트, 예컨대 솔비탄 트라이올레이트(스팬(SPAN) 85); 및 솔비탄 트라이스테아레이트, 예컨대 솔비탄 트라이스테아레이트(스팬(SPAN)65)); 폴리글라이콜화된 글라이세라이드(예를 들어, 라우로일 마크로골-6 글라이세라이드(라브라필(Labrafil)(등록상표) M2130CS); d-α-토코페릴 폴리에틸렌글라이콜 1000 숙시네이트(TPGS), 폴리에틸렌글라이콜 660 12-하이드록시스테아레이트(SOLUTOL(등록상표) HS 15), 폴리옥실 올레이트 및 스테아레이트(예를 들어 PEG 400 모노스테아레이트 및 PEG 1750 모노스테아레이트)); 비이온성 수용성 트라이블록 공중합체(예를 들어 폴리(에틸렌옥사이드)/폴리-(프로필렌옥사이드)/폴리(에틸렌옥사이드) 트라이블록 공중합체, 예컨대 옥시란 BHT를 지니는 메틸-옥시란 중합체(플루로닉(PLURONIC)(등록상표) F-127))를 포함한다.
일 실시형태에서, 비이온성 수용성 모노글라이세라이드, 비이온성 수용성 다이글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이글라이세라이드, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 모노지방산 에스터, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 이지방산 에스터, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 비이온성 폴리글라이콜화된 글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이블록 공중합체, 및 이들의 조합물로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 함유하는 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "생물학적으로 활성인 유도체"는 퓨린 폴리펩타이드의 내용에서 사용될 때, 또한 재조합 DNA 기법을 통해 얻어지는 폴리펩타이드를 포함한다. 이는 (i) 유전자 조작, 예를 들어 RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 재조합 DNA의 생성 단계, (ii) 형질감염에 의해, 예를 들어 전기천공법 또는 미세주입법을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 재조합 DNA의 도입 단계, (iii) 상기 형질전환된 세포를, 예를 들어 연속적 또는 회분식 방식으로 배양시키는 단계, (iv) 퓨린 단백질을, 예를 들어 구성요소로서 또는 유도 시 발현시키는 단계, 및 (v) 상기 퓨린 단백질을, 예를 들어 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 채취함으로써 단리시켜서, (vi) 실질적으로 정제된 재조합 퓨린 단백질을 얻는 단계, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 크리 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 얻는 단계를 위해 당업계에서 어떤 공지된 방법을 포함한다. 용어 "생물학적으로 활성인 유도체"는 예를 들어, 포유류, 특히 인간의 순환계에서 퓨린 단백질의 반감기와 같은 생물학적/약리학적 특성을 개선시키기 위해, 예를 들어 퓨린 단백질 또는 이들의 기능적 단편과 같은 키메라 분자를 제2 폴리펩타이드, 예를 들어 폴리펩타이드, 예를 들어, 면역글로뷸린 Fc 도메인 또는 알부민 도메인과 조합하여 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 바와 같은, 단수 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는다면 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "완충제"에 대핸 언급은 하나의 작용제 또는 이러한 작용제의 혼합물을 지칭하며, "해당 방법"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법 등에 대한 언급을 포함한다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것돠 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물에 기재되고, 현재 기재된 발명과 함께 사용될 수 있는 장치, 조성물, 제형 및 방법을 기재하고, 개시하는 목적을 위해 본 명세서에 참조로서 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 이는 각각의 사이에 있는 값, 달리 명확하게 표시되지 않는다면, 해당 범위의 상한과 하한 사이 및 언급된 범위 내에서 임의의 다른 언급되거나 또는 사이에 있는 값이 하한의 단위의 1/10까지 본 발명 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 본 발명에 포함되며, 언급된 범위에서 어떤 구체적으로 제외된 한도가 적용된다. 언급된 범위가 상한과 하한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한도 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "BDS"는 "벌크 약물 물질(Bulk Drug Substance)"을 지칭한다.
III . 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 퓨린, 예를 들어 r퓨린의 안정화된 수성 제형을 제공한다. 다음의 실시형태는 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제의 포함이 당, 당 알코올, 및/또는 비이온성 계면활성제가 없는 조성물에 비해 수성 퓨린 조성물을 안정화한다는 발견에 부분적으로 기초한다.
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 실시형태에 따라 제형화된 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)은 명확하게 개시된 성분에 추가로 용액 성분 또는 pH 변형제의 포함이 원인이 된 반대 이온, 예를 들어, 아세테이트 염, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이 원인이 된 나트륨 또는 칼륨, 또는 염화칼슘 또는 염산이 원인이 된 염산염을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 내용에서, 주어진 제형으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 저장 안정적인 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린)은 특정 pH에서 제형 공정에 의해 필요한 바와 같은 하나 이상의 반대 이온을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 저장 안정적인 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)은 시간 기간 동안 실온(즉, 18℃ 내지 32℃)에서 안정화될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 저장 안정적인, 수성 면역글로뷸린 조성물은 실온에서 적어도 4일 동안 저장될 때 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 21일, 28일 이상 동안 실온에서 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1개월 동안 안정할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 36개월, 37개월, 38개월, 39개월, 40개월, 41개월, 42개월, 43개월, 44개월, 45개월, 46개월, 47개월, 48개월 이상 동안 안정할 것이다. 특정 실시형태에서, 실온은 20℃ 내지 30℃, 21℃ 내지 29℃, 22℃ 내지 28℃, 23℃ 내지 27℃, 24℃ 내지 26℃, 또는 약 25℃를 지칭한다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 저장될 때 연장된 시간 기간 동안 안정할 것이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 저장 안정적인 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)은 시간 기간 동안 냉장 온도(즉, 2℃ 내지 10℃)에서 안정화될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 저장 안정적인, 수성 면역글로뷸린 조성물은 적어도 4일 동안 냉장 온도에서 저장될 때 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 21일, 28일 이상 동안 냉장 온도에서 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1개월 동안 안정할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 36개월, 37개월, 38개월, 39개월, 40개월, 41개월, 42개월, 43개월, 44개월, 45개월, 46개월, 47개월, 48개월 이상 동안 안정할 것이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 저장될 때 연장된 시간 기간 동안 안정할 것이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 저장 안정적인 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)은 시간 기간 동안 상승된 온도(즉, 32℃ 내지 42℃)에서 안정할 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 저장 안정적인, 수성 면역글로뷸린 조성물은 적어도 4일 동안 상승된 온도에서 저장될 때 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 21일, 28일 이상 동안 상승된 온도에서 안정할 것이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 1개월 동안 안정할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 36개월, 37개월, 38개월, 39개월, 40개월, 41개월, 42개월, 43개월, 44개월, 45개월, 46개월, 47개월, 48개월 이상 동안 안정할 것이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 35℃ 내지 40℃의 온도에서 저장될 때 연장된 시간 기간 동안 안정할 것이다.
일 실시형태에서, 조성물이 저장 기간의 시작시(예를 들어, 시점 = 0) 존재하는 퓨린 활성의 적어도 40%를 유지하는 한, 저장된 퓨린 조성물은 저장 안정적인 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 조성물이 저장 기간의 시작시(예를 들어, 시점 = 0) 존재하는 퓨린 활성의 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상을 유지하는 한, 저장된 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 일 실시형태에서, 퓨린 활성은 문헌[Malloy SS, et al., J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16396-402]에 기재된 바와 같은 분석으로 측정된다.
일 실시형태에서, 퓨린 조성물은 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 시간 기간 동안 저장 후 조성물이 적어도 10% 초과의 퓨린 활성을 함유할 때, 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화되는 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 퓨린 조성물은 시간 기간 동안 저장 후 조성물이 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상의 백분율의 퓨린 활성을 더 함유할 때, 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화되는 것으로 고려된다.
일 실시형태에서, 응집된 상태로 존재하는 퓨린의 백분율이 50% 이하인 한, 저장된 퓨린 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 응집된 상태로 존재하는 퓨린의 백분율이 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하로 남아있는 한, 저장된 퓨린 조성물은 안정한 것으로 고려된다.
일 실시형태에서, 조성물은 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 시간 기간 동안 저장 후 응집된 상태로 존재하는 퓨린을 적어도 10% 미만으로 함유할 때, 퓨린 조성물은 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화되는 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 퓨린 조성물은 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 시간 기간 동안 저장 후 조성물이 응집된 상태로 존재하는 퓨린을 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상의 백분율을 덜 함유할 때, 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화된 것으로 고려된다.
일 실시형태에서, 조성물이 기계적 스트레스를 받은 후, 시작되는 퓨린 활성(예를 들어, 시간 = 0에서)의 적어도 40%를 유지하는 한 저장된 퓨린 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 조성물이 기계적 스트레스를 받은 후, 조성물이 시작되는 퓨린 활성(예를 들어, 시간 = 0에서)의 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상을 유지하는 한 저장된 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 구체적 실시형태에서, 기계적 스트레스는 교반(예를 들어, 진탕)이다.
일 실시형태에서, 조성물이 기계적 스트레스를 받은 후 적어도 10% 초과의 퓨린 활성을 함유할 때, 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 퓨린 조성물은 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화된 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 조성물이 기계적 스트레스를 받은 후 퓨린 활성을 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상의 백분율만큼 더 함유할 때, 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해, 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화된 것으로 고려된다. 구체적 실시형태에서, 기계적 스트레스는 교반(예를 들어, 진탕)이다.
일 실시형태에서, 기계적 스트레스를 받은 후 응집된 상태로 존재하는 퓨린의 백분율이 50% 이하로 남아있는 한 저장된 퓨린 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 기계적 스트레스를 받은 후 응집된 상태로 존재하는 퓨린의 백분율이 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하로 존재하는 한, 저장된 퓨린 조성물은 안정한 것으로 고려된다. 구체적 실시형태에서, 기계적 스트레스는 교반(예를 들어, 진탕)이다.
일 실시형태에서, 기계적 스트레스를 받은 후 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해 조성물이 응집된 상태로 존재하는 적어도 10% 미만의 퓨린을 함유할 때, 퓨린 조성물은 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화된 것으로 고려된다. 다른 실시형태에서, 기계적 스트레스를 받은 후 안정제를 함유하지 않거나 또는 더 낮은 양의 안정제를 함유하는 퓨린 조성물에 비해 조성물이 응집된 상태로 존재하는 퓨린을 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상 덜 함유할 때, 퓨린 조성물은 안정제(예를 들어, 당, 당 알코올 또는 비이온성 계면활성제)의 첨가에 의해 안정화된 것으로 고려된다. 구체적 실시형태에서, 기계적 스트레스는 교반(예를 들어, 진탕)이다.
본 출원에 기재된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형이 동결건조되고, 표시된 농도로 재구성될 수 있지만, 이들 제제는 또한 더 희석된 형태로 재구성될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 동결건조되고/되거나 보통 2㎖ 용액 중에서 재구성되는 본 개시내용에 따른 제제는 또한 5㎖와 같은 더 큰 용적의 희석제 중에서 재구성될 수 있다. 마찬가지로, 동결건조된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 또한 더 농축된 형태로 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조되고/되거나 보통 보통 2㎖ 용액 중에서 재구성되는 본 개시내용에 따른 제제는 또한 1㎖와 같은 더 작은 용적 중에서 재구성될 수 있다.
유리하게는, 일 양태에서, 본 발명의 고도로 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 얻어진 조성물이 생산 방법에서, 예를 들어 rVWF의 성숙에서(또한 본 명세서에서 "rVWF 성숙 방법"으로서 칭해짐) 사용될 때, 증가된 퓨린 회복을 부여하는 희석제와 조합된다. 프로-폰빌레브란트 인자(vWF)의 그것의 활성 형태로의 성숙은 잔기 763에서 한 쌍의 이염기성 아미노산(-Lys-Arg-) 다음에 단백질 가수 분해 처리를 필요로 한다. vWF는 짝지어진 이염기성 아미노산 절단 효소 퓨린에 의해 우선적으로 처리되는 것으로 나타났다. 따라서 vWF에 대한 생성 과정은 바람직하게는 고도로 안정화된 제형에서 퓨린의 사용을 포함한다. 추가 양태에서, 본 희석제 중의 고도로 안정화된 제형은 대조군 희석제 중에 위치된 대조군 제형에 비해 3 내지 4배만큼 rVWF 성숙 단계에서 퓨린 활성 회복을 증가시킨다.
특정 양태에서, 본 발명의 고도로 안정화된 제형은 적어도 6개월의 저장 수명을 가진다. 인식될 바와 같이, 이 저장 수명은 액체 또는 동결건조된 형태로 냉동 온도(즉, -80℃, -25℃, 0℃), 냉장(0℃ 내지 10℃), 또는 실온(20℃ 내지 32℃)에서 일 수 있다. 추가 양태에서, 본 발명의 고도로 안정화된 제형은 적어도 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월 또는 60개월의 저장 수명을 가진다.
추가 양태에서 그리고 상기에 따라서, 저장 수명은 상기 시간 기간 중 어떤 기간 동안 상기 온도 중 어떤 온도에서 저장 후 남아있는 활성 백분율만큼 결정된다. 특정 실시형태에서, 저장 수명은 제형이 상기 온도 중 어떤 온도에서 상기 시간 양 중 어떤 시간 동안 저장 전 활성에 비해 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 분석 중 어떤 것에 의해 측정되는 바와 같은 퓨린 활성의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%를 보유한다는 것을 의미한다.
일 양태에서, 본 개시내용에 따른 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 고도로 안정화된 제형은 하기를 포함한다: (a) 8,000 U/㎖ - 57,000 U/㎖ 퓨린(예를 들어, r퓨린); (b) 190mM 염화나트륨; (c) 0.92mM 염화칼슘; (d) 10% w/w 트레할로스 2수화물; (e) 75ppm 폴리솔베이트 80; (f) 45mM 아세트산; 및 (g) 46mM HEPES.
특정 양태에서, 본 개시내용의 고도로 안정화된 제형은 다음의 성분: 47mM HEPES, 46mM 아세트산, 195mM 염화나트륨, 0.094mM 염화칼슘, 0.0075 % 폴리솔베이트 80, 10% w/w 트레할로스 2수화물, pH 6.0을 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용에 따른 r퓨린을 포함하는 퓨린의 고도로 안정화된 제형은 (a) 약 5,500 U/㎖ 내지 55,000 U/㎖; 6,000 U/㎖ 내지 50,000 U/㎖; 6,500 U/㎖ 내지 45,000 U/㎖; 7,000 U/㎖ 내지 40,000 U/㎖; 7,500 U/㎖ 내지 35,000 U/㎖; 8,000 U/㎖ 내지 30,000 U/㎖; 8,500 U/㎖ 내지 25,000 U/㎖; 9,000 U/㎖ 내지 20,000 U/㎖; 9,500 U/㎖ 내지 15,000 U/㎖; 또는 10,000 U/㎖ 퓨린; (b) 약 100mM 내지 300mM, 110mM 내지 280mM, 120mM 내지 260mM, 130mM 내지 240mM, 140mM 내지 220mM, 150mM 내지 200mM, 또는 160mM 내지 180mM 염화나트륨; (c) 약 0.5mM 내지 9mM, 1mM 내지 8mM, 1.5mM 내지 7mM, 2mM 내지 6mM, 2.5mM 내지 5mM, 또는 3mM 내지 4.5mM 염화칼슘; (d) 약 0.5% 내지 19%, 1% 내지 18%, 1.5% 내지 17%, 2.0% 내지 16%, 2.5% 내지 15%, 3.0% 내지 14%, 3.5% 내지 13%, 4.0% 내지 12%, 4.5% 내지 11%, 5.0% 내지 10%, 5.5% 내지 9%, 또는 6.0% 내지 8% 트레할로스 2수화물; (e) 약 0.5ppm 내지 140ppm, 1.0ppm 내지 130ppm, 10ppm 내지 120ppm, 20ppm 내지 110ppm, 30ppm 내지 100ppm, 40ppm 내지 95ppm, 50ppm 내지 90ppm, 55ppm 내지 85ppm, 60ppm 내지 80ppm 또는 70ppm 내지 75ppm 폴리솔베이트 80; (f) 약 25mM 내지 90mM, 30mM 내지 80mM, 35mM 내지 70mM, 40mM 내지 60mM, or 45mM 내지 50mM 아세트산, 및 (g) 15mM 내지 95mM, 20mM 내지 90mM, 25mM 내지 85mM, 30mM 내지 80mM, 35mM 내지 75mM, 40mM 내지 70mM, 45mM 내지 65mM, 또는 50mM 내지 60mM HEPES를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 퓨린(예를 들어, r퓨린), 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 50mM 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 10mM 칼슘, 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5을 포함하는 안정화된 수성 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린)을 제공한다. 구체적 실시형태에서, 당은 펜토스 또는 헥소스 당이다.
일 실시형태에서, 안정화된 수성 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린)은 퓨린(예를 들어, r퓨린), 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염; 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 20%의 당 또는 당 알코올; 100 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제; 10 내지 200mM 완충제; 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당은 펜토스 또는 헥소스 당이다.
구체적 실시형태에서, 본 발명의 고도로 안정화된 제형은 다음의 성분: 47mM HEPES, 46mM 아세트산, 195mM 염화나트륨이다, 0.094mM 염화칼슘, 0.0075% 폴리솔베이트 80, 10% w/w 트레할로스 2수화물, pH 6.0을 포함한다.
다른 구체적 실시형태에서, 본 발명에 따른 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 고도로 안정화된 제형은 (a) 8,000 내지 57,000 U/㎖ r퓨린; (b) 190mM 염화나트륨; (c) 0.92mM 염화칼슘; (d) 10% w/w 트레할로스 2수화물; (e) 75ppm 폴리솔베이트 80; (f) 45mM 아세트산; 및 (g) 46mM HEPES를 포함한다.
A. 안정제
유리하게는, 당, 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 포함은 수성 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물을 안정화시키는 것으로 발견되었다. 이들 효과는 본 명세서에 제공된 실시예에서 입증된다. 예를 들어, 이들 작용제의 첨가는 액체 저장 시 퓨린 활성 보유를 증가시키고, 액체 저장 시 퓨린 폴리펩타이드의 응집을 감소시키며, 액체 저장 시 퓨린 폴리펩타이드의 분해를 감소시키고, 수성 퓨린 조성의 교반 시 퓨린 활성의 손실을 감소시키며, 수성 퓨린 조성물의 교반에 의해 야기되는 응집을 감소시킨다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올 및 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 수성 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)을 제공한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올 및 10ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올 및 75±25ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 당 또는 당 알코올 및 75ppm의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 표 1 내지 표 9에서 발견되는 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물을 포함한다.
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1. 당 및 당 알코올
유리하게는, 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)에 당 및/또는 당 알코올의 첨가는 조성물의 저장 안정성을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 도 17 내지 20 및 22 내지 25에서 나타내는 바와 같이, 2%만큼 적은 당 및/또는 당 알코올의 포함은 적어도 20%만큼 저장 퓨린 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다. 그리고, 10% 당 및/또는 당 알코올의 포함은 적어도 75%만큼 저장 퓨린 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일 양태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적 조성물은 당 및/또는 당 알코올의 안정화 양을 함유한다.
일 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적 조성물은 단당류 당을 함유한다. 특정 실시형태에서, 단당류 당은 이탄당 당, 트라이오스 당, 테트로오스 당, 펜토스 당, 헥소스 당, 헵토스 당 및 옥토스 당으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 당은 펜토스 당, 헥소스 당, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 당은 헥소스 당이다.
다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물은 이당류 당을 함유한다. 특정 실시형태에서, 이당류 당은 펜토스 및/또는 헥소스 단당류로부터 형성된 이당류 당으로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 당은 헥소스 단당류로부터 형성된 이당류 당으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 또는 이들의 조합물이다. 일 구체적 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 당은 트레할로스 2수화물로서 조제된다.
다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물은 당 알코올을 함유한다. 특정 실시형태에서, 당 알코올은 글라이콜, 글라이세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 리비톨, 푸시톨, 이디톨, 볼미톨, 아이소말트, 말티톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 당 알코올은 만니톨이다.
또 다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 안정한 조성물은 당과 당 알코올의 혼합물을 함유한다. 일 실시형태에서, 혼합물은 단당류, 이당류 및 당 알코올 중 적어도 2종을 함유한다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 펜토스 및/또는 헥소스 단당류 및 당 알코올로부터 형성된 펜토스 당, 헥소스 당, 이당류 중 적어도 2종을 함유한다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 수크로스, 트레할로스 및 만니톨 중 적어도 2종을 함유한다.
일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 2% 내지 20%, 2% 내지 17.5%, 2% 내지 15%, 2% 내지 12.5%, 2% 내지 10%, 2% 내지 9%, 2% 내지 8%, 2% 내지 7%, 5% 내지 20%, 5% 내지 17.5%, 5% 내지 15%, 5% 내지 12.5%, 5% 내지 10%, 7.5% 내지 20%, 7.5% 내지 17.5%, 7.5% 내지 15%, 7.5% 내지 12.5%, 10% 내지 20%, 10% 내지 17.5%, 10% 내지 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5±1%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%로부터의 농도로 존재한다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50mM 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5을 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 2% 내지 20% 트레할로스, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 트레할로스 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 20% 트레할로스, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 트레할로스 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 10±5% 당 또는 당 알코올, 90±25mM 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 10 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 당 또는 당 알코올을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 10±5% 당 또는 당 알코올, 10 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 당 또는 당 알코올을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 10±5% 트레할로스, 10 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 트레할로스를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 트레할로스를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 트레할로스를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 트레할로스 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 10±5% 당 또는 당 알코올, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 10 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 당 또는 당 알코올을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 10±5% 당 또는 당 알코올, 75ppm 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 당 또는 당 알코올을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 당 또는 당 알코올을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 10±5% 트레할로스, 75ppm 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±2% 트레할로스를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10±1% 트레할로스를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 10% 트레할로스를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 트레할로스 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제형에 사용된 안정제는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 라피노스 및 알기닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 군으로부터 선택된다. 이들 작용제는 0.1% 내지 20%의 양으로 본 발명의 제형에 존재한다. 특정 실시형태에서, 안정제는 5% 내지 15% 또는 약 10%의 양으로 존재한다. 추가 실시형태에서, 본 개시내용의 제형은 0.5% 내지 19%, 1% 내지 18%, 1.5% 내지 17%, 2.0% 내지 16%, 2.5% 내지 15%, 3.0% 내지 14%, 3.5% 내지 13%, 4.0% 내지 12%, 4.5% 내지 11%, 5.0% 내지 10%, 5.5% 내지 9% 또는 6.0% 내지 8%의 양으로 안정제를 포함한다. 특정 제형은 본 명세서에 개시된 화합물의 임의의 다른 제형 중 하나 이상과 조합물로 만니톨, 수크로스 및/또는 트레할로스를 포함한다.
2. 비이온성 계면활성제
유리하게는, 퓨린 조성물(예를 들어, r퓨린 조성물)에 당 비이온성 계면활성제의 첨가는 기계적 스트레스에 대해 조성물의 안정성을 증가시킨다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 도 31 내지 42에서 나타내는 바와 같이 10ppm만큼 적은 비이온성 계면활성제의 포함은 적어도 25%만큼 기계적 스트레스를 받을 때 퓨린 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다. 그리고, 50ppm 비이온성 계면활성제의 포함은 기계적 스트레스를 받을 때 적어도 40%만큼 퓨린 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일 양태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물은 비이온성 계면활성제의 안정제를 함유한다.
일 실시형태에서, 비이온성 수용성 모노글라이세라이드, 비이온성 수용성 다이글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이글라이세라이드, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 모노지방산 에스터, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 이지방산 에스터, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 비이온성 폴리글라이콜화된 글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이블록 공중합체 및 이들의 조합물로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 함유하는 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 10 내지 200ppm, 10 내지 175ppm, 10 내지 150ppm, 10 내지 125ppm, 10 내지 100ppm, 10 내지 90ppm, 10 내지 80ppm, 10 내지 75ppm, 10 내지 70ppm, 10 내지 60ppm, 10 내지 50ppm, 10 내지 25ppm, 25 내지 200ppm, 25 내지 175ppm, 25 내지 150ppm, 25 내지 125ppm, 25 내지 100ppm, 25 내지 90ppm, 25 내지 80ppm, 25 내지 70ppm, 25 내지 60ppm, 25 내지 50ppm, 50 내지 200ppm, 50 내지 175ppm, 50 내지 150ppm, 50 내지 125ppm, 50 내지 90ppm, 50 내지 80ppm, 75 내지 200ppm, 75 내지 175ppm, 75 내지 150ppm, 100 내지 200ppm, 100 내지 175ppm, 50±25ppm, 60±25ppm, 70±25ppm, 75±25ppm, 80±25ppm, 90±25ppm, 100±25ppm, 125±25ppm, 150±25ppm, 175±25ppm, 30±10ppm, 40±10ppm, 50±10ppm, 60±10ppm, 70±10ppm, 75±10ppm, 80±10ppm, 90±10ppm, 100±10ppm, 110±10ppm, 120±10ppm, 125±10ppm, 130±10ppm, 140±10ppm, 150±10ppm, 160±10ppm, 170±10ppm, 175±10ppm, 180±10ppm, 190±10ppm, 25ppm, 30ppm, 40ppm, 50ppm, 60ppm, 70ppm, 75ppm, 80ppm, 90ppm, 100ppm, 110ppm, 120ppm, 125ppm, 130ppm, 140ppm, 150ppm, 160ppm, 170ppm, 175ppm, 180ppm, 190ppm 또는 200ppm의 농도로 존재한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50mM 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이고, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이고, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 100 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터의 조합물, 10mM 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 75±25% 비이온성 계면활성제, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이고, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터의 조합물, 90±25mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 75±25% 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 10% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm의 비이온성 계면활성제를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 10% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다. 일 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±15ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75±5ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다. 다른 구체적 실시형태에서, 조성물은 75ppm 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터를 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 계면활성제의 조합물, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이고, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘; 표 1 내지 표 9에서 발견된 변형 1 내지 6035로부터 선택된 당 또는 당 알코올 및 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터의 조합물, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
본 발명의 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 또한 계면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를, 바람직하게는 0.1ppm 내지 150ppm, 또는 65ppm 내지 80ppm, 또는 약 75ppm의 양으로 바람직하게 포함한다. 추가 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 0.5ppm 내지 140ppm, 1.0ppm 내지 130ppm, 10ppm 내지 120ppm, 20ppm 내지 110ppm, 30ppm 내지 100ppm, 40ppm 내지 95ppm, 50ppm 내지 90ppm, 55ppm 내지 85ppm, 60ppm 내지 80ppm 또는 70ppm 내지 75ppm의 양으로 계면활성제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60, 폴리솔베이트 80, 플루로닉 폴리올, 글라이세롤, 글루카마이드(예컨대, 메가 8), 트리톤, 및 Brij 35(폴리옥시에틸렌 23 라우릴 에터)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 등급의 플루로닉 폴리올(BASF 와이언도트(Wyandotte) 코포레이션에 의해 제조된 상표명 플루로닉(Pluronic) 하에 시판됨)이 이용가능하다. 여러 가지 분자량(1,000 내지 16,000)의 이들 폴리올 및 물리화학적 특성은 계면활성제로서 사용되었다. 분자량 5,000의 플루로닉 F-38과 분자량 9,000의 플루로닉 F-68은 둘 다 80% 친수성 폴리옥시에틸렌 기 및 20% 소수성 폴리옥시프로필렌 기를 함유한다(중량으로). 일 실시형태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 80이다. 특정 실시형태에서, 폴리솔베이트 80은 식물성 유래 폴리솔베이트 80이다.
B. 약제학적으로 허용가능한 염
본 명세서에 제공된 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 안정화된 조성물은 일반적으로 저장 동안 퓨린 폴리펩타이드에 의해 용인되는 농도에서 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 1가의 염산염이다. 더 구체적인 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물의 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 10mM 내지 500mM이다. 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 100mM 내지 300mM이다. 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 150mM 내지 250mM이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물 내 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180에서 선택된다.
Figure pct00019
Figure pct00020
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180로부터 선택되는 농도의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180으로부터 선택되는 농도에서 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180으로부터 선택되는 농도의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 10±5% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 일 실시형태에서, 완충제의 농도는 90±25mM. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘, 10% 당 또는 당 알코올, 75ppm 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 pH 6.0±0.2를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다, 염화칼륨이다, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일부 실시형태에서, 1가의 염산염, 예컨대 염화나트륨 및 염화칼륨이고, 본 개시내용의 제형에서 사용된다. 1가의 염산염을 포함하는 제형 성분은 주로 염화나트륨에 대해 설명되지만, 염화칼륨을 포함하는 임의의 1가의 염산염이 염화나트륨에 대한 본 명세서의 설명에 따라 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 특정 실시형태에서, 염화나트륨은 50 내지 500mM의 양으로 존재하는 제형에 포함된다. 다른 실시형태에서, 염화나트륨은 100 내지 300mM, 150 내지 250mM, 또는 약 190mM의 양으로 제형에 포함된다. 추가 실시형태에서, 염화나트륨은 100 내지 300mM, 110 내지 280mM, 120 내지 260mM, 130 내지 240mM, 140 내지 220mM, 150 내지 200mM, 또는 160 내지 180mM의 양으로 존재하는 제형에 포함된다. 구체적 실시형태에서, 제형은 본 명세서에 개시된 어떤 다른 제형 성분 중 하나 이상과 조합된 190mM 염화나트륨을 포함한다.
C. 완충제
유리하게는, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 pH 6.0 내지 7.0에서 안정화되는 것이 발견되었다. 예를 들어, 도 11 및 12에서, pH 5.5에서 제형화된 퓨린 조성물은 pH 5.0에서 제형화된 퓨린 조성물에 비해 안정한 것으로 나타난다. 또한 pH 6.0에서 제형화된 퓨린 조성물은 pH 5.5에서 제형화된 조성물에 비해 추가로 안정화된 것으로 나타난다. 더 나아가, 도 17에서 나타나는 바와 같이, pH 7.0에서 제형화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 pH 6.0에서 제형화된 조성물과 유사한 안정성을 가진다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 pH 5.5 내지 7.5에서 제형화된다. 구체적 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 pH 6.0 내지 7.0에서 제형화된다. 다른 구체적 실시형태에서, 안정화된 퓨린 조성물은 pH 6.0±0.2에서 제형화된다. 더 구체적인 실시형태에서, 안정화된 퓨린 조성물은 pH 6.0에서 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 안정화된 퓨린 조성물은 표 11에서 발견되는 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH에서 제형화된다.
Figure pct00021
Figure pct00022
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10 내지 200mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서,당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 10±5% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 10 내지 200mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 10±5% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 90±25mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 191mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘, 10% 당 또는 당 알코올, 75ppm 비이온성 계면활성제, 91mM 완충제, 및 표 11의 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 하나 이상의 완충제를 사용하여 적절한 pH에서 제형화된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 완충제는 히스티딘, 이미다졸, 포스페이트, 시트레이트, 트리스, 아세테이트(예를 들어, 아세트산), BIS-트리스 프로판, PIPES, MOPS, HEPES, MES, ACES, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다.
완충제는 시간 기간(예를 들어, 주, 개월 또는 년)에 걸쳐 저장 동안 조성물의 pH를 유지하는데 적합한 농도에서 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 제형 내 완충제의 농도는 10mM 내지 300mM이다. 다른 실시형태에서, 제형 내 완충제의 농도는 10mM 내지 200mM이다. 구체적 실시형태에서, 제형 내 완충제의 농도는 90±25mM이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물 내 완충제의 농도는 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된다.
Figure pct00023
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물은 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 저장 안정적인 퓨린 조성물 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 200ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 500mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 5mM 칼슘, 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 2% 내지 10% 당 또는 당 알코올, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 50 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 10±5% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 190±50mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.5mM 내지 2mM 칼슘, 10±5% 당 또는 당 알코올, 75±25ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
일 실시형태에서, 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 191mM의 약제학적으로 허용가능한 염, 0.9mM 칼슘, 10% 당 또는 당 알코올, 75ppm 비이온성 계면활성제, 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된 농도의 완충제, 및 pH 5.5 내지 7.5를 포함한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이고, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다. 일 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 조성물의 pH는 6.0이다. 구체적 실시형태에서, 조성물은 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린을 함유한다.
완충제는 또한 본 명세서에 기재된 어떤 다른 제형 성분 중 하나 이상과 조합물로 본 발명의 제형에 존재할 수 있다. 실시예에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 고도로 안정화된 제형은 pH 6.0에서 증가된 안정성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 고도로 안정화된 제형의 pH는 6.0 내지 8.0 또는 약 6.0의 pH의 범위에서 바람직하게 유지되어야 한다. 완충제는 히스티딘, 이미다졸, 포스페이트, 시트레이트, 트리스, 아세테이트, BIS-트리스 프로판, PIPES, MOPS, HEPES, MES 및 ACES를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 완충제로서 작용하는 능력을 갖는 임의의 생리적으로 허용가능한 화학적 독립체 또는 화학적 독립체의 조합일 수 있다. 이들 완충제 중 다수의 전체 화학적 명칭은 이하의 표 1에서 열거한다. 특정 실시형태에서, 칼슘이 약 5mM 초과의 농도에서 제형 내에 존재한다면, 포스페이트는 완충제로서 사용되지 않는다. 일부 실시형태에서, 완충제는 10mM 내지 200mM, 또는 10 내지 100mM, 또는 30 내지 60mM, 또는 약 46mM의 농도로 포함된다. 추가 실시형태에서, 개개의 완충제는 15 내지 95mM, 20 내지 90mM, 25 내지 85mM, 30 내지 80mM, 35 내지 75mM, 40 내지 70mM, 45 내지 65mM, 또는 50 내지 60mM의 농도로 포함된다. 특정 실시형태에서, 제형은 2종의 완충제를 함유한다.
대표적인 완충제
트리스 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄
BIS-트리스 프로판 1,3-비스-[트리스-(하이드록시-메틸)메틸아미노]-프로판
PIPES 피페라진-N,N'-비스-(2-에탄설폰산)
MOPS 3-{N-모폴리노)프로판설폰산
HEPES N-2-하이드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산
MES 2-(N-모폴리노)에탄설폰산
ACES N-2-아세트아미도-2-아미노에탄설폰산
특정 양태에서 본 제형은 본 명세서에 기재된 제형 성분 중 하나 이상과 조합된 카복실산을 포함한다. 추가 양태에서, 카복실산은 바람직하게는 아세트산(예를 들어, 아세테이트)이다. 특정 실시형태에서, 제형은 20mM 내지 100mM 아세트산, 또는 30mM 내지 50mM, 또는 약 45mM 아세트산 또는 임의의 다른 카복실산을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제형은 25mM 내지 90mM, 30mM 내지 80mM, 35mM 내지 70mM, 40mM 내지 60mM, 또는 45mM 내지 50mM 아세트산 또는 임의의 다른 카복실산을 포함한다.
D. 추가적인 제형 성분
본 개시내용의 고도로 안정화된 제형은 퓨린, 예를 들어, r퓨린 및 안정제, 완충제, 염화나트륨, 염, 및 다른 부형제 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 성분은 이하에 추가로 상세하게 설명된다. 인식될 바와 같이, 본 명세서에 기재된 제형 성분 중 하나 이상 중 어떤 것은 단독으로 또는 임의의 조합물로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 고도로 안정화된 퓨린 제형은 대조군 또는 출발 제형에 비해 전단(교반), 동결건조 및 냉동/해동 스트레스뿐만 아니라 용기 표면에서 생성물 손실 또는 변성에 대한 저항성에 대해 증가된 안정성을 나타낸다.
퓨린은 5,000 내지 500,000 U/㎖의 농도로 본 개시내용의 제형에 포함된다. 특정 실시형태에서, 퓨린은 5,500 내지 55,000, 6,000 내지 50,000, 6,500 내지 45,000, 7,000 내지 40,000, 7,500 내지 35,000, 8,000 내지 30,000, 8,500 내지 25,000, 9,000 내지 20,000, 9,500 내지 15,000, 및 약 10,000 U/㎖의 농도로 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 퓨린은 표 14에서 발견되는 변형 6470 내지 6533으로부터 선택된 농도에서 본 개시내용의 제형에 포함되며, ㎖ 당 퓨린 활성의 수천개의 단위로 보고되었다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용의 고도로 안정화된 제형에 함유된 퓨린은 r퓨린이다.
Figure pct00024
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 안정화된 조성물의 퓨린(예를 들어, r퓨린) 농도는 조성물에 존재하는 퓨린의 질량으로서 표현될 수 있다. 일 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)은 100 ng/㎖ 내지 100 ㎎/㎖의 농도로 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정화된 조성물로 존재한다. 다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)은 1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎎/㎖의 농도에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정화된 조성물로 존재한다. 다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정화된 조성물로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)은 표 15에서 발견되는 변형 6534 내지 6638로부터 선택된 농도에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정화된 조성물에 존재한다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용의 고도로 안정화된 제형에 함유된 퓨린은 r퓨린이다.
Figure pct00025
Figure pct00026
본 개시내용의 일 양태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 칼슘 또는 다른 2가의 금속 양이온을 포함한다. 추가 양태에서, 2가의 양이온은 염, 바람직하게는 염산염으로서 존재한다. 특정 실시형태에서, 2가의 양이온 염의 0.1mM 내지 10mM 또는 0.5mM 내지 2mM, 또는 약 0.92mM이 사용될 수 있다. 또한 추가 실시형태에서, 2가의 양이온 염의 0.5mM 내지 9mM, 1mM 내지 8mM, 1.5mM 내지 7mM, 2mM 내지 6mM, 2.5mM 내지 5mM, 또는 3mM 내지 4.5mM이 본 발명의 제형에 사용된다. 칼슘 염이 사용될 때, 이는 바람직하게는 염화칼슘이지만, 또한 다른 칼슘 염, 예컨대 칼슘 글루코네이트, 칼슘 글루비오네이트 또는 칼슘 글루셉테이트일 수 있다. 칼슘을 포함하는 2가의 양이온은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다른 제형 성분과의 조합물로 포함될 수 있다. 본 명세서에 제공된 제형에서 유용한 2가의 금속 양이온의 비제한적 예는 칼슘, 바륨, 망간, 마그네슘, 코발트, 구리, 니켈 및 아연을 포함한다.
일부 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 항산화제를 포함한다. 수성 및 동결건조된 제형에 항산화제의 첨가는 이들 제형의 안정성을 개선시키는 것으로 발견되었고, 따라서 그것의 저장 수명을 연장시킨다. 사용된 항산화제는 약제학적 제제와 함께 사용에 적합하여야 하고, 추가로 바람직하게는 수용성이다. 제형에 항산화제를 첨가할 때, 항산화제의 자발적 산화를 피하기 위해 가능한 동결건조 전 과정만큼 늦게 이러한 항산화제를 첨가하는 것이 바람직하다. 이하의 표 2는 적합한 항산화제를 열거하는데, 이는 칼바이오켐(Calbiochem) 및 시그마(Sigma)와 같은 회사를 통해 상업적으로 입수가능하다.
대표적인 항산화제
N-아세틸-L-시스테인 / 호모시스테인
글루타티온
6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산(트롤록스(Trolox))
리폰산
메티오닌
티오황산나트륨
백금
글라이신-글라이신-히스티딘(트라이펩타이드)
뷰틸화된 하이드록시 톨루엔(BHT)
항산화제의 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 1.0 ㎎/㎖ 범위의 농도가 사용될 수 있고, 더 높은 농도가 또한 유용한 것으로 믿어진다(동결건조된 생성물의 유리 전이 온도의 억제와 같은 임의의 독성 효과 또는 유해한 제조 효과의 지점까지). 따라서, 일 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 0.05 ㎎/㎖ 내지 1.0 ㎎/㎖ 항산화제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 0.05 내지 0.5 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.9 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.8 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.7 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.6 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.4 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.3 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.2 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.9 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.8 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.7 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.6 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.4 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖ 내지 0.3 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖ 내지 0.7 ㎎/㎖, 0.4 ㎎/㎖ 내지 0.6 ㎎/㎖ 항산화제를 포함한다.
E. 제형 개발
본 개시내용의 특정 양태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 고도로 안정화된 제형은 출발(대조군) 퓨린 제형을 제공하고, 원하는 수준의 성분 농도를 달성하기 위해 성분을 첨가함으로써 제조된다. 예를 들어, 비이온성 계면활성제가 없는 9부 퓨린 조성물에 대해 1부 750ppm 비이온성 계면활성제의 첨가로 75ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 최종 제형을 제공한다. 이 공정은 또한 출발 제형에 "첨가하는 것"으로 불린다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 고도로 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형을 생성하기 위해, 퓨린은 출발 제형에 함유되었고, 완충제 조성물은 출발 제형에 첨가된다. 다른 실시형태에서, 고도로 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 당업계에 공지된 방법에 따라 투석을 사용하여 형성된다. 일부 실시형태에서, 제형화 방법은 퓨린의 출발 제형에 농축된 완충제 조성물을 첨가하는 단계를 수반한다. 일 실시형태에서, 혼합 동안 교반에 대해 퓨린을 보호하기 위해, 폴리솔베이트 80은 다른 성분의 첨가 전, 특히 트레할로스의 첨가 전 출발 제형에 첨가된다.
대표적인 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 벌크 약물 물질(BDS)은 10mM 아세트산나트륨, 230mM 염화나트륨이다, 1mM 염화칼슘, pH 6.0의 출발 제형에 함유된다. 일 실시형태에서, 다음의 성분: 1% 폴리솔베이트 80, 500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM CaCl2, pH 6.0 및 트레할로스 2수화물 분말은 다음의 성분: 46mM HEPES, 45mM 아세트산, 190mM NaCl, 0.92mM CaCl2, 75ppm 폴리솔베이트 80, 10% w/w 트레할로스 2수화물, pH 6.0.을 달성하기 위해 출발 제형에 첨가된다. 아세트산의 증가 및 HEPES의 첨가는 더 큰 안정성의 pH를 야기한다. pH 6.0에서 아세트산과 HEPES는 둘 다 그것의 가장 높은 완충 능력 밖에 있기는 하지만, 이들 화학물질의 고농도는 고도로 안정화된 제형의 완충 능력을 크게 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 폴리솔베이트 80은 다른 시약이 첨가될 때 혼합 동안 용기 표면에 응집 및 흡착으로부터 퓨린을 보호하기 위한 다른 성분 전에 출발 물질에 첨가된다. 특정 실시형태에서, 출발 제형의 퓨린은 폴리솔베이트 80 및/또는 트레할로스를 제외한 임의의 다른 성분과 혼합된다. 트레할로스 및 임의의 남아있는 성분은 폴리솔베이트 80이 첨가된 후 첨가되어 혼합동안 응집 및 흡착으로부터 퓨린을 보호한다.
특정 실시형태에서, 안정화된 제형은 희석제와 조합되며, 따라서, 제형은 rVWF 성숙 과정과 같은 방법에서 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 안정화된 희석제는 출발 희석제(50mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM CaCl2, pH 7.0)를 폴리솔베이트 80 내지 75ppm과 함께 첨가함으로써 제조된다. 본 개시내용의 고도로 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형과 이 안정화된 희석제의 조합물은 시작되는 퓨린 및 희석제 제형의 사용과 비교하여, 3 내지 4배만큼 rVWF 성숙 단계에서 퓨린 회복을 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 고도로 안정화된 퓨린 제형은 동결건조된다. 동결건조 동안, 제형은 수성상으로부터 무정형 고체상으로 전환되는데, 이는 화학적 및/또는 구조적 불안정성으로부터 단백질을 보호하기 위한 것으로 생각된다. 추가 실시형태에서, 동결건조된 제제는 무정형 상을 함유할 뿐만 아니라, 동결건조 동안 결정화되는 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서 고도로 안정화된 제형 중 하나 이상의 성분은 동결건조된 케이크의 무정형 상 중에서 분산될 수 있다. 추가로, 무정형상의 겉보기 유리 전이 온도(Tg')는 냉동 건조 동안 바람직하게는 상대적으로 높고, 고체의 유리 전이 온도(Tg)는 마찬가지로 바람직하게는 저장 동안 높다.
IV . 재조합 퓨린의 수성 조성물을 희석시키기 위한 방법
일 양태에서, 본 개시내용은 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 수성 조성물을 희석시키기 위한 방법을 제공한다. 다음의 실시형태는 퓨린(예를 들어, r퓨린)을 희석시키기 위해 사용한 완충제 중의 비이온성 계면활성제의 포함이 비이온성 계면활성제가 없는 완충제에 의한 희석과 비교하여 3 내지 4배 더 많은 퓨린 활성의 회복을 야기한다는 발견에 부분적으로 기초한다.
일 실시형태에서, 해당 방법은 비이온성 계면활성제를 함유하는 희석 완충제를 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물에 첨가하여 희석된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1(희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 1,000:1 (희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1 (희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 500:1 (희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1 (희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 250:1(희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1(희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 200:1(희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1(희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 100:1(희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 1:1(희석 완충제:퓨린 조성물) 내지 50:1(희석 완충제:퓨린 조성물)의 비로 첨가된다.
일 실시형태에서, 해당 방법은 비이온성 계면활성제를 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물에 첨가하는 제1 단계 및 희석 완충제를 비이온성 계면활성제를 함유하는 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물에 첨가하여 희석된 퓨린 조성물을 형성하는 제2 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 계면활성제는 X배의 원하는 농도의 최종 농도로 희석된 퓨린 조성물 중에서 퓨린 조성물에 첨가될 것이며, X는 희석인자이다. 예를 들어, 퓨린 조성물이 100배 희석되는데 10ppm 비이온성 계면활성제의 최종 농도가 요망된다면, 비이온성 계면활성제는 1,000ppm(10ppm x 100배 희석)의 최종 농도에서 시작되는 퓨린 조성물에 첨가되며, 조성물은 1부 출발 용액 당 99부 희석 완충제를 첨가함으로써(비이온성 계면활성제의 첨가 동안 첨가된 용적을 설명함) 후속적으로 희석된다.
특정 실시형태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 조성물은 1배 내지 1,000배, 1배 내지 500배, 1배 내지 250배, 1배 내지 200배, 1배 내지 100배, 1배 내지 50배, 1배 내지 10배, 10배 내지 1,000배, 10배 내지 500배, 10배 내지 250배, 10배 내지 200배, 10배 내지 100배, 10배 내지 50배, 50배 내지 1,000배, 50배 내지 500배, 50배 내지 250배, 50배 내지 200배, 50배 내지 100배, 100배 내지 1,000배, 100배 내지 500배, 100배 내지 250배, 100배 내지 200배, 200배 내지 1,000배, 200배 내지 500배 또는 200배 내지 250배로 희석된다.
A. 퓨린 희석 완충제
일 실시형태에서, 퓨린 희석 완충제는 약제학적으로 허용가능한 염, 비이온성 계면활성제 및 완충제를 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 희석 완충제는 칼슘을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 당 및/또는 당 알코올을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 10mM 내지 500mM의 농도로 희석 완충제 중에 존재한다. 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 100mM 내지 300mM이다. 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 150mM 내지 250mM이다. 또 다른 실시형태에서, 퓨린 희석 완충제 내 약제학적으로 허용가능한 염의 농도는 표 10에서 발견되는 변형 6036 내지 6180로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다, 염화칼륨이다, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 다른 구체적 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨이다.
일 실시형태에서, 희석 완충제는 pH 5.5 내지 7.5를 가진다. 일 실시형태에서, 희석 완충제의 pH는 5.5 내지 7.0이다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제의 pH는 5.5 내지 6.5이다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제의 pH는 6.0±0.2이다. 구체적 실시형태에서, 희석 완충제의 pH는 6.0이다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 표 11에서 발견되는 변형 6181 내지 6403으로부터 선택된 pH를 가진다.
일 실시형태에서, 완충제는 10mM 내지 300mM의 농도로 희석 완충제 중에 존재한다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제 중의 완충제 농도는 10mM 내지 200mM이다. 다른 실시형태에서, 희석 완충제 중의 완충제 농도는 표 12에서 발견되는 변형 6404 내지 6469로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, HEPES, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 완충제는 아세테이트 및 HEPES의 조합물이다.
일부 실시형태에서, 퓨린 희석 완충제는 칼슘 또는 다른 2가의 금속 양이온을 포함한다. 일 실시형태에서, 2가의 양이온은 염, 바람직하게는 염산염으로서 첨가된다. 특정 실시형태에서, 희석 완충제 중의 2가의 양이온(예를 들어, 칼슘)의 농도는 0.1mM 내지 10mM, 0.5mM 내지 2mM, 또는 약 0.92mM이다. 또한 추가 실시형태에서, 0.5mM 내지 9mM, 1mM 내지 8mM, 1.5mM 내지 7mM, 2mM 내지 6mM, 2.5mM 내지 5mM, 또는 3mM 내지 4.5mM의 2가의 양이온이 희석 완충제 중에 사용된다. 칼슘 염이 사용될 때, 이는 바람직하게는 염화칼슘이지만, 또한 다른 칼슘 염, 예컨대 칼슘 글루코네이트, 칼슘 글루비오네이트 또는 칼슘 글루셉테이트일 수 있다. 칼슘을 포함하는 2가의 양이온은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다른 제형 성분과 조합물로 포함될 수 있다. 본 명세서에 제공된 희석 완충제에서 유용한 2가의 금속 양이온의 비제한적 예는 칼슘, 바륨, 망간, 마그네슘, 코발트, 구리, 니켈 및 아연을 포함한다.
일부 실시형태에서, 퓨린 희석 완충제는 당 및/또는 당 알코올을 포함한다. 일 실시형태에서, 희석 완충제는 단당류 당을 함유한다. 특정 실시형태에서, 단당류 당은 이탄당 당, 트라이오스 당, 테트로오스 당, 펜토스 당, 헥소스 당, 헵토스 당, 및 옥토스 당으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 당은 펜토스 당, 헥소스 당, 또는 이들의 조합물이다. 구체적 실시형태에서, 당은 헥소스 당이다.
다른 실시형태에서, 희석 완충제는 이당류 당을 함유한다. 특정 실시형태에서, 이당류 당은 펜토스 및/또는 헥소스 단당류으로부터 형성된 이당류 당으로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 당은 헥소스 단당류로부터 형성된 이당류 당으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 또는 이들의 조합물이다. 일 구체적 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 다른 구체적 실시형태에서, 당은 트레할로스이다. 일 실시형태에서, 당은 트레할로스 2수화물로서 제형화된다.
다른 실시형태에서, 희석 완충제는 당 알코올을 함유한다. 특정 실시형태에서, 당 알코올은 글라이콜, 글라이세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 리비톨, 푸시톨, 이디톨, 볼미톨, 아이소말트, 말티톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 당 알코올은 만니톨이다.
또 다른 실시형태에서, 희석 완충제는 당과 당 알코올의 혼합물을 함유한다. 일 실시형태에서, 혼합물은 단당류, 이당류, 및 당 알코올 중 적어도 2종을 함유한다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 펜토스 당, 헥소스 당, 펜토스 및/또는 헥소스 단당류 및 당 알코올로부터 형성된 이당류 중 2종을 함유한다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 수크로스, 트레할로스 및 만니톨 중 적어도 2종을 함유한다.
일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 2% 내지 20%, 2% 내지 17.5%, 2% 내지 15%, 2% 내지 12.5%, 2% 내지 10%, 2% 내지 9%, 2% 내지 8%, 2% 내지 7%, 5% 내지 20%, 5% 내지 17.5%, 5% 내지 15%, 5% 내지 12.5%, 5% 내지 10%, 7.5% 내지 20%, 7.5% 내지 17.5%, 7.5% 내지 15%, 7.5% 내지 12.5%, 10% 내지 20%, 10% 내지 17.5%, 10% 내지 15%, 4±2%, 5±2%, 6±2%, 7±2%, 8±2%, 9±2%, 10±2%, 11±2%, 12±2%, 13±2%, 14±2%, 15±2%, 16±2%, 17±2%, 18±2%, 3±1%, 4±1%, 5±1%, 6±1%, 7±1%, 8±1%, 9±1%, 10±1%, 11±1%, 12±1%, 13±1%, 14±1%, 15±1%, 16±1%, 17±1%, 18±1%, 19±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%의 농도로 희석 완충제 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 당 또는 당 알코올은 트레할로스이다.
일 실시형태에서, 비이온성 수용성 모노글라이세라이드, 비이온성 수용성 다이글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이글라이세라이드, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 모노지방산 에스터, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 2지방산 에스터, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 비이온성 폴리글라이콜화된 글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이블록 공중합체 및 이들의 조합물로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 함유하는 퓨린(예를 들어, r퓨린)의 저장 안정적인 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
1. 비이온성 계면활성제
일 실시형태에서, 희석 전 첨가된 퓨린 희석 완충제 또는 비이온성 계면활성제 용액은 비이온성 수용성 모노글라이세라이드, 비이온성 수용성 다이글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이글라이세라이드, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 모노지방산 에스터, 폴리에틸렌 글라이콜의 비이온성 수용성 2지방산 에스터, 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터, 비이온성 폴리글라이콜화된 글라이세라이드, 비이온성 수용성 트라이블록 공중합체 및 이들의 조합물로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 함유한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 10 내지 200ppm, 10 내지 175ppm, 10 내지 150ppm, 10 내지 125ppm, 10 내지 100ppm, 10 내지 90ppm, 10 내지 80ppm, 10 내지 75ppm, 10 내지 70ppm, 10 내지 60ppm, 10 내지 50ppm, 10 내지 25ppm, 25 내지 200ppm, 25 내지 175ppm, 25 내지 150ppm, 25 내지 125ppm, 25 내지 100ppm, 25 내지 90ppm, 25 내지 80ppm, 25 내지 70ppm, 25 내지 60ppm, 25 내지 50ppm, 50 내지 200ppm, 50 내지 175ppm, 50 내지 150ppm, 50 내지 125ppm, 50 내지 90ppm, 50 내지 80ppm, 75 내지 200ppm, 75 내지 175ppm, 75 내지 150ppm, 100 내지 200ppm, 100 내지 175ppm, 50±25ppm, 60±25ppm, 70±25ppm, 75±25ppm, 80±25ppm, 90±25ppm, 100±25ppm, 125±25ppm, 150±25ppm, 175±25ppm, 30±10ppm, 40±10ppm, 50±10ppm, 60±10ppm, 70±10ppm, 75±10ppm, 80±10ppm, 90±10ppm, 100±10ppm, 110±10ppm, 120±10ppm, 125±10ppm, 130±10ppm, 140±10ppm, 150±10ppm, 160±10ppm, 170±10ppm, 175±10ppm, 180±10ppm, 190±10ppm, 25ppm, 30ppm, 40ppm, 50ppm, 60ppm, 70ppm, 75ppm, 80ppm, 90ppm, 100ppm, 110ppm, 120ppm, 125ppm, 130ppm, 140ppm, 150ppm, 160ppm, 170ppm, 175ppm, 180ppm, 190ppm 또는 200ppm의 농도로 희석 완충제 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
일 실시형태에서, 희석 후 비이온성 계면활성제의 목표 농도는 10 내지 200ppm, 10 내지 175ppm, 10 내지 150ppm, 10 내지 125ppm, 10 내지 100ppm, 10 내지 90ppm, 10 내지 80ppm, 10 내지 75ppm, 10 내지 70ppm, 10 내지 60ppm, 10 내지 50ppm, 10 내지 25ppm, 25 내지 200ppm, 25 내지 175ppm, 25 내지 150ppm, 25 내지 125ppm, 25 내지 100ppm, 25 내지 90ppm, 25 내지 80ppm, 25 내지 70ppm, 25 내지 60ppm, 25 내지 50ppm, 50 내지 200ppm, 50 내지 175ppm, 50 내지 150ppm, 50 내지 125ppm, 50 내지 90ppm, 50 내지 80ppm, 75 내지 200ppm, 75 내지 175ppm, 75 내지 150ppm, 100 내지 200ppm, 100 내지 175ppm, 50±25ppm, 60±25ppm, 70±25ppm, 75±25ppm, 80±25ppm, 90±25ppm, 100±25ppm, 125±25ppm, 150±25ppm, 175±25ppm, 30±10ppm, 40±10ppm, 50±10ppm, 60±10ppm, 70±10ppm, 75±10ppm, 80±10ppm, 90±10ppm, 100±10ppm, 110±10ppm, 120±10ppm, 125±10ppm, 130±10ppm, 140±10ppm, 150±10ppm, 160±10ppm, 170±10ppm, 175±10ppm, 180±10ppm, 190±10ppm, 25ppm, 30ppm, 40ppm, 50ppm, 60ppm, 70ppm, 75ppm, 80ppm, 90ppm, 100ppm, 110ppm, 120ppm, 125ppm, 130ppm, 140ppm, 150ppm, 160ppm, 170ppm, 175ppm, 180ppm, 190ppm 또는 200ppm이다. 일 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 비이온성 수용성 솔비탄 지방산 에스터이다. 구체적 실시형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트)이다.
일 실시형태에서, 퓨린 희석 완충제 내 비이온성 계면활성제의 포함 또는 희석 전 첨가는 비이온성 계면활성제의 사용 없이 또는 더 낮은 농도의 비이온성 계면활성제의 사용으로 희석시킨 퓨린 조성물 중에서 회복된 활성과 비교하여 적어도 10%만큼 희석된 퓨린 조성물 중에서 회복된 퓨린 활성을 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 비이온성 계면활성제를 사용하는 희석 후 회복된 퓨린 활성은 비이온성 계면활성제 없이 또는 더 낮은 농도의 비이온성 계면활성제를 사용하여 희석 후 회복된 퓨린 활성의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 2배, 3배, 4배, 5배 이상이다.
V. 안정성 분석
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 고도로 안정화된 퓨린(예를 들어, r퓨린) 본 개시내용의 제형은 대조군 제형에 비해 개선된 안정성을 나타낸다. 일 실시형태에서, 개선된 안정성은 다양한 안정성 분석에서 대조군 제형보다 활성의 더 높은 백분율의 보유를 포함한다. 이러한 분석은 제형이 고도로 안정화된 제형인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고도로 안정화된 제형은 본 명세서에 논의되거나 또는 당업계에 공지된 안정성 분석 중 어떤 것에 의해 평가될 때, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 활성을 가진다.
추가 양태에서, 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형은 고온에서 저장, 교반, 냉동/해동 주기 또는 이들 중 일부의 조합과 같은 스트레스원 조건 하에 시험된다. 이러한 스트레스원 후, 제형은 이들 조건 하에서 안정성을 결정하기 위해 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 방법 중 어떤 것을 사용하여 분석된다.
일 양태에서, 퓨린 활성 분석은 제형의 안정성을 평가하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 퓨린 활성 분석은 기질 절단의 측정을 수반한다. 일 실시형태에서, 기질은 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1; AMC = 7-아미노-4-메톡시 쿠마린)인데, 이는 퓨린에 의해 절단되고, 7-아미노-4-메톡시 쿠마린을 방출한다. 분석은, 예를 들어 ELISA 플레이트 상에서 수행된다. 샘플 내 퓨린 활성은 생성된 표준 곡선으로부터, 예를 들어 품질관리(QC) 퓨린 표준으로부터 결정된다. 활성 값은 일반적으로 두 희석물로부터의 평균 값으로서, 각각 2회 계산된다.
다른 양태에서, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC)는 퓨린(예를 들어, r퓨린) 제형의 안정성을 평가하기 위해 사용된다. 이러한 분석에서, 안정성은 모노머 퓨린에 대응되는 피크의 높이에 의해 표시된다. 단량체 피크 높이의 감소는 생성물이 상실되는 것(불안정함)을 의미하며, 더 높은 분자량 피크의 생성은 응집물이 생기는 것을 의미하고, 더 낮은 분자량 피크는 생성물이 분해되는 것을 의미한다. 대표적인 실시형태에서, 37℃에서 4일 후, 대조군 퓨린 제형의 상대적 피크 높이는 58.5%였지만, 고도로 안정화된 제형에서, 상대적 피크 높이는 74.8%였다(도 48). 따라서, 고도로 안정화된 제형은 더 고온(37℃) 에서 4일 동안 저장하기 전 알 수 있는 것에 비해, 조성물 내 퓨린의 안정성을 유지하였고, 피크의 더 큰 백분율을 보유하였다.
다른 양태에서, 웨스턴 블롯 분석과 같은 품질 분석은 퓨린 제형의 안정성을 평가하기 위해 사용된다. 예를 들어, 도 26은 35℃에서 5일 후, 더 큰 신호의 백분율이 비안정화 제형(레인 5)에 비해, 안정화된 제형(레인 11)에서 분해된 종보다는 오히려 무결함 퓨린 분자로서 존재한다는 것을 나타낸다.
또 다른 양태에서, UV 스펙트럼과 같은 품질 분석을 사용하여 안정성을 평가한다. 이러한 분석은 특히 사용된 스트레스원이 교반될 때 유용하다. UV 스펙트럼은 응집물의 존재를 나타낼 수 있으며 - 응집물의 존재는 불안정성을 표시한다. 예를 들어, 도 36은 대조군 제형이 교반될 때, 위쪽 스펙트럼의 주된 변위를 나타낸다(응집물을 나타냄). 도 41 및 42는 고도로 안정화된 제형의 보호력을 나타내며, 즉, 교반에 의해 교반된 샘플의 스펙트럼은 위쪽으로 이동되지 않지만, 미교반 샘플과 중첩되지 않는데, 이는 제형이 교반을 통한 스트레스 하에 놓을 때 응집물이 형성되지 않는다는 것을 나타낸다.
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않는다면, 당업계의 기술 내에 있는 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물(재조합 기법을 포함), 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법 및 설명을 사용할 수 있다. 이러한 통상적인 기법은 중합체 배열 합성, 혼성화, 결찰 및 표지를 사용하는 혼성화의 검출을 포함한다. 적합한 기법의 구체적 설명은 본 명세서에서 이하의 실시예를 참고로 할 수 있다. 그러나, 물론 다른 동등한 통상적인 과정이 또한 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기법 및 설명은 문헌[Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual(모두 Cold Spring Harbor Laboratory Press제), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y.]과 같은 표준 실험 매뉴얼에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위하여 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
다음의 설명에서, 다수의 구체적 세부사항이 본 발명의 철저한 이해를 제공하도록 제시된다. 그러나, 본 발명이 이들 구체적 세부사항 중 하나 이상 없이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 본 발명을 모호하게 하는 것을 회피하기 위해 잘 알려진 특징 및 당업자에게 잘 알려진 과정은 기재되지 않았다.
본 발명은 구체적 실시형태를 참고로 주로 기재되지만, 또한 다른 실시형태가 본 개시내용을 읽을 때 명백할 것으로 생각되며, 이러한 실시형태는 본 발명의 방법 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1 - 수성 r퓨린 제형의 저장 안정성
대조군 퓨린 제형의 안정성을 3가지 상이한 온도: 실온(예를 들어, 25℃), 37℃ 및 45℃에서 시험하였다. 상승된 온도에서 이들 연구를 사용하여 가속화된 안정성을 연구하였는데, 이는 더 저온에서 장기간의 안정성 연구와 비슷하다. 샘플을 인큐베이션의 0시간, 그 다음에 1, 2, 3, 4 및 7일 후 시험하였다. 분석은 퓨린 활성 분석, SEC, 및 웨스턴 블롯팅을 포함하하였다.
간략하게, 몇몇 5㎖ 폴리프로필렌 바이알을 3㎖의 r퓨린으로 채웠고, 3가지 상이한 온도: 주위(실온), 37℃ 내지 45℃에서 인큐베이션시켰다. 각 인큐베이션 조건으로부터 한 바이알을 0시간, 그 다음에 1, 2, 3, 4 및 7일 후 꺼냈다. 200㎕ 알리쿼트를 0.65㎖ 폴리프로필렌 바이알로 만들었고, 분석을 기다리면서 -80℃에서 냉동시켰다.
몇몇 퓨린 제형의 안정성을 이들 조건 하에 결정하였다. 구체적인 다양한 제형은 표 17에 주어진다.
대조군 제형 10mM 아세테이트
230mM 염화나트륨
1mM 염화칼슘
pH 6.0
시험 제형 #1 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
75ppm 폴리솔베이트 80
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
시험 제형 #2 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
시험 제형 #3 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
10ppm 폴리솔베이트 80
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
시험 제형 #4 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
25ppm 폴리솔베이트 80
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
시험 제형 #5 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
50ppm 폴리솔베이트 80
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
시험 제형 #6 46mM HEPES
45mM 아세테이트
190mM 염화나트륨
0.92mM 염화칼슘
100ppm 폴리솔베이트 80
10%(w/w) 트레할로스 탈수화물
pH 6.0
안정성을 평가하기 위한 한 방법은 퓨린 활성 분석을 통한다. 이 분석에서, 기질 절단 속도로부터 퓨린의 활성을 결정한다. 기질인 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(서열번호 1; AMC = 7-아미노-4-메톡시 쿠마린)을 퓨린에 의해 절단하고, 형광 AMC를 방출시킨다. 예를 들어, ELISA 상에서 분석을 수행한다. 샘플 내 퓨린 활성을 만들어진 표준 곡선으로부터, 예를 들어 품질 관리 r퓨린 표준으로부터 결정한다. 두 희석으로부터 평균 값으로서 활성 값을 각각 2회 계산하였다.
37℃에서 고도로 안정화된 제형 내 r퓨린 안정성. 본 실험의 목적은 75ppm 폴리솔베이트 80을 함유하는 안정화된 제형에서 r퓨린 안정성을 시험하는 것이었다. 이 샘플의 조성물에서 작은 변화가 있었는데, 수화되지 않은 트레할로스(C12H22O11, FW 342.30)보다는 트레할로스 2수화물(C12H22O11*2H2O, FW 378.33)이 사용되었기 때문이다. 트레할로스 2수화물의 사용은 약간 더 묽은 샘플을 만들었다. 교반 연구는 교반에 의해 유발된 r퓨린 변성에 대한 최고의 보호를 제공하기 위해, 폴리솔베이트 80 농도가 50ppm 내지 100ppm을 유지하여야 한다는 것을 시사한다. 이 연구에서, 시험 제형 #1의 r퓨린 샘플에 폴리솔베이트 80 내지 75ppm을 첨가하였고, 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. r퓨린 샘플을 대조군으로서 작용하는 대조군 제형으로 제형화하였다.
퓨린 활성 분석(도 1)에 의한 분석은 37℃ 내지 45℃에서 인큐베이션시킨 대조군 제형 내 샘플의 활성 손실을 나타낸다. 45℃ 샘플이 고도로 분해되고, 단지 2일 후 응집되었지만, 샘플을 해당 시간 후 시험하지 않았다. 샘플을 실온에서 인큐베이션하기 위해, 데이터는 분석에서 가변성의 양의 결과로서 결정적이지 않았지만, 데이터는 r퓨린 활성이 상대적으로 안정하고, 7일 후 T=0와 거의 동일한 활성을 지니는 것을 시사하였다.
대조군 제형의 데이터와 대조적으로, 퓨린 활성 분석(도 46)에 의한 분석은 시험 제형 #1의 r퓨린이 대조군 제형보다 더 큰 활성을 보유한다는 것을 나타낸다. 37℃에서 4일 후, r퓨린은 그것의 본래 활성의 76.7%를 보유한 반면, 대조군 제형은 그것의 본래 활성의 단지 55.5%를 보존하였다(도 47).
또한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 다양한 퓨린 제형의 안정성을 평가하였다. SEC 방법에 대해, 다음의 도구 및 재료를 사용하였다:
Figure pct00027
온도 제어된 오토샘플러 및 포토-다이오드 어레이 검출기를 구비한 애질런트(Agilent) HPLC 1100 시리즈
Figure pct00028
오토샘플러 100㎕ 폴리프로필렌 바이알
Figure pct00029
TOSOH 바이오사이언스(Bioscience), TSKgel제의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼
Figure pct00030
G3000SWxl, 7.8㎜ ID x 30㎝, 5㎛
추가로, SEC 방법을 위해 다음의 조건을 사용하였다:
Figure pct00031
이동상: 50mM MOPS, 200mM 황산 나트륨, 0.02% 아자이드 나트륨, pH 7.0
Figure pct00032
유속: 0.5㎖/분
Figure pct00033
실행 시간: 30분
Figure pct00034
샘플 용적: 100㎕
Figure pct00035
오토샘플러 온도: 4℃
Figure pct00036
컬럼 온도: 주위
280㎚(기준을 벗어남)에서 단일 파장 흡수를 사용하여 크로마토그래프를 만들었다. 수동 통합 후, 제형의 r퓨린 함량에 대응되는 19분에 주요 피크의 높이를 사용하여 안정성을 평가하였다. 피크 영역 대신 피크 높이를 사용하기 위한 이유는 크로마토그래피 피크가 종종 분리된 기준이 아닌데, 이는 큰 오류를 야기할 수 있다는 것이었다. 각 샘플의 단지 1회 주입을 수행하였다. r퓨린 대조군 제형의 반복된 분석은 피크 높이에서 2% 미만의 변형을 나타내었다(도시하지 않음).
SEC 결과는 상기 보고한 퓨린 활성 분석 결과와 상호 관련 지었다. SEC에 의한 분석(도 2)은 대조군 제형의 r퓨린 단량체 피크(체류 시간 19분)가 모든 온도에 대한 인큐베이션 시간에 따라 감소된다는 것을 나타낸다. r퓨린 단량체 피크의 비율은 실온에서 인큐베이션한 샘플 중에서 상대적으로 낮았는데, 피크 높이의 82%는 7일의 인큐베이션 후 남아있었기 때문이다. 그러나, 37℃에서, r퓨린 단량체 피크의 높이는 7일의 인큐베이션 후 본래 높이의 21.6%로 떨어졌다. 45℃에서, 인큐베이션 2일 후, 주요 피크는 14.1%로 감소되었다. r퓨린 단량체 함량의 손실과 일치되게, 다른 크로마토그래피 피크는 시간에 따라 나타나기 시작했고(도 3), 이는 응집(더 이른 시점에 용리됨) 및 분해 생성물(더 이후의 시점에 용리됨)에 대응된다. 이들 추가적인 피크는 대조군 제형 내 r퓨린의 분해와 응집을 나타낸다. 또한 실온 저장에 비해 37℃에서 증가된 분해를 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다(도 4). r퓨린 분해는 r퓨린과 공동 정제한 프로테아제에 의해 또는 r퓨린 그 자체의 자동 촉매적 활성에 의해 야기될 수 있다.
대조적으로, SEC 분석으로 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 대조군 제형에 비해 트레할로스를 함유하는 시험 제형 #1의 증가된 안정성(도 48)을 확인하였다. 도 48은 37℃에서 4일 동안 인큐베이션 후 시험 제형 #1이 동일 인큐베이션 동안 출발 용액의 r퓨린 단량체 높이의 58.5%만을 유지한 대조군 제형과 비교하여, 출발 용액의 r퓨린 단량체 피크 높이의 74.8%를 유지한다는 것을 나타낸다.
실시예 2 - 냉동/해동 시 수성 r퓨린 제형의 저장 안정성
대조군 제형 및 시험 제형 #2-6의 안정성을 냉동/해동 연구에 의해 시험하였다. 5회의 냉동/해동 주기를 완료하였고, 샘플을 퓨린 활성 분석 및 SEC에 의해 분석하였다. 냉동/해동의 영향을 조사하는 것은 중요한데, 이 연구의 r퓨린 샘플 및 r퓨린 BDS가 냉동 저장되기 때문이다. 대조군 제형(n = 4)을 사용하는 냉동/해동 실험은 전체 5회의 냉동/해동 주기 후 퓨린 활성의 부수적 손실(대략 7%)을 보여준다. 아래쪽의 경향이 되는 것으로 나타났지만, 이는 단백질의 실제 손실 또는 분석 가변성의 반영에 기인할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 데이터는 r퓨린을 냉동하고 해동하는 능력을 1배뿐만 아니라 몇 배로 뒷받침하지만, 활성의 손실은 거의 내지 전혀 없다. 마찬가지로, 대조군 제형의 퓨린의 올리고머 상태의 SEC 분석은 냉동/해동 실험의 과정에 걸쳐 단량체 함량의 손실을 나타내지 않았다(도 6).
r퓨린은 일반적으로 냉동저장되기 때문에, 해당 방법의 영향을 평가하였다. 활성 분석에 의한 분석(도면)은 두 해당 방법: 4℃에서 밤새 해동, 또는 실온에서 2시간 동안 해동 간에 유의한 차이가 없다는 것을 보여준다.
함께 취합하면, 이들 데이터는 대조군 제형 내 r퓨린이 실온에서 단기간 동안 상대적으로 안정하다는 것을 시사한다. 더 나아가, 상승된 온도에서 저장 시 활성의 손실은 r퓨린 분해와 응집 둘 다와 관련된다. 추가로, 대조군 제형의 r퓨린은 5회의 냉동/해동 주기 후조차 그것의 활성을 제대로 보유하였다.
고도로 안정화된 제형 내 r퓨린의 냉동/해동 연구. 이전의 냉동/해동 연구로서 동일한 설정의 샘플을 사용하여 냉동/해동 연구를 수행하였고; 시험 제형 #2(0ppm 폴리솔베이트 80), #3(10ppm 폴리솔베이트 80), #4(25ppm 폴리솔베이트 80), #5(50ppm 폴리솔베이트 80) 및 #6 (100ppm 폴리솔베이트 80)에서 r퓨린의 안정성을 평가하였다. 대조군 제형 내 퓨린은 대조군으로서 작용하였다. 대조군 제형의 사전 분석과 일치되게, 퓨린 활성의 분석(도 43)은 시험 제형 중 어떤 것에서 5회의 냉동/해동 주기 후 활성의 유의한 손실이 없음을 보여주었다. SEC(도 44 및 45)에 의한 r퓨린 단량체 함량의 분석은 냉동/해동 후 샘플 열화만의 약간의 경향을 보여주었다. 5회의 냉동/해동 주기 후 조차, 모든 샘플은 그것의 본래 활성의 95% 초과를 보유하였다.
실시예 3 - 기계적 스트레스에 대한 수성 r퓨린 제형의 저장 안정성
이론에 구속되지 않고, r퓨린 샘플에 대한 교반 효과의 한 가지 가능성 있는 메커니즘은 그것이 r퓨린의 변성을 유발하며, 소수성 표면을 노출한다는 것이다. 소수성 표면은 응집을 유발하는 다른 변성된 r퓨린 단백질과 같은 다른 소수성 표면에 끌어 당겨지거나 또는 샘플 튜브 및 재료 상의 소수성 표면에 흡착을 야기한다.
교반 연구는 r퓨린 사용의 실제 공정을 모방하도록 설계된 것은 아니지만, 샘플에 과한 스트레스를 주었다. 안정화된 것으로 생각하기 위해, r퓨린의 제형은 최소한의 제형뿐만 아니라 대조군 제형으로 수행되며, 고도로 안정화된 제형은 대조군 제형보다 더 양호하게 수행된다.
테플론(Teflon) 볼을 함유하는 보틀 내에서 r퓨린 샘플을 진탕함으로써 교반 연구를 수행하였다. 교반의 2 및 17시간 후 샘플을 취하였고, 퓨린 활성 분석 및 SEC에 의해 분석하였다. 퓨린 활성 분석과 SEC 분석 둘 다에 대한 결과에서 나타나는 바와 같이(각각 도 7 및 8), 대조군 제형 내 r퓨린은 제한된 시간 기간 동안 교반에 대해 상당히 저항성이 있다. 정용여과 단계 동안 일어날 수 있는 것과 같은 2시간의 격렬한 교반 후, 85% 초과의 r퓨린은 대조군 제형에서 여전히 활성이었다. 그러나, 17시간의 교반 후, 샘플의 부하 동안 일어날 수 있는 바와 같이, 10% 미만의 r퓨린 함량이 활성으로 남아있었다.
그 다음에 퓨린 시험 제형 #2 내지 6에 대해 시험하였는데, 이는 9부의 r퓨린 샘플에 1부의 500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM CaCl2, pH 6 + 10% w/w 트레할로스 + 변형된 양의 폴리솔베이트 80을 첨가함으로써 만들었다.
이 교반 연구를 테플론 볼을 함유하는 보틀 내에서 시험 r퓨린 제형 및 대조군 제형을 3시간 동안 진탕시킴으로써 수행하였다. 다음의 수준의 폴리솔베이트 80을 함유하는 시험 제형을 평가하였다: 없음, 10ppm, 25ppm, 50ppm 또는 100ppm. 도 31에 나타내는 바와 같이, 시험 제형 내 폴리솔베이트 80은 교반 동안 r퓨린에 대한 유의한 보호를 제공하였다. 3시간 교반 후, 폴리솔베이트 80를 함유하는 샘플 내 r퓨린의 활성은 31,499 ± 1,218 U/㎖ 내지 36,787 ± 847 U/㎖의 범위에 있지만, 폴리솔베이트 80이 없는 제형 내 샘플은 17,835 ± 1,706 U/㎖의 퓨린 활성을 가졌다. 대조군 제형(10mM 아세트산나트륨, 230mM 염화나트륨, 1mM 염화칼슘, pH 6.0)의 샘플은 24,368 ± 1,135 U/㎖의 활성을 가졌다.
SEC에 의한 분석은 이 연구에서 폴리솔베이트 80의 유리한 효과를 확인하였다(도 32). 3시간 교반 후, 폴리솔베이트 80을 함유하는 샘플 내 r퓨린의 피크 높이는 37.5mAU 내지 35.9mAU의 범위에 있지만, 폴리솔베이트 80이 없는 제형 내 r퓨린 피크의 높이는 22.1mAU였다. 대조군 제형 내 r퓨린 피크의 높이는 29.9 mAU였다. 폴리솔베이트 80의 효과를 또한 도 33 및 34에 나타낸다. 약간의 경향은 10ppm 및 25ppm 폴리솔베이트 80의 첨가가 여전히 유리하지만, 50ppm 또는 100ppm 폴리솔베이트 80의 사용만큼 효과적이지 않다는 것을 시사한다. 대조군 제형 내 교반된 샘플에 대한 SEC 프로파일(도 35)은 미교반 샘플에 비해 어떤 추가적인 피크를 나타내지 않았다. 이는 표면 흡수가 활성 손실에 대한 주된 이유가 된다는 것을 시사한다. 그러나, UV 흡수 스펙트럼(도 36)은 교반된 샘플이 응집물의 존재에 의해 야기되는 광산란 및 차폐의 신호인, 편향되고 상승된 프로파일을 가진다는 것을 나타낸다. 광차폐는 일반적으로 더 작은 분자보다 더 불투명한 거대 응집물을 변화시킴으로써 야기되는데, 이는 UV 스펙트럼의 상승을 야기한다. 이 현상은 분광광도계에 의한 흡수와 차이를 나타낼 수 없는데, 그것의 검출기가 샘플을 통과한 빛의 양을 측정하기 때문이다. 더 적은 빛이 검출기로 들어오기 때문에, 이는 흡수로서 보고되며; 따라서 흡수 프로파일은 상승된다.
빛은 또한 응집물에 의해 산란될 수 있는데, 이는 또한 검출기 내로 들어가는 빛의 양을 감소시킨다. 파장 길이가 짧을수록, 더 많은 빛이 산란된다(산란된 빛의 양은 파장의 4 제곱에 반비례한다). 이는 파장이 짧을수록 검출기에 더 적은 빛이 들어가고; 따라서 흡수 프로파일은 편향된다는 것을 의미한다. 응집물은 이 샘플 내에 존재하지만, SEC 분석은 그것을 검출하는데 사용가능하지 않을 가능성이 있다. SEC 분석에 의한 이런 종류의 문제는 드문 것이 아닌데, 단백질 응집물이 종종 컬럼을 통과하기에 너무 크거나 또는 컬럼 매트릭스에 의해 흡수되기 때문이다. 폴리솔베이트 80이 없는 제형 내 r퓨린 샘플의 UV 흡수 스펙트럼(도 37)은 유사한 상승된 프로파일을 나타낸다. 또한, 이 샘플의 SEC 분석에서 응집물은 검출되지 않았다(도 38). 폴리솔베이트 80에 의해 제형화된 샘플은 UV 흡수 스펙트럼에 의해 분석될 때 폴리솔베이트 80이 없는 것보다 응집을 덜 나타낸다(도 39 내지 42). UV 스펙트럼은 응집물의 양을 정량화할 수 없지만, 또한 50ppm 및 100ppm에서 폴리솔베이트 80을 지니는 샘플은 10ppm 또는 25ppm보다 응집물로부터 r퓨린을 보호하는데 더 양호하다는 것을 암시하는 약간의 경향을 관찰할 수 있다. 데이터는 75ppm의 수준으로 제형에 포함된 폴리솔베이트 80은 효과적이라는 것을 시사하는데, 이 농도가 넓은 정체기(50 내지 10ppm)의 중간에 있고, 강한 상태를 나타내기 때문이다.
다음의 장비 및 재료를 사용하여 UV 분광광도 분석을 수행하였다:
Figure pct00037
애질런트 8453 분광광도계
Figure pct00038
석영 큐벳 1㎝ 광 경로
우선 큐벳 내에 0.5㎖의 적절한 제형을 넣음으로써 분광광도 분석을 수행하였고, 블랭크로서 측정하였다. 그 다음에, 0.5㎖의 r퓨린 샘플을 큐벳 내에 넣고, 240㎚ 내지 400㎚에서 스캔하였다.
실시예 4 - r퓨린 안정성에 대한 pH , 수크로스 및 폴리솔베이트 80의 영향
pH를 5.0, 5.5, 6.0, 7.0 및 8.0로 조절하기 위해서 r퓨린 샘플에 다양한 완충제를 첨가하였다. 추가로, 수크로스 및/또는 폴리솔베이트 80을 pH 6.0, 7.0 및 8.0에서 샘플에 첨가하였다. 퓨린 활성 분석 및 SEC에 의해 시험하기 위해 샘플을 37℃에서 인큐베이션시켰다.
퓨린 활성 분석(도 11)과 SEC(도 12)는 둘 다 37℃에서 r퓨린이 pH 5.0 또는 5.5보다 pH 6.0에서 더 안정하였다는 것을 나타내었다. 대조군 제형(도 13)과 MES(도 14) 둘 다에서 pH 6.0의 샘플은 SEC에 의해 분석하였을 때 pH 7.0 또는 8.0(도 15 및 16)에서 제형화된 것보다 더 안정하였다. pH 6.0 및 7.0에서 샘플에 수크로스의 첨가는 r퓨린 안정성에 대해 유리한 효과를 가졌다. SEC 분석(도 17)은 37℃에서 인큐베이션의 4일 후, 수크로스를 함유하는 샘플의 피크 높이는 수크로스가 없을 때 52%와 비교하여 평균적으로 T = 0의 75%였다. 퓨린 활성 분석에 의한 분석으로 SEC 실험의 결과를 확인하였다(도 18 및 19). 수크로스의 첨가는 대조군 제형과 MES pH 6.0(도 18 및 19) 둘 다에서 r퓨린 안정성을 개선시켰고, 완충제를 사용할 때 보이는 것(도 20)과 유사한 안정성을 지녔다. 37℃에서 수크로스 함유 제형에서 r퓨린 안정성에 대한 폴리솔베이트 80의 효과는 최소였고, 효과가 있다 하더라도 도 17, 18 및 19에 나타내는 바와 같았다.
이들 데이터는 37℃ r퓨린에서 pH 5.0, 5.5, 7.0 및 8.0에 비해 pH 6.0에서 가장 안정하다는 것을 시사한다. 데이터는 수크로스가 r퓨린 안정성에 대해 37℃에서 유리한 효과를 가진다는 것을 추가로 나타낸다. 추가로, 10% 수크로스의 존재에서 pH 6.0의 대조군 완충제(아세테이트) 또는 MES 사이의 r퓨린 안정성에서 유의한 차이는 보이지 않았다. 최종적으로, 37℃에서 수크로스 제형 내 r퓨린 안정성에 대한 폴리솔베이트 80의 유의한 효과가 없었다.
실시예 5 - 수크로스 및 만니톨에서 퓨린 제형 안정성의 비교
실시예 4에서 알 수 있는 바와 같이, 수크로스의 첨가는 37℃에서 r퓨린 분해 및/또는 활성 손실을 늦추었다. 수크로스는 rVWF 과정과 같은 하류 적용에 사용되지 않았지만, 다른 및/또는 당 알코올, 예컨대 만니톨은 사용된다. 따라서 r퓨린 제형에 수크로스보다 만니톨의 첨가는 vWF 과정에 새로운 원재료를 도입하지 않았다. 이 연구는 만니톨의 첨가가 r퓨린 안정성에 대한 유리한 효과를 가지는지 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 시험 제형은 또한 pH 6.0에서 각각 50mM의 최종 농도로 HEPES 및 아세트산의 첨가에 의해 개선된 완충 능력을 소유하였다. 10%의 500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM CaCl2, pH 6의 r퓨린 샘플을 첨가한 다음, 수크로스, 만니톨 및/또는 폴리솔베이트 80 중 하나를 첨가함으로써 안정화된 제형을 만들었다. 퓨린 활성 분석(도 21)과 SEC(도 22) 둘 다에 의한 분석은 37℃에서 인큐베이션의 4일 후, 만니톨 및 수크로스가 r퓨린 제형에 대하 유사한 안정화 효과를 가진다는 것을 나타내었다. 또한, 이들 제형에 대한 폴리솔베이트 80의 효과는 유의하지 않았다. 활성 데이터(도 21)는 37℃에서 인큐베이션의 4일 후 만니톨 및 폴리솔베이트 80을 함유하는 샘플이 다른 샘플보다 더 양호하였다는 것을 나타내지만, 이들 샘플은 전반적인 패턴을 따르지 뿐만 아니라 SEC 분석(도면)은 그것을 확인하지 못했다. 이 결과는 이상점일 가능성이 있다.
실시예 6 - 수크로스 및 트레할로스에서 퓨린 제형 안정성의 비교
다양한 간행물은 만니톨이 냉동 동안 단백질의 변성을 가속화한다는 것을 나타내었는데, 이는 r퓨린 제형 완충제 중에 그것의 포함에 대한 일부 우려를 상승시켰다. 이러한 문제는 이미 rVWF 생산 과정의 부분이 되는 다른 당인 트레할로스에 대해 보고되지 않았다. 트레할로스가 r퓨린 안정성에 대해 유리한 효과를 가지는지 여부를 결정하기 위해 이 연구를 수행하였다. 추가로, 다양한 농도의 폴리솔베이트 80을 평가하였다. 퓨린 활성 분석을 사용하는 분석(도 23 및 24)은 37℃에서 5일의 인큐베이션 후, 10% 수크로스를 함유하는 샘플이 그것의 본래 활성의 66.2% ±2.9%를 보유하는 반면, 10% 트레할로스를 샘플은 60.1%±4%를 보유한다는 것을 나타내었다. 이들 샘플 사이의 차이는 유의하지 않다. 샘플은 둘 다, 본래 활성의 단지 37.5% ±4.2%를 보유한 대조군 제형보다 r퓨린 활성을 보존하는데 유의하게 더 양호하였다.
SEC(도 25)에 의한 분석으로 활성 분석을 확인하였다. 10% 트레할로스의 샘플에 대해 75.1% 및 대조군 제형에 대해 44.2%와 비교하여 10% 수크로스의 샘플에 대한 r퓨린 피크는 그것의 높이의 78.3%를 보유하였다. 또한 웨스턴 블롯팅(도 26)에 의한 분석은 10% 수크로스 또는 10% 트레할로스를 함유하는 샘플에서 최소의 분해를 나타내었다. 샘플은 각각의 제형에 대해 제0일 다음에 제5일에 쌍으로서 제시된다는 것을 주목한다.
퓨린 활성 분석(도 27)과 SEC(도 28) 분석은 둘 다 10% 트레할로스가 37℃에서 r퓨린 활성을 보존하는데 5% 또는 2% 더 양호하였다는 것을 나타낸다. 이들 발견은 또한 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다(도 26). 37℃에서 r퓨린 안정성에 대한 폴리솔베이트 80의 영향은 퓨린 활성 분석 및 SEC(각각 도 29 및 30)에 의한 분석에 따라 최소였다.
SEC 및 퓨린 활성 분석을 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. 웨스턴 블롯팅을 다음의 장비 및 재료를 사용하여 수행하였다:
Figure pct00039
산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)제의 염소 항-퓨린(펩타이드) 1차 항체(카탈로그 번호 SC-12484)
Figure pct00040
시그마(Sigma)제의 토끼 항-염소 IgG-HRP 컨쥬게이트 2차 항체(카탈로그 번호 A5420)
Figure pct00041
DAB/금속 농축물 10X를 함유하는 피어스(Pierce) 금속 증강 기재 키트,
Figure pct00042
피어스(Pierce)(카탈로그 번호 1856090) 및 안정한 페록시다제 완충제, 피어스(카탈로그 번호 185591)
Figure pct00043
인비트로젠(Invitrogen)제의 4 내지 20% 트리스-글라이신 겔(카탈로그 번호 EC6025BOX)
Figure pct00044
인비트로젠제의 NuPAGE(등록상표) 샘플 환원제(0.5M DTT, 10x, 카탈로그 번호 NP0004)
Figure pct00045
써모(Thermo)제의 비환원성 완충제(4X, 카탈로그 번호 84788)
Figure pct00046
시그마제의 PBS(카탈로그 번호 P4417)
Figure pct00047
EMD 케미칼스제(EMD Chemicals)의 트윈(Tween) 20(카탈로그 번호 9480)
Figure pct00048
시그마제의 BSA(카탈로그 번호 A7906)
Figure pct00049
인비트로젠 제의 겔 전달 장치(iBLOT 카탈로그 번호 IB401001)
Figure pct00050
밀리포어(Millipore)제의 PVDF(임모빌론(Immobilon)-P, 카탈로그 번호 IPVH07850) 전달 막
이 분석에서 단클론성 항체 대신 다클론성 항체를 사용하여 r퓨린 분해 산물의 검출을 증가시켰다. 5㎕의 샘플을 1㎕의 10x DTT, 및 4㎕의 4x 비환원성 염료와 합하였다. 샘플을 70℃ 내지 75℃에서 10분 동안 가열하였다. 10㎕의 샘플을 4 내지 20% SDS-PAGE 겔에 부하하였고, 150V에서 60 내지 70분 동안 실행하였다. 20V에서 6분 동안 iBLOT를 사용하여 PVDF 막에 전달하였다. 그 다음에 PVDF 막을 0.1% 트윈(TWEEN) 20 및 3% BSA를 함유하는 PBS 완충제로 1시간 동안 차단시켰다. 막을 동일한 완충제로 125배 희석시킨 1차 항체 중에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 5분 동안 PBST 완충제로, 각각 3회 세척하였다. 막을 1차 항체와 동일한 완충제로 10,000배 희석시킨 2차 항체 중에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 시간은 1시간이었다. PBST 완충제를 사용하여 5분 동안 블롯을 각각 3회 세척하였다. 10㎖의 사전혼합한 크로마제닉 기재(1㎖ 농축물 + 9㎖의 안정한 페록시다제 완충제)에서 블롯을 발생시킨 다음에 10분 동안 물로 세척하였다.
실시예 7 - 퓨린 조성물의 희석에 대한 안정제의 효과
출발 제형 및 그것의 희석제와 안정화된 제형 및 안정화된 희석제를 비교하기 위한 r퓨린 희석 연구를 수행하였다. 연구는 rVWF 성숙 과정에 사용된 희석 방법을 모방하였다. 간략하게, r퓨린 BDS는 필터를 통과시킨 후 희석제의 200배 용적으로 첨가하였다. 시험 희석 방법과 시작 희석 방법 사이의 주된 차이는 시험(고도로 안정화된) 방법에서, 75ppm 폴리솔베이트 80이 r퓨린 BDS와 희석제 둘 다로 존재하는 반면, 시작 방법에서, r퓨린 BDS 또는 희석제 중의 하나에서 폴리솔베이트 80이 없다는 것이다.
두 희석 실험을 수행하였고, 둘 다 안정화된 제형과 그것의 안정화된 희석제의 조합은 시작되는 퓨린과 희석제 제형보다 우수하다는 것을 나타내었다. 제1 실험에서, 안정화된 제형을 사용하는 시험 방법은 예상된 r퓨린 활성의 83% 내지 87%를 회복한 반면, 대조군 방법은 단지 21% 내지 22%를 회복하였다(표 18). 이 실험에서, r퓨린 샘플은 필터를 통과시킨 후 희석제의 200배 용적으로 첨가하였다. 여과액을 백(bag)에 수집한 다음, 눈금 실린더에 옮겼다.
비이온성 계면활성제와 함께 그리고 비이온성 계면활성제 없이 수행한 r퓨린 희석 실험의 실험 결과
샘플 활성( IU ) 표준 편차 희석인자 예상된 활성( IU ) 회복(활성%)
출발 물질 25,953 1,118 1 N/A N/A
여과 후 대조군 제형 백으로부터 27.264 2.815 200 129.8 21.0
실린더로부터 28.3 1.56 200 129.8 21.8
여과 후 새로운 제형 백으로부터 108.137 6.611 200 129.8 83.3
실린더로부터 113.4 5.21 200 129.8 87.4
제2 실험에서, 시험 방법은 예상된 r퓨린 활성을 회복한 반면, 대조군 방법은 27%만을 회복하였다(표 19). 이 실시형태에서, r퓨린 샘플은 필터를 통과시킨 후 희석제의 200배 용적으로 첨가하였다. 여과액을 실린더에 수집하였다. 안정화된 r퓨린 제형과 안정화된 희석제의 조합물은 대조군 방법에 비해 3배 내지 4배로 r퓨린 회복을 증가시켰다. 개선된 회복은, 이론에 제한되지 않고, 폴리솔베이트 80의 존재와 관련된다.
비이온성 계면활성제와 함께 그리고 비이온성 계면활성제 없이 수행한 r퓨린 희석 실험의 실험 결과
샘플 활성( IU ) 표준 편차 희석 인자 예상된 활성( IU ) 회복(활성%)
출발 물질 32,379 1,654 N/A N/A N/A
여과 후 대조군 제형 44.267 1.607 200 161.9 27.3
여과 후 새로운 제형 129.646 11.514 200 161.9 80.1
실시예 8 - 안정화된 제형 저장 완충제의 특징
안정화된 r퓨린 제형(500mM HEPES, 400mM 아세트산, 1mM CaCl2, pH 6.0)에 대한 저장 완충제를 일괄하여 만들 수 있다(표 20). pH 및 전도도에 대한 RSD는 < 0.3%이었다. pH는 온도와 약간 및 간접적으로 상관관계가 있었고, ℃ 당 0.014 단위로 떨어진 한편, 전도도는 온도와 직접적으로 상관관계가 있었으며, ℃ 당 0.40 mS/㎝로 상승되었다(도 49). pH 및 전도도를 측정하였을 때 샘플의 평균 온도는 27.6℃였다. 제조 시, 샘플을 25±0.5℃에서 판독한다. 도 48의 선형 회귀에 기반하여, 예상한 pH 및 25℃에서 전도도를 계산하였다. 표 20으로부터의 상대적 표준 편차를 이 값에 적용하여 예상 범위를 결정하였다(±3 sd). 25℃에서 pH는 6.04(±0.01)가 되는 것으로 예상한다. 25℃에서 전도도는 19.9±0.2 mS/㎝가 되는 것으로 예상한다. 이 예상 범위는 제한된 환경 하에서 만들어지는 3개의 로트를 기반으로 한다. 완충제에 대한 사양 범위는 엄격하게 설정될 필요가 없다. pH 사양은 최종 BDS pH 사양, 즉 5.90 내지 6.10과 동일할 것이다. 전도도 범위는 앞의 BDS 완충제에 대해 사용한 것과 유사할 것이며, 예를 들어 15.9 내지 23.9 mS/㎝의 사양에 대해 ±20%의 범위이다. rVWF 과정의 필요는 완충제 사항의 설정하는데 문제를 갖지 않는데, r퓨린이 rVWF 과정에서 200배로 희석될 것이기 때문이다. 표 21 및 표 22의 실험 데이터는 도 49에 제시한 그래프에 대응된다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
참고문헌
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개개 간행물 또는 특허 또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 그의 전문이 모든 목적을 위하여 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원의 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 명백할 바와 같이 본 출원의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시형태는 단지 예로서 제공되며, 본 출원은 특허청구범위에 부여된 등가물의 전체 범주에 따라 첨부되는 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

Claims (56)

  1. 재조합 퓨린(recombinant furin: r퓨린)의 안정화된 수성 조성물로서, 상기 조성물은,
    (a) 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린;
    (b) 100mM 내지 300mM의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 0.5mM 내지 2mM 칼슘;
    (d) 2% 내지 20% 당 또는 당 알코올;
    (e) 10 내지 200ppm 비이온성 계면활성제;
    (f) 10 내지 200mM 완충제; 및
    (g) pH 5.5 내지 7.5를 포함하는, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 150mM 내지 250mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 190±10mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 190mM의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨인 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염화칼륨인 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 0.9±0.2mM 칼슘을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 0.92mM 칼슘을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5% 내지 15% 당 또는 당 알코올을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 10±2% 당 또는 당 알코올을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 10% 당 또는 당 알코올을 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 또는 당 알코올은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 또는 당 알코올은 당 또는 당 알코올은 트레할로스인 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 또는 당 알코올은 수크로스인 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 10ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 50ppm 내지 100ppm 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 75ppm 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트-80인 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 50mM 내지 150mM 완충제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 90±10mM 완충제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 91mM 완충제를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  22. 제1항 내지 제21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 아세테이트를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  23. 제1항 내지 제21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 HEPES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  24. 제1항 내지 제21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 MES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  25. 제1항 내지 제21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 아세테이트 및 HEPES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 25mM 내지 75mM 아세테이트 및 25 내지 75mM HEPES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 45±5mM 아세테이트 및 45±5mM HEPES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 45mM 아세테이트 및 46mM HEPES를 포함하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  29. 제1항 내지 제28 중 어느 한 항에 있어서, pH 5.5 내지 7.0을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, pH 5.5 내지 6.5를 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  31. 제30항에 있어서, pH 6.0±0.2를 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  32. 제31항에 있어서, pH 6.0을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 37℃에서 저장될 때 증가된 안정성을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 37℃에서 저장될 때 더 높은 백분율을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 조성물은 당 또는 당 알코올을 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 37℃에서 저장될 때 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체 함량을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 교반될 때 증가된 안정성을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 교반될 때 더 높은 백분율의 r퓨린 활성을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 교반될 때 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체 함량을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 희석될 때 증가된 안정성을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 희석될 때 더 높은 백분율의 r퓨린 활성을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유하지 않는 r퓨린 조성물에 비해, 희석될 때 더 높은 백분율의 r퓨린 단량체 함량을 유지하는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  42. 재조합 퓨린(r퓨린)의 안정화된 수성 조성물로서, 상기 조성물은,
    (a) 8,000 U/㎖ 내지 500,000 U/㎖ r퓨린;
    (b) 190mM 염화나트륨;
    (c) 0.92mM 칼슘;
    (d) 10% 트레할로스;
    (e) 75ppm 폴리솔베이트 80;
    (f) 45mM 아세트산;
    (g) 46mM HEPES; 및
    (g) pH 5.5 내지 7.5를 포함하는, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  43. 제42항에 있어서, pH 5.5 내지 7.0을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  44. 제42항에 있어서, pH 5.5 내지 6.5를 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  45. 제42항에 있어서, pH 6.0±0.2를 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  46. 제42항에 있어서, pH 6.0을 갖는 것인, 재조합 퓨린의 안정화된 수성 조성물.
  47. 수성 r퓨린 조성물을 희석시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 수성 r퓨린 조성물에 10ppm 내지 200ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 희석 완충제를 첨가함으로써, 희석된 r퓨린 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 희석 완충제는 10ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 희석 완충제는 50ppm 내지 100ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 희석 완충제는 75ppm의 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석 완충제는 pH 5.5 내지 7.5를 갖는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 희석 완충제는 pH 5.5 내지 6.5를 갖는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 희석 완충제는 pH 6.0±0.2를 갖는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 희석 완충제는 pH 6.0를 갖는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  55. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석된 r퓨린 조성물은 희석 전 수성 r퓨린 조성물에 존재하는 r퓨린 활성의 적어도 50%를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 희석된 r퓨린 조성물은 희석 전 수성 r퓨린 조성물에 존재하는 r퓨린 활성의 적어도 75%를 포함하는 것인, 수성 재조합 퓨린 조성물의 희석방법.
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