CN101910401A

CN101910401A - 基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶及其生产方法

Info

Publication number: CN101910401A
Application number: CN2008801240838A
Authority: CN
Inventors: 巴巴拉·普莱莫尔; 西蒙·冯菲尔克斯; 利奥波德·格里尔博格; 梅因哈德·哈希拉彻; 罗兰·盖伊尔; 阿图尔·米特雷尔; 曼弗雷德·赖特尔
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Hundred deep company; Hundred deep limited liability company
Priority date: 2007-12-31
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-12-08
Also published as: NZ586411A; SG192471A1; AR069892A1; EP2240578A1; BRPI0821467B1; CA2710260C; US9127264B2; BRPI0821467A2; PL2240578T3; AR113492A2; CN110066782B; ES2735173T3; KR20100114057A; ES2897561T3; MX2010007344A; AU2008346817A1; SG10201805749QA; US20090181423A1; JP5806465B2; DK2240578T3

Abstract

本发明涉及重组体弗林蛋白酶(rFurin)及生产rFurin的方法。更具体地说，本发明涉及基本上无动物蛋白的rFurin以及生产基本上无动物蛋白rFurin的方法。

Description

基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶及其生产方法

本申请要求于2007年12月31日申请的美国临时专利申请No.61/018,152的优先权，将其全部并入此文以供参考。

技术领域

本发明通常涉及重组体弗林蛋白酶(rFurin)及生产rFurin的方法。更具体地说，本发明涉及基本上无动物蛋白的rFurin以及生产基本上无动物蛋白rFurin的方法。

背景技术

在生物机体中活性的或者成熟的蛋白质通常存在的量是很低的。因此，它们的前蛋白或者酶原在体内优选地通过它们与活化酶(比如蛋白酶)相接触从而被活化。前蛋白(或者蛋白前体)是没有活性的蛋白，它们通过一种或多种的翻译后修饰以及尤其是通过将前肽从前蛋白中切除从而变得有活性。前蛋白的例子包括：比如胰岛素原、凝血酶原、前冯威勒布兰特因子(前VWF)等等。

冯威勒布兰特因子(VWF)是涉及凝血的血液糖蛋白。在冯威勒布兰特病中，VWF是缺乏的或者是有缺陷的，并且VWF涉及其他许多疾病，包括血栓性血小板减少性紫癜、Heyde′s综合症以及有可能的溶血的尿毒症综合症。VWF是以一系列多聚体的形式在血浆中循环的糖蛋白，大小范围从大约500至20000kD。VWF的多聚体形式是由250kD的多肽亚基组成，这些亚基通过二硫键相互连接。VWF介导初始的血小板粘附至受损伤的血管壁的内皮下膜，并且人们认为只有大的VWF多聚体才能显示出止血活性。具有大分子量的VWF多聚体储存在内皮细胞的怀布尔-帕拉德体(Weibel-Pallade bodies)中，并且一旦受到刺激就被释放出来。释放出来的VWF然后更进一步地被血浆蛋白酶加工以便生成低分子量形式的VWF。

在人类体内，前肽的去除几乎是完全的，然而，在具有高水平的重组体VWF表达的哺乳动物细胞系中，这个过程不是非常有效的。因此，来自于这种重组细胞系的细胞培养上清液中通常包含成熟VWF和VWF前体比如前VWF的混合物。为了获得成熟的VWF，因此将VWF前体尤其是前VWF转化为成熟的VWF是必要的。这个过程通常是通过利用蛋白酶将前肽切除来完成的。

当前生产成熟的VWF的常规方法是：或者通过将VWF前体与蛋白酶在液相中一起温育，借此在游离溶液中呈未结合状态进行自身熟化(即将前肽从前蛋白中切除)；或者如同例如WO 00/49047所述，通过将蛋白酶固定在固体载体上，蛋白酶与含有前VWF的制品相接触并温育(参见WO 00/49047)。但是，相对于根据本发明的方法，这些方法包括了许多缺点。

工业上，VWF并且尤其是重组体VWF连同重组体因子Ⅷ(rFⅧ)一起在基因工程化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中被合成和表达。在细胞培养过程中，rVWF的共表达的作用是用来稳定rFⅧ。在细胞中rVWF是以前体的形式合成的，包含连接于N末端的大的前肽。一旦在内浆网和高尔基体中成熟，就通过细胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用将前肽切除，并且成熟蛋白质以同样的亚基均聚物形式被分泌出来，均聚物由被表达蛋白的二聚体组成。然而，成熟过程一般是不完全的，导致产物包括前VWF和成熟VWF的混合物。

以前的出版物已经显示，前VWF可以通过利用弗林蛋白酶或者类似弗林蛋白酶的蛋白酶在体外加工处理而转变为成熟的VWF(Schlokat et al.，Biotechnol.Appl.Biochem.24：257-267，1996；Preininger et al.，Cytotechnology 30：1-15，1999；以及EP 0775750A)。尤其是，EP 0775750A建议将弗林蛋白酶和VWF重组地共表达以致于VWF可以在原位发生成熟。

通过将精氨酸741-丝氨酸742肽键切开，重组弗林蛋白酶(rFurin)将前rVWF(前重组冯威勒布兰特因子)转换成rVWF。这个成熟步骤是用于治疗冯威勒布兰特病B型的rVWF产生过程的一部分，以及是用于重组因子Ⅷ-半衰期(rFⅧ-HL)的生产过程的一部分。弗林蛋白酶属于前蛋白转化酶家族，并依赖于钙离子(Ca²⁺)。弗林蛋白酶特异性地切断特定序列中C末端的精氨酸肽键，此序列包含1位和4位上的精氨酸。在人的许多蛋白上都能发现此序列，表明弗林蛋白酶在许多人类前蛋白的成熟过程中起着重要的作用。

活化蛋白的生产具有高度的临床和诊断价值。例如，活性的或者成熟的蛋白比如成熟的VWF，可以被用于控制血液凝固。本发明提供了改进的基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶(rFurin)，用于随后的活化蛋白的生产。更具体地说，本发明提供基本上无动物蛋白的rFurin，用于将前VWF转化为成熟的VWF。

发明内容

本发明提供了基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶(rFurin)及其生产方法。这种rFurin是基本上不含那些与rFurin的产生可能正常相关的其它蛋白，例如血清蛋白和寄主细胞蛋白。这种rFurin使得随后生产出具有高比活性和高纯度的成熟蛋白，并且没有与rFurin制备中蛋白污染相关的副作用。更具体地说，此rFurin使得生产出具有高比活性和高纯度的成熟VWF。因此，本发明提供用于筛选重组寄主细胞并使之适应化学确定的培养基、表达被分泌进细胞培养上清液中的rFurin、以及细胞除去后的rFurin纯化的方法。

本发明中基本上无动物蛋白的rFurin包括rFurin制品或者组合物，此rFurin制品或者组合物包括浓度范围是大约0.1至0.6ng之间或以下蛋白/单位弗林蛋白酶活性、或者大约2至11μg之间或以下蛋白/mL的寄主细胞蛋白，并且基本上没有来自于培养基中血清的污染蛋白。在一个实施例中，基本上无动物蛋白的rFurin包括rFurin制品，此rFurin制品包括浓度范围是大约0至0.4pg之间或以下DNA/单位弗林蛋白酶活性、或者大约0至24ng之间或以下DNA/mL的污染性寄主细胞DNA，并且基本上没有来自于培养基中血清的污染蛋白。

本发明包括组合物，此组合物包含活性至少是10000U弗林蛋白酶/mL的基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约11μg蛋白/mL的寄主细胞蛋白。这种组合物同样可以包含浓度小于大约1.0ng/U弗林蛋白酶活性的寄主细胞蛋白。在一个实施例中，寄主细胞蛋白是来自于CHO细胞。

在另一个实施例中，本发明包括组合物，此组合物包含活性至少是10000U弗林蛋白酶/mL的基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约14ng DNA/mL的寄主细胞DNA。在许多实施例中，这种组合物同样可以包含浓度小于大约0.5pg/U弗林蛋白酶活性的寄主细胞DNA。在一个实施例中，寄主细胞DNA是来自于CHO细胞。

本发明也包括组合物，此组合物包含弗林蛋白酶比活性至少是大约100U/μg的基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶和浓度小于大约11μg蛋白/mL的寄主细胞蛋白。这种组合物同样可以包含浓度小于大约1.0ng蛋白/U弗林蛋白酶活性的寄主细胞蛋白。在一个实施例中，寄主细胞蛋白是来自于CHO细胞。

本发明更进一步地包括组合物，此组合物包含弗林蛋白酶的比活性至少是大约100U/μg的基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶和浓度小于大约14ng DNA/mL的寄主细胞DNA。这种组合物同样可以包含浓度小于大约0.5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的寄主细胞DNA。在一个实施例中，寄主细胞DNA是来自于CHO细胞。

本发明同样包括生产本申请中所述包含基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶的组合物的方法。这些方法包括下述步骤：使寄主细胞适应生长在逐渐降低血清浓度、直至所有的血清从培养基中除去的培养基中。在另一个实施例中，此方法包括下述步骤：使寄主细胞由在含有血清的培养基中生长转移至在无血清的培养基中生长。在一个典型的实施例中，寄主细胞是CHO细胞。

本发明包括应用本申请中所述的包含基本上无动物蛋白的重组弗林蛋白酶的组合物的方法。这些应用包括下述步骤：在可将前肽从前蛋白中切除从而形成成熟蛋白的条件下使前蛋白与组合物相接触。rFurin可被用于任何通过弗林蛋白酶切割前蛋白而由前蛋白形成成熟蛋白。在一个实施例中，此成熟蛋白是冯威勒布兰特因子。在另一个实施例中，此成熟蛋白是因子Ⅷ。此外，本发明预期本发明的rFurin可用于通过rFurin切割的任何前蛋白的体外和体内加工。

附图说明

根据附图本发明给出更进一步的阐述，如在下述图1-18中所示。

图1描述了在本发明的一个实施方式中的被表达的活性rFurin蛋白酶构建体。rFurin构建体在C末端的氨基酸577位点处截断以便除去富含半胱氨酸的贯穿细胞膜和细胞液的结构域。

图2描述了CHO/rFurin克隆#488-3产生的谱系。

图3显示了CHO/rFurin克隆#289-20产生的谱系。

图4描述了在PMCB#01和PMCB#04中的细胞种群中rFurin产生者的分布图的比较。在PMCB#04中80.74％的细胞表达rFurin；在PMCB#01中74.06％的细胞表达rFurin。

图5显示了“Doehlert矩阵”，其中5个温度与3个pH值组合得到7种温度和pH的组合。

图6显示根据体积生产率数据的表面曲线图分析。图6中数据的坐标被标记为点。表面显示了假设的单个数据的相关性。

图7显示了显示温度和pH对体积生产率的影响的等高线图。圆点表明已经通过实验测试的条件(pH/温度)。

图8显示了三维图表的表面曲线图，说明了温度对体积生产率强烈的影响和pH对体积生产率的微弱影响。

图9显示了用三维显示模型相关性的表面曲线图；它表明了平方关系并且清楚地显示了在36.5℃下生长速率的最大值。

图10给出了根据比生产率的数据分析。比生产率与温度及pH的相关性与体积生产率所示的相似。

图11显示，通过温度从37℃降低至35.1℃，体积生产率可以从大约200kU/L/d增加至540kU/L/d。

图12显示了rFurin的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染情况。ORFU06002和ORFU07002系列的Capto-MMC洗脱物的条带模式相互关联度很高；所有样品在大约60kDa处显示了明显的弗林蛋白酶条带。在ORFU06002系列的样品中从MMC01批次到MMC08批次可以看见弗林蛋白酶条带有分子量轻微降低的趋势(图12，泳道1-8)。

图13显示通过使用单克隆抗弗林蛋白酶抗体的样品的蛋白质印迹分析。

图14显示了ORFU06002系列的rFurin样品的等电聚焦((IEF)和随后的蛋白质印迹法中rFurin特定的条带模式。

图15显示了ORFU07002系列的rFurin样品的等电聚焦(IEF)和随后的蛋白质印迹法中rFurin特定的条带模式。

图16显示了ORFU07002系列的rFurin样品的等电聚焦(IEF)和随后的蛋白质印迹法中rFurin的蛋白质印迹结果。

图17显示了弗林蛋白酶的反相HPLC，用于ORFU06002系列(Capto-MMC洗脱物)的样品。样品通过C4RP-HPLC检测以便建立rFurin的指纹图谱。

图18显示了弗林蛋白酶的反相HPLC，用于ORFU07002系列(Capto-MMC洗脱物)的样品。样品通过C4RP-HPLC检测以便建立rFurin的指纹图谱。

具体实施方式

本发明涉及重组寄主细胞系的开发和生产，此寄主细胞系能够在无血清培养基中生长并且分泌活性重组弗林蛋白酶(rFurin)至细胞培养上清液中。在一个实施例中，经选择用于转染编码重组弗林蛋白酶质粒的寄主细胞系与用于重组因子Ⅷ和重组VWF表达的寄主细胞系相同。生成的rFurin然后被纯化，所以rFurin基本上不含动物蛋白。

弗林蛋白酶，也已知为比如PACE、PACE4、PC1/PC3、PC2、PC4和PC5/PC6，都属于枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶组，在前蛋白的切割上起重要作用，尤其是在分泌合成中(Van de Ven et al.，Crit.Rev.Oncogen.4：115-136，1993)。前蛋白是通过高尔基体中的内源蛋白酶在翻译后、胞内加工成成熟形式。蛋白酶的切割位点包括具有精氨酸-X-赖氨酸/精氨酸-精氨酸的氨基酸序列特征的可识别序列。蛋白酶弗林蛋白酶可特异性地在此共有序列之后切割前蛋白(Hosaka et al.，J.Biol.Chem.266：12127-12130，1991)。

人和小鼠的弗林蛋白酶的DNA和氨基酸序列、以及具有枯草杆菌蛋白酶样的蛋白酶功能的其它蛋白质已经被鉴定(Roebroek等人，MoI.Biol.Rep.11：117-125，1986；Roebroek等人，EMBO J.5：2197-2202，1986；Barr等人，DNA Cell Biol.10：319-328，1991；Van denOuweland等人，Nucleic Acids Res.17：7101-7102，1989；Van den Ouweland等人，NucleicAcids Res.18：664，1990；Smeekens等人，1990，J.Biol.Chem.265：2997-3000；Smeekens等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA.88；340-344，1991；Kiefer等人，DNA Cell Biol.10：757，1991；Nakayama等人，J.Biol.Chem.267：5897-5900，1992；以及Hatsuzawa等人，J.Biol.Chem.265：22075-22078，1990)。人的弗林蛋白酶基因编码由794个氨基酸组成的蛋白质，特定的功能被分配至各个特征性区域：催化中心，中间结构域，富含胱氨酸区域，跨膜结构域以及细胞质结构域(Van de Ven et al.，Crit.Rev.Oncogen.4：115-136，1993)。在一个实施例中，被陈述的人弗林蛋白酶多肽的GenBank登录号是：EAX02111(国立生物技术信息中心，美国国家医学图书馆，Bethesda，马里兰州)。然而，本领域中技术人员会理解，任何具有弗林蛋白酶生物活动性即切割前蛋白的能力(比如前VWF生成成熟的VWF)的蛋白，都能通过本文描述的方法来生产。

完整的弗林蛋白酶被吞进入高尔基体的薄膜系统，在此它在是有功能活性的。被过量表达的75-80kD的天生的弗林蛋白酶的截断形式能够作为分泌性蛋白在细胞上清液中被检测出来(Wise et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9378-9382，1990)。这种自然分泌的弗林蛋白酶被认为是“棚式(shed)弗林蛋白酶”(Vidricaire et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.195：1011-1018，1993)并在N末端被切除贯穿细胞膜的部分。

通过基因工程被截断的弗林蛋白酶，其中贯穿细胞膜结构域和胞质结构域的编码部分被删除，也可以相应地被表达和被分泌。已经描述过这种N-末端缺失：氨基酸714-794(Leduc等人，J.Biol.Chem.267：14304-14308，1992，Molloy等人，J.Biol.Chem.267：16396-16402，1992)；氨基酸716-794(″SoI-PACE″)(Wasley等人，J.Biol.Chem.268：8458-8465，1993；以及Rehemtulla等人，Blood 79：2349-2355，1992)；氨基酸705-794(Hatsuzawa等人，J.Biol.Chem.267：16094-16099，1992)。另外也描述过包括删除富含胱氨酸区域的弗林蛋白酶变异体(Hatsuzawa等人，J.Biochem.101：296-301，1992；Creemers等人，J.Biol.Chem.268：21826-21834，1993)。

弗林蛋白酶的内切蛋白酶活性和它对于碱性氨基酸的选择性首先是在使用前冯威勒布兰特因子(前VWF)的实验中被确定。前vWF由具有741个氨基酸的前多肽和具有2050个氨基酸的成熟冯威勒布兰特因子(vWF)组成(Verweij等人，EMBO J.5：1839-1847，1986)。从前vWF中释放的成熟vWF源于在精氨酸763之后的蛋白水解切割。前vWF cDNA在真核表达载体中的转染结果是在细胞培养上清液中生成相同量的360kD的前vWF和260kD的成熟vWF。VWF在被转染的细胞中可能通过内源生成的弗林蛋白酶被加工成它的成熟型(Wise等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9378-9382，1990，Van de Ven等人，MoI.Biol.Rep.14：265-275，1990)。

在其它的可通过弗林蛋白酶或者枯草杆菌蛋白酶样的酶切割的前蛋白中，分别有激素和生长因子系列(如前活化素A、肝细胞生长因子)，血浆蛋白(白蛋白、因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ)，受体(胰岛素前受体)，病毒蛋白(如HIV-1gp160、流感病毒血细胞凝集素)以及细菌蛋白(白喉毒素、炭疽毒素)(Decroly等人，J.Biol.Chem.269：12240-12247，1994；Stieneke-Grober等人，EMBO J.11：2407-2414，1992；Barr，Ce//66：1-3，1991，Wasley等人，J.Biol.Chem.268：8458-8465，1993；Klimpel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10277-10281，1992；Tsuneoka等人，J.Biol.Chem.268：26461-26465，1993；Bresnahan等人，J.Cell.Biol.111：2851-2859，1990；Hosaka等人，J.Biol.Chem.266：12127-12130，1991；以及Vey等人，J.Cell.Biol.127：1829-1842，1994)。本发明中的rFurin被预期也是用于切割这些前蛋白。

通过在真核细胞培养物中共表达编码完整的弗林蛋白酶和一种前蛋白的核酸序列，在体内可以获得提高的前蛋白加工。这已经可以得到证明，比如前因子Ⅸ(Wasley等人，J.Biol.Chem.268：8458-8465，1993)和前vWF(WO 91/06314；Van de Ven等人，MoI.Bio.Rep.14：265-275，1990；和Rehemtulla等人，Blood 79：2349-2355，1992)。本发明预期本发明的rFurin可用于体外和体内通过rFurin切割的任何前蛋白的加工。

除了完整的弗林蛋白酶和前蛋白共表达，截断的弗林蛋白酶也能和前蛋白一起表达。当弗林蛋白酶缺失突变体在体内共表达和被分泌时已经被证明是有酶活性的；这种缺失突变体的酶活性尤其可以在前因子Ⅸ的加工中被检测出来(Wasley等人，J.Biol.Chem.268：8458-8465，1993)和前vWF(Rehemtulla等人，Blood 79：2349-2355，1992)。弗林蛋白酶缺失突变体的共表达实验已经表明，弗林蛋白酶的贯穿细胞膜和胞质的部分对于催化功能不是必需的(Rehemtulla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8235-8239，1992)。

WO91/06314公开了在原核和真核细胞中弗林蛋白酶的重组表达，弗林蛋白酶融合蛋白、缺失突变体和片段的制品，重组制备的弗林蛋白酶的纯化以及纯化的弗林蛋白酶通常用于体外前蛋白加工的潜在用途。WO 92/09698描述了PACE(弗林蛋白酶)的表达，和蛋白质无活性前体比如前vWF的共表达，以及融合蛋白的制备。Stieneke-Grober等人(EMBO J.11：2407-2414，1992)描述了体外通过纯化的弗林蛋白酶切割流感病毒HA蛋白。Decroly等人(J.Biol.Chem.269：12240-12247，1994)描述了体外通过弗林蛋白酶切割HIV gp 160。

在利用C末端缩短的弗林蛋白酶的实验中，在体外已经成功地进行了前白蛋白和补体前C3(Oda等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.189：1353-1361，1992)、炭疽毒素(Klimpel等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA 89：10277-10281，1992)、白喉毒素(Tsuneoka等人，J.Biol.Chem.268：26461-26465，1993)和前因子Ⅸ(Wasley等人，J.Biol.Chem.268：8458-8468，1993，Bristol et al.，Biochemistry 33：14136-14143，1994)的切割。

因此如上所述本发明中的rFurin被预期用于这些前蛋白的体内和体外加工。在一个实施例中，本发明的rFurin在前vWF和前因子Ⅸ的体外加工中是尤其有用的。然而，不能认为它的使用仅局限于上述蛋白的加工。在进一步的一个实施例中，本发明的rFurin在重组前蛋白的体外加工中是尤其有用的。

本发明的进一步的方面是表达前vWF和rFurin的细胞的共培养。因此细胞培养上清液中的前vWF被同样存在于细胞培养上清液中的rFurin在体外切割成其活性形式。如同在美国专利No.6,210,929中所述的那样，其被并入本文以供参考，被加工的vWF随后从培养物中被分离出来并且被纯化。对于共培养，可以使用所有常用的表达系统，也可以将表达前vWF和rFurin的不同系统互相组合起来使用。在一个实施例中，使用一种表达系统，其中前vWF和rFurin两者都可在相同来源的寄主细胞中表达。

术语“寄主细胞”指的是已经被核酸序列转化，或者能够被该核酸序列转化，然后表达经选择的正在研究中的基因的细胞。该术语包括亲代细胞的后代，只要被选择的基因还存在于细胞中，无论后代在形态学上或者在基因组成上是否与最初的亲本一样。

本发明包括任何寄主细胞或者在本领域中任何已知的用于重组蛋白产物的寄主。因此，本发明的细胞可以来自于任何来源。在一个实施例中，本发明包括真核的和原核的寄主细胞。在另一个实施例中，本发明包括植物细胞、动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。在一个实施例中，典型的酵母细胞包括：毕赤氏酵母属，比如嗜甲醇毕赤酵母；和酵母属比如酿酒酵母；以及裂殖酵母属(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，比如K.Zactis，K.fragilis，K.bulgaricus，K.wickeramii，K.waltii，K.drosophilarum，K.thernotolerans和K.marxianus，K.yarrowia；李氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙链孢霉，许旺酵母(Schwanniomyces)，比如Schwanniomyces occidentalis；链孢霉；青霉属；弯颈霉(Totypocladium)，曲菌属，构巢曲霉，黑曲霉，汉逊酵母(Hansenula)，念珠菌属，克勒克酵母属，球拟酵母病和蔷微色酵母属。典型的昆虫细胞包括苜宿银纹夜蛾和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)以及果蝇。

在进一步的实施例中，寄主细胞是哺乳动物细胞，包括主要的上皮细胞(如角质形成细胞，颈的上皮细胞，支气管的上皮细胞，气管的上皮细胞，肾脏上皮细胞和视网膜的上皮细胞)和被建立的细胞系以及它们的菌株(比如293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa颈的上皮细胞和PER-C6枧网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、Hela229细胞、Hela S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LS180细胞、LS 174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI 2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GH1细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MH1Ci细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I，B1细胞，或者它们的衍生物)，来自于任何组织或者器官的成纤维细胞(包括但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠管、食管，胃部、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺的、扁桃体、骨髓和血液)、脾脏和成纤维细胞和成纤维细胞类似细胞系(比如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜胺酸血症(citrullinemia)细胞、Dempsey细胞、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞WI-38细胞、WI-26细胞、MiCh细胞CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C.sub.3H/IOTI/2细胞、HSDM1C3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、Strain2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472及2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、Indian muntjac细胞、SIRC细胞、C.sub.ll细胞和Jensen细胞，或者它们的衍生物。)

典型的哺乳动物细胞包括各种CHO、BHK、HEK-293、NSO、YB2/3、SP2/0和人的细胞如PER-C6或HT1080，以及VERO、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat、Saos、PC-12、HCT 116、L929、LIk-、WI38、CV1、TM4、W138、Hep G2、MMT、白血病细胞，胚胎干细胞或者受精卵细胞。在本发明的一个实施例中，典型的寄主细胞是CHO细胞。在本发明进一步的方面，培养基被用于在悬浮液中培养CHO细胞。

寄主细胞可以用本领域中各种已知的方法被工程化来表达蛋白质，这些方法包括，但不限于：插入编码想要的蛋白的外源核酸，可选择地作为表达载体的一部分；插入外源表达控制序列，以致于能引起寄主细胞中编码想要的蛋白的内源基因的表达增加；或者活化寄主细胞内源表达控制序列，以便增加编码想要的蛋白的内源基因的表达。

寄主细胞培养物可以根据本领域中任何已知的方法来制备，培养寄主细胞和回收细胞产生的重组蛋白(无论是从细胞或者培养基中)的方法也是本领域中已知的。这种培养方法可以包括向培养基中添加用于蛋白质生产的化学诱导剂。典型的寄主细胞和步骤如下文所述。

编码弗林蛋白酶多肽的核酸通过使用标准的分子生物学技术被插入合适的表达载体中。在一个实施例中，GenBank登录号：EAX02111(国家生物技术信息中心，美国医药国家图书馆，Bethesda，MD)所显示的核酸编码人类弗林蛋白酶多肽。然而，本领域中技术人员会理解，任何具有弗林蛋白酶生物活动性(即切割前VWF生成成熟的VWF)的蛋白都能通过本文描述的方法来生产。在进一步的实施例中，通过删除编码氨基酸578至794的包含富含胱氨酸结构域、贯穿细胞膜结构域和胞浆结构域的核苷酸，设计出C末端截断的、被充分分泌的rFurin。在甚至更进一步的实施例中，可能添加氨基酸的尾部，以便有助于纯化过程。在另一个实施例中，含10个组氨酸残基的尾部被添加在氨基酸577之后，无论有或者没有中间的4个甘氨酸残基作为弹性连结物。

表达载体可选择地包括启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整的内含子序列、编码用于多肽分泌的引导或者信号序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区域、和/或选择性标记元件。每一个序列叙述如下。

可选择地，载体可以包含编码“标记物”的序列，即位于弗林蛋白酶多肽编码序列5′或3′末端的寡核苷酸序列；编码多聚组氨酸(如六聚组氨酸)或者另一种市场上可买到其抗体的“标记物”如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或真菌(myc)的寡核苷酸分子。在多肽刚表达后这种标记物一般就被融合于该多肽，并且可以用作检测或者亲和纯化来自于寄主细胞的弗林蛋白酶多肽的手段。

合适的载体包括，但不限于，粘端质粒、质粒或者修饰过的病毒，但是应理解这个载体系统必须适合被选择的寄主细胞。在一个实施例中，载体是质粒。在进一步的一个实施例中，质粒是基于pUC的克隆载体。可以被用于发明的其它载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、序列载体和逆转录病毒载体。本发明预期的载体包括，但不限于：用重组噬菌体、质粒、噬菌粒或者粘端质粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒、豇豆蚜传花叶病毒、烟草花叶病毒、TMV)转染的植物细胞系统；或者甚至动物细胞系统。

哺乳动物表达载体一般包含复制起点、合适的启动子以及任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起始点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以被用于提供要求的表达控制元件。典型的真核载体包括pcDNA3、pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和pVITRO。

核酸可以通过本领域中任何已知的方法被转移至寄主细胞中，比如通过脂质体介导转移、受体介导转移(配体-DNA复合体)、电穿孔、微量注射DNA、细胞融合、二乙氨基乙基葡聚糖、氯化钙、磷酸钙沉淀、微粒轰击、利用病毒载体感染、脂转染、转染或者同源重组。

此处使用的术语“转化”或者“转染”指的是寄主细胞经过修饰含有外源的多核苷酸，此多核苷酸可以并入寄主细胞的染色体中或者作为游离的元件被保留。预期在提供的方法的某些实施例中，寄主细胞在“转染步骤”被转染。该方法可以包含多重转染步骤。此外，本领域中其它已知的用于将外源的多核苷酸导入寄主细胞的方法包括，比如，电穿孔法和细胞融合。出描述目的，它们并不是技术上地“转化”，而是在术语“转化”的定义范围内。

本发明还提供了用于培养的方法，即在可引起rFurin蛋白表达的条件下培养寄主细胞。这些方法包括将寄主细胞产生的rFurin从培养基中回收的步骤。在一个典型的实施例中，寄主细胞是在化学限定的、无血清的培养基中生长。因为血清是生物化学上不明确的物质，包含许多并没有被充分鉴定的成分，批次和批次之间也有差别，并且经常被微生物例如病毒和支原体污染，所以在重组rFurin的生产中是不希望有血清的存在。此外，培养基中血清的动物蛋白的存在需要冗长的提纯步骤。

因此本发明提供生物化学限定的培养基，基本上没有动物蛋白，用于培养被人的弗林蛋白酶基因重组转染的细胞。培养基成分大部分是无机的、合成的或者重配的，并且不是直接从任何动物来源中获得的。

本发明的细胞培养基可以包含一种或多种替代化合物，也可以包含一种或多种可以与金属结合的代替化合物，并且/或者包含一种或多种包含一种或多种替代化合物的复合体。在一些实施方式中，培养基可以包含一种或多种复合体，上述复合体包含一种或多种过渡元素或者其盐或离子，它们与可以结合金属的一种或多种替代化合物相复合。在一些实施方式中，培养基能够在体外支持细胞培养并且允许其中培养的细胞的转染。

根据本发明的一个方面，过渡元素优选地选自于由下述元素组成的组：钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、锝、铷、铑、钯、银、镉、镧、铪、钽、钨、铼、锇、铱、银、金、汞和锕，或者其盐和离子，并且优选是铁盐。合适的铁盐包括但不限于FeCl₃、Fe(NO₃)₃或者FeSO₄或者其它含有Fe⁺⁺⁺或Fe⁺⁺离子的化合物。

培养基中结合金属的化合物包括任何可以与过渡元素相互作用或者与其结合、并且促进细胞对它们的摄取的大分子。这种作用/结合在自然界中可以是共价的或者非共价的。在本发明的一个实施例中使用的金属结合化合物优选地选自由下述化合物所组成的组：多元醇、羟基吡啶派生物、1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羟基苯酰)氨基-甲苯、乙二胺-N，N′-四亚甲基磷酸、翠苏素(trisuccin)、酸性糖类(如葡萄糖酸亚铁)、糖胺聚糖、二亚乙基三胺戊酸、尼克酸-N-氧化物、2-羟基-尼克酸、单取代2，2′-二吡啶、双取代2，2′-二吡啶、三取代2，2′-二吡啶、氧肟酸盐(hydroxamate)衍生物(如乙酰羟肟酸)、氨基酸衍生物、去铁胺、铁草氨菌素(ferrioxamine)、铁基卟吩和它的衍生物、DOTA赖氨酸、泰萨卟啉(texaphyrin)、萨普卟啉(sapphyrin)、多氨基羧酸、α-羟基羧酸、聚乙烯氨基甲酸盐、乙基麦芽酚、3-羟基-2-吡啶和IRC011。在一个实施例中，结合金属的化合物是多元醇例如山梨醇或者葡聚糖，尤其是山梨醇。在一个相关的实施例中，结合金属的化合物是羟基吡啶衍生物，如2-羟基吡啶-N-氧化物、3-羟基-4-吡喃酮、3-羟基哌吡啶-2-酮(3-hydroxypypyrid-2-one)、3-羟基吡啶-2-酮(3-hydroxypyrid-2-one)、3-羟基吡啶-4-酮、1-羟基吡啶-2-酮、1，2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羟基吡啶-2-酮、3-羟基-2(1H)-羟基吡啶酮、乙基麦芽酚或者吡哆醛异烟碱基腙。本发明的结合金属的化合物也可以结合二阶阳离子例如Ca⁺⁺和Mg⁺⁺。

本发明的培养基可以包含一种或多种成分，此成分选自由下述成分所组成的组：腺嘌呤、乙酸胺、D-葡萄糖、肝素缓冲剂、氢化可的松、胰岛素、亚油酸、硫辛酸、苯酚矿酞、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、三碘化甲腺氨酸、胸腺嘧啶核苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组胺酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、N-乙酰-半胱氨酸、生物素、氯化胆碱、D-Ca++泛酸、叶酸、肌醇、尼克酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、维他命B12、Pluronic F68、重组胰岛素、钙盐、CuSO₄、FeSO₄、FeCl₃、Fe(NO₃)₃、KCl、镁盐、锰盐、钼盐、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、Na₂SO₄、钒盐、镍盐、锡盐、ZnCl₂、ZnSO₄或者其他锌盐，其中每个成分添加的量能支持体外细胞的培养。

在一种实施方式中，本发明的培养基可以选择性地进一步包括一种或多种补充物，此补充物选自下组：一种或多种细胞因子、大豆蛋白胨、一种或多种酵母肽和一种或多种植物肽(大部分优选一种或多种大米、芦荟真皮、大豆、玉米、小麦、豌豆、南瓜、菠菜、胡萝卜、马铃薯、红薯、木薯、油梨、大麦、椰子和/或青豆、和/或一种或多种其它植物)，比如参见国际申请No.PCT/US97/18255，公布号是WO98/15614。

本发明的培养基可以优选地包括一种或多种缓冲剂以便维持一个最佳的pH。合适的缓冲剂包括但不限于：N-[2-羟乙基]-哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、重碳酸盐和其他适合用于细胞培养基应用的缓冲剂。合适的缓冲剂是可以提供缓冲能力并且基本上对培养的细胞没有细胞毒性的缓冲剂。选择合适的缓冲剂是在细胞培养领域中的常规技术范围内。

当上述的培养基成分在溶液中混和在一起时，形成了本发明的完全培养基。完全培养基适用于各种哺乳动物细胞的培养，在本文中会更加详细地描述。根据本文获得的信息和本领域中常规技术的知识，本领域的技术人员可以不用做很多实验就能获得可操作的培养基配方。

最初并且在适应在化学限定的无血清的培养基中生长之前，寄主细胞可以在本领域技术人员所熟知的标准培养基中生长。培养基通常包含所有必要的用于细胞生长和存活的营养物质。用于培养真核细胞的合适培养基是：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基1640(RPMI1640)、最低必需培养基(MEM)、和/或Dulbecco′s Modified Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F12和ExCeII325培养基，所有的培养基都可以添加血清和/或生长因子，如同在培养特定的细胞系时所显示的那样。然而，值得注意的是，本发明提供了将培养基中的血清从培养物中除去以便得到可以在无血清培养基中生长的寄主细胞的方案。因此，本发明提供了在无血清状态下的最佳培养基，用于培养寄主细胞，得到最大产量的rFurin。在一个进一步的实施例中，细胞在无血清的培养悬浮培养基中生长。本文的实施例部分提供了本发明中不同的培养基配方。

在一个方面，抗生素或者其他可用于转化细胞选择性生长的化合物被作为补充物被添加至培养基中。待使用的化合物被存在于转化细胞的质粒上的选择性标记元素指示。赋予对特定的通常对于动物细胞有毒性的药物抗性的选择性标记可被用于本发明的方法和组合物中。例如，当选择性标记元件是抗卡那霉素时，被加到培养基中的化合物是卡那霉素。其它用于选择性培养的化合物包括氨苄西林、四环素、遗传霉素、新霉素、佐奥霉素(zeomycin(zeo))；嘌呤霉素(PAC)；杀稻瘟菌素(BIaS)和GPT。附加的选择性标记在本领域中是已知的，并且在本发明的组合物和方法中是有用的。

在规定的条件下可以让细胞存活或者诱导细胞死亡的代谢酶类可以被用于本发明的方法和组合物中。其例子包括但不限于：二氢叶酸还原酶(DHFR)；单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT)和腺苷酸转磷酸核糖基酶(APRT)，这些基因可以分别被应用于缺乏TK、HGPRT或者APRT的细胞中。然而，本领域的技术人员可以理解，本发明的rFurin产物基本上不含这些添加的蛋白质。

培养基可以被用于培养任何寄主细胞或者在本领域中任何已知的用于重组蛋白生产的寄主。在本发明的一个实施例中，典型的寄主细胞是CHO细胞。在本发明进一步的实施例中，培养基被用于以悬浮方式培养CHO细胞。

当所研究的重组蛋白被寄主细胞分泌至培养基中时，培养基可以被周期性地收获，以致于可以使用相同的寄主细胞经过几个收获周期。培养基可以在分批过程中被添加，比如培养基在单个批次中被一次性添加至细胞，或者在分批补料过程被添加。分批补料过程中周期性地添加小批量的培养基。培养基可以在培养结束时或者在培养期间分几次来收集。连续灌注式生产过程同样在本领域中是已知的，并包括连续补料新鲜培养基进入培养液中，同时相同体积的培养基连续地从反应器中排出。灌注培养通常会比分批培养达到更高的细胞密度，并且在重复收获下可以维持几周或者几个月。因此，恒化培养和分批补料培养(batch reefed culture)两者都适用于rFurin的大量生产，如同本领域中其他已知的培养方法。

本领域中各种已知的培养系统包括：T烧瓶、转瓶和摇瓶、滚瓶和搅拌罐式生物反应器。转瓶培养通常是通过将细胞接种于转瓶中，转瓶被培养基部分地填充(如10-30％的体积)并缓慢地旋转，使得细胞附着于瓶子的侧面并生长至汇合。通过将上清液慢慢倒出来收获细胞培养基，并用新鲜培养基代替上清液。可以在微载体比如聚合球体上培养贴壁依赖性细胞，在被搅拌罐式生物反应器中微载体被维持悬浮状态。可选择地，细胞在单细胞悬浮液中生长。

寄主细胞产生的rFurin的量可以用本领域已知的标准方法来测定。这些方法包括，但不限于：蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、高压液相色谱(HPLC)分离、免疫沉淀、酶联免疫吸附试验和/或活性测试例如DNA结合凝胶位移测试。本发明同样预期使用本领域中已知的和本文所描述的标准方法来测定rFurin的比生产率(被表示为蛋白量/细胞/天)。

“基本上无动物蛋白的rFurin”被定义为包括rFurin制品，此rFurin制品包括浓度范围是大约0.1至0.6ng之间或以下蛋白/单位弗林蛋白酶活性或者大约2至11μg之间或以下蛋白/mL的寄主细胞蛋白，并且基本上没有来自于培养基中血清的污染蛋白。在一个实施例中，基本上无动物蛋白的rFurin包括rFurin制品，此rFurin制品包括浓度范围是大约0.1至0.4pg之间或以下DNA/单位弗林蛋白酶活性或者大约0至24ng之间或以下DNA/mL的寄主细胞DNA，并且基本上没有来自于培养基中血清的污染蛋白。在一个实施例中，表达rFurin的寄主细胞是在化学限定的、无血清的培养基中培养。可选择地，细胞可以在有血清的培养基中生长并且根据本文提供的方法而被纯化。

表达rFurin的寄主细胞在恒化条件下被悬浮培养在不含动物(包括人)衍生物的培养基中。细胞通过过滤被除去，含有rFurin的细胞培养上清液通过超滤被浓缩并通过离子交换层析被纯化，生成的rFurin溶液具有的活性至少大约是：1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、120000、140000、160000、180000、200000、500000单位/ml和直至超过500000U/ml。

在另一个实施例中，本发明的重组弗林蛋白酶的被纯化的溶液的比活性至少大约是：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000U/μg蛋白。

在另一个实施方式中，本发明的rFurin的被纯化的溶液包含的寄主细胞蛋白的浓度小于大约：20.0、19.0、18.0、17.0、16.0、15.0、14.0、13.0、12.0、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和0μg/ml。

在另一个实施例中，本发明的rFurin的被纯化的溶液包含的寄主细胞蛋白的浓度小于大约：1.0、0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0ng蛋白/U rFurin。

下面的实施例表明了本发明使用CHO寄主细胞来生产rFurin，然而，技术人员可以理解，任何寄主细胞都可以相似地适用于本发明的rFurin的生产。CHO细胞被广泛地应用于重组蛋白的生产中，被工程化的CHO细胞(在这些细胞中CHO细胞系被产物基因和选择性标记基因转染)通常在含有血清的培养基中培养。然而，血清的使用引起了许多问题。血清是昂贵的商品，并不能容易地得到用于工业生产的所需要的量。血清同样是生化上不确定的物质，包含了许多没有被充分鉴定的并且功能没有被确定的成分。血清批次之间是不同的，可能需要通过检测来确定各种成分的水平和它们对细胞的影响。

此外，血清通常会被微生物如病毒和支原体污染，在这些微生物中有许多可能是有害的，但仍然代表了另外一种不明因素。此外，培养基中动物蛋白的存在可能会需要冗长的提纯步骤。尤其是，牛血清白蛋白(BSA)中牛抗体的存在使得被重组CHO细胞系表达的想要的抗体的纯化变得非常困难。在使用前将牛抗体除去是有可能的，但是这个除去过程和除去后所需要的额外的产物测试给产品的生产增加了很多成本。因此，使用没有动物成分的培养基是有益处的，并且此培养基可以维持细胞尤其是CHO细胞生长。当CHO细胞不能容易地在无血清状态下生长时，本发明提供了可以在无血清状态下生长的CHO细胞的rFurin。

工程化的CHO细胞同样是很难在悬浮液中生长。当使用细胞来表达类似于rFurin的产物时，非常期望能在悬浮液中生长。对于大规模地生产这样的生物蛋白质，能够在相当大的发酵罐中维持生长是很理想的。需要合适的培养基来维持细胞以致于它们能在大规模生产的条件下生长。这种合适的培养基在本文的实施例中被描述。本领域的技术人员会理解，本领域中任何能培养细胞的方法都可以用于培养含有rFurin的寄主细胞，正如本发明中所陈述的那样。本文的实施例提供了培养方法的非限制性的例子。

本发明也提供了细胞在无血清的培养基中培养之后进行的纯化方法，以便从rFurin中去除CHO细胞蛋白。本领域的技术人员会理解，本领域中任何已知的蛋白纯化的方法都可以用于从培养基中纯化rFurin。本文的实施例提供了纯化方法的非限制性的例子。因此，可以生产出基本上没有所有动物来源蛋白的rFurin。基本上没有动物蛋白的rFurin可选择地被冷冻储存直至被使用。

实施例

本发明的其他方面和细节可以从下面的实施例中显现出来，实施例是用于说明而不是用于限制本发明。实施例1描述了rFurin表达质粒的构建和寄主细胞的转染；实施例2描述了使表达rFurin的CHO细胞克隆适应于在无血清状态下生长的方法；实施例3描述优化在无动物蛋白的培养基中生产rFurin的方法；实施例4描述了rFurin的纯化；实施例5陈述了下游过程(浓缩和纯化)以及大规模生产rFurin的分析；而实施例6证明了安全性、无菌性和稳定性试验，进行这些试验以便测定和维持寄主细胞库的质量。

实施例1：重组弗林蛋白酶表达质粒的构建和寄主细胞的转染

用于构建rFurin表达质粒#556的弗林蛋白酶起源质粒的详细说明在表1中被列出。在组成型巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下被表达的成熟的rFurin包含催化结构域、P结构域和胱氨酸富集结构域的一小部分，而位于C-末端至氨基酸577的区域被去除，生成了完全分泌的活性蛋白酶。

作为选择质粒的DHFR-载体的构建的详细说明在表2中被描述。为了发展命名为#488-3和#289-20的稳定表达CHO/rFurin的细胞克隆，通过使用磷酸钙共沉淀法，缺乏功能性内源DHFR基因的CHO细胞被质粒#556和#73共转染。使用DHFR/MTX选择系统，经过几轮的亚克隆和扩增，挑选出高水平地分泌rFurin的克隆。

表1.弗林蛋白酶质粒产生的描述

质粒	描述	评论
			#177	从Wim J.M.van de Ven(Leuven大学，比利时)获得的初始质粒。基于pUC18的质粒包含人弗林蛋白酶cDNA(2.385kbp)的4.0kbp EcoRI片段，具有5’和3’未翻译区域(UTR)的附加序列。	在比利时的Leuven大学进行。
#180	人全长弗林蛋白酶表达载体。	质粒#177的2.8kbp的Smal/AvrII片段，包含完整的弗林蛋白酶cDNA(2.385kbp)并且另外约50bp的5’-UTR的和约400bp的3’-UTR的被克隆进入表达载体#55中。
			#55	来自于Clontech(Palo Alto，加州，美国)的真核表达质粒被修饰含有多个克隆位点代替β-半乳糖cDNA。质粒提供了人的巨细胞病毒立即早期(CMV IE)基因启动子和增强子、来自于由晚病毒蛋白基因16s/19s剪接供体和受体序列组成的SV40基因组的RNA剪接信号和SV40多腺苷酸化信号。初始载体pCMVβ是pUC19衍生物，含有插入在NotI位点的大肠杆菌约3.4kbp的β半乳糖cDNA。	β半乳糖NotI盒被去除，并且插入多克隆位点，代替其他限制性位点和SmaI及AvrII专有位点。

#229	缺乏从位点578至794的C末端序列的人弗林蛋白酶，跨越半胱氨酸富集区域、跨膜区域和胞质区域。在甘氨酸577后，4个附加的甘氨酸作为’间隔子’和10个组氨酸残基被引入。	在SauI和AvrII位点之间，合适的重退火的寡聚脱氧核苷酸-连接物被插入，编码4个甘氨酸、10个组氨酸和后面的终止子。
			#378	质粒#229的衍生物。在甘氨酸577后被截断的弗林蛋白酶，含有10个组氨酸但是不含4个甘氨酸。	编码4个甘氨酸的12bps，位于SauI/HindIII片段，通过PCR被去除。被修饰的片段然后重连接至质粒主链中。
#556	质粒#378的衍生物。在甘氨酸577后被截断的弗林蛋白酶，没有任何附加的外源序列。	通过PCR删除编码10个组氨酸残基的30bps。修饰的SauI/HindIII片段被重连接至质粒主链中。

表2.DHFR质粒产生的描述

质粒	描述	评论
			#29	命名为pAdD26SV(A)-3的原始质粒从H.J.Hauser(GBF，Braunschweig，德国)获得。这个质粒在腺病毒主要晚期启动子后包含全长的鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)cDNA。	在巴克斯特外被构建。
#73	鼠的DHFR-cDNA，受SV40早启动子的控制。	包含DHFR cDNA和质粒#29的SV40多聚腺苷酸化信号的PstI片段被克隆进入质粒#53的PstI位点。由于克隆策略，质粒#73包含两个多聚腺苷酸化信号。
			#	来自于Clontech(Palo Alto，加州，美国)的真核表达质粒被修饰	β半乳糖NotI盒被去除并且插

53

含有多个克隆位点代替β-半乳糖cDNA。质粒提供了猴病毒40(SV40)早期基因启动子和增强子、来自于由晚病毒蛋白基因16s/19s剪接供体和受体序列组成的的SV40基因组的RNA剪接信号和SV40多腺苷酸化信号。初始的载体pCMVβ是pUC19的衍生物，含有约3.4kbp的大肠杆菌β半乳糖cDNA，被插入在NotI位点。

入多克隆位点，代替其他限制性位点和PstI的专有位点。

被转染的CHO细胞在DHFR培养基中培养，DHFR培养基由DMEM NUT MIX F12(1∶1)组成，没有次黄嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸，添加了Hepes、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素和5％或10％被透析的、γ辐射的FBS(＝5％DHFR，10％DHFR)。经透析和γ辐射的FBS购自生命技术公司，具有完整的分析、来源和辐射证书。γ-胰蛋白酶溶液(1mg/ml)的制备是在奥地利Orth的巴克斯特由培养基配制/PPC部门进行的。

图2描述了CHO/rFurin克隆#488-3产生的谱系。克隆CHO/rFurin#488-3是由初始的克隆得到的，它在进入扩增(添加了100nM MTX的选择性培养基中)之前，经过了两轮的在10％DHFR选择性培养基中的亚克隆，其中一轮的亚克隆是在MTX浓度没有变化的培养基中进行的。克隆#448-3被扩增用于冷冻。CHO/rFurin克隆#289-20同样地被制备和扩增。然而，克隆#289-20来源于克隆#488-3的后继克隆。图3描述了CHO/rFurin克隆#289-20产生的谱系。

在克隆要求的培养基中检测弗林蛋白酶活性，克隆在没有血清的DHFR培养基中培养了24小时。显示高弗林蛋白酶活性(每24小时U/10⁶个细胞)的细胞克隆被选中。被选中的高产量的克隆被扩增用于冷冻储存安瓿的制备，并用于下一轮克隆的分流。进行高产量细胞克隆的分离和识别。使用Casy细胞计数器来分析细胞密度。对于克隆#488-3，可以达到直至每24小时200-300U/10⁶个细胞的弗林蛋白酶表达量。对于克隆#289-20，可以达到直至每24小时400U/10⁶个细胞的弗林蛋白酶表达量。

实施例2：使表达重组弗林蛋白酶的细胞克隆适应于无血清状态下的培养

细胞系适应和筛选的策略是，通过逐渐地逐步稀释或者突然地，使细胞系适应成无血清和蛋白的细胞系。此项研究的目的是发现可以在无血清状态下生长的CHO细胞种群，并且能稳定得生成rFurin。CHO细胞克隆#488-3被用作起始材料。表达rFurin的细胞克隆#488-3在三个平行进行的适应中被改变成无血清的状态，详细描述如下。

去除血清的过程开始于旋转烧瓶中，通过使用微载体以便发现保留细胞的方法，因为在那个阶段时细胞通常表现为缓慢生长。通过使用此方法，可以避免在随后的培养基变化期间，将细胞稀释到生长被抑制的浓度。

内部研发的三种不同的培养基：BAP、BAS和BCS(如表3所示)在此研究的过程中被使用。

表3：BAP、BAS和BCS的内部培养基配方

成分	JDE项目号	浓度[g/kg]	BAP	BAS	BCS
						DMEM/F12	0200437	11.745	X	X	X
L-谷氨酰胺	0200444	0.600	X	X	X¹
						酚红钠盐	0200425	0.008	X	X	X
二盐酸腐胺	0200233	0.0036	--	--	X
						硫酸铁(II)七水合物	0200231	0.0006	--	--	X
乙醇胺	0200426	0.00153	X	X	--
						Synperonic F68	0200172	0.250	X	X	X²
大豆胨	0200171	2.50	X	--	--
						碳酸氢钠	0301012	2.00	X	X	X

WFI(注射用水)

F124

加1kg

X

¹BCS中L-谷氨酸盐的浓度：0.900g/kg

²BCS中Synperonic F68的浓度：1.00g/kg

取决于各个实验的目的，利用不同的补充剂提供这些不同的培养基，如表4中所列。

表4：培养基和它们的补充剂

	Put¹(mg/l)	Glut²(mg/l)	Synp³(mg/l)	Fe⁴(mg/l)	Zn⁵(mg/l)
						ExCell 325PF CHO	--	600	--	--	1.0或5.0
BAS	3.6	300	750	0.6	5.0
						BCS	--	--	--	--	1.0或5.0

¹二盐酸腐胺

²L-谷氨酰胺

³Synperonic F68

⁴硫酸铁(II)七水合物

⁵硫酸锌(II)七水合物

下面的表格给出了用于此研究过程中的培养基和试剂的总览。表5概括了用于建立前主细胞库克隆PMCB#01和PMCB#04的培养基和试剂。

表5.用于建立PMCB#01和PMCB#04的培养基和试剂

¹只应用于PMCB#01

⁴只应用于PMCB#04

表6概括了用于亚克隆和建立亚克隆#488-3/CJ06-19/5F10(5F10)和#488-3/CJ06-19/1E8(1E8)的相应的评估细胞库(ECBs)过程的培养基和试剂。

表6.用于建立亚克隆5F10和1E8的培养基和试剂的批号

所有的被添加到培养基的补充剂的批号都被引用在相应培养基的合适的生产流程中。其它培养基添加剂在表7中被列出。

表7.其它培养基添加剂

描述	生产厂商	目录号	批号	提供者
					Aqua Bidest	Fresenius	B230673	SBV093	生产厂商
Aqua Bidest	Fresenius	B230673	TDV252	生产厂商
					Aqua Bidest	Fresenius	B230673	TKV261	生产厂商
Aqua Bidest	Fresenius	B230673	UCV282	生产厂商
					Cytopore 2载体	PharmaciaBIotech	17-1271-03	249933	中试车间II
DMEM NUT MIX F12²	Gibco	041-90163M	3097428	重组细胞系
					ExCell 325PF CHO	JRH	14340	4N0597	生产厂商
ExCell 325PF CHO	JRH	14340	5L0191	生产厂商
					ExCell 325PF CHO	SAFC Biosciences	14340C	5M0775	生产厂商
FBS^1，2	Gibco	10603-017	3092829A	重组细胞系
					FBS¹	JRH	12303	1A0348	生产厂商
Glutamin²	Gibco	25030-024	3096452	重组细胞系
					谷氨酰胺	Sigma	G-5763	117H00655	生产厂商
Hepes-Puffer²	Gibco	15630-056	3094125	重组细胞系
					多聚甲醛	Sigma	P-6148	043K0653	生产厂商
多聚甲醛	Sigma	P-6148	045K0703	生产厂商
					多聚甲醛	Sigma	P-6148	118H0987	生产厂商

青霉素/链霉素²	Gibco	15140-122	1276184	重组细胞系
					腐胺	Sigma	P5780	22K2615	生产厂商
Synperonic F68	Serva	35724	01137	生产厂商

¹动物来源材料：用于涉及附录的证明

²“10％DHFR培养基”的成分，只被用于实验SF05-80的初期

在T烧瓶或者在旋转烧瓶中进行无血清条件的适应，同时通过使细胞脱离胎牛血清来进行细胞维持(离心等等)。

T烧瓶中的悬浮培养物在36±2℃和7.5±1.0％CO₂下被温育。旋转烧瓶中的培养在Techne和Bellco旋转瓶中没有载体时进行，分别在36±2℃和80rpm、130rpm下进行。

CHO/rFurin细胞克隆#488-3的亚克隆，在适应无血清的培养基条件后，得到了可在无血清的室内培养基的悬浮液中生长的CHO细胞克隆，可稳定地大量生产rFurin。此工艺是基于被限制的稀释法。简言之，细胞悬浮液被稀释以致于100μl的悬浮液包含一个细胞。96孔板的孔中用100μl悬浮液填充。理论上，每个孔含有一个细胞用于克隆发育。当这些单细胞开始生长时，克隆发育。因此，每个新产生的细胞可以追溯到孔中第一个原始细胞。克隆在24孔板上、接着在T25烧瓶中、然后在T75烧瓶中、然后在T175烧瓶中扩增。

培养期间，进行过程控制(IPC)来监测培养条件并测定rFurin的表达。使用Casy仪器来测定培养期间的细胞密度。在CTX提取后Nucleo计数仪被应用于检测细胞核。解冻后细胞密度和存活率的测定是通过台盼蓝排斥法使用血细胞计数器进行的。细胞密度和存活率同样可以通过Cedex仪器进行的自动台盼蓝排斥法来分析。

细胞培养的上清液被用于确定表达的rFurin的数量和活性。荧光激活细胞分类术(FACS)分析被用于测定在特定的细胞种群中生产细胞与非生产细胞的比值。细胞形态学和生长行为通过光控制来确测定。另外，细胞培养的上清液同样被检测用于监测培养基条件，比如测定pH值和葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和铵基的残余浓度。这些分析通过NOVA仪器进行。

在研究期间，生产了两个前主细胞库(PMCBs)PMCB#01和PMCB#04并建立了两个细胞系，如下所示。也产生了评估细胞库(ECB)(参见表15)。

PMCB#01的制备和QC试验

将一小瓶CHO/rFurin#488-3(ECB#01)在BAS培养基中解冻，BAS培养基包含添加剂(Put、Glut、Synp和Fe)和5％FBS。细胞在T175中被培养了5天。然后将细胞适应无血清条件，如下所示。

细胞在150ml生长培养基(具有Put、Glut、Synp和Fe的BAS)中制备，培养基中含有5％FBS，0.2g/l。Cytopore 2载体用于适应无血清条件。接种了5天的细胞悬液导致起始细胞密度是大约2.0x10⁵细胞/ml，在第一个小时内细胞附着在多孔载体上。因此细胞维持在旋转烧瓶中，同时分两个步骤交换生长培养基以便减少血清浓度，从5％至3.8％，在第5天至0％。在接下来的培养期间，细胞习惯于无血清培养条件。细胞从载体表面脱离并在悬浮液中继续生长。悬浮细胞的细胞密度和存活率连续地增加。每两至三天悬浮细胞以1∶2的比率被分流。

然后制备评估细胞库(ECB)。在培养第28天，存活率大于60％的细胞被转移至新的实验中。培养物在没有载体的Bellco旋转器中200-300ml的BAS培养基(具有Put，Glut，Synp和Fe)中生长。根据测定的CASY细胞密度，每两至三天悬浮培养液被分流至开始的细胞密度大约是2.0x10⁵细胞/ml。16天后，当细胞培养达到存活率大于80％时，产生了由6个小瓶组成的评估细胞库(ECB)。

一小瓶ECB在新实验中被解冻。细胞在T175中在具有Put，Glut，Synp，Fe和Zn的BAS培养基中被培养四天。然后细胞被转移至Bellco旋转器中，旋转器包含最多600ml的具有Put，Glut，Synp，Fe和Zn的BAS培养基。再次，每两至三天悬浮培养液被分流至开始的细胞密度大约是2.0x10⁵细胞/ml。在培养第13天，143ml的细胞悬浮液被移出用于PMCB#01的制备，由20个小瓶组成。细胞被扩增，并且在PMCB#01上进行质量控制试验。

PMCB#04的制备和QC试验

一小瓶CHO/rFurin#488-3(ECB#01)在BAS培养基中解冻，BAS培养基包含Put、Glut、Synp和Fe以及5％FBS。六天的培养物的一半被转移至新的实验用于适应无血清条件。

这里，对无血清的适应不是逐步进行的，而是突然进行的。Bellco旋转烧瓶通过BAS培养基(添加Put，Glut，Synp和Fe)来制备，培养基中不含FBS和载体。细胞被接种，开始的细胞密度是大约2.5x10⁵细胞/ml。由于突然的无血清条件，细胞的加倍时间减少至相当低的水平。为了避免稀释细胞至生长可能被抑制的浓度，通过旋转细胞悬浮液来改变培养基。细胞颗粒在新鲜的生长培养基中再悬浮。当细胞密度大于4.0x10⁵细胞/ml时，进行培养物分开。在培养第15天达到大约50％的最小存活率之后，细胞开始恢复。并且从培养第32天以及之后，存活率增加至在85-90％之间。在培养第61天，适应的细胞被冷冻，作为由15个小瓶组成的ECB。

在新的实验中，一小瓶ECB被解冻在不含血清的BAS培养基中，培养基中包含Put，Glut，Synp和Fe。培养物在T175烧瓶中被培养七天，被转移至Bellco旋转器，在其内细胞又培养了两天。然后，检测添加的Zn。大约100ml离心的细胞悬浮液被再悬浮在无血清的BAS培养基中，培养基含有Put，Glut，Synp，Fe和Zn。悬浮液在Bellco旋转器中被培养。根据测定的CASY细胞密度，每两至三天悬浮培养液被分流至开始的细胞密度大约是2.0x10⁵细胞/ml。

为了接种物制备并能够生产出大量的同源细胞悬浮液用于生成PMCB#04，在Bellco旋转瓶中细胞培养放大至1000ml。在培养第2天，465ml的细胞悬浮液被用于生产PMCB#04，由20个安瓿组成。细胞被扩增，并且质量控制试验在PMCB#04上进行。

图4描述了在PMCB#01和PMCB#04细胞群落中rFurin生产者的分布图比较。PMCB#04中80.74％的细胞表达rFurin。PMCB#01中74.06％的细胞表达rFurin。

然后产生CHO/rFurin#488-3亚克隆CJ06-19/5F10和CJ06-19/1E8。一安瓿CHO/rFurin克隆#488-3被解冻，并且培养物在T175烧瓶中被传代。在培养第17天，三个不同的培养基被检测：BAP培养基(由巴克斯特研发)、CD-CHO(由Gibco提供)和ExCeII325PF CHO(由JRH提供)，每个都含有5％FBS。在T175烧瓶中生长四天后，在ExCeII培养基中生长的细胞被适应无血清条件。

细胞从血清中一点一点地被移出。整个步骤包括三个实验。首先，贴壁依赖性细胞在T175烧瓶中最初被培养在含有5％的FBS的ExCeII325PF CHO中。然后在培养第13天血清被减少至0.5％。在下一个培养的13天期间，进行两次分流，其中血清浓度进一步地被减少至0.25％并且存活率减少至小于70％。细胞丧失了它们的贴壁依赖性行为，显示越来越多球形并开始在悬浮液中生长。

血清减少的最后步骤发生在Techne旋转瓶的ExCeII325PF CHO培养中，培养基含有5％FBS，不含载体。在23天培养期之后，血清浓度达到0％。细胞被分流，并且被培养至所有的相关参数维持在特定的范围内。细胞密度在0.15和0.9x10⁶细胞/ml之间浮动。在第一个星期存活率降至小于40％，不过然后恢复至大于90％的值。在培养第42天，被适应的细胞被冷冻在ECB/CJ06-20中，由20个小瓶组成。

然后细胞被亚克隆。悬浮液用预处理的ExCeII325PF CHO稀释至100μl的悬浮液理论上含有0.5-1.0个细胞。亚克隆实验中，五个96孔板被100μl细胞悬浮液填充。在细胞接种后的当天，在显微镜下寻找孔中的单细胞。包含一个细胞的孔被标记并被进一步地观察。必要时，进行预处理的ExCeII325PF CHO的添加和交换。当细胞死亡或者在下两个星期中没有细胞分裂，相应的孔被排除于实验之外。

两个单细胞显示了生长。发展的克隆，达到合适的大小时，被转移至24孔板的孔中。这里，根据生长和培养的要求同样可以进行预处理的ExCeII 325PF CHO的交换。在培养第7天和第10天亚克隆CJ06-19/5F10和CJ06-19/1E8被分别转移至T25烧瓶中。

在ExCell培养基中制备ECB。这些ECB代表了用于涉及两个亚克隆的进一步研究中的起始材料，该研究是例如从购买昂贵的培养基适应至更加经济的由巴克斯特自己研发的配方。亚克隆CJ06-19/5F10、CJ06-42的ECB在ExCeII325PF CHO培养基中从T25扩增至T75，再至T175，然后转至Bellco旋转器中。在第21天来自于T175培养的由10个小瓶组成的ECB/CJ06-63被冷冻。亚克隆CJ06-19/1E8、CJ06-43的ECB也在ExCeII325PFCHO培养基中扩增。培养物从T25扩增至T75，再至T175，然后转至Bellco旋转器中。在第18天，来自于T175培养的由10个小瓶组成的ECB/CJ06-64被冷冻。

使ECB(亚克隆5F10和1E8)适应BCS，如下所示。在实验CJ06-66中ECB克隆CJ06-19的亚克隆CJ06-19/5F10被解冻，然后将体积逐渐增加的BCS培养基加至ExCeII培养基中，细胞脱离ExCeII培养基，获得能在BCS培养基中生长的能力。按类似方式使ECB克隆CJ06-19的亚克隆CJ06-19/1E8同时适应BCS培养基。

表8显示了所有的在本研究期间被制备的无血清细胞库。

表8：表达rFurin的CHO细胞克隆#488-3的无血清细胞库的总结

PMCB#01、PMCB#04、亚克隆5F10和1E8的比较如表9所示。

表9：PMCB#01、PMCB#04、亚克隆5F10和1E8的比较

在CJ06-69以及SK06-49和SK06-63试验中，培养的细胞种群代表用于PMCB细胞系的前体培养物。细胞在BAS培养基中(添加有Put、Glut、Synp、Fe和Zn)生长并分别作为PMCB#01和PMCB#04被冷冻。

亚克隆5F10和1E8在市场上可买到的JRH产的培养基ExCeII 325PF CHO中培养。因为在基于BAS配方的培养基中的生长能力是优选的，PMCB#01和PMCB#04被选中用于进一步的rFurin的生产。

如表10中所示，PCMB#04与PCMB#01相比显示了更好的生长现象。PMCB#04的存活率和生长速率比较高，世代加倍时间较短。贯穿整个评估时段rFurin的细胞特异性以及体积产量比率也比较大。在进一步的实验中，关于存活率的数据被确定。每个PMCB的一个安瓿被解冻在含有BCS培养基的T175的烧瓶中，并用Zn作为添加剂。如表10中所显示，PMCB#04的存活率再次比PMCB#01的大。

表10：PMCB#01和PMBC#04的解冻实验

细胞种群	实验	细胞密度[x10⁷细胞/瓶]	存活率[％]
				PMCB#01	CJ06-77[75]	1.05	68.7
PMCB#04	SK06-67[76]	0.99	77.4

因此，PMCB#04被选中作为用于rFurin主细胞库(MCB)的进一步生产和所有进一步的工作细胞库(WCB)的原材料。根据当前的良好组织规范建立由20个小瓶组成的PMCB#04。根据ICH指南Q5D进行质量管理(QC)检验。在生产过程中PMCB#04被选中用于生产rFurin。

生长培养基不含人的或者动物的衍生物质并且是自身发展的。通过过滤将细胞去除，包含rFurin的上清液通过超滤浓缩。纯化后通过交换色谱法，rFurin溶液的活性的目标至少是200单位rFurin/ml。

进行支原体、病毒、外来因子、无菌和表达效力的检验。用于选则的标准是高弗林蛋白酶活性(比如弗林蛋白酶蛋白，酶联免疫吸附试验)和在免疫荧光(FACS)中的细胞种群的均一性，分别在不同的亚克隆上进行与初始的克隆#488-3和#289-20的比较。此外，杂质分布被定性地比较(比如通过反相HPLC后的紫外峰图式或者通过SDS-PAGE/考马斯亮蓝技术)。

实施例3：在无动物蛋白培养基中生产重组弗林蛋白酶的最优化

这个实施例描述了用于表达rFurin的CHO克隆#488-3培养的发展和优化过程。进行关于氨基酸、葡萄糖和NaHCO₃浓度的特定培养基的优化，导致细胞生长速度的增加和发酵过程中产率的提高。利用优化的培养基配方对于pO₂(10％、20％和50％)进行在线控制过程参数的优化，以及进行因子试验确定最佳的pH(范围7.1-7.3)和温度(范围35.1℃-37.9℃)，导致了在较低的温度35℃-36℃之间进行发酵时CHO克隆#488-3产量的显著增加。

作为可能的生产模式，比较恒化培养和分批补料培养，表明两个过程类型都适合rFurin的生产，并且在相同的参数设置下给出了类似的产量。进行特定的实验以便研究在不同生物反应器设置中的搅拌类型和速度的影响。研究显示，比生长速率和表达速率、细胞密度以及因此的体积产率都会因生物反应器设置的不同而受到强烈的影响，并且在增加搅拌速度的情况下产量可能会显著地增加。总而言之，rFurin上游过程的主要参数的影响关于它们的作用被很好地检定，并且高产量过程可能被转移至中试，用于临床前和临床生产。细节如下所示。

亚克隆#488-03被在内部开发，并被适应于无血清和无胰岛素的培养基。在作为基础培养基配方的无FBS和无胰岛素的培养基(BACD培养基)(参见表11)中进行以下实验。

表11：基础培养基的成分(BACD培养基)

成分	浓度[g/kg]
		DMEM/F12(1∶1)	11.76
L-谷氨酰胺	0.6
		乙醇胺	0.00153
Synperonic	0.25
		腐胺·2HCl	0.0036

FeSO₄·7H₂O	0.0006
		CuSO₄·5H₂O	0.00000125
NaHCO₃	2.0

为了加快细胞生长和提供用于细胞增殖的最佳条件，进行恒化培养上清液的氨基酸分析(参见表12)。结果是，三个必需氨基酸被加到培养基中，是甲硫氨酸(10mg/L)、亮氨酸(40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L)。在37℃、pH 7.15以及20％的pO₂下的1.5L的生物反应器中进行发酵。

表12：通过HPLC进行氨基酸分析

氨基酸	BACD_24_06_014_026	FUR_06/10_M04_K06	FUR_06/10_M04_K07
					峰面积[％]	相对峰面积[％]	相对峰面积[％]
天冬氨酸	100.00	24.04	9.88
				谷氨酸	100.00	57.78	24.89

丝氨酸	100.00	14.37	15.35
				天冬酰胺H₂O	100.00	15.03	19.17
甘氨酸	100.00	103.55	90.58
				谷氨酰胺	100.00	19.26	23.14
组氨酸	100.00	45.59	45.32
				苏氨酸	100.00	63.09	61.39
精氨酸	100.00	72.22	74.25
				丙氨酸	100.00	1513.36	1518.46
脯氨酸	100.00	58.54	55.36
				酪氨酸	100.00	46.37	47.63
胱氨酸	100.00	53.43	56.39
				缬氨酸	100.00	42.75	42.11
甲硫氨酸	100.00	13.23	11.51
				异亮氨酸	100.00	48.39	48.79
亮氨酸	100.00	23.58	20.63
				赖氨酸	100.00	41.85	40.65
苯丙氨酸	100.00	34.99	33.00
				色氨酸％：	100.00	69.1	68.8

BACD_24_06_014_026...基础培养基(材料和方法)

FUR 06/10M04K06...发酵批次，培养第6天

FUR_06/10_M04_K07...发酵批次，培养第7天

基础培养基的HPLC图中各自的氨基酸的峰面积被调整至100％。通过比较恒化培养第6天和第7天获得的峰面积，确定各个氨基酸的减少。

由于培养上清液中的谷氨酰胺浓度低，谷氨酰胺被添加至培养基(300mg/L)中以便给出最终的谷氨酰胺浓度在900mg/L。在添加谷氨酰胺至培养基后，生长速率从0.55d^-1增加至0.67d^-1(参见表13和14)。通过添加上述三个氨基酸(甲硫氨酸(10mg/L)、亮氨酸(40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L))至培养基中，细胞的生长速率可能被再次提高(0.69d^-1)(参见表15)。体积产率上升至大约267kU/L/d(＝+13％)，并且比生产率显示了16％的提高。培养基中谷氨酰胺、甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的添加显示了在细胞生长、体积和比活性上的积极作用，因此被保留用于进一步的培养基配制。

表13：从培养第6天至第9天，恒化培养FUR_06/10-M04的发酵数据

实验

glc

gln

pH

D

CC

μ

Furin

P

qP

FUR_06/10-M04

[g/L]

NOVA

[1/d]

[1E6/mL]

[1/d]

[IU/mL]

[kIU/L/d]

[IU/C/d]*10⁶

天数6-9

1.58

0.10

7.16

0.494

2.35

0.548

306.55

151

64

表14：在第12天补充300mg/L谷氨酰胺至培养基后恒化培养FUR_06/10-M04的发酵数据

实验

glc

gln

pH

D

CC

μ

Furin

P

qP

FUR_06/10-M04

[g/L]

NOVA

[1/d]

[1E6/mL]

[1/d]

[IU/mL]

[kIU/L/d]

[IU/C/d]*10⁶

天数15-21

1.47

0.35

7.16

0.668

2.27

0.673

352.68

236

104

表15：在第22天添加甲硫氨酸(10mg/L)、亮氨酸(40mg/L)和苯丙氨酸(10mg/L)至培养基后恒化培养FUR_06/10-M04的发酵数据。

实验

glc

gln

pH

D

CC

μ

Furin

P

qP

FUR_06/10-M04

[g/L]

NOVA

[1/d]

[1E6/mL]

[1/d]

[IU/mL]

[kIU/L/d]

[IU/C/d]*10⁶

天数26-29

1.37

0.38

7.13

0.713

2.20

0.695

373.80

267

121

为了检测在培养基中补充的氨基酸的量是否足够，进行了另一种恒化培养(10L)的氨基酸分析。300mg/L谷氨酰胺和三个氨基酸的各自的量被补加至培养基中。在培养第7天和第15天抽取样品，并且培养条件与上述的类似。结果(参见表16，只显示了甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的数据)确证了有足够量的被补充的氨基酸存在于发酵液中。

表16：在补充了谷氨酰胺(300mg/L)、甲硫氨酸(10mg/L)，亮氨酸(40mg/L)苯丙氨酸(10mg/L)的恒化培养物(FUR06/17_F04)中甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的相对含量。

氨基酸	峰面积[％]	相对峰面积[％]	相对峰面积[％]
					BACD-24-030-057	FUR 06/17_F04-K07	FUR 06/17_F04-K15
甲硫氨酸	100.0	47.5	61.7
				亮氨酸	100.0	50.3	65.4
苯丙氨酸	100.0	50.1	65.2

NaHCO₃浓度的减少和葡萄糖浓度的增加。细胞培养物中高度溶解的CO₂浓度对生长和产率的影响被研究。由于在生物反应器中大规模的生产，可以预期CO₂的浓度比在2.5-32L的生物反应器中的浓度要大。因此，平行进行两个发酵流程，一个流程的CO₂浓度大约是7.5％，另一个CO₂浓度大约是12％。通过改变液面上部气流中CO₂的组分进行CO₂浓度的调整。通过用NOVA仪器分析抽取的样品，细胞培养的CO₂浓度被测定。在37℃、pH 7.15和20％的pO₂下进行发酵。

11-12％的CO₂浓度对细胞生长和产量具有负面影响。在这个CO₂浓度下，间隔12天，在细胞计数是1.1x10⁶、并且稀释率是0.30d^-1时，达到的生长速率是0.29d^-1。在CO₂大约7.5％的发酵流程中，在相同的时间间隔下，在细胞计数是1.49x10⁶细胞/mL和稀释率是0.53d^-1时，达到的生长速率是0.52d^-1。在高CO₂浓度下，与7.5％CO2的95.9％相比，存活率减少至86.1％。另外，体积生产率减少至大约36％并且比生产率减少至50％。由于高CO₂浓度，特定的葡萄糖摄入率也减少(-39％)。提高的CO₂浓度(11-12％)对细胞生长和产率的负面影响是非常明显的，因此在7.5％CO₂下进行时最佳的。

如上所述，实验显示，在1000L生物反应器中当CO₂浓度增加至12％时，可以预期CHO-弗林蛋白酶克隆488-3的性能的剧烈下降。因此，可以决定将培养基中NaHCO₃浓度从2g/L减少至1.5g/L。培养基中较少量的NaHCO₃也降低了培养基的缓冲能力。因此，比较两个发酵流程(10L)，一个培养基中是3.15g/L葡萄糖和2g/L的NaHCO₃(FUR_06/24_F01)，而另一个培养基中是4.65g/L葡萄糖和1.5g/L的NaHCO₃(FUR_06/26_F04)。

为了模拟大规模生物反应器(1000L)的条件，通过将CO₂恒定地吹入至液面上部，发酵期间具有2g/L NaHCO₃的发酵液中溶解的CO₂浓度调整至7-8％；并且具有1.5g/LNaHCO₃的发酵液中溶解的CO₂浓度调整至6-7％。两个培养物的生长速率是相似的(0.58和0.56d^-1)，并且培养显示了类似的体积产率和存活率。然而，在低NaHCO₃浓度的培养中特定的葡萄糖摄入率稍高(0.83mg/10⁶细胞/d对0.67mg/10⁶细胞/d)。因此，4.65g/L的葡萄糖浓度被认为是合理的，并被保留在进一步的培养基配制中。

在弗林蛋白酶培养基中的Synperonic F68浓度的研究。细胞培养培养基中SynperonicF68的常规浓度被设为0.25g/L。培养基中Synperonic F68的目的是保护细胞免于由于浸没氧化而造成的损害。因此，在2×10L的生物反应器中进行一个实验，在其中增加的Synperonic F68浓度是1.0g/L与常规的0.25g/L浓度相比较地研究。在35.8℃、pH 7.30和20％的pO₂下进行发酵。

随着增加的Pluronic浓度(Synperonic F68)，有可能达到比较高的比生长速率和细胞密度。因此，由于增加的比生产率，可以达到与278kU/L/d相比相应更高的体积产率365kU/L/d。

收集这些实验中的上清液，并用深度过滤器(Cuno Cart.Z08P4A30SP 4个盘片)和随后的膜过滤器(Pall Fluorodyne Il KA2DFLP2)过滤。被过滤的上清液通过超滤(Sartorius3OS 1463901E--SG PSU 10KD，0.2m²)被浓缩，并用弗林蛋白酶渗滤缓冲液进行渗滤。无菌的被过滤的浓缩物(Sartorius Sartobran P 523130748-000.45/0.2μ)在Capto MMC柱上被纯化。从纯化实验的结果显示，增加Synperonic F68并没有对纯化的rFurin的性质和/或纯度造成有害的影响。在Capto MMC柱子的洗脱物中没有发现增加的Synperonic F68浓度，在两个洗脱物中都是＜0.15mg/mL。

尽管有这些结果，在rFurin培养基中的Synperonic F68浓度保持着初始浓度0.25g/L。然而，由于浸没氧化以防万一出现的放大问题，可以考虑增加Synperonic浓度直至1.0g/L，可能会增加产量，并且不对最终的弗林蛋白酶产品存在有害的影响。

最终的培养基组合物用于发酵中的rFurin生产。根据培养基优化试验，显示下面的培养基组合物对于在生物反应器培养中用于rFurin生产的CHO克隆488-3的发酵是最佳的。

表17：基础培养基和优化的发酵培养基的成分

成分	基础培养基	优化培养基
				浓度[g/kg]	浓度[g/kg]
DMEM/F12(1∶1)	11.76	11.76
			L-谷氨酰胺	0.6	0.9
D-葡萄糖	--	1.5
			乙醇胺	0.00153	0.00153
Synperonic	0.25	0.25
			腐胺·2HCl	0.0036	0.0036
甲硫氨酸	--	0.01
			亮氨酸	--	0.04
苯丙氨酸	--	0.01

FeSO₄·7H₂O	0.0006	0.0006
			CuSO₄·5H₂O	0.00000125	0.00000125
NaHCO₃	2.0	1.5

不同的pO₂设置点对于生长速率和产率的影响也被研究。测定三个不同的pO₂设定值，即10％、20％和50％。在1.5L生物反应器中通过将气体吹过液面上部进行实验。在35.1℃、pH 7.20下进行所有发酵流程。在10、20和50％pO₂下发酵流程的比较显示，随着pO₂设定值的提高，生长速率也稍有提高(0.59、0.62和0.65d^-1)。同样地，在pO₂50％下体积产率也是最高的。不同发酵的平均细胞计数是非常相似的。因此，体积产率的增加是生长速率增加的结果。

因此，50％的pO₂设定值似乎对生长速率有积极的作用，并且其结果是，体积产率比标准条件(＝20％的pO₂)高出约4％。没有观察到对存活率的影响。因此，可以确定pO₂＝20％的设定值和10％-50％的调节范围适合于CHO克隆#488-3的发酵。

优化温度和pH以便使的体积产率最大化。研究了pH和温度对CHO-弗林蛋白酶克隆性能的影响。通过使用“实验方法设计”，不同的温度与不同的pH值相结合来确定导致最大体积产率的条件。根据“Doehlert矩阵”，五个温度与三个pH值相结合，得到了温度和pH的七个组合，如图5所示。

36.5℃和pH 7.20的组合被选中作为中心点，被应用于两个发酵批次中。表18给出了用于不同发酵批次的培养条件。

表18：Doehlert矩阵的实验设定：不同发酵批次的培养条件

发酵批号	温度[℃]	pH
			FUR_06/43-B07	35.1	7.20
FUR_06/43-B05	35.8	7.10
			FUR_06/40-B03	35.8	7.30
FUR_06/40-B01	36.5	7.20
			FUR_06/43-B02	36.5	7.20
FUR_06/40-B08	37.2	7.10
			FUR_06/40-B04	37.2	7.30
FUR_06/40-B06	37.9	7.20

表19：发酵FUR_06/40-B01、-B03、-B04、-B06、-B08以及FUR_06/43-B02、-B05、-B07的发酵数据的平均值

发酵批号	温度	pH	CC	μ	Furin	P¹)	qP¹)	存活率
										[℃]		[10⁶/mL]	[1/d]	[IU/mL]	[kIU/L/d]	[U/10⁶/d]	[％]
FUR_06/43-B07	35.1	7.20	1.74	0.595	930	543	312	97.7
									FUR_06/40-B03	35.8	7.30	1.64	0.632	621	379	232	97.6
FUR_06/43-B05	35.8	7.10	1.73	0.647	683	429	250	98.5
									FUR_06/40-B01	36.5	7.20	1.78	0.696	439	309	174	97.9
FUR_06/43-B02	36.5	7.20	1.66	0.684	454	310	186	96.8
									FUR_06/40-B04	37.2	7.30	1.71	0.642	284	184	108	96.8
FUR_06/40-B08	37.2	7.10	1.68	0.652	338	215	128	98.3
									FUR_06/40-B06	37.9	7.20	1.52	0.473	143	65	43	96.1

¹⁾通过形成单个生产率的平均值来计算5天培养的平均体积和平均比生产率。

利用表面响应方法(RSM)，使用“Minitab”软件来统计分析数据。RSM研究了在数个解释性变量与一个或多个反应变量之间的关系。RSM的要旨是使用一组设计实验来获得最佳响应。分析集中在体积和比生产率以及生长速率上。

关于体积产率的数据分析。作为第一步，绘制表面曲线图(图6)。图6中数据的坐标被标记为点。表面显示了假设的单个数据的相关性。

表面曲线图认为参数温度/pH和响应的体积产率之间线性相关。图表显示，随着温度降低，体积产率增加。图表认为pH的影响是微弱的。随后的计算显示了数据的线性相关性(没有显示计算方法)。通过方差分析，产生的方程描述了pH、温度和体积产率之间的相关性：

P＝7693.1-162.4×温度-202.8×pH

基于数学模型产生的等高线图(图7)显示了温度和pH对体积产率的影响。这些点显示了已经进行过实验测试的条件(pH/温度)。

等高线图显示，预期体积产率最大的区域是在35.1℃和大约pH7.10处。两个值都在实验设计的边缘处，这意味着实际的最大值甚至可能在这些数值以下被发现。此外，等高线图pH对体积产率的影响是边缘性的，并且在低pH值时影响稍高。

表面曲线图(图8)是三维显示的数学模型，给出的结果与等高线图相同：温度对体积产率强烈的影响和pH对体积产率的微弱影响。

关于生长速率μ的数据分析。生长速率与温度、pH的相关性在二次方程中被描述。再次发现温度的强烈影响和pH的微弱影响。生长速率剧烈变化妨碍数学模式的设计。方差分析和回归给出了下列方程式：

P＝-103.539+5.706×温度-0.079×温度²-0.233×pH-0.020×pH²

pH对于生长速率的影响在统计上是不能确定的，正如通过高P值所显示的用于pH-术语，被计算是0.99(没有显示计算方法)。

表面曲线图(图9)显示了三维方法的模型相关性，表明了平方关系式并且显示了在36.5℃下生长速率的最大值。

数据分析显示了比生产率与温度及pH的相关性，其与体积产率(图10)所示的相关性相似。通过线性方程描述该相关性。pH的影响通过方差分析再次被证明是低的(没有显示计算方法)：

qP＝4261.40-93.35×温度-93.77×pH。

总之，用于温度和pH优化的实验和随后的数据分析给出了完全清楚的结果。最高的体积产率，被认为是最重要的过程优化的参数，通过在最低的温度(35.1℃)和最低的pH(7.10)下培养可以达到。pH的影响在统计学上不是显著的，在7.10和7.30之间的pH值给出了非常相似的结果。通过将温度从37℃降低至35.1℃，体积产率可以从大约200kU/L/d增加至540kU/L/d，高2.7倍(图11)。根据这些结果，对于恒化模式中的CHO-弗林蛋白酶克隆的培养，温度和pH的新设定值被确定为35.1℃和7.15。

恒化模式与分批补料模式的比较。低温(35.1℃)下恒化模式中的CHO-弗林蛋白酶克隆的培养物导致了小试(1.5L、2.5L、10L和32L)中的高产率，并被认为是用于生产rFurin的大规模培养的合适培养方法。然而，大规模(在PP1工厂中的1200L生物反应器)的初始发酵流程显示了在恒化模式下生长速率的急剧下降。作为另一种方式，为了获得高生产速率，在大规模发酵中设定分批补料模式。在10L生物反应器中进行实验，用于比较恒化模式和分批补料模式的生长和产率。在36.5℃、pH 7.15和20％的pO₂下培养细胞。每隔一天将分批培养液分流成细胞计数为0.6-0.7x 10⁶细胞/mL。

恒化和分批补料发酵是平行进行的，使用相同的细胞培养物作为接种物。以恒化模式培养细胞直至第6天。然后将一个发酵流程转变成分批补料模式(FUR_06_50-F03)，同时另一个继续为恒化模式(FUR_06_51-F04)。在分批补料模式中的培养导致了在批次结束时平均细胞计数是2.22x10⁶细胞/mL，生长速率是0.64d^-1(表20)。在恒化模式中，获得了0.50d^-1的生长速率并且平均细胞计数是1.67x10⁶细胞/mL。由于在分批补料模式中的较高细胞计数和生长速率，体积产率也较高(238对197kU/L/d)。

数据显示，对于10L规模中的CHO-弗林蛋白酶克隆而言，分批补料模式是优选的培养方法，其得到了比恒化模式更高的体积产率(在36.5℃和pH7.15下)。然而，在分批补料模式中，收获和进一步的下游处理受限于特定的间隔期。而在恒化模式下，收获可以连续地进行。因此，每个方法都有其优势。在批次结束时，没有像优化细胞计数那样进行分批补料模式参数的优化实验或者最佳分流比的优化实验。

表20：来自发酵流程FUR_06_51-F04(恒化器)和Fur_06_50-F03(分批补料)发酵数据的平均值

发酵批次

体积

模式

D

μ

CC

弗林蛋白酶

P

[1d]

[1E6/mL]

[1U/mL]

[kIU/L/d]

FUR_06_51-F04

10L

恒化

0.494

0.497

1.67

401.4

198

FUR_06_50-F03

10L

分批补料

--

0.637

2.22(结束)¹⁾

539.8

238²⁾

1)在每个批次结束时(2个批次)的细胞计数的平均值

2)在每个批次结束时(2个批次)的产率的平均值

放大实验研究。在不同的搅拌速度下比较Rushton类型和ball类型搅拌器。研究搅拌器类型对于生长速率和产率的影响。在用于CHO-弗林蛋白酶克隆实验的生物反应器中使用的标准设置包括Rushton搅拌器和四个挡板。用于rFurin生产的1000L生物反应器配备有三对ball搅拌器，没有任何挡板。因此，在10L生物反应器中进行实验来测试三个不同的设置：一个反应器配备标准设置；另一个反应器配备两对ball搅拌器，没有挡板；第三个反应器的配备与标准的相似，但是搅拌速度从170rpm减小至90rpm。

表21给出了生物反应器设置的综述。60rpm的搅拌速度和ball搅拌器给出了与rushton搅拌器在90rpm下相似的端速(参见表21)。然而，由于搅拌器的几何形状(形状、直径)不同，端速不可能互相等同。

表21：用于搅拌器/搅拌速度实验的10L生物反应器设置

发酵批号	搅拌器类型/直径	级别	挡板	搅拌速度	端速
						FUR_06/37_F03	Rushton 80mm	2	4	170	0.712m s^-1
FUR_06/35_F01	Rushton 80mm	2	4	90	0.337m s^-1
						FUR_06/38_F04	Ball 140mm，39.5mm直径	2	--	60	0.440m s^-1

发酵条件如下：37℃、pH 7.15、20％的pO₂和6-7％的pCO₂。(培养基：4.65g/L Glc，1.5g/L NaHCO₃)。发酵数据比较显示，在具有标准设置的生物反应器中的性能，即配备有rushton搅拌器并在170rpm的速度下搅拌，相比在具有另一个设置的反应器中要高(表22)。Ball搅拌器在60rpm下的使用，与rushton搅拌器在170rpm下的使用相比，导致了稍微低的生长速率(0.57对0.61d^-1)、较低的体积生产率(197对227kU/L/D)。使用rushton搅拌器的搅拌式生物反应器，搅拌速度是90rpm而不是170rpm，可以明显地降低生长速率(0.54对0.61d^-1)、体积生产率(175对227kU/L/D)和细胞比生产率(115对138U/10⁶细胞/天)。

来自这个实验的数据显示，ball搅拌器在60rpm下与rushton搅拌器在减小的搅拌速度下，两者与rushton搅拌器在170rpm下相比，都导致了CHO-弗林蛋白酶克隆的性能的下降。不过，结果也显示，使用ball搅拌器用于CHO-弗林蛋白酶克隆的培养是可能的。在这些被测试的设置中，rushton搅拌器在170rpm下加上四个挡板的设置显示为最差的设置。然而值得注意的是，在这些条件下没有观察到细胞存活率的下降，显示了被研究的CHO-弗林蛋白酶克隆的较高机械耐受力。

表22：在不同设置(搅拌器类型、挡板)下的生物反应器中CHO-弗林蛋白酶克隆的三个发酵流程的发酵数据的平均值

发酵批号	设置	CC	D	Furin	μ	P	qP	存活率
											[10⁶/ml]	[d^-1]	[IU/mL]	[d^-1]	[kU/L/d]	[U/10⁶/d]	[％]
FUR_06/37_F03	Rushton 170rpm	1.65	0.628	361.37	0.614	227	138	95.4
									FUR_06/38_F04	Ball搅拌器60rpm	1.52	0.600	328.10	0.568	197	130	94.1
FUR_06/35_F01	Rushton 90rpm	1.53	0.574	305.31	0.544	175	115	94.3

在32L生物反应器中使用斜叶搅拌器(pitched blade impeller)，比较不同的搅拌速度。对于PP1中GMP流程系列ORFURFB07002，生物反应器(工作体积950L)配备有斜叶搅拌器类型(2片，d＝700mm)而不是以前使用的ball类型搅拌器。

在这个系列期间，进行2天的分批补料循环。为了评估与以前系列相比较下的改变，配置了32L生物反应器，具有相似类型的斜叶搅拌器(1片，d＝140mm)，并且使用来自于PP1工厂的细胞悬浮液和培养基以便保证使用类似的材料。

进行相似的分批补料工艺，其中开始2-3个连续的两天分批循环，起始细胞密度是0.5x10E06细胞/mL。以2个不同的搅拌速度即55rpm和120rpm进行实验。培养条件与在PP1中使用的培养条件相同：pH-SP 7.15，温度-SP 35.5℃，pO₂-SP 20％。在适应了各自的搅拌条件后，比较来自于最后批次的数据。

表23：在32L生物反应器中使用斜叶搅拌器的流程FUR_07/06-F07的各批次的生长速率、细胞计数和体积生产率

FUR_07/06-F071	搅拌速度	CC¹⁾	分流比	Furin	μ	P³⁾
							Intevall	[rpm]	[10⁶/ml]	1∶x	[IU/ml]	[d^-1]	[KU/L/d]
批次K02-K04	120	1.95	3.89	1197.8	0.680	445
							K10-K12	50	1.50	3.13	812.0	0.570	276

1)每个批次结束时的细胞计数

2)理论分流比被应用于2个分批补料过程：分流比＝e^Λ(2xμ)

3)体积生产率的计算：P＝(1-(1/分流比))x产物滴度/2天

实验再次表明搅拌条件对CHO克隆#488-3的比生长率的影响。当采用相同的起始细胞密度时，提高的生长速率导致了批次结束时的更高的最终细胞密度。体积产率从276kU/L/D增加至445kU/L/D(+61％)，然而最终的细胞密度增加了30％(1.95比上1.5x10E06细胞/ml)。这些结果表明，增加搅拌速度对细胞比生产率有积极影响。

同样可以得出结论，导致平均产率大约是200kU/L/D的发酵流程主要是采用了低搅拌速率20rpm的结果，而不是由于搅拌器设计本身造成的。在此可以得出结论，如果相应地调整搅拌速度，则斜叶搅拌器可以导致产量＞400kU/L/D。

实施例4：重组弗林蛋白酶的纯化(rFurin)

这个实施例提供了用于过滤和纯化rFurin的方法。被收集的细胞培养上清液首先在深度过滤器(Cuno Zetaplus过滤器)上被过滤，使得它们无细胞和无颗粒，继之以在0.45μmPVDF过滤器(PALL Fluorodyne II)上进行膜过滤。被过滤的细胞培养上清液含有rFurin，然后在Sartorius产的10K PES UF盒中(Sartocon PESU 10kDa)通过超滤浓缩，浓缩倍数范围是10-50。弗林蛋白酶浓缩物(弗林蛋白酶活性范围是290-1700单位/ml)在＜-60℃下以等分被储存。

在致力于得到更加均一的rFurin制品用于VWF熟化过程的应用中，进行实验的目的在于部分纯化来自于细胞培养上清液中的rFurin。部分纯化的rFurin试剂易于使用于表征和释放测试。它也导致了在VWF成熟过程中CHO寄主细胞蛋白的减少。

开发了在阴离子交换树脂上纯化的工艺，需要＜5mS/cm(RT)的加样电导率用于有效的rFurin结合。然后进行洗脱作为一个离子浓度大约是500-300mM NaCl的步骤，并且在筛选阶段期间，应用梯度洗脱直至300mM的NaCl(参见表24综述)。缓冲液由最初的pH 6.7增加至7.5以便提高加样期间rFurin的结合，尤其是在高蛋白加样下和高线性流速下(参见表25相关的缓冲液综述)。在EMD TMAE(Merk)和CaptoQ(GE Healthcare)阴离子交换树脂上进行纯化实验，阴离子交换树脂在填充稳定性和操作的最大流速上是不同的。在表26中概括的分析数据显示，rFurin可以从细胞培养上清液被浓缩直至362倍，产率范围为20-71％。取决于被采用的加样，在洗脱层中的rFurin活性在639单位/ml和27651单位/ml之间。发现洗脱物中CHO杂质水平的范围为10-134ng CHO蛋白/单位rFurin，并且减少速率直至12.3，比用CaptoQ树脂发现的CHO减少有更好的表现。

总之，通过阴离子交换色谱分离法纯化rFurin被证明是用于浓缩的一种选择，其对于在＜-60℃下储存rFurin试剂是重要的。此外，CHO轻微减少3-12倍对于降低VWF制备中CHO蛋白的浓度是重要的。

表24：在阴离子交换树脂上纯化rFurin的大致工艺。对于EMD TMAE(Merck)，被运用的流速是150-75cm/h；对于CaptoQ(GE Healthcare)，流速是600/300

表25：在阴离子交换树脂上纯化弗林蛋白酶的缓冲液

表26：在阴离子交换树脂上弗林蛋白酶相关纯化实验的综述。使用Bradford测试法确定总蛋白含量。CHO减少速度计算为加样的CHO蛋白除以在洗脱收集液中发现的总CHO蛋白。

实施例5：rFurin浓度、纯化和分析

此实施例描述了用于大规模rFurin浓缩和纯化(即下游过程)的其他方法。这些加工方法包括超滤、渗滤和capto-MMC色谱分离法，在基本上无动物蛋白的rFurin的生产中进行这些方法。还描述了分析蛋白浓度、比活性以及被寄主细胞蛋白和DNA污染的方法。

超滤。上清液(在恒化系列中大约是800-1200kg，在RFB系列中大约是550-700kg)从细胞中分离，并通过超滤浓缩至最终体积35-45L。浓缩步骤中的超滤/渗滤系统(UFS)的参数和设定值列于表27中。

表27：浓缩步骤的操作参数和设定值

参数	设定值
		过滤收获物的温度	10-15℃
过滤面积	14m²
		进料压力	0.9-1.5bar
滞留压力	0.7-1.2bar

渗透压力	0-0.1bar
		跨膜压力	0.7-1.0bar
比漫流流速(流送流速)	300-600L/h/m²
		比渗透流速	15-40L/h/m²
浓缩系数	20-30
		加工时间	3-4h

渗滤。在完成浓缩步骤之后，立即开始滞留物的渗滤。渗滤步骤中的UFS的参数和设定值列于表28中。

表28：渗滤步骤的操作参数和设定值

参数	设定值
		过滤面积	14m²
进料压力	0.9-1.5bar
		滞留压力	0.7-1.2bar
渗透压力	0-0.1bar
		跨膜压力	0.7-1.0bar
比漫流流速(流送流速)	300-600L/h/m²
		比渗透流速	7-20L/h/m²
目标电导率	＜2mS/cm
		渗滤速度(V_渗透液/V_滞留液)	4-5.5
加工时间	0.75-1.25h

当滞留物的电导率降至2mS/cm以下(用UFS在线的导电探针测定)时，此加工步骤结束。需要低导电率以便确保在随后的纯化步骤中rFurin与色谱胶的定量结合。渗滤产物被转移，并且通过添加1M醋酸溶液调整渗滤产物的pH值至6.0。产物在被施加至Capto-MMC柱之前，被储存在室温下(RT)。

Capto-MMC色谱分离法。Capto-MMC凝胶，一种多峰阳离子交换剂，被用于结合rFurin并去除渗滤产品中的大多数污染物。在色谱胶平衡后，渗滤产物被加样至柱子上。0.22μm的过滤管被安装以便进行渗滤产品的在线过滤。表29中详细列出进一步的色谱分离步骤。

表29：Capto-MMC色谱分离步骤

	色谱分离步骤	缓冲液/产品	线性流速	数量
								cm/h	CV¹⁾
1	酸洗	ES4在线稀释至0.2M醋酸	300	1
					2	平衡	EP2	150	37
3	吸附	35-45L渗滤产品	150
					4	平衡	EP2	150	30
5	洗涤	WPF	150	10
					6	梯度洗脱	EL1/MMC洗脱物	150	15
7	洗脱II	EL2/MMC洗脱物	150	10
					8	再生	ES4	150	10
9	再生	SHD	150	10

¹⁾CV＝柱体积：在色谱柱中填充树脂的体积

在下游过程中，没有观察到结果。下游步骤(过滤、超滤、渗滤)进行的条件可以与针对恒化培养中的收获物使用的条件相同。平均总rFurin活性产量可以达到91％(系列ORFU06002)、66％(系列ORFU07001)和84％(系列ORFU07002)。唯一的小改变是以下的这个事实：用于超滤步骤的起始体积与连续培养相比有点低。但是这个改变对纯化产品的质量没有影响。(参见总活性、寄主细胞DNA、寄主细胞蛋白数据；参见表30)。

这三个系列中寄主细胞蛋白和寄主细胞DNA含量的平均值显示了相当低的平均值：分别是8.55μg/ml(范围是2.2-10.4μg/ml)和13.48ng/ml(范围是0.0-23.9ng/ml)(参见表30)。色谱分离步骤能降低特定的污染物至低的平均值：0.35ng CHO蛋白/U rFurin活性(范围是0.13-0.52ng CHO蛋白/U)和0.148pg寄主细胞DNA/U rFurin活性(范围是0.0-0.365pg DNA/U rFurin活性)。

表30：Capto-MMC色谱分离杂质结果-系列比较

系列	CHO-蛋白含量	CHO-蛋白/rFurin活性	寄主细胞DNA含量	寄主细胞DAN/rFurin活性
						μg/ml	ng/U	ng/ml	pg/U

ORFU06002	8.55	0.22	1.66	0.059
					ORFU07001	3.50	0.35	2.54	0.031
ORFU07002	2.36	0.026	13.48	0.148

弗林蛋白酶表征。通过下面的生物化学/生物物理方法对rFurin的性质和功能进行评估(表31)。

表31：用于rFurin的分析方法

方法	目的	评论

荧光底物切割	酶活性	低分子量底物
			弗林蛋白酶应用实验	酶活性，熟化有效性	rVWF底物
SDS-PAGE	蛋白组合物	蛋白印迹实验
			IEF	蛋白组合物	考马斯染色，蛋白印迹实验
RP-HPLC	蛋白组合物	蛋白指纹图谱

弗林蛋白酶活性测试。纯化的rFurin批次(Capto-MMC洗脱收集液)被用于检测弗林蛋白酶的酶活性。底物是短合成肽，其包含附着于荧光氨甲基香豆素(AMC)基团的二碱基识别序列，在切割后被释放出来(BOC-RVRR-AMC)。释放的荧光基团可以通过在380nm处激发并随后在435nm处测定发射光而被检测出来。一个活性单位定义为在30℃下每分钟释放1pMol的AMC。

取决于发酵和纯化有效性，rFurin活性的测定值在大约10000U/ml直到大于大约100000U/ml的范围内，平均值为大约69000U/ml(表32、表32和表34)。注意到RFB模式系列的rFurin活性的增加，尤其是当恒化系列ORFU06002(47737U/ml)平均值与RFB系列ORFU07001(77653U/ml)和ORFU07002(93178U/ml)平均值比较。(总体来说，rFurin活性范围是大约10000至大于100000U/ml；没有显示所有的数据)。

弗林蛋白酶比活性表示为活性U/μg蛋白(参见表32-34)。系列ORFU06002平均比活性是269U/μg蛋白。分别地，ORFU07001增加至500U/μg和ORFU07002增加至563U/μg。(总体来说，比活性范围是124-620U/μg蛋白；没有显示数据)。因此，两个RFB系列的比活性加倍，与恒化模式生产的批次比较，RFB rFurin的结果是酶活性较高。

表32：ORFU06002系列Capto-MMC洗脱收集液

表33：ORFU07001系列Capto-MMC洗脱物

表34：ORFU07002系列Capto-MMC洗脱物

弗林蛋白酶-应用-活性试验。设计弗林蛋白酶-应用-试验用来定量rFurin处理前VWF成为成熟的rVWF的有效性。熟化有效性被表示为熟化1个VWF抗原单位所需要的弗林蛋白酶单位的量(U弗林蛋白酶/U VWF)。底物是前VWF/VWF制品，此制品根据当前的制造工序在中试规模中被纯化，但是省略了弗林蛋白酶熟化和最后在Superose 6上纯化的步骤。rVWF底物浓度是100U抗原/ml(F8HL_24_01 UF02-R)。

四个样品稀释物在1ml的微量离心管中被检测，覆盖了特定的弗林蛋白酶浓度：比如0.25-2.0U/U VWF。反应和稀释缓冲液是100mM的HEPES、1mM CaCl₂、pH 7.0并且熟化实验在轻微搅拌下在37℃下进行16个小时。在温育后通过添加SDS-样品缓冲液并且在＞90℃下加热样品5分钟来终止酶反应。通过SDS-PAGE在8％的凝胶上使用银染法将分离的多肽染色来分析样品。得到＞95％的熟化有效性所需要的弗林蛋白酶比活性可以通过凝胶的目测检查来评估(前VEF条带应当小于成熟VWF条带的5％)，然后被报导并被用作被检测的rFurin的质量属性。

表35：ORFU06002系列Capto-MMC洗脱收集液

弗林蛋白酶批号恒化模式	Furin活性	应用测试活性	成熟度
					[U/ml]	[U/U]	[％]

				ORFUCHR06002MMC01	28231	0.7	＞95
ORFUCHR06002MMC02	16307	0.4	＞95
				ORFUCHR06002MMC03	44854	1.1	＞95
ORFUCHR06002MMC04	39102	1.3	＞95
				ORFUCHR06002MMC05	71871	1.0	＞95
ORFUCHR06002MMC06	44292	1.0	＞95
				ORFUCHR06002MMC07	68728	1.0	＞95
ORFUCHR06002MMC08	68510	1.0	＞95

平均值	47737	0.58	＞95

表36：ORFU07001系列Capto-MMC洗脱收集液

弗林蛋白酶批号重复分批补料	Furin活性	应用测试活性	成熟度
					[U/ml]	[U/U]	[％]

				ORFUCHR07001MMC01	77090	0.5	＞95
ORFUCHR07001MMC02	68450	0.5	＞95

ORFUCHR07001MMC03	87420	0.5	＞95
				平均值	77653	0.5	＞95

表37：ORFU07002系列Capto-MMC洗脱收集液

弗林蛋白酶批号重复分批补料	Furin活性	应用测试活性	成熟度
					[U/ml]	[U/U]	[％]

				ORFUCHR07002MMC01	91200	0.5	＞95
ORFUCHR07002MMC02	96400	0.5	＞95
				ORFUCHR07002MMC03	95020	0.5	＞95
ORFUCHR07002MMC04	85690	0.3	＞95
				ORFUCHR07002MMC05	102670	0.6	＞95
ORFUCHR07002MMC06	88090	1.0	＞95

平均值	93178	0.6	＞95

发现所有检测的rFurin批次对于前VWF具有好的和一致的熟化活性。这些系列的平均值在1.0U弗林蛋白酶/U VWF：抗原以下，并且在任何情况中成熟度都超过95％。(表35-37)。就系列ORFU06002、ORFU07001和ORFU07002的计算平均值而言，所有rFurin批次的熟化活性都是类似的，几乎没有发现恒化模式生产的rFurin和RFB模式生产的rFurin之间的差异。

弗林蛋白酶SDS-PAGE和银染。所有的rFurin批次都进行了8％SDS-PAGE和银染及蛋白质印迹分析，以便确保一致的质量并使杂质程度目视化。如图12所示，系列ORFU06002和ORFU07002的Capto-MMC洗脱物的条带模式相互关联度很高；所有样品在大约60kDa处显示了明显的弗林蛋白酶条带。在ORFU06002系列的样品中从MMC01批次到MMC08批次可以看见弗林蛋白酶条带有分子量轻微降低的趋势(图12，泳道1-8)。那些批次的样品被去糖基化，造成了这个趋势在随后的SDS-PAGE和银染中不再可目测(没有显示数据)，这就支持了如下假说：在系列ORFU06002期间，在正在进行的发酵过程中rFurin糖基化稍有不同或者差异程度更小。在RFB系列ORFU07002中没有观察到这个趋势，表明在整个系列中rFurin恒定的糖基化。批次ORFU06002至ORFU07002中的杂质几乎完全相同；然而，RFB模式系列ORFU07002中的样品在40kDa区域(在系列ORFU06002的样品中特别强烈富集的多肽)显示了不明显的区带。

SDS-PAGE蛋白质印迹。使用单克隆抗弗林蛋白酶抗体对所有的样品进行蛋白质印迹分析(图13)。在约60kDa处的主要条带可以被鉴定为弗林蛋白酶条带，并在所有的样品中被发现。样品的相似性很高。条带强度上的细微差别是由于样品中弗林蛋白酶浓度不同。总体来说，SDS-PAGE分析描绘了恒化模式和RFB模式生产的rFurin的相似性。

为了支持常规的SDS-PAGE，在系列ORFU06002和ORFU07002的样品上进行等电聚焦(IEF)。使用垂直IEF在pH 7.0和pH 3.0之间进行IEF。通过考马斯染色和蛋白质印迹分析使多肽可视化。系列ORFU06002 rFurin样品的IEF和随后的蛋白质印迹法提供了弗林蛋白酶特定的条带图形(参见图14)。在pH 4.5至pH 5.5的区域可以确定多达七个分开的条带，在所有的样品中至少有五个条带存在。

使用考马斯着色和蛋白质印迹分析对系列ORFU07002样品进行IEF用于目测。所有样品的考马斯染色显示了特定的条带模式，显示在pH 4.5至pH 5.5范围内至少五个分开的条带，可以确定多达八个条带(参见图15，泳道3)。

蛋白质印迹分析(参见图16)确证了这些结果，有些样品显示在考马斯凝胶上并非所有条带都是可见的(参见图17)，可能由于蛋白从凝胶到印迹膜上不完全的转移。

弗林蛋白酶反相HPLC。来自于系列ORFU06002和ORFU07003(Capto-MMC洗脱物)的样品通过C4RP-HPLC进行检测，以便建立用于rFurin的指纹图谱。比较了两个系列的样品的峰图谱(参见图17和图18)。

所以被检测的样品的色谱在大约13分钟的保留时间处显示了特征性主峰，可以被认定是弗林蛋白酶。峰高度与样品中弗林蛋白酶的浓度很好地相关。在8分钟至17分钟的范围内可以看见其它蛋白杂质以较小的峰出现。来自系列ORFU07002的所有样品比来自ORFU06002的样品显示了明显少的和小的杂质峰。这个事实与RFB模式系列ORFU07002的SDS-PAGE结果充分一致，因为在RFB模式系列ORFU07002中发现较小数量且数量减少的杂质。

从上述讨论的检定方法中获得的分析数据证明了在恒化模式和RFB模式两者中产生的rFurin具有很好的相似性。从得到的数据中没有检测出rFurin性质上的差异，然而，以RFB模式生产的rFurin批次比以恒化模式生产的rFurin有更高的比活性和更少的杂质。色谱分离步骤统计了在大体积制剂物质(Bulk Drug Substance，BDS)中非常低的寄主细胞蛋白和寄主细胞DNA含量。至少包括RFB发酵和整个下游加工过程(过滤、超滤/渗滤、Capto-MMC色谱分离法)的完整生产过程是可能容易实现的，以用于rFurin的工业生产，比如在单个使用的生物反应器(SUB)系统中。

实施例6：安全性、无菌性和稳定性试验

这个实施例描述了安全性、无菌性和稳定性试验，进行这些试验以便测定和维持CHO细胞库的质量。根据ICH指南Q5D的要求进行无菌/菌原体检测。细胞库的质量得通过测定解冻细胞的平均存活率和细胞密度和随后的培养的生长速率来检测。

细胞进行病毒安全性检测(表38)、遗传稳定性检测(表39)和同一性检测(表40)。细胞被发现是无菌的，不含菌原体、外来因子、逆转录病毒，对于MVM病毒、外来病毒、啮齿类动物病毒是呈阴性的，不含猪和牛病毒、Cache Vallley病毒(CW)。

通过荧光激活细胞分类术分析来检测细胞库的弗林蛋白酶生产者/非生产者比率。还测试它们的长期稳定性(一段时间内生产弗林蛋白酶的能力)。更进一步地，还得研究在无血清条件下生产的被分泌的弗林蛋白酶的产生的同工型。所有的数据显示，使用这些细胞库可以完成稳定生长和弗林蛋白酶的生产。

在整个生产过程中来自于MCB/WCB的细胞应当显示稳定生长和弗林蛋白酶表达。

表38.病毒安全性项目

实验	MCB	WCB	MEPC
				体外外来病毒(CHO、A9、Vero、MRC-5细胞)	X	X	X
体内外来病毒(在乳鼠、成年鼠、豚鼠和含胚的蛋中)	X	(X)	X
				啮齿类病毒用LCMV挑战的MAP实验	X	---	---
啮齿类病毒HAP	X	---	---
				啮齿类病毒	X	---	X

MMV(体外实验)
				逆转录病毒EM(透射电镜检测)	X	---	X
逆转录病毒用Pert终点法的逆转录传染性实验	X	---	X
				逆转录病毒EXS+L-(通过MinkS+L-Focus体外检测异嗜性逆转录病毒)	X	---	X
逆转录病毒/通过与HEK293细胞共培养来共培养检测传染性逆转录病毒(5代)	---	---	X
				牛病毒：根据CMPC&US 9CFR要求检测牛血清中的病毒污染物	X	---	---
猪病毒：在体外实验中，根据9CFR使用PPK指示细胞检测猪的病毒污染物	X	---	---
				PCR牛多瘤病毒	X	---	X
Cache Valley病毒的实时PCR(CVV)	X	---	X

在MEPC由其制备的WCB上没有进行病毒测定。

表39.遗传稳定性项目

实验	MCB	WCB	MEPC
				生产率：弗林蛋白酶活性测试	X	X	X
测序	X	---	X
				定量PCR(基因拷贝数)	X	---	X
DNA印迹法	X	---	X
				蛋白印迹法	X	---	X

表40.同一性项目

实验	MCB	WCB	MEPC
				同工酶分析	X	X	X

本发明已经描述了已发现的或者打算做的具体的实施方式，以便包括优选方式用于以后发明的实验操作。根据本文的公开，本领域的技术人员应理解，在不违背本发明范围的情况下，本发明具体实施方式能够具有各种修饰和改变。因此，本发明附后的权利要求覆盖了本发明范围内的所有的这些等效的变型。

Claims

1.一种包含基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶的组合物。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约10000U弗林蛋白酶/mL的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约11μg蛋白/mL的CHO寄主细胞蛋白。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约10000U弗林蛋白酶/mL的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约1.0ng蛋白/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主细胞蛋白。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约10000U弗林蛋白酶/mL的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约14ng DNA/mL的CHO寄主细胞DNA。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约10000U弗林蛋白酶/mL的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约0.5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主细胞DNA。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约100U/μg的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约11μg蛋白/mL的CHO寄主细胞蛋白。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约100U/μg的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约1.0ng蛋白/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主细胞蛋白。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约100U/μg的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约14ng DNA/mL的CHO寄主细胞DNA。

9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含活性至少是大约100U/μg的重组体弗林蛋白酶和浓度小于大约0.5pg DNA/U弗林蛋白酶活性的CHO寄主细胞DNA。

10.一种制造基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶的方法，包括以下步骤：在无血清培养基中在允许弗林蛋白酶分泌进入培养基的条件下，培养用编码弗林蛋白酶的多核苷酸转化的或者转染的寄主细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：使寄主细胞适应在血清浓度逐渐降低、直至血清从培养基中被除去的培养基中生长。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括使寄主细胞由在含有血清的培养基中生长转移至在无血清的培养基中生长。

13.如权利要求11或者12所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞是CHO细胞。

14.一种应用如权利要求1所述组合物的方法，包括下述步骤：在可将前肽从前蛋白中切除从而形成成熟蛋白的条件下使前蛋白与所述组合物相接触。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述成熟蛋白是冯威勒布兰特因子。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述成熟蛋白是因子Ⅷ。