CN108611342A - 一种重组人凝血因子ix活性分子的补料发酵方法 - Google Patents

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    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Abstract

本发明公开了一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，它包括如下步骤：(1)接种培养：将用于生产重组人凝血因子IX活性分子的细胞株接种于培养基中，发酵培养；(2)补料发酵：发酵72‑96小时后，调节培养液中钙、镁离子浓度；并补加培养基，继续发酵；(3)当发酵至细胞活率低于70％，终止培养。本发明采用一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，对补料培养工艺进行了优化，通过控制发酵过程中钙离子与镁离子的浓度比例、补料液中Cell Boost 2的含量、葡萄糖的浓度、补料频率等因素，有效的提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量，具有良好的应用前景。

Description

一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
技术领域
本发明涉及一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法。
背景技术
人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)是一种糖蛋白，属于维生素K依赖性凝血因子，在血液中以丝氨酸蛋白酶的形式存在，在内源性凝血途径中起着重要的作用。人凝血因子IX在人肝脏中合成，并经过多种翻译后修饰才能成为成熟蛋白，包括糖基化、信号肽和前导肽的切除、N末端GLA区域的维生素K依赖性的γ-羧基化等。人凝血因子IX缺乏或者功能异常会导致出血性疾病血友病B的发生。血友病B在男性中的发病率为1/30000，而在女性中则非常罕见。血友病B临床主要靠定期输新鲜血浆或人凝血IX因子浓缩剂进行治疗。
补料批次培养是大规模产业化细胞培养中使用最广泛的一种培养，然而，在补料批次培养中细胞在经历对数生长期、平台期后会进入衰退期，期间细胞密度、细胞活率急剧下降，大大影响重组蛋白产量。为解决上述问题，需要对培养工艺进行优化，目前，优化方法主要包括使用半乳糖或果糖替代葡萄糖作为细胞培养的碳源，可以有效减少细胞培养过程中乳酸的产生和积累，改善细胞的后期生长状况；在无血清培养基中添加丙氨酰谷氨酰胺作为碳源可以提高细胞表达量，降低细胞凋亡率；或是利用基因工程手段抑制乳酸过量产生。
然而，目前重组人凝血因子IX活性分子及其衍生物的产量并不高，例如Kim等人通过对培养工艺优化，凝血因子IX的最高的产量为1.33IU/mL(Effect of Ca2+and Mg2+concentration in culture medium on the activation of recombinant factor IXproduced in Chinese hamster ovary cells，Journal of Biotechnology，2009，142，275-278)。因此，现有的培养工艺优化方法并不能实现较高的重组人凝血因子IX的产率，如何对培养工艺进行优化以提高产量一直是生物医药企业迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，该方法对补料培养工艺进行了优化，显著提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量。
本发明中，术语“分批补料”就是在发酵过程中，随着营养物质消耗，按照一定的时间间隔分批补入营养物质以达到维持代谢的目的。
本发明中，所述的CDM4PERMAb培养基、ActiPro培养基、CDM4Mab培养基购买于HYCLONE公司；CD OptiCHO培养基购买于GIBCO公司。
Cell Boost 2为HYCLONE公司的一款商业化的补料试剂，主要成分为氨基酸，维生素和葡萄糖。
重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白为一种融合蛋白，它包括重组人凝血因子IX蛋白和Fc蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。
重组人凝血因子IX-白蛋白融合蛋白为一种融合蛋白，它包括重组人凝血因子IX蛋白和白蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。
PEG修饰的重组人凝血因子IX包括一个位点或多个位点带有官能团PEG修饰的重组人凝血因子IX蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。
本发明提供了一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，它包括如下步骤：
(1)接种培养：将用于生产重组人凝血因子IX活性分子的细胞株接种于培养基中，发酵培养；
(2)补料发酵：发酵72-96小时后，调节培养液中钙离子浓度至1mM/L-3mM/L，镁离子浓度至0.5mM/L-2mM/L；并补加培养基，继续发酵；
(3)当发酵至细胞活率低于70％，终止培养。
其中，所述的重组人凝血因子IX活性分子包括重组人凝血因子IX或长效重组人凝血因子IX；优选地，所述的长效重组人凝血因子IX包括重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白、重组人凝血因子IX-白蛋白融合蛋白、PEG修饰的重组人凝血因子IX。
其中，步骤(1)中，所述的细胞株包括CHO细胞株、HEK293细胞株；优选地，所述的CHO细胞株为重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株、长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)细胞株。
其中，步骤(1)中，所述的培养基包括CDM4PERMAb培养基、ActiPro培养基、CDM4MAb培养基或CD OptiCHO培养基。
其中，所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的细胞株按10-100万/ml细胞密度接种于培养基中，培养；
优选地，所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的CHO DG44细胞株按50-80万/ml细胞密度接种于含5-10μg/ml维生素K1的培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。
其中，步骤(2)中，所述的发酵时间为72小时。
其中，步骤(2)中，所述的调节培养液中钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3；
优选地，所述浓度比为4:3。
其中，步骤(2)中，所述的补加培养基的频率为每12小时或者24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的10％-40％。
其中，所述的补加培养基的频率为每12小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的10％-20％；或所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的20％-40％。
其中，所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的30％。
其中，所述的补加的培养基中还含有Cell Boost 2；含有Cell Boost 2的培养基中的Cell Boost 2的含量不高于1.2％。
其中，步骤(2)中，所述补料发酵过程中还包括维持葡萄糖浓度在4g/L-8g/L之间；优选地，所述的葡萄糖浓度为5g/L。
其中，所述葡萄糖的补料方式是：每12小时或者24小时补加一次，每次补加至葡萄糖浓度为4g/L-8g/L之间；优选地，每次补加至葡萄糖浓度为5g/L。
其中，步骤(2)中，所述补料发酵过程中还包括维持培养液中钙离子浓度至1mM/L-3mM/L，镁离子浓度至0.5mM/L-2mM/L。
其中，所述的培养液中钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3；
优选地，所述浓度比为4:3。
本发明采用一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，对补料培养工艺进行了优化，通过控制发酵过程中钙离子与镁离子的浓度比例、补料液中Cell Boost 2的含量、葡萄糖的浓度、补料频率等因素，有效的提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为摇瓶分批补料发酵中钙离子和镁离子对重组人凝血因子IX发酵的影响；横坐标为“实施例”中各实验组编号，纵坐标为各实验组相对对照组重组人凝血因子IX活性产量；
图2为摇瓶分批补料发酵中钙镁离子比例对重组人凝血因子IX发酵的影响；横坐标为“实施例”中各实验组编号，纵坐标为各实验组相对对照组重组人凝血因子IX活性产量；
图3为摇瓶分批补料发酵中补料液对重组人凝血因子IX发酵的影响；横坐标为“实施例”中各实验组编号，纵坐标为各实验组相对对照组重组人凝血因子IX活性产量；
图4为摇瓶分批补料发酵中不同补料速率对重组人凝血因子IX发酵的影响；横坐标为“实施例”中各实验组编号，纵坐标为各实验组相对对照组重组人凝血因子IX活性产量；
图5为摇瓶分批补料发酵长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)；横坐标为“实施例”中各实验组编号，纵坐标为各实验组相对对照组重组人凝血因子IX活性产量；
图6为摇瓶分批补料发酵重组人凝血因子IX细胞生长曲线；
图7为摇瓶分批补料发酵重组人凝血因子IX产量曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株及长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)的构建
1材料与方法
1.1细胞、质粒及菌株
真核表达质粒pRH由成都蓉生药业有限责任公司构建；二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-DG44)购自Invitrogen；大肠杆菌TOP10为成都蓉生药业有限责任公司保存。
1.2主要试剂
阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；PERMAb无血清培养基购自HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自PAA公司；限制性内切酶及各种修饰酶购自TaKaRa公司；1kb DNA marker购自NEB；蛋白marker、APS、TEMED、聚丙烯酰胺浓缩液购自Bio-Rad公司；MTX、次黄嘌呤和胸苷(HT)购自Sigma；DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。
1.3细胞复苏
将CHO/DG44细胞株从液氮复苏于30ml PERMAb无血清培养基，37℃，5％CO2摇床转速100rpm进行悬浮培养，为细胞转染做准备。
1.4重组质粒的构建
人FIX基因由Invitrogen公司合成，与美国上市产品BeneFix氨基酸序列一致，为Ala148等位基因；人FIX-Fc基因以及Fc片段基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成，通过内切酶位点BssHⅡ/XbaⅠ将目的基因克隆到质粒pRH上，由CMV启动子控制其表达，表达载体上含有DHFR基因作为筛选标记基因。经双酶切鉴定和测序分析验证重组表达质粒的正确性。
1.5CHO细胞转染
实验所使用的宿主细胞是CHO-DG44，制备转染用重组质粒，细胞转染用阳离子脂质体转染法。转染前一天，将对数生长期的CHO-DG44以无抗生素培养基PERMAb培养于6孔细胞板，2ml/孔，补加10％FBS和HT，待细胞生长至90％时，取上述构建的重组质粒4μg和真核细胞脂质体转染试剂10μl(Lipofectamine2000，Invitrogen)于200μl上述无抗生素培养基中轻轻混匀，静置5分钟，再将上述表达质粒和脂质体转染试剂混合物加于细胞孔中，轻轻摇匀，于37℃，5％CO2静置培养6h。6h后更换新鲜培养基PERMAb，补加10％FBS和HT，37℃继续培养24h；用0.25％胰酶消化细胞，分种于96孔板中，用不含HT的筛选培养基于37℃培养，每3d更换新鲜培养液直至克隆出现。并测定凝血因子IX的活性。
1.6工程细胞株的筛选及表达
阳性细胞克隆依次从96孔板转入24孔板、T25方瓶和摇瓶中进行逐级筛选和放大培养，将筛选的细胞株分别用MTX进行逐步加压和极限稀释法进行数轮亚克隆筛选，并在过程中监测人FIX在上清中的活性，最终筛选得到表达量较高的工程细胞株。最后通过SDS-PAGE鉴定表达的人FIX。
经过以上方法的筛选，筛选得到的工程细胞株为重组人凝血因子IXCHO(DG44)细胞株或长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)。
实施例2重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
(1)接种培养：将实施例1制备得到的重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含10μg/ml维生素K1的CDM4MAb(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养；
(2)补料发酵：接种发酵72h后调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并以起始培养体积的30％/24h补加CDM4MAb(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％CellBoost 2(HYCLONE)，补料的同时，维持培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L；
(3)发酵至细胞活率低于70％终止培养。
实施例3重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
(1)接种培养：将实施例1制备得到的重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按80万/ml细胞密度接种于30ml含5μg/ml维生素K1的CDM4MAb(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养；
(2)补料发酵：接种发酵72h后调节培养液钙离子至1mM/L，镁离子至0.5mM/L，并以起始培养体积的20％/24h补加CDM4MAb(HYCLONE)培养基，其中培养基含有0.6％CellBoost 2(HYCLONE)，补料的同时，维持培养液中钙离子至1mM/L，镁离子至0.5mM/L，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于4g/L，则将葡萄糖浓度补足至4g/L；
(3)发酵至细胞活率低于70％终止培养。
实施例4重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
(1)接种培养：将实施例1制备得到的重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含10μg/ml维生素K1的ActiPro(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养；
(2)补料发酵：接种发酵72h后调节培养液钙离子至3mM/L，镁离子至2mM/L，并以起始培养体积的40％/24h补加ActiPro(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％Cell Boost2(HYCLONE)，补料的同时，维持培养液中钙离子至3mM/L，镁离子至2mM/L，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于8g/L，则将葡萄糖浓度补足至8g/L；
(3)发酵至细胞活率低于70％终止培养。
实施例5重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)细胞株按100万/ml细胞密度接种于50ml含10μg/ml维生素K1的CDM4PERMAb(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养；
(2)补料发酵：接种发酵72h后调节培养液钙离子至3mM/L，镁离子至2mM/L，并以起始培养体积的40％/24h补加ActiPro(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％Cell Boost2(HYCLONE)，补料的同时，维持培养液中钙离子至3mM/L，镁离子至2mM/L，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于8g/L，则将葡萄糖浓度补足至8g/L；
(3)发酵至细胞活率低于70％终止培养。
实施例6重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法
(1)接种培养：将实施例1制备得到的重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按10万/ml细胞密度接种于10ml CDM4MAb(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养；
(2)补料发酵：接种发酵72h后调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并以起始培养体积的30％/24h补加CDM4MAb(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％CellBoost 2(HYCLONE)，补料的同时，维持培养液中钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L；(3)发酵至细胞活率低于70％终止培养。
以下通过具体实验证明本发明的有益效果：
试验例1：摇瓶分批补料发酵中钙离子和镁离子对重组人凝血因子IX发酵的影响
1、实验材料
重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；CDM4PERMAb、Cell Boost 2购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IX BIOPHEN Factor IX(5)购买于HYPHEN BioMed公司。
2、实验方法
将重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按80万/ml细胞密度接种于30ml含5μg/ml维生素K1的CDM4PERMAb培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。分为三组进行分批补料发酵：a、接种和补料时都带有1mM/L的钙离子和镁离子浓度；b、补料时调节培养液钙离子和镁离子至1mM/L；c、接种和补料时都不进行任何离子的添加。补料方案如下：接种发酵72h后以起始培养体积的20％/24h补加CDM4PERMAb培养基，其中培养基含有1.2％CellBoost 2，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。
台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果：
由图1可知，以c组重组人凝血因子IX产量作为1，在接种时带有钙离子和镁离子的a组，在一个相对于批次发酵拥有更长发酵周期的摇瓶分批补料发酵中，相对于对照组c，并不能得到一个更优的重组人凝血因子IX产量，这是由于初始较高浓度的钙离子和镁离子明显抑制细胞生长，使得在整个发酵周期中达不到一个很高的细胞密度；而另一方面，在接种发酵72h后，细胞已生长至一定的细胞密度，再添加钙离子和镁离子的b组，明显降低早期较高浓度的钙离子和镁离子对发酵过程的负面作用，相对于对照组c，得到了一个更优的重组人凝血因子IX产量。
试验例2：摇瓶分批补料发酵中钙镁离子比例对重组人凝血因子IX发酵的影响
1、实验材料
重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；CDM4PERMAb、Cell Boost 2购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IX BIOPHEN Factor IX(5)购买于HYPHEN BioMed公司。
2、实验方法
将重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含5μg/ml维生素K1的CDM4PERMAb培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。分为五组进行分批补料发酵：a、补料时调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1mM/L；b、补料时调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.3mM/L；c、补料时调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L；d、补料时调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至2mM/L；e、接种和补料时都不进行任何离子的添加。a，b，c，d组分别对应钙镁离子比例为2比1，3比2，4比3和1比1。补料方案如下：接种发酵72h后以起始培养体积的20％/24h补加CDM4PERMAb培养基，其中培养基含有1.75％Cell Boost 2，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。
台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果
由图2可知，以e组重组人凝血因子IX产量作为1，钙镁离子的适当配比才能得到较优的重组人凝血因子IX产量。钙镁离子比例过高的a组虽然相对于对照组e，提高了重组人凝血因子IX的产量，但是钙镁离子比例适中的b，c，d组得到了更优的重组人凝血因子IX产量，且三组间无显著性差异。所以钙镁离子比例过低的d组也没有达到进一步提高重组人凝血因子IX产量的目的。钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3能有效提高重组人凝血因子IX的产量。
试验例3：摇瓶分批补料发酵中补料液对重组人凝血因子IX发酵的影响
1、实验材料
重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；ActiPro、Cell Boost 2购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IXBIOPHEN Factor IX(5)购买于HYPHEN BioMed公司。
2、实验方法
将重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含5μg/ml维生素K1的ActiPro培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。分为五组进行分批补料发酵：a.补料液为ActiPro培养基；b.补料液为含0.6％Cell Boost 2的ActiPro培养基；c.补料液为含1.2％Cell Boost 2的ActiPro培养基；d.补料液为含1.75％Cell Boost2的ActiPro培养基；e.补料时根据维持葡萄糖浓度为5g/L，添加3.5％Cell Boost 2的水溶液。接种发酵72h后调节钙离子至1.5mM/L，镁离子至1mM/L，除了e组以外以起始培养体积的20％/24h进行补料，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。
台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果
由图3可知，以a组重组人凝血因子IX产量作为1，联合补料Cell Boost 2(HYCLONE)和ActiPro(HYCLONE)培养基得到了更优的重组人凝血因子IX产量；在摇瓶分批补料发酵过程中，高于1.2％Cell Boost 2(HYCLONE)的补料方案d组，出现了抑制细胞生长的现象，细胞状态也不如其他组，重组人凝血因子IX产量也不如b组和c组。补料液中含CellBoost 2(HYCLONE)不高于1.2％能有效提高重组人凝血因子IX的产量。
试验例4：摇瓶分批补料发酵中不同补料速率对重组人凝血因子IX发酵的影响
1、实验材料
重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；ActiPro购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IX BIOPHEN Factor IX(5)购买于HYPHENBioMed公司。
2、实验方法
将重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含10μg/ml维生素K1的ActiPro(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。分为三组进行分批补料发酵：a.补料速率为起始培养体积的20％/24h；b.补料速率为起始培养体积的30％/24h；c.补料速率为起始培养体积的40％/24h。接种发酵72h后调节钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并进行补料，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果
由图4可知，以b组重组人凝血因子IX产量作为1，补料速率为起始培养体积的20％-40％/24h都能有效提高重组人凝血因子IX的产量。可以满足工业生产中3-5倍体积的放大。
试验例5：摇瓶分批补料发酵长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)
1、实验材料
长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；CDM4PERMAb、Cell Boost 2购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IX BIOPHENFactor IX(5)购买于HYPHEN BioMed公司。
2、实验方法
将长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含5μg/ml维生素K1的CDM4PERMAb培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。分为二组进行分批补料发酵：a.接种发酵72h后调节培养液钙离子至1.5mM/L，镁离子至1mM/L，并以起始培养体积的20％/24h补加CDM4PERMAb培养基，其中培养基含有1.2％Cell Boost 2，补料的同时，检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L；b.接种发酵72h后仅以起始培养体积的20％/24h补加CDM4PERMAb培养基，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。
台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果
由图5可知，以对照组b组长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)作为1，根据本发明的补料发酵方法，有效地提高了长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)的产量。
试验例6：一次高产摇瓶分批补料发酵重组人凝血因子IX
1、实验材料
重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株(根据实施例1的构建方法制备得到)；ActiPro、Cell Boost 2购买于HYCLONE公司；重组人凝血因子IXBIOPHEN Factor IX(5)购买于HYPHEN BioMed公司。
2、实验方法
将重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml含10μg/ml维生素K1的CDM4MAb培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养，接种发酵72h后调节培养液钙离子至2mM/L，镁离子至1.5mM/L，并以起始培养体积的30％/24h补加CDM4MAb培养基，其中培养基含有1.2％Cell Boost 2，补料的同时，维持原钙离子、镁离子浓度，并检测葡萄糖含量，若是葡萄糖浓度低于5g/L，则将葡萄糖浓度补足至5g/L。发酵至细胞活率低于70％终止培养。
台盼蓝染色计数细胞。重组人凝血因子IX活性由BIOPHEN Factor IX(5)试剂盒进行测定。
3、实验结果
图6展示了在整个发酵过程中细胞的生长情况，加入钙镁离子后，细胞成团逐日明显，所以造成细胞计数不准确。由图7可知，根据本发明的补料发酵方法，有效地提高了重组人凝血因子IX的产量，经过14天的补料发酵，产量高达20.62IU/ml。
综上，本发明采用一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，对补料培养工艺进行了优化，通过控制发酵过程中钙离子与镁离子的浓度比例、补料液中Cell Boost2的含量、葡萄糖的浓度、补料频率等因素，有效的提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量，具有良好的应用前景。

Claims (15)

1.一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)接种培养：将用于生产重组人凝血因子IX活性分子的细胞株接种于培养基中，发酵培养；
(2)补料发酵：发酵72-96小时后，调节培养液中钙离子浓度至1mM/L-3mM/L，镁离子浓度至0.5mM/L-2mM/L；并补加培养基，继续发酵；
(3)当发酵至细胞活率低于70％，终止培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组人凝血因子IX活性分子包括重组人凝血因子IX或长效重组人凝血因子IX；优选地，所述的长效重组人凝血因子IX包括重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白、重组人凝血因子IX-白蛋白融合蛋白、PEG修饰的重组人凝血因子IX。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的细胞株包括CHO细胞株、HEK293细胞株；优选地，所述的CHO细胞株为重组人凝血因子IX CHO(DG44)细胞株、长效重组人凝血因子IX(Fc融合蛋白)CHO(DG44)细胞株。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的培养基包括CDM4PERMAb培养基、ActiPro培养基、CDM4MAb培养基或CD OptiCHO培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的细胞株按10-100万/ml细胞密度接种于培养基中，培养；
优选地，所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的CHO DG44细胞株按50-80万/ml细胞密度接种于含5-10μg/ml维生素K1的培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的发酵时间为72小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的调节培养液中钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3；
优选地，所述浓度比为4:3。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的补加培养基的频率为每12小时或者24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的10％-40％。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的补加培养基的频率为每12小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的10％-20％；或所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的20％-40％。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的30％。
11.根据权利要求1、8、9、10任意一项所述的方法，其特征在于：所述的补加的培养基中还含有Cell Boost 2；含有Cell Boost 2的培养基中的Cell Boost 2的含量不高于1.2％。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述补料发酵过程中还包括维持葡萄糖浓度在4g/L-8g/L之间；优选地，所述的葡萄糖浓度为5g/L。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖的补料方式是：每12小时或者24小时补加一次，每次补加至葡萄糖浓度为4g/L-8g/L之间；优选地，每次补加至葡萄糖浓度为5g/L。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述补料发酵过程中还包括维持培养液中钙离子浓度至1mM/L-3mM/L，镁离子浓度至0.5mM/L-2mM/L。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的培养液中钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3；
优选地，所述浓度比为4:3。
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