KR101618144B1 - 실질적으로 동물 단백질-부재인 재조합 푸린 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 푸린(r푸린) 및 r푸린의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린 및 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

실질적으로 동물 단백질-부재인 재조합 푸린 및 이의 제조 방법{SUBSTANTIALLY ANIMAL PROTEIN-FREE RECOMBINANT FURIN AND METHODS FOR PRODUCING SAME}

본 출원은 여기서 그 전체가 참조로 도입된 2007년 12월 31일 출원된 미국 가특허 출원 제61/018,152호의 우선권을 주장한다.

<기술 분야>

본 발명은 전체적으로 재조합 푸린(furin)(r푸린) 및 r푸린의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린 및 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린의 제조 방법에 관한 것이다.

활성 또는 성숙 단백질은 일반적으로 살아있는 유기체 안에 매우 적은 양으로 존재한다. 따라서, 그들의 프로-단백질 또는 프로-효소를 활성화 효소(예컨대, 프로테아제)와 접촉시킴으로써 그들을 바람직하게 시험관 내에서 활성화시킨다. 프로-단백질(또는 단백질 전구체)은 1 이상의 번역 후 변형에 의해 및, 구체적으로 프로-단백질로부터 프로-펩티드의 절단에 의해 활성이 되는 불활성 단백질이다. 프로-단백질의 예는 예컨대, 프로-인슐린, 프로트롬빈, 프로-폰 빌레브란트 인자(프로-VWF) 등을 포함한다.

폰 빌레브란트 인자(VWF)는 응고에 관련된 혈액 글리코단백질이다. VWF는 폰 빌레브란트병에서 결핍 또는 결손되며, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 히데 증후군(Heyde's syndrome) 및 가능하게는 용혈성 요독 증후군을 포함한 수많은 다른 병과 관련된다. VWF는 약 500 내지 20,000 kD 크기 범위의 일련의 다량체로서 혈장 속에서 순환하는 글리코단백질이다. VWF의 다량체 형태는 이황화물 결합으로 함께 연결된 250 kD 폴리펩티드 아단위로 구성된다. VWF는 손상된 혈관 벽의 내피밑층에의 초기 혈소판 부착을 매개하고, VWF의 더 큰 다량체만이 지혈 활성을 보인다고 여겨진다. 큰 분자량을 갖는 VWF 다량체들은 내피 세포의 바이벨-펠라드 소체 내에 저장되고 자극에 의해 유리된다. 그 후 유리된 VWF는 혈장 프로테아제에 의해 추가로 가공되어 VWF의 저분자량 형태를 낳는다.

인간에게서 프로-펩티드의 제거는 거의 완전한 반면, 높은 수준의 재조합 VWF 발현을 갖는 포유동물 세포주에서 이 과정은 별로 효과적이지 않다. 따라서, 이와 같은 재조합 세포주로부터의 세포 배양 상청액은 통상적으로 성숙 VWF 및 프로-VWF와 같은 VWF 전구체의 혼합물을 포함한다. 따라서 성숙 VWF를 얻기 위해 VWF 전구체, 구체적으로 프로-VWF를 성숙 VWF로 전환하는 것이 필수적이다. 이 과정은 통상적으로 프로-펩티드를 프로테아제로 절단함으로써 달성된다.

현재의 통상적인 방법은 성숙 VWF의 프로-형태를 프로테아제와 함께 액체 상에서 인큐베이션시키고 그로써 자유 용액 내에서 부착되지 않은 상태로 그것 자체의 성숙(즉, 프로-단백질로부터 프로-펩티드의 절단)이 일어나게 하거나, 또는 예컨대 WO 00/49047에 기술된 바와 같이, 프로-VWF를 포함하는 제제와 접촉 및 인큐베이션되는 고체 담체 위에 프로테아제를 고정화시킴으로써(WO 00/49047 참조) 성숙 VWF를 생산한다. 그러나, 이들 방법은 본 발명에 따른 방법에 비해 다양한 단점을 갖는다.

공업적으로, VWF 및 구체적으로, 재조합 VWF(rVWF)는 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 내에서 재조합 인자 VIII(rFVIII)와 함께 합성 및 발현된다. 공-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 공정 중 rFVIII를 안정화하는 것이다. rVWF는 N-말단에 부착된 큰 프로-펩티드를 함유하는 프로-형태로 세포 내에서 합성된다. 원형질 망상체 및 골지체 내에서 성숙시, 세포 프로테아제 푸린의 작용에 의해 프로-펩티드가 절단되고 발현된 단백질의 이량체로 구성된 동일한 아단위의 단독중합체로서 성숙 단백질이 분비된다. 그러나, 성숙은 통상적으로 불완전하여, 프로-VWF 및 성숙 VWF의 혼합물을 포함하는 산물을 생성한다.

종전 문헌들은 푸린 또는 푸린형 프로테아제로의 시험관 내 처리에 의해 프로-VWF가 성숙 VWF로 전환될 수 있음을 보여주었다(문헌 [Schlokat et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 24: 257-267, 1996]; 문헌 [Preininger et al., Cytotechnology 30: 1-15, 1999]; 및 EP 0775750A). 구체적으로, EP 0775750A는 VWF의 성숙이 현장에서 일어날 수 있도록 푸린 및 VWF의 재조합적인 공-발현을 제안한다.

재조합 푸린(r푸린)은 Arg741-Ser742 펩티드 결합을 절단함으로써 프로-rVWF(프로-재조합 폰 빌레브란트 인자)를 rVWF로 변형시킨다. 이 성숙 단계는 폰 빌레브란트병 유형 B 치료를 위한 rVWF 생산 공정의 일부이며 재조합 인자 VIII-반감기(rFVIII-HL) 생산 공정의 일부이다. 푸린은 프로-단백질 변환효소군에 속하며 칼슘(Ca^{2 +})에 의존한다. 푸린은 -1 및 -4 위치의 아르기닌을 함유한 특정한 서열 내 아르기닌의 C-말단 펩티드 결합을 특이적으로 절단한다. 이 서열은 수많은 인간 단백질에서 찾을 수 있고, 푸린이 수많은 인간 프로-단백질의 성숙에 중요한 역할을 함을 보여준다.

활성화된 단백질의 생산은 임상적으로 및 진단적으로 매우 중요하다. 예컨대, 성숙 VWF와 같은 활성 또는 성숙 단백질은 혈액 응고를 조절하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 활성화된 단백질의 후속적인 생산을 위한 실질적으로 동물 단백질-부재 r푸린인 개선된 재조합 푸린(r푸린)을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 프로-VWF의 성숙 VWF로의 변형을 위한 실질적으로 동물 단백질-부재의 r푸린을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 실질적으로 동물 단백질-부재 재조합 푸린(r푸린)인 재조합 푸린(r푸린) 및 이의 제조 방법을 제공한다. 이와 같은 r푸린은 정상적으로 r푸린의 생산과 관련될 수 있는 다른 단백질, 예컨대 혈청 단백질 및 숙주 세포 단백질이 실질적으로 없다. 이 r푸린은 r푸린 제제 내의 단백질 오염과 관련된 부작용 없이 높은 특이적 활성 및 높은 순도를 갖는 성숙 단백질의 후속하는 생산을 가능하게 한다. 더 구체적으로, 이 r푸린은 높은 특이적 활성 및 높은 순도를 갖는 성숙 VWF의 생산을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 재조합 숙주 세포의 화학적으로-정의된 배지에의 선택 및 적응, 세포 배양 상청액 내로 분비되는 r푸린의 발현 및 세포 제거 이후 r푸린의 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린은 약 0.1 내지 0.6 ng 단백질 이하/푸린 활성 단위 또는 약 2 내지 11 μg 단백질 이하/mL 범위인 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하고 및 배양 배지 내에 혈청으로부터의 오염 단백질이 본질적으로 없는 r푸린의 제제 또는 조성물을 포함한다. 일 태양에서, 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린은 약 0 내지 0.4 pg DNA 이하/푸린 활성 단위 또는 약 0 내지 24 ng DNA 이하/mL 농도의 오염 숙주 세포 DNA를 포함하고 및 배양 배지 내에 혈청으로부터의 오염 단백질을 본질적으로 갖지 않는 r푸린의 제제를 포함한다.

본 발명은 10000 U 푸린/mL 이상 활성의 실질적으로 동물 단백질 부재인 재조합 푸린 및 약 11 μg 단백질/mL 미만 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 이와 같은 조성물은 또한 약 1.0 ng 단백질/U 푸린 활성 미만의 농도의 숙주 세포 단백질을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 숙주 세포 단백질은 CHO 세포에서 기인한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 10000 U 푸린/mL 이상의 활성의 실질적으로 동물 단백질 부재인 재조합 푸린 및 약 14 ng DNA/mL 미만의 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 다양한 태양에서, 이와 같은 조성물은 또한 약 0.5 pg DNA/U 푸린 활성 미만의 농도의 숙주 세포 DNA를 포함한다. 일 태양에서, 숙주 세포 DNA는 CHO 세포에서 기인한다.

본 발명은 또한 약 100 U/μg 이상의 특이적 푸린 활성의 실질적으로 동물 단백질 부재인 재조합 푸린 및 약 11 μg 단백질/mL 미만의 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 이와 같은 조성물은 또한 약 1.0 ng 단백질/U 푸린 활성 미만의 농도의 숙주 세포 단백질을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 숙주 세포 단백질은 CHO 세포에서 기인한다.

본 발명은 추가로 약 100 U/μg 이상의 특이적 푸린 활성의 실질적으로 동물 단백질 부재인 재조합 푸린 및 약 14 ng DNA/mL 미만의 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 이와 같은 조성물은 또한 약 0.5 pg DNA/U 푸린 활성 미만의 농도의 숙주 세포 DNA를 포함할 수 있다. 일 태양에서, 숙주 세포 DNA는 CHO 세포에서 기인한다.

본 발명은 또한 여기서 기술된 실질적으로 동물 단백질-부재인 재조합 푸린을 포함하는 조성물의 제조 방법을 포함한다. 이와 같은 방법은 모든 혈청이 배지로부터 제거될 때까지 점점 줄어드는 혈청 농도를 갖는 배지 내에서 성장하도록 숙주 세포를 적응시키는 단계를 포함한다. 또 다른 태양에서, 방법은 숙주 세포를 혈청을 포함하는 배지 내에서의 성장으로부터 혈청-부재 배지 내에서의 성장으로 이동시키는 단계를 포함한다. 예시적인 태양에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.

본 발명은 여기에 기술된 실질적으로 동물 단백질-부재인 재조합 푸린을 포함하는 조성물의 사용 방법을 포함한다. 이와 같은 사용은 프로-단백질로부터 프로-펩티드를 절단하여 성숙 단백질을 형성하는 조건 하에서 프로-단백질을 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. r푸린은 푸린에 의해 절단되는 프로-단백질로부터 임의의 성숙 단백질의 형성에 사용될 수 있다. 일 태양에서, 성숙 단백질은 폰 빌레브란트 인자이다. 다른 태양에서, 성숙 단백질은 인자 VIII이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 r푸린이 그것이 절단하는 임의의 프로-단백질의 시험관 내 및 생체 내 가공 모두에 유용한 것으로 생각된다.

아래 도 1-18에 제시되는 첨부하는 도면을 참조해 본 발명의 추가의 도시를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예의 발현된 활성 r푸린 프로테아제 구축물을 나타낸다. r푸린 구축물는 AA 577에서 C-말단 단부에서 절단되어 Cys-풍부 막통과 및 세포질 구역이 제거되었다.
도 2는 CHO/r푸린 클론 #488-3 세대의 가계도를 나타낸다.
도 3은 CHO/r푸린 클론 #289- 20 세대의 가계도를 나타낸다.
도 4는 PMCB#01 및 PMCB#04의 세포 집단에서 r푸린 생산자의 그래프적 분포의 비교를 제시한다. PMCB#04 내 세포의 80.74 %가 r푸린을 발현한다; PMCB#01 내 세포의 74.06 %가 r푸린을 발현한다.
도 5는 다섯 개의 온도가 세 개의 pH 값과 합쳐져 일곱 개의 온도 및 pH의 조합을 만드는 "도럴트 매트릭스(Doehlert Matrix)"를 도시한다.
도 6은 부피 생산성에 대한 자료의 표면 플롯 분석을 도시한다. 도 6에서 자료의 좌표는 점으로 표시되었다. 표면은 단일 자료의 추정된 상관을 도시한다.
도 7은 온도 및 pH의 부피 생산성에의 영향을 도시하는 윤곽 플롯을 도시한다. 점은 실험적으로 시험된 조건(pH/온도)을 나타낸다.
도 8은 부피 생산성에의 온도의 강한 영향 및 pH의 약한 영향을 보여주는 3 차원 도시인 표면 플롯을 보여준다.
도 9는 모델화된 상관을 삼차원적으로 보여주는 표면 플롯을 도시한다; 이는 2차 방정식적 관계를 나타내고 36.5 ℃에서 성장속도의 최대를 분명하게 보여준다.
도 10은 비생산성에 관한 자료의 분석을 제공한다. 부피 생산성에 대해 보여진 것과 유사한 비생산성과 온도 및 pH의 상관이 있다.
도 11은 온도를 37 ℃에서 35.1 ℃로 낮춤으로써, 부피 생산성을 대략 200 kU/L/일에서 540 kU/L/일까지 증가시킬 수 있음을 보여준다.
도 12는 r푸린에 대한 SDS-PAGE 및 은 염색을 보여준다. 회전 ORFU06002 및 ORFU07002의 캡토(Capto)-MMC 용출액의 밴드 무늬는 높은 정도로 상관된다; 모든 샘플들은 대략 60 kDa에서 현저한 푸린 밴드를 보여준다. 배치 MMC01 내지 MMC08로부터의 회전 ORFU06002 샘플에서 약간 더 낮은 푸린 밴드 분자량의 경향을 볼 수 있다(도 12, 1-8 레인)
도 13은 단일클론 안티-푸린 항체를 사용한 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 14는 회전 ORFU06002의 r푸린 샘플의 등전 집속(IEF) 및 연이은 웨스턴 블롯으로부터의 r푸린에 대한 특이적인 밴드 무늬를 도시한다.
도 15는 회전 ORFU07002의 r푸린 샘플의 등전 집속(IEF) 및 연이은 웨스턴 블롯으로부터의 r푸린에 대한 특이적인 밴드 무늬를 도시한다.
도 16는 회전 ORFU07002의 r푸린 샘플의 등전 집속(IEF) 및 연이은 웨스턴 블롯으로부터의 r푸린에 대한 웨스턴 블롯의 결과를 도시한다.
도 17은 회전 ORFU06002로부터의 샘플(캡토-MMC 용출액)에 대한 푸린 역상 HPLC를 도시한다. r푸린의 지문 패턴을 얻기 위해 C4 RP-HPLC로 샘플을 시험했다.
도 18은 회전 ORFU07002로부터의 샘플(캡토-MMC 용출액)에 대한 푸린 역상 HPLC를 도시한다. r푸린의 지문 패턴을 얻기 위해 C4 RP-HPLC로 샘플을 시험했다.

본 발명은 혈청-부재 배지에서 성장 및 세포 배양 상청액 내로 활성 재조합 푸린(r푸린)의 분비가 가능한 재조합 숙주 세포주의 개발 및 생산에 관한 것이다. 재조합 푸린을 암호화하는 플라스미드의 형질감염을 위해 선택되는 숙주 세포주는 일 태양에서 재조합 인자 VIII 및 재조합 VWF의 발현에 사용되는 것과 동일하다. 결과로 얻은 r푸린은 그 후 실질적으로 동물 단백질이 부재하도록 정제된다.

PACE, PACE4, PC1/PC3, PC2, PC4 및 PC5/PC6으로도 알려져 있는 푸린은 서브틸리신형 세린 프로테아제의 군에 속하며, 이는 프로단백질의 절단에서, 특히 분비성 합성에서 중요한 역할을 한다(문헌 [Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen. 4:115-136, 1993]). 프로-단백질은 골지체 내의 내생 프로테아제에 의해 번역후, 새포 내부적으로 그들의 성숙 형태로 가공된다. 프로테아제 절단 부위는 아미노산 서열 Arg-X-Lys/Arg-Arg로 특징되는 인지 서열을 포함한다. 프로테아제 푸린은 이 공통 서열 이후에 프로단백질을 특이적으로 절단한다(문헌 [Hosaka et al., J. Biol. Chem. 266:12127-12130, 1991]).

인간 및 쥐과 푸린의 DNA 및 아미노산 서열과 서브틸리신형 프로테아제 기능을 갖는 추가의 단백질이 동정되었다(문헌 [Roebroek et al., MoI. Biol. Rep. 11 : 117-125, 1986]; 문헌 [Roebroek et al., EMBO J. 5:2197-2202, 1986]; 문헌 [Barr et al., DNA Cell Biol. 10:319-328, 1991]; 문헌 [Van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 17:7101-7102, 1989]; 문헌 [Van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18:664, 1990]; 문헌 [Smeekens et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2997-3000]; 문헌 [Smeekens et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA. 88; 340-344, 1991]; 문헌 [Kiefer et al., DNA Cell Biol. 10: 757, 1991]; 문헌 [Nakayama et al., J. Biol. Chem. 267:5897-5900, 1992]; 및 문헌 [Hatsuzawa et al., J. Biol. Chem. 265: 22075-22078, 1990]). 인간 푸린 유전자는 794 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고, 특정한 기능이 개별적인 특징적 영역에 할당될 수 있다: 촉매 중심, 가운데 구역, 시스틴-풍부 영역, 막통과 구역 및 세포질 구역(문헌 [Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen. 4:115-136, 1993]). 일 태양에서, 인간 푸린 폴리펩티드가 유전자 뱅크 기탁 번호: EAX02111(미국 국립 의학 도서관, 국립 생물기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD))로 제시된다. 그러나, 당업자는 푸린 생물학적 활성, 즉 프로-단백질을 절단할 수 있는 (예컨대, 프로-VWF를 절단해 성숙 VWF를 생산하는) 능력을 갖는 임의의 단백질을 여기에 기술된 방법으로 생산할 수 있음을 이해할 것이다.

무상 푸린은 그것이 기능적으로 활성인 골지체의 멤브레인 시스템 내로 도입된다(문헌 [Bresnahan et al., J. Cell Biol. 111 :2851- 2859, 1990]). 과-발현된 75-80 kD의 원 푸린의 절단된 형태는 분비된 단백질로 세포 상청액 내에서 검출될 수 있다(문헌 [Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9378-9382, 1990]). 이 자연 분비된 푸린은 "탈피 푸린(shed furin)"(문헌 [Vidricaire et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 195:1011-1018, 1993])으로도 알려져 있으며 막통과 부분의 N-말단이 절단된다(문헌 [Vey et al, J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42]).

막통과 및 세포질 구역의 암호화 부분이 삭제된, 유전자 공학에 의해 잘려진 푸린 역시 상응하게 발현 및 분비될 수 있다. 이와 같은 N-말단 삭제는 아미노산 714-794에 대해(문헌 [Leduc et al., J. Biol. Chem. 267:14304-14308, 1992], 문헌 [Molloy et al., J. Biol. Chem. 267:16396-16402, 1992]); 아미노산 716-794("SoI-PACE")에 대해(문헌 [Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993]; 및 문헌 [Rehemtulla et al., Blood 79:2349-2355, 1992]); 및 아미노산 705-794에 대해(문헌 [Hatsuzawa et al., J. Biol. Chem. 267:16094-16099, 1992]) 기술되었다. 추가적으로 시스틴-풍부 영역의 결손을 포함하는 푸린 돌연변이도 기술되었다(문헌 [Hatsuzawa et al., J. Biochem. 101 :296-301 , 1992]; 문헌 [Creemers et al., J. Biol. Chem. 268:21826-21834, 1993]).

푸린의 내단백분해 활성 및 그것의 염기성 아미노산에 대한 선택성은 우선 프로-폰 빌레브란트 인자(프로-vWF)로의 실험에서 측정된다. 프로-vWF는 741 개의 아미노산을 가진 프로폴리펩티드 및 2050 개의 아미노산을 가진 성숙 폰 빌레브란트 인자(vWF)로 구성된다(문헌 [Verweij et al., EMBO J. 5:1839-1847, 1986]). 프로-vWF로부터의 성숙 vWF의 유리는 Arg763 후의 단백분해성 절단에 기인한다. 진핵 발현 벡터에서 프로-vWF cDNA의 형질감염은 세포 배양 상청액 내에서 등몰량의 360 kD 프로-vWF 및 260 kD 성숙 vWF의 생산을 불러온다. vWF는 내생으로 나타나는 푸린에 의해 형질감염된 세포 내에서 그것의 성숙 형태로 가공될 수 있다(문헌 [Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9378-9382, 1990], 문헌 [Van de Ven et al., MoI. Biol. Rep. 14:265- 275, 1990]).

각각 푸린에 의해 또는 서브틸리신형 효소에 의해 절단되는 추가적인 프로-단백질 중, 일련의 호르몬 및 성장 인자(예컨대, 프로액티빈 A, 간 세포 성장인자), 혈장 단백질(알부민, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X), 수용체(인슐린 프로-수용체), 바이러스성 단백질(예컨대, HIV-1 gp160, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌)과 박테리아 단백질(디프테리아 독소, 안트락스 독소)이 있다(문헌 [Decroly et al., J. Biol. Chem. 269:12240-12247, 1994]; 문헌 [Stieneke-Grober et al., EMBO J. 11 :2407-2414, 1992]; 문헌 [Barr, Cell 66:1-3, 1991], 문헌 [Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993]; 문헌 [Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10277-10281 , 1992]; 문헌 [Tsuneoka et al., J. Biol. Chem. 268:26461-26465, 1993]; 문헌 [Bresnahan et al., J. Cell. Biol. 111 :2851-2859, 1990]; 문헌 [Hosaka et al., J. Biol. Chem. 266:12127-12130, 1991 ]; 및 문헌 [Vey et al., J. Cell. Biol. 127:1829-1842, 1994]). 본 발명의 r푸린은 이들 프로-단백질의 절단에의 사용도 고려된다.

진핵 세포 배양 내에서 무상 푸린 및 프로-단백질을 암호화하는 핵산 서열의 공-발현을 통해, 생체 내에서 프로-단백질의 증가된 가공이 달성되었다. 이는 예컨대, 프로-인자 IX에 대해(문헌 [Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993]) 및 프로-vWF에 대해(WO 91/06314; 문헌 [Van de Ven et al., MoI. Bio. Rep. 14:265-275, 1990]; 및 문헌 [Rehemtulla et al., Blood 79:2349-2355, 1992]) 증명되었다. 본 발명은 본 발명의 r푸린이 그것이 절단하는 임의의 프로-단백질의 시험관 내 및 생체 내 가공 둘 다에 유용한 것으로 생각된다.

무상 푸린과 프로-단백질의 공-발현 외에, 절단된 푸린은 프로-단백질과 함께 발현되었다. 푸린 삭제 돌연변이체는 생체 내에서 공-발현되고 그대로 분비될 때 효소적으로 활성이라고 증명되었다; 이와 같은 삭제 돌연변이체의 효소적 활성은 특히 프로-인자 IX(문헌 [Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993]) 및 프로-vWF(문헌 [Rehemtulla et al., Blood 79: 2349-2355, 1992])의 가공에서 검출될 수 있다. 푸린 삭제 돌연변이체로의 공-발현 실험은 단백질의 막통과 및 세포질 부분이 촉매 기능에 필수적이지 않음을 보여주었다(문헌 [Rehemtulla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8235-8239, 1992]).

WO 91/06314는 원핵 및 진핵 세포 내에서 푸린의 재조합 발현, 푸린 융합 단백질의 제조, 삭제 돌연변이체 및 단편, 재조합적으로 제조된 푸린의 정제 및 시험관 내 프로단백질 가공에의 정제된 푸린의 잠재적인 용도를 전반적으로 개시한다. WO 92/09698는 PACE(푸린)의 발현, 예컨대 프로-vWF와 같은 단백질의 비활성 전구체와의 공-발현과 융합 단백질의 제조를 기술한다. 문헌 [Stieneke-Grober et al., EMBO J. 11 :2407-2414, 1992]은 정제된 푸린에 의한 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 시험관 내 절단을 기술한다. 문헌 [Decroly et al., J. Biol. Chem. 269:12240-12247, 1994]은 푸린에 의한 HIV gp160의 시험관 내 절단을 기술한다.

C-말단 단축된 푸린으로의 실험에서, 프로-알부민 및 보체 프로-C3(문헌 [Oda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189:1353-1361 , 1992]), 안트락스 독소(문헌 [Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10277-10281 , 1992]), 디프테리아 독소(문헌 [Tsuneoka et al., J. Biol. Chem. 268: 26461- 26465, 1993]) 및 프로-인자 IX(문헌 [Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8468, 1993], 문헌 [Bristol et al., Biochemistry 33:14136-14143, 1994])의 절단이 시험관 내에서 성공적으로 수행되었다.

따라서 본 발명의 r푸린은 상기한 바와 같은 프로-단백질의 생체 내 및 시험관 내 가공에서의 사용이 고려된다. 일 태양에서, 본 발명의 r푸린은 프로-VWF 및 프로-인자 IX의 시험관 내 가공에 특히 유용하다. 그러나, 그것의 사용이 상기 단백질의 가공에 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 추가의 태양에서, 본 발명의 r푸린은 재조합 프로-단백질의 생체 내 가공에 특히 유용하다.

본 발명의 추가의 태양은 프로-vWF 및 r푸린을 발현하는 세포들의 공-배양이다. 따라서, 세포 배양 상청액 내의 프로-vWF는 세포 배양 상청액 내에도 존재하는 r푸린에 의해 그것의 활성 형태로 시험관 내에서 절단된다. 이어서 가공된 vWF는 여기에 참조로 도입된 미국 특허 제6,210,929호에 논의된 바와 같이 배양으로부터 단리되고 정제된다. 공-배양을 위해, 모든 통상적인 발현 시스템이 사용될 수 있고, 프로-vWF 및 r푸린을 발현하기 위한 다양한 시스템이 서로 합쳐질 수 있다. 일 태양에서, 프로-vWF 및 r푸린이 동일 기원의 숙주 세포에서 발현되는 발현 시스템이 사용된다.

용어 "숙주 세포"는 형질전환된 또는 핵산 서열로 형질전환되고 그 후 관심 대상의 선택된 유전자를 발현할 수 있는 세포를 지칭하도록 사용된다. 용어는 자손이 원래의 부모와 형태적으로 또는 유전적 구성에서 동일한지 여부와 관계없이, 선택된 유전자가 존재하는 한, 모세포의 자손을 포함한다.

본 발명은 재조합 단백질 생산을 위한 해당 분야에 공지된 임의의 숙주 세포 또는 숙주를 포함한다. 따라서, 본 발명의 세포는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일 태양에서, 본 발명은 진핵 및 원핵 숙주 세포를 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 식물 세포, 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포를 포함한다. 일 태양에서, 예시적인 효모 세포는 피치아(Pichia), 예컨대 피. 패스토리스(P. pastoris) 및 사카로마이세스(Saccharomyces), 예컨대 에스. 세레비시아(S. cerevisiae)와 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 케이. 작티스(K. Zactis), 케이. 프래질리스(K. fragilis), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus), 케이. 위커라미(K. wickeramii), 케이. 왈티(K. waltii), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum), 케이. 터노톨레란스(K. thernotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 케이. 야로위아(K. yarrowia); 트리초더마 리시아(Trichoderma reesia), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 슈와니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 토티포클라디움(Totypocladium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 에이. 니둘란스(A. nidulans), 에이. 나이거(A. niger), 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida), 클로엑케라(Kloeckera), 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)를 포함한다. 예시적인 곤충 세포는 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) 및 스포돕테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda) 및 드로소필라(Drosophila)를 포함한다.

추가의 태양에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이며, 1차 상피 세포(예컨대, 케라티노사이트, 경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 형성된 세포주 및 그들의 균주(예컨대, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, 장(Chang) 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK₂ 세포, 클론(Clone) M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK₁ 세포, PK(15) 세포, GH₁ 세포, GH₃ 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C₁ 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포 및 TH-I, B1 세포, 또는 그들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관(심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프양 조직(림프 샘, 아데노이드, 편도, 골수 및 혈액), 비장을 포함하나 여기에 제한되지 않음)으로부터의 섬유모세포 및 섬유모세포 및 섬유모세포형 세포주(예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, 돈(Don) 세포, GHK-21 세포, 시트룰리네미아(citrullinemia) 세포, 뎀지(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 베로(Vero) 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C.아.3H/IOTI/2 세포, HSDM₁C₃ 세포, KLN205 세포, 멕코이(McCoy) 세포, 생쥐 (Mouse) L 세포, 균주 2071(생쥐 L) 세포, L-M 균주(생쥐 L) 세포, L-MTK(생쥐 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스(Swiss)/3T3 세포, 인디안 문트잭(Indian muntjac) 세포, SIRC 세포, C.아.ll 세포 및 젠슨(Jensen) 세포 또는 그들의 유도체)를 포함한다.

예시적인 포유동물 세포는 다양한 CHO, BHK, HEK-293, NSO, YB2/3, SP2/0 및 PER-C6 또는 HT1080와 같은 인간 세포와 VERO, HeLa, COS, MDCK, NIH3T3, 져캐트(Jurkat), 사오스(Saos), PC-12, HCT 116, L929, Ltk-, WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT, 백혈병 세포, 배아 줄기 세포 또는 수정된 난소 세포를 포함한다. 본 발명의 일 태양에서, 예시적인 숙주 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 추가의 태양에서, CHO 세포를 현탁액에서 배양하기 위해 배지가 사용된다.

임의로 발현 벡터의 일부로서, 바람직한 단백질을 암호화하는 외인성 핵산의 삽입, 외인성 발현 조절 서열을 그것이 바람직한 단백질을 암호화하는 숙주 세포 내생 유전자의 증가된 발현을 야기하도록 삽입 또는 바람직한 단백질을 암호화하는 내생 유전자의 발현을 증가시키기 위해 숙주 세포의 내생 발현 조절 서열(들)을 활성화하는 것을 포함하나 여기에 제한되지 않는 해당 분야에 공지된 다양한 방법으로 숙주 세포를 단백질을 발현하도록 조작할 수 있다.

숙주 세포의 배양은 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이와 같은 숙주 세포를 기르고 세포에 의해 생산된 재조합 단백질을 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 이와 같은 배양 방법은 배양 배지에 단백질 생산의 화학적 유도자의 첨가를 수반할 수 있다. 예시적인 숙주 세포 및 과정을 아래에 기술한다.

표준 분자 생물학 기술을 사용해 푸린 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터 내로 삽입한다. 일 태양에서, 핵산은 유전자 뱅크 기탁 번호: EAX02111(미국 국립 의학 도서관, 국립 생물기술 정보 센터)로 제시된 바와 같은 인간 푸린 폴리펩티드를 암호화하나, 당업자는 푸린 생물학적 활성, 즉 프로-VWF를 절단해 성숙 VWF를 생산하는 능력을 갖는 임의의 단백질을 여기에 기술된 방법으로 생산할 수 있음을 이해할 것이다. 추가의 태양에서, 시스틴-풍부, 막통과 및 세포질 구역을 포함하는 아미노산 578 내지 794를 암호화하는 뉴클레오티드를 삭제함으로써 C-말단 절단된, 완전히 분비된 r푸린을 설계했다. 또 추가의 태양에서, 정제 공정을 돕기 위해 아미노산 꼬리가 첨가될 수 있다. 또 다른 태양에서, 유연한 연결자로 기능하는 개제된 4 개의 글리신 잔기와 함께 또는 그들 없이, 10 개의 히스티딘 잔기의 꼬리가 아미노산 577 이후에 첨가되었다.

발현 벡터는 임의로 촉진자, 1 이상의 증강인자 서열, 복제 기원, 전사 종결 서열, 도너 및 억셉터 스플라이스 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비의 리더(leader) 또는 신호 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되어야 하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리연결자 영역 및/또는 선택성 마커 요소를 포함할 수 있다. 이들 서열 각각을 아래에 논의한다.

임의로, 벡터는 "표지"-암호화 서열, 즉 푸린 폴리펩티드 암호 지정 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 올리고뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다; 올리고뉴클레오티드 분자는 상업적으로 입수가능한 항체가 존재하는 폴리히스티딘(예컨대 헥사히스티딘) 또는 다른 "표지" 예컨대, FLAG, HA(헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스) 또는 myc를 암호화한다. 이 표지는 통상적으로 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드에 융합되고 숙주 세포로부터 푸린 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제의 수단으로 작용할 수 있다.

적절한 벡터는 비제한적으로 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나 벡터 시스템이 선택된 숙주 세포와 양립할 수 있어야 함이 이해될 것이다. 일 태양에서, 벡터는 플라스미드이다. 추가의 태양에서, 플라스미드는 pUC계 클로닝 벡터이다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 탐침 생성 벡터, 서열화 벡터 및 레트로바이러스성 벡터를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 벡터는 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 파지미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스성 발현 벡터(예컨대, 베큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염된 또는 박테리아성 발현 벡터(예컨대, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 심지어는 동물 세포 시스템을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.

포유동물 발현 벡터는 통상적으로 복제 기원, 적절한 촉진자 및 또한 임의의 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랭킹(flanking) 비전사 서열을 포함한다. SV40 바이러스성 게놈, 예컨대 SV40 기원, 초기 촉진자, 증강인자, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 필요한 발현 조절 요소를 제공하는데 사용할 수 있다. 예시적인 진핵 벡터는 pcDNA3, pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG(스트라타진(Stratagene)) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL 및 pVITRO3를 포함한다.

해당 분야에 공지된 임의의 수단으로, 예컨대 리포솜-매개된 전달, 수용체-매개된 전달(리간드-DNA 복합물), 전기천공, DNA의 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 염화칼슘, 인산 칼슘 침전, 미세입자 충격, 바이러스성 벡터로의 감염, 리포펙션, 형질감염 또는 상동 재조합을 통해 핵산을 숙주 세포 내로 전달할 수 있다.

여기서 사용된 용어 "형질전환된" 또는 "형질감염된"은 외인성 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 변형된 숙주 세포를 지칭하며, 이는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되거나 또는 에피솜 요소로 유지될 수 있다. 제공된 방법의 특정한 태양에서, 숙주 세포가 "형질감염 단계"에서 형질감염됨이 고려된다. 방법은 다수의 형질감염 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 예컨대 기술적으로 "형질전환"이 아닌 전기천공 및 세포 융합을 포함한 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 해당 분야에 공지된 다른 방법은 본 명세서의 목적에서 용어 "형질전환"의 정의 내이다.

본 발명은 또한 r푸린 단백질 발현을 야기하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양, 즉 기르는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 r푸린을 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함한다. 예시적인 태양에서, 숙주 세포는 화학적으로 정의된, 혈청-부재 배지 내에서 길러진다. 혈청이 생화학적으로 정의되지 않은 물질이고, 완전히 확인되지 않은, 롯트마다 다른 많은 성분들을 함유하며, 종종 미생물, 예컨대 바이러스 및 미코플라즈마로 오염되기 때문에, r푸린의 재조합 생산에서 혈청의 존재는 바람직하지 않다. 또한, 배양 배지 내 혈청 중 동물 단백질의 존재는 긴 정제 공정을 요구할 수 있다.

따라서 본 발명은 인간 푸린 유전자로 재조합적으로 형질감염된 세포를 배양하기 위한 실질적으로 동물 단백질이 없는 생화학적으로 정의된 배양 배지를 제공한다. 배지의 성분은 대부분 무기, 합성 또는 재조합이며 그대로는 임의의 동물 공급원에서 직접 얻어지지 않는다.

본 발명의 세포 배양 배지는 1 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고 금속 결합 화합물일 수 있는 대체 화합물 1 이상을 포함할 수 있으며/있거나 1 이상의 대체 화합물을 포함하는 1 이상의 복합물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 배지는 1 이상의 복합물을 포함할 수 있고, 상기 복합물은 금속-결합 화합물일 수 있는 1 이상의 대체 화합물과 복합된 1 이상의 전이 원소 또는 그의 염 또는 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 배지는 시험관 내에서 세포의 배양을 지탱할 수 있고 그 안에 배양된 세포의 형질감염을 허용한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 전이 원소는 바람직하게 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 니오브, 몰리브덴, 테크네튬, 루비듐, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 란타늄, 하프늄, 탄탈, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은 및 악티늄 또는 그의 염 또는 이온으로 구성된 군에서 선택되며 바람직하게는 철염이다. 적절한 철염은 FeCl₃, Fe(NO₃)₃ 또는 FeSO₄ 또는 Fe⁺⁺⁺ 또는 Fe⁺⁺ 이온을 함유하는 다른 화합물을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.

배지 내의 금속 결합 화합물은 전이 원소와 상호작용 또는 결합하고 세포에 의한 그들의 흡수를 용이하게 할 수 있는 임의의 거대 분자를 포함한다. 이와 같은 상호작용/결합은 성질이 공유 또는 비공유일 수 있다. 본 발명의 이 태양에 사용되는 금속-결합 화합물은 바람직하게는 폴리올, 히드록시피리딘 유도체, 1,3,5-N,N',N"-트리스(2,3-디히드록시벤조일)아미노-메틸벤젠, 에틸렌디아민-N,N'- 테트라메틸렌포스폰산, 트리숙신, 산성 사카라이드(예컨대, 글루콘산 제일철), 글리코사미노글리칸, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 니코틴산-N-옥시드, 2-히드록시-니코틴산, 모노-, 비스- 또는 트리스-치환된 2,2'-비피리딘, 히드록사메이트 유도체(예컨대, 아세토히드록삼산), 아미노산 유도체, 데페록사민, 페리옥사민, 철 염기성 포르핀 및 그 유도체, DOTA-리신, 텍사피린, 사피린, 폴리아미노카르복실산, 알파-히드록시카르복실산, 폴리에틸렌카르바메이트, 에틸 말톨, 3-히드록시-2-피리딘 및 IRC011로 구성된 군에서 선택된다. 일 태양에서, 금속-결합 화합물은 폴리올, 예컨대 소르비톨 또는 덱스트란 및 구체적으로 소르비톨이다. 관련된 태양에서, 금속-결합 화합물은 히드록시피리딘 유도체, 예컨대 2-히드록시피리딘-N-옥시드, 3-히드록시-4-피론, 3-히드록시피리드-2-온, 3-히드록시피리드-2-온, 3-히드록시피리드-4-온, 1-히드록시피리드-2-온, 1,2-디메틸-3-히드록시피리드-4-온, 1-메틸-3-히드록시피리드-2-온, 3-히드록시-2(1H)-피리디논, 에틸 말톨 또는 피리독살 이소니코티닐 히드라존이다. 본 발명의 금속 결합 화합물은 또한 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺와 같은 2가 양이온에도 결합할 수 있다.

본 발명의 배양 배지는 아데닌, 에탄올아민, D-글루코스, 헤파린, 완충화제, 히드로코르티손, 인슐린, 리놀레산, 리포산, 페놀 레드, 포스포에탄올아민, 퓨트레신, 소듐 피루베이트, 트리-요오도티로닌, 티미딘, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, N-아세틸-시스테인, 바이오틴, 염화콜린, D-Ca⁺⁺-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B₁₂, 플루로닉(Pluronic) F68, 재조합 인슐린, 칼슘염, CuSO₄, FeSO₄, FeCl₃, Fe(NO₃)₃, KCl, 마그네슘 염, 망간염, 아세트산 나트륨, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, Na₂SO₄, 셀레늄염, 규소염, 몰리브덴염, 바나듐염, 니켈염, 주석염, ZnCl₂, ZnSO₄ 또는 다른 아연염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상의 성분을 포함할 수 있고, 여기서 각 성분은 시험관 내 세포 배양을 지탱하는 양으로 첨가된다.

또 다른 태양에서, 본 발명의 배양 배지는 임의로 추가로 1 이상의 사이토킨, 대두 펩톤, 1 이상의 효모 펩티드 및 1 이상의 식물 펩티드(가장 바람직하게는 쌀, 알로에 베라, 대두, 옥수수, 밀, 콩, 호박, 시금치, 당근, 감자, 고구마, 타피오카, 아보카도, 보리, 코코넛 및/또는 콩깍지 중 1 이상 및/또는 1 이상의 다른 식물)로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 보충물을 포함할 수 있다, 예컨대 WO 98/15614로 공개된 국제 출원 제PCT/US97/18255호 참고.

본 발명의 배양 배지는 또한 최적의 pH를 유지하기 위해 1 이상의 완충화제를 임의로 포함할 수 있다. 적절한 완충화제는 N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄술폰산](HEPES), MOPS, MES, 인산염, 중탄산염 및 세포 배양 분야에 사용하기에 적절한 다른 완충화제를 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 적절한 완충화제는 배양되는 세포에 대한 실질적인 세포독성 없이 완충 용량을 제공하는 것이다. 적절한 완충화제의 선택은 세포 배양 분야의 보통의 기술 범위 내이다.

상기한 배지 성분은 용액 내에서 함께 혼합될 시 본 발명의 완전 배양 배지를 형성한다. 완전 배지는 여기에 더 상세히 기술되는 바와 같이 다양한 포유동물 세포의 배양에 사용하기에 적절하다. 여기서 얻은 정보 및 당업자가 가진 지식에 기초해, 당업자는 과도한 실험 없이 작동가능한 배지 제제를 얻을 수 있다.

최초에 및 화학적으로 정의된 혈청-부재 배지 내에서의 성장에 적응 전에, 숙주 세포는 당업자에게 주지된 표준 배지 내에서 길러질 수 있다. 배지는 통상적으로 세포의 성장 및 생존에 필수적인 모든 영양분을 함유할 것이다. 진핵 세포를 배양하는데 적절한 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 배지 1640(RPMI 1640), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM) 및/또는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), DMEM/F12 및 ExCell 325 배지이고, 이들 모두는 배양되는 특정한 세포주로 나타낸 바와 같은 혈청 및/또는 성장 인자로 보충될 수 있다. 그러나, 특히 본 발명은 배지 내의 혈청이 그 후 배양으로부터 제거되어 혈청-부재 배지 또는 내에서 자랄 수 있는 숙주 세포를 얻는 것을 제공한다. 따라서, 본 발명은 r푸린의 최대 생산을 위해 혈청-부재 조건 하에서 숙주 세포를 배양하기 위한 최적의 배지를 제공한다. 추가의 태양에서, 세포는 현탁액 배양으로 혈청-부재 배지 내에서 자란다. 본 발명의 다양한 배지에 대한 조성을 여기의 실시예에 제공한다.

일 실시예에서, 형질전환된 세포의 선택적인 성장에 유용한 항생제 또는 다른 화합물이 배지에 보충제로 첨가된다. 사용될 화합물은 숙주 세포를 형질전환시킨 플라스미드 위에 존재하는 선택가능한 마커 요소에 의해 규정될 것이다. 보통 동물 세포에 독성인 특정한 약물에 대한 내성을 부과하는 선택가능한 마커를 본 발명의 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 예컨대, 선택가능한 마커 요소가 카나마이신 내성인 경우, 배양 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신일 것이다. 선택적인 성장을 위한 다른 화합물은 암피실린, 티트라시클린, 제네티신, 네오마이신, 제오마이신(zeo); 푸로마이신(PAC); 블라스티시딘 S(BlaS) 및 GPT를 포함한다. 추가적인 선택가능한 마커는 해당 분야에 공지되어 있고 본 발명의 조성물 및 방법에 유용하다.

규정된 조건 하에서 세포 생존을 부과하거나 세포 죽음을 유도하는 대사 효소 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 예는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR); 단순성 포진 바이러스 티미딘 키나아제(TK), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소(HGPRT) 및 아데닌 포스포리보실전이효소(APRT)를 포함하나 여기에 제한되지 않으며, 이들은 각각 TK, HGPRT 또는 APRT가 결여된 세포에 사용될 수 있는 유전자이다. 그러나 당업자는 본 발명의 r푸린 생산물이 본질적으로 이들 첨가된 단백이 없을 것임을 알 것이다.

배지는 재조합 단백질 생산을 위해 해당 분야에 공지된 임의의 숙주 세포 또는 숙주를 배양하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 태양에서, 예시적인 숙주 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 추가의 태양에서, 배지는 CHO 세포를 현탁액에서 배양하는데 사용된다.

관심 대상인 재조합 단백질이 숙주 세포에 의해 배지 내로 분비될 시, 동일한 숙주 세포를 몇몇 수확 주기 동안 사용할 수 있도록 배지를 정기적으로 수확할 수 있다. 예컨대, 배양 배지가 단일 배치 내의 세포에 한 번 첨가되는 회분식 공정으로 또는 배양 배지의 작은 배치들이 정기적으로 첨가되는 유가식 공정으로 배양 배지를 첨가할 수 있다. 배지는 배양의 마지막에 또는 배양 중 몇 번 수확할 수 있다. 연속적으로 관류되는 생산 공정 또한 해당 분야에 공지되어 있고 새로운 배지를 배양 내로 연속적으로 공급하는 동안 동일한 부피를 반응기로부터 연속적으로 빼내는 것을 수반한다. 관류되는 배양은 일반적으로 회분식 배양보다 더 높은 세포 밀도를 달성하며 반복적으로 수확되며 수주 또는 수개월 동안 유지될 수 있다. 따라서, 케모스텟 배양 및 회분식 재공급 배양은 해당 분야에 공지된 다른 배양 방법이 그런 것처럼 둘 다 r푸린의 제조에 적절하다.

T-플라스크, 스피너 및 진탕 플라스크, 롤러 병 및 교반-탱크 생반응기를 포함한 다양한 배양 시스템이 해당 분야에 공지되어 있다. 롤러 병 재배는 일반적으로 배지로 부분적으로 충전(예컨대 용량의 10-30 %로)되고 천천히 회전되는 롤러 병 내로 세포를 시딩하고 세포가 병의 측면에 부착되고 집단으로 자라도록 함으로써 수행된다. 상청액을 경사분리함으로써 세포 배지를 수확하며, 이는 새로운 배지로 대체한다. 부착-의존성 세포 역시 교반-탱크 생반응기 내의 현탁액 내에 유지되는 미세담체, 예컨대 중합체 구 상에서 재배할 수 있다. 대안으로서, 세포를 단일-세포 현탁액 내에서 기를 수 있다.

해당 분야에 공지된 표준 방법을 사용해 숙주 세포에 의해 생산된 r푸린의 양을 평가할 수 있다. 이와 같은 방법은 제한 없이 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비-변성 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분리, 면역침전, 엘리사(ELISA) 및/또는 DNA 결합 겔 이동 분석과 같은 활성 분석을 포함한다. 본 발명은 또한 r푸린의 비생산성(단백질의 양/세포/일로 표현됨)이 해당 분야에 공지된 바와 같은 및 여기에 기술된 바와 같은 표준 방법을 사용해 평가될 수 있음을 고려한다.

"실질적으로 동물 단백질 부재인 r푸린"은 약 0.1 내지 0.6 ng 단백질 이하/푸린 활성 단위 또는 약 2 내지 11 μg 단백질 이하/mL 범위인 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하고 배양 배지 내에 혈청으로부터의 오염 단백질이 본질적으로 없는 r푸린의 제제를 포함하도록 정의된다. 일 태양에서, 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린은 약 0 내지 0.4 pg DNA 이하/푸린 활성 단위 또는 약 0 내지 24 ng DNA 이하/mL 범위의 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하고 배양 배지 내에 혈청으로부터의 오염 단백질을 본질적으로 갖지 않는 r푸린의 제제를 포함한다. 일 실시예에서, r푸린을 발현하는 숙주 세포는 화학적으로-정의된, 혈청-부재 배지 내에서 자란다. 대안으로서, 세포는 혈청을 갖는 배지 내에서 자라고 여기에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있다.

r푸린을 발현하는 숙주 세포는 케모스텟 조건 하에서 동물(인간 포함) 유래된 물질 부재인 배지 내에서 현탁액으로 배양된다. 여과에 의해 세포를 제거하고 한외여과에 의해 r푸린 함유 세포 배양 상청액을 농축하며 이온 교환 크로마토그래피로 정제해 약 1000 단위/ml 이상, 약 2000 단위/ml 이상, 약 3000 단위/ml 이상, 약 4000 단위/ml 이상, 약 5000 단위/ml 이상, 약 6000 단위/ml 이상, 약 7000 단위/ml 이상, 약 8000 단위/ml 이상, 약 9000 단위/ml 이상, 약 10000 단위/ml 이상, 약 15000 단위/ml 이상, 약 20000 단위/ml 이상, 약 25000 단위/ml 이상, 약 30000 단위/ml 이상, 약 35000 단위/ml 이상, 약 40000 단위/ml 이상, 약 45000 단위/ml 이상, 약 50000 단위/ml 이상, 약 55000 단위/ml 이상, 약 60000 단위/ml 이상, 약 65000 단위/ml 이상, 약 70000 단위/ml 이상, 약 75000 단위/ml 이상, 약 80000 단위/ml 이상, 약 85000 단위/ml 이상, 약 90000 단위/ml 이상, 약 95000 단위/ml 이상, 약 100000 단위/ml 이상, 약 120000 단위/ml 이상, 약 140000 단위/ml 이상, 약 160000 단위/ml 이상, 약 180000 단위/ml 이상, 약 200000 단위/ml 이상, 및 약 500000 단위/ml 이상 및 최대 500000 U/ml 초과의 활성을 갖는 r푸린 용액을 생성한다.

본 발명의 재조합 푸린의 정제된 용액의 또 다른 태양은 약 10 U/μg 단백질 이상, 약 20 U/μg 단백질 이상, 약 30 U/μg 단백질 이상, 약 40 U/μg 단백질 이상, 약 50 U/μg 단백질 이상, 약 60 U/μg 단백질 이상, 약 70 U/μg 단백질 이상, 약 80 U/μg 단백질 이상, 약 90 U/μg 단백질 이상, 약 100 U/μg 단백질 이상, 약 120 U/μg 단백질 이상, 약 140 U/μg 단백질 이상, 약 160 U/μg 단백질 이상, 약 180 U/μg 단백질 이상, 약 200 U/μg 단백질 이상, 약 250 U/μg 단백질 이상, 약 300 U/μg 단백질 이상, 약 350 U/μg 단백질 이상, 약 400 U/μg 단백질 이상, 약 450 U/μg 단백질 이상, 약 500 U/μg 단백질 이상, 약 550 U/μg 단백질 이상, 약 600 U/μg 단백질 이상, 약 650 U/μg 단백질 이상, 약 700 U/μg 단백질 이상, 약 750 U/μg 단백질 이상, 약 800 U/μg 단백질 이상, 약 850 U/μg 단백질 이상, 약 900 U/μg 단백질 이상, 약 950 U/μg 단백질 이상 및 약 1000 U/μg 단백질 이상의 비활성(specific activity)을 갖는다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 r푸린의 정제된 용액은 약 20.0 μg/ml 미만, 약 19.0 μg/ml 미만, 약 18.0 μg/ml 미만, 약 17.0 μg/ml 미만, 약 16.0 μg/ml 미만, 약 15.0 μg/ml 미만, 약 14.0 μg/ml 미만, 약 13.0 μg/ml 미만, 약 12.0 μg/ml 미만, 약 11.0 μg/ml 미만, 약 10.5 μg/ml 미만, 약 10.0 μg/ml 미만, 약 9.5 μg/ml 미만, 약 9.0 μg/ml 미만, 약 8.5 μg/ml 미만, 약 8.0 μg/ml 미만, 약 7.5 μg/ml 미만, 약 7.0 μg/ml 미만, 약 6.5 μg/ml 미만, 약 6.0 μg/ml 미만, 약 5.5 μg/ml 미만, 약 5.0 μg/ml 미만, 약 4.5 μg/ml 미만, 약 4.0 μg/ml 미만, 약 4.0 μg/ml 미만, 약 3.5 μg/ml 미만, 약 3.0 μg/ml 미만, 약 2.5 μg/ml 미만, 약 2.0 μg/ml 미만, 약 1.5 μg/ml 미만, 약 1.0 μg/ml 미만, 약 0.5 μg/ml 미만, 약 0.4 μg/ml 미만, 약 0.3 μg/ml 미만, 약 0.2 μg/ml 미만, 약 0.1 μg/ml 미만 및 약 0 μg/ml 농도의 숙주 세포 단백질을 함유한다.

또 다른 태양에서, 본 발명의 r푸린의 정제된 용액은 약 1.0 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.95 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.90 ng 단백질/U r푸린 미만, 0.85 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.80 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.75 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.70 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.65 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.60 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.55 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.50 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.45 ng 단백질/U r푸린 미만, 0.40 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.35 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.30 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.25 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.20 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.15 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.10 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.05 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.04 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.03 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.02 ng 단백질/U r푸린 미만, 약 0.01 ng 단백질/U r푸린 미만 및 약 0 ng 단백질/U r푸린 농도의 숙주 세포 단백질을 함유한다.

이하의 예는 r푸린을 생산하는데 CHO 숙주 세포를 사용한 발명을 보여주나, 당업자는 임의의 숙주 세포 유형이 본 발명의 r푸린을 생산하는데 유사하게 맞춰질 수 있음을 알 것이다. CHO 세포는 재조합 단백질의 생산에 널리 사용되었고 조작된 CHO 세포(CHO 세포주가 생성물 유전자 및 선택가능한 마커 유전자로 형질감염된 것들)가 통상적으로 혈청을 함유하는 배양 배지 내에서 길러졌다. 그러나, 혈청의 사용은 많은 문제들을 제기한다. 혈청은 값비싼 상품이고, 상업적인 생산에 요구되는 양으로 쉽게 입수가능하지 않다. 혈청은 또한 생화학적으로 정의되지 않은 물질이며 완전히 동정되지 않았고 그들의 작용도 결정되지 않은 많은 성분들을 함유한다. 따라서 혈청은 배치마다 상이할 것이고, 다양한 성분의 수준 및 그들의 세포에의 영향을 측정하기 위한 시험을 요구할 수 있다.

추가로, 혈청은 종종 다수가 무해할 수 있으나 여전히 추가적인 미지의 인자를 나타내는 바이러스 및 미코플라즈마와 같은 미생물로 오염된다. 추가로, 배양 배지 중 동물 단백질의 존재는 긴 정제 과정을 요구할 수 있다. 구체적으로, 소 혈청 알부민(BSA) 내의 소 항체의 존재는 재조합 CHO 세포주에 의해 발현된 바람직한 항체의 정제를 매우 어렵게 만든다. 사용 전 배지로부터 소 항체를 제거하는 것이 가능하나, 이 제거 및 제거 후 요구되는 추가적인 생성물 시험은 생성물 생산의 비용을 크게 증가시킨다. 따라서, 세포 성장, 특히 CHO 세포의 성장을 지탱할 동물 성분이 없는 배양 배지를 사용하는데에는 이점이 있다. CHO 세포는 혈청-부재 조건에서 쉽게 자라지 않지만, 본 발명은 혈청-부재 조건 하에 CHO 세포 내에서 성장된 r푸린을 제공한다.

조작된 CHO 세포는 또한 현탁액 내에서 자라기 어렵다. r푸린과 같은 산물을 발현하기 위해 세포를 사용하는 경우 현탁액 내에서의 성장을 달성하는 것이 매우 바람직하다. 이와 같은 생물학적 단백질의 상업적인 규모의 생산을 위해, 상당한 크기의 발효기 내에서의 성장을 지탱할 수 있는 것이 바람직하다. 세포가 큰 생산 조건에서 자랄 수 있도록 세포를 지탱하는데 적절한 배지 또한 요구된다. 이와 같은 적절한 배지를 여기서 실시예에 제시한다. 당업자는 해당 분야의 세포를 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 제시된 것과 같은 r푸린을 포함하는 숙주 세포를 배양하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 배양 방법의 비제한적인 예를 여기서 실시예에 제공한다

본 발명은 또한 세포가 혈청-부재 배지에서 성장한 후 r푸린으로부터 CHO 세포 단백질을 제거하기 위해 수행되는 정제 방법을 제공한다. 당업자는 해당 분야에 공지된 임의의 단백질 정제 방법이 배양 배지로부터 r푸린을 정제하는데 사용될 수 있음을 알 것이다. 정제 방법의 비제한적인 예를 여기서 실시예에 제공한다. 그에 따라, 본질적으로 실질적으로 모든 동물원 단백질 부재인 r푸린을 생산할 수 있다. 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린은 사용시까지 임의로 냉동 저장한다.

<실시예>

본 발명의 추가적인 태양 및 세부사항이 아래 실시예로부터 자명할 것이며, 이들은 제한하기 보다는 예시적이도록 의도된다. 실시예 1은 r푸린 발현 플라스미드의 구축 및 숙주 세포 형질감염을 기술한다; 실시예 2는 r푸린-발현 CHO 세포 클론을 혈청-부재 조건에서의 성장에 적응시키는 방법을 기술한다; 실시예 3은 동물-단백질 부재 배지 내에서 r푸린의 제조를 위한 최적화 방법을 기술한다; 실시예 4는 r푸린의 정제를 기술한다; 실시예 5는 r푸린의 큰 규모 생산의 하류 가공(농축 및 정제) 및 분석을 제시한다; 실시예 6은 숙주 세포 뱅크의 질을 측정하고 유지하기 위해 수행되는 안전성, 멸균성 및 안정성 시험을 나타낸다.

실시예 1

재조합 푸린 발현 플라스미드의 구축 및 숙주 세포 형질감염

#556로 명명된 r푸린 발현 플라스미드를 구축하는데 사용된 푸린 원종 플라스미드의 상세한 설명을 표 1에 제시한다. 구성적 거대세포바이러스(CMV) 촉진자의 조절 하에 발현된 경우, 성숙 r푸린은 촉매 구역, P 구역 및 시스틴-풍부 구역의 작은 부분을 함유하는 반면 C-말단 내지 아미노산 577에 위치한 영역은 제거되어 완전히 분비된 활성 프로테아제를 생성한다.

선택 플라스미드로 사용된 DHFR-벡터 구축의 설명을 표 2에 나타냈다. # 488-3 및 # 289-20로 명명된 안정하게 발현하는 CHO/r푸린 세포 클론의 개발을 위해, 기능적 내생 DHFR 유전자가 결여된 CHO 세포들을 인산 칼슘 공-침전을 이용하여 플라스미드 # 556 및 # 73과 공-형질감염시켰다. 몇 회의 서브클로닝 및 DHFR/MTX 선택 시스템을 사용한 증폭으로 높은 수준의 r푸린을 분비하는 클론을 선택했다.

형질감염된 CHO 세포를 DHFR-배지 내에서 길렀고, 상기 배지는 하이포크산틴이 없는 DMEM NUT MIX F12(1:1), 헤페스로 보충된 티미딘 및 글리신, L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin) 및 5 % 또는 10 % 투석된, 감마-조사된 FBS(= 5 % DHFR, 10 % DHFR)로 구성된다. 투석 및 감마-조사된 FBS는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 분석, 기원 및 조사의 모든 증명 서류와 함께 구입했다. 감마-트립신 용액(1 mg/ml)의 제조는 오스트리아 오르트(Orth, Austria)의 백스터(Baxter)에서, 배지 제조부(department of Media Preparation/PCC)가 수행하였다.

CHO/r푸린 클론 # 488-3 세대의 가계도를 도 2에 나타낸다. 비변화된 MTX 농도를 갖는 배지 내에서의 1 회의 서브클로닝이 수행된, 100 nM MTX로 보충된 선택 배지 내에서의 증폭에 들어가기 전 10 % DHFR 선택 배지 내에서의 2 회의 서브클로닝을 겪은 최초의 클론으로부터 클론 CHO/r푸린 # 488-3을 얻었다. 냉동을 위해 클론 # 448-3를 팽창시켰다. CHO/r푸린 클론 # 289-20를 유사하게 제조 및 팽창시켰다. 그러나, 클론 #289-20은 클론 #488-3으로부터 유래된 후손 클론이다. CHO/r푸린 클론 # 289-20 세대의 가계도를 도 3에 나타낸다.

푸린 활성을 클론의 상태조절된 배지 내에서 측정했고, 클론을 혈청-부재 DHFR 배지 내에서 24 시간 동안 배양했다. 높은 푸린 활성(24 시간당 U/10⁶ 세포)을 보인 세포 클론을 선택했다. 냉동 저장 앰플의 제조를 위해 선택된 고 생산자 클론을 팽창시켰고 다음 회의 클로닝을 위한 분할에 사용했다. 고 생산자 세포 클론의 단리 및 동정을 수행했다. 캐시(Casy) 세포 계수기를 사용해 세포 밀도를 분석했다. 24 시간당 200-300 U/10⁶ 세포 이하의 푸린 발현 수준이 클론 # 488-3에 대해 달성되었다. 24 시간당 400 U/10⁶ 세포 이하의 푸린 발현 수준이 클론 # 289-20에 대해 달성되었다

실시예 2:

혈청-부재 조건에서의 성장에 대한 재조합 푸린 발현 세포 클론의 적응

세포주 적응 및 선택의 전략은 세포주를 혈청- 및 단백질-부재인 세포주로 단계적인 희석으로 점진적으로 또는 갑자기 적응시키는 것이다. 본 연구의 목적은 혈청-부재 조건 하에서 자라는 CHO 세포 집단을 찾는 것이었으며, 이는 r푸린을 안정적으로 생산한다. CHO 세포 클론 #488-3을 출발 물질로 사용했다. 세포 클론 CHO #488-3를 발현하는 r푸린을 아래 상세히 제시하는 바와 같이 세 개의 동시에 수행된 적응으로 혈청-부재 조건으로 전환시켰다.

적응 시기에 세포는 통상적으로 느린 성장을 보이기 때문에, 적응 시기로 세포를 억제할 수단을 찾기 위해 미세담체를 사용하여 스피너 플라스크 내에서 혈청 고갈 공정을 시작했다. 이 방법을 사용함으로써, 후속하는 배지 변경 중 세포를 성장이 억제될 수 있는 농도로 희석시키는 것을 피하는 것이 가능하였다.

사내에서 개발된 배지의 세 개의 변경물, BAP, BAS 및 BCS(표 3에 도시)를 이 연구 중 사용하였다.

각 실험의 목적에 따라 이들 배지 변경물에 표 4에 나열한 바와 같은 상이한 보충물을 제공하였다.

아래 표는 배지 및 시약의 개관을 제공하며, 이들을 본 연구 중 사용하였다. 표 5는 예비-마스터 세포 뱅크 클론 PMCB#01 및 PMCB#04의 생성에 사용되는 배지 및 시약을 요약한다.

표 6은 서브-클론 #488-3/CJ06-19/5F10(5F10) 및 #488-3/CJ06-19/1E8 (1E8)의 상응하는 평가 세포 뱅크(ECB)의 서브클로닝 및 확립 중 사용된 배지 및 시약을 요약한다.

배지에 첨가된 모든 보충물의 롯트 번호는 상응하는 배지의 적절한 제조 프로토콜을 참조한다. 다른 배지 첨가물을 표 7에 나열하였다.

혈청-부재 조건에의 적응은 우태아 혈청(FBS)으로부터의 세포를 이탈시킴에 의한 세포 보유(원심분리 등)와 함께 T-플라스크 또는 스피너 플라스크 내에서 수행하였다.

T-플라스크 내의 현탁액 배양을 36±2 ℃ 및 7.5±1.0 % CO₂에서 인큐베이션시켰다. 스피너 플라스크 내의 배양은 36±2 ℃ 및 각각 80 rpm 및 130 rpm에서 작동하는 담체를 갖지 않는 테크네(Techne) 및 벨코(Bellco) 스피너에서 수행하였다.

CHO/r푸린 세포 클론 #488-3의 서브클로닝은, 그것의 혈청-부재 배지 조건에의 적응에 이어서, 혈청-부재 사내 배지 내 현탁액 내에서 자라며 r푸린을 많은 양으로 안정하게 생산하는 CHO 세포 클론을 생성했다. 공정은 한정된 희석 방법에 기초했다. 간단하게, 세포 현탁액을 100 μl의 현탁액이 하나의 세포를 함유하도록 희석했다. 96-웰 플레이트의 웰을 이 현탁액 100 μl로 채웠다. 이론적으로, 각 웰은 클론 발달을 위한 하나의 세포를 함유한다. 이들 단일 세포들이 자라기 시작하면서, 클론이 발달한다. 따라서, 모든 새롭게 생성된 세포는 웰 내의 첫 번째 기원 세포로 거슬러 올라갈 수 있다. 클론을 24-웰 플레이트 내, 그 후 T25플라스크 내, 그 후 T75 플라스크 내 및 그 후 T175 플라스크 내에서 늘렸다.

배양 중, 내부 공정 제어(IPC)를 수행해 성장 조건을 관찰했고 r푸린 발현을 측정했다. 캐시 기기를 사용해 배양 중 세포 밀도를 측정했다. CTX 추출 이후 세포 핵의 검출을 위해 뉴클레오(Nucleo) 계수 기기를 사용했다. 혈구계산기를 사용한 트립판 블루 제외법(trypan blue exclusion method)으로 해동 이후 세포 밀도 및 생육성의 측정을 수행하였다. 세포 밀도 및 생육성을 또한 세덱스(Cedex) 기기에 의해 수행되는 자동화된 트립판 블루 제외법을 사용해 분석했다.

발현된 r푸린의 양 및 활성을 측정하기 위해 세포 배양 상청액을 사용했다. 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석을 사용해 주어진 세포 집단 내의 생산자 대 비생산자 세포의 비를 관찰했다. 세포의 형태 및 성장 거동을 광학적 제어로 측정했다. 추가로, 또한 배지 조건을 관찰하기 위해, 예컨대 pH 값 및 포도당, 글루타민, 락테이트 및 암모늄의 잔존 농도의 측정을 위해 세포 배양 상청액을 검사했다. 이들 분석은 노바(NOVA) 기기로 수행했다.

본 연구 중, 두 개의 예비-마스터 세포 뱅크(PMCB) PMCB#01 및 PMCB#04를 제조했고 두 개의 세포 클론주를 아래에 제시한 바와 같이 확립했다. 평가 세포 뱅크(ECB)(표 15 참조) 또한 생성했다.

PMCB #01의 제조 및 QC 시험

1 바이알의 CHO/r푸린 #488-3(ECB#01)을 첨가물(Put, Glut, Synp 및 Fe) 및 5 % FBS를 함유하는 BAS 배지 내에서 해동시켰다. 세포는 T175 내에서 5일 동안 배양된 세포였다. 그 후 세포를 아래 제시한 바와 같이 혈청-부재 조건에 적응시켰다.

5 % FBS, 0.2 g/l를 함유하는 150 ml 성장 배지(Put, Glut, Synp 및 Fe를 구비한 BAS) 내에서 세포를 제조했다. 혈청-부재 조건에의 적응에 사이토포어(Cytopore) 2 담체를 사용했다. 접종된, 5일 된 세포 현탁액은 출발 세포 밀도 약 2.0x10⁵ 세포/ml를 형성했고, 세포는 처음 몇 시간 내에 다공성 담체에 부착되었다. 따라서, 05일에 세포는 스피너 플라스크 내에 유지된 반면, 성장 배지는 두 단계로, 5 %에서 3.8 % 내지 0 %로 혈청 농도를 줄이도록 교환되었다. 후속하는 배양 기간 중 세포는 혈청-부재 배지 조건에 적응되었다. 세포는 담체의 표면으로부터 분리되었고 현탁액 내에서 계속 성장했다. 현탁 세포의 세포 밀도 및 생육성은 계속해서 증가했다. 매 2 내지 3일 마다 현탁 세포를 1:2의 비로 분할했다.

그 후 평가 세포 뱅크(ECB)를 제조했다. 배양 28일에, 60 % 초과의 생육성을 갖는 세포를 새로운 실험으로 이동시켰다. 담체를 갖지 않는 벨코 스피너 내의 BAS 배지(Put, Glut, Synp 및 Fe 구비) 200-300 ml 내에서 배양을 성장시켰다. 측정된 캐시 세포 밀도에 따라, 현탁액 배양을 매 2 내지 3일 마다 약 2.0x10⁵ 세포/ml의 출발 세포 밀도로 분할했다. 16일 후, 세포 배양이 80 % 초과의 생육성에 도달했을 때, 6 개의 세포 바이알로 구성된 평가 세포 뱅크(ECB)를 제조했다.

새로운 실험에서 ECB의 하나의 바이알을 해동했다. 세포를 Put, Glut, Synp, Fe 및 Zn를 갖는 BAS 배지 내에서 T175 내에서 4일 동안 성장시켰다. 그 후 세포를 600 ml 이하의, Put, Glut, Synp, Fe 및 Zn를 갖는 BAS 배지를 함유하는 벨코 스피너로 옮겼다. 다시, 매 2 내지 3일 마다 현탁액 배양을 약 2.0x10⁵ 세포/ml의 출발 세포 밀도로 분할했다. 배양 13일에, 20 개의 바이알로 구성된 PMCB#01의 제조를 위해 143 ml의 세포 현탁액을 제거했다. 세포를 늘렸고 PMCB#01에 대해 품질 관리 시험을 수행했다.

PMCB #04의 제조 및 QC 시험

CHO/r푸린 #488-3(ECB#01)의 하나의 바이알을 Put, Glut, Synp, Fe 및 5% FBS를 함유하는 BAS 배지 내에서 해동시켰다. 6일 된 배양의 반을 혈청-부재 조건에의 적응을 위한 새로운 실험으로 옮겼다.

여기서, 혈청-부재 조건에의 적응은 단계적으로 수행되지 않았고 오히려 급작스럽게 수행되었다. FBS 및 담체를 함유하지 않는 BAS 배지(Put, Glut, Synp 및 Fe가 첨가됨)로 벨코 스피너 플라스크를 준비하였다. 세포를 약 2.5x10⁵ 세포/ml의 출발 세포 밀도로 접종했다. 갑작스러운 혈청-부재 조건에 의해, 세포의 배가 시간이 다소 낮은 수준으로 감소했다. 성장이 억제될 수 있는 농도로 세포를 희석시키는 것을 회피하기 위해, 세포 현탁액을 회전 침강시킴으로써 배지를 바꾸었다. 세포 펠렛을 새로운 성장 배지 내에 재현탁시켰다. 세포 밀도가 4.0x10⁵ 세포/ml 초과일 때 배양 분할을 수행하였다. 배양 15일에 약 50 %의 최저 생육성에 도달한 후, 세포가 회복되기 시작했으며, 배양 32일부터, 그들의 생육성은 85-90 % 사이로 증가했다. 배양 61일에, 적응된 세포를 15 개의 바이알로 구성된 ECB로 냉동시켰다.

Put, Glut, Synp 및 Fe를 포함하는 혈청-부재 BAS에서의 내의 새로운 실험에서 ECB의 하나의 바이알을 해동시켰다. 배양을 T175 플라스크 내에서 7일 동안 배양한 후, 그것을 벨코 스피너로 옮겼고, 여기서 세포를 추가로 2일 동안 성장시켰다. 그 후, Zn의 첨가를 시험했다. 약 100 ml의 원심분리된 세포 현탁액을 Put, Glut, Synp, Fe 및 Zn를 함유하는 혈청-부재 BAS 배지 내에 재현탁시켰다. 현탁액을 벨코 스피너 내에서 배양했다. 측정된 캐시 세포 밀도에 따라, 매 2 내지 3일 마다 현탁액 배양을 약 2.0x10⁵ 세포/ml의 출발 세포 밀도 분할했다.

접종 준비 및 PMCB#04의 생성을 위한 많은 양의 균일한 세포 현탁액을 생산할 수 있기 위해, 세포 배양을 벨코 스피너 내에서 1000 ml로 규모를 증가시켰다. 배양 02일에, 20 개의 앰플로 구성된 PMCB#04를 제조하는데 465 ml의 세포 현탁액을 사용하였다. 세포를 늘렸고 PMCB#04에 대해 품질 관리 시험을 수행했다.

도 4는 PMCB#01 및 PMCB#04의 세포 집단 내 r푸린 생산자의 그래프적 분포의 비교를 제시한다. PMCB#04 내 80.74 %의 세포가 r푸린을 발현한다. PMCB#01 내 74.06 %의 세포가 r푸린을 발현한다.

그 후 CHO/r푸린 #488-3 서브클론 CJ06-19/5F10 및 CJ06-19/1E8를 생성했다. CHO/r푸린 클론 #488-3의 앰플을 해동하고 배양을 T175 플라스크 내에서 계대시켰다. 배양 17일에, 각각이 5 % FBS를 함유한 세 개의 상이한 배지, BAP 배지(백스터 개발), CD-CHO(깁코(Gibco) 제공) 및 ExCell 325PF CHO(JRH 제공)를 시험했다. T175 플라스크 내에서 4일 성장 후, ExCell 배지에서 성장한 세포를 혈청-부재 조건에 적응시켰다.

작은 단계들로 세포를 혈청으로부터 이탈시켰다. 전체 과정은 세 개의 실험에 걸쳤다. 첫째로, 부착-의존적 세포를 초기에 5 % FBS를 함유하는 ExCell 325PF CHO 내에서 T175 플라스크 내에서 배양했다. 그 후 배양 13일에 혈청을 0.5 %로 천천히 감소시켰다. 다음의 13 배양일 동안 두 번의 분할이 수행되었고, 여기서 혈청 농도는 추가로 0.25 %로 감소되었으며 생육성은 70 % 미만으로 감소되었다. 세포는 그들의 부착-의존적 거동을 잃었고, 더욱더 구형인 모양을 보였으며 현탁액으로 자라기 시작했다.

혈청 감소의 마지막 단계는 0.25 % FBS를 함유하고 담체를 함유하지 않는 ExCell 325PF CHO 배지 내에서 테크네 스피너 내에서 일어났다. 23일의 배양기간 후, 혈청 농도는 0 %에 도달했다. 세포를 분할했고 모든 관련 지표들이 그들의 주어진 범위 내에 유지되도록 배양했다. 세포 밀도는 0.15 내지 0.9x10⁶ 세포/ml 사이에서 변동했다. 생육성은 첫 주 동안 40 % 미만으로 떨어졌으나, 그 후 90 % 초과의 값으로 돌아왔다. 배양 42일에, 적응된 세포들을 20 개의 바이알로 구성된 ECB/CJ06-20 내에서 냉동시켰다.

그 후 세포를 서브클로닝했다. 세포 현탁액을 사전상태조절된 ExCell 325PF CHO로 100 μl의 현탁액이 이론적으로 0.5-1.0 개의 세포를 함유하도록 하는 방법으로 희석했다. 서브클로닝 실험에서, 다섯 개의 96-웰 플레이트를 웰 당 이 세포 현탁액 100 μl로 채웠다. 세포 시딩일 다음날, 현미경 아래에서 웰에 단일 세포가 있는지 조사했다. 하나의 세포를 함유한 웰을 표시하고 추가로 관찰했다. 필요시 사전상태조절된 ExCell 325PF CHO의 첨가 및 교환을 실시했다. 다음 2 주 동안 세포가 죽거나 세포 분열이 없는 경우, 관련 웰을 실험에서 제외했다.

두 개의 단일 세포가 성장을 보였다. 적절한 크기에 도달한 발달된 클론을 24-웰 플레이트의 웰 내로 옮겼다. 여기서, 배양의 성장 및 요구조건에 따라 사전상태조절된 ExCell 325PF CHO의 교환 또한 수행하였다. 각각 배양 07일 및 10일에 서브클론 CJ06-19/5F10 및 CJ06-19/1E8를 T25 플라스크로 옮겼다.

ExCell 배지 내에서 ECB를 제조했다. 이들 ECB는 두 서브클론에 대한 추가의 조사, 예컨대 값비싸게 구입한 배지로부터 백스터에 의해 자체-개발된 더 경제적인 제제로의 재-적응을 위한 원료 물질을 나타낸다. 서브클론 CJ06-19/5F10, CJ06-42의 ECB를 ExCell 325PF CHO 배지 내에서 T25에서 T75로, T175로 및 그 후 벨코 스피너 내로 늘렸다. 21일에 10 개의 바이알로 구성된 ECB/CJ06-63를 T175로부터의 배양으로부터 냉동시켰다. 서브클론 CJ06-19/1E8, CJ06-43의 ECB 또한 ExCell 325PF CHO 배지 내에서 늘렸다. 배양을 T25에서, T75로, T175로 및 그 후 벨코 스피너로 늘렸다. 18일에 10 개의 바이알로 구성된 ECB/CJ06-64를 T175로부터의 배양으로부터 냉동시켰다.

아래 제시한 바와 같이 ECB(서브클론 5F10 및 1E8)를 BCS 배지에 적응시켰다. ECB 클론 CJ06-19의 서브클론 CJ06-19/5F10을 실험 CJ06-66에서 해동시켰고, 그 후 BCS 배지를 ExCell 배지에 부피를 증가시키며 첨가해, 세포를 ExCell 배지로부터 이탈시키고 BCS 배지 내에서 자랄 수 있는 능력을 획득하게 했다. ECB 클론 CJ06-19의 서브클론 CJ06-19/1E8를 동시에 유사한 방법으로 BCS 배지에 적응시켰다.

표 8은 본 연구 중 제조된 모든 혈청-부재 세포 뱅크를 도시한다.

PMCB#01과 PMCB#04 및 서브클론 5F10과 1E8의 비교를 표 9에 제시한다.

실험 CJ06-69에서 배양된 세포 집단과 SK06-49 및 SK06-63은 PMCB를 위한 세포주의 전구체 배양을 나타낸다. 이들 세포를 BAS 배지 내에서 성장시켰고(Put, Glut, Synp, Fe 및 Zn를 추가하였음), 각각 PMCB#01 및 PMCB#04로 냉동시켰다.

서브클론 5F10 및 1E8를 JRH로부터 제공되는 상업적으로 입수가능한 배지 ExCell 325PF CHO 내에서 성장시켰다. BAS 제제에 기초한 배지 내에서 성장하는 능력이 바람직하기 때문에, r푸린의 추가적인 생산을 위해 PMCB#01 및 PMCB#04를 선택했다.

표 10에 나타낸 바와 같이, PMCB#04의 세포는 PMCB#01에 비해 더 우수한 성장 거동을 보였다. 생육성 및 성장률이 PMCB#04에서 더 컸으며, 세대 배가 시간이 더 짧았다. r푸린의 세포-특이적 및 부피 성장비 역시 평가된 시간 기간 내내 더 컸다. 추가의 실험에서, 생육성에 관한 자료를 확인했다. 각 PMCB의 하나의 앰플을 Zn을 첨가물로 가진 BCS 배지를 함유하는 T175 플라스크 내로 해동시켰다. 표 10에 나타냈듯이, 이번에도 PMCB#04의 생육성이 PMCB#01의 그것보다 더 컸다.

따라서, PMCB#04를 r푸린 마스터 세포 뱅크(MCB)의 향후 생산 및 모든 추가의 작업 세포 뱅크(WCB)를 위한 원료 물질로 선택했다. 현재의 우수 조직 가이드라인(Good Tissue Practice) 규정에 따라 20 개의 바이알로 구성된 PMCB#04를 만들었다. ICH-가이드라인 Q5D의 요건에 따라 품질 관리(QC) 시험을 수행했다. 제조 공정에서 r푸린의 생산을 위해 PMCB#04를 선택했다.

성장 배지는 인간 또는 동물 유래 물질을 갖지 않으며 자체-발달되었다. 여과에 의해 세포를 제거하고, r푸린 함유 상청액을 한외여과로 농축한다. 교환 크로마토그래피에 의한 여과 이후, r푸린 용액의 활성은 200 단위 r푸린/ml 이상이 되도록 한다.

미코플라즈마, 바이러스, 외인성 시약, 멸균성 및 발현 효율에 대한 시험을 수행했다. 선택의 기준은 각각 최초의 클론 #488-3 및 #289-20에 비교한, 상이한 서브클론에서 수행된 높은 푸린 활성(예컨대, 푸린 단백질, 엘리사) 및 면역형광법(FACS)에서의 세포 집단의 균일성이다. 추가로, 불순물 프로파일을 정성적으로 비교해야 한다(예컨대, RP HPLC 이후의 UV-피크 패턴에 의해 또는 SDS-PAGE/쿠마쉬(Coomassie) 기술에 의해).

실시예 3:

동물 단백질-부재 배지 내에서 재조합 푸린 생산을 위한 최적화

본 실시예는 r푸린 발현 CHO 클론 #488-3 배양을 위한 개발 및 최적화 과정을 기술한다. 아미노산, 포도당 및 NaHCO₃ 농도에 관한 특이적 배지 최적화를 수행했고, 이는 발효 과정의 증가된 세포 성장률 및 더 높은 생산성을 가져왔다. 인-라인 조절된 공정 지표의 최적화를 pO₂(10 %, 20 % 및 50 %)에 대해 최적화된 배지 제제로 수행했고, 최적의 pH(7.1-7.3 범위) 및 온도(35.1 ℃-37.9 ℃ 범위)를 결정하기 위해 요인 실험을 수행했으며, 발효는 35 ℃-36 ℃ 사이의 더 낮은 온도에서 수행될 시 CHO 클론 #488-3에 대한 상당한 수득률 개선을 불러왔다.

가능한 생산 모드로서, 케모스텟 배양 및 회분식 재공급 배양을 비교했으며, 두 공정 유형 모두가 r푸린의 제조에 적절함을 나타내었고 동일한 지표 설정에서 견줄만한 수득률을 주었다. 상이한 생반응기 설정에서 교반 유형 및 속도의 영향을 조사하기 위해 특정한 실험을 수행했다. 비성장률 및 발현율, 세포 밀도 및 그에 따른 부피 생산성이 생반응기 설정의 변수들에 의해 강하게 영향을 받고 증가된 교반 속도의 조건 하에서 수득률이 상당히 증가할 수 있음이 증명되었다. 전체적으로, r푸린 상류 공정의 주요 지표의 영향은 그들의 효과에 관해 잘 특성화되며 높은 수득률을 내는 공정은 전임상적 및 임상적 제조를 위한 파일럿 플랜트로 옮겨질 수 있다. 자세한 내용은 아래에 제시한다.

혈청- 및 인슐린-부재 배지에 적응된 서브클론 # 488-03을 사내에서 개발했다. 아래 실험을 기본 배지 제제로서 FBS-부재 및 인슐린-부재 배지(BACD-배지)에서 수행했다(표 11 참조)

세포 성장을 개선하고 세포 증식에 최적인 조건을 제공하기 위해, 케모스텟 배양 상청액의 아미노산 분석을 수행했다(표 12 참조). 결과로, 세 개의 필수 아미노산, 즉 메티오닌(10 mg/L), 류신(40 mg/L) 및 페닐알라닌(10 mg/L)을 배지에 첨가했다. 1.5 L 생반응기 내에서 37 ℃, pH 7.15 및 20 %의 pO₂에서 발효를 수행했다.

배양 상청액의 낮은 글루타민 농도 때문에, 글루타민(300 mg/L)을 배지에 첨가해 최종 글루타민 농도 900 mg/L를 만들었다. 배지에 글루타민 첨가 후, 성장률이 0.55 일^-1에서 0.67 일^-1로 증가했다(표 13 및 14 참조). 배지에 상기한 이들 세 개의 아미노산(즉, 메티오닌(10 mg/L), 류신(40 mg/L) 및 페닐알라닌(10 mg/L))의 첨가에 의해, 세포의 성장률을 다시 증가시킬 수 있었다(0.69 일^-1)(표 15 참조). 부피 생산성은 대략 267 kU/L/일 (= +13 %)로 증가했고 비생산성은 16 %의 증가를 보였다. 배지의 글루타민, 메티오닌, 류신 및 페닐알라닌으로의 보충은 세포 성장 및 부피 및 비활성에 긍정적인 영향을 보였고 따라서 추가의 배지 제조에서 계속되었다.

배지 내 아미노산의 보충량이 충분한지 점검하기 위해, 케모스텟 배양(10 L)의 다른 아미노산 분석을 수행했다. 배양에 300 mg/L 글루타민 및 각각의 양의 세 개의 아미노산을 공급하였다. 배양 7 및 15일에 샘플을 뽑아냈고 배양 조건은 상기한 것들과 유사했다. 결과(메티오닌, 류신 및 페닐알라닌에 대한 자료만 도시한 표 16 참조)는 발효 배양액 내에 충분한 양의 보충된 아미노산이 존재함을 확인시켜주었다.

NaHCO₃ 농도의 감소 및 포도당 농도의 증가. 세포 배양 내 높은 용존 CO₂ 농도의 성장 및 생산성에의 영향을 조사했다. 생반응기 내 큰 규모의 생산 때문에, 2.5-32 L 생반응기에서보다 더 큰 세포 배양 내 CO₂ 농도를 예상할 수 있다. 따라서, 하나의 실행은 대략 75 %의 CO₂ 농도로, 다른 것은 대략 12 %의 CO₂ 농도로 두 개의 발효 실행을 동시에 수행했다. 상부 빈공간 흐름 내의 CO₂ 분율을 변화시켜 CO₂ 농도를 조절했다. 뽑아진 샘플을 노바(NOVA) 기기로 분석하여 세포 배양 내의 CO₂ 농도를 측정했다. 37 ℃에서 pH 7.15에서 및 20 %의 pO₂로 발효를 수행했다.

11-12 %의 CO₂ 농도는 세포 성장 및 생산성에 악영향을 주었다. 이 CO₂ 농도에서, 1.1x10⁶ 세포/mL의 세포 수 및 0.30 일^-1의 희석률에서 12일의 중간기 후에 0.29 일^-1의 성장률이 도달되었다. 대략 7.5 %의 CO₂로 실행된 발효에서, 1.49x10⁶ 세포/mL의 세포 수 및 0.53 일^-1의 희석률에서 동일한 중간기 후에 0.52 일^-1의 성장률이 도달되었다. 높은 CO₂ 농도에서, 생육성이 7.5 % CO₂에서의 95.9 %에 비해 86.1 %로 감소하였다. 추가로, 부피 생산성은 대략 36 % 및 비생산성은 50 % 감소했다. 높은 CO₂ 농도로 인해, 비포도당 섭취율 또한 감소했다(-39 %). 증가된 CO₂ 농도(11-12 %)의 세포 성장 및 생산성에의 악영향은 꽤 분명하였고, 따라서 7.5 % CO₂에서 발효를 수행하는 것이 최적이다.

아래 제시한 바와 같이, 실험은 1,000 L 생반응기 내에서 CO₂의 농도가 12 %로 증가할 시, CHO-푸린 클론 488-3 성능의 큰 감소를 예상할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 배지 내 NaHCO₃ 농도를 2 g/L에서 1.5 g/L로 감소시키기로 하였다. 배지 내 더 적은 양의 NaHCO₃는 배지의 완충 용량 또한 감소시키므로, 하나는 배지 내에 3.15 g/L 포도당 및 2 g/L NaHCO₃(FUR_06/24_F01)를 갖고 다른 것은 4.65 g/L 포도당 및 1.5 g/L NaHCO₃(FUR_06/26_F04)를 갖는 두 개의 발효 실행(10 L)을 비교하였다.

큰 규모 생반응기(1,000 L)의 조건을 모사하기 위해, 상부 빈공간 내의 일정한 CO₂ 기체 공급을 통해 발효 중 용존 CO₂의 농도를 2 g/L NaHCO₃를 갖는 발효기에서 7-8 %로 및 1.5 g/L NaHCO₃를 갖는 발효기에서 6-7 %로 조절했다. 두 배양의 성장률은 비슷했고(0.58 및 0.56 일^-1) 배양들은 견줄만한 부피 생산성 및 생육성을 보였다. 그러나, 비포도당 섭취율은 더 낮은 NaHCO₃ 농도를 갖는 배양에서 약간 더 높았다(0.83 mg/106 세포/일 대 0.67 mg/106 세포/일). 따라서, 4.65 g/L의 포도당 농도가 적당하다고 여겨졌고 추가의 배지 제조에서 유지되었다.

푸린 배지 내 신퍼로닉(Synperonic) F68 농도의 조사. 세포 배양 배지 내 신퍼로닉 F68의 보통 농도는 0.25 g/L로 설정되었다. 배지 내 신퍼로닉 F68의 목적은 액내 산소화에 의한 손상으로부터 세포를 보호하는 것이다. 따라서, 2x1O L 생반응기 내에서 하나의 실험을 수행하였고, 여기서 1.0 g/L의 증가된 신퍼로닉 F68 농도 대 0.25 g/L의 보통의 농도를 조사하였다. 35.8 ℃에서 pH 7.3에서 및 20 %의 pO₂로 발효를 수행하였다.

증가하는 플루로닉(Pluronic)(Synperonic F68) 농도로, 약간 더 높은 비성장률 및 세포 밀도를 달성할 수 있었다. 따라서, 증가된 비생산성에 의해, 365 대 278 kU/L/일의 비례하는 더 큰 부피 생산성을 달성할 수 있었다.

이들 실험에서의 상청액을 모아서 심층 여과기(쿠노 카트.(Cuno Cart.) Z08P4A30SP 4 디스크)로 그 후 멤브레인 여과기(폴 플루오로딘(Pall Fluorodyne) II KA2DFLP2)로 여과했다. 여과된 상청액을 한외여과(사토리우스(Sartorius) 3OS 146390 1E--SG PSU 10KD, 0.2m²)로 농축하고 푸린 투석여과 완충액에 대해 투석여과했다. 멸균 여과된 농축액(사토리우스 사토브란(Sartobran) P 523130748-00 0.45/0.2μ)을 캡토 MMC 칼럼 위에서 정제했다. 이 정제 실험의 결과는 증가된 신퍼로닉 F68이 정제된 r푸린의 질 및/또는 순도에 악영향을 갖지 않음을 나타냈다. 캡토 MMC 칼럼의 용출액에서 증가된 신퍼로닉 F68 농도를 발견할 수 없었으며, 이는 두 용출액 모두에서 <0.15 mg/mL였다.

이들 결과에도 불구하고, r푸린 배지 내의 신퍼로닉 F68 농도는 원래의 0.25g/L로 유지되었다. 그러나, 액내 산소화에 의한 규모 증대 문제의 경우, 최종 푸린 생성물에의 악영향이 없는 증가된 수득률의 가능성과 함께 1.0 g/L 이하의 증가하는 신퍼로닉 농도를 고려할 수 있다.

발효 내의 r푸린 생산을 위한 최종 배지 조성물. 배지 최적화 실험에 기초해, 아래 배지 조성물이 r푸린의 생산을 위한 생반응기 배양 내의 CHO 클론 488-3의 발효에 최적인 것으로 나타났다.

상이한 pO₂ 설정 지점의 성장률 및 생산성에의 영향 또한 조사했다. 세 개의 상이한 pO₂ 설정 지점, 즉 10 %, 20 % 및 50 %를 시험했다. 상부 빈공간을 통한 기체 공급이 있는 1.5 L 생반응기 내에서 실험을 수행했다. 모든 발효 실행은 35.1 ℃에서 pH 7.20에서 수행했다. 10, 20 및 50 % pO₂에서의 발효 실행의 비교는 증가하는 pO₂ 설정 지점에 따른 성장률의 약간의 증가(0.59, 0.62 및 0.65 일^-1)를 보였다. 유사하게, 부피 생산성은 50 % pO₂에서 최대였다. 상이한 발효 실행의 평균 세포 수는 매우 유사했다. 따라서, 부피 생산성의 증가는 증가하는 성장률의 결과였다.

따라서, 50 %의 pO₂ 설정 지점이 성장률에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각되었고, 그 결과로 부피 생산성이 표준 조건(=20 % pO₂)에서보다 대략 4 % 더 높았다. 생육성에의 영향은 관찰되지 않았다. 따라서, pO₂=20 %의 설정 지점 및 10 %-50 % 사이의 규제 범위가 CHO 클론 #488-3의 발효에 적절한 것으로 확인될 수 있었다.

부피 생산성의 최대화를 위한 온도 및 pH의 최적화. CHO-푸린 클론의 성능에 대한 pH 및 온도의 영향을 조사했다. "실험 방법 설계"를 사용해, 최대 부피 생산성을 낳는 조건을 확인하기 위해 상이한 온도들을 상이한 pH 값들과 결합시켰다. "도럴트 매트릭스(Doehlert Matrix)"에 따라 다섯 개의 온도를 세 개의 pH 값들과 결합시켜 도 5에 도시한 바와 같은 온도 및 pH의 일곱 개의 조합을 얻었다:

36.5 ℃ 및 pH 7.20의 조합이 중앙값으로 선택되었으며, 이를 두 개의 발효 롯트에 적용했다. 표 18은 상이한 발효 롯트에 사용된 배양 조건을 제시한다.

자료를 "미니탭(Minitab)" 소프트웨어를 사용해 반응 표면 분석법(RSM)으로 통계적으로 분석하였다. RSM은 몇몇 설명 변수와 1 이상의 반응 변수 사이의 관계를 조사했다. RSM의 주요 개념은 최적의 반응을 얻는데 일군의 설계된 실험을 사용하는 것이다. 분석은 부피 및 비생산성과 성장률에 초점을 두었다.

부피 생산성에 대한 자료 분석. 첫 번째 단계로서, 표면 플롯을 만들었다(도 6). 도 6에서 자료의 좌표는 점으로 표시했다. 표면은 단일 자료의 추정된 상관을 도시한다.

표면 플롯은 지표 온도/pH 및 반응하는 부피 생산성 사이의 선형 상관을 가정한다. 도표는 온도가 감소함에 따른 부피 생산성의 증가를 나타낸다. pH의 영향은 약한 것으로 고려된다. 이어진 계산은 자료의 선형 상관을 보여주었다(계산은 나타내지 않음). 분산 분석을 통해, pH, 온도 및 부피 생산성 사이의 상관을 기술하는 방정식을 만들었다.

P(생산성) = 7693.1-162.4*온도-202.8*pH

수학적 모델에 기초해 온도 및 pH의 부피 생산성에의 영향을 나타내는 윤곽 플롯을 생성했다(도 7). 점들은 실험적으로 시험된 조건(pH/온도)을 나타낸다.

윤곽 플롯은 최대 부피 생산성이 기대될 수 있는 영역이 35.1 ℃ 및 대략 7.10의 pH에서임을 보여준다. 두 값 모두는 실험 디자인의 가장자리에 있고, 이는 실제 최대가 심지어는 그들 값들 아래에서 발견될 수 있음을 의미한다. 추가로 윤곽 플롯은 pH의 부피 생산성에의 영향이 거의 없으며 낮은 pH값에서 약간 더 높음을 보여준다.

수학적 모델의 3 차원 도시인 표면 플롯(도 8)은 윤곽 플롯과 동일한 결과를 제공한다(부피 생산성에의 온도의 강한 영향 및 pH의 약한 영향).

성장률 μ에 대한 자료의 분석. 성장률과 온도 및 pH의 상관은 2차 방정식으로 기술된다. 역시, 온도의 강한 영향과 pH의 약한 영향을 발견할 수 있다. 성장률의 큰 변동은 수학적 모델의 설계를 방해한다. 분산 및 회귀의 분석은 아래의 방정식을 제공한다:

P = -103.539 + 5.706*온도 - 0.079*온도² - 0.233*pH - 0.020*pH²

0.99로 계산된(계산은 나타내지 않음) pH-표현에 대한 P-값에 의해 나타내지듯이 pH의 성장률에의 영향은 통계적으로 확인할 수 없다.

표면 플롯(도 9)은 모델화된 상관을 3차원적으로 도시하며 2차적 관계를 나타내고 36.5 ℃에서 최대 성장률을 보인다.

자료의 분석은 부피 생산성(도 10)에 대해 보여진 바와 유사한 비생산성과 온도 및 pH의 상관을 보여준다. 상관은 선형 방정식으로 기술된다. 분산 분석(계산은 나타내지 않음)에 의해 증명된 바와 같이 pH의 영향은 이번에도 낮다:

qP(비생산성) = 4261.40 - 93.35*온도- 93.77*pH

요컨대, 온도 및 pH의 최적화를 위한 실험 및 이어진 자료의 분석은 꽤 분명한 결과를 주었다. 공정 최적화에 가장 중요한 지표로 여겨지는 가장 큰 부피 생산성은 가장 낮은 온도(35.1 ℃) 및 가장 낮은 pH(7.10)에서의 배양에 의해 달성되었다. pH의 영향은 통계적으로 거의 없고, 7.10 내지 7.30의 pH값은 매우 유사한 결과를 줄 것이다. 온도를 37 ℃에서 35.1 ℃로 낮춤으로써, 부피 생산성은 대략 200 kU/L/일에서 2.7배 더 큰 540 kU/L/일로 증가될 수 있었다(도 11). 이들 결과에 기초해, 케모스텟 모드에서 CHO-푸린 클론의 배양을 위한 온도 및 pH의 새로운 설정 지점을 35.1 ℃ 및 7.15로 결정했다.

케모스텟 모드 및 회분식 재공급 모드의 비교. 낮은 온도(35.1 ℃)의 케모스텟 모드 내 CHO-푸린 클론의 배양은 작은 규모의 실험(1.5 L, 2.5 L, 10 L 및 32 L)에서 높은 수득률을 주었고, r푸린의 생산을 위한 큰 규모의 배양에 적절한 배양법으로 고려되었다. 그러나, 큰 규모(PP1 시설 내의 1200 L 생반응기)에서의 초기의 발효 실행은 케모스텟 모드에서 성장률의 큰 감소를 보였다. 대안으로서, 더 높은 성장률을 얻기 위해, 큰 규모에서 회분식 재공급 모드를 설정했다. 10 L 생반응기 규모에서 실험을 수행해 케모스텟 모드와 회분식 재공급 모드에서의 성장 및 생산성을 비교했다. 36.5 ℃에서 7.15의 pH에서 및 20 %의 pO₂에서 세포를 배양했다. 매 두 번째 배양일 마다 배치를 0.6-0.7x10⁶ 세포/mL의 세포 수로 분할했다.

동일한 세포 배양을 종균으로 사용해 케모스텟- 및 회분식 재공급-발효를 동시에 수행했다. 세포를 6일까지 케모스텟 모드에서 배양했다. 그 후 하나의 발효 실행(FUR_06_50-F03)을 회분식 재공급 모드로 변경한 반면 다른 것(FUR_06_51-F04)은 케모스텟 모드로 계속했다. 회분식 재공급 모드에서의 배양은 배치의 마지막에 2.22x10⁶ 세포/mL의 평균 세포 수를 생성했고, 성장률은 0.64 일^-1(표 20)이었다. 케모스텟 모드에서는, 0.50 일^-1의 성장률과 1.67x10⁶ 세포/mL의 평균 세포 수를 얻었다. 회분식 재공급 모드에서 더 높은 세포 수 및 성장률 때문에, 부피 생산성도 더 컸다(238 대 197 kU/L/일).

자료는 회분식 재공급 모드가 10 L 규모에서의 CHO-푸린 클론의 배양 방법에 바람직함을 나타내며 이는 심지어는 케모스텟 모드에서보다 약간 더 높은 부피 생산성을 가져온다(36.5 ℃ 및 7.15의 pH에서). 그러나, 회분식 재공급 모드에서는, 포집 및 추가의 하류 공정이 특정한 간격으로 제한되는 반면 케모스텟 모드에서는 포집이 연속적으로 수행될 수 있다. 따라서, 각 방법이 자신의 장점을 갖는다. 배치 마지막에서의 최적의 세포 수 또는 최적의 분할비와 같은 회분식 재공급 모드의 지표에 대한 최적화 실험은 수행하지 않았다.

규모 증대 조사. 상이한 교반 속도에서 러쉬톤(Rushton) 유형 대 공(ball) 유형 임펠러(impeller)의 비교. 교반기 유형의 성장률 및 생산성에의 영향을 조사했다. CHO-푸린 클론으로의 실험을 위한 생반응기에 사용된 표준 설정은 러쉬톤 임펠러 및 네 개의 배플 판을 포함했다. r푸린 생산을 위한 1,000 L 생반응기는 임의의 배플 판 없이 세 쌍의 공 임펠러가 장착되었다. 그에 따라, 10 L 생반응기 내에서 세 개의 상이한 설정을 시험하기 위한 실험을 수행했다: 하나의 반응기는 표준 설정을, 다른 반응기는 두 쌍의 공 임펠러를 장착했고 배플 판은 갖지 않았으며, 세 번째 반응기는 표준의 것과 유사하게 조립되었으나 교반 속도가 170 rpm에서 90 rpm으로 줄어들었다.

표 21은 생반응기 설정의 개관을 제공한다. 공 임펠러로의 60 rpm의 교반 속도는 90 rpm의 러쉬톤 임펠러와 유사한 선단부 속도를 제공했다(표 21 참조). 그러나, 임펠러들의 상이한 기하학적 구조(모양, 지름)로 인해 선단부 속도들은 서로 동일시될 수 없다.

발효 조건은 다음과 같았다: 37 ℃, pH 7.15, 20 %의 pO₂ 및 6-7 %의 pCO₂(배지: 4,65 g/L Glc, 1,5 g/L NaHCO₃). 발효 자료의 비교는 표준 설정을 가진, 즉 러쉬톤 임펠러가 장착되고 170 rpm의 속도로 교반된 생반응기에서의 성능이 다른 설정을 가진 생반응기에서보다 더 높음을 보여주었다(표 22). 60 rpm에서 공 임펠러의 사용은 170 rpm에서의 러쉬톤 임펠러에 비해 약간 더 낮은 성장률(0.57 대 0.61 일^-1), 더 낮은 부피(197 대 227 kU/L/일)를 가져왔다. 그럼에도 생육성은 거의 영향을 받지 않았다. 170 rpm 대신 90 rpm의 교반 속도에서 러쉬톤-임펠러 교반된 생반응기를 사용하는 것은 성장률(0.54 대 0.61 일^-1), 부피 생산성(175 대 227 kU/L/일) 및 세포 비생산성(115 대 138 U/106 세포/일)을 분명하게 감소시켰다.

이들 실험으로부터의 자료는 60 rpm의 공 임펠러 및 감소된 교반 속도의 러쉬톤 임펠러 모두가 170 rpm의 러쉬톤 임펠러에 비해 CHO-푸린 클론의 감소된 성능을 가져옴을 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 결과는 또한 CHO-푸린 클론의 배양에 공 임펠러를 사용하는 것이 가능함을 나타냈다. 시험된 설정들 중, 170 rpm의 러쉬톤 임펠러 더하기 네 개의 배플 판을 가진 설정이 가장 나쁜 조건을 보였다. 그러나 명백히 이들 조건 하에서 세포 생육성의 감소는 관찰되지 않았고, 이는 조사된 CHO-푸린 클론의 높은 기계적 저항성을 나타낸다.

32 L 생반응기 내 경사진 블레이드 임펠러로의 상이한 교반 속도의 비교. PP1 내의 GMP 실행 회전 ORFURFB07002을 위해, 생반응기(작업 부피 950 L)에 전에 사용된 공 유형 임펠러 대신 경사진 블레이드 임펠러 유형(2 pcs., d=700 mm)을 장착시켰다.

이 회전 중 2일 회분식 재공급 주기를 수행했다. 전의 회전과 비교해 이 변화를 평가하기 위해, 32 L 생반응기에 유사한 유형의 경사진 블레이드 임펠러(1 편, d=140 mm)를 설치하고, PP1 시설로부터의 세포 현탁액 및 배지를 사용해 발효를 수행하여 비슷한 물질이 사용되도록 했다.

비슷한 회분식 재공급 공정을 수행했고, 여기서 0.5x10E06 세포/mL의 출발 세포 밀도로 2-3 개의 연속하는 2일 배치 주기를 시작했다. 실험은 2 개의 상이한 교반 속도, 즉 55 rpm 및 120 rpm에서 수행했다. 배양 조건은 PP1에서 사용된 배양 조건과 동일했다: pH-SP 7.15, 온도-SP 35.5 ℃, pO₂-SP 20 %. 마지막 배치로부터의 자료를 적응 후 각각의 교반 조건에 대해 비교했다.

실험은 다시 CHO 클론 #488-3의 비성장률에의 교반 조건의 영향을 보여주었다. 동일한 출발 세포 밀도의 적용 시, 증가하는 성장률은 배치의 마지막에 더 큰 최종 세포 밀도를 불러왔다. 부피 생산성은 276 kU/L/일에서 445 kU/L/일로(+61 %) 증가한 반면, 최종 세포 밀도는 30 %(1.95 대 1.5x10E06 세포/mL) 증가했다. 이들 결과는 증가된 교반 속도가 세포-비생산성에 긍정적인 영향을 가짐을 나타낸다.

약 200 kU/L/일의 평균 생산성을 낸 발효 실행이 주로 20 rpm의 적용된 낮은 교반 속도의 결과이며 임펠러 설계 그 자체에 의한 것이 아니라고 결론지을 수도 있다. 여기서, 교반 속도가 그에 따라 조절된다면 경사진 블레이드 임펠러가 수득률 >400kU/L/일을 낼 수 있음이 밝혀질 수 있다.

실시예 4: 재조합 푸린(r푸린)의 정제

이 실험은 r푸린의 여과 및 정제 방법을 제공한다. 모아진 세포 배양 상청액을 우선 심층 여과기(쿠노 제타플러스(Cuno Zetaplus) 여과기) 위에서 여과해 그들을 세포-부재 및 입자-부재가 되게 했고, 0.45 μm PVDF 여과기(폴 플루오로딘 II)에서 멤브레인 여과시켰다. r푸린을 함유하는 여과된 세포 배양 상청액을 그 후 10-50 범위의 농축 배수로 사토리우스(sartorius)로부터의 10 K PES UF 카세트(사토콘(Sartocon) PESU 1O kDa) 위에서의 한외여과에 의해 농축시켰다. 그 후 푸린 농축물(290-1700 단위/ml 범위의 푸린 활성을 가짐)을 <-60 ℃에서 분취액으로 저장했다.

VWF 성숙 공정에 사용하기 위한 더 균일한 r푸린 제제를 얻기 위한 노력으로 실험을 수행해 r푸린을 세포 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제했다. 부분적으로 정제된 r푸린 시약은 특성화 및 방출 시험에 사용하기에 더 쉽다. 그것은 또한 VWF 성숙 공정에서 감소된 CHO 숙주 세포 단백질의 존재를 가져왔다.

r푸린의 효과적인 결합을 위해 <5 mS/cm (RT)의 부하 전도성을 요구하는 이온 교환 수지 위에서의 정제 과정을 개발했다. 그 후 대략 500-300 mM NaCl의 이온 강도에서 1 단계 공정으로 용리를 수행했고 선별 과정 중, 300 mM NaCl 까지의 경사 용리를 적용했다(표 24의 개관 참조). 6.7(RT)의 완충액의 원래 pH는 7.5로 증가해 부하 중, 구체적으로 높은 단백질 부하 및 높은 선형 유동 속도에서 r푸린의 결합을 개선시켰다(표 25의 관련 완충액의 요약 참조). 작동하기 위한 패킹된 및 최대 유동 속도의 안정성에서 상이한 EMD TMAE(머크(Merck)) 및 캡토Q(지이 헬스케어(GE Healthcare)) 이온 교환 수지에서 정제 실험을 수행했다. 표 26에 요약된 분석 자료는 r푸린이 20-71 % 범위의 수득률로 세포 배양 상청액으로부터 362 배 이하로 농축될 수 있음을 보여준다. 용출액 풀 내의 r푸린 활성은 적용된 부하에 따라 639 단위/ml 내지 27651 단위/ml 사이였다. 용출액 내 CHO 불순물 수준은 10-134 ng CHO 단백질/단위 r푸린 사이의 범위에서 발견되었으며 캡토Q 수지에서 CHO 감소에 대해 약간 더 우수한 성능과 함께 12.3 이하의 감소율이 발견되었다.

요컨대, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 r푸린의 정제는 농축의 하나의 선택사항임이 밝혀졌으며, 이는 <-60 ℃에서 r푸린 시약의 보관에 중요하다. 추가로, 3-12 배의 약간의 CHO 감소는 VWF 제제 내의 CHO 단백질의 농도를 감소시키는데 중요하다.

실시예 5: r푸린의 농축, 정제 및 분석

본 실시예는 큰-규모 r푸린의 농축 및 정제(즉, 하류 공정)에 사용되는 다른 방법을 기술한다. 이와 같은 공정 방법은 한외여과, 투석여과 및 캡토-MMC 크로마토그래피를 포함하며, 이는 실질적으로 동물 단백질-부재인 r푸린의 생산에서 수행되었다. 이는 또한 단백질 농도, 비활성 및 숙주 세포 단백질 및 DNA에 의한 오염의 분석 방법을 기술한다.

한외여과. 상청액(케모스텟 회전 내 대략 800-1200 kg 및 RFB-회전 내 550-700 kg)을 세포로부터 분리하고 한외여과에 의해 35-45 L의 최종 부피로 농축했다. 농축 단계 중 한외여과/투석여과 시스템(UFS)의 지표 및 설정지점을 표 27에 나열한다.

투석여과. 농축 단계를 끝낸 직후, 잔류물의 투석여과를 시작했다. 투석여과 단계 중 UFS의 지표 및 설정지점을 표 28에 나열한다.

잔류물의 전도성이 2 mS/cm 미만으로 떨어졌을 때(UFS의 인라인 전도성 탐침으로 측정), 이 공정 단계를 끝냈다. 후속하는 정제 단계에서 r푸린의 크로마토그래피 겔에의 정량적 결합을 보장하기 위해 이 낮은 전도성이 요구된다. 투석여과 생성물을 옮겼고 1 M 아세트산 용액을 첨가함으로써 투석여과 생성물의 pH-값을 6.0으로 조절했다. 캡토-MMC 칼럼에 적용 전, 생성물을 실온(RT)에서 저장했다.

캡토-MMC 크로마토그래피. r푸린을 결합시키는데 및 투석여과 생성물로부터 거의 대부분의 오염물을 제거하는데 캡토-MMC 겔, 다봉 양이온 교환제를 사용했다. 크로마토그래피 겔의 평형 이후, 투석여과 생성물을 칼럼에 부하했다. 0.22 μm 여과기 캡슐을 설치해 투석여과 생성물의 온라인 여과를 수행했다. 추가의 크로마토그래피 단계를 표 29에서 나열하고 세부사항을 기술한다.

하류 공정에서, 문제가 관찰되지 않았다. 하류 공정 단계(여과, UF, DF)는 케모스텟 배양으로부터의 포집에 사용된 것과 동일한 조건에서 수행될 수 있었다. 91 %(ORFU06002 회전), 66 %(ORFU07001 회전) 및 84 %(ORFU07002 회전)의 평균 총 r푸린 활성 수득률을 달성할 수 있었다. UF-단계를 위한 출발 부피가 연속식 배양에 비해 다소 더 낮다는 사실에 의해,적은 변화만이 주어졌다. 이 변화는 정제된 생성물의 질에 영향을 주지 않았다(총 활성, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질의 자료 참조; 표 30 참조)

숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA 함량에 대한 세 개의 회전 모두의 평균 값은 각각 8.55 μg/ml(2.2-10.4 μg/ml 범위) 및 13.48 ng/ml(0.0-23.9 ng/ml 범위)의 약간 낮은 평균 최대값을 보였다(표 30 참조). 크로마토그래피 단계는 비오염을 0.35 ng CHO 단백질/U r푸린 활성(0.13-0.52 ng CHO 단백질/U 범위) 및 0.148 pg 숙주 세포 DNA/U r푸린 활성(0.0-0.365 pg DNA/U r푸린 활성 범위)의 낮은 평균값으로 감소시킬 수 있었다.

푸린 특성화. r푸린의 질 및 기능성을 아래의 생화학적/생물리적 방법으로 분석했다(표 31).

푸린 활성 분석. 정제된 r푸린 배치(캡토-MMC 용출액 풀)를 푸린의 효소적 활성에 대해 시험했다. 기질은 형광 아미노-메틸 쿠마린(AMC)기에 부착된 2 염기성 인지 서열을 함유하는 짧은 합성 펩티드이고, AMC는 절단(BOC-RVRR-AMC) 이후 방출된다. 방출된 형광기는 380 nm에서의 여기 및 이어진 435 nm의 방출광에서의 측정에서 검출가능하다. 1 활성 단위는 30 ℃에서 1 분당 1 pMol AMC의 방출로 정의된다.

발효 및 정제 효능에 따라, r푸린 활성의 측정값은 약 10000 U/ml 내지 약 100000 U/ml 초과까지의 범위였으며, 평균값은 대략 69000 U/ml였다(표 32, 표 33 및 표 34). 특히 케모스텟 회전 ORFU06002의 평균값(47737 U/ml)을 RFB 회전 ORFU07001 및 ORFU07002의 평균값(77653 U/ml 및 93178 U/ml)과 비교할 때, RFB 모드 회전에 대한 r푸린 활성의 증가가 관찰되었다. (전체적으로, r푸린 활성은 약 10000 내지 100000 U/ml 초과 범위였다; 모든 자료를 나타내지는 않음).

푸린의 비활성은 활성 U/μg 단백질로 표현한다(표 32-34 참조). 회전 ORFU06002에 대한 평균 비활성은 269 U/μg 단백질이었고, 각각 ORFU07001에 대해 500 U/μg 및 ORFU07002에 대해 563 U/μg으로 증가했다. (전체적으로, 비활성은 124-620 U/μg 단백질 범위였다; 자료는 나타내지 않음). 그에 따라, 케모스텟 모드에서 생산된 배치에 비해 더 높은 RFB r푸린의 촉매적 활성의 결과로 두 RFB 회전에 대해 비활성이 배가되었다.

푸린-사용-시험 활성. 프로-VWF를 성숙 rVWF로 가공하는 r푸린의 효능을 정량화하기 위해 푸린-사용-시험을 설계했다. 성숙화 효능은 1 VWF 항원 단위의 성숙화에 요구되는 푸린 단위의 양으로 표현된다(U 푸린/U VWF). 기질은 현재의 제조 공정에 따라 파일럿 규모에서 정제되었으나, 푸린 성숙화 및 수퍼로즈(Superose) 6에서의 최종 정제 단계가 생략된 프로VWF/VWF 제제이다. rVWF 기질 농도는 100 U Ag/ml(F8HL_24_01 UF02-R)였다.

샘플의 네 개의 희석액을 1 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내에서 시험해 예컨대 0.25-2.0 U/U VWF의 비푸린 농도를 포함시켰다. 반응 및 희석 완충액은 pH 7.0의 100 mM 헤페스, 1 mM CaCl₂였으며, 성숙화 실험은 약간의 교반 하에서 37 ℃에서 16 시간 동안 수행했다. 인큐베이션 후, SDS-샘플 완충액을 첨가하고 샘플을 >90 ℃에서 5 분 동안 가열함으로써 효소적 반응을 중단시켰다. 그 후 은 염색을 사용한 8 % 겔 위에서의 분리된 폴리펩티드의 SDS-PAGE에 의해 샘플을 분석했다. 그 후 겔의 시각적 검사에 의해 평가시 >95 %의 성숙화 효능을 얻기 위해(프로VWF 밴드는 성숙 VWF 밴드에 비해 5 % 미만으로 나타나야 한다) 요구되는 비푸린 활성이 보고되었으며 시험된 r푸린의 품질 특성으로 사용되었다.

시험된 모든 r푸린 배치에서 프로 VWF에 대한 우수하고 일관된 성숙화 활성이 발견되었다. 회전의 평균값은 1.0 U 푸린/U WVF:Ag 이하이며 모든 경우에 성숙화도는 95 % 초과이다(표 35-37). 모든 r푸린 배치의 성숙화 활성은 비슷하며 회전 ORFU06002, ORFU07001 및 ORFU07002의 계산된 평균값에 따르면 케모스텟 모드 및 RFB-모드에서 생산된 r푸린 사이에 차이를 거의 발견할 수 없다.

푸린 SDS-PAGE 및 은 염색. 모든 r푸린 배치에 대해 은 염색을 사용하는 8 % SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행해 일관된 질을 보장했으며 불순도를 시각화했다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 회전 ORFU06002 및 ORFU07002의 캡토-MMC 용출액의 밴드 무늬는 높은 정도로 상관된다; 모든 샘플들은 대략 60 kDa에서 두드러진 푸린 밴드를 보인다. 배치 MMC01 내지 MMC08로부터의 회전 ORFU06002의 샘플에서 약간 더 낮은 푸린 밴드 분자량의 경향을 볼 수 있다(도 12, 1-8 레인). 이들 배치의 샘플을 후속하는 은 염색을 사용하는 SDS-PAGE에서 이 경향이 더 이상 보이지 않도록(자료는 도시하지 않음) 탈글리코실화했고, 이는 회전 ORFU06002 중, r푸린이 진행중인 발효 과정중 약간 상이하게 또는 더 낮은 정도로 글리코실화된다는 가정을 뒷받침했다. 이 경향은 RFB 회전 ORFU07002에서는 관찰되지 않았고, 이는 전체 회전 동안 r푸린의 일정한 글리코실화를 제안한다. ORFU06002 및 ORFU07002로부터의 배치 내의 불순물은 거의 완전히 동일했다; 그러나, RFB-모드 회전 ORFU07002로부터의 샘플은 회전 ORFU06002의 샘플에서 특히 굉장히 풍부한 폴리펩티드인 40 kDa 영역에서 덜 강한 밴드를 보였다.

SDS-PAGE 웨스턴 블롯. 단일클론 안티-푸린 항체를 사용하여 모든 샘플에 대해 웨스텃 블롯 분석을 수행했다(도 13). ~60 kDa에서 두드러진 밴드를 푸린 밴드로 확인할 수 있었고 이는 모든 샘플에서 발견되었다. 샘플들의 유사성이 매우 높다. 밴드 강도의 약간의 변동은 샘플 내 푸린 농도의 차이에 기인한다. 전체적으로, SDS-PAGE 분석은 케모스텟 및 RFB 모드에서 생산된 r푸린의 유사성을 분명히 나타낸다.

종래의 SDS-PAGE을 뒷받침하기 위해, 회전 ORFU06002 및 ORFU07002의 샘플에 대해 등전 집속(IEF)을 수행했다. 수직 IEF를 사용해 pH 7.0 내지 pH 3.0에서 IEF를 수행했다. 쿠마쉬 염색 및 웨스턴 블롯 분석으로 폴리펩티드를 시각화했다. 회전 ORFU06002 r푸린 샘플의 IEF 및 후속하는 웨스턴 블롯은 푸린에 대해 특이적인 밴드 무늬를 제공했다(도 14 참조). pH 4.5 내지 pH 5.5 영역에서 7개 이하의 별도의 밴드를 확인할 수 있고, 5개 이상의 밴드가 모든 샘플에 존재한다.

시각화를 위해 쿠마쉬 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 사용해 회전 ORFU07002 샘플의 IEF를 수행했다. 쿠마쉬 염색은 특이적인 밴드 무늬를 나타내고 pH 4.5 내지 pH 5.5 범위에서 모든 샘플들은 최소 5개의 별도의 밴드를 보이며 8개 이하의 밴드를 확인할 수 있다(도 15, 3 레인).

웨스턴 블롯 분석(도 16 참조)은 이들 결과를 확증하며, 일부 샘플은 아마도 겔에서 블롯팅 멤브레인으로의 불완전한 단백질 이송 때문에 쿠마쉬 겔에서 보이는 모든 밴드를 보이지는 않는다(도 17 참조).

푸린 역상 HPLC. r푸린의 지문 무늬를 형성하기 위해 회전 ORFU06002 및 ORFU07003로부터의 샘플(캡토-MMC 용출액)을 C4 RP-HPLC으로 시험했다. 두 회전의 샘플의 피크 무늬를 비교했다(도 17 및 도 18 참조).

모든 시험된 샘플의 크로마토그램은 대략 13 분의 보유 시간에서 푸린으로 지정될 수 있는 특징적인 주피크를 보인다. 피크 높이는 샘플 내 푸린 농도와 크게 상관된다. 다른 단백질 불순물은 8 분 내지 17 분 범위의 작은 피크로 볼 수 있다. 회전 ORFU07002로부터의 모든 샘플들은 ORFU06002로부터의 것들보다 불순물로부터의 훨씬 더 적은 더 작은 피크를 보인다. RFB 모드 회전 ORFU07002에서 더 적은 수 및 줄어든 양의 불순물이 발견되므로, 이 사실은 SDS-PAGE1의 결과와 잘 일치한다

위에서 논의한 특성화 방법으로부터 얻은 분석 자료는 케모스텟 모드 및 RFB 모드에서 생산된 r푸린의 매우 우수한 유사성을 입증한다. 이용가능한 자료로부터 r푸린 질의 큰 차이를 발견할 수 없었으나, RFB 모드에서 생산된 r푸린 배치가 케모스텟 모드에서의 생산에 비해 더 높은 비활성 및 더 낮은 불순물을 보였다. 크로마토그래피 단계는 벌크 약물 물질(BDS) 내의 매우 낮은 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA 함량을 설명한다. RFB-발효 및 전체 하류 공정(여과, UF/DF, 캡토-MMC 크로마토그래피)으로 구성된 적어도 하나의 완전한 제조 과정이 예컨대, 단일 사용 생반응기(SUB) 시스템 내에서 r푸린의 상업적인 생산을 위해 실행되기에 더 쉬울 수 있다.

실시예 6: 안전성, 멸균성, 및 안정성 시험

본 실시예는 CHO 세포 뱅크의 질을 측정하고 유지하기 위해 수행된 안전성, 멸균성 및 안정성 시험을 기술한다. ICH-가이드라인 Q5D의 요구사항에 따라 멸균성/미코플라즈마에 대한 시험을 수행해야 한다. 해동된 세포의 평균 생육성과 세포 밀도 및 후속하는 배양의 성장률 측정에 의해 세포 뱅크의 질을 검사해야 한다.

세포를 바이러스적 안전성(표 38), 유전적 안정성(표 39) 및 동일성(표 40)에 대해 시험했다. 세포는 멸균성이며, 미코플라즈마가 없고, 외부 시약이 없고, 레트로바이러스가 없으며, MVM 바이러스에 대해 음성이고, 외래 바이러스에 대해 음성이며, 설치류 바이러스에 대해 음성이고, 돼지 및 소 바이러스가 없고 캐시 발리 바이러스(Cache Vallley virus(CW))가 없는 것으로 밝혀졌다.

FACS 분석으로 푸린 생산자/비생산자 비에 대해 세포 뱅크를 시험했다. 그들의 장기 안정성(시간 기간 동안 푸린을 생산하는 능력)에 대해서도 그들을 시험했다. 추가로, 생성된 동형에 대해 혈청-부재 조건 하에 생산된 분비된 푸린을 조사해야 한다. 모든 자료는 안정한 성장 및 푸린 생산이 이들 세포 뱅크를 사용해 달성될 수 있음을 나타내야 한다.

MCB/WCB로부터의 세포는 전체 생산 과정에 걸쳐 안정한 성장 및 푸린 발현을 보여야 한다.

본 발명은 발명의 실시에 바람직한 모드를 포함하도록 밝혀진 또는 제안된 특정한 실시예에 대해 기술되었다. 당업자는 본 개시 내용의 관점에서, 본 발명의 의도된 범위를 벗어남이 없이 예시된 특정한 실시예에 많은 변형 및 수정이 만들어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 속하는 그러한 변형 및 수정이 첨부된 청구 범위에 포함됨이 의도되었다.

Claims (17)

1. 막통과 구역 및 세포질 구역이 결여되어 있는 실질적으로 동물 단백질-부재인 재조합 푸린을 포함하고 400 U/μg 단백질 이상의 비활성(specific activity)을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 1.0 ng 단백질/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 단백질 또는 0.5 pg DNA/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하고, 혈청으로부터의 오염 단백질을 본질적으로 갖지 않는, 조성물.
2. 제1항에 있어서, 0.8 ng 단백질/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 450 U/μg 이상 활성의 재조합 푸린을 포함하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 500 U/μg 이상 활성의 재조합 푸린을 포함하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 550 U/μg 이상 활성의 재조합 푸린을 포함하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 0.6 ng 단백질/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하는 조성물.
7. 제1항에 있어서, 0.4 ng 단백질/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 단백질을 포함하는 조성물.
8. 제1항에 있어서, 0.4 pg DNA/U 푸린 활성 미만 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하는 조성물.
9. 제1항에 있어서, 0 내지 0.4 pg DNA/U 푸린 활성 농도의 숙주 세포 DNA를 포함하는 조성물.
10. 반복되는 유가식 공정 내의 혈청-부재 배지 내에서 막통과 구역 및 세포질 구역이 결여되어 있는 분비된 재조합 푸린을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 성장시키고; 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 또는 이들의 조합을 제거하기 위해 다봉 양이온 교환 수지 상의 상기 분비된 푸린을 결합시키고; 및 상기 다봉 양이온 교환 수지로부터 상기 분비된 재조합 푸린을 회수하는 것을 포함하는, 제1항의 조성물의 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 모든 혈청이 배지로부터 제거될 때까지 점점 줄어드는 혈청 농도를 갖는 배지 내에서 성장하도록 숙주 세포를 적응시키는 것을 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 숙주 세포를 혈청을 포함하는 배지 내에서의 성장으로부터 혈청-부재인 배지 내에서의 성장으로 이동시키는 것을 포함하는 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
14. 푸린 절단 부위를 포함하는 프로-단백질을 제1항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 프로-단백질로부터 프로-펩티드를 절단하여 성숙 단백질을 형성하기 위한, 푸린 절단 부위를 포함하는 프로-단백질 처리 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 성숙 단백질이 폰 빌레브란트 인자인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 성숙 단백질이 인자 VIII인 방법.
17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 조성물.

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