BRPI0821467B1 - Composição de furina recombinante, método para produzir a composição de furina recombinante, e, método para produzir uma proteína madura utilizando a composição de furina recombinante - Google Patents

Abstract

composição de furina recombinante, método para produzir a composição de furina recombinante, e, método para produzir uma proteína madura utilizando a composição de furina recombinante a presente invenção refere-se a furina recombinante (rfurina) e métodos para produzir rfurina. mais especificamente, a invenção refere-se a rfurina substancialmente livre de proteína animal e a métodos para produzir rfurina substancialmente livre de proteína animal.

Description

COMPOSIÇÃO DE FURINA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR A COMPOSIÇÃO DE FURINA RECOMBINANTE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA MADURA UTILIZANDO A COMPOSIÇÃO DE FURINA RECOMBINANTE [001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S.

No. 61/018.151, depositado em 31 de dezembro de 2007, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se genericamente a furina recombinante (rFurina) e a métodos para produzir rFurina. Mais especificamente, a invenção refere-se a rFurina substancialmente livre de proteína animal e a métodos para produzir rFurina substancialmente livre de proteína animal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] Proteínas ativas ou maduras estão usualmente presentes em quantidades muito baixas nos organismos vivos. Portanto, suas pro-proteínas ou pro-enzimas são preferivelmente ativadas in vitro contatando-as com enzimas de ativação (p. ex., proteases). As pro-proteínas (ou precursores da proteína) são proteínas inativas que tornam-se ativas por uma ou mais modificações postranslacionais e, em particular, pela clivagem de um propeptídeo da pro-proteína. Exemplos de pro-proteínas incluem, por exemplo, pro-insulina, protrombina, pro-von Willedebrand Factor (pro-VWF) e similares.

[004] O fator von Willbrand (VWF) é uma glicoproteína sanguínea, envolvida na coagulação. O VWF é deficiente ou defeituoso na doença de von Willebrand e está envolvido em um grande número de doenças, incluindo púrpura trobocitopênica trombótica, síndrome de Heyde e possivelmente síndrome hemolítica-urêmica. O VWF é uma glicoproteína circulando no plasma como uma série de multímeros variando de tamanho de cerca de 500 a

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20,.000 kD. As formas multiméricas de VWF são compostas de 150 kD de subunidades de polipeptídeo ligadas entre si por ligações dissulfeto. O VWF media a adesão plaquetária inicial ao sub-endotélio da parede do vaso danificado e se acredita que somente os maiores multíferos de VWF exibem atividade hemostática. Os multímeros de VWF tendo grandes massas moleculares são armazenados nos corpos Weibel-Pallade das células endoteliais e são liberados sob estímulo. O VWF liberado é então mais processado pelas proteases de plasma para resultar em formas de baixo peso molecular de VWF.

[005] Em humanos, a remoção do pro-peptídeo é quase completa, enquanto que, em linhagens de células mamíferas com um alto nível de expressão de VWF recombinante, este processo não é muito eficiente. Portanto, os sobrenadantes de cultura de célula de tais linhagens de células recombinantes usualmente compreendem uma mistura VWF maduro e precursores de VWF, como pro-VWF. A fim de obter-se VWF maduro, é portanto necessário converter os precursores de VWF, em particular proVWF, em VWF maduro. Este processo é usualmente conseguido clivando-se o pro-peptídeo com uma protease.

[006] Os métodos convencionais atuais produzem VWF maduro incubando sua pro-forma com proteases em uma fase líquida, por meio do que a própria maturação (isto é, a clivagem do pro-peptídeo da pro-proteína) ocorre em um estado não ligado em solução livre, ou como descrito, por exemplo, no WO 00/49047, imobilizando-se a protease em um veículo sólido, que é contatado e incubado com uma preparação compreendendo pro-VWF (vide, p. ex., WO 00/49047). Entretanto, estes métodos compreendem várias desvantagens em relação aos métodos de acordo com a invenção.

[007] Industrialmente, o VWF e, em particular, o VWF recombinante (rVWF) é sintetizado e expresso junto com o Fator VIII recombinante (rFVIII) em uma linhagem de célula de ovário de Hamster

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Chinês (CHO) engenheirada geneticamente. A função do rVWF co-expresso é estabilizar o rFVIII no processo de cultura da célula. O rVWF é sintetizado na célula na pro-forma, contendo um grande pro-peptídeo ligado ao término-N. Na maturação no retículo endoplásmico e aparelho de Golgi, o pro-peptídeo é clivado pela ação da furina de protease celular e a proteína madura é secretada como um homopolímero de subunidades idênticas, consistindo de dímeros da proteína expressa. Entretanto, a maturação é tipicamente incompleta, resultando em um produto compreendendo uma mistura de pro-VWF e VWF maduro.

[008] Publicações anteriores mostraram que a pro-VWF pode ser convertida em VWF madura por tratamento in vitro com furina ou proteases semelhantes a furina (Schlokat et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 24: 257267, 1996; Preininger et al., Cytotechnology 30: 1-15, 1999; e EP 0775750A). Em particular, EP 0775750A sugere a coexpressão da furina e VWF recombinantemente, de modo que a maturação do VWF possa ocorrer in situ.

[009] A furina recombinante (rFurina) transforma o pro-rVWF (fator de von Willebrand pro-recombinante) em rVWF por clivagem da ligação de peptídeo Arg741-Ser742. Esta etapa de maturação é parte de um processo de produção rVWF para o tratamento da Doença de von Willebrand Tipo B e parte do processo de manufatura para a meia-vida - Fator recombinante VIII (rFVIII-HL). A furina pertence à família das convertases de pro-proteína e é dependente do cálcio (Ca²⁺). A furina especificamente cliva a ligação de peptídeo terminal da arginina dentro de uma seqüência específica, contendo arginina nas posições -1 e -4. Esta sequência pode ser encontrada em numerosas proteínas humanas, mostrando que a furina representa um papel principal na maturação de numerosas pro-proteínas humanas.

[0010] A produção de proteínas ativadas é de alta importância clínica e diagnóstica. Por exemplo, as proteínas ativas ou maduras, como VWF maduro, podem ser usadas para controlar a coagulação sanguínea. A presente

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 12/86 / 74 invenção provê furina recombinante aperfeiçoada (rFurina) que é rFurina livre de proteína substancialmente animal para a subseqüente produção de proteínas ativadas. Mais especificamente, a presente invenção provê rFurina livre de proteína substancialmente animal, para transformar pro-VWF em VWF maduro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] A presente invenção provê furina recombinante (rFurina), que é furina recombinante livre de proteína substancialmente animal (rFurina), e métodos para produzi-la. Tal rFurina é substancialmente livre de outras proteínas que podem normalmente ser associadas com a produção de rFurina, tais como proteínas de soro e proteínas de célula hospedeira. Esta rFurina permite a subseqüente produção de proteínas maduras com alta atividade específica e alta pureza, sem efeitos colaterais associados com contaminante de proteína na preparação de rFurina. Mais especificamente, esta rFurina permite a produção de VWF maduro com elevada atividade específica e elevada pureza. Portanto, a invenção provê métodos para seleção e adaptação de células hospedeiras recombinantes para meio quimicamente definido, expressão de rFurina que é secretada para dentro do sobrenadante de cultura de células, e purificação da rFurina após a remoção das células.

[0012] A rFurina substancialmente livre de proteína animal da invenção inclui preparações ou composições de rFurina compreendendo proteína de célula hospedeira em uma concentração que varia entre cerca de 0,1 a 0,6 ng de proteína ou menos/Unidade atividade de furina ou entre cerca de 2 e 11 qg de proteína ou menos/ml e essencialmente faltando proteínas contaminantes do soro no meio de cultura. Em um aspecto, a rFurina substancialmente livre de proteína animal abrange preparações de rFurina compreendendo contaminar DNA de célula hospedeira em uma concentração entre cerca de 0 a 0,4 pg DNA ou menos/Unidade atividade de furina ou entre cerca de 0 e 24 ng DNA ou menos/ml e essencialmente sem proteínas

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 13/86 / 74 contaminantes do soro no meio de cultura.

[0013] A invenção inclui composições compreendendo furina recombinante substancialmente livre de proteína animal e uma atividade de pelo menos 10.000 U furina/ml e proteína de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 11 pg proteína/ml. Tais composições podem também compreender proteína de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 1,0 ng de proteína/U atividade de furina. Em um aspecto, a proteína de célula hospedeira é de uma célula CHO.

[0014] Em outro aspecto, a invenção inclui composições compreendendo furina recombinante substancialmente livre de proteína animal em uma atividade de pelo menos 10.000 U furina/ml e DNA de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 14 ng DNA/ml. Em vários aspectos, tais composições também compreendem DNA de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 0,5 pg DNA/U atividade de furina. Em aspecto, o DNA de célula hospedeira é de uma célula CHO.

[0015] A invenção também inclui composições compreendendo furina recombinante substancialmente livre de proteína animal em uma atividade de furina específica de pelo menos cerca de 100 U/pg e proteína de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 11 pg de proteína/ml. Tais composições podem também compreender proteína de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 1,0 ng proteína/U atividade de furina. Em um aspecto, a proteína de célula hospedeira é de uma célula de CHO.

[0016] A invenção inclui ainda composições compreendendo substancialmente furina recombinante substancialmente livre de proteína animal em uma atividade de furina específica de pelo menos cerca de 100 U/pg e DNA de célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 14 ng DNA/mol. Tais composições podem também compreender DNA de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 14/86 / 74 célula hospedeira em uma concentração menor do que cerca de 0,5 pg DNA/U atividade de furina. Em um aspecto, o DNA de célula hospedeira é de uma célula de CHO.

[0017] A invenção também inclui métodos de produzir uma composição compreendendo furina recombinante substancialmente livre de proteína animal descrita aqui. Tais métodos compreendem a etapa de adaptar as células hospedeiras para crescerem em meio com concentrações crescentemente mais baixas de soro, até todo o soro ser removido do meio. Em outro aspecto, os métodos compreendem a etapa de transferir a célula hospedeira do crescimento em meio compreendendo soro para crescimento em meio livre de soro. Em um aspecto exemplar, a célula hospedeira é uma célula de CHO.

[0018] A invenção inclui métodos de utilizar uma composição compreendendo furina recombinante substancialmente livre de proteína animal descrita aqui. Tais usos compreendem a etapa de contatar uma proproteína com a composição sob condições para clivar um pro-peptídeo da proproteína para formar uma proteína madura. A rFurina pode ser usada na formação de qualquer proteína madura de uma pro-proteina que seja clivada por furina. Em um aspecto, a proteína madura é o Fator von Willebrand. Em outro aspecto, a proteína madura é Fator VIII. Além disso, a invenção contempla que a rFurina da invenção é útil para processamento tanto in vitro como in vivo de qualquer pro-proteína que ela clive.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHOS [0019] Uma outra ilustração da invenção é dada com referência aos desenhos anexos, que são expostos abaixo nas Figuras 1 - 18.

[0020] A Figura 1 representa a construção da protease de rFurina ativa expressa em uma forma de realização da invenção. A construção de rFurina é truncada na extremidade do terminal-C em AA 577, para remover a transmembrana rica-Cys e domínios de citosol.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 15/86 / 74 [0021] A Fig. 2 representa um pedigree da geração do clone de CHO/rFurina #488-3.

[0022] A Fig. 3 mostra um pedigree da geração do clone de CHO/rFurina #289-20, [0023] A Fig. 4 expõe uma comparação da distribuição gráfica dos produtores de rFurina nas populações de célula de PMCB#01 E PMCB#04. 80,74% das células de PMCB#04 expressam rFurina; 74,06% das células em PMCB#01 expressam rFurina.

[0024] A Fig. 5 mostra uma “Matriz Doehlert”, em que as cinco temperaturas foram combinadas com três valores pH, resultando em sete combinações de temperatura e pH.

[0025] A Figura 6 mostra uma análise de plotagem de superfície dos dados em referência para a produtividade volumétrica. As coordenadas dos dados da Figura 6 são marcados como pontos. A superfície mostra a correlação assumida dos dados simples.

[0026] A Figura 7 mostra uma plotagem de contorno que ilustra a influência da temperatura e pH sobre a produtividade volumétrica. Os pontos indicam as condições (pH/temp.) que tinham sido testadas experimentalmente.

[0027] A Figura 8 mostra uma plotagem de superfície que é uma ilustração tridimensional demonstrando a forte influência da temperatura e a fraca influência do pH na produtividade volumétrica.

[0028] A Figura 9 mostra uma plotagem de superfície, que ilustra a correlação modelada tridimensionalmente; ela demonstra a relação quadrática e mostra claramente um máximo para a taxa de crescimento a 36,5 ^oC.

[0029] A Figura 10 expõe uma análise dos dados em referência para produtividade específica. Há uma correlação similar da produtividade específica com temperatura e pH, como visto para a produtividade volumétrica.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 16/86 / 74 [0030] A Figura 11 mostra que, diminuindo-se a temperatura de 37 ^oC para 35,1 ^oC, a produtividade volumétrica poderia ser aumentada de aproximadamente 200 kU/L/d para 500 kU/L/d.

[0031] A Figura 12 mostra SDS-page e coloração pela prata para rFurina. Os padrões de faixa dos eluados Capto-MMC de Campanha ORFU06002 e ORFU07002 correlacionam-se com um alto grau; todas as amostras mostram uma faixa de Furina proeminente a aproximadamente 60 kDa. Uma tendência para peso molecular ligeiramente menor das faixas dxe Furina é visível em amostras de Campanha ORFU06002 de batelatas MMC01 a MMC08 (Figura 12, alamedas 1 - 8).

[0032] A Figura 13 mostra a análise de Western blot de amostras utilizando um anticorpo anti-Furina monoclonal.

[0033] A Figura 14 mostra os padrões de faixa específicos para rFurina de focalização isoelétrica (IEF) e subseqüente Western blotting de amostras de rFurina da Campanha ORFU06002.

[0034] A Figura 15 mostra os padrões de banda específicos para rFurina de focalização isoelétrica (IEF) e subseqüente Western blotting de amostras de rFurina da Campanha ORFU07002.

[0035] A Figura 16 mostra os resultados da Western blot para rFurina pela focalização isoelétrica (IEF) e subseqüente Western blotting de amostras de rFurina da Campanha ORFU07002.

[0036] A Figura 7 mostra HPLC de fase inversa de Furina, para amostras de Campanha ORFU06002 (eluados Capto-MMC). As amostras foram testadas com C4 RP-HPLC a fim de estabelecer um padrão de impressão digital para rFurina.

[0037] A Figura 18 mostra HPLC de fase inversa de Furina para amostras da Campanha 0RFU07002 (eluados Capto-MMC). As amostras foram testadas com C4 RP-HPLC a fim de estabelecer um padrão de impressão digital para rFurina.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0038] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento e produção de uma linhagem de célula hospedeira recombinante, que é capaz de crescer em meio livre de soro e secretar furina recombinante ativa (rFurina) para dentro do sobrenadante de cultura de célula. A linhagem de célula hospedeira selecionada para transfecção de um plasmídeo codificando furina recombinante está em um aspecto da mesma como usada para expressão de Fator VIII recombinante e VWF recombinante. A rFurina resultante é então purificada de modo que seja substancialmente livre de proteína animal.

[0039] A Furina, também conhecida como PACE, PACE4, PC1/PC3, PC4 e PC5/PC6 pertence ao grupo das proteases de serina semelhante à subtilisina, que representam um papel importante na clivagem de proproteínas, especialmente na síntese secretória (Van de Ven et al.., Crit. Rev. Oncogen. 4:115-136, 1993). As pro-proteins são pós-translacionalmente, intracelularmente processadas em sua forma madura pela protease endógena no aparelho de Golgi. O sítio de clivagem da protease compreende uma seqüência de reconhecimento que é caracterizada pela seqüência amino ácida Arg-X-Lys/Arg-Arg. A furina da protease cliva pro-proteínas especificamente após esta seqüência de consenso (Hosaka et al., J. Biol. Chem. 266:1212712130, 1991).

[0040] As seqüências de DNA e amino ácido da furina humana e de murino, bem como outras proteínas com função de protease semelhante a subtilisina, foram identificadas (Roebroek et al., Mol. Biol. Rep. 11: 117-125, 1986; Roebroek et al., EMBO J. 5:2197-2202, 1986; Barr et al., DNA Cell Biol. 10:319-328, 1991; Van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 17:7101-7102, 1989; Van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18:664, 1990; Smeekens et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2997-3000; Smeekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88; 340-344, 1991; Kiefer et al., DNA Cell Biol. 10: 757, 1991; Nakayama et al., J. Biol. Chem. 267:5897-5900, 1992; e

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Hatsuzawa et al., J. Biol. Chem. 265: 22075-22078, 1990). O gene da furina humana codifica uma proteína consistindo de 794 amino ácidos, certas funções sendo alocáveis a regiões características individuais: um centro catalítico, um domínio mediano, uma região rica em cisteína, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático (Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen. 4:115-136, 1993). Em um aspecto, o polipeptídeo da furina humana e exposto no GenBank Acesso No. EAX02111 (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD). Entretanto, o trabalhador de habilidade comum na arte apreciará que qualquer proteína tendo atividade biológica de furina, isto é, a capacidade de clivar pro-proteínas (p. ex., pro-VWF para produzir VWF madura), pode ser produzida pelos métodos descritos aqui.

[0041] A furina intacta é incorporada dentro do sistema de membrana do aparelho Golgi, onde ela é funcionalmente ativa (Bresnahan et al., J. Cell Biol. 111:2851-2859, 1990). Um forma truncada da furina nativa superexpressa de 75 - 80 kD poderia ser detectada no sobrenadante de célula como proteína secretada (Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9378-9382, 1990). Esta furina naturalmente secretada é conhecida como “furina vertida” (Vidricaire et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 195:1011-1018, 1993) e é clivada N-terminalmente da parte da transmembrana (et al., J. Cell Biol. 127:1829-1842, 994).

[0042] A furina truncada por engenharia genética, em que a parte de codificação da transmembrana e os domínios citoplásmáticos foram deletados, pode também ser expressa e secretada correspondentemente. Tais deleções N-terminais foram descritas para os aminoácidos 714-794 (Leduc et al., J. Biol. Chem. 267:14304-14308, 1992, Molloy et al., J. Biol. Chem. 267:16396-16402, 1992); para os amino ácidos 716-794 (Sol-PACE) (Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993; e Rehemtulla et al., Blood 79:2349-2355, 1992); e para os amino ácidos 705-794 (Hatsuzawa et

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 19/86 / 74 al., J. Biol. Chem. 267:16094-16099, 1992). Os mutantes da Furina, adicionalmente compreendendo uma deleção da região rica em cistina, foram também descritos (Hatsuzawa et al., J. Biochem. 101 :296-301, 1992; Creemers et al., J. Biol. Chem. 268:21826-21834, 1993).

[0043] A atividade endoproteolítica da furina e sua seletividade para os amino ácidos básicos foi primeiro determinada em experimentos com fator pro-von Willebrand (pro-vWF). Pro-vWF consiste de um propolipeptídeo com 741 amino ácidos e fator von Willebrand (pro-vWF). Pro-vWF consiste de um propolipeptídeo com 741 amino ácisos e fator von Willebrand (vWF) com 2050 amino ácidos (Verweij et al., EMBO J. 5:1839-1847, 1986). A liberação de vWF maduro de pro-vWF resulta de uma clivagem proteolítica após Arg763. A transfecção do cDNA de pro-vWF em vetores de expressão eucarióticos resulta na produção de quantidades equimolares do pro-vWF de 360 kD e do vWF maduro de 260 kD no sobrendante da cultura de células. vWF é provavelmente processado em sua forma madura em células transfectadas, por furina ocorrendo endogenamente (Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9378-9382, 1990, Van de Ven et al., Mol. Biol. Rep. 14:265-275, 1990).

[0044] Entre pro-proteínas adicionais que são clivadas pela furina ou pelas enzimas semelhantes a subtilisina, respectivamente, está uma série de hormônios e fatores de crescimento (p. ex., proactivina A, fator de crescimento de hepatócito), proteínas de plasma (albumina, fator VII, fator IX, fator X), receptores (pro-receptor da insulina), proteíns virais (p. ex. HIV1 gp160, hemaglutinina do vírus da influenza) bem como proteínas bacterianas (toxina da difteria, toxina antrax) (Decroly et al., J. Biol. Chem. 269:12240 - 12247, 1994; Stieneke-Grober et al., EMBO J. 11: 2407 - 2414, 1992; Barr, Cell 66: 1 - 3, 1991, Wasley et al., J. Biol. Chem. 268: 8458 8465, 1993; Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10277 - 10281, 1992; Tsuneoka et al., J. Biol. Chem. 268:26461-26465, 1993; Bresnahan et

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 20/86 / 74 al., J. Cell. Biol. 111: 2851 - 2859, 1990; Hosaka et al., J. Biol. Chem. 266: 12127 - 12130, 1991; e Vey et al., J. Cell. Biol. 127: 1829 - 1842, 1994). A rFurina da presente invenção é contemplada para uso em clivar estas proproteínas também.

[0045] Por co-expressão das sequências de ácido nucleico codificando a furina intacta e uma pro-proteína de culturas de células eucarióticas, um aumentado processamento das pro-proteínas foi conseguido in vivo. Isto foi demonstrado, p. ex., para o pro-fator IX (Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993) e para pro-vWF (WO 91/06314; Van de Ven et al., MoI. Bio. Rep. 14: 265 - 275, 1990; e Rehemtulla et al., Blood 79: 2349 2355, 1992). A presente invenção contempla que a rFurina da invenção é útil para processamento tanto in vitro como in vivo de qualquer pro-proteína que ela cliva.

[0046] Além da co-expressão da furina intacta com pro-proteínas, a furina truncada foi expressa junto com pro-proteínas. Os mutantes de deleção da furina foram demonstrados como enzimaticamente ativos quando coexpressos in vivo e como secretados; a atividade enzimática de tais mutantes de deleção poderia ser detectada inter alia no processamento do profator IX (Wasley et al., J. Biol. Chem. 268:8458-8465, 1993) e pro-vWF (Rehemtulla et al., Blood 79: 2349-2355, 1992). Os experimentos de coexpressão com mutantes de deleção da furina mostraram que a transmembrana e as partes citoplasmáticas da proteína não são essenciais para a função catalítica (Rehemtulla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 82358239, 1992).

[0047] A WO 91/06314 descreve a expressão recombinante da furina em células procarióticas e eucarióticas, a preparação das proteínas de fusão da furina, mutantes de deleção e fragmentos, a purificação da furina recombinantemente preparada e o uso potencial de furina purificada para o processamento de proproteínas in vitro em geral. O WO 92/09698 descreve a

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 21/86 / 74 expressão de PACE (furina), a co-expressão com precursores inativos de proteínas, tais como, p. ex., pro-vWF, bem como a preparação de proteínas de fusão. Stieneke-Grober et al. (EMBO J. 11: 2407 - 2414, 1992) descreve a clivagem in vitro da proteína HA do vírus da influenza por meio da furina purificada. Decroly et al. (J. Biol. Chem. 269: 12240 - 12247, 1994) descreve a clivagem in vitro de HIV gp 160 por meio da furina.

[0048] Em experimentos com furina encurtada terminalmente-C, a clivagem da pro-albumina e complemento Pro-C3 (Oda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 1353 - 1361, 1992), da toxina antraz (Limpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10277-10281, 1992), da toxina da difteria (Tsuneoka et al., J. Biol. Chem. 268: 26461-26465, 1993) e do pro-fator IX (Waley et al., J. Biol. Chem. 268: 8458-8468, 1993, Bristol et al., Biochemistry 33: 14136 - 14143, 1994) foi realizada com sucesso in vitro.

[0049] A rFurina da presente invenção, portanto, é contemplada para uso no processamento in vivo e in vitro das pro-proteínas como descrito acima. Em um aspecto, a rFurina da invenção é especialmente útil no processamento in vitro de pro-vWF e pro-fator IX. Entretanto, seu uso não é interpretado como limitado ao processamento de ditas proteínas. Em um outro aspecto, a rfurina da invenção é particularmente útil no processamento in vitro das pro-proteínas recombinantes.

[0050] Um outro aspecto da presente invenção é a co-cultura de células que expressam pro-vWF e rFurina. Assim, pro-vWF do sobrenadante da cultura de células é clivado in vitro em sua forma ativa pela rFurina que está também presente no sobrenadante da cultura de células. O vWF processado é subsequentemente isolado da cultura e purificado como discutido na Patente U.S. No. 6.210,929, incorporada aqui por referência. Para co-cultura, todos os sistemas de expressão comuns podem ser usados e vários sistemas para expressar pro-vWF e rFurina podem ser combinados entre si. Em um aspecto, um sistema de expressão é usado em que tanto pro

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 22/86 / 74 vWF como rFurina são expressos em células hospedeiras da mesma origem. [0051] A expressão “célula hospedeira” é usada para referir-se a uma célula que tenha sido transformada ou é capaz de ser transformada com uma sequência de ácido nucleico e então de expressar um gene selecionado de interesse. O termo inclui a progênie da célula mãe, quer ou não a progênie seja idêntica em morfologia ou em composição genética à precursora original, contanto que o gene selecionado esteja presente.

[0052] A invenção inclui quaisquer células hospedeiras ou hospedeiros conhecidos na arte para produção de proteína recombinante. Portanto, as células da presente invenção podem ser derivadas de qualquer fonte. Em um aspecto, a invenção inclui células hospedeiras eucarióticas e procarióticas. Em outro aspecto, a invenção inclui células vegetais, células animais, células anfíbias, células aviárias, células de insetos e células de levedura. Em um aspecto, células de levedura exemplares incluem Pichia, e.g. P. pastoris, e Saccharomyces e.g. S. cerevisiae, bem como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, K. Zactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, e K. marxianus; K. yarrowia; Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Neurospora, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus, A. nidulans, A. niger, Hansenula, Candida, Kloeckera, Torulopsis, e Rhodotorula. Células de insetos exemplares incluem Autographa californica e Spodoptera frugiperda, e Drosophila.

[0053] Em um outro aspecto, as células hospedeiras são células mamíferas, incluindo células epiteliais primárias (p. ex., ceratinícitos, células epiteliais cervicais, células epiteliais bronquiais, células epiteliais traqueais, células epiteliais de rins e células epiteliais retinais) e linhagens de células estabelecidas e suas cepas (p. ex., 293 células embriônics de rins, células BHK, células epiteliais cervicais HeLa e células retinais PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911, células CRFK, células MDCK, células CHO,

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 23/86 / 74 células BeWo, células de Chang, células Detroite 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células LS 180, células LS 174T, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células WISH, células BS-C-I, células LLC-MK2, células de clone M-3, células 1-10, células RAG, células TCMK-1, células Y-1, células LLC-PK₁, células PK(15), células GH₁, células GH3, células L2, células LLC-RC 256, células MH1C1, células HX, células MDOK, células VSW e células TH-I, B1 ou seus derivativos), células de fibroblasto de qualquer tecido ou órgão (incluindo mas não limitado a coração, fígado, rins, cólon, intestinos, esófago, estômago, tecido neural (cérebro, cordão espinhal), pulmão, tecido vascular (artéria, veia, capilar), tecido linfoide (glângula linfática, adenoide, tosila, medula óssea e sangue), baço e linhagens de célula de fibroblasto e semelhante a fibroblasto (p. ex., células de ovário de hamster chinês (CHO), células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células da citrulinemia, células de Dempsey, células Detroit 551, células Detroit 510, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MiCl₁, células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células Vero, células DBS-FrhL, células BALB/373, células F9, células SV-72, células MSV-BALB/3T3, células K-BALB, células BLO-11, células NOR-10, células C.sub.3H/IOTI/2, células HSDM₁, células KLN205, células McCoy, células camundongo L, células Cepa 2071 (Camundongo L), células cepa L-M (Camundongo L), células L-MTK (Camundongo L), clones NCTC 2472 e 2555, células SCCPSA1, células Swiss/3T#, células Indian muntjac, células SIRC, células C.sub.II e células Jensen ou seus derivativos).

[0054] As células mamíferas incluem variedades de CHO, BHK, HEK-293, NSO, YB2/3, SP2/0, e células humanas, tais como PER-C6 ou HT1080, bem como VERO, HeLa, COS, MDCK, NIH3T3, Jurkat, Saos, PC12, HCT 116, L929, LIk-, WI38, CV1 , TM4, W138, Hep G2, MMT, uma

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 24/86 / 74 célula leucêmica, uma célula tronco ou uma célula de ovo fertilizado. Em um aspecto da invenção, uma célula hospedeira exemplar é uma célula CHO. Em um outro aspecto da invenção, o meio é usado para cultivar células CHO em suspensão.

[0055] As células hospedeiras podem ser engenheiradas para expressar uma proteína em uma variedade de maneiras conhecidas na arte, incluindo mas não limitado a inserção de ácido nucleico exógeno codificando a proteína desejada, opcionalmente como parte de um vetor de expressão, inserção de uma sequência de controle de expressão exógena, de modo que causa expressão aumentada do gene endógeno das células hospedeiras codificando a proteína desejada, ou ativação da(s) sequência(s) de controle de expressão endógena das células hospedeiras para aumentar a expressão do gene endógeno codificando a proteína desejada.

[0056] Culturas de células hospedeiras podem ser preparadas de acordo com quaisquer métodos conhecidos na arte e métodos de cultivar tais células hospedeiras e recuperar a proteína recombinante produzida pelas células, quer das células ou meio de cultura, são conhecidos na arte. Tais métodos de cultura podem envolver adição de indutores químicos de produção de proteína para o meio de cultura. Células hospedeiras e procedimentos exemplares são descritos abaixo.

[0057] Um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de furina é inserido dentro de um apropriado vetor de expressão empregando-se técnicas de biologia molecular padrão. Em um aspecto, o ácido nucleico codifica o polipeptídeo de furina humano como exposto no GenBank Accession No. EAX02111 (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesta, MD), entretanto o trabalhador de habilidade comum na arte observará que qualquer proteína tendo atividade biológica de furina, isto é, a capacidade de clivar pro-VWF para produzir VWF maduro, pode ser produzida pelos métodos descritos aqui. Em um outro aspecto, uma

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 25/86 / 74 rFurina C-terminalmente truncada, totalmente secretada foi projetada deletando-se nucleotídeos codificando os amino ácidos 578 a 794, compreendendo os domínios ricos em cistina, da transmembrana e os citoplásmicos. Em um ainda um outro aspecto, uma cauda de amino ácidos pode ser adicionada para auxiliar nos processos de purificação. Em ainda outro aspecto, uma cauda de 10 resíduos de histidina foi adicionada após o amino ácido 577, com ou sem quatro resíduos de glicina interjacentes, servindo como um ligador flexível.

[0058] Os vetores de expressão opcionalmente podem incluir um promotor, uma ou mais sequências intensificadores, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência de íntron completa contendo um sítio de junção doador e aceitador, uma sequência codificando uma sequência líder ou de sinal para secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação de ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligadora para inserir o ácido nucleico codificando o polipeptídeo a ser expresso e/ou um elemento marcador selecionável.

[0059] Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência codificando-“etiqueta”, isto é, uma sequência de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência codificando polipeptídeo de furina; a molécula de oligonucleotídeo codifica poliHis (tal como hexaHis), ou outra “etiqueta” tal como FLAG, HA (vírus influenza da hemaglutinina) ou myc, para os quais anticorpos comercialmente disponíveis existem. Esta etiqueta é tipicamente fundida ao polipeptídeo na expressão do polipeptídeo e pode servir como um meio para detecção ou afinidade de purificação do polipeptídeo da furina da célula hospedeira.

[0060] Vetores adequados incluem mas não são limitados em cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, porém observamos que o sistema vetor deve ser compatível com a célula hospedeira selecionada. Em

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 26/86 / 74 um aspecto, o vetor é um plasmídeo. Em um outro aspecto, o plasmídeo é vetor de clonagem baseado em PUC. Outros vetores que podem ser usados na invenção incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de solda, vetores de sequenciamento e vetores retrovirais. Os vetores contemplados pela invenção incluem mas não são limitados a microorganismos tais como bactérias transformadas com bacteriógrafo recombinante, plasmídeo, fagemídio ou cosmídeo, ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão viral (p. ex., baculovírus); sistemas de célula vegetal transfectado com vetores de expressão de vírus (p. ex., Vírus Mosaico da Couveflor, CaMV; Virus Mosaico do Tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão bacterianos (p. ex., Ti ou plasmídeo Ti ou pBR322; ou mesmo sistemas celulares de animais.

[0061] Os vetores de expressão de mamíferos tipicamente compreendem uma origem de replicação, um promotor adequado e também quaisquer sítios de ligação de ribossomo necessários, sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores, sequências de terminação transcripcionais e sequências não-transcritas flanqueando 5'. Sequências derivadas de DNA do genoma viral SV40, por exemplo, os sítios de origem de origem de SV40, promotor prematuro, intensificador, de junção e poliadenação podem ser usados para prover os requeridos elementos de controle de expressão. Vetores eucarióticos exemplares incluem pcDNA3, pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene), psVK3, pBPV, pMSG, pSVL e pVITRO3.

[0062] O ácido nucleico pode ser transferido para dentro das células hospedeiras por qualquer meio conhecido na arte, p. ex., através de uma transferência mediada por lipossomo, transferência mediada por receptor (complexo de DNA-ligando), eletroporação, microinjeção de DNA, fusão de célula, DEAE-dextrano, cloreto de cálcio, precipitação de fosfato de cálcio,

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 27/86 / 74 bombardeio de micropartículas, infecção com vetores virais, lipofecção, transfecção ou recombinação homóloga.

[0063] O termo “transformado” ou “transfectado” como aqui usado refere-se a uma célula hospedeira modificada para conter um polinucleotídeo exógeno, que pode ser integrado dentro do cromossoma da célula hospedeira ou mantido em um elemento epissomal. É contemplado que em certos aspectos dos métodos providos, a célula hospedeira seja transfectada em uma ‘etapa de transfecção”. O método pode compreender multi-etapas de transfecção. Além disso, outros métodos conhecidos na arte para introduzir polinucleotídeos exógenos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, eletroporação e fusão celular, que não são tecnicamente “transformação”, estão dentro da definição do termo “transformação” para fins desta descrição.

[0064] A invenção também provê métodos para cultivar; isto é, desenvolver, células hospedeiras sob condições que resultam em expressão de proteína de rFurina. Tais métodos incluem a etapa de recuperar a rFurina produzida pelas células hospedeiras pelo meio de cultura. Em um aspecto exemplar, as células hospedeiras são cultivadas em um meio quimicamente definido, livre de soro. Em razão de o soro ser um material bioquimicamente indefinido, ele contém muitos componentes que não foram totalmente identificados, difere de lote para lote e é frequentemente contaminado com microorganismos, tais como vírus e microplasma, a presença do soro na produção recombinante de rFurina é indesejável. Além disso, a presença de proteínas animais no soro do meio de cultura pode requerer procedimento de purificação longos.

[0065] A invenção, portanto, fornece um meio de cultura bioquimicamente definido, essencialmente livre de proteína animal, para cultivar células recombinantemente transfectadas com um gene da furina humana. Os componentes do meio são na maior parte inorgânicos, sintéticos ou recombinantes e como tal não são obtidos diretamente de qualquer fonte

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 28/86 / 74 animal.

[0066] O meio de cultura de célula da presente invenção pode compreender um ou mais compostos de substituição e pode compreender um ou mais compostos de substituição que podem ser compostos de ligação metálicos e/ou podem compreender um ou mais complexos compreendendo um ou mais compostos de substituição. Em algumas formas de realização, o meio pode compreender um ou mais complexos, dito complexo compreendendo um ou mais elementos de transição ou seus sais ou íons complexados com um ou mais dos compostos de substituição que podem ser compostos de ligação-metálicos. Em algumas formas de realização, o meio é capaz de suportar a cultura de células in vitro e permitir transfecção de células cultivadas ali.

[0067] De acordo com um aspecto da invenção, um elemento de transição é preferivelmente selecionado do grupo consistindo de escândio, titânio, vanádio, cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco, ítrio, zircônio, nióbio, molibdênio, tecnétio, rubídio, ródio, paládio, prata, cádmio, lantânio, háfnio, tântalo, tungstênio, ósmio, irídio, platina, ouro, mercúrio e actínio, ou seus sais ou íons e é preferivelmente um sal de ferro. Sais de ferro adequados incluem mas não são limitados a FeCl3, Fe(NO3)3 ou FeSO₄, ou outros compostos que contenham íons Fe⁺⁺⁺ ou Fe⁺⁺.

[0068] Os compostos de ligação metálicos do meio incluem quaisquer macromoléculas que possam interagir ou ligar-se com elementos de transição e facilitem sua absorção pelas células. Tais interação/ligação podem ser covalentes ou não covalentes por natureza. O composto de ligação metálico usado neste aspecto da invenção é preferivelmente selecionado do grupo consistindo de um poliol, um derivativo de hidroxipiridina, 1,3,5-N,N',Ntris(2,3-diidróxibenzooil)amino-metilbenzeno, ácido etilenodiamina-N,N'tetrametilenofosfônico, trissuccina, um sacarídeo ácido (p. ex., gliconato ferroso), uma glicosaminoglicano, ácido dietilenotriaminopentacético, ácido

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 29/86 / 74 nicotínico-N-óxido, ácido 2-hidróxinicotínico, 2,2’-bipiridina mono, bis ou trissubstituída, um derivativo de hidroxamato (p. ex., ácido acetoidroxâmico), um derivativo de amino ácido, deferoxamina, ferrioxamina, porfina básica de ferro e seus derivativos, DOTA-lisina, uma texafirina, uma safirina, um ácido poliaminocarboxílico, um ácido hidroxicarboxílico, um polietilenocarbamato, etil maltol, 3-hidróxi-2-piridina e IRC011. Em um aspecto, o composto de ligação metálico é um poliol tal como sorbitol ou dextrano e particularmente sorbitol, o composto de ligação metálico é um poliol tal como sorbitol ou dextrano e particularmente sorbitol. Em um aspecto relacionado, o composto de ligação metálico é um derivativo da hidroxipiridina, tal como 2idroxipiridino-N-óxido, 3-hidróxi-4-pirona, 3-hidroxipipirid-2-ona, 3hidroxipiri-2-ona, 3-hidroxipirid-4-ona, 1-hidroxipirid-2-ona, 1,2-dimetil-3hidroxipiri-4-ona, 1-metil-3-hidroxipirid-2-ona, 3-hidróxi-2-(1H-piridinona, etil maltol ou piridoxal isonicotinil hidrazona. Os compostos de ligação metálicos da presente invenção podem também ligrem-se a cátions divalentes, tais como Ca++ e Mg++.

[0069] O meio de cultura da presente invenção pode compreender um ou mais ingredientes selecionados do grupo consistindo de adenina, etanolamina, D-glicose, heparina, um agente de tamponamento, hidrocortisona, insulina, ácido linoleico, ácido lipoico, vermelho de fenol, fosfoetanolamina, putrescina, piruvato de sódio, tri-iodotironina, timidina, Lalanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido Lglutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, Ltirosina, L-valina, N-acetil-cisteína, biotina, cloreto de colina, pantotenato-DCa . acido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, vitamina B₁₂, Plurônico F68, insulina recombinante, um sal de cálcio CuSO₄, FeSO4, FeCI3, Fe(NO3)3, KCl, um sal de magnésio, um sal de manganês, acetato de sódio, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, um sal de selênio, um

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 30/86 / 74 sal de silício, um sal de molibdênio, um sal de vanádio, um sal de níquel, um sal de estanho, ZnCb, ZnSO₄ ou outros sais de zinco, em que cada ingrediente é adicionado em uma quantidade que suporta cultura de célula in vitro.

[0070] Em outro aspecto, o meio de cultura da invenção pode opcionalmente compreender ainda um ou mais suplementos selecionados do grupo consistindo de uma ou mais citocinas, peptona de soja, um ou mais peptídeos de levedura e um ou mais peptídeos vegetais, (mais preferivelmente um ou mais de arroz, aloe vera, soja, milho, trigo, ervilha, abóbora, espinafre, cenoura, batata, batata doce, tapioca, avocado, cevada, coco e/ou feijão verde e/ou uma ou mais de outras plantas), p. ex., vide pedido internacional no. PCT/US97/18255, publicado como WO 98/15614.

[0071] O meio de cultura da presente invenção pode também opcionalmente incluir um ou mais agentes de tamponamento para manter um pH ótimo. Agentes de tamponamento adequados incluem mas não são limitados a ácodp N-[2-hidroxietil]-piperazina-N’-[ácido 2-etanossulfônico] (HEPES), MOPS, MES, fosfato, bicarbonato e outros agentes de tamponamento adequados para uso em aplicações de cultura de célula. Um agente de tamponamento adequado é um que provê capacidade de tamponamento sem substancial citotoxicidade para as células cultivadas. A seleção de agentes de tamponamento adequados está dentro do âmbito da habilidade comum na arte de cultura de células.

[0072] Os componentes dos meios descritos acima, quando misturados entre si em solução, formam um meio de cultura completo da presente invenção. Um meio completo é adequado para uso na cultura de uma variedade de células mamíferas, como descrito mais detalhadamente aqui. Com base na informação obtida aqui e o conhecimento possuído por aqueles de habilidade comum na arte, uma pessoa de habilidade comum na arte pode obter formulações de meios operativos sem indevida experimentação.

[0073] Inicialmente e antes da adaptação para crescimento em um

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 31/86 / 74 meio livre de soro quimicamente definido, as células hospedeiras podem sr cultivadas em meios padrão bem conhecidos de uma pessoa de habilidade comum na arte. Os meios usualmente conterão todos os nutrientes necessários para o desenvolvimento e sobrevivência das células. Meios adequados para cultivar células eucarióticas são meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (RPMI 1640), Meio Essencial Mínimo (MEM) e/ou Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM), DMEM/F12 e meio ExCell 325, todos os quais podem ser suplementdos com fatores de soro e/ou de crescimento, como indicado pela linha de célula particular sendo cultivada. Notavelmente, entretanto, a invenção provê que o soro dos meios seja então removido da cultura para obterem-se células hospedeiras que podem crescer em meio livre de soro. Assim, a invenção provê meios ótimos para cultivar células hospedeiras sob condições livres de soro para produção máxima de rFurina. Em um outro aspecto, as células são cultivadas em meio livre de soro em cultura de suspensão. Receitas para os vários meios da invenção são providas nos Exemplos aqui.

[0074] Em um aspecto, um antibiótico ou outro composto útil para crescimento seletivo de células transformadas é adicionado como um suplementos aos meios. O composto a ser usado será ditado pelo elemento marcador selecionável presente no plasmídeo com que a célula hospedeira foi transformada. Os marcadores selecionáveis que conferem resistência a medicamentos particulares que são ordinariamente tóxicos a uma célula animal podem ser usados nos métodos e composições da invenção. Por exemplo, onde o elemento marcador selecionável for resistência à canamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será canamicina. Outros compostos para crescimento seletivo incluem ampicilina, tetraciclina, geneticina, neomicina, zeomicina (zeo); puromicina (PAC); Blasticidina S (BlaS) e GPT. Marcadores selecionáveis adicionais são conhecidos na arte e úteis nas composições e métodos da invenção.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 32/86 / 74 [0075] As enzimas metabólicas que conferem sobrevivência das células ou induzem a morte das células sob condições prescritas podem também ser usados nos métodos e composições das invenções. Exemplos incluem mas não são limitados a: diidrofolato redutase (DHFR); timidina cinase (TK) do vírus do herpes simples, fosforibosiltransferase de hipoxatinaguanina (HGPTA) e fosforibosiltransferase de adenina (APTA), que são genes que podem ser empregados em células faltando TK, HGPTA ou APTA, respectivamente. O trabalhador de trabalhador de habilidade comum na arte apreciará, entretanto, que um produto de rFurina da invenção será essencialmente livre destas proteínas adicionadas.

[0076] O meio pode ser usado para cultivar quaisquer células hospedeiras ou hospedeiros conhecidos na arte para produção de proteína recombinante. Em um aspecto da invenção, uma célula hospedeira exemplar é uma célula CHO. Em um outro aspecto da invenção, o meio é usado para cultivar células de CHO em suspensão.

[0077] Quando a proteína recombinante de interesse é secretada para dentro do meio pelas células hospedeiras, o meio pode ser colhido periodicamente, de modo que as mesmas células hospedeiras podem ser usadas através de diversos ciclos de colheita. O meio de cultura pode ser adicionado em processo de batelada, p. ex., onde o meio de cultura é adicionado uma vez às células em uma única batelada ou em um processo de batelada alimentada, em que pequenas bateladas de meio de cultura são periodicamente adicionadas. O meio pode ser colhido no final da cultura ou diversas vezes durante a cultura. Processos de produção difundida continuamente são também conhecidos na arte e envolvem alimentação contínua de meio fresco para dentro da cultura, enquanto o mesmo volume é continuamente retirado do reator. As culturas difundidas geralmente obtêm mais elevadas densidades de célula do que as culturas de batelada e podem ser mantidas por semanas ou meses com colheitas repetidas. Assim, culturas

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 33/86 / 74 quimiostáticas e culturas reduzidas de tamanho são ambas adequadas para a manufatura de rFurina, como o são outros métodos de cultura conhecidos na arte.

[0078] Uma variedade de sistemas de cultura são conhecidos na arte, incluindo frascos-T, frascos de fiandeira e agitadores, frascos roletes e biorreatores de tanque agitado. O cultivo de frasco rolete é geralmente realizado por semeação de células dentro de frascos roletes, que são parcialmente enchidos (p. ex., até 10 - 30 % da capacidade) com meio e lentamente girados, permitindo que as células se fixem nos lados dos frascos e cresçam até a confluência. O meio celular é colhido por decantação do sobrenadante, que é substituído por meio fresco. As células dependentes da ancoragem podem também ser cultivadas em microveículo, p. ex., esferas poliméricas, que são mantidas em suspensão em biorreatores de tanque agitado. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em suspensão de célula única.

[0079] A quantidade de rFurina produzida por uma célula hospedeira pode ser avaliada usando-se métodos padrão conhecidos na arte. Tais métodos incluem, sem limitação, análise Western blot, eletroforese de gel de SDSpoliacrilamida, eletroforese de gel não-desnaturante, separação por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), imunoprecipitação, ELISA e/ou ensaios de atividade, tais como ensaios de mudança de gel de ligação de DNA. A invenção também contempla que a produtividade específica (expressa como quantidade de proteína/célula/dia) de rFurina possa ser avaliada usando-se métodos padrão, como sabido na arte e como descrito aqui.

[0080] “rFurina substancialmente livre de proteína animal” é definida como abrangendo preparações de rFurina compreendendo proteína de célula hospedeira em uma concentração que varia entre cerca de 0,1 a 0,6 ng de proteína ou menos/Unidade atividade de furina ou entre cerca de 2 e 11 pg de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 34/86 / 74 proteína ou menos/ml e essencialmente não tendo proteínas contaminantes de soro no meio de cultura. Em um aspecto, a rFurina substancialmente livre de proteína animal abrange preparações de rFurina compreendendo DNA de célula hospedeira em uma concentração que varia de cerca de 0 a 0,4 pg DNA ou menos/Unidade atividade de furina ou entre cerca de 0 e 24 ng DNA ou menos/ml e essencialmente não tendo proteínas contaminantes de soro no meio de cultura. Em um aspecto, as células hospedeiras expressando rFurina são cultivadas em um meio quimicamente definido, livre de soro. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em meio com soro e purificadas de acordo com métodos providos aqui.

[0081] As células hospedeiras expressando rFurina são cultivadas em suspensão em um meio livre de substâncias derivadas de animal (incluindo humano) sob condições quimiostáticas. As células são removidas por filtragem e a rFurina contendo sobrenadante de cultura de célula é concentrada por ultrafiltragem purificada por cromatografia de troca de íons, para resultar em uma solução de rFurina com uma atividade de pelo menos cerca de 1.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 2.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 3.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 4.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 5.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 6.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 7.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 8.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 9.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 10.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 15.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 20.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 25.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 30.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 35.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 40.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 45.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 50.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 55.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 60.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 65.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 70.000 Unidades/ml, de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 35/86 / 74 pelo menos cerca de 75.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 80.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 85.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 90.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 95.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 100.000 Unidades/ml,, de pelo menos cerca de 120.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 140.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 160.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 180.000 Unidades/ml, de pelo menos cerca de 200.000 Unidades/ml, and de pelo menos cerca de 500.000 Unidades/ml, e até mais do que 500.000 U/ml.

[0082] Em outro aspecto, a solução purificada da furina recombinante da invenção tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 10 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 20 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 30 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 40 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 50 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 60 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 70 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 80 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 90 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 100 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 120 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 140 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 160 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 180 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 200 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 250 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 300 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 350 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 400 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 450 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 500 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 550 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 600 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 650 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 700 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 750 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 800 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 850 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 900 U/gg de proteína, pelo menos cerca de 950 U/gg de proteína, e pelo menos cerca de 1.000 U/gg de proteína.

[0083] Em outra forma de realização, a solução purificada da rFurina

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 36/86 / 74 da invenção contém proteína de célula hospedeira em uma concentração de menos do que cerca 20,0 pg/ml, menos do que cerca de 19.0 pg/ml, menos do que cerca de 18.0 pg/ml, menos do que cerca de 17.0 pg/ml, menos do que cerca de 16.0 pg/ml, menos do que cerca de 15.0 pg/ml, menos do que cerca de 14.0 pg/ml, menos do que cerca de 13,0 pg/ml, menos do que cerca de 12,0 pg/ml, menos do que cerca de 11,0 pg/ml, menos do que cerca de 10,5 pg/ml, menos do que cerca de 10,0 pg/ml, menos do que cerca de 9,5 pg/ml, menos do que cerca de 9,0 pg/ml, menos do que cerca de 8,5 pg/ml, menos do que cerca de 8,0 pg/ml, menos do que cerca de 7,5 pg/ml, menos do que cerca de 7,0 pg/ml, menos do que cerca de 6,5 pg/ml, menos do que cerca de 6,0 pg/ml, menos do que cerca de 5,5 pg/ml, menos do que cerca de 5,0 pg/ml, menos do que cerca de 4,5 pg/ml, menos do que cerca de 4,0 pg/ml, menos do que cerca de 4,0 pg/ml, menos do que cerca de 3,5 pg/ml, menos do que cerca de 3,0 pg/ml, menos do que cerca de 2,5 pg/ml, menos do que cerca de 2,0 pg/ml, menos do que cerca de 1,5 pg/ml, menos do que cerca de 1,0 pg/ml, menos do que cerca de 0,5 pg/ml, menos do que cerca de 0,4 pg/ml, menos do que cerca de 0,3 pg/ml, menos do que cerca de 0,2 pg/ml, menos do que cerca de 0,1 pg/ml, e cerca de 0 pg/ml.

[0084] Em outro aspecto, a solução purificada de rFurina da invenção contém proteína de célula hospedeira em uma concentração de menos do que cerca de 1,0 ng proteína/U rFurin, menos do que cerca de 0,95 ng proteína/U rFurin, menos do que cerca de 0,90 ng proteína/U rFurin, menos do que 0,85 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,80 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,75 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,70 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,65 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,60 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,55 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,50 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,45 ng proteína/U rFurina, menos do que 0,40 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,35 ng proteína/U

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 37/86 / 74 rFurina, menos do que cerca de 0,30 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,25 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,20 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,15 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,10 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,05 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,04 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,03 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,02 ng proteína/U rFurina, menos do que cerca de 0,01 ng proteína/U rFurina, e cerca de 0 ng proteína/U rFurina.

[0085] Os exemplos aqui abaixo demonstram a invenção empregando-se células hospedeiras CHO para produzir rFurina, entretanto, o trabalhador de habilidade comum entenderá que qualquer tipo de célula hospedeira pode ser similarmente adaptado para produzir a rFurina da invenção. As células CHO foram largamente usadas na produção de proteínas recombinantes e as células CHO engenheiradas (aquelas em que uma linhagem de célula de CHO é transfectada com um gene produto e um gene marcador selecionável) são rotineiramente cultivadas em meio de cultura contendo soro. Entretanto, o uso de soro apresenta numerosos problemas. O soro é uma mercadoria cara, que não é prontamente disponível em quantidades requeridas para produção comercial. O soro é também um material bioquimicamente indefinido e contém muitos componentes que não foram totalmente identificados nem suas ações determinadas. Assim, o soro diferirá de batelada para batelada, possivelmente requerendo testar para determinar níveis dos vários componentes e seu efeito sobre as células.

[0086] Além disso, o soro é frequentemente contaminado com microorganismos tais como vírus e micoplasma, muitos dos quais podem ser nocivos, porém ainda representa um fator desconhecido adicional. Além disso, a presença de proteínas animais nos meios de cultura pode requerer longos procedimentos de purificação. Em particular, a presença de anticorpos bovinos na albumina de soro bovino (BSA) torna a purificação dos

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 38/86 / 74 anticorpos, desejados expressos pela linhagem de célula de CHO recombinante, extremamente difícil. A remoção do anticorpo de bovino do meio antes do uso é possível, porém esta remoção e o teste do produto adicional requerido após remoção aumenta grandemente o custo de produção do produto. Consequentemente, há benefícios na utilização de um meio de cultura desprovido de componentes animais, que suportarão o crescimento celular, especialmente de células de CHO. Embora as células de CHO não se desenvolvam prontamente em condições livres de soro, a presente invenção provê rFurina cultivada em células de CHO sob condições livres de soro.

[0087] As células CHO engenheiradas são também de difícil crescimento em suspensão. É altamente desejável obter-se crescimento em suspensão quando utilizando-se as células para expressar um produto como rFurina. Para a produção de tal proteína biológica em uma escala comercial, é desejável ser-se capaz de suportar o cultivo em fermentadores de um tamanho considerável. Um meio adequado é também necessário para suportar as células, de modo que elas possam crescer em condições de grande produção. Tais meios adequados são expostos nos Exemplos aqui. O trabalhador de habilidade comum na arte apreciará que quaisquer métodos de cultivar células na arte pode ser usado no cultivo de células hospedeiras compreendendo rFurina como exposto na invenção. Exemplos não limitantes de métodos de cultura são providos nos Exemplos aqui.

[0088] A invenção também fornece métodos de purificação que são realizados após as células serem cultivadas no meio livre de soro, para remover proteínas de célula CHO de rFurina. O trabalhador de habilidade comum na arte apreciará que quaisquer métodos de purificação de proteína na arte podem ser usados na purificação de rFurina do meio de cultura. Exemplos não-limitativos de métodos de purificação são providos nos Exemplos aqui. Por conseguinte, a rFurina que é essencial e substancialmente livre de toda proteína de origem animal pode ser produzida. A rFurina

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 39/86 / 74 substancialmente livre de proteína animal é opcionalmente armazenada congelada até uso.

EXEMPLOS [0089] Aspectos e detalhes adicionais da invenção serão evidentes pelos seguintes exemplos, que são destinados a ser ilustrativos em vez de limitantes. O Exemplo 1 descreve a construção de um plasmídeo de expressão de rFurina e transfecção de célula hospedeira; o Exemplo 2 descreve os processos de adaptar os clones de célula CHO expressando rFurina para cultivo em condições livres de soro; o Exemplo 3 descreve um processo de otimização para manufaturar rFurina em meio livre de proteína animal; o Exemplo 4 descreve a purificação de rFurina; o Exemplo 5 expõe o processamento a jusante (concentração e purificação) e análise da produção em grande escala de rFurina; e o Exemplo 6 demonstra o teste de segurança, esterilidade e estabilidade que é realizado para determinar e manter a qualidade do grupo de célula hospedeira.

EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DE FURINA RECOMBINANTE E TRANSFECÇÃO DE CÉLULA HOSPEDEIRA [0090] Uma descrição detalhada dos plasmídeos progenitores da furina usados para construir um plasmídeo de expressão de rFurina designado #556 é dada na Tabela 1. Expressa sob o controle de um promotor do citomegalovírus (CMV) constitutivo, a rFurina madura contém o domínio catalítico, o domínio P e uma pequena parte do domínio rico em cistina, enquanto que as regiões localizadas no terminal-C do amino ácido 577 são removidas, resultando em uma protease ativa totalmente secretada.

[0091] Uma descrição da construção do vetor DHFR usado como o plasmídeo de seleção é representada na Tabela 2. Para o desenvolvimento de clones de célula de CHO/rFurina expressando-se estavelmente, designados # 488-3 e # 289-20, as células CHO sem um gene DHFR endógeno funcional

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 40/86 / 74 foram co-transfectadas com plasmídeos # 556 e #73 empregando coprecipitação de fosfato de cálcio. Os clones secretando altos níveis de rFurina foram selecionados em diversas séries de subclonagem e amplificação, usando-se o sistema de seleção DHFR/MTX.

Tabela 1. Descrição da geração de plasmídeo de furina

Plasmídeo	Descrição	Comentários
#177	Plasmídeo original obtido de Wim J.M. van de Ven (Universidade de Leuven, Bélgica). Um plasmídeo baseado-pUC18, contendo o fragmento EcoRI de 4,0 kbp do cDNA da furina humana (2.385 kbp) com seqüências adicionais das regiões não transladadas-5’ e 3' (UTR).	Realizado na Universidade de Leuven, Bélgica
#180	Vetor de expressão de furina de comprimento total.	O fragmento Smal/Avrll de 2,8 kbp do plasmídeo #177, compreende o cDNA de furina completo (2.385 kbp) e em adição ~50 bp da UTR-5’ e ~400 bp da UTR-3’, foi clonado dentro do vetor de expressão # 55.
#55	Plasmídeo de expressão eucariótica da Clontech (Palo Alto, CA, USA) que foi modificado para conter um sítio de clonagem múltipla em vez do cDNA de β-galactosidase. O plasmídeo provê um promotor e intensificador de gene prematuro imediato de citomegalovírus humano (CMV IE), os sinais de união do genoma SV40 consistindo das seqüências doadoras e aceitadoras da junção 16s/19s do gene da proteína viral tardia e o sinal de poliadenilação SV40. O vetor original pCMVfl é um derivativo contendo o cDNA da galactosidase-β de E. coli ~3,4 kbp inserido dentro do sítio Notl.	O cassete-Notl da β-galactosidase foi removido e um sítio de múltipla clonagem foi inserido em vez de terse, entre outros sítios de restrição, também os únicos sítios para Smal e AvrlI.
# 229	Furina huymana faltando as seqüências da posição 578 a 794 abarcando as regiões rica em cisteína, da transmembrana e citoplásmicas. Após glicina 577, 4 glicinas adicionais como ‘espaçadoras” e 10 resíduos de histidina foram introduzidos.	Entre os sítios Saul e Avrll, um ligador de oligodesoxinucleotídeo recozido foi inserido codificando para 4 glicinas, 10 histidinas seguidas por um códon de parada.
#378	Derivativo de plasmídeo # 229. Furina truncada após glicina 577 contendo 10 histidinas porém sem 4 glicinas	Os 12 bps codificando para 4 glicinas localizados em um fragmento Saul I Hind III foram removidos por PCR. O fragmento modificado foi então religado dentro da cadeia principal do plasmídeo.’
#556	Derivativo de plasmídeo #378. Furina truncada após glicina 577, que é desprovida de quaisquer seqüências heterólogas.	Deleção de 30 bps codificando para os 10 resíduos de histidina por PCR. O fragmento Saul/Hind III foi relegado para dentro da cadeia principal de plasmídeo.

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Tabela 2. Descrição da geração de plasmídeo DHFR

Plasmídeo	Descrição	Comentários
#29	O plasmídeo original chamado pAdD26SV(A)3 foi obtido de H.J. Hauser (GBF, Braunschwig, Alemanha), Este plasmídeo contém o cDNA da redutase de diidrofolato de murino (DHFR) de comprimento total (DHFR) atrás do promotor tardio principal do adenovírus	Engenheirado fora de Baxter.
#73	cDNA-DHFR murino sob controle do promotor prematuro SV40	O fragmento Pstl compreendendo o cDNA DHFR e o sinal de poliadenilação SV40 do plasmídeo #29 foi clonado dentro do sítio Pstl do plasmídeo #53. Devido à estratégia de clonagem, o plasmídeo #73 contém dois sinais de poliadenilação.
#53	Vetor de expressão eucariótico de Clontech (Palo Altgo, CA, USA) que foi modificado para conter um sítio de múltipla clonagem em vez do cDNA de β-galactosidase. O plasmídeo provê um promotor e intensificador de gene precoce devírus simiano 40 (SV40), os sinais de junção de RNA do genoma SV40 consistindo das sequências doadoras e aceitadoras da junção 16s/19s do gene da proteína viral tardia e o sinal de poliadenilação SV40. O vetor original pSV40[l é um derivativo pUC19 contendo o cDNA de βgalactosidase de ~3,4 kbp de E. coli inserido dentro do sítio Notl.	O cassete Notl- de ^-galactosidade foi removido e um múltiplo sítio de clonagem foi inserido em vez de ter entre outros sítios de restrição também um único sítio para Pstl.

[0092] Células CHO transfectadas foram cultivadas em meio DHFR, composto de DMEM NUT MIX F12 (1:1) sem hipoxantina, timidina e glicina suplementadas com Hepes, L-glutamina, Penicilina-Estreptomicina e com 5% ou 10% de FBS gama-irradiado 5% ou 10% dialisado (= 5% DHFR, 10% DHFR). FBS dialisado e gama irradiado foi comparado da Life Technologies com documentação de certificados de análise completa, origem e irradiação. A preparação da solução de gama-tripsina (1 mg/ml) foi realizada em Baxter in Orth, Áustria, pelo departamento de Media Preparation/PCC.

[0093] Um pedigree da geração do clone de CHO/rFurina # 488-3 é representado na Figura 2. O clone cho/rFurina #488-3 foi obtido de clones iniciais que sofreram duas rodadas de subclonagem em meio de seleção de 10%”DHFR antes de entrar em amplificação em meio de seleção suplementado com 100 nM MTX em que uma rodada de subclonagem em meio contendo concentração de MTX não mudada foi realizada. O clone #448-3 foi expandido por congelamento. O clone CHO/rFurina # 289-20 foi

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 42/86 / 74 igualmente preparado e expandido. Entretanto, o clone #289-20 é um clone sucessor derivado do clone #488-3. Um pedigree da geração do clone CHO/rFurina # 289-20 é representado na Figura 3.

[0094] A atividade da furina foi medida no meio condicionado de clones, que foi cultivado por 24 h em meio DHFR livre de soro. Os clones de célula que apresentaram atividade elevada de furina (U/10⁶ células por 24 h) foram selecionados. Os clones elevados produtores selecionados foram expandidos para a preparação de ampolas de estoque de congelamento e usados para divisão para a próxima rodada de clonagem. O isolamento e identificação dos clones de células de alta produção foram realizados. As densidades das células foram analisadas usando-se o contador de célula Casy. Níveis de expressão de furina de até 200 - 300 U/10⁶ células por 24 h foram conseguidos para o clone # 488-3. Os níveis de expressão de furina de até 400 U/10⁸ células por 24 h foram conseguidos para o clone # 289-20.

EXEMPLO 2

ADAPTAÇÃO DOS CLONES DE CÉLULAS EXPRESSANDO FURINA RECOMBINANTE AO CULTIVO EM CONDIÇÕES LIVRES DE SORO [0095] A estratégia para adaptação e seleção de linhagem de célula é adaptar a linhagem de célula a uma linhagem de célula livre de soro e proteína gradualmente em uma diluição escalonada ou abrutamente. A finalidade deste estudo foi encontrar uma população de células CHO desenvolvendo-se sob condições livres de soro, que estava estavelmente produzindo rFurina. O clone de célula CHO #488-3 foi usado como material de partida. O clone de célula expressão rFurina CHO #488-3 foi mudado através de condições livres de soro em três adaptações conduzidas paralelas como exposto em detalhe abaixo.

[0096] O processo de depleção de soro começou em frascos de girar com o uso de microveículos, para encontrar um meio para reter células na fase de adaptação, uma vez que as células daquela fase usualmente mostram lento desenvolvimento. Utilizando-se este método, foi possível evitar-se, durante as

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 43/86 / 74 mudanças de meios subseqüentes, a diluição das células em tais concentrações em que o crescimento poderia ser inibido.

[0097] Três variantes de um meio desenvolvido em casa, BAP, BAS e BCS (como mostrado na Tabela 3) foram usadas durante o curso deste estudo.

Tabela 3: Formulações de meios em casa de BAP, BAS e BCS

Componentes	JDE Item No.	Concentração [g/kg]	BAP	BAS	BCS
DMEM/F12	0200437	11,745	X	X	X
L-Glutamina	0200444	0,600	X	X	X 1
Sal de sódio verleho fenol	0200425	0,008	X	X	X
Diidrocloreto de putrescina	0200233	0,0036	---	---	X
Heptaidrato de sulfato de ferro (II)	0200231	0,0006	---	---	X
Etanolamina	0200426	0,00153	X	X	X
Synperonic F68	0200172	0,250	X	X	X 2
Peptona de Soja	0200171	2,50	X		—
Bicarbonato de sódio	0301012	2,00	X	X	X
WFI (água para injeção)	F124	ad 1 kg	X	X	X

¹ Concentração de L-Glutamina em BCS: 0,900 g/kg ² Concentração de Synperonic F68 em BCS: 1,00 g/kg [0098] Dependendo da finalidade do respectivo experimento, estas variantes de meios fora providas com diferentes suplementos, como listado na

Tabela 4.

Tabela 4: Médias e seus suplementos

	Put1 (mg/l)	Glut 2 (mg/l)	Synp 3 (mg/l)	Fe 4 (mg/l)	Zn5 (mg/l)
ExCell 325PF CHO	---	600	---	---	1.0 ou 5.0
BAS	3.6	300	750	0.6	5.0
BCS	—	—	—	—	1.0 ou 5.0
1 Diidrocloreto d	e putrescina

² L-Glutamina ³ Synperonic F68 ⁴ Heptaidrato de sulfato de ferro(II) ⁵ Heptaidrato de sulfato de zinco (II) [0099] As seguintes tabelas fornecem um resumo dos meios e reagentes, que foram usados no curso deste estudo. A Tabela 5 resume os meios e reagentes que foram usados para o estabelecimento dos clones de banco de célula pré-master PMCB#01 e PMCB#04.

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Tabela 5: Meios e Reagentes Usados para o Estabelecimento de PMCB#01 e

PMCB#04

	Descrição	Número Lote
MEIOS	10% meio DHFR	#061005/09
BAP + 5% FBS	M/MAB-05/009, M/MAB-05/013
BAS+Put+Glut+Synp+Fe+5°/0 FBS	M/MAB-06/019 4
BAS+Put+Glut+Synp+Fe	M/MAB-06/012 1 M/MAB-06/017, M/MAB-06/031, M/MAB-06/036, M/MAB-06/044, M/MAB-06/048 4, M/MAB-06/058 4, M/MAB-06/061 4
BAS +Put+Glut+ Synp Zn +Fe+	M/MAB-06/C163, M/MAB-06/069, M/MAB-06/072, M/MAB-06/074 4, M/MAB-06/076 4, M/MAB-06/079 4
BCS+Zn	M/CLD-06/001
REAGENTES	Solução de Gama-Tripsina 1mg/m1	GT 04002 1
Tampão N1 pH 7,3	N1050012
Dimetilsulfóxido (Baxter Mat.No.: 33000000001/JDE 0200407)	219102
Veículo Citoporo 2	Cyt2 24 06 001 1
Na2[ ICCl·, - Solução	R/CBIJ05/005 1

¹ somente aplicado a PMCB#01 ⁴ somente aplicado a PMCB #04 [00100] A Tabela 6 resume os meios e reagentes que foram usados no curso da sub-clonagem e do estabelecimento dos correspondentes bancos de célula de avaliação (ECBs) dos sub-clones #488-3/CJ06-19/5F10 (5F10) e #488-3/CJ06-19/1E8 (1e8).

Tabela 6: Números de lote de meios e reagentes usados pra o estabelecimento de sub-clones 5F10 e 1E8

	Descrição	Número Lote
MEIOS	10% Anzuchtmedium DHFR	#061005/09
BAP+5% FBS	M/MAB-05/009, M/MAB-05/013
ExCell+5°/0 FBS+GIut	M/MAB-05/017
ExCell+Glut	M/MAB-05/016, M/MAB-05/022, M/MAB-06/025, M/MAB-06/035, M/MAB-06/054, M/MAB-06/057, M/MAB-06/060
ExCe11+GIut+Zn	M/MAB-06/067, M/MAB-06/071, M/MAB-06/104, M/MAB-06/142
ExCell+Glut/BAS+Put+Glut+Synp+Fe (1:1)	M/MAB-06/062
ExCell+Glut/BAS+Put+Glut+Synp+Fe+Zn (1:1)	M/MAB-06/070
ExCell+Glut/BCS (1:1)	M/MAB-06/077
ExCell+BCS+Glut+Zn	M/MAB-06/090, M/MAB-06/103, M/MAB-06/106
BCS+Zn	M/MAB-06/105, M/MAB-06/110, M/MAB-06/116, M/MAB-06/143, M/MAB-06/129, M/MAB-06/149
REAGENTES	Solução Gama-Tripsina 1 mg/ml	GT 04002 1
Solução Inibidora Tripsina 1mg/ml	TI 04001 1
Tampão N1 pH 7,3	N1 05001 2
Dimetilsulfóxido (Baxter Mat.No.: 33000000001/JDE 0200407)	219102
NaiHCOs - Solução	R/CBU05005

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 45/86 / 74 [00101] Os números de lote de todos os suplementos, que foram adicionados aos meios, são referenciados no apropriado protocolo de manufatura do correspondente meio. Outros meios aditivos são listados na

Tabela 7.

Tabela 7: Outros Aditivos de Meios

Descrição	Fabricante	Catálogo No.	Lote No.	Provido por
Aqua Bidest	Fresenius	B230673	SBV 093	Fabricante
Aqua Bidest	Fresenius	8230673	TDV 252	Fabricante
Aqua Bidest	Fresenius	B230673	TKV 261	Fabricante
Aqua Bidest	Fresenius	B230673	UCV 282	Fabricante
Veículo Citoporo 2	Pharmacia Biotech	17-1271-03	249933	Planta Piloto II
DMEM NUT MIX F12 2	Gibco	041-90163M	3097428	Linhagens de células recombinantes
ExCell 325PF CHO	JRH	14340	4N0597	Fabricante
ExCell 325PF CHO	JRH	14340	5L0191	Fabricante
ExCell 325PF CHO	SAFC Biosciences	14340C	5M0775	Fabricante
FBS 1' 2	Gibco	10603-017	3092829A	Linhagens de células recombinantes
FBS 1	JRH	12303	1A0348	Fabricante
Glutamina 2	Gibco	25030-024	3096452	Linhagens de células recombinantes
Glutamina	Sigma	G-5763	117 H 00655	Fabricante
Hepes-Puffer 2	Gibco	15630-056	3094125	Linhagens de células recombinantes
Paraformaldeído	Sigma	P-6148	043 K 0653	Fabricante
Paraformaldeído	Sigma	P-6148	045 K 0703	Fabricante
Paraformaldeído	Sigma	P-6148	118 H0987	Fabricante
Penic./Estreptomicina 2	Gibco	15140-122	1276184	Linhagens de células recombinantes
Putrescina	Sigma	P5780	22 K 2615	Fabricante
Synperonic F68	Serva	35724	01137	Fabricante
1 materiais derivados d	e animal: para certificados referir-se ao apêndice

² ingredientes de “meio 10% DHFR”, somente usado no início do experimento SF05-80.

[00102] A adaptação a condições livres de soro foi realizada em frascos-T ou em frascos de rotação em conjunto com retenção de célula (centrifugação e similares) por desabituação das células do soro de bovino fetal (FBS).

[00103] As culturas de suspensão em frascos-T fora incubadas a 36 ± 2 ^oC e 7,5 ±1,0 % CO2. A cultura em frascos de rotação foi realizada em giradores Bellco sem veículos operando a 36 ± 2 ^oC com 80 rpm e 130 rpm, respectivamente.

[00104] A subclonagem do clone de célula/rFurina #488-3,

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 46/86 / 74 subseqüente a sua adaptação às condições livres de soro, resultou em uma clonagem de célula CHO, desenvolvendo-se em suspensão em meio de casa livre de soro, estavelmente produzindo rFurina em uma grande quantidade. O procedimento foi baseado no método de diluição limitado. Resumidamente, a suspensão de célula foi diluída de modo que 100 ql da suspensão contém uma célula. Os poços de uma placa com 96-poços foi enchida com 100 ql desta suspensão. Em teoria, cada poço contém uma célula para desenvolvimento clonal. Quando estas células simples começam a crescer os clones se desenvolvem. Assim, cada célula recentemente gerada pode ser rastreada de volta para a primeira célula original do poço. Os clones foram expandidos em placas com 24-poços, em seguida em frascos T25, em seguida em frascos FT75 e então em frascos T175.

[00105] Durante a cultura, em controles do processo (IPC) foram realizados para monitorar as condições de crescimento e para medir a expressão da rFurina. As densidades durante a cultura foram medidas usandose o instrumento Casy. O instrumento contador de Núcleo foi aplicado para a detecção de núcleos de célula após extração CTX. A determinação da densidade de célula e a viabilidade após descongelamento foram realizados com o método de exclusão de azul de tripano, empregando-se um hemacitômetro. A densidade e viabilidade das células foram também analisados utilizando-se um método de exclusão de azul de tripano automatizado, realizado pelo instrumento Cedex.

[00106] Os sobrenadantes das culturas de célula foram usados para determinar a quantidade e atividade da rFurina expressa. A análise da classe de células ativadas por fluorescência (FACS) foi usada para ver a relação de células de produtor para não-produtor em uma dada população de célula. A morfologia e comportamento de crescimento das células foram determinados por controle óptico. Adicionalmente, o sobrenadante das culturas de célula foi também examinado para monitorar as condições do meio, tais como a

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 47/86 / 74 determinação do valor do pH e a concentração residual da glicose, glutamina, lactato e amônio. Estas análises foram realizadas por meio de um instrumento NOVA.

[00107] No curso deste estudo, dois bancos de células pré-master (PMCBs) PMCB#01 e PMCB#04 foram produzidos e duas linhagens de clone de célula foram estabelecidas como exposto abaixo. Os bancos de células de avaliação (ECB) (vide Tabela 15) foram também gerados. Preparação e teste QC de PMCB#01 [00108] Um frasco de CHO/rFurina #488-3 (ECB#01) foi descongelado nos aditivos contendo meio BAS (Put, Glut, Synp e Fé) e 5% FBS. As células foram cultivadas por 5 dias em T175. As células foram então adaptadas a condições livres de soro como exposto abaixo.

[00109] As células foram preparadas em 150 ml de meio de crescimento (BAS com Put, Glut, Synp e Fé) contendo 5% FBS, 0,2 g/l. Veículos de citoporo 2 foram usados para a adaptação a condições livres de soro. Tendo inoculado a suspensão de célula antiga de 5 dias resultando em uma densidade de célula de partida de cerca de 2,0 x 106 células/ml, as células fixaram-se aos veículos porosos dentro das primeiras horas. Assim, as células foram mantidas no frasco de rotação, enquanto o meio de crescimento foi trocado para reduzir a concentração de soro em duas etapas, de 5% a 3,8% a 0% no dia 05. Durante o seguinte período de cultura, as células adaptaram-se às condições do meio livre de soro. As células separaram-se da superfície dos veículos e continuaram seu crescimento em suspensão. A densidade das células e a viabilidade das células de suspensão aumentaram continuamente. Cada dois a três dias, as células em suspensão foram divididas em uma razão de 1:2.

[00110] Um banco de células de avaliação (ECB) foi então preparado. No dia da cultura 28, células tendo uma viabilidade maior do que 60% foram transferidas para um novo experimento. A cultura foi desenvolvida em meio

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BAS de 200 - 300 ml (com Put, Glut, Synp e Fe) em um girador Bellco sem veículos. De acordo com a densidade de célula CASY determinada, a cultura de suspensão foi dividida a cada dois a três dias a uma densidade de célula de partida de cerca de 2,0 x 105 células/ml. Após 16 dias, quando a cultura de célula alcançou uma viabilidade maior do que 80%, o banco de célula de avaliação (ECB), consistindo de seis frascos de células, foi produzido.

[00111] Um frasco do ECB foi descongelado em um novo experimento. As células foram cultivadas por quatro dias a T175 em meio BAS com Put, Glut, Synp, Fe e Zn. As células foram então transferidas para um rotador Bellco contendo até 600 ml de meio BAS com Put, Glut, Synp, Fe e Zn. Repetindo, cada dois a três dias a cultura de suspensão foi dividida em uma densidade de célula de partida de cerca de 2,0 x 105 células/ml. No dia de cultura 13, 143 ml da suspensão de célula foram removidos para a preparação de PMCB#01, consistindo de 20 frascos. As células foram expandidas e os testes de controle de qualidade foram realizados em PMCB#01.

Preparação e teste QC de PMCB#04 [00112] Um frasco da CHO/rFurina #488-3 (ECB#01) foi congelado em meio BAS contendo Put, Glut, Synp, Fe e 5% FBS. Metade da cultura com a idade de 6 dias foi transferida para um novo experimento para adaptação às condições livres de soro.

[00113] Aqui, a adaptação às condições livres de soro não foi realizada etapa por etapa, porém mais exatamente foi realizada abruptamente. Um frasco rotador Bellco foi preparado com meio BAS (com adição de Put, Glut, Synp e Fe) não contendo FBS e nenhum veículo. As células foram inoculadas com uma densidade de célula de partida de cerca de 2,5 x 10⁵ células/ml. Devido às repentinas condições livres de soro, o tempo de dobragem das células diminuiu a um nível um tanto baixo. Para evitar diluição das células a uma tal concentração, em que o cultivo poderia ser possivelmente inibido, o meio foi trocado girando-se para baixo a suspensão de célula. A pelota de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 49/86 / 74 célula foi ressuspensa em meio de crescimento fresco. As divisões de célula foram realizadas quando a densidade da célula era maior do que 4,0 x 105 células/ml. Após ter alcançado uma viabilidade mínima de cerca de 50% no dia de cultura 5, as células começaram a recuperar-se e, do dia de cultura 32 em diante, sua viabilidade aumentou para entre 85 - 90%. No dia de cultura 61, as células adaptadas foram congeladas como um ECB consistindo de 15 frascos.

[00114] Um frasco do ECB foi descongelado em um novo experimento em meio BAS livre de soro compreendendo Put, Glut, Synp e Fe. Após a cultura ter sido cultivada em frascos T175 por sete dias, ela foi transferida para um Rotador Bellco, onde as células desenvolveram-se por mais dois dias. Em seguida, a adição de Zn foi testada. Cerca de 100 ml da suspensão de células centrifugada foram ressuspensos em meio BAS livre de soro contento Put, Glut, Synp, Fe e Zn. A suspensão foi cultivada em um rotador Bellco. De acordo com a densidade de célula CASY determinada, cada dois a três dias a cultura de suspensão foi dividida em uma densidade de célula de partida de cerca de 2,0 x 10⁵ células/ml.

[00115] Para preparação do inóculo e para poder-se produzir uma grande quantidade de uma suspensão de célula homogênea para a geração de PMCB#04, a cultura de célula foi elevada gradualmente até 1.000 ml em um rotador Bellco. No dia da cultura 02, 465 ml da suspensão de células foram usados para produzir PMCB#04, consistindo de 20 ampolas. As células foram expandidas e os testes de controle de qualidade foram realizados em PMCB#04.

[00116] A Figura 4 expõe uma comparação da distribuição gráfica dos produtores de rFurina nas populações de célula de PMCB#01 e PMCB#04. 80,74% das células da rFurina expressa em PMCB#04. 74,06% das células de rFurina expressa em PMCB#01.

[00117] Subclones CHO/rFurina #488-3 CJ06-19/5F10 e CJ06-19/1ES

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 50/86 / 74 foram então gerados. Uma ampola do clone CHO/rFurina #488-3 foi descongelada e a cultura foi passada em uma frasco T175. No dia da cultura 17, três diferentes meios foram testados, meio BAP (desenvolvido por Baxter), CD-CHO (provido por Gibco) e ExCell 325PF CHO (provido por JRH), cada um deles continha 5% FBS. Após quatro dias de crescimento em frascos T175, as células cultivadas em meio ExCell foram adaptadas para condições livres de soro.

[00118] As células foram desabituadas do soro em pequenas etapas. O inteiro procedimento variou através de três experimentos. Primeiro, as células dependentes de ancoragem foram inicialmente cultivadas em frascos T175 em ExCell 325PF CHO contendo 5% FBS. O soro foi então lentamente reduzido a 0,5% no dia de cultura 13. Durante os próximos 13 dias de cultura, duas divisões foram formadas, em que a concentração de soro foi mais reduzida para 0,25% e a viabilidade diminuiu a menos do que 70%. As células perderam seu comportamento dependente de ancoragem, mostraram mais e mais formato esférico e começaram a desenvolver-se na suspensão.

[00119] A última etapa de redução de soro ocorreu em um Rotador Techne em meio de CHO 35PF ExCell, contendo 0,25% FBS e nenhum veículo. Após um período de cultura de 23 dias, a concentração do soro alcançou 0%. As células foram divididas e cultivadas para manter todos os parâmetros pertinentes em sua dada faixa. A densidade de célula moveu-se entre 0,15 a 0,9 x 106 células/ml. A viabilidade caiu para menos do que 40% durante a primeira semana, porém então retornou para valores maiores do que 90%. No dia de cultura 42, as células adaptadas foram congeladas em ECB/CJ06-20 consistindo de 20 frascos.

[00120] As células foram então subclonadas. Uma suspensão de célula foi diluída com CHO ExCell 325PF pré-condicionado de tal maneira que 100 pl da suspensão teoricamente continha 0,5 - 1,0 células. No experimento de subclonagem, cinco placas de 96 poços foram enchidas com 100 pl desta

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 51/86 / 74 suspensão de célula por poço. No dia após a semeação das células, os poços foram pesquisados quanto a células únicas sob o microscópio. Os poços contendo uma célula foram marcados e observados mais. A adição e troca de CHO 325PF ExCell pré-condicionado foi realizadas quando necessário. Quando a célula morreu ou na ausência de divisão celular durante as próximas duas semanas, o poço pertinente foi excluído do experimento.

[00121] Duas únicas células apresentaram crescimento. Os clones evoluíram, tendo alcançado um tamanho apropriado, foram transferidos para dentro de uma placa de 24 poços. Aqui, a troca de CHO 325PF ExCell précondicionado foi também realizada de acordo com o crescimento e as exigências da cultura. Os subclones CJ06-19/5F 10 e CJ06-19/1E8 foram transferidos para dentro de um frasco T25 no dia de cultura 07 e dia 10, respectivamente.

[00122] Os ECBs foram preparados em meio ExCell. Estes ECBs apresentaram o material fonte para mais investigações concernentes aos dois subclones, tais como uma readaptação de meios dispendiosamente comparados para uma formulação mais econômica, alto-desenvolvida por Baxter. O ECB do sub-clone CJ06-19/5F10, CJ06-42 foi expandido em meio CHO ExCell 325PF de um T25 a um T75, a um T175 e então para dentro um rotador Bellco. O ECB/CJ06-63, consistindo de 10 frascos, foi congelado de uma cultura de T175 no dia 21. O ECB do subclone CJ06-19/1E8, CJ06-43 foi também expandido em meio CHO 325PF ExCell. A cultura foi expandida de um T25 para um T75 para um T175 e então para dentro de um Rotador Bellco. ECB/CJ06-64, consistindo de 10 frascos foram congelados de uma cultura de T175 no dia 18.

[00123] Os ECBs (subclones 5F10 e 1E8) foram adaptados ao meio BCS como exposto abaixo. O subclone CJ06-19/5F10 do clone ECB CJ06-19 foi descongelado no experimento CJ06-66 e então adicionando-se o meio BCS ao meio Excell em um volume crescente, as células foram desabituadas

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 52/86 / 74 do meio ExCell e adquiriram a capacidade de crescer em meio BCS. O subclone CJ06-19/1E8 do clone ECB CJ06-129 foi simultaneamente adaptado ao meio BCS de uma maneira similar.

[00124] A Tabela 8 mostra todos os bancos de célula livre de soro, que foram preparados no curso deste estudo.

Tabela 8: Resumo de bancos de células livres de soro de rFurina expressando clone de célula CHO #488-3

	No. Teste:	Data	Nome	Densidade célula/Amp	Amp.	Meio	Contr. Descongelamento
PMCB#01	DE06-02	10.03.06	ECB/DE06-02	1,0 x 107	6	BAS+Put+Glut+Synp+Fe	ok
CJ06-73	12.05.06	PMCB#01	1,5 x 107	20	BAS+Put+Glut+Synp+Fe+Zn	ok
PMCB#04	CJ06-51	11.04.06	ECB/CJ06-51	1,2 x 107	15	BAS+Put+Glut+Synp+Fe	ok
SK06-65	12.05.06	PMCB#04	1,5 x 107	20	BAS+Put+Glut+Synp+Fe+Zn	ok
Sub-clones	CJ06-20	27.02.06	ECB/CJ06-20	1,1 x 107	20	ExCell + Glut	n.d.
CJ06- 63	14.04.06	Klon:CJ06-19/5F10 ECB/CJ06-63	1,0 x 107	10	ExCell + Glut	ok
SK06-58	10.05.06	Klon:CJ06-19/5F10 ECB/SK06-58	1,0 x 107	5	ExCell+Glut/BAS+Put+Glut+S ynp+Fe (1:1)	ok
SK06-83	19.06.06	ECB/SK06-83	1,5 x 107	15	ExCell+Glut/BAS+Put+Glut+S ynp+Fe+Zn (1:1)	ok
SK06 - 151	03.11.06	Klon:CJ06-19/5F10 ECB/SK06-151	1,0 x 107	5	BCS+Zn	n.d.
CJ06- 64	14.04.06	Klon:CJ06-19/1E8 ECB/CJ06-64	1,0 x 107	10	ExCell + Glut	ok
SK06-59	10.05.06	Klon:CJ06-19/1E8 ECB/SK06-59	1,0 x 107	5	ExCell+Glut/ BAS+Put+Glut+Synp+Fe (1:1)	ok
SK06-84	19.06.06	ECB/SK06-84	1,5 x 107	15	ExCell+Glut/BCS (1:1)	ok
SK06-152	03.11.06	Klon:CJ06-19/1E8 ECB/SK06-152	1,0 x 107	7	BCS+Zn	n.d.

[00125] Uma comparação de PMCB#01 E PMCB#04 e subclones

5F10 e 1E8 é exposta na Tabela 9.

Tabela 9: Comparação de PMCB#01, PMCB#04 e Subclones 5F10 e 1E8

População células	Experimentos	Período Avaliado	Média de valores de
Densidade de célula x [x106 células/ml]	Viabilidade [%]	Ativ. Furina [U/ml]	FACS [%]	μ (d 1	g [h]	qp [U/(106*d)]	Op [U/(ml*d)]
PMCB#01	CJ06-69	29.04.- 17.05.06	1,16	84,4	274,87	71,30	0,494	35,94	123,0	77,1
PMCB#04	SK06-49, SK06-63	26.04.- 17.05.06	1,10	94,4	287,03	72,02	0,614	28,52	207,7	96,8
Clone 5F10	CJ06-66 SK06-52	21.04.- 17.05.06	0,59	94,3	105,57	83,30	0,523	37,43	135,0	40,8
Clone 1E8	CJ06-67 SK06-53	21.04.- 17.05.06	0,59	94,8	95,55	88,34	0,512	39,01	114,4	35,7

[00126] As populações de células cultivadas nos experimentos CJ06

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69, bem como SK06-49 e SK06-63 representam as culturas precursoras das linhagens de célula para os PMCBs. Estas células foram cultivadas em meio BAS (com a adição de Put, Glut, Synp, Fe e Zn) e fora congeladas como PMCB#01 e PMCB#04, respectivamente.

[00127] Os subclones 5F10 e 1E8 foram cultivados no meio comercialmente disponível ExCell 325PF CHO provido por JRH. Em razão da capacidade de crescer em meio baseado na formulação BAS ter sido preferida, PMCB#01 E PMCB#04 foram escolhidos para mais produção de rFurina.

[00128] Como apresentado na Tabela 10, as células de PMCB#04 mostraram melhor comportamento de desenvolvimento em comparação com PMCB#01. As viabilidades e taxas de crescimento foram maiores em PMCB#04 e os tempos de dobragem de geração foram menores. A relação específica de célula bem como a de produção volumétrica de rFurina foi também maior por todo o período de tempo avaliado. Em um outro experimento, os dados concernentes às viabilidades foram confirmados. Uma ampola de cada um dos PMCBs foi descongelada em um frasco T175 contendo meio BCS com Zn como aditivo. Como mostrado na Tabela 10, a viabilidade de PMCB#04 foi novamente maior do que aquela de PMCB#01. Tabela 10: Experimentos de descongelamento de PMCB#01 e PMCB#04

População de células	Experimento	Densidade de célula [x 107 células/frasco]	Viabilidade [%]
PMCB#01	CJ06-77 [75]	1,05	68,7
PMCB#04	SK06-67 [76]	0,99	77,4

[00129] Assim, PMCB#04 foi escolhido como o material fonte para a futura produção de Banco de Células Master (MCB) de rFurina e todos os outros bancos de células funcionando (WCBs). PMCB#04 consistindo de 20 frascos foi estabelecido de acordo com os atuais Regulamentos de Prática de Tecido. O teste de controle de qualidade (QC) foi realizado de acordo com as solicitações de ICH-Guideline Q5D. PMCB#04 foi escolhido para produzir rFurina em processos de manufatura.

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46/74 [00130] O meio de crescimento é livre de substâncias derivadas de humano ou animal e é auto-desenvolvido. Tendo as células removidas por filtragem, o sobrenadante contendo rFurina é concentrada por ultrafiltragem. Após purificação por cromatografia de troca, a atividade da solução de rFurina é objetivada ser de pelo menos 200 Unidades de rFurina/ml.

[00131] O teste para micoplasma, vírus, agentes estranhos, esterilidade e eficiência de expressão foi realizado. Os critérios para seleção são elevada atividade de Furina (p. ex., proteína de Furina, ELISA) e homogeneidade da população celular em imunofluorescência (FACS), realizada em diferentes subclones, em comparação com os clones iniciais #488-3 e #289-20, respectivamente. Além disso, os perfis de impureza têm que ser comparados qualitativamente (p. ex., por padrões de pico-UV após HPLC RP ou por técnicas de PAGE-SDS/Coomassie).

EXEMPLO 3

OTIMIZAÇÃO PARA MANUFATURAR FURINA RECOMBINANTE EM MEIO LIVRE DE PROTEÍNA ANIMAL [00132] Este exemplo descreve o processo de desenvolvimento e otimização para a cultura do clone #488-3 de CHO expressando rFurina. Otimização de meio específico com respeito a concentração de amino ácidos, glicose e NaHCO3 foi realizada, que resultou em aumentadas taxas de cultivo e mais elevadas produtividades do processo de fermentação. A otimização para parâmetros de processo controlados em linha foi realizada com a formulação de meio otimizado para pO2 (10%, 20% e 50%) e um experimento factorial foi realizado para determinar o pH ótimo (faixa de 7,1 7,3) e temperatura (faixa de 35, 1 °C-37,9 °C), que resultou em uma melhoria de produção significativa para o clone CHO #488-3, quando a fermentação foi realizada em mais baixas temperaturas entre 35 - 36 °C.

[00133] Como possíveis modos de produção, as culturas quimiostáticas e culturas encurtadas por batelada foram comparadas, indicando que ambos os

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 55/86 / 74 tipos de processo são adequados para a manufatura de rFurina e dão produções comparáveis com ajustes de parâmetros idênticos. Experimentos específicos foram realizados para investigar a influência dos tipos e taxas de agitação em diferentes instalações de biorreator. Foi mostrado que as taxas de crescimento específico e taxas de expressão, densidades de célula e, portanto, produtividades volumétricas, são fortemente influenciadas por variações da instalação do biorreator e que sob condições de taxas de agitação aumentadas as produções poderiam ser significativamente aumentadas. Totalmente, a influência dos parâmetros principais do processo a montante de rFurina são bem caracterizados com respeito a seu efeito e um processo de alta produção poderia ser transferido para a planta piloto para manufatura pré-clínica e clínica. Os detalhes são expostos abaixo.

[00134] Um subclone #488-03 foi desenvolvido em casa, que foi adaptado para um meio livre de soro e de insulina. Os seguintes experimentos foram realizados em um meio livre de FBS e livre de insulina (méio BACD) como a formulação de meio básico (vide Tabela 11)

Tabela 11: componentes de meio básico (BACD-meio)

Componente	Concentração [g/kg]
DMEM/F12 (1:1)	11,76
L-Glutamina	0,6
Etanolamina	0,00153
Synperonic	0,25
Putrescina.2HCl	0,0036
FeSO4.7H20	0,0006
CuSO4.5H20	0,00000125
NaHCO3	2,0

[00135] A fim de melhorar o crescimento celular e para prover condições ótimas para propagação celular, uma análise de aminoácido do sobrenadante de uma cultura quimiostática foi realizada (vide Tabela 12). Como resultado, três amino ácidos essenciais foram adicionados ao meio, isto é, metionina (10 mg/l), leucina (40 mg/l) e fenilalanina (10 mg/l). A fermentação foi realizada em um biorreator 1,5 l a 37 ^oC, pH 7,15 e um pO₂ de 20%.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 56/86 / 74

Tabela 12; Análise de amino ácido por HPLC

Amino ácidos	BACD 24 06 014 026	FUR 06/10 M04 K06	FUR 06/10 M04 K07
	Área pico [%]	Área pico relativa [%]	Área pico relativa [%]
Ácido aspártico	100,00	24,04	9,88
Ácido glutâmico	100,00	57,78	24,89
Serina	100,00	14,37	15,35
Asparagina H2O	100,00	15,03	19,17
Glicina	100,00	103,55	90,58
Glutamina,	100,00	19,26	23,14
histidina	100,00	45,59	45,32
Treonina	100,00	63,09	61,39
Arginina	100,00	72,22	74,25
Alanina	100,00	1513,36	1518,46
Prolina	100,00	58,54	55,36
Tirosina	100,00	46,37	47,63
Cistina	100,00	53,43	56,39
Valina	100,00	42,75	42,11
Metionina	100,00	13,23	11,51
Isoleucina	100,00	48,39	48,79
Leucina	100,00	23,58	20,63
Lisina HCl	100,00	41,85	40,65
Fenilalanina	100,00	34,99	33,00
Triptofano %	100	69,1	68,8
BACD_24_08_014	_026... meio básico (materiais e métodos s.)

lote de fermentação, 6o. dia de cultura lote fermentação, 7o. dia de cultura

FUR_06/10_M04_K06... FUR_06/10_M04_K07...

A área de pico dos respectivos amino ácidos do diagrama-HPLC do meio básico foi ajustado a 100%. Por comparação com a área de pico obtida no dia 6 e 7 da cultura quimiostática, a diminuição do respectivo amino ácido foi determinada.

[00136] Devido a baixas concentrações de glutamina no sobrenadante da cultura, a glutamina foi adicionada ao meio (300 mg/ml) para fornecer uma concentração final de glutamina a 900 mg/l. Após a adição de glutamina ao meido, a taxa de cultivo aumentou de 0,55 d^-1 para 0,67 d^-1 (vide Tabelas 13 e 14). Pela adição destes três amino ácidos mencionados acima (isto é, metionina (10 mg/l), leucina (40 mg/l) e fenilalanina (10 mg/l)) ao meio, a taxa de cultivo das células pôde ser aumentada novamente (0,69 d^-1) (vide Tabela 15). A produtividade volumétrica subiu até aproximadamente 267 kU/L/d (= + 13%) e a produtividade específica mostrou um aumento de 16%. A suplementação do meio com glutamina, metionina, leucina e fenilalanina mostrou um efeito positivo no crescimento da célula e atividade volumétrica e específica e foi portanto retida para mais preparação do meio.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 57/86 / 74

Tabela 13: Dados de fermentação da cultura quimiotástica FUR_06/10-M04 do dia 6 ao dia 9 da cultura.

Experimento	glc	gin	pH	D	CC	p	Furina	P	qP
FUR 06/10-M04	[g/L]	[g/L]	NOVA	[1/d]	[1 E6/mL]	[1/d]	[IU/mL]	[klU/L/d]	[IU/C/d]*106
Dia 6-9	1,58	0,10	7,16	0,494	2,35	0,548	306,55	151	64

Tabela 14: Dados de fermentação da cultura quimiotástica FUR_06/10-M04 após a suplementação do meio com 300 mg/L de glutamina no dia 12.

Experimento	glc	gin	pH	D	CC	p	Furina	P	qP
FUR 06/10-M04-	[g/L]	[g/L]	NOVA	[1/d]	[1 E6/mL]	[1/d]	[IU/mL]	[klU/Ud]	[IU/C/d]*106
Dia 15-21	1,47	0,35	7,16	0,668	2,27	0,673	352,68	236	104

Tabela 15: Dados de fermentação da cultura quimiotástica FUR_06/10-M04 após a adição de metionina (10mg/l), leucina (40 mg/l) e fenilalanina (10 mg/l) no dia 22 ao meio.

Experimento	glc	gin	pH	D	CC	p	Furina	P	qP
FUR 06/10-M04-	[g/L]	[g/L]	NOVA	[1/d]	[1 E6/mL]	[1/d]	[IU/mL]	[klU/Ud]	[IU/C/d]*106
Dia 15-21	1,47	0,35	7,16	0,668	2,27	0,673	352,68	236	104
Dia 26-29	1,37	0,38	7,13	0,713	2,20	0,695	373,80	267	121

[00137] Para verificar se as quantidades suplementadas dos amino ácidos do meio eram suficientes, outra análise de amino ácido de uma cultura quimiotástica (10 L) foi realizada. A cultura tinha sido suprida com 300 mg/l de glutamina e as respectivas quantidades dos três amino ácidos. As amostras foram tiradas nos dia 7 e 15 da cultura e as condições de cultura eram similares àquelas mencionadas acima. Os resultados (vide Tabela 16, onde somente os dados para metionina, leucina e fenilalanina são mostrados) confirmaram que suficientes quantidades dos amino ácido suplementados estavam presentes na calda de fermentação.

Tabela 16: Quantidade relativa de metionina, leucina e fenilalanin a em uma cultura quimiostática (FUR 06/17_F04) suplementada com glutamina (300 mg/L), metionina (10 mg/L), leucina (40 mg/L) e fenilalanina (10 mg/L).

Aminoácido	Área pico [%]	Área pico relativa [%]	Área pico relativa [%]
	BACD-24-06-030-057	FUR 06/17 F04-K07	FUR 06/17 F04-K15
Metionina	100,0	47,5	61,7
Leucina	100,0	50,3	65,4
Fenilalanina	100,0	50,1	65,2

[00138] A redução da concentração de NaHCO₃ e aumento da concentração da glicose. A influência das altas concentrações de CO2 dissolvidas na cultura de célula no cultivo e produtividade foi investigada.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 58/86 / 74

Devido à produção de grande escala em um biorreator, uma maior concentração de CO2 na cultura de célula pode ser esperada do que em biorreatores de 2,5 - 32 L. Portanto, duas fermentações foram realizadas em paralelo, uma com uma concentração de CO2 de aproximadamente 7,5 % e a outra com uma concentração de CO₂ de aproximadamente 12%. A concentração de CO2 foi ajustada variando-se a fração de CO2 no fluxo do espaço aéreo. A concentração de CO2 na cultura de célula foi medida analisando-se amostras extraídas com o instrumento NOVA. A fermentação foi realizada a 37 ^oC em um pH de 7,15 e com um pO₂ de 20%.

[00139] Uma concentração de CO₂ de 11 - 12 % tinha uma influência negativa sobre o cultivo e produtividade das células. Nesta concentração de CO2, uma taxa de cultivo de 0,29 d^-1 foi alcançada durante um intervalo de 12 dias em uma contagem de célula de 1,1 x 106 células/ml e uma taxa de diluição de 0,30 d^-1. Na fermentação realizada com aproximadamente 7,5% CO2, uma taxa de cultivo de 0,52 d^-1 foi alcançada em uma contagem de célula de 1,49 x 10⁶ células/ml e uma taxa de diluição de 0,53 d^-1 no mesmo intervalo. Em concentrações de CO2 elevadas, a viabilidade foi reduzida para 86,1%, em comparação com 95,9% a 7,5% CO2. Adicionalmente, a produtividade volumétrica foi reduzida a aproximadamente 36% e a produtividade específica a 50%. Devido à elevada concentração de CO2, a taxa de absorção de glicose específica foi diminuída também (-39%). A influência negativa de uma concentração de CO2 aumentada (11 - 12%) no cultivo e produtividade das células foi muito óbvio e, portanto, é ótimo realizar a fermentação a 7,5% CO₂.

[00140] Com o exposto acima, os experimentos mostraram que, quando a concentração de CO2 foi aumentada para 12% no biorreator de 1.000 L, uma forte diminuição no desempenho do clone 488-3 da FurinaCHO pode ser esperada. Portanto, foi decidido reduzir a concentração de NaHCO3 no meio de 2 g/L a 1,5 g/L. Um quantidade menor de NaHCO3 no meio também diminuiu a capacidade do tampão do meio e, portanto, duas

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 59/86 / 74 fermentações (10 L) foram comparadas, uma com 3,15 g/L glicose e 2 g/L de NaHCO₃ no meio (FUR_06/24_F01 e outra com 4,65 g/L de glicose e 1,5 g/L de NaHCO3 (FUR_06/26_F04).

[00141] Para simular as condições de um biorreator de grande escala (1.000 L), a concentração de CO₂ dissolvido durante a fermentação foi ajustada a 7 - 8% no fermentador com 2 g/L NaHCO₃ e a 6-7% no fermentador com 1,5 g/L NaHCO3 por gaseificação de CO2 constante no espaço aéreo. As taxas de crescimento de ambas as culturas foram similares (0,58 e 0,56 d^-1) e as culturas mostraram produtividades e viabilidades volumétricas comparáveis. Entretanto, a absorção de glicose específica foi ligeiramente mais elevada na cultura com uma concentração de NaHCO3 mais baixa (0,83 mg/10⁶ células/d vs. 0,67 mg/10⁸ células/d). Portanto, uma concentração de glicose de 4,65 g/L foi considerada ser razoável e foi retida em outra preparação do meio.

[00142] Investigação da concentração de Symperonic F68 no meio de Furina. A concentração regular de Synperonic F68 no meio de cultura de célula foi estabelecida a 0,25 g/L. A finalidade do Synperonic F68 no meio é proteger as células de avaria devido à oxigenação submersa. Portanto, um experimento foi realizado em biorreatores de 2 x 10 L, onde uma concentração de Synperonic F68 aumentada de 1,0 g/L vs. a concentração regular de 0,25 g/L foi investigada. A fermentação foi realizada a 35,8 ^oC em um pH de 7,30 e com um pO2 de 20%.

[00143] Com crescente concentração de Pluronic (Synperonic F68), uma taxa de cultivo específica ligeiramente mais elevada e densidade de célula puderam ser conseguidas. Assim, devido à aumentada produtividade específica, uma produtividade volumétrica proporcionalmente maior de 365 vs. 278 kU/L/d pôde ser obtida.

[00144] Os sobrenadantes destes experimentos foram coletados e filtrados com um filtro de profundidade (Cuno Cart.Z08P4A30SP 4 discos)

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 60/86 / 74 seguido por um filtro de membrana (Pan Fluorodyne II KA2DFLP2). Os sobrenadantes filtrados foram concentrados por ultrafiltragem (Sartorius 30S1463901E-SG PSU 10KD, 0,2 m²) e diafiltrados em contato com o tampão de diafiltragem de Furina. O concentrado filtrado estéril (Sartorius Sartobran P 523130748-00 0,45/0,2 μ) foi purificado na coluna Capto MMC. Os resultados destes experimentos de purificação revelaram que o Synperonic F68 aumentado não tem influência prejudicial na qualidade e/ou pureza da rFurina purificada. Não puderam ser encontradas concentrações de Synperonic F68 elevadas no eluado da coluna Capto MMC, que foram < 0,15 mg/ml em ambos os eluados.

[00145] Apesar destes resultados, a concentração de Synperonic F68 no meio de rFurina foi mantida nos originais 0,25 g/L. Entretanto, no caso de problemas de um aumento proporcional devido à oxigenação submersa, uma concentração de Synperonic de até 1,0 g/L pôde ser considerada, com o potencial de produções aumentadas sem influência prejudicial do produto de Furina final.

[00146] Composição Média Final para Produção de rFuina na Fermentação. Com base nos experimentos de otimização do meio, a seguinte composição de meio é mostrada ser ótima para a fermentação do clone 488-3 CHO em culturas de biorreator para a produção de rFurina.

Tabela 17: Componentes do meio básico e meio de fermentação otimizada

Componente	Meio Básico	Meio Otimizado
	Concentração [g/kg]	Concentração [g/kg]
DMEM/F12 (1:1)	11,76	11,76
L-Glutamina	0,6	0,9
D-Glicose	-	1,5
Etanolamina	0,00153	0,00153
Synperonic	0,25	0,25
Putrescina.2HCI	0,0036	0,0036
Metionina	-	0,01
Leucina	-	0,04
Fenilalanina	-	0,01
FeSO4.7H20	0,0006	0,0006
CuSO4.5H20	0,00000125	0,00000125
NaHCO3	2,0	1,5

[00147] A influência de diferentes pontos de ajuste de pO₂ na taxa de cultivo e na produtividade foi também investigada. Três diferentes pontos de ajuste pO₂ foram testados, isto é, 10%, 20% e 50%. Os experimentos foram

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 61/86 / 74 realizados em biorreatores de 1,5 L com gaseificação via espaço aéreo. Todas as fermentações foram realizadas a 35,1 ^oC em pH 7,20. A comparação das fermentações a 10, 20 e 50% de pO2 mostrou um ligeiro aumento das taxas de crescimento (0,5, 0,62 e 0,65 d^-1) com crescentes pontos de ajuste de pO₂. Igualmente, a produtividade volumétrica foi maior a 50% pO2. As contagens médias das células das diferentes fermentações fora muito similares. Assim, o aumento na produtividade volumétrica foi o resultado da crescente taxa de crescimento.

[00148] Conseqüentemente, um ponto de ajuste de pO₂ de 50% pareceu influenciar a taxa de cultivo positivamente e como resultado a produtividade volumétrica foi de aproximadamente 4% mais elevada do que em condições padrão (= 20% pO2). Nenhum efeito sobre a viabilidade foi observado. Portanto, um ponto de ajuste de pO2 = 20% e uma faixa de regulação entre 10% - 50% puderam ser confirmados serem adequados para fermentação do clone #488-3 CHO.

[00149] Otimização da temperatura e pH para maximizar a produtividade volumétrica. A influência do pH e temperatura sobre o desempenho do clone de Furina-CHO foi investigada. Utilizando-se um ‘projeto de método de experimentos', deferentes temperaturas foram combinadas com diferentes valores de pH, para verificar as condições que resultaram em máxima produtividade volumétrica. Cinco temperaturas foram combinadas com três valores de pH de acordo com a “Matriz de Doehlert”, resultando em sete combinações de temperatura e pH, como mostrado na Figura 5.

[00150] A combinação de 36,5 ^oC e pH 7,20 foi escolhida como o ponto central que foi aplicado a dois lotes de fermentação. A Tabela 18 expõe as condições de cultura usadas nos diferentes lotes de fermentação.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 62/86 / 74

Tabela 18: Instalação experimental da Matriz de Doehlert: Condições de

Cultura dos diferentes lotes de fermentação.

Lote de fermentação	Temp. [°C]	pH
FUR 06/43-B07	35,1	7,20
FUR 06/43-B05	35,8	7,10
FUR 06/40-B03	35,8	7,30
FUR 06/40-B01	36,5	7,20
FUR 06/43-B02	36,5	7,20
FUR 06/40-B08	37,2	7,10
FUR 06/40-B04	37,2	7,30
FUR 06/40-B06	37,9	7,20

Tabela 19: Valores médios dos dados de fermentação das fermentações (FUR 06/40-B01, -B03, -B04, -B06, -B08 e (FUR 06/43-B02, -B05, -B07

Lote Fermentação	Temp.	pH	CC	u	Furina	P1)	qP1)	Viabilidade
	[°C]		[106/mL]	[1/d]	[IU/mL]	[kIU/Ud]	[U/106/d]	[%]
FUR 06/43-B07	35,1	7,20	1,74	0,595	930	543	312	97,7
FUR 06/40-B03	35,8	7,30	1,64	0,632	621	379	232	97,6
FUR 06/43-B05	35,8	7,10	1,73	0,647	683	429	250	98,5
FUR 06/40-B01	36,5	7,20	1,78	0,696	439	309	174	97,9
FUR 06/43-B02	36,5	7,20	1,66	0,684	454	310	186	96,8
FUR 06/40-B04	37,2	7,30	1,71	0,642	284	184	108	96,8
FUR 06/40-B08	37,2	7,10	1,68	0,652	338	215	128	98,3
FUR 06/40-B06	37,9	7,20	1,52	0,473	143	65	43	96,1
1) a produtividade vo	lumétrica média e específica méd	ia durante 5 dias d	e cultura foram calculadas

formando-se o valor médio das produtividades simples.

[00151] Os dados foram analisados estatisticamente com a

Metodologia de Superfície de Resposta (RSM), usando-se o software “Minitab”. A RSM explora as relações entre diversas variáveis explanatórias e uma ou mais variáveis de resposta. A principal idéia da RSM é utilizar um conjunto de experimentos projetados para obter-se uma ótima resposta. A análise focalizou-se na produtividade volumétrida e específica, bem como na taxa de crescimento.

[00152] Análise dos dados com referência à produtividade volumétrica. Como uma primeira etapa, uma plotagem de superfície foi criada (Figura 6). As coordenadas dos dados da Figura 6 são marcadas como pontos. A superfície mostra a correlação adotada dos dados simples.

[00153] A plotagem de superfície supõe uma correlação linear entre os parâmetros de temperatura/pH e a produtividade volumétrica respondendo. O gráfico indica um aumento da produtividade volumétrica com a temperatura

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 63/86 / 74 decrescente. A influência do pH é considerada ser fraca. Cálculos subsequentes mostraram uma correlação linear dos dados (cálculo não mostrado). Por análise de variância, uma equação foi gerada, que descreve a correlação entre pH, temperatura e produtividade volumétrica:

P = 7693,1 - 162,4*Temp - 202,8*pH [00154] Com base no modelo matemático, uma plotagem de contorno foi gerada (Figura 7) que ilustra a influência da temperatura e pH na produtividade volumétrica. Os pontos indicam as condições (pH/temp.) que tinham sido testados experimentalmente.

[00155] A plotagem de contorno mostra que a área, onde produtividade volumétrica máxima pode ser esperada, é a 35,1 ^oC e um pH de aproximadamente 7,10. Ambos os valores estão na borda do projeto experimental, o que significa que o máximo real poderia ser encontrado mesmo embaixo daqueles valores. Além disso, a plotagem de Contorno mostra que a influência do pH na produtividade volumétrica é marginal e ligeiramente mais elevada em baixos valores de pH.

[00156] A plotagem de superfície (Figura 8), que é uma ilustração tridimensional do modelo matemático, fornece o mesmo resultado que a plotagem de contorno: a forte influência da temperatura e a fraca influência do pH sobre a produtividade volumétrica.

[00157] Análise dos dados com referência à taxa de crescimento μ. A correlação da taxa de crescimento com a temperatura e pH é descrita em uma equação quadrática. Repetindo, uma forte influência da temperatura e uma fraca influência do pH podem ser encontradas. A forte variação da taxa de crescimento embaraça o projeto de um modelo matemático. A análise da variância e regressão forneceu a seguinte equação:

P = -103,539 + 5,706*Temp - 0,079*Temp² - 0,233*pH - 0,020* pH² [00158] A influência do pH sobre a taxa de crescimento é estatisticamente não verificável, como indicado pelo elevado valor-P para os

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 64/86 / 74 termos-pH que foram calculados serem de 0,99 (cálculo não mostrado).

[00159] A plotagem de superfície (Figura 9) ilustra a correlação modelada tridimensionalmente, demonstra a relação quadrática e mostra uma taxa de crescimento máxima a 36,5 ^oC.

[00160] A análise dos dados mostra uma correlação similar da produtividade específica com temperatura e pH como visto para a produtividade volumétrica (Figura 10). A correlação é descrita por uma equação linear. A influência do pH é novamente baixa, como provado pela análise de variância (cálculo não mostrado):

qP = 4261,40 - 93,35*temp - 93,77*pH [00161] Em resumo, os experimentos para otimização da temperatura e pH e subsequente análise dos dados fornecem um resultado muito claro. A maior produtividade volumétrica, que é considerada como o parâmetro mais importante para otimização do processo, foi obtida por cultura na mais baixa temperatura (35,1 ^oC) e mais baixo pH (7,10). A influência do pH é estatisticamente dificilmente significante e um valor de pH entre 7,10 e 7,30 forneceria resultados muito similares. Diminuindo-se a temperatura de 37 ^oC para 35,1 ^oC, a produtividade volumétrica poderia ser elevada de aproximadamente 200 kU/L/d para 540 kU/L/d, que é 2,7 vezes maior (Figura 11). Com base nestes resultados, os novos pontos estabelecidos para a temperatura e pH para a cultura do clone de Furina-CHO no modo quimiotástico foram determinados como 35,1 ^oC e 7,15.

[00162] Comparação de modo quimiostático com modo de realimentação de batelada. A cultura do clone de furina-CHO no modo quimiotástico em uma baixa temperatura (35,1 ^oC) resultou e elevadas produções em experimentos de pequena escala (1,5L, 2,5L, 10L e 32L) e foi considerada ser o método de cultura apropriado para a cultura de larga escala para produção de rFurina. Entretanto, a fermentação inicial em larga escala (1200 L biorreator na instalação PP1) mostrou uma forte diminuição da taxa

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 65/86 / 74 de crescimento no modo quimiostático. Como uma alternativa, para obteremse mais elevadas taxas de crescimento, o modo de realimentado por batelada foi instalado em larga escala. Experimentos na escala de biorreator de 10 L foram realizados para comparar o crescimento e produtividade no modo quimiostático como modo realimentado por batelada. As células foram cultivadas a 36,5 ^oC em um pH de 7,15 e um pO2 de 20%. A batelada foi dividida em uma contagem de célula de 0,6 - 0,7 x 106 células/mL cada segundo dia de cultura.

[00163] As fermentações quimiostática e de realimentação de batelada foram realizadas em paralelo, empregando-se a mesma cultura de célula como inóculo. As células foram cultivadas no modo quimiostático até o dia 6. Em seguida uma fermentação foi trocada para o modo de realimentação por batelada (FUR_06 50-F03), enquanto a outra foi continuada no modo quimiostático (FUR_06_51-F04). A cultura do modo de realimentação por batelada resultou em uma contagem de célula média de 2,22 x 106 células/ml no final da batelada, com uma taxa de crescimento de 0,64 d^-1 (Tabela 20). No modo quimiostático, uma taxa de crescimento de 0,50 d^-1 foi obtida com uma contagem de célula média de 1,67 x 10⁶ células/ml. Devido à contagem de célula e taxa de crescimento mais elevadas no modo de realimentação de batelada, a produtividade volumétrica foi maior também (238 vs. 197 kU/L/d).

[00164] Os dados indicam que o modo de realimentação de batelada é um método de cultura preferível para o clone de furina-CHO na escala de 10 L, o que resulta em produtividades volumétricas mesmo ligeiramente mais elevadas do que no modo quimiostático (a 36,5 ^oC e um pH de 7,15). Entretanto, no modo de realimentação de batelada, processos de colheita e outros a jusante são restringidos a certos intervalos, enquanto no modo quimiostático a colheita pode ser realizada continuamente. Assim, cada método tem suas vantagens. Nenhum experimento de otimização para os parâmetros do modo de realimentação de batelada foram realizados como para as contagens de células ótimas no final de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 66/86 / 74 uma batelada ou para a melhor relação dividida.

Tabela 20: Valores médios dos dados de fermentação das realizações de fermentação (FUR_06_51-F04 (Quimiostático) e (FUR_06_50-F03 (Realimentação batelada)

Lote Ferment.	Vol.	Modo	D	1.1	C C	Furina	P
			[1/d]	[1/d]	[1 E6/mL]	[IU/mL]	[kIU/Ud]
FUR 06 51-F04	10 L	quimiostático	0,494	0,497	1,67	401,4	198
FUR_06_50-F03	10 L	realimentação batelada	-	0,637	2,22 (fim)1)	539,8	2382)

1) valor médio das contagens de célula no final de cada batelada (2 bateladas) ²⁾ Valor médio das produtividades no final de cada batelada (2 bateladas) [00165] Investigações de aumento proporcional. Comparação de impulsionadores tipo Rushton versus tipo esférico em diferentes taxas de agitação. A influência do tipo de agitador na taxa de crescimento e na produtividade foi investigada. O ajuste padrão usado nos biorreatores para experimentos com o clone de Furina-CHO consistiu de um impulsor Rushton e quatro placas defletoras. O biorreator de 1.000 L para produção de rFurina foi equipado com três pares de impulsores de esfera sem quaisquer placas defletoras. Portanto, um experimento foi realizado para testar três diferentes ajustes em biorreatores de 10 L: um reator foi equipado com o ajuste padrão, outro reator com dois pares de impulsores esféricos e nenhuma placa defletora e um terceiro reator foi montado como o padrão, porém a taxa de agitação foi reduzida de 170 rpm para 90 rpm.

[00166] A Tabela 21 fornece um resumo das instalações do biorreator. A taxa de agitação de 60 rpm com impulsores de esfera forneceu um velocidade de ponta similar à do impulsor rushton a 90 rpm (vide Tabela 21). Entretanto, as velocidades de ponta não podem ser igualadas entre si devido a diferentes geometrias dos impulsores (formato, diâmetro).

Tabela 21: Instalações de Biorreator para impulsor/experimento de taxa de agitação

Lote fermentação	Tipo de impulsor/diâm.	Níveis	Placas defletoras	Taxa agitação	Velocidade de ponta
FUR 06/37 FO3	Rushton 80 mm	2	4	170	0,712 m s-1
FUR 06/35 F01	Rushton 80 mm	2	4	90	0,377 m s-1
FUR_06/38_F04	Esfera 140 mm, 39,5 mm diâmetro	2	-	60	0,440 m s-1

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 67/86 / 74 [00167] As condições de fermentação foram como segue: 37 ^oC, pH 7,15, pO2 de 20% e pCO2 de 6-7 %. Média: 4,65 g/L, Glc, 1,5 g/L NahCO₃). A comparação dos dados de fermentação mostrou que o desempenho do biorreator com a instalação padrão, isto é, equipado com o impulsor rushton e agitado em uma taxa de 170 rpm, foi mais elevado do que nos biorreatores com as outras instalações (Tabela 22). O uso de impulsores de esfera a 60 rpm resultou em uma taxa de crescimento um tanto menor (0,57 vs. 0,6 1d-1), um volume mais baixo (197 vs. 227 kU/L/d) em comparação com o impulsor rushton a 170 rpm. A viabilidade foi dificilmente afetada contudo. Usando-se um biorreator agitado por impulsor rushton em uma taxa de agitação de 90 rpm em vez de 170 rpm, claramente diminuiu a taxa de crescimento (0,54 vs. 0,61d-1), a produtividade volumétrica (175 vs. 227 kU/L/d) e a produtividade específica da célula (115 vs. 138 U/10⁶ células/dia).

[00168] Os dados deste experimento mostraram que tanto o impulsor de esfera a 60 rpm e os impulsores Rushton em uma taxa de agitação reduzida resultaram em um desempenho declinado do clone de Furina-CHO, em comparação com os impulsores Rushton a 170 rpm. Contudo, os resultados também revelaram que é possível utilizar-se um impulsor de esfera para cultura do clone de Furina-CHO. Entre as instalações que foram testadas, a instalação com o impulsor rushton a 170 rpm mais quatro placas defletoras exibiram as condições mais rudes. Notavelmente, entretanto, nenhuma diminuição de viabilidade celular foi observada sob estas condições, o que indica uma elevada resistência mecânica do clone de Furina-CHO.

Tabela 22: Valores médios dos dados de fermentação das três fermentações do clone de Furina-CHO em biorreatores com diferentes instalações (placas defletoras tipo impulsoras)

Lote fermentação	Instalação	CC	D	Furina	u	P	qP	Viabilidade
		[106/m1]	[d-1]	[IU/mL]	[d-1]	[kU/L/d]	[U/106/d]	[%]
FUR_06/37_F03	Rushton 170 rpm	1,65	0,628	361,37	0,614	227	138	95,4
FUR_06/38_F04	Impulsor de esferas 60 rpm	1,52	0,600	328,10	0,568	197	130	94,1
FUR_06/35_F01	Rushton 90 rpm	1,53	0,574	305,31	0,544	175	115	94,3

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 68/86 / 74 [00169] Comparação de diferentes taxas de agitação com impulsores de lâmina inclinada em biorreatores de 32 L. Para a Campanha de realização GMP ORFURFB07002 do PP1 o biorreator (volume de trabalho 950L) foi equipado com um tipo de impulsor de lâmina inclinada (2 pcs., d = 700 mm) em vez dos impulsores tipo esfera anteriormente usados.

[00170] Ciclos realimentados com batelada de 2 dias foram realizados durante a Campanha. A fim de avaliar esta mudança em comparação com a Campanha anterior, um biorreator de 32 L foi instalado com um tipo similar de impulsores de lâmina inclinada (1 peça, d = 140 mm) e as fermentações foram realizadas usando-se uma suspensão de célula da instalação PP1 e meio para assegurar materiais comparáveis a serem usados.

[00171] Um processo realimentado por batelada similar foi realizado, onde 2 - 3 ciclos de batelada de dois dias consecutivos foram iniciados com uma densidade de célula de partida de 0,5x10E06 células/mL. O experimento foi realizado em 2 diferentes taxas de agitação, isto é, 55 rpm e 120 rpm). As condições de cultura fora idênticas às condições de cultura usadas em PP1: pH-SP 7,15, Temp-SP 35,5 ^oC, pO₂-SP 20%. Os dados da última batelada foram comparados após adaptação às respectivas condições de agitação.

Tabela 23: Taxa de crescimento, contagem de célula e produtividade volumétrica das bateladas de FUR 07/06-F07 com impulsores de lâmina inclinada no biorreator de 32 L.

FUR 07/06-F071	Taxa agitação	CC	Dividido 2) 3	Furina	p	P 3)
Intervalo	[rpm]	[106/m1]	1: x	[lU/mL]	[d']	[kU/Ud]
Batelada K02-K04	120	1,95	3,89	1197,8	0,680	445
K10-K12	50	1,50	3,13	812,0	0,570	276

1) contagem de célula no final de cada batelada

2) relação de divisão teórica a ser aplicada em um processo de realimentação de 2 bateladas: relação de divisão = e^A(2 x μ)

3) cálculo da produtividade volumétrica: P = (1-(1/relação divisão)) x título do produto/2 dias [00172] O experimento demonstrou novamente o efeito da condição de agitação sobre as taxas de crescimento específico do clone CHO #488-3. As taxas de crescimento crescentes resultaram em maiores densidades de célula finais na final da batelada, quando aplicando-se as mesmas densidades de

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 69/86 / 74 célula de partida. As produtividades volumétricas aumentaram de 276 kU/L/d para 445 kU/L/D (+ 61%), enquanto que a densidade de célula final aumentou em 30% (1,95 vs. 1,5 x 10E06 células/ml). Estes resultados indicam que a taxa de agitação aumentada tinha um impacto positivo sobre a produtividade específica de célula.

[00173] Pode também ser concluído que as fermentações, que resultaram em produtividades médias em torno de 200 kU/L/D foram principalmente um resultado das baixas taxas de agitação aplicadas de 200 rpm e não devido ao próprio projeto do impulsor. Aqui poderia ser demonstrado que os impulsores de lâmina inclinada pode resultar em produções > 400kU/L/D, se as taxas de agitação forem ajustadas correspondentemente.

EXEMPLO 4

PURIFICAÇÃO DA FURINA RECOMBINANTE rFURINA [00174] Este exemplo provê métodos para a filtragem e purificação da rFurina. Os sobrenadantes de cultura de célula coletados foram primeiro filtrados em filtros de profundidade (filtros Cuno Zetaplus) para obtê-los livres de célula e livres de partículas, seguido por filtragem de membrana em filtros PVDF de 0,45 μιιι (PALL Fluorodyne II). O sobrenadante de cultura de célula filtrado contendo a rFurina foi então concentrado por ultrafiltragem em cassetes 10K PES UF da Sartorius (Sartocon PESU 10kDa) com fatores de concentração variando de 10 - 50. As concentrações de furina (com atividade de furina variando de 290 - 1700 unidades/célula) foram então armazenadas em alíquotas a <-60 ^oC.

[00175] Em um esforço para obter uma preparação de rFurina mais homogênea para uso no processo de maturação VWF, os experimentos foram conduzidos para parcialmente purificar a rFurina do sobrenadante de cultura de célula. Um reagente de rFurina parcialmente purificado é de uso mais fácil para teste de caracterização e liberação. Ele também resulta em uma reduzida

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 70/86 / 74 presença de proteínas de célula hospedeira CHO no processo de maturação VWF.

[00176] Um procedimento de purificação em uma resina de troca de ânions foi desenvolvido que requereu uma condutividade de carga de <5 mS/cm (TA) para ligação eficiente de rFurina. A eluição foi então realizada como um procedimento de etapa em uma intensidade iônica de aproximadamente 500 - 300 mM NaCl e durante a fase de avaliação, uma eluição gradiente de até 300 mM NaCl foi aplicada (vide resumo na Tabela 24). O pH original dos tampões de 6,7 (TA) foi aumentado para 7,5 para melhorar a ligação da rFurina durante a carga, em particular em elevada carga de proteína e elevadas taxas de fluxo de revestimento (vide resumo de tampões pertinentes na Tabela 25). Os experimentos de purificação foram realizados em resinas de troca de ânion EMD TMAE (Merck) e CaptoQ (GE Healthcare) que diferiam na estabilidade do pacote e na máxima taxa de fluxo para operar. Os dados analíticos resumidos na Tabela 26 mostram que rFurina pode ser concentrada dos sobrenadantes de cultura de célula até 362 vezes com produções variando de 20 - 71%. As atividades de rFurina nos pools do eluado foi entre 639 Unidades/ml e 27651 Unidades/ml, dependendo da carga aplicada. O nível de impureza CHO do eluado foi constatado em uma faixa entre 10 - 134 ng proteína CHO/rFurina Unitária e taxas de redução de até 12,3 com um desempenho ligeiramente melhor para a redução de CHO encontrada para a resina CaptoQ.

[00177] Em resumo, a purificação da rFurina por cromatografia de troca de ânions provou ser uma opção para concentração, que é importante para armazenagem do reagente de rFurina a <-60 ^oC. Além disso, uma ligeira redução de CHO em um for de 3 - 12 é importante na redução da concentração de proteína CHO na preparação de VWF.

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Tabela 24: Procedimento aproximado para a purificação de rFurina em resina de troca de ânion. Para EMD TMAE (Merck) a taxa de fluxo aplicada foi de

150/75 cm/h, pra CaptoQ (Ge Healthcare) a taxa de fluxo foi de 600/300.

Etapa	Tampão	CV	Taxa fluxo [cm/h]	Comentário
Equilíbrio	tampão FEQ	10	150-600
Carga	CCS diluído com EQ1	até 1200	Condutividade da carga < 5mS/cm;
Lavagem 1	Tampão EQ	até 50	Opcional; em elevada carga de coluna esta etapa foi omitida
Lavagem 2	Mistura de tampão EQ e tampão FEL	Aprox. 10
Etapa Eluição	30% FEL/70% FEQ	14	75-300
Gradiente Eluição	100% FEQ- 30%FEL/70% FEQ	14	75-300	Opcional: usado para experimentos de avaliação inicial
Pós condicionamento	Vários tampões (FEL, tampão NaCl, tampão CIP	15	n.d.

Tabela 25: Tampões para a purificação de furina em resina de troca de ânions

Tampão	Formulação
Tampão de equilibração (FEQ)	50 mM HEPES, 1 mM CaCl2, pH= 6.7 — 7.5 a TA	Em elevadas cargas, o pH dos tampões foram aumentadas para melhorar a ligação
Tampão de eluição FEL)	50 mM HEPES, 1 mM CaCF, 1 M NaCl, pH=6.7 — 7.5 at TA
Tampão NaCl	2 M NaCl
Tampão CIP	0.5 M NaOH

Tabela 26: Resumo de experimentos de purificação pertinentes de rFurina em resina de troca de ânions. O teor de proteína total foi determinado usando-se um ensaio BraDFORD. A taxa de redução de CHO é calculada como proteína CHO carregada dividida por proteína CHO total encontrada no pool de eluado.

	Carga	Eluado
ID realização	Carga coluna	Furina	Fator conc.	Produção	CHO	Comentário
	U Furina/ml resina	U/mI	U/mg proteína	vol carga/vol eluado	% Furina atividade	ng/U Furina	redução
011	2705	639	n.d.	32	36	134	3,6	TMAE; T.A., eluição 500 mM NaCl
013	4016	2259	n.d.	33	57	51	3,0	TMAE; T.A., eluição 400 mM NaCl
015	4403	2007	n.d.	41	46	50	3,8	TMAE; T.A., eluição 300 mM NaCl
018	10635	2584	n.d.	65	37	41	6,5	TMAE; T.A., eluição 300 mM NaCl
021	8684	3550	n.d.	126	20	59	5,5	TMAE; T.A., eluição 300 mM NaCl
024	4151	903	n.d.	19	54	38	6,3	CaptoQ; T.A.; eluição 300 mM NaCl

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025	E 1 E 2	15696	6185	n.d.		45	10	12,3	CaptoQ; TA; eluição gradual
1068	n.d.		12	n.d.	n.d.
026	E 1 E 2	31316	10237	14138		51	8	10,1	CaptoQ;4°C; eluição gradual
1868	n.d.		17	n.d.	n.d.
028	32635	27651	10011	288	68	19	3,6	TMAE; 4°C; eluição 300 mM NaCl
029C	23682	12642	7789	176	71	14,4	6,9	CaptoQ; T.A.; eluição 300 mM NaCl
029T	23806	14922	2671	362	30	65,1	3,3	TMAE; T.A., eluição 300 mM NaCl
033	20625	6843	4568	n.d.	35	n.d.	4,6	CaptoQ; T.A.; eluição 300 mM NaCl; carga UF/DF conc.
035	26244	13209	6967	n.d.	78	n.d.	1,9	TMAE; T.A., eluição 300 mM NaCl; carga UF/DF conc.

EXEMPLO 5

CONCENTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E ANÁLISE DE rFURINA [00178] Este exemplo descreve outros métodos usados na concentração e purificação (isto é, processamento a jusante) da rFurina de larga-escala. Tais métodos de processamento incluem ultrafiltragem, diafiltragem e cromatografia capto-MMC, que foi realizada na produção de rFurina substancialmente livre de proteína animal. Ele também descreve métodos de analisar a concentração, atividade específica e contaminação da proteína por proteína de célula hospedeira e DNA.

[00179] Ultrafiltragem. O sobrenadante (aprox. 800 - 1200 kg das Campanhas Quimiostáticas e aprox. 550 - 700 kg nas Campanhas RFB) foi separado das células e concentrado a um volume final de 35 - 45 L por ultrafiltragem. Os parâmetros e pontos de ajuste do Sistema de Ultrafiltragem/Diafiltragem (UFS) durante a etapa de concentração são listados na Tabela 27.

Tabela 27: Parâmetros Operacionais e Pontos de Ajuste para a Etapa de

Concentração

Parâmetro	Ponto de Ajuste
Temperatura da colheita filtrada	10 - 15oC
Área de filtro	14 m2

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Pressão de alimentação	0,9 - 1,5 bar
Pressão de retido	0,7 - 1,2 bar
Pressão Permeado	0 - 0,1 bar
Pressão transmembrana	0,7 - 1,0 bar
Taxa fluxo cruzado específico (taxa fluxo alimentação)	300 - 600 L/h/m2
Taxa de Fluxo Permeado Específico	15 - 40 L/h/m2
Fator concentração	20 - 30
Tempo de processamento	3 - 4 h

[00180] Diafiltragem. Imediatamente após acabar a etapa de concentração, a diafiltragem do retido foi iniciada. Os parâmetros e pontos de ajusto do UFS durante a etapa de diafiltragem são listados na Tabela 28.

Tabela 28: Parâmetros Operacionais e Pontos de Ajuste para a Etapa de

Diafiltragem

Parâmetro	Ponto de Ajuste
Área filtro	14 m2
Pressão alimentação	0,9 - 1,5 bar
Pressão de retido	0,7 - 1,2 bar
Pressão permeado	0 - 0,1 bar
Pressão transmembrana	0,7 - 1,1 bar
Taxa fluxo transversal específica (Taxa fluxo alimentação)	300 - 600 L/h/m2
Taxa fluxo de permeato específico	7 - 20 L/h/m2
Condutividade alvo	< 2 mS/cm
Taxa diafiltragem (Vpermeado/Vretido)	4 - 5,5
Tempo processamento 1'	0,75 - 1,25 h

[00181] Quando a condutividade do retido caiu abaixo de 2 mS/cm (determinado com a sonda de condutividade em linha de UFS), esta etapa do processo foi terminada. Esta baixa condutividade é necessária para assegurar uma ligação quantitativa da rFurina no gel cromatográfico da etapa de purificação subsequente. O produto diafiltrado foi transferido e o valor-pH do produto diafiltrado foi ajustado a 6,0 adicionando-se uma solução de ácido acético 1 M. O produto foi armazenado em temperatura ambiente (TA) antes de aplicar à coluna Capto-MMC.

[00182] Cromatografia Capto-MMC. O gel Capto-MMc, um trocador de cátion multimodal, foi usado para ligar rFurina e para eliminar a grande maioria de contaminantes do produto diafiltrado. Após equilíbrio do gel de cromatografia, o produto diafiltrado é carregado na coluna. Uma cápsula de filtro de 0,22 pm foi instalada para realizar uma filtragem em linha do produto diafiltrado. As outras etapas cromatográficas são listadas e detalhadas na Tabela 29.

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Tabela 29: Etapas de Cromatografia Capto-MMC

	Etapa cromatografia	Tampão/Produto	Taxa fluxo linear	Quantidade
			cm/h	CV
1	Lavagem ácida	ES4 em linha diluído a ácido acético 0,2M	300	1
2	Equilíbrio	EP2	150	37
3	Absorção	35 - 45 L produto diafiltrado	150
4	Equilíbrio	EP2	150	30
5	Lavagem	WPF	150	10
6	Eluição Gradual	eluato EL1/MMC	150	15
7	Eluição II	eluato EL2/MMC II	150	10
8	Regeneração	ES4	150	10
9	Regeneração	SHD	150	10

1) CV = volume coluna: volume da resina empacotada na coluna de cromatografia.

[00183] No processamento a jusante, não foram observados problemas. As etapas a jusante (Filtragem, UF, DF) puderam ser realizadas nas mesmas condições usadas para as colheitas da cultura quimiostática. Produções de atividades de rFurina total média de 91% (Campanha ORFU06002), 66% (Campanha ORFU07001) e 84% (Campanha ORFU07002) puderam ser obtidas. A única mudança pequena é dada pelo fato de que o volume de partida para a etapa UF é um tanto menor em comparação com a cultura contínua. Porém esta mudança não tem efeito sobre a qualidade do produto purificado (Vide dados sobre atividade total, DNA célula hospedeira, Proteína célula hospedeira; vide Tabela 30).

[00184] Os valores médios de todas três campanhas para os conteúdos de Proteína de Célula Hospedeira e DNA de célula hospedeira revelaram valores máximos médios um tanto baixos de 8,55 pg/ml (variando de 2,2 10,4 pg/ml) e 13,48 ng/ml (variando de 0,0 - 23,9 ng/ml), respectivamente (vide Tabela 30). A etapa cromatográfica foi capaz de reduzir a contaminação específica a baixos valores máximos médios de 0,35 ng Proteína CHO/Atividade rFurina U (variando de 0,13 - 0,52 ng Proteína CHO/U) e 0,148 pg DNA célula hospedeira/Atividade rFurina U (variando de 0,0 - 365 pg DNA/Atividade rFurina U).

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Tabela 30: Resultados de Impureza de Cromatografia Capto-MMC Comparação Campanha

Campanha	Conteúdo ProteínaCHO	Proteína CHO/Atividade rFurina	Teor DNA Célula Hospedeira	DNA Célula Hospedeira/Atividade rFurina
	pg/mL	ng/U	ng/mL	pg/U
ORFU06002	8,55	0,22	1,66	0,059
ORFU07001	3,50	0,35	2,54	0,031
ORFU07002	2,36	0,026	13,48	0,148

[00185] Caracterização da Furina. A qualidade e funcionalidade da rFurina foi avaliada pelos seguintes métodos bioquímicos/biofísicos (Tabela

31).

Tabela 31: Métodos analíticos para rFurina

Método	Objetivo	Comentário
Clivagem substrato fluorescente	Atividade Enzimática	Substrato de baixo peso molecular
Teste uso furina	Atividade enzimática, eficácia maturação	substrato rVWF
SDS-PAGE	Composição proteína	Ensaio Western blot
IEF	Composição proteína	Tingimento Coomassie, ensaio Western blot
RP-HPLC	Composição proteína	Impressão digital proteína

[00186] Ensaio Atividade Furina. As bateladas de rFurina purificada (pools de eluato Capto-MMC) foram testadas quanto à atividade enzimática da Furina. O substrato é um peptídeo sintético curto, contendo a sequência de reconhecimento dibásico fixada a um grupo de amino-metil cumarina (AMC) fluorescente, que é liberado após clivagem (BOC-RVRR-AMC). O grupo fluorogênico liberado pode ser detectado por excitação a 380 nm e subsequente medição da luz emitida a 435 nm. Uma unidade de atividade é definida como a liberação de 1 pMol de AMC por minuto a 30 ^oC.

[00187] Dependendo da eficácia de fermentação e purificação, os valores medidos de atividade de rFurina de aproximadamente 69.000 U/ml (Tabela 32, Tabela 32 e Tabela 34). Um aumento da atividade de rFurina para as campanhas de modo RFB foi observado, especialmente quando comparando os valores médios da campanha quimiostática ORFU06002 (47737 U/ml) com os valores médios de campanhas RFB ORFU07001 (77653 U/ml) e ORFU07002 (93178 U/ml) (no total, a atividade de rFurina variou de cerca de 10.000 a mais do que 100.000 U/ml; todos os dados não mostrados).

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 76/86 / 74 [00188] A atividade específica da Furina é expressa como a atividade proteína U/pg (vide Tabelas 32 - 34). A atividade específica média para a campanha ORF06002 foi de 269U/pg proteína, aumentando para 5000U/pg para ORFU07001 e 563 U/pg para ORFU07002, respectivamente (atividade específica global variou de 124 - 620 U/pg proteína. dados não mostrados). Assim, a atividade específica dobrou para as duas campanhas RFB, um resultado da atividade enzimática mais elevada de rFurina RFB comparado com as bateladas produzidas no modo Quimiostático.

Tabela 32: Campanha ORFU06002 Pool Eluado Capto-MMC

Modo quimiostático Lote-Furina	Atividade Furina	Teor de Proteína	Atividade rFurina específica
	[U/m1]	[pg/m1]	[U/pg]
ORFUCHR06002MMC01	28231	148	190,8
QRFUCHR06002MMCQ2	16307	162	124,3
ORFUCHR06002MMCO3	44854	174	257,8
QRFUCHR06002MMC04	39102	148	264,2
ORFUCHR06002MMCO5	71871	236	304,5
ORFUCHR06002MMC06	44292	142	311,9
ORFUCHR06002MMC07	68728	155	443,4
ORFUCHR06002MMC08	68510	271	252,8
Valor Médio	47737	180	269

Tabela 33: Campanha ORFU07001 Pool Eluado Capto-MMC

Batelada alimentada repetida lote Furina	Atividade Furina	Atividade rFurina específica	Atividade rFurina específica
	[U/m1]	[pg/m1]	[U/pg]
ORFUCHR07001MMC01	77090	151	510,5
ORFUCHR07001MMCO2	68450	112	611,2
ORFUCHR07001MMCO3	87420	231	378,4
Valor Médio	77653	165	500

Tabela 34: Campanha ORFU07002 Pool Eluado Capto-MMC

Batelada alimentada repetida lote Furina	Atividade Furina	Atividade rFurina específica	Atividade rFurina específica
	[U/m1]	[pg/m1]	[U/pg]
ORFUCHR07002MMC01	91200	162	563,0
ORFUCHR07002MMCO2	96400	160	602,5
ORFUCHR07002MMCO3	95020	173	549,2
ORFUCHR07002MMC04	85690	190	451,0
ORFUCHR07002MMCO5	102670	174	590,1
ORFUCHR07002MMC06	88090	142	620,4
Valor Médio	93178	167	563

[00189] Atividade de teste-uso-furina. O Teste-Uso-Furina é projetado para quantificar a eficácia de rFurina para processar pro-VWF em rVWF maduro. A eficácia de maturação é expressa como a quantidade de unidades de Furina para a maturação de unidade de Antígeno 1 VWF (Furina U/U

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VWF). O substrato é uma preparação proVWF/VWF que foi purificada em escala Piloto de acordo com o atual procedimento de manufatura, porém omitindo-se a maturação e a etapa de purificação final da Furina e a etapa de purificação final em Superose 6. A concentração do substrato rVWF foi de 100 U Ag/ml (FUHL_24_01UFO2-R).

[00190] Quatro diluições da amostra foram testadas em um Tubo Eppendorf de 1 ml para cobrir as concentrações de Furina específicas de, p. ex., 0,25 - 2,0 U/U VWF. O tampão de reação e diluição foi de 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, pH7,0 e o experimento de maturação foi realizado por 16 horas a 37 ^oC sob ligeira agitação. Após a incubação, a reação enzimática é parada por adição de tampão de amostra SDS e aquecimento das amostras por 5 minutos a > 90 ^oC. As amostras são então analisadas por SDS-PAGE em 8% géis, usando-se tingimento de prata dos polipeptídeos separados. A atividade de Furina específica requereu obter-se uma eficácia de maturação de > 95%, como avaliado por inspeção visual dos géis (a faixa proVMF deve representar menos do que 5% em comparação com a faixa VWF madura) é então reportada e usada como um atributo de qualidade da rFurina testada.

Tabela 35: Campanha ORFU06002 Pool Eluado Capto-MMC

Modo quimiostático lote-frina	Atividade Furina	Atividade teste uso	Grau maturação
	[U/ml]	[U/U]	[%]
ORFUCHR06002MMC01	28231	0.7	>95
ORFUCHR06002MMCO2	16307	0.4	>95
ORFUCHR06002MMCO3	44854	1.1	>95
ORFUCHR06002MMC04	39102	1.3	>95
ORFUCHR06002MMCO5	71871	1.0	>95
ORFUCHR06002MMC06	44292	1.0	>95
ORFUCHR06002MMC07	68728	1.0	>95
ORFUCHR06002MMC08	68510	1.0	>95
Valor Médio	47737	0.58	>95

Tabela 36: Campanha ORFU07001 Pool Eluado Capto-MMC

Batelada alimentada repetida Lote-Furina	Atividade Furina	Atividade teste-uso	Grau maturação
	[U/m1]	[U/U]	[%]
ORFUCHR07001MMC01	77090	0,5	>95
ORFUCHR07001MMCO2	68450	0,5	>95
ORFUCHR07001MMCO3	87420	0,5	>95
Valor Médio	77653	0,5	>95

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Tabela 37: Campanha ORFU07002 Pool Eluado Capto MMC

Batelada alimentada repetida Lote-Furina	Atividade Furina	Atividade teste-uso	Grau maturação
	[U/m1]	[U/U]	[%]
ORFUCHR07002MMC01	91200	0,5	>95
ORFUCHR07002MMCO2	96400	0,5	>95
ORFUCHR07002MMCO3	95020	0,5	>95
ORFUCHR07002MMC04	85690	0,3	>95
ORFUCHR07002MMCO5	102670	0,6	>95
ORFUCHR07002MMC06	88090	1,0	>95
Valor Médio	93178	0,6	>95

[00191] Atividade de maturação boa e consistente para proVWF foi encontrada para todas as bateladas de rFurina testadas. Os valores médios das campanhas são abaixo de 1,0 U Furin/VWF U:Ag e o grau de maturação excede 95% em todos os casos (Tabelas 35 - 37). As atividades de maturação de todas as bateladas de rFurina são comparáveis e, com referência aos valores médios calculados das campanhas ORFU06002, ORFU07001 e ORFU07002, quase nenhuma diferença pode ser encontrada entre rFurina produzida em modo quimiostático e modo RFB.

[00192] SDS-PAGE e Tingimento Prata de Furina. 8% SDS-PAGE com tingimento prata e análise Western blot foram realizados para todas as bateladas de rFurina pra assegurar qualidade consistente e visualizar o grau de impureza. Como visto na Figura 12, os padrões de faixa dos eluados CaptoMMC da campanha ORFU06002 e ORFU07002 correlacionam-se com um elevado grau; todas as amostras mostram uma proeminente faixa de Furina a aproximadamente 60 kDa. Uma tendência para pelo molecular ligeiramente menor das faixas de Furina é visível em amostras da campanha ORFU06002 de bateladas MMC01 a MMC08 (Figura 12, linhas 1 - 8). As amostras dessas bateladas foram desglicosiladas com o efeito de que esta tendência não fosse mais visível no subsequente SDS-PAGE com tingimento de prata (dados não mostrados), suportando a suposição de que durante a campanha ORFU06002, rFurina era glicosilada ligeiramente diferente ou a um menor grau no curso da fermentação em andamento. Esta tendência não foi observada na campanha RFB ORFU07002, sugerindo constante glicosilação da rFurina durante a

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 79/86 / 74 inteira campanha. As impurezas nas bateladas de ORFU06002 e ORF07002 são quase completamente as mesmas; entretanto, amostras da campanha de modo-RFB ORFU07001 mostram faixas menos intensas na região de 40 kDA, polipeptídeos que eram particularmente fortemente enriquecidos nas amostras da campanha ORFU06002.

[00193] SDS-PAGE Wester Blot. Análise Western blot para todas as amostras foi realizada usando-se um anticorpo anti-Furina monoclonal (Figura 13). A faixa proeminente a ~60 kDa pode ser identificada como a faixa de Furina e é encontrada em todas as amostras. A comparabilidade das amostras é muito elevada. Ligeiras variações na intensidade da faixa são devidas à diferente concentração de Furina nas amostras. No total, a análise SDS-PAGE salienta a comparabilidade de rFurina produzida em modo Quimiostático e RFB.

[00194] Para suportar SDS-PAGE convencional, foi realizada focalização isoelétrica (IEF) em amostras das campanhas ORFU06002 e ORFU07002. IEF foi realizada entre pH 7,0 e pH 3,0, usando-se IEF vertical. Os polipeptídeos foram visualizados com tingimento Coomassie e análise Western blot. IEF e subsequente Wester blotting de amostras de rFurina da companha ORFU06002 proveram padrões de faixa específicos para Furina (vide Figura 14). Até sete faixas separadas na região de pH 4,5 a pH 5,5 podem ser identificadas, com pelo menos cinco faixas presentes em todas as amsotras.

[00195] IEF das amostras da campanha ORF07002 foi realizada usando-se tingimento Coomassie e análise de Western blot para visualização. O tingimento Coomassie revela o padrão de faixa específico com todas as amostras mostrando no mínimo cinco faixas separadas na faixa de pH 4,5 a pH 5,5 e até oito faixas podem ser identificadas (vide Figura 15, linha 3).

[00196] Análise de Western blot (vide Figura 16) corrobora estes resultados, com algumas amostras não mostrando todas as faixas visíveis no

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 80/86 / 74 gel de Coomassie (vide Figura 17), provavelmente devido à transferência incompleta das proteínas do gel para a membrana de manchamento.

[00197] HPLC de Fase Inversa de Furina. Amostras das campanhas ORFU06002 E ORFU07003 (eluados Capto-MMc) foram testadas com C4 RP-HPLC a fim de estabelecer um padrão de impressão digital para rFurina. Os padrões pico das amostras das duas campanhas foram comparados (vide Figura 17 e Figura 18).

[00198] Cromatogramas de todas as amostras testadas mostram um pico principal característico em um tempo de retenção de aproximadamente 13 min, que pode ser atribuído a Furina. As alturas pico correlacionam-se bem com a concentração de Furina nas amostras. Outras impurezas de proteína podem ser vistas como picos menores na faixa de 8 min a 17 min. Todas as amostras da campanha ORFU07002 mostram significativamente menos e menores picos de impurezas daquelas de ORFU06002. Este fato está bem de acordo com os resultados de SDS-PAGE, como na campanha de modo RFB ORFU07002, um menor número e quantidade diminuída de impurezas foram encontrados.

[00199] Os dados analíticos obtidos pelos métodos de caracterização discutidos acima provam comparabilidade muito boa da rFurina produzida tanto em modo quimiostático como modo RFB. Não puderam ser detectadas diferenças maiores na qualidade de rFurina pelos dados disponíveis, entretanto, as bateladas de rFurina produzidas no modo RFB mostraram mais elevada atividade específica e menos impurezas, em comparação com a produção no modo quimiostático. A etapa cromatográfica é responsável pelo conteúdo muito baixo de Proteína de Célula Hospedeira e DNA de Célula Hospedeira na Substância de Medicamento de Massa (BDS). Pelo menos um processo de produção completo, consistindo de fermentação-RFB e do inteiro processamento a jusante (Filtragem, UF/DF, cromatografia Capto-MMC) pode ser mais fácil de implementar para a produção comercial de rFurina, p.

Petição 870190012967, de 07/02/2019, pág. 81/86 / 74 ex., em sistemas de Biorreator de Uso Único (SUB).

EXEMPLO 6

TESTE DE SEGURANÇA, ESTERILIDADE E ESTABILIDADE [00200] Este exemplo descreve o teste de segurança, esterilidade e estabilidade que é realizado para determinar e manter a qualidade do banco de células CHO. O teste de esterilidade/micoplasma tem que ser realizado de acordo com as solicitações do ICH-Guideline Q5D. A qualidade do banco de células tem que ser verificada pela determinação da viabilidade média e densidade das células das células descongeladas e subsequente taxa de crescimento subsequente da cultura.

[00201] As células foram testadas quanto à segurança viral (Tabela 38), estabilidade genética (Tabela 39) e identidade (Tabela 40). As células foram constatadas serem estéreis, livres de micoplasma, livres de agentes estranhos, livres de retrovírus, vírus negativo para MVM, vírus negativos para adventicios, vírus negativos para roedores, vírus livres de porcino e bovino e vírus livres de Cache Valley (CVV).

[00202] Os bancos de célula foram examinados com respeito à relação de produtor/não produtor de Furina por análise FACS. Eles são também testados quanto a sua estabilidade de longo termo (capacidade de produzir Furina durante um período de tempo). Além disso, a Furina secretada produzida sob condições livres de soro tem que ser investigada com respeito às isoformas geradas. Todos os dados devem indicar que o crescimento estável e a produção de Furina podem ser conseguidos usando-se estes bancos de célula.

[00203] As células de MCB/WCB devem apresentar crescimento estável e expressão de Furina através do inteiro processo de produção.

Tabela 38. Programa de Segurança Virus

Teste	MCB	WCB	MEPC
Virus adventicios in vitro (células CHO, A9, Vero, MRC-5)	x	x	x
Vírus adventicios in vivo (em camundongos amamentando, camundongos adultos, porquinhos da índia e ovos embrionados	x	(x)	x

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Virus roedores teste MAP com provocação LCMV	X	-	-
Vírus roedores HAP	x	-	p
Vírus roedores MMV (ensaio in vitro)	x	-	x
Retrovírus EM (exame microscópico eletrônico de transmissão)	x	-	x
Retrovírus Ensaio de Infectividade Retroviral com Ponto Fional Pert	x	-	x
Retrovírus Ex S+L- (detecção in vitro de retrovírus xenotrópicos por Mink S+L- Focus)	x	-	x
Retrovírus/cultivo Co Detecção de retrovírus infecciosos por co-cultivo com células HEK (5 passagens)	-	-	x
Vírus bovino: [ Detecção de contaminantes virais em soro Bovino de acordo com exigências CMPC & US 9CFR	‘x	-	-
Vírus porcino: Ensaio in vitro, detecção de contaminantes virais de porcino empregando-se células indicadoras PPK de acordo com 9CFR	x	-	-
Poliomavírus Bovino PCR	x	-	x
PCR em tempo real de Virus Cache Valley (CVV)	x	-	x

(x) teste viral não foi realizado em WCB de que MEPC foi preparado

Tabela 39. Programa de Estabilidade Genética

Teste	MCB	WCB	MEPC
Produtividade: Ensaio de atividade de Furina	x	x	x
Sequenciamento	x	-	x
PCR quantitativa (número cópias de gene)	x	-	x
Southern blot	x	-	x
Northern blot	x	-	x

Tabela 40. Programa de Identidade

Teste	MCB	WCB	MEPC
Análise isoenzimática	x	x	x

[00204] A presente invenção foi descrita em termos de formas de realização particulares encontradas ou propostas para compreender modos preferidos para a prática da invenção. Será observado por aqueles de habilidade comum na arte que, à luz da presente descrição, numerosas modificações e mudanças podem ser feitas nas formas de realização particulares, exemplificadas sem desvio do escopo pretendido da invenção. Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas cubram todas tais variações equivalentes que se situem dentro do escopo da invenção como reivindicada.

Claims (12)

1. Composição de furina recombinante, caracterizada pelo fato de que a composição compreende furina recombinante substancialmente livre de proteína de célula hospedeira e tendo uma atividade específica de 300 a 620 U/pg proteína, em que a composição compreende proteína de célula hospedeira em uma concentração menor do que 0,6 ng de proteína/U atividade de furina ou DNA de célula hospedeira em uma concentração menor do que 0,5 pg DNA/U atividade de furina.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende furina recombinante tendo uma atividade específica de 350 a 620 U/pg de proteína de célula hospedeira.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende furina recombinante tendo uma atividade específica de 400 a 620 U/pg de proteína de célula hospedeira.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende furina recombinante tendo uma atividade específica de 450 a 620 U/pg de proteína de célula hospedeira.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende DNA de célula hospedeira CHO em uma concentração menor do que 0,5 pg DNA/U atividade de furina.

6. Método para produzir a composição de furina recombinante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com uma furina codificando polinucleotídeo em meio livre de soro em um processo de batelada alimentada repetida sob condições que permitam secreção da furina dentro do meio; ligar a furina secretada em uma resina de troca de cátion multimodal para remover proteína de célula hospedeira, DNA de célula hospedeira, ou uma combinação dos mesmos; e recuperar a furina recombinante secretada a partir da resina de troca de cátion

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2 / 2 multimodal.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adaptar a célula hospedeira para desenvolver-se em meio com concentrações crescentemente mais baixas de soro, até todo o soro ser removido do meio.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende transferir a célula hospedeira do cultivo em meio compreendendo soro para cultivo em meio livre de soro.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de CHO.

10. Método para produzir uma proteína madura utilizando a composição de furina recombinante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma proproteína com a composição sob condições para clivar um pro-peptídeo da proproteína para formar uma proteína madura.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína madura é Fator von Willebrand.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína madura é Fator VIII.

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