JP2003512036A - Ｔａｄｇ−１５：癌において過剰発現されている細胞外セリンプロテアーゼ - Google Patents

Ｔａｄｇ−１５：癌において過剰発現されている細胞外セリンプロテアーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードするＤＮＡ、ならびにＴＡＤＧ−１５タンパク質を提供する。また、組換え細胞における発現に適合させた、本発明のＤＮＡを発現できるベクター、および細胞におけるＤＮＡの発現に必要である調節要素を提供する。さらに、本発明は、ＴＡＤＧ−１５の発現および／またはプロテアーゼ活性を阻害する方法、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を検出する方法、ならびに、ＴＡＤＧ−１５阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。さらには、本発明は、ＴＡＤＧ−１５を介した細胞特異的ターゲティング、ならびに個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種を行う方法を提供する。記載の方法は、癌、特に乳癌および卵巣癌の診断、治療、および予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景関連出願への相互参照 本発明は、１９９８年２月２０日出願の米国特許出願第09/027,337号の一部継
続出願であり、米国特許法第１２０条の規定による優先権を主張する。
【０００２】発明の分野 本発明は、概して、細胞生物学、および新生物性疾患の診断の分野に関する。
より詳細には、本発明は、癌において過剰発現されている、腫瘍抗原誘導遺伝子
(Tumor antigen-derived gene)１５（ＴＡＤＧ−１５）と称される細胞外セリン
プロテアーゼに関する。
【０００３】 関連技術 細胞外プロテアーゼは腫瘍増殖、腫瘍細胞の脱離、および標的臓器への浸潤に
直接関連している。限定はされないが、個々のクラスのプロテアーゼは、（ａ）
腫瘍原発巣の周りのストローマの消化；（ｂ）腫瘍細胞の解離をもたらす細胞接
着分子の消化；（ｃ）転移性増殖、ならびに腫瘍増殖因子および血管新生促進因
子の活性化のための基底膜の浸潤；に関連する。
【０００４】 癌の進行および浸潤の過程において、プロテアーゼは特定のタンパク質分解を
介在し、腫瘍細胞の周りの細胞外マトリックス成分の除去、悪性腫瘍細胞の解離
をもたらす細胞間接着分子の消化、および多くの増殖因子および血管新生促進因
子の活性化に寄与する1-3。触媒ドメインの特性に依存して、プロテアーゼは４
つのファミリーに分類される：セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アス
パラギン酸プロテアーゼ、およびシステインプロテアーゼ３。それらプロテアー
ゼの中で、メタロプロテアーゼは、腫瘍増殖および進行に関連して詳細に研究さ
れており、細胞外マトリックスを分解し、それによって悪性腫瘍細胞の浸潤能を
高め得ることが知られている1,4,5。セリンプロテアーゼに関して、今までの研
究は、腫瘍細胞におけるプラスミノーゲン活性化因子の産生の増強、ならびに、
プラスミノーゲン活性化因子の活性と癌の攻撃性との正の相関を示している6,7
。前立腺特異的抗原（セリンプロテアーゼ）は異常な前立腺増殖の指標としても
広く用いられている8。つい最近、いくつかの他のセリンプロテアーゼ、すなわ
ち、卵巣癌において過剰発現され、腫瘍細胞の細胞外溶解活性を高めることによ
って悪性進行に寄与する、ヘプシンおよび角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ
）が報告された9。
【０００５】 先行技術は、癌において過剰発現されているプロテアーゼを同定するための有
効なスクリーニング手段を欠く。本発明は、本技術分野における長年の必要性お
よび要求を満たすものである。
【０００６】 発明の概要 本発明は、正常組織と比較して、初期の腫瘍および転移性腫瘍における差別的発
現を用いて、増幅ＰＣＲ産物を調べることによって、癌において過剰発現されて
いるプロテアーゼを同定するためのスクリーニングプログラムについて開示する
。腫瘍細胞において過剰発現されている候補遺伝子を同定するための試みは、セ
リンプロテアーゼの触媒ドメインの三つ組アミノ酸残基(His-Asp-Ser)の周囲の
高度に保存されたドメインを利用する。本明細書において、今まで文献で報告さ
れていない、卵巣癌において高度に発現されている独自の形態のセリンプロテア
ーゼに関する証拠を示す。正常組織、悪性度の低い潜在的腫瘍(low malignant p
otential tumor)、および明らかな癌の、差別的ＰＣＲ増幅を用いたスクリーニ
ング法によって、癌にのみ存在するＰＣＲ産物をサブクローン化および配列決定
し、さらに、セリンプロテアーゼファミリーと一致する触媒ドメインを有するこ
とを見つけた。その転写物の完全クローニングおよび配列決定、ならびに卵巣腫
瘍細胞におけるその発現に関する証拠をこの中で報告する。
【０００７】 本発明の１つの実施形態において、（ａ）腫瘍抗原誘導遺伝子（ＴＡＤＧ−１
５）タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡに対し
て、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１５タン
パク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列にお
いて前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり、かつＴＡＤＧ−１５タンパ
ク質をコードする単離ＤＮＡ；より成る群から選択される、ＴＡＤＧ−１５タン
パク質をコードするＤＮＡを提供する。本実施形態は、ＴＡＤＧ−１５ ＤＮＡ
と、細胞において前記ＤＮＡを発現させるのに必要な調節要素とを包含するベク
ターをさらに含む。さらには、ＴＡＤＧ−１５アンチセンス ｍＲＮＡが産生さ
れるように、ＴＡＤＧ−１５ ＤＮＡが調節要素に対して逆配向で配置されてい
るベクターを含む。
【０００８】 本発明の別の実施形態において、（ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードす
る単離ＤＮＡ；（ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡに対してハイブリダイズし、かつ
ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の縮重のせ
いでコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり、かつＴ
ＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；より成る群から選択されたＤ
ＮＡによってコードされる、単離および精製ＴＡＤＧ−１５タンパク質を提供す
る。
【０００９】 本発明のさらに別の実施形態において、（ａ）ＴＡＤＧ−１５に特異的なプロ
ーブと試料とを接触させ；さらに（ｂ）試料中におけるＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮ
Ａに対するプローブの結合を検出する；各工程を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５
ｍＲＮＡを検出する方法を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、Ｔ
ＡＤＧ−１５に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含んでなるＴＡＤＧ−１
５ ｍＲＮＡを検出するキットを提供する。キットにおいて、検出のための標識
がさらに具体化されている。
【００１０】 さらに、本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５またはその断片に特異的な抗体と試
料とを接触させ；さらに、（ｂ）試料中におけるＴＡＤＧ−１５タンパク質に対
する抗体の結合を検出する；各工程を含んでなる、試料中のＴＡＤＧ−１５タン
パク質を検出する方法を具体化する。同様に、本発明は、ＴＡＤＧ−１５または
その断片に特異的な抗体を含んでなる、試料中のＴＡＤＧ−１５タンパク質を検
出するキットを具体化する。
【００１１】 別の実施形態において、本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片
に特異的な抗体を提供する。
【００１２】 さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質と
化合物とを接触させ；さらに（ｂ）ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を測定する
；各工程を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５を阻害する化合物をスクリーニングする
方法を提供する。通常、化合物の不在下でのＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性と
比較して、化合物の存在下でのＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性が低いことが、
ＴＡＤＧ−１５を阻害する化合物の指標となる。
【００１３】 本発明のさらに別の態様において、細胞にベクターを導入する工程を含んでな
り、ベクターの発現によって細胞中にＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲＮＡが産
生され、ＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲＮＡが内因性ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮ
Ａにハイブリダイズし、それによって細胞におけるＴＡＤＧ−１５の発現が阻害
されることを特徴とする、細胞におけるＴＡＤＧ−１５の発現を阻害する方法を
提供する。
【００１４】 さらに本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異的な抗体を
細胞に導入する工程を含んでなり、抗体のＴＡＤＧ−１５タンパク質への結合に
よって、ＴＡＤＧ−１５タンパク質が阻害されることを特徴とする、細胞におけ
るＴＡＤＧ−１５タンパク質を阻害する方法を提供する。
【００１５】 本発明の実施形態において、ＴＡＤＧ−１５に特異的なターゲット部分と、治
療部分とを含む化合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティン
グ療法を施す方法を提供する。
【００１６】 本発明の実施形態において、（ａ）個体から生物学的試料を採取し；さらに、
（ｂ）その試料中におけるＴＡＤＧ−１５を検出する；各工程を含んでなり、試
料中にＴＡＤＧ-１５が存在すれば個体に癌が存在することを示唆し、さらに試
料中にＴＡＤＧ−１５が存在しなければ個体に癌が存在しないことを示唆する、
個体における癌を診断する方法を提供する。
【００１７】 本発明の別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡ
ＤＧ-１５タンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含んでなり、ＴＡ
ＤＧ-１５タンパク質またはその断片の接種によって、個体において免疫応答が
誘導され、それによって個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種が行われる
、個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種を行う方法を提供する。
【００１８】 本発明の実施形態において、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡＤＧ-
１５タンパク質またはその断片に、樹状細胞を暴露させる工程を含んでなり、Ｔ
ＡＤＧ−１５またはその断片の暴露によって樹状細胞が活性化され、それによっ
てＴＡＤＧ−１５に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする、Ｔ
ＡＤＧ−１５に特異的な免疫活性化細胞を産生させる方法を提供する。
【００１９】 本発明の別の態様において、ＴＡＤＧ-１５タンパク質の免疫原断片と、適切な
アジュバントとを含んでなる、免疫原組成物を提供する。
【００２０】 本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の開示の目的で提供された本発明
の現在の好ましい実施形態の記載から明らかであろう。
【００２１】 図面の簡単な説明 本発明の前記の特徴、利点および目的、ならびに明らかになるであろう他の内
容が達成されかつ詳細に理解されるように、添付図面に例示された本発明のある
実施形態を参照することによって、前記において簡単に要約された本発明につい
てのより詳細な説明を行う。それら図面は本明細書の一部を構成する。しかしな
がら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示したものであり、本発明の範
囲を限定することを意図していないことに注意すべきである。
【００２２】 図１は、ヘプシン(Heps、配列番号３)、ＳＣＣＥ（配列番号４）、トリプシン
（Try、配列番号５）、キモトリプシン(Chymb、配列番号６)、７因子(Fac7、配
列番号７)、および組織プラスミノーゲン活性化因子（Tpa、配列番号８）と、Ｔ
ＡＤＧ−１５のセリンプロテアーゼ触媒ドメインとの比較を示す。星印は、触媒
三つ組残基の保存アミノ酸を指示する。
【００２３】 図２は、ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ならびにＴＡＤＧ−１
５タンパク質のアミノ酸配列を示す。推定開始コドンは、ヌクレオチド２３−２
５に位置する。
【００２４】 図３は、機能的部位およびドメインを含む、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼのア
ミノ酸配列を示す。潜在的膜貫通配列に下線を引いている。星印はＣＵＢドメイ
ンの保存システイン残基を指示する。ＬＤＬ受容体リガンド結合反復様ドメイン
のＳＤＥ-モチーフを線で囲んでいる。矢印は、活性化に基づき切断されるアル
ギニン−バリン結合を示す。触媒三つ組残基：ヒスチジン、アスパラギン酸、お
よびセリン残基：の保存アミノ酸を丸で囲む。
【００２５】 図４は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質の図解を示す。１；細胞質ドメイン（aa #1
-54）、２；膜貫通ドメイン（aa #55-57）、３；細胞外ドメイン（aa #78-213）
、４−５；ＣＵＢ反復（aa #214-447）、６−９；ＬＤＬ受容体リガンド結合反
復（クラスＡモチーフ）様ドメイン（aa #453-602）、１０；セリンプロテアー
ゼ（aa #615-855）。
【００２６】 図５は、正常卵巣、卵巣癌、癌細胞株、正常胎児性組織、および正常成体組織
における、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。全て
のサブタイプの癌、および２つの卵巣癌細胞株ＳＷ６２６およびＣＡＯＶ３にお
いて、ＴＡＤＧ−１５の１つの強い転写が観察されたが、一方、正常卵巣または
２つの乳癌細胞株では全く可視的なバンドが検出されなかった。正常胎児性組織
の中で、胎児性腎臓が増強された転写を示し、さらに、胎児性肺で弱い発現が検
出された。正常成体組織では、小腸および前立腺における弱い発現と共に、結腸
においてＴＡＤＧ−１５が検出された。
【００２７】 図６Ａは、ＴＡＤＧ−１５発現の定量的ＰＣＲ分析を示す。β-チューブリンに
対するＴＡＤＧ−１５の発現レベルは、全てのＬＭＰ腫瘍において有意に上昇し
ている。ｍ；粘液性、ｓ；漿液性。
【００２８】 図６Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍、および卵巣癌における、β-チューブリン
の発現に対するＴＡＤＧ−１５発現の比を示す。正常卵巣における発現と比較し
て、ＬＭＰ腫瘍（*；p<0.001）および癌（**；p<0.0001）の両方において、ＴＡ
ＤＧ−１５ ｍＲＮＡ発現レベルは有意に上昇していた。１０の正常卵巣試料の
全てが、低レベルのＴＡＤＧ−１５発現を示した。
【００２９】 図７は、卵巣癌組織および乳癌組織の両方から派生した腫瘍細胞株におけるＴ
ＡＤＧ−１５の発現を示す。
【００３０】 図８は、他の腫瘍組織におけるＴＡＤＧ−１５の過剰発現を示す。
【００３１】 図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離しかつ免疫ブロットした、ＳＷ６２６
およびＣＡＯＶ３細胞の溶解物を示す。ライン１および２は、陰性対象として免
疫前のウサギ血清を用いて実験した。ライン３および４は、ＴＡＤＧ−１５タン
パク質配列由来のカルボキシル末端ペプチドに対して作成されたウサギポリクロ
ナール抗体を用いて実験した。
【００３２】 図１０は、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼペプチドに対するポリクロナール抗体
を用いた正常卵巣上皮の免疫組織化学染色が、ストローマまたは上皮の染色を全
く示さないことを示唆する（図１０Ａ）。しかしながら、癌の抗体染色において
、漿液性の悪性度の低い潜在的腫瘍（図１０Ｂ）；粘液性の悪性度の低い潜在的
腫瘍（図１０Ｃ）;漿液性癌（図１０Ｄ）；の細胞質におけるＴＡＤＧ−１５発
現の存在；ならびに子宮内膜様癌（図１０Ｅ）の細胞質および細胞表面の両方に
おけるＴＡＤＧ−１５発現の存在を確認した。
【００３３】 図１１は、ヒトＴＡＤＧ−１５タンパク質と、マウスエピチン(epithin)との
配列の整列を示し、２つの配列が、８４３アミノ酸に亘り、８４％類似で８１％
同一であることを示す。２つのタンパク質の間で同一の残基は、“−”で指示さ
れ、一方、“*”はＴＡＤＧ−１５翻訳終結部分を示す。それら２つのタンパク
質の間の最も重要な差異はカルボキシル末端にあり、エピチンはＴＡＤＧ−１５
に存在しない４７アミノ酸を含む。
【００３４】 図１２は、ＴＡＤＧ−１５とヒトＳＮＣ−１９(GeneBank 登録番号#U20428)と
のヌクレオチド配列の比較を示す。
【００３５】 発明の詳細な説明 プロテアーゼは、腫瘍増殖および浸潤に必要とされる細胞外調節に関係してい
る。卵巣癌の進行に寄与するプロテアーゼを分類する目的で、触媒三つ組残基Hi
s、Asp、およびSerの周囲の保存アミノ酸ドメインに対する重複プライマーを利
用して、癌において差別的に発現されているセリンプロテアーゼを増幅させた。
本方法を用いて、ＴＡＤＧ−１５（腫瘍抗原誘導遺伝子１５）と称されるセリン
プロテアーゼが卵巣腫瘍において過剰発現されていることを確認した。ＴＡＤＧ
−１５は膜貫通型マルチドメインセリンプロテアーゼであると考えられる。ＰＣ
Ｒ、ノーザンブロット、および免疫学的局在決定によると、ＴＡＤＧ−１５は卵
巣腫瘍において高度に過剰発現されている。
【００３６】 ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡは、８５５アミノ酸タンパク質（配列番号２）をコ
ードする３１４７塩基対長（配列番号１）である。ＴＡＤＧ−１５遺伝子を利用
可能であることは、多くの有用性をもたらす。例えば、卵巣癌、ならびに乳癌、
前立腺癌、肺癌および結腸癌等の他の癌における診断または治療ターゲットとし
てＴＡＤＧ−１５遺伝子を用いることができる。
【００３７】 本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｂ）
前記（ａ）の単離ＤＮＡに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号
の縮重のせいでコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異な
り、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ：より成る群から選
択される腫瘍抗原誘導遺伝子（ＴＡＤＧ−１５）タンパク質をコードするＤＮＡ
に関する。ＤＮＡが配列番号１記載の配列を有し、かつＴＡＤＧ−１５タンパク
質が配列番号２記載のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３８】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５ ＤＮＡと、細胞における該ＤＮＡの発現に必要な
調節要素とを含んでなるベクター、あるいは、ＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲ
ＮＡが産生されるように、ＴＡＤＧ−１５ ＤＮＡが調節要素に対して逆配向で
配置されているベクターに関する。通常、ＤＮＡは、配列番号２記載のアミノ酸
配列を有するＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする。また、本発明は、前記の
ベクターの何れかでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。例示的宿主細胞
は、細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、および昆虫細胞である。好ましくは、細
菌細胞は大腸菌(E.coli)である。
【００３９】 本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｂ）
高ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の単離ＤＮＡに対してハイブリダイズ
し、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の
縮重のせいでコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり
、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；より成る群から選択
されたＤＮＡによってコードされる、単離および精製ＴＡＤＧ−１５タンパク質
に関する。好ましくは、本タンパク質は配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
。
【００４０】 本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５に特異的なプローブと試料とを接触させ；さ
らに、（ｂ）試料中におけるＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡに対するプローブの結合
を検出する；各工程を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡを検出する方法に
関する。本発明はまた、（ａ）ＴＡＤＧ−１５またはその断片に特異的な抗体と
試料とを接触させ；さらに、（ｂ）試料中におけるＴＡＤＧ−１５タンパク質に
対する抗体の結合を検出する；各工程を含んでなる、試料中のＴＡＤＧ−１５タ
ンパク質を検出する方法に関する。通常、試料は生物学的試料であり；好ましく
は、その生物学的試料は個体に由来するものであり；さらに通常、その個体は癌
を有する疑いがある個体である。
【００４１】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含んでな
る、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡを検出するキットに関する。本キットは：プロー
ブを標識するための標識；および標識を検出する手段；をさらに含んでいて差し
支えない。さらに、本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異
的な抗体を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出するキットに関する。
本キットは、抗体を検出する手段をさらに含んでいて差し支えない。
【００４２】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異的な抗体に関する
。
【００４３】 本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質と化合物とを接触させ；さらに、
（ｂ）ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を測定する；各工程を含んでなる、ＴＡ
ＤＧ−１５を阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。通常、化合物
の不在下でのＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性と比較して、化合物の存在下での
ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性が低いことが、ＴＡＤＧ−１５を阻害する化合
物の指標となる。
【００４４】 内因性ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡにハイブリダイズするＴＡＤＧ−１５アンチセ
ンスｍＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入し、それによって細胞におけるＴ
ＡＤＧ−１５の発現を阻害する工程を含んでなる、細胞におけるＴＡＤＧ−１５
の発現を阻害する方法に関する。
【００４５】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質を阻害する、ＴＡＤＧ−１５タンパク質
またはその断片に特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞におけ
るＴＡＤＧ−１５タンパク質を阻害する方法に関する。通常、ＴＡＤＧ−１５タ
ンパク質の阻害は、癌を治療するためである。
【００４６】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５に特異的なターゲット部分と、治療部分とを含む化
合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティング療法を施す方法
に関する。例示的ターゲット部分は、ＴＡＤＧ−１５に特異的な抗体、およびＴ
ＡＤＧ−１５に結合するリガンドまたはリガンド結合ドメイン（例えば、ＣＵＢ
、ＬＤＬＲ、プロテアーゼ、および細胞外ドメイン）である。同様に、例示的治
療部分は、放射性同位体、毒素、化学療法剤、および免疫促進剤である。通常、
前記の方法は、個体が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、および子宮頸
癌に罹っている場合に有用である。
【００４７】 本発明は、（ａ）個体から生物学的試料を採取し；さらに、（ｂ）その試料中
におけるＴＡＤＧ−１５を検出する；各工程を含んでなる、個体における癌を診
断する方法に関する。通常、試料中にＴＡＤＧ-１５が存在すれば個体に癌が存
在することを示唆し、さらに試料中にＴＡＤＧ−１５が存在しなければ個体に癌
が存在しないことを示唆する。通常、生物学的試料は、血液、腹水、尿、涙液、
唾液、または間質液である。ＴＡＤＧ−１５を検出する一般的手段は、ノーザン
ブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオ
イムノアッセイ、ＤＮＡチップ、または腫瘍細胞標識である。本方法は，卵巣癌
、乳癌、ならびに肺癌、前立腺癌および結腸癌のようなＴＡＤＧ−１５が過剰発
現されている他の癌において有用であろう。
【００４８】 本発明はまた、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を有
するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、そのようなアン
チセンスヌクレオチド、および該アンチセンスヌクレオチドのための生理的に許
容される担体を含んでなる組成物に関する。
【００４９】 本発明はまた、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを個体に投与する工
程を含んでなる、治療を必要とする個体の個々の症候群における、新生物性の症
状を治療する方法に関する。好ましくは、新生物性の症状は、卵巣癌、乳癌、肺
癌、前立腺癌、結腸癌、ならびにＴＡＤＧ−１５が過剰発現されている他の癌よ
り成る群から選択される。そのような治療のため、オリゴヌクレオチド単独で、
または他の抗新生物薬と組み合わせて、全身投与または局所投与等、種々の投与
形態に適応させて製剤化することができる。技術および製剤は、Remington’s P
harmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Paに記載されている
。通常、投与形態および剤形に基づき、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤
、崩壊剤、界面活性剤、または滑剤等の希釈剤または賦形剤のような生理的に許
容される担体と、オリゴヌクレオチド活性材料とを組み合わせる。一般的な剤形
として、錠剤；粉末；懸濁液、エマルジョン、および溶液等の液体製剤；顆粒剤
；カプセル；および坐剤；ならびにリポソーム製剤等の注射用液体製剤等が挙げ
られる。
【００５０】 全身投与のため、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下等の注射が好ましい。
注射のため、本発明のオリゴヌクレオチドは、溶液中、好ましくは生理学的に適
合するバッファー中に製剤化される。さらに、オリゴヌクレオチドを固形製剤と
し、使用直前に再溶解または懸濁させても差し支えない。凍結乾燥形態であって
も差し支えない。全身投与に用いられる用量は、好ましくは、約0.01mg/kgから5
0mg/kgの範囲であり、１日当たり１回または２回投与する。しかしながら、（１
）ターゲットＤＮＡの活性を阻害する個々のオリゴヌクレオチドの能力、（２）
病的症状の重篤度または程度、あるいは（３）所定のオリゴヌクレオチドの薬物
動力学的挙動に基づいて、様々な用量スケジュールを用いることができる。
【００５１】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡＤＧ-１５タンパク質ま
たはその断片を個体に接種する工程を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５過剰発現に対
して個体にワクチン接種する方法に関する。ＴＡＤＧ-１５タンパク質またはそ
の断片の接種は、個体における免疫応答を誘導し、それによって個体にＴＡＤＧ
−１５に対するワクチン接種が行われる。この中に記載のＴＡＤＧ−１５のワク
チン接種は、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性のある
個体を対象とする。通常、個体にワクチン接種するのに有用であるＴＡＤＧ−１
５断片は、配列番号２、１９、２０、２１、２９、３９、４９、５０、５９、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８９、および９０に記載の好ましい９残基
断片を有する、９残基断片から２０残基断片である。
【００５２】 本発明は、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡＤＧ-１５タンパク質ま
たはその断片に樹状細胞を暴露させる工程を含んでなり、ＴＡＤＧ−１５または
その断片への暴露によって樹状細胞が活性化され、それによってＴＡＤＧ−１５
に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする、ＴＡＤＧ−１５に特
異的な免疫活性化細胞を産生させる方法を提供する。例示的免疫活性化細胞は、
Ｂ細胞、Ｔ細胞、および樹状細胞である。通常、ＴＡＤＧ−１５断片は、配列番
号２、１９、２０、２１、２９、３９、４９、５０、５９、７９、８０、８１、
８２、８３、８４、８９、および９０に記載の好ましい９残基断片を有する、９
残基断片から２０残基断片である。好ましくは、暴露前に樹状細胞を個体から単
離し、暴露後、活性化樹状細胞を個体に再導入する。通常、本方法が適用される
個体は、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性のある個体
である。
【００５３】 本発明は、ＴＡＤＧ-１５タンパク質の免疫原断片と、適切なアジュバントとを
含んでなる、免疫原組成物に関する。通常、ＴＡＤＧ−１５断片は、配列番号２
、１９、２０、２１、２９、３９、４９、５０、５９、７９、８０、８１、８２
、８３、８４、８９、および９０に記載の好ましい９残基断片を有する、９残基
断片から２０残基断片である。
【００５４】 本発明に基づき、当業技術内の従来の分子生物、微生物および組換えＤＮＡ技
術を用いて差し支えない。そのような技術は文献に全て記載されている。例えば
、Maniatis, Fritsch＆Sambrook, “Molecular Cloning”: A Laboratory Manua
l (1988); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes I and II (D.N.
Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “
Nucleic Acid Hybridization” [B.D.Hames＆S.J.Higgins eds. (1985)]; “Tra
nscription and Translation” [B.D. Hames ＆S.J. Higgins eds. (1984)]; “
Animal Cell Culture” [R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells A
nd Enzymes” [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, “A Practical Guide To Molec
ular Cloning” (1984)を参照。
【００５５】 従って、この中に出てきた場合に、以下の用語は次に示す定義を有する。
【００５６】 この中で用いられた「ｃＤＮＡ」の用語は遺伝子のｍＲＮＡ転写物のＤＮＡ複
製物を称する。
【００５７】 この中で用いられた「誘導アミノ酸配列」の用語は、ｃＤＮＡにおける３塩基
連鎖を読むことによって特定されるアミノ酸配列を意味する。
【００５８】 この中で用いられた「ライブラリーをスクリーニングする」の用語は、標識プ
ローブを用いて、適切な条件下においてプローブに対して相補的である配列が特
定ＤＮＡライブラリ−中に存在するか否かを調べる方法を称する。さらには、「
ライブラリーをスクリーニングする」ことは、ＰＣＲによって実施しても差し支
えない。
【００５９】 この中で用いられた「ＰＣＲ」の用語は、米国特許第４，６８３，１９５号お
よび第４，６８３，２０２号（Mullis）の主題であるポリメラーゼ連鎖反応、な
らびに当業界で現在公知である他の改良法を称する。
【００６０】 この中に記載のアミノ酸は、好ましくは、「Ｌ」異性体である。しかしながら
、ポリペプチドによる免疫グロブリン−結合の所望の機能的特性が維持される限
り、「Ｄ」異性体の残基もＬアミノ酸残基を代用し得る。ＮＨ２はポリペプチド
のアミノ末端に存在するフリーのアミノ基を称する。ＣＯＯＨはポリペプチドの
カルボキシル末端に存在するフリーのカルボキシル基を称する。標準的ポリペプ
チド命名法, J Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969)を踏まえて、アミノ酸残基の
省略形は当業界で公知である。
【００６１】 この中で、全てのアミノ酸残基配列は、左から右への方向がアミノ末端からカ
ルボキシル末端への従来の方向で示されていることに注意すべきである。さらに
は、アミノ残基配列の始めまたは終わりにおけるダッシュ記号は、１つ以上のア
ミノ酸残基から成る別の配列に対するペプチド結合を指示する。
【００６２】 「レプリコン」は、インビボにおいてＤＮＡ複製の自律単位として機能する；
すなわち、それ自体の制御下において複製し得る任意の遺伝要素（例えば、プラ
スミド、染色体、ウィルス）である。
【００６３】 「ベクター」は、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリ
コンであり、それに対して別のＤＮＡ断片が結合してその結合した断片の複製を
もたらすことができる。
【００６４】 「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖螺旋形態の何れかのデオキシリボ
ヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体を称する
。ＤＮＡ分子の用語は、その分子の１次および２次構造のみを称し、特定の３次
構造に限定されない。従って、ＤＮＡ分子の用語は、特に、線状ＤＮＡ分子（例
えば制限酵素断片）、ウィルス、プラスミドおよび染色体において認められる二
本鎖ＤＮＡを含む。この中で構造について議論する際に、ＤＮＡの転写されない
鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向にあ
る配列のみを与える通常のやり方に従う。
【００６５】 発現ベクターは、細胞においてポリペプチドの発現をもたらし得る適切な制御
配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列が作動可能に結合した複製可能な構
築物である。そのような制御配列の必要性は、選択された細胞および選択された
形質転換法に依存して変化するであろう。通常、制御配列は、転写プロモーター
および／またはエンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転
写および翻訳の終結を制御する配列を含む。適切な転写および翻訳制御シグナル
を包含する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることが
できる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory M
anual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. に記載の技術を参照のこと
。転写制御配列が効率的に遺伝子の転写を制御する場合には、遺伝子とその転写
制御配列とが「作動可能に結合している」と定義される。本発明のベクターとし
て、限定はされないが、プラスミドベクターおよびウィルスベクターが挙げられ
る。本発明の好ましいウィルスベクターとして、レトロウィルス、アデノウィル
ス、アデノ随伴ウィルス、ＳＶ４０ウィルスまたはヘルペスウィルスが挙げられ
る。通常、発現ベクターは、挿入されたＤＮＡ断片の効率的な転写を促進させる
、宿主と関連して用いられるプロモーター配列を含む。発現ベクターは、通常、
複製起点、プロモーター、ターミネーター、ならびに形質転換細胞において表現
型の選択をもたらし得る特定遺伝子を包含する。当業界で公知の手段に従って形
質転換宿主を発酵および培養して、最適な細胞増殖を得ることができる。
【００６６】 「複製起点」は、ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列を称する。
【００６７】 ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビ
ボにおいて、転写されかつポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列を称する
。５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端にお
ける翻訳終止コドンによって、コード配列の境界が特定される。コード配列とし
て、限定はされないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、
真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮ
Ａ配列等が挙げられる。ポリアデニル酸シグナルおよび転写終結配列は、通常、
コード配列の３’側に位置する。
【００６８】 転写および翻訳の制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす
、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル酸シグナル、ターミネータ
ー等のＤＮＡ調節配列である。
【００６９】 「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合しかつ下流
（３’側）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を特
定する目的において、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位
に結合し、さらに、バックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始す
るのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’側）に伸長する。
プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼに対する結
合を担うタンパク質結合部位（コンセンサス配列）が認められるであろう。真核
生物のプロモーターは、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ
」ボックスを包含することが多い。原核生物プロモーターは、−１０および−３
５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガーノ配列を包含する。
【００７０】 「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する
ＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、さら
にその転写物がそのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場
合、コード配列は転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００７１】 「シグナル配列」はコード配列の近くに包含されていて差し支えない。シグナ
ル配列は、宿主細胞に伝達してそのポリペプチドを細胞表面に方向付けし、ある
いはそのポリペプチドを媒体中に分泌させる、そのポリペプチドのＮ末端にある
シグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドは、タンパク質が細胞から遊離
する前に宿主細胞によって切り離される。シグナル配列は、原核生物および真核
生物に天然に存在する種々のタンパク質と関連して見出される。
【００７２】 この中で用いられている「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」の用
語は、特定ヌクレオチド配列部分またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素
を称する。
【００７３】 外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞はそのようなＤＮＡ
によって「形質転換されている」。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノム中に（共有結
合して）組み込まれても組み込まれなくても差し支えない。例えば、原核細胞、
酵母および哺乳類細胞において、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソ
ーム要素上に保持されていて差し支えない。真核細胞に関して、安定に形質転換
された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体複製を介して娘
細胞に受け継がれるような細胞である。その安定性は、真核細胞が、形質転換Ｄ
ＮＡを包含する娘細胞の集団から成る細胞株またはクローンを樹立する能力によ
って説明される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または祖先に由
来する細胞集団である。「細胞株」は何世代にも亘りインビトロで安定に増殖し
得る初代細胞のクローンである。
【００７４】 ＤＮＡ配列の特定された長さに亘り、ヌクレオチドの約７５％以上（好ましく
は約８０％以上、さらに最も好ましくは約９０％または９５％以上）が一致する
場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同である」。配列データバンクにおいて
利用可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、
例えば、特定の系のために決定されたストリンジェントな条件下におけるサザン
ハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同である配列を同定すること
ができる。適切なハイブリダイゼーション条件を決定することは、当業技術の範
囲内である。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I＆II, su
pra; Nucleic Acid Hybridization, supraを参照。
【００７５】 ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡ
断片であって、そのより大きな分子に関連して天然では認められないＤＮＡ断片
である。従って、その異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺
伝子は、その由来生物のゲノム中ではその哺乳類遺伝子に隣接しないようなＤＮ
Ａに隣接するであろう。別の例において、コード配列は、そのコード配列自体が
天然では認められないような構造である（例えば、ゲノムコード配列がイントロ
ンまたは天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を包含するようなｃＤＮＡ
）。対立遺伝子変異または自然に生じる突然変異事象は、この中で定義されたＤ
ＮＡの異種領域を生じさせない。
【００７６】 そのような研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、
紫外線に暴露された際に蛍光を発する化学物質等である。多くの蛍光物質が公知
であり、標識として用いることができる。蛍光物質として、例えば、フルオレセ
イン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシフ
ァーイエロー(Lucifer Yellow)が挙げられる。特定の検出物質は、ヤギにおいて
調製しかつイソチオシアネートを介してフルオレセインに結合させた抗ウサギ抗
体である。
【００７７】 また、放射性元素または酵素を用いてタンパク質を標識しても差し支えない。
任意の現在利用可能な測定法によって放射能標識を検出することができる。3Ｈ
、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆ
ｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅから好ましいアイソトープを
選択することができる。
【００７８】 酵素標識も同様に有用であり、任意の現在利用されている比色、分光測光、蛍
光測光、電流滴定またはガス定量技術によって検出することができる。カルボジ
イミド、ジイソシアネート、グルタールアルデヒド等のような架橋分子を用いた
反応によって、選択された粒子に酵素を結合させる。それら方法において用いら
れる多くの酵素は公知でありかつ利用可能である。好ましい酵素は、ペロキシダ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペロキシダーゼ、およびアルカリ
ホスファターゼである。代替の標識物質および方法の開示を例示する目的で、米
国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号および第４，０１６，
０４３号を参照する。
【００７９】 本技術分野において開発されかつ利用される特定の測定系は、受容体測定法と
して知られている。受容体測定法において、測定すべき物質を適切に標識し、次
に、多くのその標識物質を特定細胞試験コロニーに接種し、その後、標識物質が
細胞受容体に結合する割合を特定するために結合試験を行う。本方法において、
物質間の親和性の違いを確かめることができる。
【００８０】 本技術分野において有用である測定法は、「シス／トランス」測定法として知
られている。詳細には、その測定法は２つの遺伝子構築物を用い、第一の構築物
は通常適切な細胞株にトランスフェクトされた場合に特定の関心受容体を連続的
に発現するプラスミドであり、第二の構築物は受容体／リガンド複合体の制御下
においてルシフェラーゼのような受容体を発現するプラスミドである。従って、
例えば、特定受容体に対するリガンドとして化合物を評価するのが望ましい場合
、第一のプラスミドは選択された細胞株において受容体の発現をもたらす構築物
であり、一方、第二のプラスミドは特定受容体に対する応答要素が挿入された、
ルシフェラーゼ遺伝子に結合したプロモーターを有するであろう。試験された化
合物が受容体のアゴニストである場合、そのリガンドは受容体と複合体を形成し
、得られた複合体が応答要素に結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させ
るであろう。得られた化学ルミネセンスを光度計測によって測定し、さらに用量
反応曲線を作成して公知リガンドのものと比較する。前記プロトコルは米国特許
第４，９８１，７８４号に詳細に記載されている。
【００８１】 この中で用いられている「宿主」の用語は、原核細胞のみでなく、酵母、植物
および動物細胞等の真核細胞も含むことを意味する。本発明のヒトＴＡＤＧ−１
５タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子または遺伝子を用いて、当業者に周
知である任意の技術を利用して、宿主を形質転換させることができる。原核生物
を形質転換させる目的において、本発明のヒトＴＡＤＧ−１５タンパク質をコー
ドする遺伝子のコード配列を包含するベクターを用いることが特に好ましい。原
核宿主として、大腸菌(E.coli)、サルモネラ・タイフィムリウム(S. typhimuriu
m)（ネズミチフス菌）、セラシア・マルセッセンスおよび枯草菌が挙げられる。
真核宿主として、ピッチア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母、哺乳
類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００８２】 本発明は、実質的に純粋なＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードするＤＮＡを含
み、そのＤＮＡ鎖は、配列番号１記載の配列の少なくとも１５連続ヌクレオチド
から成る配列を包含するプローブに対して、高ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするであろう。本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、
図３および４に挙げられたアミノ酸（配列番号２）と８０％以上（好ましくは８
５％以上、さらに最も好ましくは９５％以上）の配列の一致を有するであろう。
より好ましくは、そのＤＮＡは、図２のヌクレオチド（配列番号１）のコード配
列、またはそのような配列の縮重変異体を包含する。本発明はまた、図２に示さ
れたヌクレオチド（配列番号１）の１から３１４７までのヌクレオチドの領域の
少なくとも１５（好ましくは２０、より好ましくは３０、さらに好ましくは５０
、最も好ましくは全て）の連続ヌクレオチドの配列を包含する実質的に純粋なＤ
ＮＡを含む。
【００８３】 「実質的に純粋なＤＮＡ」は、その環境中のいくつかのまたは全ての分子の分
離（部分精製または全精製）によって、あるいは請求ＤＮＡに隣接する配列の変
化によって、そのＤＮＡが自然に生じた環境の一部ではなくなったＤＮＡを意味
する。従って、その用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウ
ィルスに組み込まれたまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込ま
れた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した分離分子（例えば、ｃＤＮＡ
、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化
によって作成されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡ
を含む。また、その用語は、例えば融合タンパク質のような追加のポリペプチド
配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。また、
その用語は、ＴＡＤＧ−１５の選択的スプライシング変異体（ＴＡＤＧ−１５Ｖ
）をコードする、図２に挙げられているヌクレオチド（配列番号１）の一部を包
含する組換えＤＮＡを含む。
【００８４】 「実質的に純粋なタンパク質」は、天然において付随する成分の少なくともい
くつかから分離されたタンパク質を意味する。通常、インビボにおいて目的タン
パク質と共に自然に生じたタンパク質および天然の他の有機分子を含まないで６
０重量％以上の純度である場合に、そのタンパク質は実質的に純粋である。好ま
しくは、調製物の純度は、７５重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さ
らに最も好ましくは９９重量％以上である。例えば、天然供給源からの抽出によ
って；ＴＡＤＧ−１５ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；ま
たはタンパク質の化学合成によって；実質的に純粋なＴＡＤＧ−１５タンパク質
を得ることができる。ＴＡＤＧ−１５に特異的な抗体を用いたイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析のような任意の適切な方法によって純度を
測定することができる。天然の状態において目的タンパク質に付随する不純物の
少なくともいくつかから分離された場合には、そのタンパク質は天然において付
随する成分を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたまたはそれが天然
において由来する細胞と異なる細胞系において産生されたタンパク質は、定義に
よれば、天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋
なタンパク質は、大腸菌、他の原核生物、あるいはそれらタンパク質が自然には
生じない任意の他の生物体において合成された原核生物タンパク質を含む。
【００８５】 この中で用いられている「オリゴヌクレオチド」の用語は、２つ以上、好まし
くは３つより多くのリボヌクレオチドを包含する分子として定義される。その正
確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終機能および用途に依存する多くの
因子に基づくであろう。この中で用いられている「プライマー」の用語は、精製
制限酵素消化物の場合のような自然に生じたものであるかあるいは合成されたも
のであるかにかかわらず、適切な条件下、すなわち適切な温度およびｐＨにおい
てヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在下に置かれた場
合に、特定核酸に相補的な鎖の合成を開始させることができるオリゴヌクレオチ
ドを称する。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であっても差し支えなく、誘
発剤の存在下において所望の伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さである
必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの配列および／また
は相同性、ならびに使用する方法等の多くの因子に依存するであろう。例えば、
診断に用いる場合には、ターゲット配列の複雑さに依存し、オリゴヌクレオチド
プライマーは通常１５−２５以上のヌクレオチドを包含するが、それより少ない
ヌクレオチドを包含するものであっても差し支えない。
【００８６】 この中のプライマーは、特定ターゲットＤＮＡ配列に対して「実質的に」相補
的であるように選択される。このことは、プライマーが各鎖とハイブリダイズす
るのに十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列
は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断
片（すなわち、制限酵素部位を有する）は、プライマー配列の残り部分がその鎖
に相補的であるプライマーの５’末端に結合することができる。あるいは、プラ
イマー配列がその鎖に十分な相補性を有しまたはその鎖とハイブリダイズして伸
長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、非相補的塩基またはよ
り長い配列がプライマー中に散在していて差し支えない。
【００８７】 本発明のＤＮＡがハイブリダイズするプローブは、好ましくは、図２に挙げら
れたヌクレオチド（配列番号１）のコード配列またはその相補体の好ましくは２
０連続ヌクレオチド、より好ましくは４０ヌクレオチド、よりさらに好ましくは
５０ヌクレオチド、最も好ましくは１００ヌクレオチド以上（１００％まで）の
配列から成る。そのようなプローブは、（ａ）細胞から採取したｍＲＮＡを、標
識ＴＡＤＧ−１５ハイブリダイゼーションプローブと接触させ；さらに（ｂ）そ
のプローブとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する；各工程を含んで
なる方法によって、細胞におけるＴＡＤＧ−１５の発現を検出するのに有用であ
る。
【００８８】 「高ストリンジェント」とは、例えば約０．１ｘＳＳＣの塩濃度による６５℃
での洗浄条件のような、高温および低い塩濃度によって特徴付けされるＤＮＡハ
イブリダイゼーションおよび洗浄の条件、あるいは機能的にそれに対応するよう
な条件を意味する。例えば、非常に厳しい条件として：約５０％ホルムアミドの
存在下における約４２℃でのハイブリダイゼーション；１％ＳＤＳを含有する約
２ｘＳＳＣによる約６５℃での１回目の洗浄；続く約０．１ｘＳＳＣによる約６
５℃での２回目の洗浄；が挙げられる。
【００８９】 ＤＮＡは、図２に挙げられているヌクレオチド（配列番号１）のコード配列に
対して、約７０％以上、好ましくは７５％以上（例えば８０％以上）、最も好ま
しくは９０％以上の同一性を有する。その２つの配列間の同一性は、マッチング
数または同一位置の数の一次関数である。例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれに
おいて所定の位置がアデニンによって占められている場合のように、その２つの
配列の両方における特定位置が同じ単量サブユニットで占められている場合に、
その位置においてそれら２つの配列は同一である。例えば、長さが１０ヌクレオ
チドの配列中の７つの位置が、第２の１０ヌクレオチド配列中の対応する位置と
同一である場合に、その２つの配列は７０％配列同一性を有する。比較配列の長
さは、通常、５０ヌクレオチド以上であり、好ましくは６０ヌクレオチド以上、
より好ましくは７５ヌクレオチド以上、最も好ましくは１００ヌクレオチドであ
る。通常、配列分析ソフトウェア（Sequence Analysis Software Package of th
e Genetics Computer Group(GCG), University of Wisconsin Biotechnology Ce
nter, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を用いて、配列同一性を
測定する。
【００９０】 本発明は、ヒトＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する
ベクターを含み、そのベクターは、宿主において複製でき、作動可能に結合した
ａ）複製起点；ｂ）プロモーター；およびｃ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列：を包含する。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１
記載のＤＮＡ配列の一部を包含する。「ベクター」は、ＴＡＤＧ−１５タンパク
質またはその断片をコードする核酸を増幅および／または発現させるために用い
られる。
【００９１】 実質的に完全長のタンパク質に加えて、本発明は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質
（配列番号２）の断片（例えば抗原性断片）も含む。この中で用いられている、
ポリペプチドに適用される「断片」は、一般的に６残基以上、より一般的に９−
１２残基以上、さらに好ましくは１３−２０残基以上の長さであるが、完全な無
傷の配列よりは短い。あるいは、断片は、配列番号２からの２０−１２０残基の
個々のドメインであっても差し支えない。例えば、天然のまたは組換えのＴＡＤ
Ｇ−１５タンパク質の酵素消化によって、またはＴＡＤＧ−１５の特定断片をコ
ードする発現ベクターを用いた組換えＤＮＡ技術によって、または化学合成によ
って、当業者に公知の方法でＴＡＤＧ−１５タンパク質の断片を作成することが
できる。この中に記載の方法によって、候補断片がＴＡＤＧ−１５の特性（例え
ばＴＡＤＧ−１５に特異的な抗体に結合する）を示す能力を評価することができ
る。当業者に公知の標準的プロトコルによって、精製ＴＡＤＧ−１５またはＴＡ
ＤＧ−１５の抗原性断片を用いて、新規な抗体を作成しまたは既存の抗体を試験
する（例えば、診断的測定における陽性コントロールとして）ことができる。例
えばウサギにおいて免疫原としてＴＡＤＧ−１５またはＴＡＤＧ−１５の断片を
用いることによって作成されたポリクロナール抗血清も本発明に含まれる。当業
者に公知であるモノクロナールおよびポリクロナール抗体作成の標準的プロトコ
ルを用いる。組換えＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡクローンを同定する能力、および
公知のｃＤＮＡクローンからＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡクローンを区別する能力
について、本方法によって作成したモノクロナール抗体をスクリーニングするこ
とができる。
【００９２】 さらには、例えば選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的タンパク質プロ
セッシング事象の産物のような、配列番号２記載の配列の一部によって少なくと
もその一部がコードされているＴＡＤＧ−１５タンパク質、あるいはＴＡＤＧ−
１５の配列の一部分が欠失しているＴＡＤＧ−１５タンパク質も本発明に含まれ
る。例えば標識、リガンド、または抗原性を高める手段として作用するような別
のポリペプチドに、ＴＡＤＧ−１５ポリペプチドの断片または完全ＴＡＤＧ−１
５ポリペプチドを共有結合させて差し支えない。
【００９３】 また、本発明は、ＴＡＤＧ−１５に特異的に結合するポリクロナール抗体また
はモノクロナール抗体も含む。本発明は、完全なモノクロナール抗体のみならず
、例えばＦａｂまたは(Ｆａｂ)2断片；人工単鎖Ｆｖ分子；または例えばマウス
由来の１つの抗体の結合特異性および例えばヒト由来の別の抗体の残りの部分を
有する抗体のようなキメラ分子：等の免疫活性抗体断片も含む。
【００９４】 １つの実施形態において、抗体またはその断片を、毒素、あるいは放射性標識
、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、常磁性標識、酵素標
識または比色標識等の検出可能な標識に結合させて差し支えない。適切な毒素の
例として、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素Ａ、リシン、およびコレラ毒
素が挙げられる。適切な酵素標識として、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌
ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコール脱水素酵素、α−
グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペロキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ等が挙げられる。適切な放射性標識として、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ
、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ等が挙げられる。
【００９５】 本発明の方法に基づいて、インビボ診断のために常磁性同位体を用いて差し支
えない。磁気共鳴画像法において有用である元素について多くの例がある。イン
ビボでの核磁気共鳴画像法について検討するために、例えば、Schaefer et al.,
(1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336
-340; Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey
et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al.,
(1984) Invest. Radiol. 19, 408-415を参照。適切な蛍光標識の例として、イ
ソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニ
ン標識、アロフィコシアニン標識、オフタルデヒド(ophthaldehyde)標識、フル
オレサミン標識等が挙げられる。化学ルミネセンス標識の例として、ルミナル標
識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識
、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェ
ラーゼ標識、エクオリン標識等が挙げられる。
【００９６】 当業者は、本発明に基づいて用いることができる他の適切な標識を知っている
であろう。当業者に公知の標準技術を用いて、それら標識を抗体またはその断片
に結合させることができる。一般的な技術は、Kennedy et al., (1976) Clin. C
him. Acta 70, 1-31; and Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40
に記載されている。後者の文献に記載のカップリング技術はグルタールアルデヒ
ド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキ
シ−スクシニミドエステル法である。それら方法の全てが参照によってこの中に
組み込まれる。
【００９７】 生物学的試料中のＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出する方法も本発明の範囲内
であり、その方法は、例えば放射能でタグ付けしたＴＡＤＧ−１５特異的抗体の
ような標識抗体と、試料とを接触させ、さらにその抗体が試料中の成分に結合し
たか否かを特定する工程を含む。免疫測定において、ＴＡＤＧ−１５タンパク質
に対する抗体を用いて、新生物性形質転換の疑いが高い組織におけるＴＡＤＧ−
１５タンパク質発現レベルの上昇を検出することができる。ノーザンブロット法
および分析を用いてそれら同じ用途を達成できる。
【００９８】 この中に記載のように、本発明は多くの診断的利点および用途を提供する。例
えば、本発明において開示されたＴＡＤＧ−１５タンパク質は、そのタンパク質
が腫瘍細胞において高度に過剰発現されていることから、様々な組織における癌
を診断するのに有用である。ＴＡＤＧ−１５に特異的なエピトープに結合する抗
体（またはその抗原結合断片）は、癌または新生物の形質転換を診断するための
、生物学的試料中のＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出する方法において有用であ
る。本方法は、癌を有する疑いがある患者から生物学的試料（例えば細胞、血液
、血漿、組織等）を採取し、さらにＥＬＩＳＡのような標準的免疫測定技術を用
いてＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出する各工程を含んでなる。生物学的試料に
対する抗体結合は、その試料がＴＡＤＧ−１５内のエピトープを有する成分を含
むことを示唆する。
【００９９】 同様に、標準的なノーザンブロット法を用いて、当業者に公知の従来のノーザ
ンハイブリダイゼーション技術に基づいて、癌であることが疑わしい細胞または
組織中におけるＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡの相対量を確かめることができる。そ
のノーザン法は、例えば、配列番号１（図２）に相補的である配列を有する完全
長の一本鎖ＤＮＡ、あるいは２０以上（好ましくは３０以上、より好ましくは５
０以上、さらに最も好ましくは１００以上の連続ヌクレオチドの長さ）の前記Ｄ
ＮＡ配列の断片の何れかを包含する放射性標識ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡのよう
なハイブリダイゼーションプローブを用いる。当業者に周知の様々な方法によっ
て、そのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。
【０１００】 以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、
何ら本発明を限定することを意図していない。
【０１０１】実施例１ 組織採取および保存 患者の子宮摘出、両方の卵巣摘出、または新生組織の外科的切除の際に、試料
を回収して氷上に置いた。特定組織試料の単離および同定のために、その試料を
研修医の病理学者に渡した。最終的に、液体窒素中においてその試料を凍結し、
実験記録に記入して、−８０℃に保存した。
【０１０２】 時々、ヒト組織ネットワーク協会（ＣＨＴＮ）から追加の試料を得た。それら
試料はＣＨＴＮによって調製され、ドライアイスに入れて出荷された。到達する
と、それら試料（例えば、血液（血清）、尿、唾液、涙液、および間質液）を実
験記録に記入して、−８０℃で保存した。腫瘍組織の提供において、ヒト組織ネ
ットワーク協会（ＣＨＴＮ）の以下の部門の参加が承認されている：西部部門、
ウェスタンリザーブ大学(クリーブランド、オハイオ州)；中西部部門、オハイオ
州立大学（コロンバス、オハイオ州）；東部部門、NDRI（フィラデルフィア、ペ
ンシルベニア州）；小児科部門、子供病院（コロンバス、オハイオ州）；南部部
門、バーミンガムのアラバマ大学（バーミンガム、アラバマ州）。
【０１０３】実施例２ ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ合成 ４１の卵巣腫瘍（１０の悪性度の低い潜在的腫瘍、および３１の癌）、ならび
に１０の正常卵巣を外科的試料から得て、液体窒素中において凍結した。Americ
an Type Culture Collection(Rockville, MD)から、ヒト卵巣癌細胞株ＳＷ６２
６およびＣＡＯＶ３、ならびに、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭ
ＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓを購入した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および抗生物
質を補足したダルベッコの改良イーグル培地中において、サブコンフルエントに
なるまで細胞を培養した。
【０１０４】 Becton Dickinsonから購入したMini RiboSepTM Ultra mRNA 単離キットを用い
て、その取扱説明書に基づいて、ｍＲＮＡを単離した。その方法において、オリ
ゴ（ｄＴ）セルロースを介したアフィニティークロマトグラフィーを用いて、組
織溶解物からポリＡ＋ｍＲＮＡを直接単離した。回収されたｍＲＮＡの量は、Ｕ
Ｖ分光測光法によって定量化された。
【０１０５】 CLONTECH(Palo Alto, CA)から購入した第一鎖合成キットを利用して、製品のプ
ロトコルに基づき、５．０μg ｍＲＮＡ、ならびにランダムヘキサマーまたはオ
リゴ（ｄＴ）プライマーの何れかを用いて、第一鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を
合成した。ｐ５３遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって、ｃＤＮ
Ａの純度を評価した。ゲノムＤＮＡが混入したｃＤＮＡから純粋なｃＤＮＡを区
別できるように、プライマーはイントロンに架かる。
【０１０６】 実施例３重複プライマーを用いたＰＣＲ、ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡのクローニング、Ｔ- ベクターライゲーションおよび形質転換、ならびにＤＮＡ配列決定 セリンプロテアーゼの触媒三つ組残基の周囲のアミノ酸に対応する重複プライ
マーとして、前進の５’−ＴＧＧＧＴＩＧＴＩＡＣＩＧＣＩＧＣＩＣＡ（Ｃ／Ｔ
）ＴＧ−３’（配列番号１１）、および反対の５’−Ａ（Ａ／Ｇ）ＩＧＧＩＣＣ
ＩＣＣＩ（Ｃ／Ｇ）（Ｔ／Ａ）（Ａ／Ｇ）ＴＣＩＣＣ−３’（配列番号１２）を
用いて、正常および癌のｃＤＮＡからのＰＣＲ産物を比較した。
【０１０７】 製品取扱説明書に基づいて、プロメガＴ−ベクタープラスミド中に精製ＰＣＲ
産物を連結し、さらに、その連結産物を用いて、ＪＭ１０９コンピテント細胞(P
romega)を形質転換した。増幅のために陽性コロニーを培養し、さらに、WizardT M Miniprep ＤＮＡ精製システム（Promega）によってプラスミドＤＮＡを単離し
、その後、ApaIおよびSacI制限酵素でプラスミドを消化し、挿入物のサイズを特
定した。以前に記載のＰＣＲ産物ゲル電気泳動によって可視化されたサイズの挿
入物を有するプラスミドを配列決定した。
【０１０８】 個々のクローンを培養し、Wizard Miniprep ＤＮＡ精製システム（Promega）を
用いてプラスミドＤＮＡを単離した。直接的ｃＤＮＡ配列決定のために、Applie
d Biosystemsモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンスシステムを用いた。クローニ
ング部位近傍のプラスミド特異的プライマーを利用して、製品の取扱説明書に基
づき、PRISMTM Ready Reaction Dye DeoxyTMターミネーターサイクルシークエン
スキット(Applied Biosystems)を用いてヌクレオチド配列決定を実施した。Cent
ri-sepTMスピンカラム(Princeton Separation)を用いて、完了した配列決定反応
から染色ターミネーターを除去した。特定された配列に基づき、関心遺伝子を特
異的に増幅させるプライマーを設計および合成した。
【０１０９】 初代のＴＡＤＧ−１５サブクローン(436bp)を無作為に標識して、標準的ハイブ
リダイゼーション技術13によって卵巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするためのプローブとして用いた。そのライブラリーは、ステージIII／グレ
ードIIIの卵巣腺癌患者の癌細胞から単離したｍＲＮＡを用いて、８ＺＡＰ中に
構築された。３１４７ヌクレオチドに架かる３つの重複するクローンを得た。
【０１１０】実施例４ ノーザンブロット分析 0.02M ＭＯＰＳ、0.05M酢酸ナトリウム(pH7.0)、および0.001M ＥＤＴＡ中の
１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルを用いた電気泳動によって、ｍＲＮＡ（
１０μg）をサイズ分離した。次に、２０ｘＳＳＰＥ中での毛管現象によって、H
ybond-N+ナイロン膜(Amersham)上にｍＲＮＡをブロットした。８０℃で２時間加
熱乾燥することによって、ＲＮＡを膜に固定した。Prime-a-Gene標識システム(P
romega)によって、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作成した。前記と同じプライ
マーによって増幅させたＰＣＲ産物をプローブに用いた。ブロットを３０分間プ
レハイブリダイズさせ、さらにExpressHybハイブリダイゼーション溶液(CLONTEC
H)中において、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと、６８℃で６０分間ハイブリダイ
ズさせた。β−チューブリンプローブを用いて、相対的ゲル装填量を特定するた
めの対照ハイブリダイゼーションを実施した。
【０１１１】 同じハイブリダイゼーション法によって、正常なヒト組織；脾臓、胸腺、前立
腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児性組
織；脳、肺、肝臓および腎臓(Human Multiple Tissue Northern Blot; CLONTECH
)も評価した。CLONTECHから購入した別途の多様組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロッ
トは、ヒトＭＴＮブロット、ヒトＭＴＮ IIブロット、ヒト胎児性ＭＴＮ IIブロ
ット、およびヒト脳ＭＴＮ IIIブロットを含む。
【０１１２】実施例５ ウェスタンブロット分析 ＴＡＤＧ−１５タンパク質配列「ＬＦＲＤＷＩＫＥＮＴＧＶ」（配列番号１３
）由来の、ポリリジン結合複合Ａｇペプチドで免疫することによって、ウサギポ
リクロナール抗体を作成した。約２０μgの細胞溶解物を１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
ゲルで分離し、４℃、１００Ｖで４０分間、ＰＶＤＦに電気ブロッティングした
。５０％ＭｅＯＨ中において１０分間インキュベートすることによってタンパク
質を膜に固定した。0.2％脱脂乳を含有するＴＢＳ(pH7.8)中において、膜を1晩
ブロッキングした。0.2％乳／ＴＢＳで１：１００に希釈した一次抗体を膜に添
加し、室温で２時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、１：３０００に希
釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ(BioRad)と共に室温で１
時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、化学発光性基質と共にインキュベ
ートした後、可視化のためにＸ線フィルムを１０秒間感光させた。
【０１１３】実施例６ 定量的ＰＣＲ 定量的ＰＣＲを用いて、ＴＡＤＧ−１５のｍＲＮＡ過剰発現を特定した。以前
報告された方法11、12に基づいて、定量的ＰＣＲを実施した。オリゴヌクレオチ
ドプライマーとして：ＴＡＤＧ−１５のために、前進の５’−ＡＴＧＡＣＡＧＡ
ＧＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１４）、および反対の５’−ＧＡＡ
ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１５）；およびβ−チュ
ーブリンのために、前進の５’−ＣＧＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡ−
３’（配列番号１６）、反対の５’−ＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧ
Ａ−３’（配列番号１７）を用いた。β−チューブリンは内部対照として用いら
れた。
【０１１４】 ＰＣＲ反応混合物は、最終容積２５μl中に、反応バッファー(Promega)と共に
、ｍＲＮＡ（５０ng）から誘導されたｃＤＮＡ、ＴＡＤＧ−１５遺伝子およびβ
−チューブリン遺伝子のためのセンスおよびアンチセンスプライマー（５pmol）
、ｄＮＴＰs（２００μmol）、α-３２ＰｄＣＴＰ（５μＣｉ）、ならびにＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０．２５ｕｎｉｔ）を含む。β−チューブリン遺伝子
と並行させて、ターゲット配列を増幅させた。サーマルサイクラー(Thermal Cyc
ler)(Perkin Elmer Gene Amp 2400; Perkin-Elmer Cetus)において、ＰＣＲを３
０サイクル実施した。ＰＣＲの各サイクルは、９４℃での３０秒間の変性、６０
℃での３０秒間のアニーリング、および７２℃での３０秒間の伸長を含む。アニ
ーリング温度は、ＰＣＲ反応に用いられるプライマーによって変化する。縮重プ
ライマーを含む反応のため、４８℃のアニーリング温度を用いた。ＴＡＤＧ−１
５特異的プライマーおよびβ-チューブリン特異的プライマーのための適切なア
ニーリング温度は６２℃である。
【０１１５】 ２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物の一部を分離し、さらに、ホスホイメージ
ャー(Molecular Dynamics)を用いることによって、各ＰＣＲ産物の放射能を特定
した。本研究では、発現比（ＴＡＤＧ−１５／β−チューブリン）を用いて遺伝
子発現を評価し、さらに、正常卵巣の平均値±２ＳＤを、過剰発現を特定するた
めのカットオフ値として定義した。正常卵巣と腫瘍の平均値を比較するために、
student’s-t testを用いた。
【０１１６】実施例７ 免疫組織化学分析 Vectastain Elite ABCキット(Vector)を用いて、免疫組織化学染色を実施した
。ホルマリン固定およびパラフィン包埋した切片をいつものように脱パラフィン
処理し、さらに、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（pH6.0）中におい
てマイクロ波熱処理によって処理した。湿気のあるチャンバー中において３０分
間、正常ヤギ血清と共にその切片をインキュベートした。ビオチン化抗ウサギＩ
ｇＧと共に３０分間インキュベートした後、その切片をＡＢＣ試薬(Vector)と共
に３０分間インキュベートした。ＡＢＣ基質系(DAKO)を用いて最終生成物を可視
化し、さらに標本にする前にヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の代わり
に正常血清を用いることによって、陰性対照を実施した。
【０１１７】実施例８ アンチセンスＴＡＤＧ−１５ アンチセンスＲＮＡ分子（配列番号１８）が産生されるように、逆配向でＴＡ
ＤＧ−１５をクローン化および発現させた。例えば、アンチセンスＲＮＡを用い
て、細胞中の相補的ＲＮＡにハイブリダイズさせ、それによってＴＡＤＧ−１５ ＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する。
【０１１８】実施例９ ペプチドの順位付け ワクチンまたは免疫刺激のために、それぞれ９マーから１１マーのＴＡＤＧ−
１５タンパク質を調べて、一般人口の上位８つのハプロタイプに対する各ペプチ
ドの結合を順位付けした（Parker et al., (1994)）。＜http://www-bimas.dcrt
.nih.gov/molbio/hlabind/＞において、その分析に用いられるコンピュータープ
ログラムを見つけることができる。表１は、各ペプチドの特定ＨＬＡ対立遺伝子
に対する結合の予測半減期に基づくペプチドの順位付けを示す。より長い半減期
は、そのペプチドと特定ＨＬＡ分子とのより強い結合を示唆する。ＨＬＡ対立遺
伝子に対して強く結合するＴＡＤＧ−１５ペプチドは推定上の免疫原であり、か
つ個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種を行うために用いられる。
【０１１９】
【表１】
【表２】
【表３】 実施例１０ ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡ 正常組織と比較して腫瘍において特異的に増幅されるＲＴ-ＰＣＲ産物を調べ
ることによる、ヒト癌において過剰発現されているプロテアーゼを同定するため
のスクリーニング戦略を開発した。本試みの間、触媒ドメインのＮＨ３末端にあ
る保存されたヒスチジンドメインに対する重複センスプライマー、および下流の
保存されたセリンドメインに対するアンチセンスプライマーを用いて、候補遺伝
子を同定した。プロテアーゼをコードする遺伝子を同定するため、そのようなＰ
ＣＲ反応において増幅された適切な４８０塩基対のバンドをサブクローニングお
よび配列決定した。増幅された触媒ドメインの中で、ＴＡＤＧ−１５（腫瘍抗原
誘導遺伝子１５）と称される新規なセリンプロテアーゼ遺伝子を同定した。その
新規に同定されたＴＡＤＧ−１５タンパク質の触媒ドメインは、他のセリンプロ
テアーゼのものと類似しており、具体的には、チロシン様セリンプロテアーゼフ
ァミリーの触媒ドメインに適した保存アミノ酸を包含している。
【０１２０】 ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼドメインに相同であるアミノ酸配列に関する、Ｆ
ＡＳＴＡプログラム(Wisconsin Package Version 9.1, GCG, Madison, Wisconsi
n)を用いたGenEMBLデータベースのコンピューター検索は、他の公知のヒトプロ
テアーゼとの相同性が５５％を越えないことを示した。図１は、他のヒトセリン
プロテアーゼと比較して、ＴＡＤＧ−１５のプロテアーゼドメインを整列させた
ものを示す。ＧＣＧを介して利用可能なBESTFITプログラムを用いた結果、ＴＡ
ＤＧ−１５と、チロシン、キモトリプシン、および組織プラスミノーゲン活性化
因子との間の類似性は、それぞれ、５１％、４６％、および５２％であった。
【０１２１】 ＴＡＤＧ−１５触媒ドメイン由来の配列から、特異的プライマーを合成して、
ライブラリーのスクリーニングのためＴＡＤＧ−１５特異的プローブを増幅させ
た。卵巣癌ライブラリーをスクリーニングした後、ＴＡＤＧ−１５転写物の３’
末端を含む１つの１７８５ ｂｐクローンを得た。その新規に検出されたクロー
ンの５’末端を用いてさらにスクリーニングすることによって、ＴＡＤＧ−１５
転写物の５’末端を含む、別の１３６２ ｂｐのｃＤＮＡを提供する、追加のク
ローンを同定した。配列決定されたｃＤＮＡの全長は、約3.15ｋｂであった。得
られた全ヌクレオチド配列は、予測された８５５アミノ酸部分をコードする単一
のオープンリーディングフレームの前にあるコザックのコンセンサス配列を含む
（図２）。
【０１２２】 ＴＡＤＧ−１５ヌクレオチド配列によってコードされた予測オープンリーディ
ングフレーム（図２、３、および４）は、以下のようないくつかの別個のドメイ
ンを含む：アミノ末端細胞質テイル（アミノ酸(aa) #1-54）；潜在的膜貫通ドメ
イン（aa #55-57）；細胞外膜ドメイン（aa #78-213）；２つの補体サブコンポ
ーネント Clr/Cls、 Uegf、および骨形成タンパク質１（ＣＵＢ）反復（aa #214
-447）；４つの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体様ドメインのリガンド結
合反復（aa #453-602）；ならびにセリンプロテアーゼドメイン（aa #615-855）
。ＴＡＤＧ−１５タンパク質はまた、２つの潜在的Ｎ-結合グリコシル化部位(aa
#109および302)、ならびに本タンパク質のカルボキシル末端においてプロテア
ーゼを遊離および／または活性化させることができる、プロテアーゼドメインの
上流にある潜在的タンパク質分解性切断部位(aa #614)を含む。さらには、ＴＡ
ＤＧ−１５は、細胞−細胞接着に関連するタンパク質において共通に見出されて
いる、ＲＧＤモチーフ(aa #249-251)を含む。
【０１２３】実施例１１ ＴＡＤＧ−１５発現 ＴＡＤＧ−１５の転写物のサイズ、および様々な組織における発現パターンを
調べるため、代表的な組織タイプの癌、一連の細胞株、胎児性組織、および正常
生体組織について、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施した（図５
）。ＴＡＤＧ−１５メッセージの転写物サイズは約3.2ｋｂとして特定され、１
つの強い転写物が、調べた癌の全てに存在することが観察されたが、正常卵巣で
は全く可視バンドが検出されなかった（図５）。その転写物サイズは、配列デー
タから予測した転写物サイズ3.15ｋｂともよく一致している。卵巣腫瘍細胞株Ｓ
Ｗ６２６およびＣＡＯＶ３も多量の転写物を示したが、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５５では殆どまたは全く転写物が検出されな
かった。正常ヒト胎児性組織の中で、胎児性腎臓が多量のＴＡＤＧ−１５転写物
を示し、さらに胎児性肺においても低い発現が検出された。正常生体組織では、
小腸および前立腺における低レベルでの発現と共に、結腸においてＴＡＤＧ-１
５が検出された（図５）。
【０１２４】 卵巣腫瘍および正常卵巣におけるＴＡＤＧ−１５のｍＲＮＡ転写物発現を評価
するため。半定量的ＰＣＲを実施した（図６）。予備実験において、本測定法11 ,12 の直線性を確認しており、その結果はノーザンブロットおよび免疫組織化学
分析と相関した。ホスホイメージャーを用いてデータを定量化し、発現比（ＴＡ
ＤＧ−１５／β-チューブリン）として比較した。結果は、ＴＡＤＧ−１５転写
物発現が、調べた腫瘍の全てにおいて、カットオフ値（正常卵巣の平均値±２Ｓ
Ｄ）を越える高いレベルで検出されるが、正常卵巣では検出されないかまたは低
レベルで検出されることを示唆した（図６ＡおよびＢ）。疾患の初期および末期
を含む卵巣癌サブタイプの分析は、調べた全ての癌におけるＴＡＤＧ−１５の過
剰発現を確認した（表２）。５症例のステージＩおよび３症例のステージＩＩの
癌を含む、調べた癌の全てが、ＴＡＤＧ−１５遺伝子の過剰発現を示した。
【０１２５】 腫瘍の病期および組織学的サブタイプに関してそれらデータを調べた結果、全
ての病期および全ての組織学的サブタイプの癌がＴＡＤＧ−１５を過剰発現して
いることが示唆された。発現比（平均値±ＳＤ）は、正常卵巣群が0.182±0.024
、ＬＭＰ腫瘍群が0.847±0.419、癌群が0.771±0.380であった（表２）。正常卵
巣群と腫瘍群との比較は、ＬＭＰ癌群と癌群の両方において、ＴＡＤＧ−１５遺
伝子の過剰発現が統計的に有意であることを示した（ＬＭＰ腫瘍：p<0.001、癌
：p<0.0001）。
【０１２６】 図６に示すように、ＴＡＤＧ−１５転写物は、全ての卵巣癌において認められ
たが、以下の組織の何れにおいても、検出可能なレベルでは存在しなかった：ａ
）正常卵巣、ｂ）胎児性の肝臓および脳、ｃ）生体の脾臓、胸腺、精巣、卵巣、
および末梢血白血球、ｄ）骨格筋、肝臓、脳、または心臓。本評価を約４０腫瘍
からなる標準的パネルに広げた。ＴＡＤＧ−１５特異的プライマーを用いて、図
７に示すような卵巣癌組織および乳癌組織由来の腫瘍細胞株、ならびに図８に示
すような他の腫瘍組織においても発現を調べた。ＴＡＤＧ−１５の発現は、乳癌
、結腸癌、前立腺癌、および肺癌でも観察された。
【０１２７】 プロテアーゼドメインのカルボキシル末端の合成ペプチド（１２マー）に対し
て作成されたポリクロナール抗体を用いて、正常卵巣および卵巣腫瘍におけるウ
ェスタンブロットおよび免疫学的局在決定によって、細胞株におけるＴＡＤＧ−
１５発現を調べた。抗体および免疫前血清の両方を用いて、ＳＷ６２６およびＣ
ＡＯＶ３細胞由来の細胞抽出物のウェスタンブロットを調べた（図９）。約100,
000ダルトン、約60,000ダルトン、および32,000ダルトンのバンドを含む、いく
つかのバンドが、抗体を用いて検出された。完全ＴＡＤＧ−１５分子の予想分子
サイズは、約100,000ダルトンと推定され、さらに、aa #614でタンパク質分解性
切断によって遊離されるであろうプロテアーゼドメインは約32,000ダルトンと推
定された。いくつかの中間のタンパク質分解産物が60,000ダルトンのバンドに該
当するであろう。
【０１２８】 腫瘍細胞の抗体染色は、一連のＬＭＰ腫瘍、粘液性ＬＭＰ腫瘍、および漿液性
癌の細胞質にＴＡＤＧ−１５プロテアーゼが存在することを支持する（それぞれ
、図１０Ｂ、Ｃ、およびＤ）。その広汎性染色パターンは、ＴＡＤＧ−１５が詰
め込まれて細胞表面に輸送されている時の細胞内のＴＡＤＧ−１５の検出のせい
であろう。子宮内膜様癌において、抗原は癌細胞表面にはっきりと検出された（
図１０Ｅ）正常卵巣の上皮細胞およびストローマ細胞では全く染色が検出されな
かった（図１０Ａ）。２７の一連の腫瘍の免疫組織化学染色は、悪性度の低い潜
在的腫瘍群を含む、調べた全ての癌のサブタイプに、ＴＡＤＧ−１５タンパク質
が存在することを示唆した。９例の悪性度の低い潜在的腫瘍の内７例、および１
８の癌のうち１３例において、強い染色が観察された（表３）。
【０１２９】
【表４】
【表５】 実施例１２ ＴＡＤＧ−１５の相同性 最近、エピチン（GenBank 登録番号AF042822）と称されるマウスタンパク質が
報告されている14。エピチンは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、２つのＣＵ
Ｂドメイン、４つのＬＤＬＲ様ドメイン、およびカルボキシル末端セリンプロテ
アーゼドメインを有する点においてＴＡＤＧ−１５に類似する構造を有する、９
０２アミノ酸タンパク質である。ＴＡＤＧ−１５とエピチンは、８４３アミノ酸
に亘り８４％類似しており、２つのタンパク質がオーソロガスな関係にある(ort
hologous)ことを示唆する（図１１）。エピチンの正確な役割はまだ明らかにさ
れていない。
【０１３０】 以前同定された類似配列に関するGenBankの調査は、ＴＡＤＧ−１５遺伝子の
一部に相対的に高い相同性を有する１つの配列をもたらした。＃１８２から３１
３９ヌクレオチドまでのＴＡＤＧ−１５の一部とＳＮＣ−１９（GenBank登録番
号#U20428）との類似性は、約９７％である（図１２）。しかしながら、ＳＮＣ
−１９とＴＡＤＧ−１５との間には顕著な違いがある。例えば、ＴＡＤＧ−１５
は８５５アミノ酸のオープンリーディングフレームを有するが、ＳＮＣ−１９の
最も長いオープンリーディングフレームは１７３アミノ酸である。さらに、ＳＮ
Ｃ−１９は翻訳開始のための適切な開始部位を含まないばかりか、ＴＡＤＧ−１
５によってコードされているタンパク質のアミノ末端部分も含まない。さらには
、ＳＮＣ−１９は、機能的であるために必要である触媒三つ組残基のHis、Asp、
およびSer残基が異なるリーディングフレーム中にコードされているため、機能
的セリンプロテアーゼのためのオープンリーディングフレームを含まない。
【０１３１】考察 ＴＡＤＧ−１５タンパク質の全体の構造は、トロイド(tolloid)／ＢＭＰ-1フ
ァミリーのメンバー、および補体サブコンポーネントClr/Clsに相対的に類似し
ている。それらタンパク質は、ＣＵＢおよびプロテアーゼドメインの両方を含み
、リガンド結合ドメインを介した複合体形成がその機能に必須である。Clrおよ
びClsのセリンプロテアーゼドメインの活性化は、それぞれ、Arg-GlyおよびArg-
Ile結合のタンパク質分解性切断を必要とする15。同様に、ＴＡＤＧ−１５タン
パク質が、他のセリンプロテアーゼチモーゲンの活性化機構に類似する、Arg614 とVal615との間の切断によって活性化されるチモーゲンとして合成されることが
予測される。培養細胞の溶解物のウェスタンブロット分析は、推定されるチモー
ゲン（完全分子）およびＴＡＤＧ−１５の切断プロテアーゼ産物に対応する１０
０ｋＤａおよび３２ｋＤａペプチドの両方を確認した（図９）。それらデータは
、類似のII型セリンプロテアーゼにおいて生じるような、ＴＡＤＧ−１５のタン
パク質分解性遊離および／または活性化のモデルを支持する。
【０１３２】 ＣＵＢドメインは、補体サブクローンClr/Cls16-18において初めて発見され、
例えば骨形成タンパク質−１（ＢＭＰ-1）およびトロイド遺伝子産物18-20のよ
うな、発生上調節されるタンパク質において広範囲に存在するモジュールである
ことが分かっている。それら反復の役割はまだ分かっていない。しかしながら、
いくつかのモデルは、ＣＵＢドメインがタンパク質−タンパク質相互作用に関連
していることを示唆する。ClrおよびClsのＣＵＢドメインは、タンパク質−タン
パク質相互作用ドメインを提供することによって、補体の古典経路の活性化にお
けるCls-Clr-Clr-Cls四量複合体の集合に参加する15。ショウジョウバエのデカ
ペンタプレギック(decapentaplegic)タンパク質（ＤＰＰ）は、胚の背部−腹部
の指定に必須であり、さらにショウジョウバエのトロイド（ＴＬＤ）は、その活
性を調節するためにＤＰＰと複合体を形成する19,20。トロイドタンパク質のＣ
ＵＢドメインにおけるミスセンス変異は、ＤＰＰ複合体とのタンパク質相互作用
を許さない発現型をもたらす19。
【０１３３】 ＴＡＤＧ−１５タンパク質は、２１４アミノ酸残基と４４７アミノ酸残基との
間に、ＣＵＢ様ドメインの２つのタンデム反復を含む。それら反復のそれぞれは
、約１１０アミノ酸長であり、それぞれ、他のＣＵＢの特性を示している４つの
保存システイン残基を有する（アミノ酸214、244、268、294、340、366、397、4
10）。類推によると、ＴＡＤＧ−１５タンパク質のＣＵＢ反復は、多重結合複合
体の形成を促進し、さらにターゲットタンパク質またはＴＡＤＧ−１５自身の活
性を調節することができる、インターラクティブなドメインを形成するであろう
。
【０１３４】 また、ＴＡＤＧ−１５タンパク質は、４つの隣接したシステインに富む反復か
ら成る、ＬＤＬ受容体リガンド結合反復（クラスＡモチーフ）様ドメイン（アミ
ノ酸残基４５３−６０２）を含む。システインに富む反復のそれぞれは、約４０
アミノ酸長であり、６つのシステイン残基と共に、保存された負に荷電した配列
（Ser-Asp-Glu）を含む。ＬＤＬ受容体タンパク質において、その反復は、リポ
タンパク質中に存在するリジンおよびアルギニン残基と相互作用するタンパク質
結合ドメインとして機能すると考えられている21,22。さらには、ＬＤＬ受容体
の最初の反復は、Ｃａ2+に結合し、リポタンパク質には結合しないと考えられる 23 。類推によると、ＴＡＤＧ−１５におけるＬＤＬ受容体様反復は、他のタンパ
ク質の正に荷電した領域と相互作用する同様の態様でおよび／またはＣａ2+結合
部位として、作用する可能性がある。リガンド結合および受容体−リガンド複合
体の形成の結果として、ＬＤＬ受容体はクラスリン被覆小孔を介して内側に取り
込まれる2,4。ＴＡＤＧ−１５は、サイトゾル領域中にそのモチーフを含まず、
さらには、ＴＡＤＧ−１５の細胞質ドメインにおいて、他の公知タンパク質の配
列との類似性が全く認められなかった。そのような所見は、ＴＡＤＧ−１５が、
細胞外マトリックス中に類似のリガンド結合反復を有するが、エンドサイトーシ
ス受容体（例えばＬＤＬ受容体）とは異なる態様で機能することを示唆する。
【０１３５】 ＴＡＤＧ−１５の正確な役割は分かっていないが、本遺伝子は卵巣腫瘍におい
て明らかに過剰発現されている。例えばＩＶ型コラゲナーゼおよびプラスミノー
ゲン活性化因子のような様々なプロテアーゼは、腫瘍浸潤の過程に関連し、悪性
進行におけるプロテアーゼカスケードの構成要素であると考えられている。ＴＡ
ＤＧ−１５は、そのような活性を構成し、さらに腫瘍の周囲の細胞外マトリック
ス成分を直接消化し、あるいは、不活性前駆体の切断によって他のプロテアーゼ
を活性化して、腫瘍の増殖および浸潤を間接的に増強させるであろう。ＴＡＤＧ
−１５が、他の増殖因子または情報伝達タンパク質と複合体を形成してそれらの
活性を調節することによって、トロイド／ＢＭＰ-1ファミリーのメンバーと同様
に機能することもあり得る。
【０１３６】 それらデータは、ＴＡＤＧ−１５遺伝子およびその翻訳タンパク質が、細胞外
マトリックスおよび最終的に循環へのプロテアーゼドメインの遊離を介して、卵
巣癌の早期検出のための有用なマーカーとなる可能性を高める。また、それらデ
ータは、ＣＵＢ／ＬＤＬＲリガンド結合ドメインを狙った送達システムによる、
治療的介入のためのターゲットとしてＴＡＤＧ−１５を用いることができる可能
性を示唆する。
【０１３７】 以下の引例がこの中で挙げられている：
【表６】 本明細書中に記載された任意の特許または刊行物は、本発明が属する分野の当
業者のレベルを示す。それら特許および刊行物は、個々の刊行物が具体的におよ
び個別的に参照によって組み込まれることが示唆されたのと同様に、参照によっ
てこの中に組み込まれる。
【０１３８】 当業者は、本発明をうまく応用して、その目的を達成しかつ記載のおよび本来
の結果ならびに利点を得ることを容易に理解するであろう。この中において方法
、手段、処置、分子および特定化合物と共に記載した本実施例は、現在での好ま
しい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として見な
されない。当業者はそれらに対する変化および他の用途を考えつき、それらは本
請求の範囲によって特定された本発明の精神に含まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヘプシン(Heps、配列番号３)、ＳＣＣＥ（配列番号４）、トリプシン
（Try、配列番号５）、キモトリプシン(Chymb、配列番号６)、７因子(Fac7、配
列番号７)、および組織プラスミノーゲン活性化因子（Tpa、配列番号８）と、Ｔ
ＡＤＧ−１５のセリンプロテアーゼ触媒ドメインとの比較を示す
【図２Ａ】 図２Ａは、ＴＡＤＧ−１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ならびにＴＡＤＧ
−１５タンパク質のアミノ酸配列を示す
【図２Ｂ】 図２Ｂは、図２Ａの続きである
【図２Ｃ】 図２Ｃは、図２Ｂの続きである
【図３】 図３は、機能的部位およびドメインを含む、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼのア
ミノ酸配列を示す
【図４】 図４は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質の図解を示す
【図５】 図５は、正常卵巣、卵巣癌、癌細胞株、正常胎児性組織、および正常成体組織
における、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す
【図６Ａ】 図６Ａは、ＴＡＤＧ−１５発現の定量的ＰＣＲ分析を示す
【図６Ｂ】 図６Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍、および卵巣癌における、β
-チューブリンの発現に対するＴＡＤＧ−１５発現の比を示す
【図７】 図７は、卵巣癌組織および乳癌組織の両方から派生した腫瘍細胞
株におけるＴＡＤＧ−１５の発現を示す
【図８】 図８は、他の腫瘍組織におけるＴＡＤＧ−１５の過剰発現を示す
。
【図９】 図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、さらに免疫ブロット
した、ＳＷ６２６およびＣＡＯＶ３の細胞溶解物を示す
【図１０】 図１０は、ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼペプチドに対するポリクロナール抗体
を用いた正常卵巣上皮の免疫組織化学染色が、ストローマまたは上皮の染色を全
く示さないことを示唆する
【図１１Ａ】 図１１Ａは、ヒトＴＡＤＧ−１５タンパク質と、マウスエピチン(epithin)と
の配列の整列を示す
【図１１Ｂ】 図１１Ｂは、図１１Ａの続きである
【図１２Ａ】 図１２Ａは、ＴＡＤＧ−１５と、ヒトＳＮＣ−１９(GeneBank 登録番号#U2042
8)とのヌクレオチド配列の比較を示す
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、図１２Ａの続きである
【図１２Ｃ】 図１２Ｃは、図１２Ｂの続きである
【図１２Ｄ】 図１２Ｄは、図１２Ｃの続きである
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 47/48 ４Ｃ０５７ 45/00 48/00 ４Ｃ０７６ 47/48 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８４ 48/00 11/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 1/00 13/08 ４Ｃ０８６ 11/00 15/00 ４Ｈ０４５ 13/08 35/00 15/00 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 16/40 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/06 1/68 Ａ 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/574 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA12 BA14 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ43 QQ44 QR16 QR32 QR55 QS34 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA33 CA44 CA46 4C057 BB05 DD01 MM04 MM09 4C076 AA95 CC41 EE59 FF68 4C084 AA02 AA07 AA13 AA19 BA44 CA18 DC50 MA05 NA10 NA13 ZB092 ZB312 ZC022 4C085 AA03 AA13 AA35 AA38 FF24 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA05 NA10 NA13 ZA59 ZA66 ZA81 ZB26 4H045 AA11 CA41 DA75 EA51 FA74

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；
    （ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイズし、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；ならびに
    、 （ｃ）遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単
    離ＤＮＡと異なり、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；よ
    り成る群から選択される、腫瘍抗原誘導遺伝子１５（ＴＡＤＧ−１５）タンパク
    質をコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 配列番号１記載の配列を有することを特徴とする請求項１記
    載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 前記ＴＡＤＧ−１５タンパク質が、配列番号２記載のアミノ
    酸配列を有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡと、細胞における該ＤＮＡの発現に必
    要である調節要素とを含んでなるベクター。
  5. 【請求項５】 前記ＤＮＡが、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＴＡ
    ＤＧ−１５タンパク質をコードすることを特徴とする請求項４記載のベクター。
  6. 【請求項６】 ＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲＮＡが産生されるように、
    前記ＤＮＡが、前記調節要素に対して逆配向で配置されていることを特徴とする
    請求項４記載のベクター。
  7. 【請求項７】 ＴＡＤＧ−１５タンパク質を発現する請求項４記載のベクタ
    ーでトランスフェクトされた宿主細胞。
  8. 【請求項８】 細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、および細菌細胞より成る
    群から選択されることを特徴とする請求項７記載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 大腸菌であることを特徴とする請求項８記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 （ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ
    ；（ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡに対して、高ストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；ならび
    に、 （ｃ）遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単
    離ＤＮＡと異なり、かつＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；よ
    り成る群から選択されたＤＮＡによってコードされる単離および精製ＴＡＤＧ−
    １５タンパク質。
  11. 【請求項１１】 配列番号２記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする
    請求項１０記載のＴＡＤＧ−１５タンパク質。
  12. 【請求項１２】 （ａ）ＴＡＤＧ−１５に特異的なプローブと試料とを接触
    させ；さらに （ｂ）前記試料中におけるＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡに対する前記プローブの結
    合を検出する；各工程を含んでなる、試料中のＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡを検出
    する方法。
  13. 【請求項１３】 前記試料が生物学的試料であることを特徴とする請求項１
    ２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記生物学的試料が個体由来であることを特徴とする請求
    項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記個体が、癌を有する疑いがあることを特徴とする請求
    項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＴＡＤＧ−１５に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを
    含んでなる、ＴＡＤＧ−１５ ｍＲＮＡを検出するキット。
  17. 【請求項１７】 前記プローブを標識するための標識；および前記標識を検
    出する手段；をさらに含んでなる請求項１６記載のキット。
  18. 【請求項１８】 （ａ）ＴＡＤＧ−１５またはその断片に特異的な抗体と試
    料とを接触させ；さらに、 （ｂ）前記試料中におけるＴＡＤＧ−１５タンパク質に対する前記抗体の結合を
    検出する；各工程を含んでなる、試料中のＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出する
    方法。
  19. 【請求項１９】 前記試料が生物学的試料であることを特徴とする請求項１
    ８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記生物学的試料が個体由来であることを特徴とする請求
    項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記個体が、癌を有する疑いがあることを特徴とする請求
    項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異的な抗体
    を含んでなる、ＴＡＤＧ−１５タンパク質を検出するキット。
  23. 【請求項２３】 前記抗体を検出する手段をさらに含んでなる請求項２２記
    載のキット。
  24. 【請求項２４】 ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異的な抗体
    。
  25. 【請求項２５】 （ａ）ＴＡＤＧ−１５タンパク質を含む試料と化合物とを
    接触させ；さらに、 （ｂ）ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を測定する；各工程を含んでなり、 前記化合物の不在下でのＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性と比較して、前記化
    合物の存在下でのＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性が低いことが、ＴＡＤＧ−１
    ５を阻害する化合物の指標となることを特徴とする、ＴＡＤＧ−１５を阻害する
    化合物をスクリーニングする方法。
  26. 【請求項２６】 細胞に請求項６記載のベクターを導入する工程を含んでな
    り、前記ベクターの発現によって前記細胞中にＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲ
    ＮＡが産生され、前記ＴＡＤＧ−１５アンチセンスｍＲＮＡが内因性ＴＡＤＧ−
    １５ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって前記細胞におけるＴＡＤＧ−
    １５の発現が阻害されることを特徴とする、細胞におけるＴＡＤＧ−１５の発現
    を阻害する方法。
  27. 【請求項２７】 ＴＡＤＧ−１５タンパク質またはその断片に特異的な抗体
    を細胞に導入する工程を含んでなり、前記抗体のＴＡＤＧ−１５タンパク質への
    結合によって、ＴＡＤＧ−１５タンパク質が阻害されることを特徴とする、細胞
    におけるＴＡＤＧ−１５タンパク質を阻害する方法。
  28. 【請求項２８】 ＴＡＤＧ−１５に特異的なターゲット部分と、治療部分と
    を有する化合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティング療法
    を施す方法。
  29. 【請求項２９】 前記ターゲット部分が、ＴＡＤＧ−１５に特異的な抗体、
    およびＴＡＤＧ−１５に結合するリガンドまたはリガンド結合ドメインより成る
    群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記治療部分が、放射性同位体、毒素、化学療法剤、免疫
    促進剤、および細胞傷害性物質より成る群から選択されることを特徴とする請求
    項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、およびＴ
    ＡＤＧ−１５が過剰発現されている他の癌より成る群から選択される癌に罹って
    いることを特徴とする請求項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 （ａ）個体から生物学的試料を採取し；さらに、 （ｂ）前記試料中におけるＴＡＤＧ−１５を検出する；各工程を含んでなり、 前記試料中にＴＡＤＧ-１５が存在すれば前記個体に癌が存在することを示唆し
    、前記試料中にＴＡＤＧ−１５が存在しなければ前記個体に癌が存在しないこと
    を示唆する、個体における癌を診断する方法。
  33. 【請求項３３】前記生物学的試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水
    、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とす
    る請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記ＴＡＤＧ−１５の検出が、ノーザンブロット、ウェス
    タンブロット、ＰＣＲ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法、ラジオイ
    ムノアッセイ、ＤＮＡチップ、またはフローサイトメトリーより成る群から選択
    される手段によってなされることを特徴とする請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記癌が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およ
    びＴＡＤＧ−１５が過剰発現されている他の癌より成る群から選択されることを
    特徴とする請求項３２記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡＤＧ-１５タ
    ンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含んでなり、 ＴＡＤＧ-１５タンパク質またはその断片の接種によって、個体において免疫応
    答が誘導され、それによって、個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種が行
    われることを特徴とする、個体にＴＡＤＧ−１５に対するワクチン接種を行う方
    法。
  37. 【請求項３７】 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは
    癌に罹る危険性があることを特徴とする請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、９残基断片から２０残基断片
    までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項３６記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、配列番号２、１９、２０、２
    １、２９、３９、４９、５０、５９、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８
    ９、および９０に記載の配列より成る群から選択される９残基断片であることを
    特徴とする、請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ＴＡＤＧ−１５プロテアーゼ活性を欠くＴＡＤＧ-１５タ
    ンパク質またはその断片に、樹状細胞を暴露させる工程を含んでなり、 ＴＡＤＧ−１５またはその断片への暴露によって樹状細胞が活性化され、それ
    によってＴＡＤＧ−１５に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とす
    る、ＴＡＤＧ−１５に特異的な免疫活性化細胞を産生させる方法。
  41. 【請求項４１】 前記免疫活性化細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および樹状細胞
    より成る群から選択されることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、９残基断片から２０残基断片
    までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、配列番号２、１９、２０、２
    １、２９、３９、４９、５０、５９、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８
    ９、および９０に記載の配列より成る群から選択される９残基断片であることを
    特徴とする、請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記暴露前に個体から樹状細胞を単離し、暴露後、活性化
    樹状細胞を個体に再導入することを特徴とする、請求項４０記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは
    癌に罹る危険性があることを特徴とする請求項４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ＴＡＤＧ-１５タンパク質の免疫原断片と、適切なアジュ
    バントとを含んでなる免疫原組成物。
  47. 【請求項４７】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、９残基断片から２０残基断片
    までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項４６記載の免疫原
    組成物。
  48. 【請求項４８】 前記ＴＡＤＧ−１５断片が、配列番号２、１９、２０、２
    １、２９、３９、４９、５０、５９、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８
    ９、および９０に記載の配列より成る群から選択される９残基断片であることを
    特徴とする、請求項４７記載の免疫原組成物。
  49. 【請求項４９】 請求項１記載のＤＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を
    有するオリゴヌクレオチド。
  50. 【請求項５０】 請求項４９記載のオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレ
    オチドのための生理学的に許容される担体とを含んでなる組成物。
  51. 【請求項５１】 有効量の請求項４９記載のオリゴヌクレオチドを個体に投
    与する工程を含んでなる、治療を必要とする個体おける新生物性の症状を治療す
    る方法。
  52. 【請求項５２】 前記新生物性の症状が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前
    立腺癌、およびＴＡＤＧ−１５が過剰発現されている他の癌より成る群から選択
    されることを特徴とする請求項５１記載の方法。
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