JP2003523524A5 - - Google Patents

Download PDF

Info

Publication number
JP2003523524A5
JP2003523524A5 JP2001561336A JP2001561336A JP2003523524A5 JP 2003523524 A5 JP2003523524 A5 JP 2003523524A5 JP 2001561336 A JP2001561336 A JP 2001561336A JP 2001561336 A JP2001561336 A JP 2001561336A JP 2003523524 A5 JP2003523524 A5 JP 2003523524A5
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hepsin
cancer
individual
protein
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001561336A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2003523524A (ja
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/510,738 external-priority patent/US6268165B1/en
Application filed filed Critical
Publication of JP2003523524A publication Critical patent/JP2003523524A/ja
Publication of JP2003523524A5 publication Critical patent/JP2003523524A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Description

【発明の名称】卵巣癌の早期診断のための組成物および方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】 個体における癌を診断する方法であって：
（ａ）個体から生物試料を採取する工程；および
（ｂ）前記試料中のヘプシンを検出する工程；を含み、
前記試料中にヘプシンが存在すれば前記個体に癌が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンが存在しなければ前記個体に癌が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項２】 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】 前記ヘプシンの検出が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡアレイチップ、またはフローサイトメトリーより成る群から選択される手段によってなされることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】 前記癌が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】 生体試料中の悪性増殖を検出する方法であって：
（ａ）前記試料からｍＲＮＡを単離する工程；および
（ｂ）前記試料中のヘプシンｍＲＮＡを検出する工程；を含み、
前記試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在すれば悪性増殖が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在しなければ悪性増殖が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項６】 ヘプシンｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の診断が行われることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】 ヘプシンｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の治療法が決定されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】 前記ヘプシンｍＲＮＡの検出が、ＰＣＲ増殖によってなされることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】 前記ＰＣＲ増殖が、配列番号８および９の配列より成る群から選択されるプライマーを使用することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１１】 生体試料中の悪性増殖を検出する方法であって：
（ａ）前記試料からタンパク質を単離する工程；および
（ｂ）前記試料中のヘプシンタンパク質を検出する工程；を含み、
前記試料中にヘプシンタンパク質が存在すれば悪性増殖が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンタンパク質が存在しなければ悪性増殖が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項１２】 ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の診断が行われることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】 ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の治療法が決定されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】 前記ヘプシンタンパク質の検出が、ヘプシンに特異的な抗体に対するイムノアフィニティーによってなされることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１６】 細胞における内因性ヘプシンの発現を阻害する方法であって、
発現に必要なエレメントに作動可能に結合した逆方向のヘプシン遺伝子を含むベクターを細胞に導入する工程を含み、前記細胞での前記ベクターの発現によってヘプシンアンチセンスｍＲＮＡが産生され、該ヘプシンアンチセンスｍＲＮＡが内因性ヘプシンｍＲＮＡにハイブリダイズして、前記細胞における内因性ヘプシンの発現が阻害されることを特徴とする方法。
【請求項１７】 細胞においてヘプシンタンパク質を阻害する方法であって、
ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに対して特異的な抗体を細胞に導入する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質に対する抗体が該ヘプシンタンパク質を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１８】 個体の標的治療の方法であって、ヘプシンに対して特異的なターゲティング部分と薬効部分とを有する化合物を個体に投与する工程を含むことを特徴とする方法
【請求項１９】 前記ターゲティング部分が、ヘプシンに対して特異的な抗体、ヘプシンに結合するリガンドまたはリガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】 前記薬効部分が、放射性同位体、毒素、化学療法薬、免疫増強薬、および細胞傷害性物質より成る群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２１】 前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌に罹患していることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】 個体にヘプシンに対するワクチン接種を行う方法であって、
ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントを個体に接種する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントの接種によって個体に免疫応答が誘導されて、個体にヘプシンに対するワクチン接種が行われることを特徴とする方法。
【請求項２３】 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、または癌を発症するリスクがあることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】 ヘプシンに対する免疫活性化細胞を産生する方法であって、
ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに樹状細胞を曝露する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質またはその断片への曝露によって樹状細胞が活性化されて、ヘプシンに対する免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする方法。
【請求項２７】 前記免疫活性化細胞が、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞、および樹状細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】 前記樹状細胞が、曝露に先立って個体から単離され、曝露後に前記個体に再導入されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３１】 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、または癌を発症するリスクがあることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】 ヘプシンタンパク質の免疫原性フラグメントおよび適当なアジュバントを含む免疫原組成物。
【請求項３３】 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の免疫組成物。
【請求項３４】 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項３３記載の免疫組成物。
【請求項３５】 配列番号１８８の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】 請求項３５記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３７】 個体の腫瘍状態を治療する方法であって、
個体に請求項３５記載のオリゴヌクレオチドの有効量を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】 前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】 ヘプシン活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）ヘプシンタンパク質を含む試料を特定の化合物と接触させる工程；および
（ｂ）ヘプシンプロテアーゼ活性についてアッセイを行う工程；を含み、
前記化合物の存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性が、該化合物の非存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性と比較して低下している場合、該化合物がヘプシン活性を阻害する化合物であることが示唆されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、概して、細胞生物学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、癌、特に卵巣癌の診断の分野に属する。
【０００２】
発明の背景
今日まで、卵巣癌は、婦人科悪性増殖を有する女性の第１位の致死的病気であり続けている。そのような癌を有すると診断された女性の約７５％が、その最初の診断において、既に疾患の進行ステージ（IIIおよびIV）にある。過去２０年間、それら患者の診断および５年生存率のいずれもほとんど改善されていない。それは、実質的に、高いステージでの最初の疾患の検出の割合が高いためである。従って、早期診断を改善させ、それによって高いステージでの最初の診断の割合（％）を減らすような、新規なマーカーを開発するという課題が残されている。
【０００３】
悪性細胞は、in situで成長し得るのみならず、原発腫瘍から解離して、新しい表面に浸潤し得ることから、細胞外プロテアーゼが、多くの癌の増殖、広がり、および転移性の進行に関連していると考えられている。１つの組織から離脱して、別の組織の表面に再び結合し得ることは、その疾患に関連する罹患率および死亡率につながるものである。従って、細胞外プロテアーゼは、新生物発生のマーカーの優れた候補であろう。
【０００４】
悪性細胞が増殖、拡散、および転移するためには、細胞がホストの局所組織に浸潤し、原発腫瘍から解離もしくは分離する能力が必要であり、更に転移が起こるには、悪性細胞が血流中に進入して生存し、標的組織の表面に浸潤、生着し、新たなコロニーの増殖に有利な環境（脈管形成および増殖因子の誘導など）を形成する必要がある。この進行過程において、基底膜や結合組織などの天然の組織障壁が分解されなければならない。こうした障壁として、コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンや、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクス糖タンパク質がある。原発腫瘍の周辺および転移浸潤部位の双方におけるこうした天然障壁の分解は、一群の細胞外プロテアーゼの作用によるものと考えられている。
【０００５】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびシステインプロテアーゼの４つのファミリーに分類される。多くのプロテアーゼはヒトの疾患プロセスにおける関与が示されており、これらの酵素の阻害剤は新たな治療剤としての開発目標となっている。また、ある種のプロテアーゼは多様な癌において誘導、過剰発現が見られることが示されおり、このため初期診断および潜在的な治療的介入のマーカーとして有力な候補であると云える。その例を表１に示す。
【０００６】
【表１】
Figure 2003523524
個々のプロテアーゼの阻害のダウンレギュレーションまたは阻害、ならびに浸潤能および悪性度の低下を示す多くの証左が示されている。クラーク（Ｃｌａｒｋ）等の研究によれば、一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤の使用によるヒト小細胞肺癌のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖阻害が示されている。より最近では、トレス−ロセド（Ｔｏｒｒｅｓ−Ｒｏｓｅｄｏ）等により、セリンプロテアーゼであるヘプシン遺伝子の特定のアンチセンス阻害剤を用いた肝癌腫瘍細胞の増殖阻害が示されている（Proc, Natl. Acad, Sci,USA, 90, 7181-7185 (1993)）。メタロプロテアーゼの合成阻害剤（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）を用いたマウスモデルにおいて、メラノーマ細胞の転移能が低下することも示されている。パウエル（Powell, et al., Cancer Research, 53, 417-422 (1993)）等によれば、腫瘍形成性であるが非転移性の前立腺細胞系を用いて、比較的低浸潤性の腫瘍細胞における細胞外プロテアーゼの発現によって細胞の悪性化が亢進することを示す証左が示された。詳細には、ＰＵＭＰ−１メタロプロテアーゼ遺伝子の導入、発現後に転移能の亢進が確認された。また、比較的低転移性の細胞型における細胞表面プロテアーゼの発現によってこうした細胞の浸潤能が亢進することを示すデータも多く示されている。
【０００７】
すなわち従来の技術にあっては、初期の疾患、特に卵巣癌の指示薬として有用な腫瘍マーカーは存在しなかった。本発明は、当該分野におけるこうした永年の需要、要請に応えたものである。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ヘプシンプロテアーゼの指標である、組織中におけるヘプシンｍＲＮＡ（卵巣癌および他の腫瘍の８０％の表面に特異的に存在することがこの中で示されている）をスクリーニングすることによって、癌、特に卵巣癌の検出を可能とする。プロテアーゼは、腫瘍増殖および転移に必須のものであると考えられており、従って、プロテア−ゼの存在または不在を示唆するマーカーは、癌の診断に有用である。さらには、本発明は、治療（すなわち、ヘプシンまたはヘプシンの発現を阻害することによる）、ターゲティング療法、またはワクチン接種に有用である。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、個体における癌を診断する方法であって、生物試料を個体から採取する工程、およびその試料中のヘプシンを検出する工程を含んでなる方法を提供する。試料中にヘプシンが存在すれば、その個体に癌が存在することが示唆され、試料中にヘプシンが存在しなければ、その個体に癌が存在しないことが示唆される。
【００１０】
本発明の別の一実施形態では、生体試料中の悪性増殖を検出するための方法であって、当該試料からｍＲＮＡを単離する工程、および試料中のヘプシンｍＲＮＡを検出する工程を含んでなる方法が提供される。試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在する場合には、悪性増殖の存在を示し、試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在しない場合には、悪性増殖が存在しないことを示すものである。
【００１１】
本発明の更なる別の一実施形態では、生体試料中の悪性増殖を検出する方法であって、当該試料からヘプシンタンパク質を単離する工程、および試料中のヘプシンタンパク質を検出する工程を含んでなる方法が提供される。試料中にヘプシンタンパク質が存在する場合には、悪性増殖の存在を示し、試料中にヘプシンタンパク質が存在しない場合には、悪性増殖が存在しないことを示すものである。この方法は、ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含んでいてもよく、この比較によって悪性増殖の診断が行われ、または悪性増殖の治療法が決定される。
【００１２】
本発明の更なる別の一実施形態では、細胞におけるヘプシンの発現を阻害する方法であって、発現に必要なエレメントに作動可能に結合した、逆方向のヘプシン遺伝子を含むベクターを細胞に導入する工程を含んでなる方法が提供される。細胞でのベクターの発現によってヘプシンのアンチセンスｍＲＮＡが産生される。このヘプシンのアンチセンスｍＲＮＡは内因性のヘプシンｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって細胞におけるヘプシンの発現を阻害する。
【００１３】
本発明の更なる別の一実施形態では、細胞においてヘプシンタンパク質を阻害する方法であって、ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに対して特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなる方法が提供される。この抗体がヘプシンに結合することでヘプシンタンパク質が阻害される。
【００１４】
本発明の更なる別の一実施形態では、個体の標的治療のための方法であって、ヘプシンに対して特異的なターゲティング部分と薬効部分とを有する化合物を個体に投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１５】
本発明の更なる別の一実施形態では、個体にヘプシンに対するワクチン接種を行う方法であって、ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントを個体に接種する工程を含んでなる方法が提供される。このヘプシンタンパク質またはそのフラグメントの接種によって個体に免疫応答が誘導されて、個体にヘプシンに対するワクチン接種が行われる。
【００１６】
本発明の更なる別の一実施形態では、配列番号１８８に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが提供される。更に具体化されるものとして、上記のオリゴヌクレオチドと生理学的に許容されるその担体を含む組成物がある。更に具体化されるものとして、個体の腫瘍状態を治療する方法であって、個体に上記のオリゴヌクレオチドの有効量を投与する工程を含んでなる方法がある。
【００１７】
本発明の更なる別の一実施形態では、ヘプシン活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、ヘプシンタンパク質を含む試料を特定の化合物と接触させる工程、およびヘプシンプロテアーゼ活性についてアッセイを行う工程を含んでなる方法が提供される。当該化合物の存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性が、当該化合物の非存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性と比較して低下している場合、当該化合物がヘプシン活性を阻害する化合物であることが示されるものである。
【００１８】
本発明の更なる、または他の側面、特徴、ならびに利点は、下記に示す発明の現時点での好ましい実施形態の説明より明らかとなろう。これらの実施形態はあくまで開示を目的としたものである。
【００１９】
図面の簡単な説明
本発明の前記の特徴、利点および目的が明確にされかつ詳細に理解されるように、添付図面が含まれている。それら図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示したものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことに注意すべきである。
【００２０】
図１は、正常および癌のｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物のアガロースゲルの比較を示す。
【００２１】
図２は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、ＰＵＭＰ−１、ＴＡＤＧ−１４、およびβ−チューブリンのプローブを用いた卵巣腫瘍のノーザンブロット分析を示す。
【００２２】
図３は、セリンプロテアーゼ重複プライマー(redundant priminers)での増幅を示す：正常ｃＤＮＡ（レーン１）および腫瘍ｃＤＮＡ（レーン２）を用いて、ヒスチジンセンス（Ｓ１）およびアスパラギン酸アンチセンス（ＡＳ１）での増幅；ならびに正常ｃＤＮＡ（レーン３）および腫瘍ｃＤＮＡ（レーン４）を用いて、ヒスチジンセンス（Ｓ１）およびセリンアンチセンス（ＡＳ２）での増幅。
【００２３】
図４は、システインプロテアーゼ重複プライマーでの増幅を示す。正常（レーン１）、低悪性潜在的腫瘍（レーン２）、漿液性癌（レーン３）、粘液性癌（レーン４）、および明細胞癌（レーン５）。
【００２４】
図５は、メタロプロテアーゼ重複プライマーでの増幅を示す。正常（レーン１）、低悪性潜在的腫瘍（レーン２）、漿液性癌（レーン３）、粘液性癌（レーン４）、および明細胞癌（レーン５）。
【００２５】
図６は、セリンプロテアーゼであるヘプシンに特異的なプライマーでの増幅を示す。正常（レーン１−３）、低悪性潜在的腫瘍（レーン４−８）、および卵巣癌（レーン９−１２）における発現を示す。
【００２６】
図７は、正常、低悪性潜在的腫瘍、および卵巣癌でのヘプシン発現レベルを示す。Ｓ＝漿液性、Ｍ＝粘液性、ＬＭＰ＝低悪性潜在的腫瘍。
【００２７】
図８は、正常、低悪性潜在的腫瘍、および卵巣癌でのセリンプロテアーゼである角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）の発現レベルを示す。
【００２８】
図９は、正常組織（レーン１−２）および卵巣癌組織（レーン３−１０）での、メタロプロテアーゼＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）遺伝子の発現を示す
図１０Ａは、正常卵巣および卵巣癌でのヘプシン発現のノーザンブロット分析を示す。レーン１、正常卵巣（ケース１０）；レーン２、漿液性癌（ケース３５）；レーン３、粘液性癌（ケース４８）；レーン４、子宮内膜様癌（ケース５１）；ならびにレーン５、明細胞癌（ケース５４）。ケース３５、５１、および５４において、１０倍を越えるヘプシン１．８ｋｂ転写物の量の増加が観察された。図１０Ｂは、正常ヒト胎児におけるヘプシンのノーザンブロット分析を示す。図１０Ｃは、成体組織におけるヘプシンのノーザンブロット分析を示す。胎児の肝臓および胎児の腎臓において、ヘプシン転写物の有意な過剰発現が認められた。特に、ヘプシンの過剰発現は正常成体組織では観察されなかった。バックグラウンドレベルを越えるわずかな発現が成体前立腺において観察された。
【００２９】
図１１Ａは、正常（Ｎ）、粘液性（Ｍ）および漿液性（Ｓ）低悪性潜在的（ＬＭＰ）腫瘍、ならびに癌（ＣＡ）におけるヘプシン発現を示す。
【００３０】
図１１Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍、および卵巣癌におけるヘプシン：β−チューブリン発現の比を示す。ヘプシンｍＲＮＡ発現レベルは、正常卵巣におけるレベルと比較して、ＬＭＰ腫瘍（p<0.005）および癌(p<0.0001)において有意に上昇していた。正常卵巣の１０のケース全てが、相対的に低いレベルのヘプシンｍＲＮＡ発現を示した。
【００３１】
図１２Ａは、胎児組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。図１２Ｂは、卵巣組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。
【００３２】
図１３Ａは、正常卵巣および卵巣癌からのＳＣＣＥ ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲの比較を示す。図１３Ｂは、１０の正常組織および４４の卵巣癌組織における、β−チューブリンに対するＳＣＣＥの比を比較する棒グラフを示す。
【００３３】
図１４は、正常および卵巣癌におけるプロテアーゼＭのｍＲＮＡ発現の定量的ＰＣＲによる比較を示す。
【００３４】
図１５は、Ｈｉｓ ５’末端近くに挿入物を含むＴＡＤＧ−１２触媒ドメインを示す。
【００３５】
図１６Ａは、正常組織および卵巣癌組織におけるＴＡＤＧ−１４発現を比較するノーザンブロット分析を示す。図１６Ｂは、ＴＡＤＧ−１４特異的プライマーを用いた、正常および癌のｃＤＮＡの予備定量的ＰＣＲを示す。
【００３６】
図１７Ａは、ヒト胎児組織におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す。図１７Ｂは、正常卵巣および卵巣癌におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【００３７】
図１８Ａは、内部対照β−チューブリンを用いた定量的ＰＣＲによって、正常組織および癌組織におけるＰＵＭＰ−１発現を比較したものを示す。図１８Ｂは、１０の正常および４４の卵巣癌における、内部対照β−チューブリンに対するＰＵＭＰ−１のｍＲＮＡ発現の比を示す。
【００３８】
図１９は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、プロテアーゼＭ、ＰＵＭＰ−１、およびカテプシンＬの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の比較を示す。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、卵巣および他の癌細胞において、そのタイプの癌の特性となり、かつ他のプロテアーゼとの様々な組み合わせにおいて個々の腫瘍タイプの特性となる、ヘプシンプロテアーゼを発見した。そのような情報は、診断試験（アッセイまたは免疫組織化学分析）、予後評価（表示パターンに依存する）、ならびに、立証された阻害データから得られたおよび／または新規な薬剤の設計のための、プロテアーゼに対する抗体、ダウンレギュレーションのためのアンチセンス手段、またはプロテアーゼ阻害剤の何れかを利用する治療的介入のための基礎を提供できる。腫瘍増殖、浸潤、および転移の長期間の治療は、化学療法剤−多数サイクルの化学療法の後、ほとんどの腫瘍が薬剤耐性となる−の存在をもって成功していない。
【００４０】
本発明の第１の目的は、組織試料における悪性増殖の存在を検出する方法である。卵巣組織における癌の検出を特定の目的とすることは、本発明の利点である。特定タイプの癌細胞の特定の指標であるプロテアーゼに対するマーカーの存在に関して、生物試料を分析することによって癌を検出する。試料からｍＲＮＡを単離することによって、あるいはポリクロナール抗体または好ましくはモノクロナール抗体で蛋白質を検出することによって、本目的を達成できる。ｍＲＮＡ検出が用いられる場合、標準的方法に基づいて単離ｍＲＮＡを試薬と混合してｃＤＮＡに変化させ；表２のリストから選択された核酸プライマーの適切な混合物と共に、容器内で増幅反応試薬（例えばｃＤＮＡ ＰＣＲ反応試薬）でそのｃＤＮＡを処理し；容器内の内容物を反応させて増幅産物を作成し；さらに増幅産物を分析して、試料中における悪性増殖マーカーの存在を検出する；ことによって、その方法を実施する。ｍＲＮＡに関して、ノーザンブロット分析を用いて増幅産物中における悪性増殖マーカーの存在を検出することによって、分析工程を実施することができる。ノーザンブロット分析は当業界で公知である。増幅産物中における悪性増殖マーカーの存在を定量的に分析し、さらに、検出されたマーカーの量を、類似のプライマーを用いた場合における正常組織および悪性組織中における存在または不在に関する予測値のパネルと比較することによって、分析工程をさらに実施する。
【００４１】
本発明の別の一実施形態は、本明細書が開示する方法において有用な様々な核酸配列である。これらの核酸配列を表２に列記した。本発明の有用性を実現すべく、これらの核酸配列の混合物を使用することが予想される。こうした混合物としては、配列番号１と配列番号２；配列番号１と配列番号３；配列番号４と配列番号５；配列番号６と配列番号７；配列番号８と配列番号９；配列番号１０と配列番号１１などが挙げられる。当業者によれば、他の核酸配列およびその混合物を開発して本発明の効果を得ることも可能であるが、表２に列記した配列を使用することが煩瑣な実験をともなうこともなく有利である。
【００４２】
本発明は個体における癌診断の一方法を与えるものである。この方法は、個体から生体試料を得る工程、および当該試料中のヘプシンを検出する工程を含んでなるものである。試料中にヘプシンが存在する場合には、個体の体内の癌の存在を示し、試料中にヘプシンが存在しない場合には、個体の体内に癌が存在しないことを示すものである。一般に、ヘプシンの検出は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡサンドウィッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡアレイチップ、およびフローサイトメトリーによって行われる。本方法によって診断される典型的な癌の一例として卵巣癌がある。
【００４３】
本発明はまた、生体試料中における悪性増殖を検出するための一方法を与えるものである。この方法は、当該試料からｍＲＮＡを単離する工程、および当該試料中のヘプシンｍＲＮＡを検出する工程を含んでなるものである。試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在する場合には、悪性増殖の存在を示し、試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在しない場合には、悪性増殖が存在しないことを示すものである。この方法は、ヘプシンｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含んでもよく、この比較によって悪性増殖の診断、および／または、治療法の決定が可能となる。ヘプシンｍＲＮＡの検出の一般的な手段としてはＰＣＲ増殖があり、配列番号８および配列番号９に示されるプライマーを使用することが好ましい。生体試料の主なものとしては、組織や体液があり、体液としては血液が好ましい。
【００４４】
本発明は更に、生体試料中における悪性増殖を検出するための別の一方法を与えるものである。この方法は、当該試料からタンパク質を単離する工程、および当該試料中のヘプシンタンパク質を検出する工程を含んでなるものである。試料中にヘプシンタンパク質が存在する場合には悪性増殖の存在を示し、試料中にヘプシンタンパク質が存在しない場合には、悪性増殖が存在しないことを示すものである。この方法もまた、ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含むことが可能であり、この比較によって悪性増殖の診断、または治療法の決定が可能となる。好ましくはヘプシンタンパク質の検出はヘプシンに対して特異的な抗体に対する免疫親和性アッセイによって行われる。生体試料の主なものとしては、組織や体液があり、体液は血液であることが好ましい。
【００４５】
本発明は更に、細胞におけるヘプシンの発現を阻害するための一方法を与えるものである。この方法は、ヘプシン遺伝子の発現に必要なエレメントに作動可能に結合した、逆方向のヘプシン遺伝子を含むベクターを細胞に導入する工程からなり、当該ベクターの発現によって細胞でヘプシンのアンチセンスｍＲＮＡが産生される。このヘプシンのアンチセンスｍＲＮＡは内因性のヘプシンｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって細胞におけるヘプシンの発現を阻害する。
【００４６】
本発明は更に、細胞においてヘプシンタンパク質を阻害するための一方法を与えるものである。この方法は、ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに対して特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなる。この抗体がヘプシンに結合することでヘプシンタンパク質が阻害される。ヘプシンフラグメントは、９残基〜２０残基からなるフラグメントであることが好ましく、９残基のフラグメントは、配列番号２８，２９，３０，３１，８８，８９，１０８，１０９，１２８，１２９，１４８，１４９，１５０，１５１，１５２，１５３および１５４で表されるものであることがより好ましい。
【００４７】
本発明は更に、個体の標的治療のための一方法を与えるものである。この方法は、ヘプシンに対して特異的なターゲティング部分と薬効部分とを有する化合物を個体に投与する工程を含んでなる。このターゲティング部分は、ヘプシンに対して特異的な抗体か、ヘプシンに結合するリガンドまたはリガンド結合ドメインであることが好ましい。同様に、薬効部分は、放射性同位体、毒素、化学療法薬、免疫増強薬や細胞傷害性物質であることが好ましい。一般に対象個体は、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌やヘプシンを過剰発現している他の癌などの疾患を罹患した個体である。
【００４８】
本発明は更に、個体にヘプシンに対するワクチン接種を行うための一方法を与えるものである。この方法は、ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントを個体に接種する工程を含んでなるものである。このヘプシンタンパク質またはそのフラグメントの接種によって個体に免疫応答が誘導されて、個体にヘプシンに対するワクチン接種が行われる。一般にこの方法は、個体が癌を有するか、癌を有することが疑われるか、あるいは癌を発症するリスクがある場合に適用することが可能である。ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントの配列としては、配列番号２８，２９，３０，３１，８８，８９，１０８，１０９，１２８，１２９，１４８，１４９，１５０，１５１，１５２，１５３および１５４に示されるものが好ましい。
【００４９】
本発明は更に、ヘプシンに対する免疫活性化細胞(immune-activated cell)を産生するための一方法を与えるものである。この方法は、ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに樹状細胞を曝露する工程を含んでなるものである。一般に、ヘプシンタンパク質やその断片への曝露によって樹状細胞は活性化し、ヘプシンに対する免疫活性化細胞を産生する。一般に免疫活性化細胞としては、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞、および／または樹状細胞が挙げられる。ヘプシンフラグメントは９残基〜２０残基のフラグメントであることが好ましく、９残基のフラグメントは、配列番号２８，２９，３０，３１，８８，８９，１０８，１０９，１２８，１２９，１４８，１４９，１５０，１５１，１５２，１５３または１５４で表されるものであることがより好ましい。多くの場合、樹状細胞は曝露に先立って個体から単離され、曝露後に個体に再導入される。一般に対象個体は、癌を有するか、癌を有することが疑われるか、あるいは癌を発症するリスクがある個体である。
【００５０】
本発明は更に、ヘプシンタンパク質の免疫原性フラグメントおよび適当なアジュバントを含む免疫原組成物を提供する。ヘプシンフラグメントは９残基〜２０残基のフラグメントであることが好ましく、９残基のフラグメントは、配列番号２８，２９，３０，３１，８８，８９，１０８，１０９，１２８，１２９，１４８，１４９，１５０，１５１，１５２，１５３または１５４で表されるものであることがより好ましい。
【００５１】
本発明は更に、配列番号１８８またはそのフラグメントに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを与えるものである。本発明は更に、上記のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容されるその担体からなる組成物、ならびに、個体の腫瘍状態を治療する方法であって、個体に上記のオリゴヌクレオチドの有効量を投与する工程を含んでなる方法を与えるものである。通常、対象となる腫瘍状態は、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌やヘプシンを過剰発現している他の癌である。
【００５２】
本発明は更に、ヘプシン活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法を与えるものである。この方法は、ヘプシンタンパク質を含む試料を特定の化合物と接触させる工程、およびヘプシンプロテアーゼ活性についてアッセイを行う工程を含んでなるものである。当該化合物の存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性が、当該化合物の非存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性と比較して低下している場合、当該化合物がヘプシン活性を阻害する化合物であることが示されるものである。
【００５３】
本発明は更に、生体試料中における卵巣悪性増殖を検出するための一方法を与えるものである。この方法は、生体試料中に存在するプロテアーゼまたはプロテアーゼｍＲＮＡを単離する工程、および当該生体試料中に存在する特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼｍＲＮＡを検出する工程を含んでなるものである。このプロテアーゼは、ヘプシン、プロテアーゼＭ、補体因子Ｂ、ＳＣＣＥ、カテプシンＬおよびＰＵＭＰ−１からなる群から選択される。この方法は更に、検出された特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含んでもよく、この比較によって悪性増殖の診断または治療法の決定が可能となる。通常、プロテアーゼｍＲＮＡは全ｍＲＮＡの増幅によって検出され、プロテアーゼは抗体によって検出される。主な生体試料としては、血液、尿、唾液、涙液、組織間液、腹水、腫瘍組織生検、および循環腫瘍細胞が挙げられる。
【００５４】
当業者によれば、発明の範囲ならびに精神から逸脱することなくここに開示される発明に多くの置換および改変を加えることが可能である点は了承されよう。
【００５５】
本発明に従えば、当業者の通常の知識の範囲内である従来の分子生物学、微生物学、ならびに組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。こうした技術については文献に詳細に記載されている。（参照例、Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1985); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney. ed. 1986); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)）従って、下記の用語は明細書中で用いられる場合には下記の定義を有するものとする。
【００５６】
本明細書で用いる「ｃＤＮＡ」なる用語は、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のコピーＤＮＡのことを云う。
【００５７】
本明細書で用いる「誘導アミノ酸配列」なる用語は、ｃＤＮＡのヌクレオチド塩基のトリプレット配列を読むことによって決定されたアミノ酸配列を意味するものである。
【００５８】
本明細書で用いる「ライブラリーのスクリーニング」なる用語は、適当な条件下で標識プローブを用いて、当該プローブに相補的な配列が特定のＤＮＡライブラリー中に存在する否かを調べるプロセスのことを云う。更に、「ライブラリーのスクリーニング」はＰＣＲによって行うことも可能である。
【００５９】
本明細書で用いる「ＰＣＲ」なる用語は、ミューリス（Ｍｕｌｌｉｓ）に付与された米国特許第４，６８３，１９５号明細書ならびに同第４，６８３，２０２号明細書に開示されるポリメラーゼ連鎖反応、ならびに現在当該技術に関して知られている改良のことを云う。
【００６０】
本明細書で用いるアミノ酸は「Ｌ」型の異性体であることが好ましいが、ポリペプチドが所望の機能的性質である免疫グロブリンへの結合能を維持するかぎりにおいて、「Ｄ」型の異性体残基を任意のＬ型アミノ酸残基に置換することが可能である。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基のことを云う。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシル基のことを云う。場合に応じ、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９に示される標準的なポリペプチド命名法に準拠したアミノ酸残基の略号を使用する。
【００６１】
本明細書ではすべてのアミノ酸残基配列は、従来どおりアミノ末端からカルボキシ末端へと左から右に向かって示した式によって表した。更に、アミノ酸残基配列の始点または終点におけるダッシュ記号は、１個以上の更なるアミノ酸残基へのペプチド結合を示すものである。
【００６２】
「レプリコン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち自己の制御下で複製可能な任意の遺伝子エレメントのことを云う（例、プラスミド、染色体、ウイルス）。
【００６３】
「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントを組み込んでこれを発現させることが可能なプラスミド、ファージ、コスミドといったレプリコンのことを云う。「ベクター」はまた、プラスミドやウイルス核酸などの複製能を有する核酸構築物として定義することもできる。
【００６４】
「ＤＮＡ分子」とは、１本鎖または２本鎖螺旋構造を有するデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）の重合体のことを云う。この用語は、分子の１次および２次構造のみについて述べたものであり、特定の３次構造にその分子構造を限定するものではない。したがってこの用語には、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体などに見られる２本鎖ＤＮＡが含まれるものである。本明細書ではこの構造は、転写されない側のＤＮＡ鎖（ｍＲＮＡと相同配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向に延びる配列のみを与える従来の習わしにしたがって考察する。
【００６５】
発現ベクターとは、ポリペプチドをコードした核酸配列が、細胞でこのポリペプチドを発現させることが可能な適当な制御配列に作動可能に結合しているような複製能を有する構築物のことを云う。こうした制御配列に対する要求は、選択される細胞や選択される形質転換方法に応じて異なるものである。一般に制御配列は、転写プロモーターおよび／またはエンハンサー、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位、転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。当業者には周知の方法を用いて適当な転写および翻訳制御シグナルを有する発現ベクターを構築することも可能である。これについては、例えばサムブルック等により述べられる方法を参照されたい（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y.）。ある遺伝子とその転写制御配列は、転写制御配列によってその遺伝子の転写が効果的に制御される場合に「作動可能に結合している」ものとして定義される。これらに限ったものではないが、本発明のベクターとしてはプラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。本発明のウイルスベクターとして好適なものとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルスやヘルペスウイルスから得られるものがある。一般に発現ベクターは、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写を促し、特定のホストと関連して用いられるプロモーター配列を有している。発現ベクターは通常、複製の開始点、プロモーター、ターミネーター、および、形質転換細胞において表現型に基づいた選択を可能とする特定の遺伝子を有している。形質転換したホストは当該技術分野では周知の方法によって培養して最適な細胞増殖を得ることが可能である。
【００６６】
「複製開始点」は、ＤＮＡの合成に関与するＤＮＡ配列である。
【００６７】
ＤＮＡの「コード配列」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写および翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列のことである。コード配列の境界は、通常、５’（アミノ）末端に位置する開始コドンと３’（カルボキシル）末端に位置する翻訳停止コドンとによって決められる。これらに限ったものではないが、コード配列には、原核細胞の配列、真核細胞のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ、真核細胞（例、哺乳動物細胞）のＤＮＡから得たゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列までもが含まれる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コード配列の３’末端側に位置している。
【００６８】
転写および翻訳制御配列は、ホスト細胞でコード配列を発現させるプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
【００６９】
「プロモーター配列」とは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始するＤＮＡ調節領域のことを云う。本発明の定義において、プロモーター配列はその３’末端においては転写開始部位を境界とし、その上流方向（５’方向）ではバックグラウンドから検出可能なレベルの転写を開始するうえで必要な最少数の塩基やエレメントを含む配列である。プロモーター配列中には、ＲＮＡポリメラーゼの結合に与るタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とともに、転写開始部位が見られる。真核生物のプロモーターには常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスがしばしば含まれている。原核生物のプロモーターは通常、−１０および−３５のコンセンサス配列に加え、シャイン−ダルガルノリボソーム結合配列を含んでいる。
【００７０】
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列のことである。ＲＮＡポリメラーゼがあるコード配列をｍＲＮＡに転写し、このｍＲＮＡがコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される際、このコード配列は細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にあるという。
【００７１】
「シグナル配列」がコード配列の近くに存在する場合がある。この配列は、ポリペプチドのＮ末端側に位置するシグナルペプチドをコードする。シグナルペプチドはホスト細胞と情報伝達を行ってポリペプチドを細胞表面に移送したり、ポリペプチドを基質中に分泌させる。こうしたシグナルペプチドはタンパク質が細胞から分泌されるのに先立ってホスト細胞によって切断される。シグナル配列は原核生物および真核生物に存在する様々なタンパク質との関与が示されている。
【００７２】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる用語は、２本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列またはその付近で切断する酵素のことを云う。
【００７３】
ある細胞は、外因性または異種ＤＮＡが細胞内部に導入された場合にこうしたＤＮＡによって「形質転換された」という。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれる（共有結合を介して連結される）場合とそうでない場合がある。例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメント上で維持することが可能である。真核細胞に関しては、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれることによって染色体の複製を通じて娘細胞に受け継がれるような細胞を安定的に形質転換した細胞という。この安定性は、真核細胞において形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンが樹立されることによって証明される。「クローン」とは、１個の細胞または祖先から体細胞分裂によって得られる細胞集団のことである。「細胞系」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの世代にわたって安定的に増殖可能な初代細胞のクローンのことである。
【００７４】
２個のＤＮＡ配列は、これらのＤＮＡ配列の所定の長さにわたって少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）のヌクレオチドが一致する場合に「ほぼ相同である」という。配列データバンクより入手可能な標準的ソフトウェアを使用するか、あるいは、例えばその特定の系について定義されるストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験を行って配列同士を比較することによって互いにほぼ相同な配列を特定することが可能である。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは当業者の知識の範囲内である（参照例、Maniatis et al.,前出; DNA Cloning, Vols. I & II, 前出; Nucleic Acid Hybridization,前出）。
【００７５】
ＤＮＡ構築物の「ヘテロ」領域とは、より大きなＤＮＡ分子内の特定可能なＤＮＡセグメントであって、この大形分子中に関連して天然には見られないＤＮＡセグメントのことである。したがって、ヘテロ領域が哺乳動物の遺伝子をコードしている場合、その遺伝子は、それが由来する生物のゲノムで哺乳類ゲノムＤＮＡを挟み込んでいるものとは異なるフランキングＤＮＡによって挟み込まれる。別の例としては、コード配列自体が自然界に見られないような構築物がある（例、ゲノムコード配列がイントロンを含んでいるｃＤＮＡや、本来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。ここで定義したＤＮＡのヘテロ領域は、対立遺伝子変異や自然発生する突然変異によって生ずることはない。
【００７６】
これらの研究で最も一般的に使用されている標識は、放射性元素、酵素、紫外線を照射すると蛍光を発する化学物質などである。多くの蛍光物質が知られており、標識として利用されている。こうした物質の例として、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシフェールイエローなどが挙げられる。特定の検出物質として、ヤギ体内で調製し、イソチオシアネートによってフルオロセインと結合させた抗ウサギ抗体がある。放射性元素や酵素でタンパク質を標識することも可能である。放射性標識は現在用いられている計数法のいずれによって検出することも可能である。好ましい同位体は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５ ８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択されるものを用いることができる。酵素標識も同様に有用であり、今日用いられている比色定量法、分光測光法、蛍光分光測光法、電流測定法、またはガス定量法のいずれによって検出することも可能である。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によって選択した粒子に結合させる。これらの方法で使用可能な酵素は多くが知られており、それらを利用することが可能である。好ましい酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ、ならびにアルカリホスファターゼがある。米国特許第３，６５４，０９０号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、および同第４，０１６，０４３号明細書を別の標識物質ならびに方法の開示例として援用する。
【００７７】
当該技術分野において開発利用されているアッセイシステムとして受容体アッセイとして特に知られるものがある。受容体アッセイでは、アッセイを行う物質を適当に標識し、特定の細胞試験コロニーを所定量の標識物質と培養した後、結合分析を行って標識物質の細胞受容体への結合度を調べる。このようにして物質間の親和度の差を求めることが可能である。
【００７８】
当該技術分野において有用なアッセイとして「シス／トランス」アッセイとして知られるものがある。簡単に述べると、このアッセイは２種類の遺伝子構築物を用いたものである。２種類の遺伝子構築物の一方は通常、適当な細胞系にトランスフェクトした場合に特定の対象受容体を継続的に発現するプラスミドであり、他方は、受容体／リガンド複合体の制御下でルシフェラーゼなどの受容体を発現するプラスミドである。したがって、例えば特定の受容体に対するリガンドとしてある化合物の評価を行いたい場合、一方のプラスミドは、選択した細胞系でこの受容体を発現する構築物とし、他方のプラスミドは、この特定の受容体に対する応答エレメントを挿入したルシフェラーゼ遺伝子に連結したプロモーターを有するものとする。試験する化合物が受容体のアゴニストである場合、リガンドは受容体と複合体を形成し、この複合体が応答エレメントに結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させる。発生した化学ルミネセンスを光度測定によって測定し、得られた用量応答曲線を公知のリガンドの用量応答曲線と比較する。以上のプロトコールは米国特許第４，９８１，７８４号明細書に詳細に述べられている。
【００７９】
本明細書で用いる「ホスト」なる用語は、原核生物ばかりでなく、酵母、植物、および動物細胞などの真核生物をも含むものである。本発明のヒトヘプシンタンパク質をコードした組換えＤＮＡ分子または遺伝子を用い、当業者に一般的に知られる技術のいずれかによってホストを形質転換することが可能である。原核細胞の形質転換を行うために本発明のヒトヘプシンタンパク質をコードした遺伝子のコード配列を有するベクターを使用することが特に好ましい。原核生物のホストとしては、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。真核生物のホストとしては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母、哺乳動物細胞、および昆虫細胞が挙げられる。
【００８０】
本明細書で用いる「ほぼ純粋なＤＮＡ」とは、そのＤＮＡが自然に存在する環境の一部ではなく、その環境の分子の一部もしくは全体を分離（部分または全単離）したＤＮＡか、本発明のＤＮＡを挟んで位置する配列を改変したＤＮＡのことである。したがってこの用語には、例えば、ベクターに組み込まれたＤＮＡ、自己複製能を有するプラスミドまたはウイルスに組み込まれたＤＮＡ、原核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡや、他の配列とは独立した別の分子（例、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生成するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメント）が含まれる。この用語には更に、融合タンパク質などの更なるポリペプチド配列をコードしたハイブリッド遺伝子の一部としての組換えＤＮＡも含まれる。この用語には更に、配列番号１８８に示したヌクレオチドの一部を含むとともにヘプシンの別のスプライス産物をコードした組換えＤＮＡも含まれる。
【００８１】
「ほぼ純粋なタンパク質」とは、自然に併存する成分の少なくとも一部から分離されたタンパク質を意味する。通常、こうしたタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで併存するタンパク質や他の自然に存在する有機分子から少なくとも６０％（重量）分離されている場合にほぼ純粋であるという。こうした調製物の純度（重量）は少なくとも７５％で有ることが好ましく、少なくとも９０％であることがより好ましく、少なくとも９９％であることが最も好ましい。ほぼ純粋なヘプシンタンパク質は、例えば、天然の供給源からの抽出、ヘプシンポリペプチドをコードした組換え核酸の発現、またはタンパク質の化学合成によって得ることが可能である。純度は、ヘプシンに対して特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィのようなカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やＨＰＬＣ解析などの任意の適当な方法によって測定することが可能である。タンパク質は、自然状態で併存する夾雑物の少なくとも一部から分離される場合に自然に併存する成分をほぼ含まないものとみなす。すなわち、化学的に合成されるか、あるいは自然界でそれが存在する細胞とは異なる細胞系で産生されるタンパク質は、定義上、その天然併存成分から実質的に分離されているものとみなされる。したがって、ほぼ純粋なタンパク質には、Ｅ．Ｃｏｌｉや他の原核生物、そのタンパク質が自然には存在しない他のすべての生物において合成される真核生物のタンパク質が含まれるものである。
【００８２】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２以上のリボヌクレオチド、好ましくは３よりも多いリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その正確な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能や用途に応じて異なる多くの因子に依存する。本明細書で用いる「プライマー」なる用語は、自然に存在する（単離した制限酵素消化物など）か、あるいは合成したオリゴヌクレオチドであって、適当な条件下、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下で適切な温度およびｐＨ条件下に置かれた場合に、特定の核酸に対して相補的な鎖の合成を開始することが可能なオリゴヌクレオチドのことを云う。こうしたプライマーは１本鎖または２本鎖のいずれでもよく、また誘導物質の存在下で所望の延長産物の合成の起点となるうえで充分な長さを有するものでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの配列および／または相同性、使用する方法などの多くの因子に依存する。例えば、診断における用途では、オリゴヌクレオチドプライマーは標的配列の複雑さに応じて１５〜２５個またはこれよりも多いヌクレオチドを通常有するが、これよりも少ないヌクレオチドを有する場合もある。
【００８３】
本明細書で云うところのプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列に対して「ほぼ」相補的なものが選択される。これは、プライマーは、各鎖にハイブリダイズするうえで充分な相補性を有さなければならないということである。したがってプライマー配列は鋳型の正確な配列を反映したものである必要はない。例えば、プライマーの５’末端に非相補的なヌクレオチドフラグメント（制限部位を含んだもの）を連結し、プライマー配列の残りの部分はＤＮＡ鎖に対して相補的であるようなものとすることが可能である。また、プライマー配列がこれとハイブリダイズする配列と充分な相補性を有し、延長産物の合成の鋳型となる限りにおいて、プライマー中に非相補的な塩基やより長い配列を散在させることも可能である。
【００８４】
本発明のＤＮＡがハイブリダイズするプローブは、配列番号１８８に示されるヌクレオチドのコード配列またはその相補配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは４０個のヌクレオチド、更により好ましくは５０個のヌクレオチド、最も好ましくは１００個以上のヌクレオチドの配列からなることが好ましい。こうしたプローブは、（ａ）細胞から得られたｍＲＮＡを標識されたヘプシンハイブリダイゼーションプローブに接触させる工程、および（ｂ）ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含んでなる方法によって細胞でのヘプシンの発現を検出するうえで有用である。
【００８５】
「高いストリンジェンシー」とは、高い温度と低い塩濃度によって特徴付けられるＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を意味するものであり、例えば、約０．１×ＳＳＣの塩濃度下、６５℃での洗浄条件またはこれに機能的に相当する条件である。高ストリンジェンシー条件の例として、約５０％のホルムアミドの存在下約４２℃でハイブリダイゼーションを行い、約６５℃で１％ＳＤＳを含む約２×ＳＳＣで初回の洗浄を行った後、約６５℃で約０．１×ＳＳＣで２回目の洗浄を行う場合が挙げられる。
【００８６】
こうしたＤＮＡは、配列番号１８８に示したヌクレオチドのコード配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも７５％（例、少なくとも８０％）、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有しうる。２個の配列間の同一性は一致すなわち同一位置の数の直接的な関数である。２個の配列の特定の位置に同じ単量体サブユニットが存在する場合、例えば、２個のＤＮＡ分子においてある位置にアデニンが存在する場合、これらの配列はその位置において同一であるという。例えば、ヌクレオチド１０個分の長さの配列中で７箇所の位置が、やはり１０個のヌクレオチドからなる第２の配列の対応する位置と同一である場合、これら２個の配列は７０％の配列同一性を有することになる。比較配列の長さは、一般に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、最も好ましくは１００ヌクレオチドである。通常、配列同一性は配列解析ソフトウェアを用いて測定される（例、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（1710 University Avenue, Madison, WI 53705所在）、ジェネティクス・コンピューターグループ（ＧＣＧ）の配列解析ソフトウェアパッケージ）。
【００８７】
本発明は、ヘプシンタンパク質をコードした、ホスト体内で複製可能なベクターであり、それぞれ作動可能に結合した、ａ）複製開始点、ｂ）プロモーター、およびｃ）前記ヘプシンタンパク質をコードしたＤＮＡ配列を有するものである。好ましくは本発明のベクターは配列番号１８８に示されるＤＮＡ配列の一部を有する。ベクターはヘプシンタンパク質またはそのフラグメントをコードした核酸を増幅および／または発現させるために使用することが可能である。
【００８８】
本発明にはほぼ完全長のタンパク質の他、ヘプシンタンパク質のフラグメント（例、抗原性フラグメント）も含まれる。本明細書でポリペプチドに対して用いる「フラグメント」とは、通常は少なくとも１０個の残基、より一般的には少なくとも２０個の残基、好ましくは少なくとも３０個の残基（例、５０個）分の長さを有するものをいうが、完全な配列である必要はない。ヘプシンタンパク質のフラグメントは、天然または組換えヘプシンタンパク質の酵素的消化、ヘプシンの所定のフラグメントをコードした発現ベクターを用いた組換えＤＮＡ技術や化学的合成など、当業者に周知の方法によって調製することが可能である。候補フラグメントがヘプシンの性質（例、ヘプシンに対して特異的な抗体への結合）を示す能力を本明細書で述べる方法によって評価することが可能である。精製したヘプシンまたはヘプシンの抗原性フラグメントを用い、当業者に周知の標準的なプロトコールによって、新規な抗体を作出したり、既存の抗体の試験（例、診断アッセイのポジティブコントロールとして）を行うことが可能である。例えばウサギにおいてヘプシンまたはヘプシンのフラグメントを免疫原として使用することによって調製されるポリクローナル抗血清も本発明に含まれるものである。その際、当業者に周知のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を調製するための標準的なプロトコールを用いる。この方法によって調製されるモノクローナル抗体を、組換えヘプシンｃＤＮＡクローンを特定する能力およびヘプシンｃＤＮＡクローンを他のｃＤＮＡクローンから判別する能力についてスクリーニングすることが可能である。
【００８９】
オルタナティブなｍＲＮＡスプライシングやオルタナティブなタンパク質プロセシングの結果得られる産物のような、少なくともその一部が配列番号１８８の部分によってコードされたヘプシンタンパク質や、ヘプシン配列の一部が欠失したヘプシンタンパク質も本発明に含まれるものである。ヘプシンのフラグメントまたは完全なポリペプチドを、標識、リガンドや抗原性を高める機能を有する別のポリペプチドと共有結合によって連結することも可能である。
【００９０】
本発明は更に、ヘプシンに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むものである。本発明は、完全なモノクローナル抗体だけではなく、Ｆａｂや（Ｆａｂ）２フラグメントなどの免疫学的な活性を有する抗体フラグメント、遺伝子操作した１本鎖Ｆｖ分子やキメラ分子も含むものである。キメラ分子は例えば、ある抗体（例、マウス由来）の結合特異性部分と別の抗体（例、ヒト由来）の残りの部分を有するものである。
【００９１】
一実施形態では、抗体またはそのフラグメントを、放射性標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、常磁性体標識、酵素標識や比色定量標識などの検出可能な標識や毒素に連結することが可能である。
【００９２】
適当な毒素の例としては、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。適当な酵素標識の例としては、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ状球菌ヌクレアーゼ、Δ５−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。適当な放射性同位体標識としては、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃなどが挙げられる。
【００９３】
本発明の方法に従えば、ｉｎ ｖｉｖｏ診断の目的で常磁性同位元素を使用することも可能である。磁気共鳴イメージングにおいて有用な元素には多くの例がある。ｉｎ ｖｉｖｏでの核磁気共鳴イメージングの例については下記を参照されたい。Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G. L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey at al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415.適当な蛍光標識の例としては、フルオロセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オフサルデヒド標識、フルオレスカミン標識などが挙げられる。化学ルミネセンス標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、蓚酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識などが挙げられる。
【００９４】
当業者であれば本発明に従って使用が可能な他の適当な標識も想到されよう。これらの標識のその抗体やフラグメントへの結合は当業者に周知で一般的に使用されている標準的な方法を用いて行うことが可能である。典型的な技術としては、ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）等およびシュルス（Ｓｃｈｕｒｓ）等によって述べられるものがある（Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1-31； and Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40）。これらの文献に述べられる結合方法として、グルタルアルデヒド法、ペリオデート法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法がある。これらの方法のすべてを本明細書中に援用するものである。
【００９５】
本発明は更に、生体試料中のヘプシンタンパク質を検出するための方法を含むものである。この方法は、当該試料を標識抗体（例、ヘプシンに対して特異的な放射性標識抗体）と接触させる工程、および該抗体が試料中の特定成分と結合するか否かを判定する工程を含んでなるものである。ヘプシンタンパク質に対する抗体をイムノアッセイに用いて悪性形質転換が疑われる組織におけるヘプシンタンパク質の発現レベルの上昇を検出することが可能である。同様の使用はノーザンブロットアッセイおよび分析においても可能である。
【００９６】
本明細書で述べるように本発明によって診断における多くの利点および用途が与えられる。例えば本発明のヘプシンタンパク質は腫瘍細胞において過剰発現されることから、異なる組織における癌の診断に有用である。ヘプシンに対して特異的なエピトープに結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、癌性または腫瘍性悪性形質転換の診断のために生体試料中のヘプシンタンパク質を検出する方法において有用である。この方法は、癌が疑われる患者から生体試料（例、細胞、血液、血漿、組織など）を採取する工程と、ヘプシンに対して特異的な標識抗体（例、放射性標識抗体）と試料を接触させる工程、およびＥＬＩＳＡなどの標準的なイムノアッセイ技術を用いてヘプシンタンパク質を検出する工程を含んでなるものである。生体試料への抗体の結合は、その試料にヘプシン分子内のエピトープに特異的に結合する成分が含まれていることも示すものである。
【００９７】
同様に、当業者には周知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に基づいて標準的なノーザンブロットアッセイを行って、癌が疑われる患者から採取した細胞や組織中のヘプシンｍＲＮＡの相対量を求めることが可能である。このノーザンアッセイでは、配列番号１８８に相補的な配列を有する完全長の１本鎖ＤＮＡ、または少なくとも連続したヌクレオチド２０個分の長さ（好ましくは少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも１００個）を有するこのＤＮＡ配列のフラグメントを含む、放射性標識したヘプシンｃＤＮＡなどのハイブリダイゼーションプローブを使用する。このＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは当業者に周知の多くの異なる方法のいずれによって標識することも可能である。
【００９８】
以下の実施例は発明の異なる実施形態を説明するためのものであって、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。
【００９９】
実施例１
重複特異的プライマーを用いたセリンプロテアーゼの増幅
遺伝子発現分析のために、ゲノムＤＮＡを含まないと思われるｃＤＮＡ調製物のみを用いた。セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびシステインプロテアーゼ用に重複プライマーを調製した。セリンプロテアーゼの触媒三つ組残基の周りのアミノ酸のコンセンサス配列、すなわち、ヒスチジン．．．アスパラギン酸．．．およびセリンに対するプライマーを合成した。センス（ヒスチジンおよびアスパラギン酸）およびアンチセンス（アスパラギンおよびセリン）重複プライマーの両方の配列を表２に示した。
【０１００】
【表２】
Figure 2003523524
実施例２
癌組織
漿液性嚢胞腺癌より得たｃＤＮＡのＰＣＲ増幅物から複数のプロテアーゼ様分子が特定、サブクローニングされた。したがってここで述べるプロテアーゼとは卵巣癌の最も一般的な形態であるこのタイプの癌の表面活性を反映したものである。出願人は更に、同様の塩基対サイズの粘液性腫瘍型および明細胞型に特徴的なＰＣＲ増幅バンドを検出した。卵巣癌の約２０〜２５％が粘液性、明細胞型、または子宮内膜性として分類される。
【０１０１】
実施例３
ライゲーション、形質転換、および配列決定
上記のＰＣＲ産物を同定するため、適当なバンドをすべてプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社のＴベクタープラスミドにライゲートし、このライゲーション産物を用いて選択培地上で培養したＪＭ１０９細胞（プロメガ社）の形質転換を行った。個々のコロニーの選択、培養を行った後、プラスミドＤＮＡをＷＩＺＡＲＤ ＭＩＮＩＰＲＥＰ(商標名)ＤＮＡ精製システムによって単離した。Ｐｒｉｓｍ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ダイデオキシ・ターミネーターサイクル配列決定キット（アプライド・バイオシステムズ社）を用いてインサートの配列を求めた。残留した色素ターミネーターは、ＣＥＮＴＲＩＳＴＥＰ ＳＰＩＮ（商標）カラム（プリンストン・セパレーション社）を用いて得られた配列反応溶液から除去し、試料をアプライド・バイオシステムズ社のモデル３７３Ａ ＤＮＡ配列決定システムにかけた。セリンプロテアーゼプライマーのサブクローニングおよび配列決定の結果を表３にまとめた。
【０１０２】
【表３】
Figure 2003523524
実施例４
クローニングおよびキャラクタリゼーション
新規遺伝子候補のクローニングおよびキャラクタリゼーションを行って卵巣癌サブタイプに対して特異的な細胞外プロテアーゼのパネルを拡大した。腫瘍ｃＤＮＡから得られたＰＣＲ産物の配列決定によってこれらの遺伝子が潜在的な候補物質であることが示された。３つの新規遺伝子はいずれも、セリンプロテアーゼファミリーの一員であることと符合して触媒トライアッド配列中に保存された残基を有する。
【０１０３】
出願人は、センス−ヒスチジンとアンチセンス−アスパラギン酸、およびセンス−ヒスチジンとアンチセンス−セリンを用いて正常ｃＤＮＡおよび癌ｃＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物の比較を行った。これらのプライマーの組に対して、約２００ｂｐおよび５００ｂｐの予想されたＰＣＲ産物が観察された（アスパラギン酸はヒスチジンからアミノ酸約５０〜７０個下流の位置にあり、セリンはヒスチジンからアミノ酸約１００〜１５０個だけカルボキシ末端に向かった位置にある。）。
【０１０４】
図１は、正常ｃＤＮＡおよび癌ｃＤＮＡから得られたＰＣＲ産物の比較をアガロースゲル上での染色によって示したものである。レーン２では２本の異なるバンドがセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−ＡＳＰ（ＡＳ１）のプライマーの組において見られ、レーン４ではセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒ（ＡＳ２）のプライマーの組に対し約５００ｂｐの位置に複数のバンドが癌のレーンにおいて確認された。
【０１０５】
実施例５
定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲによってヘプシンのｍＲＮＡ過剰発現を検出、その値を求めた。定量的ＰＣＲはＮｏｏｎａｎ等の方法にほぼ準じて行った（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 7160-7164 (1990)）。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【０１０６】
ヘプシン：
順方向 5'-TGTCCCGATGGCGAGTGTTT-3' （配列番号８）、および
逆方向 5'-CCTGTTGGCCATAGTACTGC-3' （配列番号９）
β−チューブリン：
順方向 5'-TGCATTGACAACGAGGC-3' （配列番号１８）、および
逆方向 5'-CTGTCTTGA CATTGTTG-3' （配列番号１９）
β−チューブリンは、内部コントロールとして用いた。増幅した遺伝子の予測されたサイズはヘプシンでは２８２ｂｐ、β−チューブリンでは４５４ｂｐであった。この実験で使用したプライマー配列はＬｅｙｔｕｓ等により述べられたｃＤＮＡ配列に基づいて設計したものである（ヘプシンについては、[Biochemistry, 27, 1067-1074], β−チューブリンについては、[Mol. Cell. Biol., 3. 854-862 (1983)]）。ＰＣＲ混合物は、従来法によって転換した５０ｎｇのｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡ、ヘプシン遺伝子およびβ−チューブリン遺伝子の両者に対し５ｐｍｏｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、２００μｍｏｌのｄＮＴＰ、５μＣｉのα−３２ＰｄＣＴＰ、および０．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼに、反応緩衝溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて最終容量を２５μｌとしたものである。標的配列とβ−チューブリン遺伝子と並行して増幅した。サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中で３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの各サイクルでは、９５℃で３０秒間の変性、６３℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を行う。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分離し、各ＰＣＲ産物の放射性をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（商標）（モレキュラー・ダイナミクス社）を用いて調べた。平均値の比較にはステューデントのｔ検定を用いた。
【０１０７】
正常な卵巣および卵巣癌におけるＰＣＲ増幅を比較した実験により、腫瘍組織においてｍＲＮＡ転写産物が過剰発現および／または変異されていることが示された。ＴＡＤＧ−１４のノーザンブロット分析により１．４ｋｂの転写産物のサイズが確認され、またデータから卵巣癌における過剰発現が示された（図２）。ポジティブなプラークをスクリーニングするためＰＣＲおよび２５０ｂｐの特定のＰＣＲ産物を用いた単離および精製によって、ＴＡＤＧ−１４の１．２ｋｂのクローンが得られた。表２の適当なプライマーを用いた同様の方法によって他のプロテアーゼも増幅された。
【０１０８】
実施例６
組織バンク
表４に示されるような卵巣癌の新鮮な凍結組織の腫瘍組織バンクを用いて評価を行った。悪性腫瘍以外の医療上の理由によって除去された約１００個の正常卵巣を外科手術により入手し、コントロールとして用いた。
【０１０９】
【表４】
Figure 2003523524
この腫瘍バンクより、境界悪性または低悪性度の腫瘍または顕性癌を含む、卵巣癌の最も組織学的なサブタイプを含む約１００検体の癌について評価を行った。この方法では、新鮮な凍結組織（正常組織および腫瘍の両方）から調製したｍＲＮＡを用いて正常組織、低悪性度腫瘍、および顕性癌における遺伝子の発現を比較した。ポリＡ＋ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡは、β−チューブリンおよびｐ５３プライマーを用いて既知のイントロン−エキソン・スプライス部位を有するプライマーによってすべての調製物を調べた結果、ゲノムＤＮＡを含まないものと考えられた。
【０１１０】
実施例７
ノーザンブロット
ノーザンブロットによって上記の候補遺伝子の発現を調べることによって多くの情報を得ることができる。正常な成人の多組織ブロット分析によって、プロテアーゼを発現する可能性を有する正常組織を同定することが可能である。したがって、治療的介在のためにプロテアーゼを阻害する手法が開発されるとするならば、正常組織においてこれらの遺伝子が発現された場合にこれを認識できることが不可欠である。
【０１１１】
胎児組織のノーザンブロット分析から多くの情報が得られることが期待される。癌において過剰発現される遺伝子はしばしば器官発生期に高レベルの発現が見られる。示したように、肝癌細胞からクローニングされ、卵巣癌で過剰発現されるヘプシン遺伝子は胎児肝臓で著明な発現が見られる。ヘプシン遺伝子の発現は胎児腎臓においても検出されていることから、ヘプシン遺伝子は腎癌における発現の候補ともなりうる。
【０１１２】
胎児組織ならびに多組織の正常な成人における遺伝子の発現を調べるためのノーザンパネルが市販されている（クロンテック社）。こうした評価ツールは、腫瘍および正常組織における個々の転写産物の過剰発現を確認するうえで重要であるばかりでなく、転写産物のサイズを確認し、卵巣癌においてオルタナティブスプライシングや他の転写の変化が起きているかを判定することを可能とするものである。
【０１１３】
実施例８
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析を下記のように行った。１０μｇのｍＲＮＡを１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにロードし、電気泳動してＨｙＢｏｎｄ−Ｎ＋（商標）ナイロン膜（アマシャム社）上にブロットした。Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ標識システム（商標）（プロメガ社）を使用して３２Ｐ−標識したｃＤＮＡプローブを作成した。特定のプライマーによって増幅したＰＣＲ産物をプローブとして用いた。ブロットは、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液（クロンテック社）中、３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブにより、３０分間プレハイブリダイズした後、６８℃で６０分間ハイブリダイズした。β−チューブリンプローブを用いて相対的なゲルロードを求めるためのコントロールハイブリダイゼーションとした。
【０１１４】
脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、および、脳、肺、肝臓および腎臓などの正常なヒトの胎児組織を含む正常なヒト組織をすべて同様のハイブリダイゼーション法を用いて調べた（ヒト多組織ノーザンブロット、クロンテック社）。
【０１１５】
実施例９
セリン、システイン、およびメタロプロテアーゼに対応するＰＣＲ産物
低悪性度腫瘍または癌におけるそれらの特徴的な発現に基づいて、ＰＣＲ−増幅したｃＤＮＡ産物をクローニング、配列決定し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいて特定した適切な遺伝子をＧＣＧおよびＥＳＴデータベースに保存した。図３、４および５に、セリンプロテアーゼ（図３）、システインプロテアーゼ（図４）、およびメタロプロテアーゼ（図５）について重複プライマーを用いて正常組織と癌性組織を比較したＰＣＲ産物のディスプレイを示した。癌性組織と正常組織における発現の相違に注意されたい。プロテアーゼは、内在的な酵素活性（セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼに対する）に関連した保存配列に対する重複ｃＤＮＡプライマー（表２を参照）を用い、サカナリ等（Sakanari et al., Biochemistry 86, 4863-4867 (1989)）による方法にしたがって、正常組織、低悪性度組織、顕性卵巣癌組織におけるｍＲＮＡ発現を比較することによって同定した。
【０１１６】
実施例１０
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ群に関しては、ヒスチジンドメインを有するセンスプライマーＳ１をアンチセンスプライマーＡＳ２とともに用い、以下のプロテアーゼを同定した。
【０１１７】
（ａ）ヘプシン。肝癌細胞からクローニングされたトリプシン様セリンプロテアーゼ。培養中での肝癌細胞の増殖に不可欠な細胞表面プロテアーゼであり、肝腫瘍細胞において高レベルで発現することが示されている（図３、レーン４）。
【０１１８】
（ｂ）補体因子Ｂプロテアーゼ（ヒト第ＩＸ因子）。凝固カスケードに関与しているプロテアーゼであり、腫瘍細胞に関連したフィブリン分解産物（図３、レーン４）の生成および蓄積に関連している。補体因子Ｂは凝固因子Ｘ（クリスマス因子）のファミリーに属している。内因性経路の一部として、補体因子ＢはＣａ２＋、リン脂質、および第ＶＩＩＩａ因子ｅ５の存在下で凝固因子Ｘの蛋白分解による活性化を触媒する。
【０１１９】
（ｃ）角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）。ヒト角質層からの皮膚細胞の剥離に関与しているセリンプロテアーゼ（図３、レーン４）。ＳＣＣＥは表皮のケラチノサイトで発現され、角質化層の接着構造を分解して皮膚表面の連続的な剥脱を可能にする。
【０１２０】
実施例１１
システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼ群では、システインに対する重複センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いることにより、特徴的なＰＣＲ産物が正常な卵巣組織と比較して卵巣癌において過剰発現されていることにより特定された（図４、レーン３〜５）。このＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定により、カテプシンＬ配列が特定された。カテプシンＬは、悪性形質転換、増殖因子、および腫瘍プロモーターによって発現および分泌が誘導されるリソソームのシステインプロテアーゼである。多くのヒト腫瘍（卵巣腫瘍を含む）は高レベルのカテプシンＬを発現する。カテプシンＬシステインプロテアーゼは、ストロメリシンファミリーに属し、強いエラスターゼおよびコラゲナーゼ活性を有する。文献によれば卵巣の粘液性嚢胞腺癌を有する患者の血清中に高レベルで存在することが報告されている。カテプシンＬの他の卵巣腫瘍での発現はこれまでに示されていない。
【０１２１】
実施例１２
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼ群に対する重複センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの使用により、正常な卵巣組織には存在しない特徴的なＰＣＲ産物が腫瘍組織中に検出された（図５、レーン２〜５）。この産物をサブクローニングおよび配列決定したところいわゆるＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）遺伝子と適当な領域において完全な相同性を有することが示された。こうした亜鉛結合性メタロプロテアーゼは、シグナル配列を有するプロ酵素として発現し、ゼラチンおよびコラゲナーゼ分解活性を有する。ＰＵＭＰ−１は正常な大腸組織と比較して１０例の結腸直腸癌のうち９例において誘導、過剰発現が示され、こうした疾患の進行におけるこの基質の一定の役割を示すものである。
【０１２２】
実施例１３
ヘプシンの発現
８検体の正常組織、１１検体の低悪性度腫瘍、１４検体の癌（粘液性および漿液性の両方）におけるセリンプロテアーゼヘプシン遺伝子の発現をヘプシン特異的プライマー（表２参照）を用いた定量的ＰＣＲによって求めた（β−チューブリンメッセージに対するプライマーを内部スタンダードとして用いた）（表５）。これらのデータは、低悪性度腫瘍および顕性癌の双方を含む卵巣癌におけるヘプシン表面プロテアーゼ遺伝子の過剰発現を示すものである。ヘプシンの発現は低悪性度腫瘍における正常レベルを上回り、この群の高ステージ腫瘍（ステージＩＩＩ）では、低ステージ腫瘍（ステージＩ）と比較してヘプシンの高い発現が見られる（表６）。顕性癌では、漿液性腫瘍においてヘプシンの発現レベルが最も高かったのに対し、粘液性腫瘍のヘプシン発現レベルは高ステージの低悪性度群と同等である（図６および７）。
【０１２３】
【表５-１】
Figure 2003523524
【０１２４】
【表５-２】
Figure 2003523524
【表６】
Figure 2003523524
実施例１４
ＳＣＣＥおよびＰＵＭＰ−１の発現
ＳＣＣＥ−特異的プライマー（図８）とＰＵＭＰ−特異的プライマー（図９）の両者を用いた実験によって卵巣癌においてこれらのプロテアーゼが過剰発現されていることが示された。
【０１２５】
実施例１５
本明細書中で検出される既知のプロテアーゼの概要
本明細書中で述べるプロテアーゼの多くは、センス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒのプライマーの組から特定され、５００ｂｐのＰＣＲ産物として得られる（図１、レーン４）。これらの酵素の一部はよく知られたものであり、その簡単な概要を下記に述べる。
【０１２６】
ヘプシン
ヘプシンは肝癌からクローニングされたトリプシン様セリンプロテアーゼである。ヘプシンは細胞外プロテアーゼ（分泌シグナル配列を有する酵素）であり、そのアミノ末端ドメインによって細胞膜に固定されていることによって、触媒ドメインが細胞外マトリクスに曝されている。ヘプシンはまた、乳癌細胞系および末梢神経細胞において発現されることが示されている。これまでヘプシンと卵巣癌の関連は示されていなかった。ヘプシン遺伝子に対する特定のプライマーが合成され、胎児組織および卵巣組織（正常組織および卵巣癌）のノーザンブロットを用いてヘプシンの発現が調べられた。
【０１２７】
図１０Ａは、ヘプシンは異なる組織型の卵巣癌において発現されるが、正常な卵巣では発現されないことを示したものである。図１０Ｂは、ヘプシンは予想に違わず胎児肝臓および胎児腎臓で発現されたが、胎児脳および肺では発現が低レベルかまったく見られないことを示したものである。図１０Ｃは、正常な成人組織ではヘプシンの過剰発現は見られないことを示したものである。成人前立腺では、バックグラウンドよりも若干高い発現が見られる。両ノーザンブロットで特定されたｍＲＮＡはヘプシンの転写産物として妥当なサイズであった。定量的ＰＣＲアッセイにおいてβ−チューブリンおよびヘプシンに対する特異的プライマーを用いて、ヘプシンの発現を１０検体の卵巣と４４検体の卵巣腫瘍について調べたところ、３５サイクルにわたって線形であった。発現量は、内部コントロールとしての３２Ｐ−β−チューブリンのバンドに対する３２Ｐ−ヘプシンのバンドの比として示される。
【０１２８】
正常組織（Ｎ）、粘液性（Ｍ）、および漿液性（Ｓ）の低悪性度（ＬＭＰ）腫瘍および癌（ＣＡ）におけるヘプシンの発現を調べた。図１１Ａはヘプシンおよび内部コントロールとしてのβ−チューブリンの定量的ＰＣＲを示したものである。図１１Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍、および卵巣癌におけるヘプシン：β−チューブリンの発現比を示したものである。ヘプシンｍＲＮＡの発現レベルは、正常卵巣における発現レベルと比較して、ＬＭＰ腫瘍（ｐ＜０．００５）および癌組織（ｐ＜０．０００１）において著明に上昇していた。正常卵巣の１０例のすべてにおいて、ヘプシンｍＲＮＡの発現は比較的低レベルであることが示された。
【０１２９】
特定の低悪性度腫瘍を含む卵巣癌のほとんどの病理組織学的タイプにおいてヘプシンの顕著な過剰発現が見られた（図１１Ａおよび１１Ｂ参照）。最も著明な点として、ヘプシンは試験を行った漿液性、子宮内膜性、および明細胞腫瘍において高レベルの発現が見られた。ヘプシンは一部の粘液性腫瘍で高レベルの発現が見られたが、こうした腫瘍の大半で過剰発現は見られなかった。
【０１３０】
角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）
特定されたＰＣＲ産物は角質層キモトリプシン酵素のセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒの触媒ドメインであった。この細胞外プロテアーゼをクローニング、配列決定し、更に表皮のケラチノサイト表面で発現していることを示した。角質層キモトリプシン酵素は、皮膚の角質層中の細胞間接着構造の触媒的消化における関与が示唆されているキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。この消化によって、皮膚表面からの細胞の連続的な剥脱（落屑）が可能となる。角質層キモトリプシン酵素は、細胞下レベルでは、正常な非掌蹠性皮膚の角質層の上部顆粒層、および、肥厚性蹠角質層の接着部分に局在している。角質層キモトリプシン酵素は、角質層との関連のみが知られており、癌性組織における発現はこれまで示されていなかった。
【０１３１】
ノーザンブロットをＰＣＲ産物でプローブして胎児組織および卵巣癌における角質層キモトリプシン酵素の発現（図１２Ａおよび１２Ｂ）を調べた。注目すべき点として、胎児組織のノーザンブロット上では、角質層キモトリプシン酵素のメッセンジャーＲＮＡはほとんど検出されなかった（適宜コントロールを行って、プローブやブロットによる問題の可能性を排除した。）。胎児腎臓では弱いバンドが現れた。これに対し、卵巣癌ｍＲＮＡ中には角質層キモトリプシン酵素のｍＲＮＡが大量に存在する（図１２Ｂ）。角質層キモトリプシン酵素に対しては、適当なサイズの転写産物が２種類見られた。ヘプシンの分析に用いたものと同じｃＤＮＡのパネルを角質層キモトリプシン酵素の発現について用いた。
【０１３２】
ノーザンブロットの正常卵巣のレーンでは、角質層キモトリプシン酵素の発現は検出されなかった。ロードマーカー（β−チューブリン）を含むすべての候補遺伝子の比較により、この観察結果がローディングの偏りによるものではないことが確認された。角質層キモトリプシン酵素のプライマーをβ−チューブリン内部コントロールのプライマーとともに用いた定量的ＰＣＲにより、卵巣の癌において角質層キモトリプシン酵素のｍＲＮＡが過剰発現され、正常な卵巣組織では発現が見られないことが確認された（図１３）。
【０１３３】
図１３Ａは、正常卵巣および卵巣癌から得た角質層キモトリプシン酵素のｃＤＮＡの定量的ＰＣＲを用いた比較を示したものである。図１３Ｂは１０検体の正常組織と４４検体の卵巣癌組織における、β−チューブリン内部スタンダードに対する角質層キモトリプシン酵素の比を示したものである。ここでもやはり、卵巣癌細胞において角質層キモトリプシン酵素が過剰発現されていることが確認された。また、一部の粘液性腫瘍において角質層キモトリプシン酵素の過剰発現が見られるものの、大半の粘液性腫瘍では発現が見られないことも示された。
【０１３４】
プロテアーゼＭ
プロテアーゼＭはＨｉｓ−ｓｅｒのプライマーの組のサブクローンから特定された。このプロテアーゼはＡｎｉｓｏｗｉｃｚ等により最初にクローニングされ（Molecular Medicine, 2, 624-636 (1996)）、癌組織で過剰発現されていることが示された（図１４）。予備評価はこの酵素が卵巣癌において過剰発現されていることを示している（図１４）。
【０１３５】
補因子Ｉおよび補体因子Ｂ
凝固経路に関与している幾つかのセリンプロテアーゼもサブクローニングされている。これらの酵素の発現について正常組織および卵巣癌を定量的ＰＣＲによって調べたところ、このｍＲＮＡは正常な卵巣組織と比較して卵巣癌における過剰発現が明らかではなかった。各候補プロテアーゼの評価には同じ腫瘍パネルを用いた。
【０１３６】
実施例１６
以前には知られておらず、本発明において検出されたプロテアーゼＴＡＤＧ−１２の概要
ＴＡＤＧ−１２は、プライマーの組としてセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ａｓｐ（図１、レーン１および２参照）を用いて特定された。レーン２の両方のＰＣＲ産物をサブクローニングしたところ、この２００ｂｐの産物はＧｅｎＢａｎｋには登録されていない特徴的なプロテアーゼ様配列を有していた。この２００ｂｐの産物は、セリンタンパク質ファミリーのＨｉｓ−Ａｓｐドメインに共通して保存されたアミノ酸を多く有する。第２番目の、より大きなＰＣＲ産物（３００ｂｐ）はＴＡＤＧ−１２（Ｈｉｓ−Ａｓｐ配列）と高い相同性を有するが、約１００個程度の固有配列も有する。特定のプライマーを合成し、３つの異なる腫瘍からのＰＣＲ産物を配列決定することによって、より大きなＰＣＲ産物（卵巣癌の約５０％に存在）は配列の５’末端（かつヒスチジンの付近）近くに約１００ｂｐのインサートを有することが示された。このインサートは、スプライシング部位が妥当な位置にあること、およびインサートがオープンリーディングフレームを含まないことから、維持されたゲノムイントロンである可能性がある（図１５）。このことは、イントロンの維持、またはＴＡＤＧ−１２遺伝子内への特定配列の転座をすべての卵巣癌の半数においてもたらすスプライシング部位変異の可能性を示唆するものである。
【０１３７】
ＴＡＤＧ−１３およびＴＡＤＧ−１４
正常組織および卵巣癌組織における遺伝子の発現を評価するためにＴＡＤＧ−１３およびＴＡＤＧ−１４について特異的なプライマーを合成した。卵巣組織のノーザンブロット分析により、ＴＡＤＧ−１４遺伝子の転写産物は約１．４ｋｂの大きさであり、卵巣癌組織で発現され（図１６Ａ）、正常組織では転写産物は検出されないことが示された。特定のプライマーを用いた定量的ＰＣＲ分析により、正常な卵巣と比較して、卵巣癌組織中でＴＡＤＧ−１４の発現が増大していることが示された（図１６Ｂ）。更に、ＨｅＬａライブラリーおよび卵巣癌ライブラリーの両方においてＴＡＤＧ−１４に対して特異的なＰＣＲ産物が存在することも確認された。ＨｅＬａライブラリーからＴＡＤＧ−１４に対する複数の候補配列がスクリーニング、単離された。
【０１３８】
配列の相同性から明らかであるが、これらの遺伝子はセリンプロテアーゼファミリーに分類されるものである。しかしながら、ＴＡＤＧ−１３および−１４は、本発明の特定のプライマーによって正常および腫瘍細胞中での評価が可能な、これらの遺伝子の発現の有無が特定の腫瘍タイプに対する診断または治療法の選択において有用であるような遺伝子としては、これまでに記載がないものである。
【０１３９】
ＰＵＭＰ−１
金属結合ドメインおよび保存されたヒスチジンドメインに対する重複プライマーを用いた同様の方法において、マトリクスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ−７）に類似した発現レベルの異なるＰＣＲ産物が特定された。これをＰＵＭＰ−１と称する。ＰＵＭＰ−１に対して特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより得られた２５０ｂｐのＰＣＲ産物にノーザンブロット分析を行った。
【０１４０】
ＰＵＭＰ−１は胎児胚と腎臓組織において発現レベルが異なる。図１７Ａはヒト胎児組織におけるＰＵＭＰ−１の発現を示したものであるが、胎児脳および胎児肝臓のいずれにおいても転写産物は検出されなかった。図１７Ｂはノーザンブロット分析を用いて正常卵巣および卵巣癌のサブタイプにおけるＰＵＭＰ−１の発現を比較したものである。ＰＵＭＰ−１は卵巣癌組織においては発現が見られるが、正常組織では転写産物の存在はやはり確認されなかった。正常卵巣および卵巣癌におけるＰＵＭＰ−１のｍＲＮＡの発現を比較した定量的ＰＣＲにより、この遺伝子は、多くの低悪性度漿液性腫瘍を含む漿液性癌において高レベルで発現され、ここでも粘液性腫瘍では比較的に発現レベルが低いことが示された（図１８Ａおよび１８Ｂ）。しかしながらＰＵＭＰ−１はこれまでのところ粘液性腫瘍において過剰発現が最も頻繁に見られるプロテアーゼである（表７）。
【０１４１】
カテプシン−Ｌ
個々のシステインおよびヒスチジン残基の周囲の保存ドメインに対する重複システインプロテアーゼプライマーを用い、カテプシン−Ｌプロテアーゼを複数の漿液性癌において特定した。正常卵巣組織および卵巣腫瘍組織におけるカテプシンＬの発現の最初の分析によって、正常組織および腫瘍組織の両方にカテプシン−Ｌプロテアーゼが存在することが示された（図１９）。しかしながら、カテプシンＬの有無を本発明の他のプロテアーゼと組み合わせることにより、特定の腫瘍タイプの同定や治療法の選択を行うことが可能である。
【０１４２】
考察
セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびシステインプロテアーゼの保存ドメインに対する重複プライマーによって、卵巣癌でｍＲＮＡが過剰発現される遺伝子のセットが得られた。著明な過剰発現が見られた遺伝子としては、セリンプロテアーゼヘプシン、角質層キモトリプシン酵素、プロテアーゼＭ ＴＡＤＧ１２、１４およびメタロプロテアーゼＰＵＭＰ−１がある（図１９および表７参照）。図１４にまとめた正常卵巣組織および卵巣癌組織のノーザンブロット分析により、ヘプシン、角質層キモトリプシン酵素、ＰＵＭＰ−１、およびＴＡＤＧ−１４の過剰発現が示された。ローディングレベルのコントロールとしてのβ−チューブリンプローブも示してある。
【０１４３】
【表７】
Figure 2003523524
これらのタンパク質は卵巣癌細胞の細胞外マトリクスとの関連が以前には示されていなかったものが大部分である。転移性癌の増殖、剥脱、浸潤、およびコロニー形成に寄与すると考えられるプロテアーゼのパネルとしては、本明細書に開示される３つの新規な候補セリンプロテアーゼを含め、これまでに記述されたものはない。悪性増殖または悪性度に関連した細胞外プロテアーゼのパネルを構築することにより、診断または予備徴候マーカーの特定、およびこれらのプロテアーゼの阻害またはダウンレギュレーションによる治療的介在の可能性が拓けるものである。
【０１４４】
腫瘍に特異的なプロテアーゼの適当な領域をコードした遺伝子特異的プライマーが利用可能であることにより、ノーザンおよびサザン分析法を用いた特異的ｃＤＮＡプローブの増幅が可能となり、これをマーカーとして用いて組織における癌の存在を検出することが可能となる。こうしたプローブにより更に、正常卵巣および低悪性度腫瘍ならびに高ステージおよび低ステージの癌における遺伝子の発現のより詳細な評価が可能となる。癌のすべてのサブタイプ（表４）から得た新鮮な凍結組織のパネルを評価することによって、あるプロテアーゼが疾患の初期ステージで主に発現するのか、または特定の癌のサブタイプにおいて発現するのかを判定することが可能となった。更に、各遺伝子の発現が腫瘍の進行の特定のステージに限定されているのか、および／または転移性病変に伴って起きるのかを判定することが可能となった。プロテアーゼの特定の組合わせの検出は、特定の腫瘍タイプの識別特性となるものであり、診断および治療法の選択のための重要な情報を与えるものである。特定の腫瘍に特徴的な発現パターンによって特定の腫瘍タイプをより正確に診断することが可能となる。
【０１４５】
実施例１７
ペプチドランキング
ワクチンまたは免疫刺激の目的で、ヘプシンタンパク質の９量体〜１１量体を調べ、人口集団で上位８位までのハプロタイプ（Parker et al., (1994)）に対する個々のペプチドの結合性をランク付けした。この分析に用いたコンピュータープログラムは＜http://www-bimas.dcrt.nig.gov/molbio/hla_bind/＞で見ることができる。表８は、特定のＨＬＡアレルに対する各ペプチドの結合の予測される半減期に基づいたペプチドのランキングを示したものである。長い半減期は、そのペプチドと特定のＨＬＡ分子との強い結合を示す。ＨＬＡアレルに強く結合するヘプシンペプチドは潜在的な免疫原であり、ヘプシンに対する患者への接種に使用される。
【０１４６】
【表８-１】
Figure 2003523524
【０１４７】
【表８-２】
Figure 2003523524
【０１４８】
【表８-３】
Figure 2003523524
【０１４９】
【表８-４】
Figure 2003523524
【０１５０】
【表８-５】
Figure 2003523524
【０１５１】
【表８-６】
Figure 2003523524
【０１５２】
【表８-７】
Figure 2003523524
本明細書中で触れた特許または刊行物は本発明が係る技術分野における当業者の水準を示すものである。更にこれらの特許および刊行物は、恰も個々の刊行物が詳細かつ個別に援用されたのと同様にここに援用されるものである。
【０１５３】
本発明は、明細書に記載された目的、結果、および利点はもとより、発明に内在する目的、結果および利点の実現に優れて適合している点は当業者によれば直ちに了承されよう。明細書中に述べられる実施例、方法、手技、処置、分子、および特定の化合物は、好ましい実施形態を現時点で代表するものであり、あくまで例示的なものであって、発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって定義される発明の精神の範囲内において発明の変更や他の用途が想到されることであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、正常および癌のｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物のアガロースゲルの比較を示す
【図２】
図２は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、ＰＵＭＰ-１、ＴＡＤＧ-１４、およびβ−チューブリンプローブを用いた卵巣腫瘍のノーザンブロット分析を示す
【図３】
図３は、セリンプロテアーゼ重複プライマーでの増幅を示す
【図４】
図４は、システインプロテアーゼ重複プライマーでの増幅を示す
【図５】
図５は、メタロプロテアーゼ重複プライマーでの増幅を示す
【図６】
図６は、セリンプロテアーゼであるヘプシンに特異的なプライマーでの増幅を示す
【図７】
図７は、正常、低悪性潜在的腫瘍、および卵巣癌でのヘプシン発現レベルを示す
【図８】
図８は、正常、低悪性潜在的腫瘍、および卵巣癌でのセリンプロテアーゼ角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）発現レベルを示す
【図９】
図９は、正常組織および卵巣癌組織でのメタロプロテアーゼＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）遺伝子の発現を示す
【図１０】
図１０は、ヘプシン発現のノーザンブロット分析を示す
【図１１Ａ】
図１１Ａは、正常（Ｎ）、粘液性（Ｍ）および漿液性（Ｓ）低悪性潜在的（ＬＭＰ）腫瘍、ならびに癌（ＣＡ）におけるヘプシン発現を示す
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍、および卵巣癌におけるヘプシン：β−チューブリン発現の比を示す
【図１２Ａ】
図１２Ａは、胎児組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、卵巣組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す
【図１３Ａ】
図１３Ａは、正常卵巣および卵巣癌からのＳＣＣＥ ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲの比較を示す
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、１０の正常組織および４４の卵巣癌組織における、β−チューブリンに対するＳＣＣＥの比を比較する棒グラフを示す
【図１４】
図１４は、正常および卵巣癌におけるプロテアーゼＭのｍＲＮＡ発現の定量的ＰＣＲによる比較を示す
【図１５】
図１５は、Ｈｉｓ ５’末端近くに挿入物を含むＴＡＤＧ−１２触媒ドメインを示す
【図１６Ａ】
図１６Ａは、正常組織および卵巣癌組織におけるＴＡＤＧ−１４発現を比較するノーザンブロット分析を示す
【図１６Ｂ】
図１６Ｂは、ＴＡＤＧ−１４特異的プライマーを用いた、正常および癌のｃＤＮＡの予備定量的ＰＣＲを示す
【図１７Ａ】
図１７Ａは、ヒト胎児組織におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す
【図１７Ｂ】
図１７Ｂは、正常卵巣および卵巣癌におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す
【図１８Ａ】
図１８Ａは、内部対照β−チューブリンを用いた定量的ＰＣＲによって、正常組織および癌組織におけるＰＵＭＰ−１発現を比較したものを示す
【図１８Ｂ】
図１８Ｂは、１０の正常および４４の卵巣癌における、内部対照β−チューブリンに対するＰＵＭＰ−１のｍＲＮＡ発現の比を示す
【図１９】
図１９は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、プロテアーゼＭ、ＰＵＭＰ−１、およびカテプシンＬの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の比較を示す

Claims (39)

  1. 癌を検査する方法であって：
    個体から採取した生物試料中のヘプシンを検出する工程を含み、前記試料中にヘプシンが存在すれば前記個体に癌が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンが存在しなければ前記個体に癌が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
  2. 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 前記ヘプシンの検出が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡアレイチップ、またはフローサイトメトリーより成る群から選択される手段によってなされることを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 前記癌が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 生体試料中の悪性増殖を検出する方法であって：
    （ａ）前記試料からｍＲＮＡを単離する工程；および
    （ｂ）前記試料中のヘプシンｍＲＮＡを検出する工程；を含み、
    前記試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在すれば悪性増殖が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンｍＲＮＡが存在しなければ悪性増殖が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
  6. ヘプシンｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の診断が行われることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. ヘプシンｍＲＮＡを参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の治療法が決定されることを特徴とする請求項５記載の方法。
  8. 前記ヘプシンｍＲＮＡの検出が、ＰＣＲ増殖によってなされることを特徴とする請求項５記載の方法。
  9. 前記ＰＣＲ増殖が、配列番号８および９の配列より成る群から選択されるプライマーを使用することを特徴とする請求項８記載の方法。
  10. 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
  11. 生体試料中の悪性増殖を検出する方法であって：
    （ａ）前記試料からタンパク質を単離する工程；および
    （ｂ）前記試料中のヘプシンタンパク質を検出する工程；を含み、
    前記試料中にヘプシンタンパク質が存在すれば悪性増殖が存在することが示唆され、前記試料中にヘプシンタンパク質が存在しなければ悪性増殖が存在しないことが示唆されることを特徴とする方法。
  12. ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の診断が行われることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  13. ヘプシンタンパク質を参照情報と比較する工程を更に含み、該比較によって悪性増殖の治療法が決定されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  14. 前記ヘプシンタンパク質の検出が、ヘプシンに特異的な抗体に対するイムノアフィニティーによってなされることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  15. 前記生物試料が、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  16. 細胞における内因性ヘプシンの発現を阻害する方法であって、
    発現に必要なエレメントに作動可能に結合した逆方向のヘプシン遺伝子を含むベクターを細胞に導入する工程を含み、前記細胞での前記ベクターの発現によってヘプシンアンチセンスｍＲＮＡが産生され、該ヘプシンアンチセンスｍＲＮＡが内因性ヘプシンｍＲＮＡにハイブリダイズして、前記細胞における内因性ヘプシンの発現が阻害されることを特徴とする方法。
  17. 細胞においてヘプシンタンパク質を阻害する方法であって、
    ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに対して特異的な抗体を細胞に導入する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質に対する抗体が該ヘプシンタンパク質を阻害することを特徴とする方法。
  18. 個体（ヒトを除く）の標的治療の方法であって、ヘプシンに対して特異的なターゲティング部分と薬効部分とを有する化合物を前記個体に投与する工程を含むことを特徴とする方法
  19. 前記ターゲティング部分が、ヘプシンに対して特異的な抗体、ヘプシンに結合するリガンドまたはリガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  20. 前記薬効部分が、放射性同位体、毒素、化学療法薬、免疫増強薬、および細胞傷害性物質より成る群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  21. 前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌に罹患していることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  22. 個体（ヒトを除く）にヘプシンに対するワクチン接種を行う方法であって、
    ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントを前記個体に接種する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質またはそのフラグメントの接種によって個体に免疫応答が誘導されて、個体にヘプシンに対するワクチン接種が行われることを特徴とする方法。
  23. 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、または癌を発症するリスクがあることを特徴とする請求項２２記載の方法。
  24. 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
  25. 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
  26. ヘプシンに対する免疫活性化細胞を作成する方法であって、
    ヘプシンプロテアーゼ活性を欠くヘプシンタンパク質またはそのフラグメントに樹状細胞を曝露する工程を含み、前記ヘプシンタンパク質またはその断片への曝露によって樹状細胞が活性化されて、ヘプシンに対する免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする方法。
  27. 前記免疫活性化細胞が、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞、および樹状細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
  28. 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
  29. 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
  30. 前記樹状細胞が、曝露に先立って個体から単離され、曝露後に前記個体に再導入されるものであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
  31. 前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、または癌を発症するリスクがあることを特徴とする請求項３０記載の方法。
  32. ヘプシンタンパク質の免疫原性フラグメントおよび適当なアジュバントを含む免疫原組成物。
  33. 前記ヘプシンフラグメントが、９残基から２０残基までのフラグメントより成る群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の免疫組成物。
  34. 前記９残基のフラグメントが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４で表される配列より成る群から選択されることを特徴とする請求項３３記載の免疫組成物。
  35. 配列番号１８８の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。
  36. 請求項３５記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容される担体を含む組成物。
  37. 個体（ヒトを除く）の腫瘍状態を治療する方法であって、
    前記個体に請求項３５記載のオリゴヌクレオチドの有効量を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
  38. 前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、およびヘプシンを過剰発現している他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
  39. ヘプシン活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって：
    （ａ）ヘプシンタンパク質を含む試料を特定の化合物と接触させる工程；および
    （ｂ）ヘプシンプロテアーゼ活性についてアッセイを行う工程；を含み、
    前記化合物の存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性が、該化合物の非存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性と比較して低下している場合、該化合物がヘプシン活性を阻害する化合物であることが示唆されることを特徴とする方法。
JP2001561336A 2000-02-22 2001-02-20 卵巣癌の早期診断のための組成物および方法 Pending JP2003523524A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/510,738 US6268165B1 (en) 1997-03-19 2000-02-22 Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US09/510,738 2000-02-22
PCT/US2001/005703 WO2001062271A1 (en) 2000-02-22 2001-02-20 Compositions and methods for the early diagnosis of ovarian cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003523524A JP2003523524A (ja) 2003-08-05
JP2003523524A5 true JP2003523524A5 (ja) 2005-11-04

Family

ID=24031976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001561336A Pending JP2003523524A (ja) 2000-02-22 2001-02-20 卵巣癌の早期診断のための組成物および方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US6268165B1 (ja)
EP (1) EP1257287B1 (ja)
JP (1) JP2003523524A (ja)
AU (2) AU2001239832B2 (ja)
CA (1) CA2400703A1 (ja)
MX (1) MXPA02008258A (ja)
WO (1) WO2001062271A1 (ja)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7795211B2 (en) * 2000-02-22 2010-09-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
AU2002213704A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-06 Mount Sinai Hospital Method for detecting ovarian cancer based on human kallikrein 6 (HK6)
US20030013097A1 (en) * 2001-01-23 2003-01-16 Welsh John Barnard Genes overexpressed in prostate disorders as diagnostic and therapeutic targets
AU2002240336A1 (en) * 2001-02-14 2002-08-28 Tularik Inc. Methods for the diagnosis and treatment of tumors employing the hepsin gene
US7229774B2 (en) * 2001-08-02 2007-06-12 Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
US7332290B2 (en) 2001-08-02 2008-02-19 The Regents Of The University Of Michigan Dectection of AMACR cancer markers in urine
US7700293B2 (en) 2001-08-02 2010-04-20 The Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
US20030113762A1 (en) * 2001-08-17 2003-06-19 Warrington Janet A. Gleason grade 4/5 prostate cancer genes
US20040009911A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs
US20040029151A1 (en) * 2002-04-09 2004-02-12 Affymetrix, Inc. Molecular genetic profiling of gleason grades 3 and 4/5 prostate cancer
US20050272052A1 (en) * 2002-04-09 2005-12-08 Affymetrix, Inc. Molecular genetic profiling of gleason grades 3 and 4/5 prostate cancer
AU2003260316A1 (en) * 2002-07-23 2004-02-09 Bayer Healthcare Ag Regulation of human hepsin
US10533998B2 (en) 2008-07-18 2020-01-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP1984738A2 (en) 2006-01-11 2008-10-29 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP2530167A1 (en) 2006-05-11 2012-12-05 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
KR101410195B1 (ko) 2006-06-22 2014-06-19 제넨테크, 인크. 헵신을 표적화하기 위한 방법 및 조성물
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US8528589B2 (en) 2009-03-23 2013-09-10 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
AR078716A1 (es) 2009-10-22 2011-11-30 Genentech Inc Anticuerpos antihepsina y metodos para su uso
WO2011073283A1 (en) * 2009-12-15 2011-06-23 Technische Universität Dresden A non-invasive method for diagnosis of prostate cancer
WO2011079176A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
EP3447155A1 (en) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP3859011A1 (en) 2011-02-11 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for forming mixed droplets
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
WO2012174569A2 (en) * 2011-06-17 2012-12-20 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas New markers for early diagnosis of ovarian cancer, monitoring during therapy, and new therapy options during and after chematherapy
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
EP3495817A1 (en) 2012-02-10 2019-06-12 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
EP3524693A1 (en) 2012-04-30 2019-08-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2014172288A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
EP3090063B1 (en) 2013-12-31 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detection of latent retrovirus
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
US10998178B2 (en) 2017-08-28 2021-05-04 Purdue Research Foundation Systems and methods for sample analysis using swabs

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5484726A (en) 1990-11-21 1996-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies specific for human stromelysin-3 and a method for detection of stromelysin-3
DE69505076T2 (de) * 1994-07-29 1999-02-25 Teijin Ltd Trypsintyp-Enzyme, dafür kodierende Nukleinsäuresequenz und Verfahren zur Herstellung des Enzymes
US6294344B1 (en) * 1997-03-19 2001-09-25 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
WO1998041656A1 (en) * 1997-03-19 1998-09-24 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and method for the early diagnosis of ovarian cancer

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003523524A5 (ja)
AU2001239832B2 (en) Compositions and methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US6316213B1 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian, breast and lung cancer
US7306927B2 (en) Method of inducing immunity against stratum corneum chymotrytic enzyme
US7939321B2 (en) TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in carcinomas
JP4558948B2 (ja) 卵巣癌において過剰発現される膜貫通型セリンプロテアーゼおよびその使用
AU2001239832A1 (en) Compositions and methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US6942978B1 (en) Transmembrane serine protease overexpressed in ovarian carcinoma and uses thereof
US6303318B1 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
EP1887082A2 (en) TADG-15: An extracellular serine protease overexpressed in carcinomas
US20030027144A1 (en) Tumor antigen-derived gene 16 (TADG-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
JP4253120B2 (ja) 新規な細胞外セリンプロテアーゼ
US6875609B2 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US6870027B2 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
AU2001234910B2 (en) Compositions and methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US7785841B2 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US6787354B2 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
JP2007503817A (ja) 卵巣癌の早期診断方法
US6627403B2 (en) Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
AU2001234910A1 (en) Compositions and methods for the early diagnosis of ovarian cancer