PT833834E - Sequencia de dna e proteina codificada do cancro da mama especifica da glandula mamaria - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIA DE DNA E PROTEÍNA CODIFICADA DO CANCRO DA MAMA ESPECÍFICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA" (1) Campo da invenção

Esta invenção diz respeito de um modo geral ao campo da patogénese do cancro da mama e, em particular, a uma sequência de cDNA e à proteína codificada específica da glândula mamária para uso na detecção e tratamento do cancro da mama. (2) Descrição dos conhecimentos científicos relacionados O cancro da mama é um dos cancros mais comuns e potencialmente letais. Embora os diagnósticos e tratamentos precoces possam reduzir a morbidez e a mortalidade relacionada com a doença, o valor positivo de previsão da mamografia tem sido estimado como sendo de somente cerca de 25% (Hall et al., N Engl J Med 327:319-328, 1992). Seria portanto desejável, ter um meio para detectar o cancro mais cedo do que ele é actualmente detectado usando a mamografia, e uma marca genética ou bioquímica pode ser capaz de proporcionar um tal processo para complementar e aumentar o valor de previsão da mamogragfia. (Hayes, Hematol Oncol Clin NAM 8:485, 1994). O desenvolvimento do cancro da mama é acompanhado por uma série de mudanças genéticas (Para estudo ver Porter Jordan, Hematol Oncol Clin N Am 8:73,1994). Tais mudanças incluem alterações cromossómicas vulgares e perda de marcas genéticas (Devilee et al, Biochim Biophys Acta 1198:113, 1994; Callahan et al, J Cell Biochem Suppl 17:167, 1993). Tem também sido mostrado que a progressão do neoplasma da mama resulta em mudanças qualitativas e quantitativas na expressão de genes previamente identificados que codificam factores de crescimento e os seus receptores (Zajchowski et al., Câncer Res 48: 7041, 1988), proteínas estruturais (Trask et al., Proc Natl Acad Sei 87: 2319, 1990), proteínas mensageiras secundárias (Ohuchi et al., Câncer Res 26:2511, 1986), e factores de transcrição (Harris, Adv Câncer Res 59:69: 1992). Estas mudanças na expressão de genes podem potencialmente formar a base para desenvolver uma marca do cancro da mama, embora o papel preciso destas mudanças de gene na patogénese do carcinoma da mama em amostras biópsias do paciente não seja bem entendida.

Adicionalmente, e para fornecer uma marca genética ou bioquímica para o cancro da mama para uma detecção precoce da doença, seria também desejável ter uma marca de tumor que pudesse fornecer uma estimativa da prognose, um meio para a selecção e avaliação da terapia e um meio para o objecto da terapia. Embora tenham sido identificadas uma série de marcas de tecido, nenhuma é suficientemente sensível ou específica a tumor para ser idealmente apropriada para diagnóstico ou para exame da população geral. (Id.). Assim, continua a permanece uma necessidade para uma marca do cancro da mama tal como um gene juntamente com a sua proteína expressa que possa ser usado para identificar especificamente e de forma selectiva o aparecimento e o desenvolvimento patogénico do cancro da mama num paciente.

Usando uma técnica da reacção de cadeia de polimerase com uma exibição diferencial modificada para isolar sequências de marcas do carcinoma mamário diferencialmente expressas, foram isoladas várias sequências de fragmentos que eram unicamente expressas no tecido epitelial mamário neoplástico quando comparados com controlos de tecido normal (Watson e Fleming, Câncer Res 54:4598-4602, 1994). A descoberta duma destas sequências de marca identificada como DEST002 conduziu à descoberta e isolamento do novo cDNA completo e da proteína codificada agora referenciada como mamaglobina. O cDNA e a proteína são ambos novos.

Sumário da Invenção

Assim, e de forma resumida, a presente invenção é dirigida à identificação de novos genes cuja expressão é aumentada no cancro da mama e ao isolamento dos cDNA a partir dos mRNA destes genes. Em conformidade, os requerentes obtiveram sucesso na descoberta de um novo cDNA e na proteína secretora codificada específica da glândula mamária, a mamaglobina. O cDNA encontra-se na forma purificada e isolada e identificado como "Sequência n°l" e a proteína codificada, a mamaglobina encontra-se na forma purificada e isolada e identificado como "Sequência n°2". A mamaglobina é superexpressa em 27% da fase I dos tumores do cancro da mama primários. Isto sugere que a desregulação do gene da mamaglobina ocorre antes e frequentemente no cancro da mama. A descoberta da mamaglobina e do seu cDNA, fornece, portanto, a base para o desenvolvimento de novos métodos e composições para a detecção e tratamento da doença neoplástica da mama em humanos e noutros mamíferos.

Assim, a presente invenção é também dirigida a novos métodos para detectar a presença de células mamárias neoplásicas numa amostra. Numa concretização é usado cDNA codificador da mamaglobina ou um derivado do dito cDNA para detectar, numa amostra, a presença de mRNA da mamaglobina. O método compreende os seguintes passos: (a) fornecer um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleótidos com o complementar da sequência da Sequência n°l ou duma derivada da mesma, (b) incubar a sequência de nucleótidos com a amostra, sob condições nas quais a sequência pode hibridar com o mRNA proveniente das células mamárias neoplásicas, e (c) detectar a existência de um complexo de hibridação DNA-RNA.

Outro aspecto da presente invenção é o fornecimento de um kit ("estojo") para detectar a presença de células mamárias neoplásicas numa amostra. O kit ("estojo") compreende um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleótidos com o complementar da sequência da Sequência n°l ou duma derivada da mesma embalada num contentor.

Noutra concretização da presente invenção, a mamaglobina, ou uma sua derivada, é usada para detectar, numa amostra, a presença de cDNA que seja um transcrito inverso do mRNA da mamaglobina. O método compreende os seguintes passos: (a) produção de um cDNA a partir de mRNA usando o método da transcrição inversa numa amostra obtida de um paciente, (b) fornecer dois oligómeros que são iniciadores para o método da reacção de cadeia de polimerase e que flanqueiam ou situam-se dentro de um cDNA que codifica a mamaglobina, e (c) amplificar o cDNA que codifica a mamaglobina pelo método da reacção de cadeia de polimerase. Os dois oligómeros incluem a "Sequência n°3" e a "Sequência n°4".

Outra concretização para a presente invenção fornece um kit ("estojo") para a detecção da presença de células mamárias neoplásicas numa amostra. O kit ("estojo") compreende dois oligómeros que são iniciadores para o método da reacção de cadeia de polimerase, e que flanqueiam ou situam-se dentro de um cDNA que codifica a mamaglobina, embalados num contentor. Os dois oligómeros incluem a "Sequência n°3" e a "Sequência n°4". -5-

Noutra concretização da presente invenção, a presença da mamaglobina expressa por uma célula de tumor é detectada, numa amostra, usando anticorpos específicos para a proteína mamaglobina. Os anticorpos específicos podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais.

Entre as várias vantagens que podem ser alcançadas pela presente invenção, pode ser realçado a provisão de uma sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos codificada que podem servir como marcas para células do cancro da mama; a provisão de métodos para uma detecção precoce da presença de células mamárias neoplásicas; a provisão de meios para detectar o cancro da mama que podem complementar a mamografia e aumentar o valor de previsão; e a provisão de métodos que podem fornecer uma estimativa de prognose; e a provisão de marcas que irão permitir o objecto da terapia

Breve Descrição da Figuras A Figura 1 ilustra a estratégia usada para isolar o cDNA completo da mamaglobina usando a técnica da amplificação rápida das extremidades do cDNA (RACE) pela Reacção de Cadeia de Polimerase (PCR) e subsequente subclonagem nos vectores pGEM7Z e pCEV27. A Figura 2 ilustra a sequência de cDNA humano da Sequência n°l (os nucleótidos estão numerados em cima) e a sequência de aminoácidos da proteína codificada específica da glândula mamária, a mamaglobina (Sequência n°2) (os aminoácidos estão numerados em baixo), em que a barra compacta ilustra o fragmento de 403 pb ("Sequência n°5") isolado pelo método RACE PCR e a barra aberta indica a sequência DEST002 de 206 pb ("Sequência n°6") -6- A Figura 3 ilustra a sequência de aminoácidos da proteína específica da glândula mamária, a mamaglobina (hMAM), (Sequência n°2) comparada com a subunidade C3 da proteína ligante do esteróide prostático de ratazana (rPSC3) ("Sequência n°7") e com a proteína de 10 kD da célula clara humana (hCCIO) ("Sequência n°8") em que as semelhanças estão assinaladas por letras intensas e linhas duplas e os aminoácidos estruturalmente similares estão assinalados por linhas simples; A Figura 4 ilustra (A) as análises "Northern blot" da hibridação da sequência de cDNA humano que codifica a proteína específica da glândula mamária, a mamaglobina (hMAM), com o mRNA expresso por tecidos mamários neoplásicos, tecidos mamários normais e outros tecidos adultos e (B) as análises das amostras amplificadas por RT/PCR de tecidos mamários neoplásicos, tecidos mamários normais e outros tecidos adultos; A Figura 5 ilustra a tradução a sequência de cDNA específico da glândula mamária num sistema de análise do lisado da reticulocitose de coelho in vitro; A Figura 6 ilustra a hibridação Northern blot com o cDNA que codifica a mamaglobina detectando o mRNA no tumor 2410, nos tumores em três de oito pacientes diferentes (mostrado a negrito), e numa menor extensão, em tecido mamário normal (mostrado em itálico) comparando em dois casos, a expressão da mamaglobina em tecido de tumor e tecido tipo normal de paciente; A Figura 7 ilustra as análises Western blot usando um anticorpo policlonal para os 16 aminoácidos do terminal-C ("Sequência n°14") a partir de meio condicionado (S) e lisado de célula (C) a partir das células MDA-MB-415 de tumor de mama na ausência (-) e na presença (+) do péptido usado para gerar o anticorpo policlonal; A Figura 8 ilustra as análises Western blot de lisados de células de células de tumor da mama humano que mostra a detecção da proteína mamaglobina usando anticorpo policlonal para os 16 aminoácidos do terminal-C (Sequência n°14) e anticorpo anti-coelho de cabra visualizado por quimioluminescência de ligação a enzima; A Figura 9 ilustra, a cor, uma secção de células do cancro da mama, fixas por parafina, de uma amostra de paciente, imuno-histoquimicamente coloridas, usando anticorpo policlonal para os 16 aminoácidos do terminal-C ("Sequência n°14") e anticorpo anticoelho de cabra rotulado com peroxidase de rábão e DAB como substrato mostrando uma coloração castanha de células que expressam a proteína mamaglobina; A Figura 9A ilustra, a preto e branco, uma secção de células do cancro da mama, fixas por parafina, de uma amostra de paciente, imuno-histoquimicamente coloridas, usando anticorpo policlonal para os 16 aminoácidos do terminal-C ("Sequência n°14") e anticorpo anticoelho de cabra rotulado com peroxidase de rábão e DAB como substrato onde é indicada a coloração castanha de células que expressam a proteína mamaglobina.

Descrição das Concretizações Preferidas

Um aspecto da presente invenção baseia-se na identificação e sequenciação do cDNA identificado como Sequência n°l que codifica uma proteína secretora específica da glândula mamária, a mamaglobina, identificada -8- pela Sequência n°2 (FIG 2). Tal como em baixo é descrito, o cDNA completo da mamaglobina foi isolado partindo de mRNA de célula de tumor que foi sujeito a transcrição inversa, amplificado usando a técnica de PCR e subclonado em vectores de expressão. Adicionalmente, a proteína mamaglobina, codificada pelo cDNA foi identificada e caracterizada.

Usando a sequência marca anónima previamente designada por DEST002, foi demonstrado que o correspondente produto do gene, que era até agora desconhecido mas aqui identificado como mamaglobina, é particularmente abundante na linhagem de células MDA-MB-415 do tumor do cancro da mama. Para isolar o cDNA completo da mamaglobina, o mRNA foi sujeito a transcrição inversa a partir desta linhagem de células e clonado usando a técnica de RACE PCR (Edwards et al., Nucleic Acids Research 19, 5227-32, 1991). Esta técnica é baseada na estratégia de ligação de oligodesoxiribonucleotídeos de cadeia simples à extremidade 3' de cDNA de cadeia simples. O método pelo qual o cDNA de mamaglobina foi isolado está esquematicamente representado na FIG 1. A sequência completa de cDNA de 503 pb (Sequência n°l) foi deduzida a partir da informação de sequência obtida do fragmento de 403 pb (Sequência n°5) (FIG 2) isolado por esta técnica juntamente com a informação de sequência previamente obtida da sequência DEST correspondente (DEST002, Sequência n°6) no nosso estudo anterior (Watson e Fleming, supra) (FIG 2). Na FIG 2 mostram-se o cDNA completo da mamaglobina e o polipéptido codificado. No interior do cDNA de 503 pb encontra-se uma grelha de leitura aberta de 279 pb que codifica um polipéptido de 93 aminoácidos e com uma massa molecular prevista de 10,5 kD (FIG 2). Os primeiros 19 resíduos desta estrutura de leitura aberta também prevêem uma sequência de sinal de péptido hidrofóbico. A metionina inicial da estrutura de leitura aberta contém uma sequência de consenso Kozak quase perfeita (Kozak, Cell 22:7-8, 1980 aqui incorporado por referência). Os 60 pb que se encontram a montante desta sequência não contêm -9- outras metioninas na estrutura ou sinais de terminação da tradução. A sequência 3' não traduzida do cDNA é formada por 163 pb e contém um sinal de poliadenilação, AATAAA, 12 pb a montante do local de iniciação da sequência DEST002 original. Estes dados indicam que o cDNA completo da mamaglobina tem sido isolado.

Uma pesquisa de sequências de DNA similares à sequência de cDNA de mamaglobina no Genbank usando o algoritmo BLAST (Benson et al., Nucl Acid Res 21:2963-2965, 1993; Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410, 1990), não identificou sequências de DNA com homologias óbvias. Assim, crê-se que o cDNA da mamaglobina é uma nova, até agora desconhecida, sequência de DNA.

Uma pesquisa para outras polipéptidos de sequências relacionadas com a mamaglobina revelou uma homologia na sequência de aminoácidos entre a mamaglobina e outros polipéptidos. A mamaglobina exibe uma identidade de 42% ao nível dos aminoácidos (58% incluindo substituições conservativas) com a subunidade 3 da proteína de ligação esteróide prostática de ratazana (prostateína) (rPSC3) (FIG 3) (Sequência n°7). A proteína de ligação esteróide prostática de ratazana é uma proteína secretora principal na próstata ventral da ratazana que consiste numa proteína tetramérica composta por duas subunidades diméricas diferentes; C3/C1 e C3/C2 (Parker et al., Ann N Y Acad Sei 438:115-124; Parker et al., J Steroid Biochem 20:67-71, 1984). Os genes Cl, C2, e C3 codificam proteínas secretoras de aproximadamente 6 kD e pensa-se que resultaram de duplicação de genes, mas enquanto que os genes Cl e C2 mostram forte homologia entre eles, eles são muito menos similares ao gene C3. Em conformidade, a mamaglobina não apresenta homologia de sequência com as proteínas Cl ou C2.

Tal como foi notado em cima, a proteína de ligação esteróide prostática (prostateína) é a principal proteína secretora na próstata ventral da ratazana e a sua expressão é regulada por esteróides androgénicos (Parker et al., Ann N Y Acad Sei 438:115-24, 1984; Parker et al., J Steroid Biochem 20:67-71, 1984). Outra proteína, a proteína de ligação estramustina humana (hEMBP) tem sido divulgada como sendo expressa na próstata humana, no cancro da mama humano e no melanoma maligno humano. (Bjork et al., Câncer Res 42:1935-1942, 1982; Bjork et al., Anticancer Res 11:1173-82, 1991). A proteína de ligação estramustina humana é imunoquimicamente similar à proteína de ligação estrasmustina de ratazana, que tem sido postulada como sendo idêntica à proteína de ligação esteróide de ratazana, a prostateína. Com foi notado em cima, a sequência de aminoácidos da mamaglobina exibe uma identidade de 42% ao nível dos aminoácidos e uma homologia de 58% incluindo as substituições conservativas com a subunidae C3 da prostateína. Assim é possível que a mamaglobina possa ser de alguma forma relacionada com a hEMBP. No entanto, enquanto que tanto a prostateína como a hEMBP são detectadas na próstata, o mRNA da mamaglobina está completamente ausente deste tecido. Por este motivo, a mamaglobina não é nem a mesma proteína nem uma subunidae da hEMBP e, além disso, a sequência da hEMBP não foi determinada logo não se sabe ainda se existe até mesmo qualquer similaridade da mamaglobina com algum fragmento ou subunidade da hEMBP.

Embora divulgações recentes demonstraram que o promotor rPSC3 fundido com o antigene SV40 T produz ambos os carcinomas prostático e mamário em ratos transgénicos (Maroulakou et al., Proc Nat Acad Sei U.S. 91:11236-11240, 1994; Sandmoller et al., Oncogene 9:2805-2815, 1994), a verdadeira função biológica desta proteína é desconhecida. Além disso, não obstante a hipotética relação da proteína de ligação esteróide de ratazana com a EMBP humana, não foi identificado qualquer polipéptido humano ou gene - 11 - humano correspondente à rPSC3. Assim, a mamaglobina e o cDNA que codifica a mamaglobina representam novas sequências até aqui desconhecidas.

Usando alinhamento manual com outras sequências que tinham menos marcas BLAST significantes com ambas as sequências de proteína da mamaglobina e da rPSC3, identificámos outras homologias com a proteína de 10 kD da célula clara humana (hCCIO) (Sequência n°8) (Peri et al., J Clin Invest 92:2099-2109, 1993) (FIG 3) e, adicionalmente, com as proteínas uteroglobinas de coelho e de ratinho (Miele et al., Endocrine Rev 8:474-90, 1987; Cato e Beato, Anticancer Res 5:65-72, 1985; Miele et al., J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994). Estas homologias, dependendo das espécies, apresentaram uma identidade de 26% ou 40% incluindo substituições conservativas. Em particular, uma série de aminoácidos estavam perfeitamente conservados entre todas as proteínas, incluindo a Cis-3 e a Cis-69 que se sabe desempenharem um papel na formação de pontes de dissufureto entre as subunidades da uteroglobina (ver em baixo). Estas homologias sugerem que a mamaglobina é um novo membro da pequena família de proteínas que são segregadas pelas células epiteliais (Miele et al., 1994, supra). O gene hCCIO é o homólogo humano dos genes da uteroglobina de coelho e de ratinho (Peri et al.,J Clin Invest 92:2099-2109,1993). A uteroglobina foi originalmente caracterizada como uma proteína secretora no útero de coelho, mas tem desde então sido encontrada noutros órgãos epiteliais incluindo o pulmão, a mama e a próstata. Contrariamente à prostateína de ratazana, a uteroglobina é uma proteína homodimérica acoplada por duas pontes de dissulfureto nos resíduos conservados Cis-2 e Cis-69 (Miele et al., 1994, supra). Embora a transcrição do gene da uteroglobina seja regulada por hormonas esteróides, a capacidade da proteína se ligar à progesterona ou a outras hormonas esteróides seja controversa e, uma vez mais, a verdadeira função biológica desta proteína é desconhecida (Miele et al., 1994, supra). A expressão da mamaglobina é limitada à glândula mamária. Este facto está em contraste com a observação de que a rPSC3 é expressa na próstata ventral de ratazana (Parker et al., Ann N Y Acad Sei 438:115-1124, 1984), e a expressão da hCCIO/uteroglobina observada em vários tecidos incluindo o pulmão, o útero, a próstata, e a mama (Miele et al, 1987, supra; Cato e Beato, supra; Miele et al., 1994, supra). Devido à homologia de sequência entre a mamaglobina e estas proteínas, determinámos o modelo de expressão específica de tecido. A mensagem da mamaglobina de 500 pb foi facilmente detectada na espécime 2410 de tumor (o tecido a partir do qual esta sequência marca foi isolada) e numa muito menor extensão em tecido de mama humano normal (FIG 4A). A mensagem da mamaglobina não pôde ser detectada na linhagem B5-589 de células epiteliais mamárias imortalizadas. A expressão da mamaglobina não foi também detectada no útero e pulmão humano, dois locais de expressão da uteroglobina. A amplificação por RT/PCR detectou o mRNA de mamaglobina quer no tumor 2410 quer no tecido mamário normal, mas não noutros 15 tecidos observados, incluindo tecidos que normalmente expressam a rPSC3 e a uteroglobina (pulmão, útero, próstata), tecidos sensíveis a hormonas e esteroidogénicos (ovário, testículo, placenta), e outros órgãos epiteliais secretores (cólon) (FIG 4B). Logo, a expressão do mRNA da mamaglobina é relativamente específico para o tecido mamário.

Com base nos estudos desta divulgação, a mamaglobina é uma proteína relativamente específica da glândula mamária. São conhecidos outros dois genes que são superexpressos no carcinoma da mama, o erb-B e o ciclina D (Jardines et al., Pathobiology 61:268-282, 1994; Keyomars e Pardee, Proc Nat Acad Sei U.S. 90:1112-1116, 1993). Contrariamente à superexpressão do erb-B ou do ciclina D, a superexpressão da mamaglobina pode reflectir uma alteração mais específica da célula epitelial mamária em vez de um aumento geral do potencial crescimento ou da razão mitótica. Assim, o aparecimento da desregulação do gene da mamaglobina pode ter uma maior importância específica para a vulnerabilidade terapêutica ou para o curso clínico de um tumor. A expressão da mamaglobina não pode ser detectada em gânglios linfáticos ou em linfócitos periféricos normais ao nível da sensibilidade permitido por um único passo de análise de RT/PCR Isto sugere que a análise dos transcritos da mamglobina em gânglios linfáticos periferias pode ser útil para detectar metastases do cancro da mama ocultos, tal como tem sido sugerido para outros genes epiteliais específicos (Schoenfeld et al., Câncer Res 54:2986-90).

Para demonstrar que o cDNA da mamaglobina codifica uma proteína traduzível, o clone de cDNA foi usado num ensaio de tradução in vitro. A Figura 5 mostra o produto de proteína de um lisado reticulócito de coelho programado com o cDNA da mamaglobina. Usando o cDNA da mamaglobina é gerada uma proteína de aproximadamente 6 kD. O peso molecular aparente é menor que o previsto pela tradução conceptual da estrutura de leitura aberta, mas tal facto é também geralmente observado noutros produtos da tradução da uteroglobina de coelhos e de humanos.

Embora tivéssemos detectado a superexpressão do RNA da mamaglobina numa espécime de tumor (i.e. 2410), não é claro a que frequência é observada esta superexpressão noutros carcinomas mamários. Assim examinámos um painel de quinze carcinomas mamários primários na fase I de diferentes tipos histológicos por hibridação Northern blot com a sonda de cDNA da - 14- mamaglobina. Devido à potencial variabilidade na expressão como consequência de influências ambientais (e.g. estado hormonal do paciente), também tentámos comparar espécimes de tumor directamente com amostras de tecidos mamários normais de pacientes, embora tal não tenha sido possível em muitos casos. Tal como é mostrado na FIG 6, o mRNA da mamaglobina de 500 pb foi mais uma vez detectado em tecido mamário normal e no tumor 2410. A mamaglobina foi também detectada em outros três tumores, dois dos quais mostraram pouca ou nenhuma expressão em tecido de paciente normal. Em todos, 4 de 15 (27%) dos tumores examinados superexpressaram o mRNA da mamaglobina. Estes dados sugerem que a superexpressão da mamaglobina não é limitada a uma única espécime de tumor e é, de facto, relativamente frequente entre os tumores mamários primários. Além disso, o facto de que todos os tumores examinados encontravam-se na fase I sugere que esta desregulação ocorre relativamente cedo na progressão da neoplasia da mama.

Porque os Requerentes acreditam que a mamaglobina é provavelmente uma proteína segregada, será esperado que a sua presença seja detectável no soro de pacientes cujo tumor superexpresse este produto de gene. Assim , é provável que a mamaglobina seja clinicamente tão útil como o antigene específico da próstata (PSA) e outras marcas de tumor sólidas para gerir pacientes com cancro da mama (Tumor markers in diagnostic pathology, Clin Lab Med 10:1-250, 1990).

Determinámos a prevalência da mamaglobina como uma marca de tumor na população geral de tumores do cancro da mama analisando a expressão da mamaglobina em vários carcinomas mamários primários. Embora o número de espécimes examinadas neste estudo tenha sido pequena, 27% dos tumores avaliados superexpressaram o mRNA da mamaglobina. Esta percentagem é comparável à prevalência de outras alterações genéticas tais como a amplificação - 15- do erb-B e a mutação do p53 (Slamon et al., Sei 244:707-712, 1989; Thor et al. J Nat'l Câncer Inst 84:845-855, 1992). Além disso, e devido a termos restringido as nossas análises a tumores na fase I, a superexpressão da mamaglobina seria de facto mais prevalecente do que qualquer outra alteração genética divulgada neste subgrupo de tumores (Alllerd et al., JNat'1 Câncer Inst 85:200-206, 1993). A identificação da mamaglobina como uma marca do cancro da mama fornece a base para outro aspecto da presente invenção, que envolve métodos para detectar a presença de cancro da mama em pacientes. O termo "detecção" tal como aqui é usado no que diz respeito à detecção de doenças neoplásticas mamárias tem a intenção de ser um aspecto abrangente da determinação da presença do cancro da mama num paciente, da distinção do cancro da mama de outras doenças, da estimativa da prognose em termos das prováveis consequências da doença e expectativas de recuperação, da monitorização do estado da doença ou reaparecimento da doença, da determinação de um regime terapêutico preferido para o paciente e do objecto da terapia antitumor. O método para detectar o cancro da mama compreende a hibridação de um polinucleotídeo a um mRNA de células mamárias neoplásicas. O polinucleotídeo compreende o complementar da Sequência n°l ou um derivado da Sequência n°l. Derivado de uma sequência de nucleotídeo significa que a sequência nucleotídea derivada é substancialmente a mesma que a sequência da qual é derivada de tal forma que a sequência nucleotídea derivada tem suficiente sequência complementar à sequência da qual á derivada para hibridar com mRNA de células mamárias neoplásicas sob as mesmas condições restringentes que a sequência da qual é derivada hibrida com o mRNA de células mamárias neoplásicas. - 16- A sequência de nucleotídeos derivada não é necessariamente fisicamente derivada da sequência de nucleotídeos , mas pode ser gerada de vários modos incluindo, por exemplo, a síntese química, a replicação de DNA, a transcrição, ou a transcrição inversa.

Para detectar a presença do mRNA que codifica a mamaglobina num sistema de detecção para o cancro da mama, é obtida uma amostra de um paciente. A amostra pode ser uma amostra biópsia de tecido ou uma amostra de sangue, plasma, soro ou semelhante. A amostra pode ser tratada para extrair os ácidos nucleicos que lá se encontrem. Os. ácidos nucleicos resultantes da amostra são submetidos a electroforese em gel ou outras técnicas de separação por tamanho. A detecção envolve por em contacto os ácidos nucleicos, e em particular o mRNA, da amostra com uma sequência de DNA que serve como sonda para formar complexos híbridos. O termo "sonda" refere-se a uma estrutura que abrange um polinucleotídeo que forma uma estrutura híbrida com uma sequência marcada, devido à complementaridade da sequência da sonda com uma sequência na região marcada. A detecção do complexo resultante é normalmente realizada pelo uso de sondas marcadas. Altemativamente, a sonda pode não ser marcada, mas pode ser detectada por ligação específica a um ligante que é marcado, quer directa ou indirectamente. São conhecidas na técnica quer marcas quer métodos para marcar sondas e ligantes, e incluem, por exemplo, marcas radiactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., tradução de corte ou utilização de cinase), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, em particular dioxetanos activados), enzimas, anticorpos, e semelhantes.

Quando se usa o cDNA que codifica a mamaglobina ou um derivado do mesmo como sonda, podem ser usadas condições muito restringentes com vista a prevenir falsos positivos. Quando se usam sequências derivadas da mamaglobina, podem ser usadas condições menos restringentes. O vigor da hibridação é determinada por uma série de factores durante a hibridação e durante o processo de lavagem, incluindo a temperatura, a força iónica, intervalo de tempo e concentração de formamida. Estes factores estão descritos em, por exemplo, Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., 1989).

Com vista a aumentar a sensibilidade da detecção numa amostra do mRNA que codifica a mamaglobina, o método da transcrição inversa/reacção de cadeia de polimerase (RT/PCR) pode ser usado para amplificar o cDNA transcrito do mRNA que codifica a mamaglobina. O método da RT/PCR é bem conhecido na técnica (por exemplo, ver Watson e Fleming, supra). O método da RT/PCR pode ser levado a cabo como a seguir se indica. Todo o RNA celular é isolado, por exemplo, pelo método padrão do isotiocianato de guanídio e todo o RNA é sujeito a transcrição inversa. O método da transcrição inversa envolve a síntese de DNA num molde de RNA usando uma enzima transcriptase inversa e um iniciador 3'. Tipicamente, o iniciador contém uma sequência oligo(dT). O cDNA assim produzido é então amplificado usando o método PCR e iniciadores específicos da mamglobina. (Belyavsky et al., Nucl Acid Res 17:2919-2932,1989; Krug e Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, pp. 316-325, 1987). O método da reacção de cadeia de polimerase é realizado usando dois oligonucleótidos iniciadores que são complementares às duas regiões

flanqueadoras do segmento de DNA a ser amplificado. Os iniciadores a montante e a jusante têm tipicamente um comprimento de 20 a 30 pares de bases e hibridam com as regiões flanqueadoras para replicação da sequência de nucleotídeos. A polimerização é catalisada por uma DNA-polimerase na presença de desoxinucleotídeos trifosfatos ou análogos de nucleotídeos para produzir moléculas de DNA em dupla cadeia. As cadeias duplas são então separadas por um método de desnaturação que pode ser físico, químico ou enzimático. Geralmente, o método de desnaturação física é usado por aquecimento do ácido nucleico, normalmente a temperaturas desde cerca de 80°C a 105°C durante tempos que variam de cerca de 1 a 10 minutos. O processo é repetido o número de ciclos desejado.

Os iniciadores são seleccionados para serem substancialmente complementares à cadeia de DNA a ser amplificada. Assim, os iniciadores não necessitam de reflectir a sequência exacta do molde, mas devem ser suficientemente complementares para hibridarem de forma selectiva com a cadeia a ser amplificada. A seguir à amplificação, o produto da PCR é então detectado por coloração com brometo de etídio (Sambrook et al., 1989, supra).

Noutra concretização da presente invenção, a sequência de cDNA da mamaglobina ou uma sua derivada pode ser usada para caracterizar qualquer alteração do gene da mamaglobina (i.e. rearranjo de gene, amplificação de gene, ou eliminação de gene) de uma espécime de paciente com cancro da mama. Isto fornece um método de acordo com o qual as espécimes ou amostras de paciente, que não contêm mRNA intacto, podem ainda ser examinadas no que diz respeito a mudanças na estrutura do gene.

Numa aplicação desta técnica, a sequência de cDNA da mamaglobina ou uma sua derivada é conduzida a hibridar com o DNA genómico do paciente que foi isolado do tumor de um paciente, tecido normal, ou limfócitos e digerida com uma ou mais endonucleases de restrição. Usando o protocolo de Southern blot, que é bem conhecidos na técnica, esta análise determina se um paciente ou tumor da mama de um paciente tem o gene da mamaglobina, que foi eliminado, sofreu rearranjo, ou foi amplificado. A detecção destas alterações pode então fornecer informação importante útil para prever a prognose e para a gerência do paciente.

Numa segunda aplicação desta técnica, um ou mais pares de oligonucleótidos iniciadores, e com base na sequência de cDNA da mamaglobina ou duma sua derivada, podem ser usados na reacção de cadeia de polimerase para amplificar segmentos do gene da mamaglobina de uma amostra de paciente. As análises dos produtos de PCR resultantes indicam se um segmento particular do gene da mamaglobina foi eliminado ou sofreu rearranjo. Tal informação é útil para a prognose e para a gerência do paciente. A presente invenção fornece adicionalmente métodos para detectar a presença do polipeptídeo, mamaglobina, numa amostra obtida dum paciente. Qualquer método conhecido na técnica para detectar proteínas pode ser usado. Tais métodos incluem, mas não estão limitados à imunodifusão, imunoelectroforese, métodos imunoquímicos, análises de ligação a ligantes, técnicas imuno-histoquímicas, análises de aglutinação e complementação. (por exemplo ver Basic and Clinicai Immunology, Sites e Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991). Os preferidos são os métodos de imunoanálise de ligação a ligantes incluindo a reacção de anticorpos com um epítopo ou epítopos da mamaglobina e substituição competitiva duma proteína mamaglobina marcada ou duma sua derivada. -20-

Tal como aqui é usado, um derivado da mamaglobina refere-se a um polipeptídeo contendo aminoácidos ou aminoácidos modificados em que o polipeptídeo derivado é sbmetido a reacção cruzada com um anticorpo anti-mamaglobina. Por reacção cruzada entende-se que um anticorpo reage com um antigene que não o que induz a sua formação. São conhecidas na técnica numerosas imunoanálises de ligação a proteína competitivas e não competitivas. Os anticorpos usados em tais análises podem não ser marcados, por exemplo tal como é usado em testes de aglutinação, ou marcados para uso numa larga variedade de métodos de análise. As marcas que podem ser usadas incluem radionúcleos, enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, substractos ou co-factores de enzimas, inibidores de enzimas, partículas, corantes e semelhantes para uso em radioimunoanálises (RIA), imunoanálises de enzima, e.g., análise imunossorvente de ligação a enzima (ELISA), imunoanálises fluorescentes.

Os anticorpos policlonais ou monoclonais para a mamaglobina ou para um seu epítopo podem ser feitos para uso em imunoanálises por qualquer de uma série de métodos conhecidos na técnica. A referência a epítopo diz respeito a um determinante antigénico de um polipeptídeo. Um epítopo pode compreender 3 aminoácidos numa conformação espacial que é única para o epítopo. Duma forma geral um epítopo consiste de pelo menos 5 de tais aminoácidos. Os métodos para determinar a conformação espacial de aminoácidos são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, a cristalografia de raio-x e ressonância magnética nuclear bidimensional.

Uma aproximação para preparar anticorpos para uma proteína é a selecção e preparação de uma sequência de aminoácidos de toda ou de uma parte da proteína, sintetizar quimicamente a sequência e injectá-la num animal apropriado, geralmente um coelho ou ratinho.

Os métodos para preparar a mamaglobina ou um seu epítopo incluem, mas não estão limitados a sínteses químicas, técnicas de DNA recombinante ou isolamento a partir de amostras biológicas. A síntese química de um peptídeo pode ser levada a cabo, por exemplo, pelo método clássico de Merrifeld de síntese de peptídeo em fase sólida (Merrifeld, J Am Chem Soc 85:2149, 1963) ou a estratégia FMOC num sistema de Síntese Múltipla de Péptidos Rápida Automática (DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino e Han, J Org Chem 37:3404,1972).

Os anticorpos policlonais podem ser preparados imunizando coelhos injectando antigene nos gânglios linfáticos popliteais seguido do subsequente reforço a intervalos de duas semanas com injecção intraperitoneal do antigene. Os animais são analisados ao sangue e ao soro contra a mamaglobina purificada geralmente pelo método de ELISA.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados após o método de Milstein e Kohler fundindo os esplenócitos de ratinhos imunizados com células de tumor que replicam continuamente tais como as células mieloma ou limfoma. (Milstein e Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre e Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone e Banatis eds., Academic Press, 1981). As células hibridoma assim formadas são então clonadas por métodos de diluição limitados e os sobrenadantes analisados para a produção de anticorpos por ELISA ou RIA. A capacidade única dos anticorpos para reconhecer e especificamente ligarem-se a antigenes alvo expressos por uma célula de tumor fornece uma aproximação para o tratamento do cancro. (Para estudo ver LoBuglio e Saleh, Am JMed Sei 304:214-224, 1992; Bagshawe, Adv Pharmacol 24:99-121, 1993). Assim, outro aspecto da presente invenção fornece para um método de impedir o início e para o tratamento do cancro da mama num animal, baseado no uso de anticorpos para a mamaglobina, que tem sido verificada como sendo superexpressa em células do cancro da mama. Os anticorpos específicos para a mamaglobina, quer policlonais quer monoclonais, são produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a murina ou anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por tecnologia de hibridoma. Altemativamente, a mamaglobina, ou um fragmento da mesma imunologicamente activo, ou um anticorpo anti-idiotípico, ou fragmento do mesmo pode ser administrado a um animal para extrair a produção de anticorpos capazes de reconhecer as células que expressam a mamaglobina.

Os anticorpos assim produzidos ou os seus fragmentos são marcados com um ou mais substâncias oncolítias tais como radionúcleos, toxinas, ou drogas citotóxicas e administrados a um paciente que se suspeite ter cancro da mama. A ligação do anticorpo específico à mamaglobina que está a ser superexpressa pelo célula do cancro da mama irá causar a morte da célula do cancro.

Qualquer uma das substâncias oncolíticas conhecidas na técnica pode ser usada para produzir tais anticorpos marcados. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser feitas acoplando toxinas de plantas e bacterianas a anticorpos. Tais toxinas incluem, por exemplo, a ricina, a toxina difteria e a exotoxina A de Pseudomonas. Podem também ser feitas drogas de conjugados de anticorpos nas quais agentes quimioterapêuticos são ligados ao anticorpo. Os agentes quimioterapêuticos apropriados para tais usos incluem, por exemplo, a tomoxifeína, a doxorrubicina, o metotrexato, o clorambucilo, alcaloides Vinca, e a mitomicina. Adicionalmente, podem ser feitos radioimuno-conjugados nos quais um radionúcleo está ligado de forma estável ao anticorpo. Os radionúcleos apropriados para formar radioimuno-conjugados incluem, por exemplo, emissores-β tais como 131I, 188Re, 186Re, 67Cu, 90Y e 47Sc; emissores-α tais como 711 717 717 1 'ye nn

At, Bi e Pb; emissores de electrões auger tais como I e Br; e núcleos fissionáveis tal como o 10B.

As concretizações preferidas da invenção estão descritas nos exemplos que se seguem. Outras concretizações estão abrangidas pelo alcance das reivindicações onde será evidente para os peritos na técnica a partir de considerações da especificação ou prática da invenção tal como é aqui divulgado. Tem-se a intenção de que a especificação, juntamente com os exemplos, seja considerada somente como exemplar, com o alcance e espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações que se seguem aos exemplos.

Nos exemplos que se seguem, as linhagens de células foram obtidas da American Type Culture Collection e crescidas em meio essencial mínimo da Dulbecco suplementado com 10% de soro de vitelo fetal. As espécimes biópsias foram obtidas da Human Cooperative Tissue NetWork (LiVolsi et al., Câncer 71:1391-1394, 1993, que é incorporado por referência).

Exemplo 1

Este exemplo ilustra o isolamento do cDNA da mamaglobina.

Todo o RNA celular da linhagem de células MDA-MB415 foi isolado usando o método padrão do isitiocianato de guanidínio. (Belyavsky et al., supra). Este RNA foi usado no processo RACE PCR usando o kit ("estojo") Amplifinder (Clonetech) e seguindo os protocolos do fabricante. A síntese da primeira cadeia de cDNA foi levada a cabo numa reacção padrão contendo 1 pg de RNA, iniciador D2R específico da mamaglobina 10 μΜ (5'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3 )(Sequência n°4), 4μ1 de 5X tampão RT (Tris HC1 250 mM pH 8,3, KC1 375 mM, MgCl2 15 mM), 2 pl de DDT 100 mM, 1 μΐ de dNTPs 10 mM e 200 unidades da transcriptase inversa Superscript^® II (Gibco/BRL) num volume reaccional de 20 μΐ. A reacção procedeu durante 1 hora a 45°C e foi terminada por incubação a 95°C durante 5 minutos. O RNA foi hidrolisado com NaOH 400 μΜ a 65°C durante 30 minutos e neutralizada com ácido acético 400 μΜ. A reacção foi então adicionada a 3 volumes de Nal 6M e 10 μΐ de pérolas de vidro tratadas. As gotas foram lavadas três vezes com EtOH a 80% e o ácido nucleico foi eluído das gotas em 45 μΐ de água. O ácido nucleico foi então precipitado e ressuspendido em 10 μΐ de água. A primeira cadeia de DNA purificada foi ligada ao oligonucleótido âncora fornecido pelo fabricante (Sequência n°9, 5'-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG-3'), usando a RNA ligase T4 a 27°C durante 20 horas. Um décimo de uma reacção de ligação foi usada para amplificação por PCR em 50 μΐ de uma reacção contendo 1 μΜ do iniciador âncora do fabricante (Sequência n°10, 5'-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-3'), 1 μΜ do iniciador d2Rb específico da mamagoblina (Sequência n°ll, 5'-AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C-3'), DntpS 200 pm, 5 unidades da DNA polimerase VentMR, e IX tampão polimerase (KC1 10 mM, TrisCl 20 mM, (NH4)2S04 10 mM, MgS04 2 mM, Triton X-100 a 0,1%). A reacção foi incubada a 94°C durante 2 minutos e depois 94°C durante 45 segundos, 50°C durante 1 minuto, e 72°C durante 90 segundos para um total de 40 vezes.

Os dois oligonucleótidos a juzante específicos da mamaglobina foram o D2R (Sequência n°4) e o D2Rb (Sequência n°l 1). Foi também usado um -25- || oligonucleótido de controlo contra a corrente específico da mamaglobina, tal como recomendado pelo fabricante, o D2F (5'-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3') (Sequência n°12). Todas as amplificações por PCR foram levadas a cabo com a DNA polimerase Vent (New England Biolabs). O produto amplificado por RACE foi digerido com EcoRI e ligado nos locais EcoRI e Smal do plasmídeo vector pGEM7Z (Promega).

Toda a sequenciação foi levada a cabo usando o kit ("estojo") de sequenciação cíclico térmico da DNA polimerase Taq conforme o protocolo do fabricante (Promega). Resumidamente o procedimento usado foi como se segue. 10 pmol de oligonucleótido específico de sequenciação foram marcados na extremidade com 10 pmol de Ρ-γΑΤΡ (3.000 Ci/mmol e 10 mCi/ml) usando a cinase polinucleotídea T4 em 10 μΐ da reacção durante 30 minutos a 37°C. Uma reacção de polimerização contendo 100 ng de plasmídeo padrão molde, 1,5 pmol de iniciador de sequenciação marcado, e 5 unidades de polimerase Taq de sequenciação foram criadas em 17 μΐ do tampão de sequenciação fornecido pelo fabricante. Esta reacção foi dividida num conjunto de quatro tubos de reacção contendo uma mistura de desoxinucleotídeos fornecida pelo fabricante e quer desoxi-A, C, G, ou T. O conjunto dos quatro tubos foi incubado a 95°C durante 2 minutos e em seguida, a 94°C durante 45 segundos, 45°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto para 30 ciclos. Após se ter completado a reacção, foi adicionado a cada tubo 3 μΐ de formamida/azul de bromofenol seco. As amostras foram aquecidas a 70°C durante 2 minutos e colocadas num gel de sequenciação de acrilamida a 6%/ureia 7,5 M e corridas durante 2-4 horas a uma potência constante de 60 W. O gel foi seco e em seguida exposto a um filme de raio-x XAR5 da Kodak durante 2 a 24 horas. -26- A sequência assim obtida foi um fragmento de 403 pb (Sequência n°5) tal como mostrado na FIG 2, barra sólida. Num trabalho anterior a sequência Tag DEST002 foi isolada (Watson e Fleming, supra). Esta sequência era um fragmento de 206 pb (Sequência n°6) tal como mostrado na FIG 2, barra aberta. A combinação das informação destas duas sequências permitiu deduzir todo o cDNA de 503 pb da mamaglobina. (FIG 2).

Exemplo 2

Este exemplo demonstra que a expressão da mamaglobina é restrita a células de tumor da glândula mamária e numa menor extensão a células normais da glândula mamária.

Todo o RNA celular das amostras foi isolado usando o método padrão do isitiocianato de guanidínio e tratado com RNase isento de DNase (Promega). Para as análises de RT/PCR, 1 pg do RNA total indicado foi sujeito a transcrição inversa com oligo dT2i (Sequência n°13) e transcriptase inversa Superscript II (Gibco/BRL) de acordo com o protocolo do fabricante.

Duzentos ng de oligo dT2i (Sequência n°13) e 1 pg de RNA total foram incubadas a 65°C durante 5 minutos num volume de 10 pl. A amostra foi arrefecida em gelo e foram-lhe adicionados 4 pl de 5X tampão RT (TrisCl 250 mM pH 8,3, KC1 375 mM, MgCl2 15 mM), 2 pl de DDT 100 mM, 1 pl de dNTPs 10 mM e 200 unidades de transcriptase inversa SuperscriptMR (Gibco/BRL). A reacção prosseguiu durante 1 hora a 45°C e foi terminada por incubação a 95°C durante 5 minutos.

Um décimo de cada reacção de RT foi sujeita a análises de PCR usando os iniciadores D2R específicos da mamaglobina (5'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT Gg-3') (Sequência n°4) e d2102 (5'- CAG CGG CTT CCT TGA TCC TTG-3') (Sequência n°3) e condições de reacção padrão durante 40 ciclos a 94°C x 30 seg./55°C x 1 min./72°Ç x 1 min.

Para as análises Northern, foram analisadas 20 pg de RNA total como previamente descrito (Watson e Fleming, supra) usando a sonda para o cDNA completo da mamaglobina. A integridade e o carregamento igual de cada amostra de RNA foi estabelecida por coloração com brometo de. etídio.

Tal como mostrado na FIG 4A, a mensagem da mamaglobina de 500 pb é facilmente detectada na espécime de tumor 2410 (o tecido a partir do qual este DEST original foi isolado) e numa muito menor extensão em tecido mamário humano normal mas não na linhagem B5-589 de células epiteliais mamárias imortalizada, ou em pulmão, placenta, útero e ovários humanos (FIG 4A). Seguindo a amplificação usando as análises RT/PCR, a expressão da mamaglobina continuou a não ser detectada em 15 tecidos analisados(FIG 4B). A detecção da mensagem (FIG 4B) do gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e da mensagem (dados não mostrados) do receptor EGF nestas reacções demonstram que a ausência de expressão não foi devido a RNA degradado ou outras explicações triviais. Assim a expressão do mRNA da mamaglobina é relativamente específica para o tecido mamário.

Exemplo 3

Este exemplo demonstra que o cDNA da mamaglobina codifica uma sequência de nucleotídeos traduzível que resulta numa proteína produto de massa molecular prevista apropriada. As traduções in vitro foram levadas a cabo usando kit ("estojo") de tradução reticulócito de coelho TNTMR com a RNA -28- polimerase T7 (Promega) e 35S-Metionina (> 1000 Ci/mol; 10 mCi/ml, Amesham) de acordo com o protocolo do fabricante. A 25 μΐ de lisado de reticulócito de coelho TNT1''® foram adicionados 2 μΐ de tampão de reacção do fabricante preparado, RNA polimerase T7, 20 μΜ de uma mistura de aminoácidos sem metionina, 40 pCi S-metionina (1.000 Ci/mmol e 10 mCi/ml), 40 unidades de inibidor de ribonuclease, 1 μg de mamaglobina/plasmídeo pGEM7, e suficiente água tratada com DEPC para criar um volume de reacção final de 50 μΐ. Esta reacção foi incubada a 30°C durante 60 minutos. 5 μΐ desta reacção foram removidos para 20 μΐ de tampão gel SDS, fervidos durante 2 minutos, e carregados num gel de poliacrilamida-SDS a 17,5%. O lisado de reticulócito de coelho programado com cDNA da mamaglobina produziu uma proteína de 60 kD enquanto que o que foi programado sem cDNA não produziu qualquer proteína produto.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra a prevalência da superexpressão da mamaglobina num carcinoma da mama primário.

Para determinar a frequência da superexpressão da mamaglobina em carcinomas de mama, examinámos um painel de quinze, carcinomas da mama primários na fase I de diferentes tipos histológicos usando hibridação Northern blot com a sonda de cDNA da mamaglobina. As amostras de tecidos mamários normais de pacientes foram também comparadas em tecidos de dois pacientes (FIG 6). O mRNA da mamaglobina de 500 pb foi detectado em tecido mamário normal e no tumor 2410 e em três outros tumores, dois dos quais quando testados -29- demonstraram pouca ou nenhuma expressão em tecido de paciente norma (B05 v. BOI6; B022 v. B023) (FIG 6). Em todos, 4 de 15 (27%) dos tumores examinados superexpressaram o mRNA da mamaglobina. Estes dados indicam que a superexpressão da mamaglobina não é restrita a uma única espécime de tumor e é, de facto, relativamente frequente entre tumores da mama primários. Além disso, o facto de que todos os tumores examinados encontravam-se na fase I sugere que esta desregulação ocorre relativamente cedo na progressão da neoplasia mamária.

Exemplo 5 O exemplo seguinte ilustra a detecção da proteína mamaglobina usando um anticorpo policlonal. O anticorpo policlonal foi preparado acoplando um peptídeo correspondente aos 16 aminoácidos previstos para o terminal-C do cDNA da mamaglobina (Glu-Val-Met-Gln-Leu-Ile-Tir-Asp-Ser-Leu-Cis-Asp-Leu-Fen, Sequência n°14) para o Keyhole Lymphet Hemocyanin e injectando-o a coelhos com o adjuvante Freund. Os coelhos inoculados foram injectados a intervalos de três semanas e na semana 12, foi retirado sangue aos coelhos e o soro foi analisado para a sua capacidade para detectar a mamaglobina. O meio condicionado isento de soro foi recolhido das linhagens de células MDA-MB-415 e MCF-7 de tumor de mama(colecções de 24 horas). A MDA-MB-415 foi anteriormente identificada como uma linhagem de células que superexpressa a mensagem da mamaglobina e a MCF-7 foi identificada como uma linhagem de células que não produz mamaglobina detectável. O meio condicionado foi resolvido num gel de acrilamida SDS a 12% sob condições redutoras, manchado num filtro Nytran, e analisado por protocolos de mancha Western padrão usando o anticorpo descrito para o peptídeo do terminal-C como o anticorpo primário neste ensaio. Após o anticorpo primário se ter ligado, a mancha foi lavada e foi adicionado anticorpo secundário (anti-coelho de cabra)). Os complexos de anticorpo da mamaglobina foram visualizados por quimioluminescência de ligação a enzima (ECL Western Blotting Detecting Reagent, Amersham, Arlington Heights, IL). O meio condicionado para a linhagem de células MDA-MB-415 mostrou uma banda de mamaglobina de peso molecular aparente de 20 kd e esta banda não foi detectada no meio condicionado da linhagem de células MCF-7. Assim, as células MDA-MB-415 segregam a proteína mamaglobina mas as células MCF-7 não.

Para adicionalmente ilustrar a especificidade desta proteína, o meio condicionado e o lisado de células da linhagem de células MDA-MB-415 foram analisadas por ensaios Western blot, com o anticorpo para o peptídeo do terminal-C, na presença e ausência do peptídeo competitivo usado para gerar o anticorpo. A visualização dos complexos do anticorpo da mamaglobina foram com acima discutido. Como se pode ver na Figura 7, na ausência do peptídeo competi ti vo(-), o meio condicionado (S) tem a banda de 20 kd representativa da proteína mamaglobina. O lisado de células (c) mostrou várias bandas a 14 kd, 20 kd, e peso molecular superior. A banda de 14 kd provavelmente representa a mamaglobina na forma não processada. O cDNA para a mamaglobina tem um local de consenso de glicosilação-N e a forma segregada de 20 kd observada representa provavelmente alguma forma processada da proteína. Quando o Western blot é levado a cabo na presença do peptídeo competitivo (+), a forma segregada e as formas intracelulares da mamaglobina não são visualizadas, indicando que estas proteínas contêm o peptídeo para o qual o anticorpo foi sintetizado.

Este anticorpo para o peptídeo do terminal-C também detectou bandas similares em lisados de células de espécimes de tumor de mama primários -31 - (Fig. 8). Adicionalmente, o anticorpo mostrou reactividade para células de tumor da mama por coloração imuno-histoquímica de secções fixas com parafina do cancro da mama obtidas de uma espécime de paciente (Fig. 9). A coloração imuno-histoquímica foi levada a cabo usando o anticorpo para o peptídeo da mamaglobina e o anticorpo anti-coelho de cabra marcado com peroxidase de rábão e 3,3'-diamino benzeno tetrahidrocloreto (DAB) como substracto. As células que expressam a mamaglobina mostraram uma coloração castanha. A partir destes resultados, acreditamos que a mamaglobina é uma proteína segregada, que a proteína mamaglobina é sintetizada como uma proteína precursora e modificações pós-tradução aumentam o seu peso molecular aparente necessário antes da segregação; e que a proteína mamaglobina pode ser detectada em espécimes de tumor da mama humano. A detecção da proteína mamaglobina é aplicável em diagnósticos de cancro usando a proteína mamaglobina como uma marca de tumor da mama, em verificar a reincidência do tumor da mama, em monitorizar transplantes de células autólogas da medula óssea/tronco para de contaminação de tumor, em vacinas de tumor da mama, e em marcar células de tumor da mama para intervenção terapêutica via complexos mediados por anticorpos.

Tendo em conta o anteriormente dito, será visto que as várias vantagens da invenção são realizáveis e outros resultados vantajosos alcançados.

Como podem ser feitas várias alterações nos métodos e composições precedentes sem sair da competência da invenção, é intenção que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nas figuras juntas deva ser interpretada como ilustrativa e não como limitativa.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: WATSON, MARK A. FLEMING, TIMOTHY P.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: SEQUÊNCIA DE DNA E PROTEÍNA CODIFICADA DO CANCRO DA MAMA ESPECÍFICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (iv) MORADA DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: ROGERS, HOWELL & HAFERKAMP (B) RUA: 7733 FORSYTH BOULEVARD, SUITE 1400

(C) CIDADE: ST. LOUIS

(D) ESTADO: MISSOURI

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 63105-1817 (v) FORMA DE LEITURA DE COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Realease #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO CORRENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO DO MANDATÉRIO/AGENTE: (A) NOME: HOLLAND, DONALD R. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35.197 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOSSIER: 964796 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (314) 727-5188 (B) FAX: (314) 727-6092 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: -33- (A) COMPRIMENTO: 503 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°l: GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60 ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120 GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATOCACAAGT GTCTAAGACT 180 GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA CACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT 240 GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300 ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360 GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATTGCTGCAA ACCACACCTT 420 CrcnTCl iA TGTCTTTTTA CTACAAACTA CAAGACAATT GTTGAAACCT GCTATACATG 480 TTTATTTTAA TAAATTGATG GCA 503 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°2: •s <*

Mct Lys Leu Leu Mel Vai Leu Mel Leu Ala Ala Leu Ser Gin His Cys 1 5 IO 15

Tyr Ala Gly Ser Glv Cys Pro Leu Leu Glu Asn Vai lie Ser LvsThr 20* 25 30 lie Asn Pro Gin Vai Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gin Glu 35 ' 40 ' 45

Phc Ilc Asp Asp Asn Ala Tlir Thr Asn Ala Ilc Asp Glu Leu Lys Glu 50 55 60

Cys Phc Leu Asn Gin Tlir Asp Glu Tlir. Leu Ser Asn Vai Glu Vai Phc 65 70 75 XO

Mel Gin Leu Uc Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phc 85 «0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: eDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°3: CAGCGGCTTC CTTGATCCTT G 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: eDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO -35-

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°4: ATAACAAAGA GAAGGTGTGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 403 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°5: GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60 ATGAAGTTGC TGATGCTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120 GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TCTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAACT GTCTAAGACT Ottl GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT 24» GAATTGAAGG AATCTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300 ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360 GCTCACAGAA CTGCACGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACCC ATT 403 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 206 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA -36-

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°6: TTTATGCAAT TAATATATGA CAGCACTCTT TCTCATTTAT TTTAACTTTC TGeAAGACCT TTGGCTCACA GAACTGCAGG GTATGGTGAG AAACCAACTA CGGATTGCTG CAAACCACAC CrrCTCTTTC ttatgtcttt TTACTACAAA ctacaacaca attgttgaaa cctgctatac atctttattt TAATAAATTG atcgca 60 120 1H0 206 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 95 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°7:

Tyr Ala Ser Gly Scr Gly Cys Scr 11c Leu Asp Glu Vai Ilc Arg GJy 20 25 30

Thr Ilc Asn Scr Thr Vai Thr Leu His Asp Tyr Met Lys Leu Vai Lys 35 40 45

Pro Tyr Vai Gin Asp His Phc Thr Glu Lys Ala Vai Lvs Gin Plic Lys 50 55 60

Gin Cys Phc Leu Asp Gin Thr Asp Lys Thr Leu Glu Asn Vai Gly Vai 65 7(1 75 80

Mel Mel Glu Ala Ilc Phc Asn Scr Glu Ser Cvs Gin Gin Pru Scr 85 90 ' 95 -37- (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 91 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°8:

Mel Lys Leu Ala Vai Thr Leu Tlir Leu Vai Tlir Leu Ala Leu Cys Cys 1 5 KJ 15

Ser Ser Ala Ser Ala Glu lie Cys Pr» Ser Phc Gin Arg Vai lie Glu 20 25 * 30

Thr Leu Leu Mel Asp Tlir Pr» Ser Ser Tvr Glu Ala Ala Mel Glu Leu 35 40 ' 45

Phe Ser Pro Asp Gin Asp Mel Arg Glu Ala Gly Ala Glu Leu Lys Lys 50 55 ‘ 60

Leu Vai Asp Tlir Leu Pro Gin Lys Pro Arg Glu Ser lie Ilc Lvs Leu 65 70 * 75 80

Met Glu Lys Ilc Ala Gin Ser Ser Leu Cys Asn 85 90 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°9:

CACGAATTCA CTATCCATTC TCGAACCTTC AGACG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°10:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°11

AATCCGTAGT TGGTTTCTCA CC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°12

CTTTCTGCAA GACCTTTGGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°13 -40- 1 1 I 1 ί 1 I 1 1 I ΤΤΤΤΤΠΊΊ I Τ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA N°14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUÊNCIA N°14:

Glu Vai Phc Mel Gin Leu Ilc Tyr Asp Scr Scr Leu Cys Asp Leu Phc 1 5 10 15

Lisboa, 22 de Maio de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial rua victor cordon; h

1200 LISBOA

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleotídeo isolado e purificado, que codifica a mamaglobina.
2. 2. Polinucleotídeo da reivindicação 1, em que o polinucleotídeo compreende a Sequência n°l.
3. 3. Polinucleotídeo da reivindicação 1, em que o polinucleotídeo codifica a sequência de aminoácidos da Sequência n°2.
4. 4. Um polipeptídeo isolado e purificado, compreendendo um epítopo da mamaglobina, em que o dito epítopo compreende pelo menos cinco aminoácidos contíguos da Sequência n°2.
5. 5. Polipeptídeo isolado e purificado da reivindicação 4, que compreende os aminoácidos 20-93 da Sequência n°2.
6. 6. Um método para detectar a presença do cancro da mama num paciente, que permite detectar e/ou quantificar, numa amostra proveniente do paciente, a presença de um mRNA que codifica um polipeptídeo da mamaglobina, em que o dito polipeptídeo da mamaglobina compreende os aminoácidos 20-93 da sequência de aminoácidos da Sequência n°2 ou um derivado de substituição conservativo deste fragmento, e uma elevada concentração do dito mRNA, superior à concentração observada num indivíduo de boa saúde, indica a presença de células mamárias cancerosas.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que o passo de detecção e/ou -2- quantificação compreende ainda os seguintes passos: a) fornecer um polinucleotídeo que hibride especificamente com a Sequência n°l; b) incubar o polinucleotídeo com a amostra sob condições nas quais o polinucleotídeo pode especificamente hibridar com mRNA proveniente de células neoplásicas mamárias; e c) detectar a existência de um complexo de hibridação formado pelo polinucleotídeo e o mRNA.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que o polinucleotídeo é o complementar da Sequência n°l.
9. 9. Método da reivindicação 7, em que o polinucleotídeo é um cDNA codificador de um polipeptídeo da mamaglobina, que consiste da sequência de aminoácidos da Sequência n°2.
10. 10. Um kit ("estojo") para detectar a presença de células mamárias neoplásicas numa amostra, que compreende um polinucleotídeo que hibrida especificamente com a Sequência n°l, embalada num recipiente.
11. 11. Um kit ("estojo") da reivindicação 10, em que o polinucléo-tídeo é o complementar da Sequência n°l.
12. 12. Um kit ("estojo") da reivindicação 10, em que o polinucleotídeo é um cDNA codificador de um polipeptídeo da mamaglobina, que consiste da sequência de aminoácidos da Sequência n°2.
13. 13. Método da reivindicação 6, em que o passo de detecção e/ou quantificação compreende ainda os seguintes passos: a) produção de um cDNA codificador de um polipeptídeo da mamaglobina a partir do mRNA usando o método da transcrição inversa; b) fornecer dois oligonucleótidos que hibridam -3- especificamente com a cDNA para definir uma região do cDNA a ser amplificada pelo método da reacção de cadeia de polimerase, em que os ditos oligonucleótidos hibridam especificamente com um cDNA que codifica a Sequência n°2; c) amplificar a região do cDNA pelo método da reacção de cadeia de polimerase usando os dois oligonucleótidos como iniciadores; e d) detectar a presença da região do cDNA amplificada.
14. 14. Método da reivindicação 13, em que um dos dois oligonucleótidos compreende a Sequência n°3 e o outro compreende a Sequência n°4.
15. 15. Um kit ("estojo") para detectar a presença de células mamárias neoplásicas numa amostra, que compreende dois oligonucleótidos, como iniciadores para o método da reacção de cadeia de polimerase, embalados num contentor, em que os ditos oligonucleótidos hibridam especificamente com um cDNA que codifica a Sequência n°2, para definir uma região a ser amplificada.
16. 16. Um kit ("estojo") da reivindicação 15, em que um dos dois oligonucleótidos compreende a Sequência n°3 e o outro compreende a Sequência n°4.
17. 17. Um método para detectar a presença do cancro da mama num paciente, que permite detectar e/ou quantificar, numa amostra proveniente do paciente, a presença de um polipeptídeo da mamaglobina, em que o dito polipeptídeo da mamaglobina compreende os aminoácidos 20-93 da sequência de aminoácidos da Sequência n°2 ou um derivado de substituição conservativo deste fragmento, e uma elevada concentração do dito polipeptídeo da mamaglobina, superior à concentração observada num indivíduo de boa saúde, indica a presença de células mamárias cancerosas. -4- <&**>**
18. 18. Método da reivindicação 17, em que o passo de detecção e/ou quantificação compreende ainda o facto de fazer reagir com o polipeptídeo da mamaglobina um anticorpo purificado e o facto de detectar a ligação do polipeptídeo da mamaglobina com o anticorpo, em que o anticorpo é específico para um epítopo da mamaglobina compreende pelo menos cinco aminoácidos da Sequência n°2 , e reage especificamente com um polipeptídeo da mamaglobina compreendendo os aminoácidos 20-93 da Sequência n°2.
19. 19. Método da reivindicação 18, em que o anticorpo purificado é um anticorpo policlonal e o epítopo da mamaglobina compreende a Sequência n°14.
20. 20. Método da reivindicação 18, em que o anticorpo purificado é um anticorpo monoclonal e o epítopo da mamaglobina compreende a Sequência n°14.
21. 21. Um kit ("estojo") para detectar a presença de células mamárias cancerosas numa amostra, compreendendo, embalado num recipiente, um anticorpo purificado, que é específico dum epítopo da mamaglobina compreendendo pelo menos cinco aminoácidos da Sequência n°2, e que reage especificamente com um polipeptídeo da mamaglobina compreendendo os aminoácidos 20-93 da Sequência n°2.
22. 22. Um kit ("estojo") da reivindicação 21, em que o anticorpo purificado é um anticorpo policlonal e o epítopo da mamaglobina compreende a Sequência n°14.
23. 23. Um kit ("estojo") conforme da reivindicação 22, em que o -5- anticorpo purificado é um anticorpo monoclonal e o epítopo da mamaglobina compreende a Sequência n°14.
24. 24. Polinucleotídeo complementar do polinucleotídeo isolado e purificado da reivindicação 1. Lisboa, 22 de Maio de 2000

    JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA