JP2007145855A - Dna配列及びエンコードされた乳房に特異的な乳癌たんぱく質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定ののアミノ酸配列を有するマンマグロビン エピトープからなる、単離されて精製されたたんぱく質。マンマグロビン又はマンマグロビンをエンコードするmRNAの存在を検出及び/又は定量することによる乳癌検出方法。
【選択図】図1
Description
Oncol Clin N Am 8巻:485頁)。
Biophys Acta 1198巻の113頁;1993年のCallahan他のJ Cel Biochem
Suppl 17巻の167頁)。乳房の腫瘍形成の進行はまた、成長因子及びそれらのレセプター(例として取り込まれる1988年のZajchowski他のCancer
Res 48巻の7041頁)、構造たんぱく質(例として取り込まれる1990年のTrask他のProc Natl Acad
Sci 87巻の2319頁)、セカンドメッセンジャーたんぱく質(例として取り込まれる1986年のOhuchi他のCancer Res
26巻の2511頁)及び転写因子(例として取り込まれる1992年のHarrisのAdv Cancer Res 59巻の69頁)をエンコードする既に同定された遺伝子の発現における質的及び量的変化をもたらすことが示されている。患者の生検試料中の乳房のカルチノーマの病原におけるこれらの遺伝子変化の正確なルールは良く理解されていないが、遺伝子の発現におけるこれらの変化は潜在的に乳癌の標識を開発するための基礎を形成しうる。
ID NO:2として同定される。
本発明の別の実施例においては、腫瘍細胞によって発現されたマンマグロビンの存在が、そのたんぱく質マグログロビンに対して特異的な抗体を使用して試料中で検出される。その特異的な抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。
ID NO:1として同定されるcDNAの同定と配列決定に基づいている。以下で記載するように、全長マンマグロビンcDNAは初めに逆転写され、PCRに技術を用いて増幅されて発現ベクター中にサブクローニングされた腫瘍細胞のmRNAから始まって、単離された。更に、cDNAによってエンコードされた、そのたんぱく質、マンマグロビンは同定され特徴が記載された。
ID NO:1)は、我々の前の研究(上記のWatson及びFleming)(図2)中の対応するDEST配列(SEQ ID NO:6であるDEST002)から既に得られている配列情報と一緒に、この技術により単離された403bpフラグメント(SEQ
ID NO:5)(図2)から得られた配列情報から演繹された。全長マンマグロビンcDNA及びエンコードされたポリペプチドは図2中に示される。503bp内でcDNAは、93アミノ酸のポリプチドをエンコードし、10.5kDの分子量を予測する279bpのオープンリーディングフレームである(図2)。このオープンリーディングフレームの最初の19残基は、また疎水性ペプチド信号配列を予測する。オープンリー
ディングフレームの初期のメチオニンはほぼ完全なKozakコンセンサス配列を含む(例として取り込まれるKozakのCell 22巻の7−8頁)。この配列の60bp(塩基対)より上流はフレーム中に他のメチオニン又は翻訳停止を含まない。3’のcDNAの非置換配列は163bpを構成し、ポリアデニレーション信号であるAATAAAをオリジナルDEST002配列の最初の部位の12bp上流に含む。これらのデータは全長マンマグロビンcDNAが単離されていることを示す。
かった。そのため、マンマグロビンcDNAは新規であり、これまでに未知のDNA配列であると解される。
ニット;C3/C1及びC3/C2から構成される4量体たんぱく質からなるラットの腹側前立腺中の主要な分泌たんぱく質である(例として取り込まれるParker他のAnn
N Y Acad Sci 438巻の115−124頁、Parker他のJ Steroid
Biochem 20巻の67−71頁)。C1,C2及びC3遺伝子は全ておよそ6kDの分泌たんぱく質をエン コードし、遺伝子の重複から生じたと考えられが、しかしC1及びC2遺伝子は強い相同性を互いに示し、それらはC3遺伝子とはそれ程類似しない。従って、マンマグロビンはC1若しくはC2たんぱく質と配列の相同性は示さない。
Steroid Biochem 20巻の67−71頁)。別のたんぱく質であるヒトのエストラムスチン−結合たんぱく質(hEMBP)はヒトの前立腺、ヒトの乳癌及びヒトの悪性黒色腫において発現されることが報告されている(例として取り込まれる1982年のBjork他のCancer
Res 42巻の1935−1942頁;1991年のBjork他のAnticancer Res 11巻の1173−1182頁)。ヒトのエストラムスチン−結合たんぱく質はラットのエストラムスチン−結合たんぱく質と免疫化学的に同様であり、それはラットのステロイド結合たんぱく質であるプロスタテインと同一であるとして示されていたものである。上記したように、マンマグロビンのアミノ酸配列は42%のアミノ酸同一性とプロスタテインのC3ユニットとの保存置換を含む58%の相同性を示す。そのため、マンマグロビンはある方法でhEMBPに関係付けられることが可能である。しかし、プロスタテインとhEMBPは両方とも摂護線中で検出され、マンマグロビンmRNAはこの組織中に全く存在しない。そのため、マンマグロビンは同じたんぱく質とhEMBPのサブユニットの何れでもなく、更に、hEMBPのサブユニットのあるフラグメントとマンマグロビンの類似性さえあるか否か知られてはいないため、hEMBPの配列は決定されていない。
Clin Invest 92巻の2099−2109頁)(図3)、そして更にウサギ及びマウスのウテログロビンたんぱく質(例として取り込まれる1987年のMiele他のEndocrine Rev 8巻の474−9
0頁;Cato及び1985年のBeatoのAnticancer Res 5巻の65−72頁;1994年のMiele他のEndocrinol
Invest 17巻の679−692頁)を伴い他の相同を同定した。これらの相同は、種に依存して26%の同一性又は40%の含有する保存置換をであった。特に、アミノ酸の数は完全に、ウテログロビン サブユニット間のジスルフィド結合の形成に役割を果たすことが知られるCys−3及びCys−69を含む全てのたんぱく質の中に保存された(以下を参照)。これらの相同は、マグノグロビンは上皮細胞によって分泌されるたんぱく質の小さな系統の新規なメンバーである(上記の1994年のMiele他)。
Sci U.S. 90巻の1112−1116頁)。erb−B及びサイクリンDと異なり、マンマグロビンの過発現は通常の増加された成長ポテンシャル又は有糸分裂の速度に比べ、乳房の上皮細胞の特異的な変化をより反映する。そのように、マンマグロビン遺伝子の調節障害の出現は腫瘍の治療的な危険度及び臨床的なコースに対するより特異的な意味を持つ。
こっている(例として取り込まれる1993年のAlllerd 他のJ Nat’l Cancer Inst 85巻の200−206頁)。
クローニング:A Laboratory Manual,第二版、1989年)。
頁)。そうして形成された雑種細胞は、その後限界希釈方法によりクローニングされ、上澄みはELISA又はRIAにより抗体生成の分析がされる。
I,188 Re,186 Re,67Cu,90Y及び47Sc等のβ−放射体;211 At,212 Bi及び212 Pb等のα−放射体;125 I及び77Br等のオージエ電子放射体;並びに10B等の核分裂性の核種を含む。
この例はマンマグロビンcDNAの単離を示す。
PCR製法において使用された。
AGG TGT GG−3’)’SEQ ID NO:4)、4μlの5X RT 緩衝剤(pH8.3の250mMのTrisCl,375mMのKcl,15mMのMgCl2
),2μlの100mMのDTT,1μlの10mMのdNTPs及び200ユニットのSuperscriptTMII逆転写酵素(Gibco/BRL)を含む標準反応の中で行なわれた。反応は45°Cで1時間の間進められ、5分間の間95°Cで培養することにより停止された。RNAは30分間の間65°Cで400μMのNaOHで加水分解され、400μMの酢酸で中和された。反応はその後3体積の6MのNaIと10μlの処理されたガラスビーズが加えられた。ビーズは80%のEtOHで3回洗浄され、核酸がそのビーズから45μlの水中に溶離された。核酸はその後、沈殿され、10μlの水中に再懸濁された。生成された一次の鎖のcDNAは、20時間の間27°CでT4
RNAリガーゼを使用して、生産者の供給したアンカー オリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:9、5’−CAC GAA
TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC
AGA GG−3’)に結紮された。結紮反応の十分の一は、1μMの生産者のアンカー プライマー(SEQ ID NO:10、5’−CTG
GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC
AGA ATC GAT AG−3’),1μMのマンマグロビン特異性プライマーD2Rb(SEQ ID
NO:11、5’−AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C−3’)、200μMのdNTRs,5ユニットのVentTMDNAポリメラーゼ、及び1X
ポリメラーゼ緩衝剤(10mMのKcl,20mMのTrisCl,10mMの(NH4 )2 SO4 ,2mMのMgSO4 ,0.1%のTriton X−100)を含む50μlの反応中でPCR増幅のために使用された。反応は2分間94°及びその後45秒間94°、1分間50°、そして90秒間72°で合計40回の間に培養された。
ID NO:12)が使用された。全てのPCR増幅はVent DNAポリメラーゼ(New england Biolabs)を用いて行なわれた。増幅されたRACE生成物はEcoRIに浸され、プラスシドベクターpGEM7Z(Proemga)のEcoRI及びSmaI部位中に結紮された。
XAR5 X線フィルムに晒された。
(上記のWatson及びFleming)。この配列は図2中の中空の線に示されるように206bpフラグメント(SEQ ID NO:6)であった。これら二つの配列からの情報の結合は、マンマグロビンの全長503bpのcDNAが演繹されることを許容する。(図2)。
この例は、マンマグロビンの発現が乳腺腫瘍細胞及びより少ない程度で正常な乳腺細胞に制限されることを示す。
dT21(SEQ ID NO:13)及びSuperscript II逆転写酵素(Gibco/BRL)を用いて逆転写された。
RT 緩衝剤(pH8.3の250mMのTrisCl,375mMのKcl,15mMのMgCl2 ),2μlの100mMのDTT,1μlの10mMのdNTPs及び200ユニットのSuperscript
TMII逆転写酵素(Gibco/BRL)でからなるものに加えられた。反応は45°Cで1時間の間進められ、5分間の間95°Cで培養することにより停止された。
ID NO:4)及びd2102(5’−CAG CGG CTT CCT TGA TCC
TTG−3’)(SEQ ID NO:3)及び94°x30秒/55°x1分/72°x1分の40サイクルによる標準反応条件を使用するPCR分析を受けた。
3−ホスフェート デヒドロゲナーゼ(GAPDH)メッ セージ(図4B)及びEGFレセプターメッセージ(データは示されない)の検出は、劣化したRNA又は他の取るに足らない説明によらない。そのため、マンマグロビンmRNAの発現は乳房の組織に対し相対的に特異的である。
この例は、マンマグロビンcDNAは適当に予測された分子量のたんぱく質生成物をもたらす翻訳可能なヌクレオチド配列をエン コードする。生体外の翻訳は、生産者のプロトコルに従いT7 RNAポリメラーゼ(Promega)及び35S−メチオニン(>1000Ci/mmol;10mCi/ml,Amersham)を用いてTNTTMウサギ
レチクロサイト 翻訳キットを使用して行なわれた。
レチクロサイト溶解産物に、2μlの生産者が調製した反応緩衝剤、T7 RNAポリメラーゼ、20μMのメチオニンを含まないアミノ酸混合物、40μCi35S−メチオニン(1000Ci/mmol及び10mCi/ml)、40ユニットのリボヌクレアーゼ禁止剤、1μgのマンマグロビン/pGEM7 プラスミド、及び50μlの最終体積を形成するのに十分な水処理されたDEPCが加えられた。この反応は60分間3
0°Cで培養された。5μlのこの反応が20μlのSDSゲル緩衝剤中に移され、2分間沸騰され、そして17.5%のSDS−ポリアクリルアミド ゲル上に負荷された。
この例は初期の乳房のカルチノーマにおけるマンマグロビンの過発現の罹患率を示す。
以下の例はポリクローナル抗体を使用するマンマグロビンたんぱく質の検出を示す。
(山羊の抗−ウサギ)が加えられた。マンマグロビン−抗体錯体は、酵素結合された化学発光(ECL Western Blotting Detecting Reagent,Amersham,アリントン ハイト、IL)により可視下された。MDA−MB−415細胞系列のために調整された培地は20kdの明確な分子量のマンマグロビンの帯を示し、この帯はMCF−7細胞系列の調整培地中には検出されなかった。このように、MDA−MB−415細胞はマンマグロビンたんぱく質を分泌するが、MCF−7細胞はしない。
Claims (3)
- SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有するマンマグロビン エピトープからなる、単離されて精製された、たんぱく質。
- 前記マンマグロビン エピトープは担体たんぱく質に結合することを特徴とする請求項1記載のたんぱく質。
- 前記担体たんぱく質は、キーホール リンフェト ヘマトシアニンであることを特徴とする請求項2に記載のたんぱく質。
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