JP6471175B2 - 高効率分泌能を有するタンパク質分泌因子及びこれを含む発現ベクター - Google Patents
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Description
本発明は、新規なタンパク質分泌因子、該タンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含むベクター、及び前記ベクターが導入された形質転換細胞に関する。また、本発明は、前記ベクターを含む形質転換細胞を用いて、標的タンパク質を生産する方法に関する。
抗体を含む組換えポリペプチド又はタンパク質は、原核細胞及び真核細胞を含む、 様々な種類の遺伝子組換え生物を使用して生産される。これらの医療、研究のために使用される多くのタンパク質は、糖タンパク質であるため、バクテリアのような原核細胞で生産するのに適していない。このような理由から、真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞を用いるタンパク質発現システムが開発され、広く使用されている。
異種タンパク質を生産しようとする生命工学技術の分野における主な問題の一つは、遺伝子組換え生物から容易に発現若しくは分泌されない、タンパク質又はタンパク質サブユニットなどの組換えポリペプチドの生産及び回収である。これらのタンパク質又はタンパク質サブユニットは、細胞内で非常に低いレベル、あるいは普通のレベルで発現されるため、所望量のタンパク質又はタンパク質サブユニットを得るためには、培養と精製の規模が大きくなる傾向がある。
このような問題を解決するための代表的な方法は、細胞で発現されるタンパク質又はタンパク質サブユニットをできるだけ高いレベルで培養培地に分泌するように誘導することである。細胞で発現されたタンパク質又はタンパク質サブユニットを細胞外培地に分泌されるようにすることは、タンパク質の精製を容易にするため、精製の面でも非常に有用である。また、細胞外の培地に分泌された組換えタンパク質又はタンパク質サブユニットは、細胞内で起こるタンパク質分解を防ぐことができ、正確にフォールディングされたタンパク質産物を得ることができるという利点がある。
真核細胞で発現されたタンパク質が細胞外にうまく分泌されるためには、細胞内網状組織（Endoplasmic Reticulum）を横断するタンパク質のトランスロケーション（translocation）過程が必要である。このトランスロケーション過程においてタンパク質の活性化に必要な様々な修飾過程も同時に起こるため、分泌過程により細胞外へと分泌されたタンパク質は、直ちに糖化又は修飾された成熟タンパク質であると考えられる。
細胞膜を通過して細胞から分泌されるタンパク質は、一般的に、細胞内で前駆体の形で生成されるが、これは「プレタンパク質」と呼ばれる。前記プレタンパク質は、タンパク質のアミノ末端（NH3−terminal）にさらなるペプチド配列を含むが、この配列は発現されたタンパク質を細胞内網状組織にターゲティングさせ、分泌経路に進入できるようにする。このさらなるペプチド配列を「タンパク質分泌因子」又は「シグナル配列或いはシグナルペプチド」と称する。
組換えタンパク質の場合、分泌が期待されたとおりに作動できない場合があるが、これは組換えタンパク質の天然シグナル配列が宿主細胞でうまく動作していないからである。特定の組換えタンパク質の分泌に有用なシグナル配列が多数知られているが、哺乳類の宿主細胞での組換えタンパク質、特に免疫グロブリンの有効な分泌を促進させうる、さらなるシグナル配列を見出すことが依然として必要とされている。
このような背景の下で、本発明者らは、様々な遺伝子組換え又は標的タンパク質をより効果的に分泌生産することのできるタンパク質分泌因子を開発するために鋭意努力した結果、動物宿主細胞から標的タンパク質を外部に効果的に分泌させることのできるタンパク質分泌因子を開発した。また、本発明のタンパク質分泌因子を用いて効果的に分泌発現される抗体を見出し、本発明を完成した。
本発明の目的は、新規なタンパク質分泌因子を提供することである。
本発明の他の目的は、標的タンパク質をコードする遺伝子に連結された、前記タンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供することである。
また、本発明の他の目的は、タンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記発現カセットを含む、標的タンパク質の分泌発現用ベクターを提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記ベクターを宿主細胞に導入した形質転換細胞を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記発現カセットを含む標的タンパク質分泌発現用ベクターが導入させた形質転換細胞を培養して、標的タンパク質を発現及び細胞外に分泌させる段階；及び前記細胞培養物又は培養上清液から標的タンパク質を回収する段階を含む、標的タンパク質を生産する方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、標的タンパク質の分泌発現のためのベクターを作製するためのタンパク質分泌因子の用途を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記標的タンパク質の分泌のためのタンパク質分泌因子の用途を提供することである。
本発明のタンパク質分泌因子を用いた場合、標的タンパク質の分泌が顕著に増加し、特に抗体に対しては従来のタンパク質分泌因子を用いた場合より著しく優れた効果を示した。したがって、本発明のタンパク質分泌因子は、組換えタンパク質の生産分野、特に抗体の生産分野で広く活用することができる。
一実施形態において、本発明は、配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するタンパク質分泌因子を提供する。
本発明の用語「タンパク質分泌因子」とは、タンパク質に連結され、タンパク質が細胞外に分泌されるように誘導する因子を意味する。、具体的には、前記タンパク質分泌因子はポリペプチドから構成されてもよい。本発明においてタンパク質分泌因子は、シグナル配列、分泌配列、シグナルペプチド（signal peptide, SP）などで混用することができる。
具体的に、前記タンパク質分泌因子は、配列番号1〜8からなる群から選択されたアミノ酸配列を有してもよく、より具体的には、配列番号1又は2のアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されない。
本発明者らは、先行文献（韓国特許出願公開番号第10−2007−0119250）を通じて、正常膵臓組織と比較して膵臓腺癌組織において異なって発現される膵臓癌マーカーを有するヒトLBFL313遺伝子を同定した。このようにして同定されたヒトLBFL313遺伝子は、配列番号47のcDNA配列を有してもよいが、これに限定されない。このヒト遺伝子は、膵臓癌を検出するか、サンプル内の正常組織と膵臓腺癌を識別するための診断薬剤又はマーカーとして使用できることが知られているが、この遺伝子の分泌因子かどうかは、知られていない。
本発明の具体的な一実施態様において、本発明者らは、新たに同定された遺伝子の構成を分析する中で、分泌因子として使用可能であると推定されるペプチド配列を選定した。その結果、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列で構成された分泌因子の候補（SP7.2とSP7.3）を選択し、前記分泌因子の候補配列を選択した後、既存の公知の6つの分泌因子（SP1〜SP6）と分泌促進能を比較した。
各分泌因子のルシフェラーゼ分泌効能を測定した結果、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列を有し、LBFL313遺伝子に由来する2つのシグナル配列のルシフェラーゼ分泌レベルが既存シグナル配列（SP1）より改善しているのが示された（図9）。 特に、SP7.2とSP7.3ベクターの場合、培養初期（2dと3d）に、大量のルシフェラーゼが分泌されることが確認できた。
前記タンパク質分泌因子は、標的タンパク質の分泌を促進するために使用することができる。
本発明において、標的タンパク質はタンパク質分泌因子を用いて目的の宿主細胞で分泌発現させることを意図したタンパク質を意味する。前記標的タンパク質をコードする核酸配列は「所望の遺伝子」と命名することができる。
本発明において、前記標的タンパク質は、宿主細胞に内在的に発現されるタンパク質又は外来から導入された遺伝子によって発現されるタンパク質であってもよい。標的たんぱく質の種類は、前記タンパク質の分泌因子によって細胞外分泌効率が向上されるものであれば、特に制限されない。
前記標的タンパク質の例としては、抗体、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、α-、β-又はγ-インターフェロン、コロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、ホスホリパーゼ-活性化タンパク質（PLAP）、インスリン、腫瘍壊死因子（TNF）、成長因子、ホルモン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、エンケファリン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化因子、成長ホルモン放出ペプチド（GHPR）、胸腺体液性因子（THF）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルクロニダーゼからなる群から選択されるものであってもよい。具体的には、抗体の重鎖又は軽鎖タンパク質であってもよいが、これに限定されない。ここで、抗体は全長抗体、Fc断片及び Fab、Fab’、F(ab’)2及びFvなどの抗体断片を含む概念である。また、前記抗体の軽鎖は配列番号48のアミノ酸配列を有してもよく、前記抗体の重鎖は配列番号49のアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。
前記タンパク質分泌因子は標的タンパク質に連結することができる。具体的に、前記タンパク質分泌因子は標的タンパク質にインフレームで連結するように設計され、宿主細胞で標的タンパク質の分泌発現をもたらすことができる。
また、標的タンパク質をコードする遺伝子に連結されるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列は、前記核酸配列と前記遺伝子が直接的に連結されるか、又はリンカーを介して連結するすべてを含む概念である。
前記リンカーの例として、アフィニティータグ及び/又はプロテアーゼ認識配列を含むことができる。
前記アフィニティータグの例として、GST、MBP、 NusA 、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD及びSータグ及びそれが属する技術分野で公知の様々なアフィニティータグを含んでもよいが、これに制限されない。
前記プロテアーゼ認識配列の例として、哺乳動物のプリン、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、サブチリシン、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ、及びユビキチン加水分解酵素及びそれが属する技術分野で公知の様々なプロテアーゼ認識配列を含んでもよいが、これに制限されない。
もう一つの実施形態において、本発明は、標的タンパク質をコードする遺伝子に連結された前記タンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。
本発明において、前記タンパク質分泌因子、標的タンパク質などは上述と同様である。
本発明の用語「発現カセット」とは、1つ以上の遺伝子及びこれらの発現を調節する配列、すなわち、様々なcis-作用転写調節要素の任意の組み合わせを含む核酸配列を意味する。本発明の発現カセットは、タンパク質分泌因子及び標的タンパク質をコードする核酸配列だけでなく、発現調節に必要であると当業界で認められている様々な要素、例えばプロモーター、エンハンサーなどの核酸配列をさらに含むものであってもよい。遺伝子の発現を調節する配列、すなわち遺伝子の転写及びその転写産物の発現を調節する配列は、通常「調整ユニット」と呼ばれる。調節ユニットのほとんどは、標的遺伝子のコード配列の上流に作動可能に連結されて位置する。また、前記発現カセットは、3’末端にポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域を含むことができる。
前記発現カセットは、プロモーター配列、及び前記タンパク質分泌因子及び標的タンパク質が連結された融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記プロモーター配列は、融合タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結されるように構成されている。
本発明の用語「機能的に連結された」とは、一つのDNA領域が別のDNA領域に機能的に連結されていることを意味する。例えば、所望の遺伝子配列は、プロモーターの活性化により所望の遺伝子が発現されることを可能にするプロモーターなどの発現調節配列に機能的に連結される。
本発明において、発現カセットは、プロモーター配列及び標的タンパク質をコードする遺伝子に連結された、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含み、宿主細胞、特に、動物宿主細胞において標的タンパク質を細胞外に分泌発現させるように設計される。
また、もう一つの実施形態において、本発明は、前記タンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供する。
さらに具体的には、本発明は前記標的タンパク質をコードする遺伝子に連結されたタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む、標的タンパク質分泌の発現用ベクターを提供する。
前記タンパク質分泌因子、標的タンパク質及びタンパク質分泌因子と標的タンパク質の結合は上述した通りである。
また、本発明における標的タンパク質分泌の発現用ベクターは、配列番号1〜8からなる群から選択された標的タンパク質をコードする遺伝子に連結されたタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む発現カセットをさらに含むことができる。
また、、本発明における標的タンパク質分泌発現用ベクターは、抗体分泌発現用ベクターであってもよい。
例えば、前記標的タンパク質分泌の発現用ベクターは、a) 抗体軽鎖をコードする遺伝子に連結されたタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第1発現カセット；及びｂ) 抗体重鎖をコードする遺伝子に連結されたタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第2発現カセットを含むことができる。
具体的に、抗体の分泌発現用ベクターは、a) 抗体軽鎖をコードする遺伝子に連結された配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第1発現カセット；及びb) 抗体重鎖に連結された配列番号1〜8からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第2発現カセットを含むことができる。例えば、b）の前記タンパク質分泌因子は、配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子であってもよい。
さらに具体的には、a)の前記タンパク質分泌因子が、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子、及び b）のタンパク質分泌因子が配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子であってもよい。ここで、前記抗体軽鎖は配列番号48のアミノ酸から構成されてもよく、前記抗体重鎖は配列番号49のアミノ酸から構成されてもよいが、それらに制限されない。
本発明の用語「標的タンパク質分泌発現用ベクター」とは、タンパク質分泌因子と標的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたタンパク質分泌因子を含むことにより、当該ベクトーを宿主細胞に導入した後に発現する時、標的タンパク質の細胞外分泌を誘導する発現ベクターを意味する。
本発明の用語「発現ベクター」とは、通常、標的DNAの断片が挿入されたキャリアであり、一般的に二本鎖のDNAの断片を意味し、当業界でタンパク質を発現するために使用される発現ベクターは制限なく使用することができる。ここで、標的DNAは、発現を目的とするタンパク質をコードするDNAを意味する。取りあえず発現ベクターが宿主細胞内にあると、宿主染色体DNAとは無関係に複製することができ、かつ、挿入された標的DNAが発現することができる。当業界に周知のように、宿主細胞で形質転換遺伝子の発現程度を高めるためには、前記形質転換遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されるべきである。
本発明の具体的な一実施態様では、「CMVe」、「CB」及び「Beta-actin Intron」（大韓民国公開特許第10−2012−0059222号） を有するpTOP-BA-RL-pA ベクターに基づいて、配列番号1〜8のアミノ酸配列で構成されたタンパク質分泌因子をコードする核酸配列、及び、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結し、標的タンパク質分泌発現用ベクターを作製した。
本発明の具体的な一実施態様では、本発明者らは、前記ルシフェラーゼ分泌測定実験において優れた分泌誘導効能を示したシグナル配列のうち、SP2（配列番号4）、SP6（配列番号8）及びSP7.2（配列番号1）を選択して、産業的に大量生産が要求されるタンパク質であるモノクローナル抗体に対しても、分泌誘導能が優れているかを確認するために、抗体発現ベクター作製した（実施例5）。この実験では、モノクローナル抗体としてRx抗体を使用しており、前記Rx抗体は配列番号48のアミノ酸配列で構成された抗体軽鎖と、配列番号49のアミノ酸配列で構成された抗体重鎖含む。
本発明者らは、抗体分泌因子の最適の構成を把握するために、抗体を構成する抗体軽鎖及び抗体重鎖の分泌因子をそれぞれ変えて組み合わせることにより分泌効率を確認した。
すなわち、SP1（配列番号3）、（SP2配列番号4）、SP6（配列番号8）及びSP7.2（配列番号1）からなる群から選択された分泌シグナル配列を、それぞれの抗体軽鎖及び抗体重鎖と連結させて作製したベクターにおいて前記記抗体軽鎖及び抗体重鎖を発現させ、それらの抗体分泌効率を確認した。
前記分泌シグナル配列の細胞外への分泌効能を試験管内細胞培養システムで確認するために、シグナル配列をCHO細胞内に形質転換した後、ELISAを使用してモノクローナル抗体の分泌程度を調査した。
前記ELISA実験により抗体の分泌程度を測定した結果、LBFL313遺伝子に由来する配列番号1のアミノ酸配列をコードするSP7.2シグナル配列を含む発現ベクターpCB-Rx71_v5.4から高い分泌レベルが確認された（図12）。特に、抗体軽鎖にSP7.2シグナル配列を連結し、抗体重鎖の配列番号3のアミノ酸配列をコードするSP1シグナル配列を連結した組み合わせからの分泌レベルが顕著に高いことを確認した。また、培養期間の増加に伴い、分泌レベルがさらに増加したことを確認した、その結果、SP7.2を用いた場合、短期間に分泌レベルが増加した前記ルシフェラーゼ分泌実験の結果に比べて、長期間培養にもかかわらず、分泌レベルが顕著に増加することを確認した。
もう一つの実施態様として、本発明は宿主細胞に前記ベクターが導入された形質転換された細胞を提供する。
本発明の用語「形質転換」とは、DNAを宿主細胞に導入してDNAが染色体の因子として、又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本発明における形質転換に用いられる宿主細胞は、原核又は真核生物をいずれも含むことができる。
本発明において、宿主細胞はバクテリア、例えば、エシェリキア、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌及び酵母のような周知の原核及び真核宿主、スポドプテラ・フルギペルダ（SF9）のような昆虫細胞、並びにCHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10などの動物細胞を含むことができる。本発明における前記宿主細胞は、動物宿主細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞であってもよいが、これらに限定されない。
本発明の具体的な一実施態様では、組換えタンパク質の生産において広く使用されているチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を宿主細胞として使用した。
もう一つの実施態様として、本発明は、i）標的タンパク質分泌発現用ベクターが導入された形質転換細胞を培養して、標的タンパク質を発現及び細胞外に分泌させる段階；及びii）宿主細胞の培養物又は培養上青液から標的タンパク質を回収する段階を含む、標的タンパク質を生産する方法を提供する。
前記標的タンパク質を生産する方法は、回収した標的タンパク質の精製段階をさらに含むことができ、標的タンパク質の精製は、必要に応じて当業界で一般的に用いられるタンパク質の精製方法により行うことができる。例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィー、受容体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティー性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及び逆相HPLCなどを含む従来のクロマトグラフィー方法によって宿主細胞の培養物又は培養上青液から分離することができる。また、標的タンパク質が特異的タグ、ラベル、又はキレート一部分を有する融合タンパク質である場合、特異的結合パートナー又は製剤によって精製することができる。精製されたタンパク質は、タンパク質分泌因子を除去することにより、所望のタンパク質部分に切断したり、又はそれ自体で残ってもよい。
本発明では、前記タンパク質の分泌因子、タンパク質、発現カセット、標的タンパク質の分泌発現用ベクター、形質転換、宿主細胞などは、前記で説明した通りである。
前記方法で使用された宿主細胞は、動物宿主細胞であってもよく、特にチャイニスハムスター卵巣（CHO）細胞であってもよい。また、前記形質転換された宿主細胞は、必要に応じて当業界で一般的に使用される培養方法により培養することができる。
さらにもう一つの実施態様として、本発明は標的タンパク質分泌発現用ベクターを作製するためのタンパク質分泌因子の用途を提供する。
前記タンパク質分泌因子、ベクター及び標的タンパク質については前記で説明した通りである。
もう一つの実施態様として、本発明は標的タンパク質分泌のため、タンパク質分泌因子の用途を提供する。
前記タンパク質分泌因子、ベクター及び標的タンパク質は前記で説明した通りである。
以下、下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
実施例1： 分子生物学的技術
制限酵素の処理、アガロースゲル電気泳動、ゲル抽出キット（QIAGEN）、プラスミドDNA精製、重合連鎖反応（PCR）、DNA切片ライゲーション及び大腸菌の形質転換などの分子生物学で一般的に使用された方法は、SAMBROOKなどのMolecular Cloning（第2版）に紹介された方法に最小限の変形を加えて実施した。
制限酵素の処理、アガロースゲル電気泳動、ゲル抽出キット（QIAGEN）、プラスミドDNA精製、重合連鎖反応（PCR）、DNA切片ライゲーション及び大腸菌の形質転換などの分子生物学で一般的に使用された方法は、SAMBROOKなどのMolecular Cloning（第2版）に紹介された方法に最小限の変形を加えて実施した。
実施例2： シグナル配列の選定
2−1.実験方法
動物宿主細胞を利用して、異種タンパク質を発現させることにおいて分泌を促進させるためのシグナル配列を同定するために、大韓民国登録特許第10-0954322号、「膵臓癌に関連する新規なLBFL313遺伝子」から高効率の分泌シグナル配列の可能性を確認しようとした。
2−1.実験方法
動物宿主細胞を利用して、異種タンパク質を発現させることにおいて分泌を促進させるためのシグナル配列を同定するために、大韓民国登録特許第10-0954322号、「膵臓癌に関連する新規なLBFL313遺伝子」から高効率の分泌シグナル配列の可能性を確認しようとした。
具体的に、LBFL313遺伝子からのシグナル配列として予想されるペプチド配列を推定し、推定された配列を動物細胞からシグナル配列として一般的に使われている6つの既存の利用されているシグナル配列と比較実験した。そこで、1次比較試験のため、組換えタンパク質の生産で広く使用されているチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株を宿主細胞として使用し分泌ルシフェラーゼ遺伝子を目的遺伝子に使用した。ルシフェリンを基質として利用して細胞外に分泌されたルシフェラーゼによる酸化で放出される光をルミノメーターで測定し、分泌の程度を決定した。
この後、1次比較試験で選択されたシグナル配列に対して、ルシフェラーゼの代わりに産業的に有用なタンパク質であるモノクローナル抗体の分泌を比較するための2次比較試験として、CHO細胞株を宿主細胞にし抗体の軽鎖及び重鎖のシグナル配列からなる様々な組み合わせによって分泌される抗体の量をELISAを使用して測定した。重鎖Fc部分を認識するF(ab')2でELISAプレートを被覆して、細胞外に分泌された抗体を固定し、軽鎖のｋａｐｐａ部分と結合する抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で標識し、基質として使用したＴＭＢが酸化されて表示されることを分光光度計で測定し、分泌された程度を決定した。
2−2：実験に用いたシグナル配列
前記実施例2−1でLBF313遺伝子からシグナル配列として予想されるペプチド配列を推定した結果、SP7.2とSP7.3を選定した。
前記実施例2−1でLBF313遺伝子からシグナル配列として予想されるペプチド配列を推定した結果、SP7.2とSP7.3を選定した。
※SP7.2（配列番号1）
NH3-MHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
※SP7.3（配列番号2）
NH3-MWRVPGTTRRPVTGESPGMHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
前記推定された配列と比較実験のために用いられた6つの既存の用いられたシグナル配列は、SP1〜SP6と命名し、その配列は下記の通りである。
NH3-MHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
※SP7.3（配列番号2）
NH3-MWRVPGTTRRPVTGESPGMHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
前記推定された配列と比較実験のために用いられた6つの既存の用いられたシグナル配列は、SP1〜SP6と命名し、その配列は下記の通りである。
※SP1（配列番号3）
NH3-MGWSYIILFLVATATDVHS-CO2H
※SP2（配列番号4）
NH3-MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR-CO2H
※SP3（配列番号5）
NH3-MDFQVQIISFLLISASVIMSRG-CO2H
※SP4（配列番号6）
NH3-MGWSLILLFLVAVATRVLS-CO2H
※SP5（配列番号7）
NH3-MLLLLLLLGLRLQLSLG-CO2H
※SP6（配列番号8）
NH3-MKTLILAVALVYCATVHC-CO2H
NH3-MGWSYIILFLVATATDVHS-CO2H
※SP2（配列番号4）
NH3-MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR-CO2H
※SP3（配列番号5）
NH3-MDFQVQIISFLLISASVIMSRG-CO2H
※SP4（配列番号6）
NH3-MGWSLILLFLVAVATRVLS-CO2H
※SP5（配列番号7）
NH3-MLLLLLLLGLRLQLSLG-CO2H
※SP6（配列番号8）
NH3-MKTLILAVALVYCATVHC-CO2H
本実験で用いられたSP1は、マウスIgG2から由来したシグナル配列; SP2は、ヒト血清アルブミン（HSA）から由来したシグナル配列;SP3は、マウスIkCから由来したシグナル配列; SP4は、天然ではなく人工的に合成されたシグナル配列で、米国特許ＵＳ7，381，560で使用されたシグナル配列; SP5は、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）から由来したシグナル配列;SP6は Cypridina noctilucaルシフェラーゼ（CLUC）から由来したシグナル配列である。
本実験では、これらのプラスミドベクターの中で最適の組み合わせをより、高い目的タンパク質分泌を示すプラスミドベクターを選別するために、代表的に測定が容易な分泌ルシフェラーゼである Cypridina noctilucaルシフェラーゼ（CLUC）遺伝子とIgG1形態の抗体であるRx抗体の遺伝子をレポーターとして使用した。
前記8つのシグナル配列をコードするDNA配列とレポーター遺伝子 Cypridina noctilucaルシフェラーゼ（CLUC）またはIgG1形態の抗体であるRx抗体軽鎖及び重鎖の遺伝子配列をイン-フレイムで連結して、次のように様々な組み合わせのプラスミドベクターを作製して使用した。作製されたプラスミドベクターの組合せ及び構成要素の順序は下記の表1の通りである。
CLUCを用いた試験はルシフェラーゼ分析法を使用して、抗体であるRxを用いた試験はELISAを使用して、各試験で細胞外への分泌程度を測定した。
3：ルシフェラーゼプラスミドベクター作製
前記実施例2−2で設計した分泌配列を異にして分泌ルシフェラーゼ（CLUC）をレポーター遺伝子として有するプラスミドベクターを作製した。
前記実施例2−2で設計した分泌配列を異にして分泌ルシフェラーゼ（CLUC）をレポーター遺伝子として有するプラスミドベクターを作製した。
3−1：pCBIN-CLUC6の作製
CMVe（CMVエンハンサー）及び CB（CMV/β-アクチン融合プロモーター）を有するレポーターベクターを作製するために、pTOP−BA−RL−pAベクター（大韓民国公開特許第10−2012−0059222号;「CMVe」と「CB」、及び「β-アクチンイントロン」を有する）をＥｃoＲＩとBamHIを処理して得られたDNA断片（1762bp）を、ｐCLUC-Basic2（ＮＥＢ、Ｃａｔ＃：N0317S）ベクターを同様の制限酵素で切断した部位に挿入して作製した。この方法で作製されたレポーターベクターはシグナル配列「SP6」を有している（pCBIN-CLUC）（図1）。
CMVe（CMVエンハンサー）及び CB（CMV/β-アクチン融合プロモーター）を有するレポーターベクターを作製するために、pTOP−BA−RL−pAベクター（大韓民国公開特許第10−2012−0059222号;「CMVe」と「CB」、及び「β-アクチンイントロン」を有する）をＥｃoＲＩとBamHIを処理して得られたDNA断片（1762bp）を、ｐCLUC-Basic2（ＮＥＢ、Ｃａｔ＃：N0317S）ベクターを同様の制限酵素で切断した部位に挿入して作製した。この方法で作製されたレポーターベクターはシグナル配列「SP6」を有している（pCBIN-CLUC）（図1）。
3−2：pCBIN-CLUC1の作製
マウスIgG2シグナル配列（SP1;配列番号3）のペプチド配列をコードするDNA配列をpCB-Ｉｘ6_v5.4を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号9及び10）でPCRし増幅した産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（80bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）用いてCLUC遺伝子をPCRで増幅した産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記pCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC1ベクターを作製した（図2）。
マウスIgG2シグナル配列（SP1;配列番号3）のペプチド配列をコードするDNA配列をpCB-Ｉｘ6_v5.4を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号9及び10）でPCRし増幅した産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（80bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）用いてCLUC遺伝子をPCRで増幅した産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記pCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC1ベクターを作製した（図2）。
上記用いたプライマーは、下記の通りである。
※oSP1-ｆ（配列番号9）
5'-tt GGATCC gcc acc atg gga tgg agc tat-3'
※ oSP1-ｒ（配列番号10）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga gtg gac atc tgt-3'
※oCLUC-Ｎ1-ｆ（配列番号11）
5'-tt c CATATG aa cct gat cca cca aa-3'
※oBasic-r（配列番号12）
5'-tca gaa gcc ata gag ccc acc gca t-3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg gga tgg agc tat-3'
※ oSP1-ｒ（配列番号10）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga gtg gac atc tgt-3'
※oCLUC-Ｎ1-ｆ（配列番号11）
5'-tt c CATATG aa cct gat cca cca aa-3'
※oBasic-r（配列番号12）
5'-tca gaa gcc ata gag ccc acc gca t-3'
3−3：pCBIN-CLUC2の作製
ヒト血清アルブミン（HSA）シグナル配列のペプチド配列をコードするDNA配列を2つのオリゴヌクレオチド（配列番号13及び14）をアニリングし鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号15及び16）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（95bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記pCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC2ベクターを作製した（図3）。
ヒト血清アルブミン（HSA）シグナル配列のペプチド配列をコードするDNA配列を2つのオリゴヌクレオチド（配列番号13及び14）をアニリングし鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号15及び16）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（95bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記pCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC2ベクターを作製した（図3）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oHSAL-U（配列番号13）
5'-atg aag tgg gtg acc ttc atc tcc ctg ctg ttc ctg ttc tcc tcc gcc tac tcc agg ggc gtg ttc agg agg-3'
※oHSAL-L（配列番号14）
5'-cct cct gaa cac gcc cct gga gta ggc gga gga gaa cag gaa cag cag gg-3'
※oSP2-f（配列番号15）
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag tgg gtg acc-3'
※oSP2-r（配列番号16）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg cct cct gaa cac gcc -3'
5'-atg aag tgg gtg acc ttc atc tcc ctg ctg ttc ctg ttc tcc tcc gcc tac tcc agg ggc gtg ttc agg agg-3'
※oHSAL-L（配列番号14）
5'-cct cct gaa cac gcc cct gga gta ggc gga gga gaa cag gaa cag cag gg-3'
※oSP2-f（配列番号15）
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag tgg gtg acc-3'
※oSP2-r（配列番号16）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg cct cct gaa cac gcc -3'
3−4：pCBIN-CLUC3の作製
マウス-ヒトキメラIgG1モノクローナル抗体を発現するpCB-Rxベクター（当社で保有している発現ベクターで「SP3」と「SP4」をシグナル配列として使用する。）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号17と18）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（89bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC3ベクターを作製した（図4）。
マウス-ヒトキメラIgG1モノクローナル抗体を発現するpCB-Rxベクター（当社で保有している発現ベクターで「SP3」と「SP4」をシグナル配列として使用する。）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号17と18）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（89bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC3ベクターを作製した（図4）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oSP3-f（配列番号17）
5'-tt GGATCC gcc acc atg gac ttc cag gtg-3'
※oSP3-r（配列番号18）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cct gga cat gat -3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg gac ttc cag gtg-3'
※oSP3-r（配列番号18）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cct gga cat gat -3'
3−5：pCBIN-CLUC4の作製
マウス-ヒトキメラIgG1モノクローナル抗体を発現するpCB-Rxベクタを鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号19と20）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（80bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC4ベクターを作製した（図5）。
マウス-ヒトキメラIgG1モノクローナル抗体を発現するpCB-Rxベクタを鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号19と20）でPCRし増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（80bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRし増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC4ベクターを作製した（図5）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oSP4-f（配列番号19）
5'-tt GGATCC gcc acc atg ggc tgg agc ctg-3'
※oSP4-r（配列番号20）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga cag cac cct ggt -3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg ggc tgg agc ctg-3'
※oSP4-r（配列番号20）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga cag cac cct ggt -3'
3−6：pCBIN-CLUC5の作製
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いたレポーターベクターであるpSEAP-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号21と22）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（74bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC5ベクターを作製した（図6）。
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いたレポーターベクターであるpSEAP-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号21と22）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（74bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC5ベクターを作製した（図6）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oSP5-f（配列番号21）
5'-tt GGATCC gcc acc atg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg g-3'
※oSP5-r（配列番号22）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cag gga gag ctg-3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg g-3'
※oSP5-r（配列番号22）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cag gga gag ctg-3'
3−7：pCBIN-CLUC7.2の作製
LBFL313遺伝子を有するpLFC250（韓国特許、特許出願第10-0954322）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号23と24）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（89bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC7.2ベクターを作製した（図7）。
LBFL313遺伝子を有するpLFC250（韓国特許、特許出願第10-0954322）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号23と24）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（89bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC7.2ベクターを作製した（図7）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oSP7-B1-f2（配列番号23）
5'-tt GGATCC gcc acc atg cac cgg cca gag-3'
※ oSP7-N1-r（配列番号24）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg tgc cca ggt ggg gcc-3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg cac cgg cca gag-3'
※ oSP7-N1-r（配列番号24）
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg tgc cca ggt ggg gcc-3'
3−8：pCBIN-CLUC7.3の作製
LBFL313遺伝子を有するｐＬＦＧ250（韓国特許、特許出願第10-0954322）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号24と25）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（143bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC7.3ベクターを作製した（図8）。
LBFL313遺伝子を有するｐＬＦＧ250（韓国特許、特許出願第10-0954322）を鋳型として使用し、2つのプライマー（配列番号24と25）でPCRして増幅された産物をBamHI及びNdeIで切った後に得られたDNA断片（143bp）、及び、前記ｐCLUC-Basic2ベクターを鋳型として使用し、2つのプライマーを（配列番号11及び12）利用してCLUC遺伝子をPCRして増幅された産物をNdeI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（1654bp）を、前記のpCBIN-CLUCベクターをBamHI及びXbaIで切った後に得られたDNA断片（6049bp）の切断された部位に挿入してpCBIN-CLUC7.3ベクターを作製した（図8）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※ oSP7-B1-f3 (配列番号25)
5'-tt GGATCC gcc acc atg tgg agg gtg ccc-3'
実施例4：ルシフェラーゼプラスミドベクターの試験管内効能実験
5'-tt GGATCC gcc acc atg tgg agg gtg ccc-3'
実施例4：ルシフェラーゼプラスミドベクターの試験管内効能実験
前記実施例3で作製したベクターには、Cypridina noctilucaから由来した分泌ルシフェラーゼがレポーターとして挿入されている。シグナル配列の細胞外への分泌効能を試験管内細胞培養システムで調査するためにCHO細胞に形質転換した後、ルシファーラゼ分析により当該シグナル配列の分泌誘導程度を調査した。
具体的に、熱で非活性されたウシ胎仔血清（FBS、GIBCO-BRL）10%を含有しているドルベコ修正イーグル培地（DMEM、GIBCO-BRL）を用いて培養したCHO細胞に、リポフェクタミン（登録商標）2000（Invitrogen、 Cat。＃：11668-019）を用いて実施例3で作製したベクターを形質転換した。形質転換一日前に24-ウェルプレート（Falcon）の各ウェル当たり6 x 104個のCHO細胞を培養した後、次の日、各ルシフェラーゼ遺伝子が挿入された8種類のプラスミドベクター（pCBIN-CLUC1、 pCBIN-CLUC2、pCBIN-CLUC4、pCBIN-CLUC5 、pCBIN-CLUC、pCBIN-CLUC7.2及びとpCBIN-CLUC7.3）を500ｎｇ、Opti-ＭＥＭ I（Invitrogen、Cat。＃31985-070）を50 ｕＬ を入れたチューブ1（1ウェル反応量）、 及び、リポフェクタミン（登録商標）2000 を2ｕＬ、Opti-MEMIを48 ｕＬを入れたチューブ2（1 well反応量）をそれぞれ室温で5分間置いた後、2つの チューブを混合して20分間室温で反応させた。前記混合液をOpti-ＭＥＭ I培地250 ｕＬに変えたCHO細胞に各100ｕＬずつ入れ、3時間37℃の培養器（5%CO2）で培養した後、20%ＦＢＳを含有しているDMEM培地を各ウェルに入れて6日間培養した。形質転換後2日、3日、5日、6日目に各ウェルの培養培地を100 ｕｌずつサンプリングして-20℃に保管し、6日目に、すべてを溶かして20 ｕＬずつ分析プレートに移しルシフェラーゼ分析を実施した。
前記ルシフェラーゼ分泌効能測定の結果、図9で示したようにLBFL313遺伝子から由来した2つのシグナル配列と、既存の2つのシグナル配列を含む合計4つのシグナル配列（SP2、SP6、SP7.2とSP7.3）が既存のシグナル配列（SP1）よりルシフェラーゼ分泌を改善した（図9）。特に、SP7.2及びSP7.3ベクターの場合、培養初期（2ｄと3ｄ）に著しく大量分泌されることが確認できた。
実施例5：抗体発現プラスミドベクター作製
前記実施例4で効果を示したシグナル配列の中でSP2、SP6及びSP7.2を選択して、産業的に大量生産が要求されるタンパク質であるモノクローナル抗体に対しても優れた分泌誘導能を有するかどうか確認するために、下記の様々な抗体発現用ベクターを作製した。
前記実施例4で効果を示したシグナル配列の中でSP2、SP6及びSP7.2を選択して、産業的に大量生産が要求されるタンパク質であるモノクローナル抗体に対しても優れた分泌誘導能を有するかどうか確認するために、下記の様々な抗体発現用ベクターを作製した。
実施例5−1：pCBIN−Rx11_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31、及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表2）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx11_v5.4ベクターを作製した（図11及び表3）。
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31、及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表2）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx11_v5.4ベクターを作製した（図11及び表3）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※oIxLs-r1（配列番号26）
5'-cag cag gat gtc gcc cct gga cat gat cac -3'
※oRx-LF1（配列番号27）
5'-cag atc gtg ctg tct cag tct-3'
※oIkC-M1X1-r（配列番号28）
5'-tt ACGCGT CTCGAG tca aca ctc tcc c-3'
※oRHn-f（配列番号29）
5'-tt GGCGCGCC atg gga tgg agc tat-3'
※oIxLs-r2（配列番号30）
5'-cag cag gat gtc gga cag cac cct ggt ggc cac ggc-3'
※oRx_HF1（配列番号31）
5'-cag gtg cag ctg cag cag ccc-3'
※oIgG1-X1N1-r（配列番号32）
5'-aa CTCGAG GCGGCCGC tca ttt acc cgg aga c-3'
5'-cag cag gat gtc gcc cct gga cat gat cac -3'
※oRx-LF1（配列番号27）
5'-cag atc gtg ctg tct cag tct-3'
※oIkC-M1X1-r（配列番号28）
5'-tt ACGCGT CTCGAG tca aca ctc tcc c-3'
※oRHn-f（配列番号29）
5'-tt GGCGCGCC atg gga tgg agc tat-3'
※oIxLs-r2（配列番号30）
5'-cag cag gat gtc gga cag cac cct ggt ggc cac ggc-3'
※oRx_HF1（配列番号31）
5'-cag gtg cag ctg cag cag ccc-3'
※oIgG1-X1N1-r（配列番号32）
5'-aa CTCGAG GCGGCCGC tca ttt acc cgg aga c-3'
実施例5−2：pCBIN−Rx12_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2 ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表4）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx12_v5.4ベクターを作製した（図11及び表5）。
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2 ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表4）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx12_v5.4ベクターを作製した（図11及び表5）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※ oAscI_SP2-f (配列番号33)
5'-ctg gcg cgc cat gaa gtg ggt gac c-3'
※ oSP2_RH-r (配列番号34)
5'-gca gct gca cct gcc tcc tga aca c-3'
※ oSP2_RH-f (配列番号35)
5'-ctg ttc att gcc agg tgc agc tgc-3'
5'-ctg gcg cgc cat gaa gtg ggt gac c-3'
※ oSP2_RH-r (配列番号34)
5'-gca gct gca cct gcc tcc tga aca c-3'
※ oSP2_RH-f (配列番号35)
5'-ctg ttc att gcc agg tgc agc tgc-3'
実施例5−3：pCBIN−Rx16v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLIC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表6）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx16_v5.4ベクターを作製した（図11及び表7）。
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLIC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表6）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx16_v5.4ベクターを作製した（図11及び表7）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※ oAscI_SP6-f (配列番号36)
5'-CAG GCG CGC CAT GAA GAC CTT AAT TC-3'
※ oSP6_ＲＨ-r (配列番号37)
5'-GCA GCT GCA CCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_ＲＨ-f (配列番号38)
5'-CTG TTC ATT GCC AGG TGC AGC TGC-3'
5'-CAG GCG CGC CAT GAA GAC CTT AAT TC-3'
※ oSP6_ＲＨ-r (配列番号37)
5'-GCA GCT GCA CCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_ＲＨ-f (配列番号38)
5'-CTG TTC ATT GCC AGG TGC AGC TGC-3'
実施例5−4：pCBIN−Rx17v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表8）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx17_v5.4ベクターを作製した（図11及び表9）。
前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号9、26、27、及び28）でPCRしてSP1と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表8）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx17_v5.4ベクターを作製した（図11及び表9）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※ oAscI_SP7.2-ｆ(配列番号39)
5'-cag gcg cgc cat gca ccg gcc aga g-3'
※ oSP7.2_ＲＨ-ｒ(配列番号40)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_ＲＨ-ｆ(配列番号41)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
5'-cag gcg cgc cat gca ccg gcc aga g-3'
※ oSP7.2_ＲＨ-ｒ(配列番号40)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_ＲＨ-ｆ(配列番号41)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
実施例5−5：pCBIN−Rx21_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41、及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表10）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿することにより、pCB-Rx21_v5.4ベクターを作製した（図10及び表11）。
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41、及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表10）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿することにより、pCB-Rx21_v5.4ベクターを作製した（図10及び表11）。
上記使用したプライマーは、下記の通りである。
※ oSP7.2_RH-r(配列番号42)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_RH-f(配列番号43)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_RH-f(配列番号43)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
実施例5−6：pCBIN−Rx22_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表12）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx22_v5.4ベクターを作製した（図10及び表13）。
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表12）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx22_v5.4ベクターを作製した（図10及び表13）。
実施例5−7：pCBIN−Rx26v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1 ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表14）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx26_v5.4ベクターを作製した（図11及び表15）。
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1 ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表14）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx26_v5.4ベクターを作製した（図11及び表15）。
実施例5−8：pCBIN−Rx27v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表16）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx27_v5.4ベクターを作製した（図11及び表17）。
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号15、42、43、及び28）でPCRしてSP2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表16）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx27_v5.4ベクターを作製した（図11及び表17）。
実施例5−9：pCBIN−Rx32_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表18）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx32_v5.4ベクターを作製した（図11及び表19）。
前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表18）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx32_v5.4ベクターを作製した（図11及び表19）。
実施例5−10：pCBIN−Rx36_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38、及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表20）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx36_v5.4ベクターを作製した（図11及び表19）。
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38、及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表20）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx36_v5.4ベクターを作製した（図11及び表19）。
実施例5−11：pCBIN−Rx37v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41、及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表22）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx37_v5.4ベクターを作製した（図11及び表23）。
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41、及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後、得られたDNA断片（図10及び表22）をpCB-Rx_v5.4のAscIとNotI切断部位に挿入することにより、pCB-Rx37_v5.4ベクターを作製した（図11及び表23）。
実施例5−12：pCBIN−Rx61v5.4の作製
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表24）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx61_v5.4ベクターを作製した（図11及び表25）。
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表24）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx61_v5.4ベクターを作製した（図11及び表25）。
※ oSP6-f(配列番号44)
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag acc tta att-3'
※ oSP6_RL-r(配列番号45)
5'-ACA GCA CGA TCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_RL-f(配列番号46)
5'-CTG TTC ATT GCC AGA TCG TGC TGT-3'
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag acc tta att-3'
※ oSP6_RL-r(配列番号45)
5'-ACA GCA CGA TCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_RL-f(配列番号46)
5'-CTG TTC ATT GCC AGA TCG TGC TGT-3'
実施例5−13：pCBIN−Rx62_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表26）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx62_v5.4ベクターを作製した（図10及び表27）。
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表26）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx62_v5.4ベクターを作製した（図10及び表27）。
実施例5−14：pCBIN−Rx66_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHIとXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表28）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx66_v5.4ベクターを作製した（図11及び表29）。
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHIとXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscIとNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表28）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx66_v5.4ベクターを作製した（図11及び表29）。
実施例5−15：pCBIN−Rx67v5.4の作製
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表30）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx67_v5.4ベクターを作製した（図11及び表31）。
前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号44、45、46、及び28）でPCRしてSP6と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表30）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx67_v5.4ベクターを作製した（図11及び表31）。
実施例5−16：pCBIN−Rx71v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表32）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx71_v5.4ベクターを作製した（図11及び表33）。
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC1ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号29、30、31及び32）でPCRしてSP1と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表32）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx71_v5.4ベクターを作製した（図11及び表33）。
実施例5−17：pCBIN−Rx72_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表34）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx72_v5.4ベクターを作製した（図10及び表35）。
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号33、34、35、及び32）でPCRしてSP2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表34）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx72_v5.4ベクターを作製した（図10及び表35）。
実施例5−18：pCBIN−Rx76_v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表36）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx76_v5.4ベクターを作製した（図10及び表37）。
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUCベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号36、37、38及び32）でPCRしてSP6と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表36）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx76_v5.4ベクターを作製した（図10及び表37）。
実施例5−19：pCBIN−Rx77v5.4の作製
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2べクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表38）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx77_v5.4ベクターを作製した（図11及び表39）。
前記pCBIN-CLUC7.2ベクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号23、42、43、及び28）でPCRしてSP7.2と抗体軽鎖が連結された産物をBamHI及びXhoIで切った後に得られたDNA断片、及び、前記pCBIN-CLUC7.2べクターとpCB-Rx_v5.4ベクターを鋳型として使用し、4つのプライマー（配列番号39、40、41及び32）でPCRしてSP7.2と抗体重鎖が連結された産物をAscI及びNotIで切った後に得られたDNA断片を（図10及び表38）、pCB-Rx_v5.4のBamHIとXhoI切断部位及びAscIとNotI切断部位にそれぞれ挿入することにより、pCB-Rx77_v5.4ベクターを作製した（図11及び表39）。
実施例6：抗体発現プラスミドベクターの試験管内効能実験
前記実施例5において作製された各抗体発現用プラスミドベクターは、マウスーヒトキメラIgG1型のモノクローナル抗体が細胞外に分泌させるように作製されている。シグナル配列の細胞外への分泌効能を試験管内細胞培養システムで調査するためにCHO細胞を形質転換した後、ELISAによりモノクローナル抗体の分泌程度を調査した。
前記実施例5において作製された各抗体発現用プラスミドベクターは、マウスーヒトキメラIgG1型のモノクローナル抗体が細胞外に分泌させるように作製されている。シグナル配列の細胞外への分泌効能を試験管内細胞培養システムで調査するためにCHO細胞を形質転換した後、ELISAによりモノクローナル抗体の分泌程度を調査した。
具体的に、実施例5において作製された各抗体発現用プラスミドベクターは、熱で非活性化されたウシ胎仔血清（FBS、GIBCO-BRL） 10％を含有しているドルベコ修正イーグル培地（DMEM、GIBCO-BRL）を用いて培養されたCHO細胞への形質転換は、リポフェクタミン（登録商標）2000（Invitrogen、Cat 。＃：11668-019）を用いて行われた。形質転換一日前、phi-100 dish（Falcon）を使用して、各dishあたり5 x 106個のCHO細胞を培養した後、次の日、各ルシフェラーゼ遺伝子が挿入された16種類のプラスミドベクター36 ngとOpti-MEM I（Invitrogen 、Cat。＃31985-070）1.5 mLを入れたチューブ 1（1 dish反応量）、及び、リポフェクタミン（登録商標）2000 90 uLとOpti-MEM I 1410uLを入れたチューブ2（1 dish反応量）とをそれぞれ室温で5分置いた後、両方のチューブを混合して20分間室温で反応させた。前記混合液をOpti-MEM Iの5 mLのCHO細胞に各3 mLずつ入れ、37℃の培養器（5％CO2）で3時間培養した後、20％FBSを含有しているDMEM培養培地を各ｄｉｓｈに5mLずつ入れて8日間培養した。トランスフェクションした後、2日、4日、6日、8日目に、各ウェルの培地を500 ulずつサンプリングして-20 ℃に保管し、8日目にすべてを溶かして100uLずつ分析プレートに移しELISAを行った。
ELISAは、ヤギ抗ヒトIgGのF（ab'）2 断片と Fcガンマ断片特定（Pierce、31163）を0.2 ug / mLとし、O/ Nコーティングした96ウェルプレートと抗ヒトKappa軽鎖- パーオキシダーゼを用いて4 ℃で行った。
前記ELISA実験によって抗体分泌の程度を測定した結果、図12に示したように、LBFL313遺伝子から由来した配列番号1のアミノ酸配列をコードするSP7.2シグナル配列を含む発現ベクターpCB-Rx71_v5.4で高い分泌を確認することができた。特に、抗体の軽鎖にSP7.2シグナル配列を連結して、抗体重鎖に配列番号3のアミノ酸配列をコードするSP1シグナル配列を連結した組み合わせで分泌量が優れたことを確認しており、培養期間が経つにつれ、より分泌量が増加する効果を確認して、これはSP7.2を用いた場合、短期間に分泌量が優れた前記ルシフェラーゼ分泌実験での結果に比べて、該当組み合わせによって、長期間培養にも分泌量が優れる効果を示すことを確認できた。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更しなくて他の具体的な形で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (19)
- 配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子。
- 前記タンパク質が、内在性タンパク質または外来性タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質分泌因子。
- 前記タンパク質が、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、抗体、免疫グロブリン、サイトカイン、α−、β−及びγ−インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ−活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ホルモン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、エンケファリン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（ＧＨＲＰ）、胸腺体液性因子（ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルクロニダーゼから構成される群から選択されたものである、請求項１に記載のタンパク質分泌因子。
- （ｉ）プロモータ及び（ｉｉ）標的タンパク質をコードする遺伝子に連結された、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む、発現カセット。
- 標的タンパク質をコードする遺伝子に連結された、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む発現カセットを含有する、標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 前記標的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、抗体、免疫グロブリン、サイトカイン、α−、β−及びγ−インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ−活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ホルモン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、エンケファリン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（ＧＨＲＰ）、胸腺体液性因子（ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルクロニダーゼから構成される群から選択されたものである、請求項５に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 標的タンパク質をコードする遺伝子が連結された、配列番号１〜８から構成される群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む発現カセットをさらに含有する、請求項５に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 前記ベクターが、抗体分泌発現用ベクターである、請求項５に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 前記ベクターが、ａ）抗体の軽鎖をコードする遺伝子が連結された、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第一発現カセット； 及び
ｂ）抗体の重鎖をコードする遺伝子が連結された配列番号１〜８から構成される群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコードする核酸配列を含む第２発現カセットを含む、請求項８に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。 - 前記ｂ）のタンパク質分泌因子が、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 前記ａ）のタンパク質分泌因子が、配列番号１のアミノ酸配列からなり、かつ、ｂ）のタンパク質分泌因子が配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 前記抗体の軽鎖が、配列番号４８のアミノ酸配列からなり、かつ、前記抗体の重鎖が配列番号４９のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクター。
- 請求項５〜１２のいずれか１項に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクターを含む、形質転換細胞。
- 前記細胞が、動物細胞である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
- 前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１４に記載の形質転換細胞。
- ｉ）請求項５〜１２のいずれか１項に記載の標的タンパク質分泌発現用ベクターが導入された形質転換細胞を培養して標的タンパク質を発現及び細胞外に分泌させる段階；及び
ｉｉ）前記 ｉ）段階の細胞培養物又は培養上清液から標的タンパク質を回収する段階を含む、標的タンパク質を生成する方法 。 - 回収された標的タンパク質を精製する段階をさらに含む、請求項１６に記載の生産方法。
- 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１６に記載の標的タンパク質を生産する方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをタンパク質分泌因子として使用する方法。
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