JP2023504648A - Ｃｈｏ細胞由来のタンパク質分泌因子及びそれを含む発現ベクター - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質分泌因子、前記タンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセット、前記発現カセットを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体細胞及び前記形質転換体細胞を用いて目的タンパク質を生産する方法に関する。

Description

本発明は、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質分泌因子、前記タンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセット、前記発現カセットを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体細胞及び前記形質転換体細胞を用いて目的タンパク質を生産する方法に関する。
組換えタンパク質は、生体内で収得されにくい有用なタンパク質成分を遺伝子組換え技術を介して微生物または動物細胞システムを用いて大量生産することができる。組換えタンパク質は細胞内で発現させるか、または細胞外に分泌されるように調節することができる。ただし、細胞内発現は不溶性の塊でタンパク質が蓄積することが多く、分離精製の難しさにより生産性が低下する欠点がある。一方、細胞外分泌は、正確なタンパク質折り畳みを有する可溶性タンパク質を容易に収得することができる。したがって、タンパク質の生産収率及び品質管理においてより適合した細胞外分泌のために、最適化された組換えタンパク質発現システムが重要である。
組換えタンパク質生産のために、宿主細胞、目的遺伝子、発現ベクター、選択マーカー、プロモーター、シグナルペプチド配列などの構成要素が必須的に要求される。前記構成要素の選択により、組換えタンパク質の品質及び生産性が異なる。
シグナルペプチドの場合、生産しようとする組換えタンパク質のＮ末端部位に位置して、組換えタンパク質の発現量に関与し、また細胞外に分泌されるようにする構成要素である。どのシグナルペプチドを使用するかによって発現量の差が見られ、またシグナルペプチドが誤切断（mis-cleavage）されてタンパク質のＮ末端にシグナルペプチド配列が一部残って、組換えタンパク質の品質に影響を与えることがある。
したがって、誤切断（mis-cleavage）が起こらず、高発現を誘導することができるシグナルペプチドを選定することが重要である。
一方、従来のシグナルペプチドは、主にヒト由来のシグナルペプチドを用い、発現宿主細胞として主にＣＨＯ細胞を使用している。宿主細胞間シグナルペプチドを併用して用いてもかまわないが、品質の面で問題が生じることもある。
韓国登録特許第１０－１０３８１２６号 韓国公開特許１０－２０１５－０１２５４０２Ａ
Pearson et al （1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 （1984） Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 （1990） Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [Carillo et al.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math （1981） 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358（1979） Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745 J.S Lee et al., 2015, "Site-Specific integration in ＣＨＯ cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway", Sci. Rep., 5
本発明者らは、ＣＨＯ細胞において、発現量を高め、誤切断（mis-cleavage）の問題を解決するために鋭意努力した結果、新規なＣＨＯ細胞由来の１７～３１個のアミノ酸配列からなるポリペプチドであるシグナルペプチドを開発し、前記シグナルペプチドは、顕著に増加した発現量と切断部位（cleavage site）で１００％切断されて誤切断を防止することを確認することによって、本発明を完成した。
本発明の１つの目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子を提供することにある。
本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む、目的タンパク質分泌用発現ベクターを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記発現ベクターが宿主細胞に導入された形質転換体細胞を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む目的タンパク質分泌用発現ベクターを含む形質転換体細胞を培養する段階；及びｉｉ）前記培養された細胞の培養物または培養上清液から目的タンパク質を回収する段階を含む、目的タンパク質を生産する方法を提供することにある。
本発明のタンパク質分泌因子、すなわちシグナルペプチドは、高発現を通じて組換えタンパク質の生産性を著しく増大させることができ、切断部位（cleavage site）で１００％切断されることにより、従来のシグナルペプチドの誤切断（mis-cleavage）問題を解決する強力な遺伝子ツールとして用いられると期待される。
ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 ＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いてシグナルペプチド（Signal Peptide）を予測した図である。 仮発現を介したシグナルペプチド（Signal Peptide）－ｍＣｈｅｒｒｙの発現量を確認した図である。 位置特異的（Site Specific）Integration用ベクターマップ（Vector Map）を示した図である。 位置特異的に組み込まれた（Site Specific Integration）細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現量を比較した図である。 ＳＰ７．２とＣｌｕｓ ｆｕｓｉｏｎされたａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体の切断を確認したＭａｓｓデータを示した図である。 ＳＰ７．２とＣｌｕｓ ｆｕｓｉｏｎされたａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体の切断を確認したＭａｓｓデータを示した図である。 ＳＰ７．２とＣｌｕｓ ｆｕｓｉｏｎされたａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体の切断を確認したＭａｓｓデータを示した図である。
これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本発明で開示された様々な要素の全ての組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記載される具体的な記述によって本出願のカテゴリが制限されると見ることはできない。
さらに、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、そのような等価物は本発明に含まれることが意図される。
前記目的を達成するための本発明の１つの様態は、ＣＨＯ細胞由来の新規なタンパク質分泌因子を提供する。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子を提供する。より具体的には、配列番号１、配列番号２、または配列番号３であってもよいが、これに制限されない。
本発明の「タンパク質分泌因子」は、目的タンパク質と連結されて目的タンパク質が細胞外に分泌されるように誘導する因子を意味し、ポリペプチドからなっていてもよい。前記タンパク質分泌因子は、目的タンパク質、すなわち内在タンパク質及び／または外来タンパク質の分泌を促進するものであってもよく、特に抗体の軽鎖及び／または重鎖の細胞外分泌を促進させるものであってもよいが、これに制限されない。
本発明で前記タンパク質分泌因子は、「シグナル配列」または「シグナルペプチド（ signal peptide；ＳＰ）」と混用してもよい。
本発明のタンパク質分泌因子は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有するものであってもよいが、これに制限されない。また、本発明のタンパク質分泌因子は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
本発明の具体的な一具現例で、前記タンパク質分泌因子はＣＨＯ細胞由来であってもよいが、これに制限されない。本発明の「ＣＨＯ細胞」は、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）細胞であり、当業界で通常に用いられる形質転換用宿主細胞であってもよい。また、宿主細胞であるＣＨＯ細胞で発現量を高めるために、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質分泌因子を選定してもよい。
本発明で配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、カテプシンＢ（Cathepsin B；Ｃａｔ）であってもよく、本発明でＣａｔ分泌配列と混用してもよい。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン（C-C motif chemokine；ＣＣ）であってもよく、本発明でＣＣ分泌配列と混用してもよい。配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、ヌクレオビンジン－２(Nucleobindin-2；Ｎｕｃ)であってよく、本発明でＮｕｃ分泌配列と混用してもよい。
さらに、本発明の配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、クルステリン（Clusterin；Ｃｌｕｓ）であってもよく、本発明でＣｌｕｓ分泌配列と混用してもよい。配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、色素上皮誘導因子（Pigment epithelium-derived factor；Ｐｉｇ）であってもよく、本発明でＰｉｇ分泌配列と混用してもよい。配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼエンハンサー１(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1；Ｐｒｏｃｏ)であってもよく、本発明でＰｒｏｃｏ分泌配列と混用してもよい。配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、スルフヒドリルオキシダーゼ（Sulfhydryl oxidase；Ｓｕｌｆ）であってもよく、本発明でＳｕｌｆ分泌配列と混用してもよい。配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、脂質タンパク質リパーゼ（Lipoprotein lipase；Ｌｉｐ）であってもよく、本発明でＬｉｐ分泌配列と混用してもよい。配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、ニドゲン－１（Nidogen-1；Ｎｉｄ）であってもよく、本発明でＮｉｄ分泌配列と混用してもよい。配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（Protein disulfide-isomerase；Ｐｒｏ）であってもよく、本発明でＰｒｏ分泌配列と混用してもよい。
前記配列番号１のアミノ酸配列からなるカテプシンＢ（Cathepsin B）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣ－Ｃモチーフケモカイン（C-C motif chemokine）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１２のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号３のアミノ酸配列からなるヌクレオビンジン－２（Nucleobindin-2）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１３のポリヌクレオチド配列であってもよい。
また、前記配列番号４のアミノ酸配列からなるクルステリン（Clusterin）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１４のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号５のアミノ酸配列からなる色素上皮誘導因子（Pigment epithelium-derived factor；Ｐｉｇ) シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１５のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号６のアミノ酸配列からなるプロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼエンハンサー１(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1；Ｐｒｏｃｏ）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１６のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号７のアミノ酸配列からなるスルフヒドリルオキシダーゼ（Sulfhydryl oxidase；Ｓｕｌｆ）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１７のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号８のアミノ酸配列からなる脂質タンパク質リパーゼ（Lipoprotein lipase；Ｌｉｐ）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号９のアミノ酸配列からなるニドゲン－１（Nidogen-1；Ｎｉｄ）シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列であってもよく、配列番号１０のアミノ酸配列からなるプロテインジスルフィドイソメラーゼ（Protein disulfide-isomerase；Ｐｒｏ)シグナルペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号２０のポリヌクレオチド配列であってもよい。
本発明のタンパク質分泌因子は、「特定配列で構成された分泌因子」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなる分泌因子と同一または相応する活性を有する場合であれば、当該配列の前後の無意味な配列の追加または自然的に起こり得る突然変異、あるいはそのサイレント変異（silent mutation）を除外するものではなく、そのような配列の追加または突然変異を有する場合であっても、本願の範囲に属することは自明である。
その例として、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子と同一または相応にシグナルペプチドとして作用することができれば、前記配列と８５％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、よりさらに具体的には９９％以上の相同性及び／または同一性を示す塩基配列も制限なく含んでもよい。また、その相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も本発明の範囲内に含まれることは自明である。
本発明の「相同性」または「同一性」は２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と互いに関連する程度を意味し、百分率として表してもよい。前記用語、相同性及び同一性はしばしば相互交換的に用いられてもよい。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定され、使用されるプログラムによって確立されたデフォルトギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一の（identical）配列は、一般的に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に沿った中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリダイズしてもよい。ハイブリダイズ化は、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献１と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献２）（バージョン５.０.０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン－ウンシュ（Needleman－Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５～7を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献８に公知されたように、例えば、非特許文献３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献９に開示されたように、非特許文献１０の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で使用されるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
本発明のまた他の様態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを提供する。
本発明の「タンパク質分泌因子」は前記記載の通りである。
本発明の「目的タンパク質」は、宿主細胞に内在的に発現されるタンパク質であるか、または外来で導入された遺伝子によって発現されるタンパク質であってもよく、本発明のシグナルペプチド配列により細胞外分泌効率が増進される限り、制限されない。
前記目的タンパク質は、抗体、抗体断片（ＦａｂまたはＳｃＦｖ）、融合タンパク質（Fusion Protein）、足場タンパク質（Protein Scaffold）、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、α- 、β-またはγ-インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ホルモン、カルシトニン(calcitonin)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(Calcitonin Gene Related Peptide、ＣＧＲＰ)、エンケファリン(enkephalin)、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、成長分化因子(Growth differentiation factor)、細胞接着タンパク質（Cell adhesion protein）、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（growth hormone releasing peptide；ＧＨＰＲ）、胸腺体液性因子（thymic humoral factor；ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルコロニダーゼであってもよく、具体的には、抗体の重鎖または軽鎖タンパク質であってもよいが、これに制限されない。
本発明の「作動可能に連結」は、本発明のタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列及びプロモーター配列が目的タンパク質をコードする遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列及びシグナルペプチド配列が 機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、位置特異的ＤＮＡ連結は当業界の連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本発明の「発現カセット」は、１つ以上の遺伝子及びそれらの発現を調節する配列、例えば様々なｃｉｓ作用転写調節要素の任意の組み合わせを含む核酸配列を意味する。本発明の発現カセットには、タンパク質分泌因子及び目的タンパク質をコード化する核酸配列だけではなく、発現調節に必要であると当業界で認められる様々な要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの核酸配列をさらに含むものであってもよい。遺伝子の発現、すなわち、その転写及びその転写生産物の発現を調節する配列は、通常、調節ユニット（unit）と称する。調節ユニットの大部分は、目的遺伝子のコード配列の上流に作動可能に連結されて位置する。さらに、前記発現カセットは、３’末端にポリアデニル化（poly-adenylation）部位を含む３’非翻訳領域（3' non-transcriptional region ）を含んでもよい。
本発明の発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結されて、宿主細胞で目的タンパク質を細胞外に分泌発現するポリヌクレオチドの組み合わせであってもよい。
本発明のまた他の様態は、タンパク質分泌因子をコード化する核酸配列である配列番号１１～配列番号２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを提供する。
本発明の「タンパク質分泌因子」、「目的タンパク質」、「作動可能に連結」及び「発現カセット」は、前記記載の通りである。
本発明で配列番号１１のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、カテプシンＢ（Cathepsin B；Ｃａｔ）であってもよく、配列番号１２のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン（C-C motif chemokine；ＣＣ）であってもよく、配列番号１３のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、ヌクレオビンジン－２(Nucleobindin-2；Ｎｕｃ)であってよく、配列番号１４のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、クルステリン（Clusterin；Ｃｌｕｓ）であってもよく、配列番号１５のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、色素上皮誘導因子（Pigment epithelium-derived factor；Ｐｉｇ）であってもよく、配列番号１６のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼエンハンサー１(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1；Ｐｒｏｃｏ)であってもよく、配列番号１７のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、スルフヒドリルオキシダーゼ（Sulfhydryl oxidase；Ｓｕｌｆ）であってもよく、配列番号１８のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、脂質タンパク質リパーゼ（Lipoprotein lipase；Ｌｉｐ）であってもよく、配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、ニドゲン－１（Nidogen-1；Ｎｉｄ）であってもよく、配列番号２０のポリヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質分泌因子は、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（Protein disulfide-isomerase；Ｐｒｏ）であってもよい。
本発明のまた他の様態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む、目的タンパク質分泌用発現ベクターを提供する。
本発明の「タンパク質分泌因子」、「目的タンパク質」、「作動可能に連結」及び「発現カセット」は、前記記載の通りである。
本発明の「目的タンパク質分泌用発現ベクター」は、タンパク質分泌因子と目的タンパク質をコード化する遺伝子が作動可能に連結され、当該ベクターを宿主細胞に導入した後、発現する時に目的タンパク質の細胞外分泌を誘導する発現ベクターを意味する。
本発明の「発現ベクター」は、目的タンパク質をコード化するＤＮＡ（目的ＤＮＡ）の断片が挿入されたキャリア（Carrier）として、一般的に二本鎖のＤＮＡ断片を意味する。当業界でタンパク質を発現するために用いられる発現ベクターは、制限なく用いてもよい。前記発現ベクターは、宿主細胞内にあれば、宿主染色体のＤＮＡとは無関係に複製することができ、挿入された目的ＤＮＡが発現されることができる。宿主細胞で形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主細胞内で機能を発揮する転写及び解読調節配列に作動可能に連結されなければならない。
本出願で用いられる発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよく、具体的には、ｐＴＺ系ベクターであってもよいが、これに制限されない 。
本発明の具体的な一具現例で、ｐＴｚ－Ｄ１Ｇ１ベクタ―(特許文献１のプロモーターを含む変形体)に基づいて、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列と生産しようとする目的タンパク質をコード化する遺伝子とを作動可能に連結して、目的タンパク質分泌用発現ベクターを製造した（実施例４）。
前記発現ベクターは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列をさらに含んでもよい。
本発明のまた他の様態は、前記発現ベクターが宿主細胞に導入された形質転換体細胞を提供する。
本発明の「発現ベクター」は前記記載の通りである。
本発明の「形質転換」は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることをいう。
形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含む。また、前記ポリヌクレオチドは目的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当該分野で公知のように適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、パーティクルガン（particle bombardment）、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、 塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、 ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法であってもよく、具体的には、電気穿孔法（electroporation）であってもよいが、これに制限されない。
本発明の「宿主細胞」は、本発明のタンパク質分泌因子の活性を有する核酸分子が導入されてシグナルペプチドで作動することができる真核細胞をいう。前記宿主細胞は、例えば、酵母などの周知の真核宿主であってもよく、スポドプテラ・フルギペルダなどの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０などの動物細胞などであってもよいが、これに制限されない。
本発明において宿主細胞は、その例として動物宿主細胞であってもよく、具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary cell、ＣＨＯ細胞）であってもよいが、これに制限されない。
本発明の具体的な一具現例では、前記宿主細胞として組換えタンパク質生産に広く用いられているＣＨＯ細胞を用いた（実施例４）。
本発明の「形質転換体」は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド及び目的タンパク質を含む発現ベクターを前記宿主細胞であるＣＨＯ細胞内に導入して形質転換された動物細胞をいう。
本発明の具体的な一具現例で、前記形質転換体は目的タンパク質の抗体であるペムブロリズマブ（pembrolizumab）の軽鎖及び重鎖の発現量が増大することを確認した（実施例４）。
本発明のまた他の様態は、ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む目的タンパク質分泌用発現ベクターを含む形質転換体細胞を培養する段階；及びｉｉ）前記培養された細胞の培養物または培養上清液から目的タンパク質を回収する段階を含む、目的タンパク質を生産する方法を提供する。
本発明の「タンパク質分泌因子」、「目的タンパク質」、「作動可能に連結」、「発現カセット」、「目的タンパク質分泌用発現ベクター」、「宿主細胞」及び「形質転換体」は、前記記載の通りである。
本出願の「培養」は、前記形質転換体細胞を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明でＣＨＯ細胞を宿主細胞として用いて目的タンパク質を製造する方法は、当業界に周知の方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは繰り返し注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式に培養してもよいが、これに制限されない。
本発明の培養に用いられる培地は適切な方法で特定菌株の要件を果たさなければならない。用いられる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、グルコン酸、酢酸、ピルビン酸などの有機酸が含まれてもよいが、これに制限されない。これらの物質は個別にまたは混合物として用いてもよい。
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。窒素源も個別にまたは混合物として用いてもよい。
用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これに制限されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体を用いてもよい。前記の原料は、培養過程で培養物に適切な方法により、回分式または連続式で添加されてもよい。
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物またはリン酸または硫酸などの酸化合物を適切な方法で培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入してもよい。培養物の温度は、普通、２０℃～４５℃、具体的には、２５℃～４０℃であってもよいが、条件に応じて変更可能であるが、これに制限されない。
本発明の具体的な一具現例では、組換え発現ベクターｐＣＢ－ＳＰ７．２－Ｐｅｍ、ｐＣＢ－Ｃｌｕｓ－Ｐｅｍ、ｐＣＢ－Ｐｉｇ－Ｐｅｍ及びｐＣＢ－ＣＣ－Ｐｅｍを宿主細胞であるＣＨＯ細胞(ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（登録商標）細胞)に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＨＯ発現培地）３０ｍＬで１２日間バッチ工程（Fed-Batch culture）で培養した（実施例４）。
本発明の目的タンパク質を製造する方法は、培養物から目的タンパク質を回収する段階を含んでもよい。本発明の「回収」は、培養物から目的タンパク質を収得することであり、当業界に知られている方法、例えば、遠心分離、ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよいが、これに制限されない。
前記回収段階は精製工程を含んでもよく、当業者は公知のいくつかの精製工程の中から必要に応じて選択して活用してもよい。例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、受容体親和性クロマトグラフィー、疎水性作用クロマトグラフィー、レクチン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣなどを含む従来のクロマトグラフィー方法によって宿主細胞の培養物または培養上清液から分離してもよい。また、所望のタンパク質が特異的タグ、ラベルまたはキレート部分を有する融合タンパク質である場合、特異的結合パートナーまたは製剤によって精製する方法がある。精製されたタンパク質は、分泌因子などが除去されるなど、所望のタンパク質部分に切断されるか、またはそれ自体のままで残っていてもよい。融合タンパク質の切断による切断過程で追加のアミノ酸を有する所望のタンパク質形態が作られてもよい。
本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子は、目的タンパク質のＮ末端切断部位で正確に切断される分泌因子であってもよい。
シグナルペプチドは、生産したい組換えタンパク質のＮ末端部位に位置し、目的タンパク質が分泌（translocation）されると、シグナルペプチド分解酵素（signal peptidase）によって分解される。しかしながら、既存のタンパク質分泌因子は、しばしば誤切断（mis-cleavage）問題のために目的タンパク質の品質（quality）を低下させる可能性がある。前記「誤切断」は、シグナルペプチドが正確な位置で完全に分解されず、目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチド配列が一部残っていることをいう。
本発明の具体的な一具現例で、精製された目的タンパク質をＱ－ＴＯＦ ＭＳ質量分析計を用いてタンパク質分泌因子（Signal Peptide）の切断の有無を確認した。その結果、予測した切断部位(Cleavage Site)で１００％切断(cleavage)されることを確認した。
したがって、本発明のタンパク質分泌因子（Signal Peptide；シグナルペプチド）を含む発現ベクターは、組換えタンパク質の効率的な発現及び分泌を介して目的タンパク質の生産性を増大させ、誤切断（mis-cleavage）問題を解決する強力な遺伝子ツールになりうる。
以下、実施例を通じてより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ＣＨＯ細胞由来の新規シグナルペプチド配列の製造
１－１. ＣＨＯ ＨＣＰ Ｍａｓｓ分析
トリプシン(trypsin)処理したＣＨＯ細胞(ＤＸＢ１１)培養液に、次のように４種類(ＡＤＨ、ＢＳＡ、ＰＨＯ、ＥＮＬ)のＭａｓｓＰＲＥＰＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｓｔａｎｄａｒｄを入れた。４種類のＭａｓｓＰＲＥＰＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｓｔａｎｄａｒｄのうち、ＰＨＯを各ＨＣＰ（Host Cell Protein）の濃度を計算するための内部標準物質（Internal Standard）として用いた。各試料は、２Ｄ ＬＣ（ｈｉｇｈ ｐＨ ＲＰ／Ｌｏｗ ｐＨ ＲＰ）－Ｑ－ＴＯＦ（ＵＤＭＳｅ）方法により宿主細胞タンパク質(Host cell protein；ＨＣＰ)を分析した。
２ＤカラムからＱ－ＴＯＦ ＭＳに直接注入（injection）し、各フラクションごとにＭＳデータ（ＵＤＭＳｅ）を収得した。前記方法で収得した１０個のフラクションのＭＳデータ（ＵＤＭＳｅ）は、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ（ＰＬＧＳ、Ｖｒ. ３．０.２）ソフトウェアを用いて１つのデータにｍｅｒｇｅした。その後、各試料のｍｅｒｇｅｄデータとチャイニーズハムスタータンパク質データベースを用いてＨＣＰをＩＤし、ＰＨＯを内部標準物質として用いて各ＨＣＰの濃度を求めた。
１－２. ＣＨＯ ＨＣＰデータからシグナルペプチドの選定
ＨＣＰ濃度が高い順に配列し、各タンパク質のアミノ酸配列をＣＨＯゲノムデータベース（http://chogenome.org）で確認した。得られたアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ４．１サーバ（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）に入力し、分泌タンパク質（Secretion Protein）の有無及びシグナルペプチド（Signal Peptide）配列を予測した（表１、図１及び表４）。
Figure 2023504648000002
実施例２．仮発現によるＣＨＯ由来の高効率シグナルペプチド（Signal Peptide）の選定
２－１. 仮発現用組換えタンパク質発現ベクターの製作
実施例１で選定された１０種のシグナルペプチド（Signal Peptide）が汎用の分泌因子として利用できるかどうかを確認するために、目的タンパク質としてｍＣｈｅｒｒｙ（pmCherry Vector, Clontech, 632522）タンパク質を選定した。
前記ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドの配列は表２の通りである。
Figure 2023504648000003
前記ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子を基づいて、ＣＨＯ ＨＣＰ Ｍａｓｓデータから確認したシグナルペプチド（Signal Peptide）配列とＫｐｎＩ／ＸｈｏＩが含まれたプライマー（Primer）でそれぞれＰＣＲして、前記１０種類のシグナルペプチド（Signal Peptide）配列によって発現されるｍＣｈｅｒｒｙを製作した。
シグナルペプチド（Signal Peptide）の長さが長い場合には、プライマー（Primer）を２つに分けて２回にわたってＰＣＲを行った。前記１０種類のシグナルペプチド(Signal Peptide)配列が含まれたｍＣｈｅｒｒｙ ＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断(Cut)してｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen, Cat. No. V790-20）にクローニング(Cloning)して、発現ベクターを製作した。
また、陽性対照群 （Positive Control）として用いるために、既存の公知の分泌因子であるＳＰ７．２シグナルペプチド（特許文献２）が融合されたｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現ベクターを同様の方法で製造した。前記ＳＰ７．２シグナルペプチドの配列は表３の通りである。
Figure 2023504648000004
Figure 2023504648000005
Figure 2023504648000006
Figure 2023504648000007
Figure 2023504648000008
Figure 2023504648000009
Figure 2023504648000010
２－２.仮発現
１０種類のシグナルペプチド（Signal Peptide）から発現されるｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターのそれぞれを、ＣＨＯ－Ｓ細胞株Ａｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従ってトランスフェクション（１ｍＬ）を進行した。その後、２日目と６日目に細胞内蛍光と培養液から分泌された蛍光タンパク質の蛍光値を測定した（図３）。
細胞内蛍光の場合、ＦＡＣＳ（Accuri）を用いて陰性対照群（Negative control；共ベクター、ｐＭａｘＧＦＰ）より高い部分のヒストグラムで平均値で測定した。
培養液に分泌された蛍光タンパク質の蛍光値の場合は、２日目と６日目に１００ｕｌをサンプリングした後、遠心分離(centrifugation)して上清液（supernatant）のみを収得し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５８７／６１０ｎｍでマルチ分析機(Multiple Reader)を用いて測定した。
前記培養液で測定された蛍光値の高いシグナルペプチド（Signal Peptide）は、Ｃａｔ、ＣＣ、Ｎｕｃ、Ｃｌｕｓ、Ｐｉｇであることを確認し、陽性対照群ＳＰ７．２より高い発現を示した分泌因子４種類（Ｃｌｕｓ、Ｐｉｇ、Ｎｕｃ、ＣＣ）と陽性対照群（positive control）として用いられるＳＰ７．２との細胞内で蛍光値の高いシグナルペプチド１種類（Proco）を陰性対照群（negative control）に選定した。
実施例３. 位置特異的に組み込み（Site-Specific Integration）による発現の比較
３－１. 位置特異的に組み込みのための発現ベクターの製作
前記実施例２で選定された５種類のシグナルペプチド（Ｃｌｕｓ、Ｐｉｇ、Ｎｕｃ、ＣＣ、Ｐｒｏｃｏ）及び対照群であるＳＰ７．２を含むｍＣｈｅｒｒｙ配列をＣＨＯゲノムの特定位置に同一に挿入して定量的に発現量を比較した（図４及び図５）。
挿入位置はＨｐｒｔ Ｓｉｔｅと定められ、非特許文献１１を参照して、ホモロジーアーム（Homology Arm）配列及びｓｇＲＮＡ配列を設計した。
５’ホモロジーアームの場合、ＣＨＯ－Ｓゲノムを鋳型（Template）としてＢｇ１ＩＩとＮｒｕＩＥｎｚｙｍｅ Ｓｉｔｅが含まれたプライマー（Primer）を用いてＰＣＲした後、Ｂｇ１ＩＩ／ＮｒｕＩでＤｉｇｅｓｔｉｏｎしたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Vector）にクローニング（Cloning）した。
３’ホモロジーアームの場合、同様にＣＨＯ－Ｓゲノムを鋳型（Template）としてＳａｌＩ Ｓｉｔｅがそれぞれ含まれたプライマー（Primer）でＰＣＲした後、５’ホモロジーアームが挿入されたベクター（Vector）とともにＳａｌＩシングルカット（Single Cut）し、ＮｅｏＲ遺伝子下流（NeoR Gene Downstream）側にクローニングした（ｐｃＤＮＡ３．１_ｈｐｒｔ）。
相同組換え（Homology Recombination）されてゲノム上に挿入されたものだけを確認するために、二重選択のため５’ホモロジーアーム上流（5'Homology Arm Upstream）部分にＣｍｙ－ＧＦＰ－ＢＨＧ ｐＡフラグメントを製作し、ＳｐｅＩとＢｇ１ＩＩで挿入した(ｐｃＤＮＡ３．１_Ｇ_ｈｐｒｔ)。
ＧＦＰフラグメントの場合、まずｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにＮｃｏＩ／ＸｂａＩでＭＣＳに挿入した後、ＳｐｅＩとＢｇ１ＩＩ制限部位が含まれたプライマー(Primer)を用いてＰＣＲした後、ホモロジーが含まれたベクター（ｐｃＤＮＡ_ｈｐｒｔ）にＳｐｅＩとＢｇ１ＩＩＳｉｔｅを用いて挿入した。
完成したｐｃＤＮＡ３．１_Ｇ_ｈｐｒｔベクターを用いてシグナルペプチド(Signal Peptide)配列が含まれたｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子配列をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断(Cut)してＭＣＳ部分に挿入した。
その結果、ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ｐＡ－５’Ｈｐｒｔホモロジーアーム－ＣＭＶ－シグナルペプチド候補－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＢＧＨ ｐＡ－ＮｅｏＲ 選択マーカーカセット－３’Ｈｐｒｔホモロジーアーム形態の発現カセットが含まれたｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクターを製作した。
３－２.位置特異的(Site-Specific) 組み込み
前記で製作した６種類の位置特異的組み込み用ベクターをＣＨＯ－Ｓゲノム内のＨｐｒｔ Ｓｉｔｅに挿入するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてノックイン（Knock In）した。ｓｇＲＮＡ ２４０ｎｇ、ｃａｓ９タンパク質 １２５０ｎｇ、ドナーベクター１μgをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液と混合して、５０μｌの混合物（Mixture）をそれぞれ製造した。
ＣＨＯ－Ｓ １×１０６細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ５０μｌに入れて先に製作した混合物と混ぜた後、最終１００μｌを電気穿孔法(Electrophoration)を進行した。
電気穿孔法（Electrophoration）を行った後、０．５ｍｌ培地と混ぜた後、２．５ｍｌ培地に添加し、６ウェルプレート（well plate）で３６．５℃、ＣＯ２ ５％の条件で培養した。
２日後、Zeneticin（０．５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＣＤ ＣＨＯ培地でセレクション（Selection）を行った後、生存率（Viability）が９０％回復するまで継代培養を行った。
生存率９０％回復後、３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬでセル濃度を合わせて６ウェルにそれぞれ４ｍＬをＤｕｐｌｉｃａｔｅで培養し、２～３日間隔でＶｉ－Ｃｅｌｌ測定及び培地蛍光値（５８７ｎｍ／６１０ｎｍ）を測定した（図５）。
その結果、ＣＣ、Ｃｌｕｓ、Ｐｉｇ分泌配列が対照群であるＳＰ７．２より高く発現されることを確認した。
実施例４．Ａｎｔｉ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ発現及びＭａｓｓ分析
４－１. Ａｎｔｉ ＰＤ１抗体生産のための発現ベクターの製作
位置特異的組み込み（Site Specific Integration）を介してシグナルペプチド（Signal Peptide）の発現能を比較した後、発現の高いＣＣ、Ｃｌｕｓ、Ｐｉｇを含む４種類のシグナルペプチド（Signal Peptide；（ＣＣ、Ｐｉｇ、Ｃｌｕｓ、ＳＰ７．２））が融合したＡｎｔｉ－ＰＤ－１抗体を発現させた。目的タンパク質としては、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｓｕｍａｂ（Keytruda（登録商標））抗体配列を用いた。
軽鎖（Light Chain）と重鎖（Heavy Chain）のアミノ酸配列と一致するＤＮＡ配列を合成した後、オーバーラップＰＣＲにより各シグナルペプチド（Signal Peptide）配列と融合した形態の配列を製作した。
前記軽鎖(Light Chain)の場合はＢａｍＨＩとＸｈｏＩで、重鎖(Heavy Chain)の場合はＡｓｃＩとＮｏｔＩで制限酵素切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）の変異体であるｐＴｚ－Ｄ１Ｇ１ベクター (特許文献１のプロモーターを含む）に挿入した。
ｐＣＢ_ＳＰ７．２_Ｐｅｍ
’（Ｎ末端)－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド(配列番号３３)－Ｐｅｍ軽鎖(配列番号５８)－ＸｈｏＩ制限部位］－（Ｃ末端）’／’（Ｎ末端）－［ＡｓｃＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号３３） － Ｐｅｍ重鎖（配列番号５９）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ末端）’
ｐＣＢ_Ｃｌｕｓ_Ｐｅｍ
’（Ｎ末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号４）－Ｐｅｍ軽鎖（配列番号５８）－ＸｈｏＩ制限部位］－（Ｃ末端）’／’（Ｎ末端）－［ＡｓｃＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号４）－Ｐｅｍ重鎖（配列番号５９）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ末端）’
ｐＣＢ_ＣＣ_Ｐｅｍ
’（Ｎ末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号２）－Ｐｅｍ軽鎖（配列番号５８）－ＸｈｏＩ制限部位］－（Ｃ末端）’／’（Ｎ末端）－［ＡｓｃＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号２）－Ｐｅｍ重鎖（配列番号５９）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ末端）’
ｐＣＢ_Ｐｉｇ_Ｐｅｍ
’（Ｎ末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号５）－Ｐｅｍ軽鎖（配列番号５８）－ＸｈｏＩ制限部位］－（Ｃ末端）’／’（Ｎ末端）－［ＡｓｃＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号５）－Ｐｅｍ重鎖（配列番号５９）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ末端）’
４－２. Ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体の発現
前記準備した組換え発現ベクターｐＣＢ－ＳＰ７．２－Ｐｅｍ、ｐＣＢ－Ｃｌｕｓ－Ｐｅｍ、ｐＣＢ－Ｐｉｇ－Ｐｅｍ及びｐＣＢ－ＣＣ－ＰｅｍをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（登録商標）細胞(Thermo Fisher Scientific)に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地(Thermo Fisher Scientific；３０ｍＬ）で１２日間培養（Fed－Batch Culture；Ｄａｙ １＆Ｄａｙ ５添加）して、前記融合ポリペプチドＰｅｍｂｒｏｌｉｓｕｍａｂを発現させた。
４－３. Ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体の精製及びＭａｓｓ分析
前記組換えベクター発現によって生産された融合ポリペプチドをＰｒｏｔｅｉｎＡ精製した。具体的には、回収した培養液は０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＡレジンがパッキングされているカラム(Hitrap MSS, GE Healthcare, 11-0034-93)をＡＫＴＡ（登録商標） Ａｖａｎｔ２５(GE Healthcare Life Sciences)に装着し、ＰＢＳバッファーを流して、カラム（colum）を平衡化した。
前記ろ過した培養液をカラム（colum）に注入した後、再びＰＢＳバッファーを流し、カラム（colum）を洗浄した。前記カラム（colum）の洗浄作業が終了した後、溶出バッファー（Citrate Buffer、ｐＨ ３．５）をカラム（colum）に流して目的タンパク質を溶出させた。溶出液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ ３０Ｋ、Merck）と遠心分離機を用いて濃縮を行った後、ＰＢＳでバッファー交換を行った。
融合ポリペプチドの定量分析は、ＵＶ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（G113A、Agilent Technologies）で２８０ｎｍ及び３４０ｎｍの吸光度を測定し、下記計算式により行った。各物質の吸光係数は、アミノ酸配列を用いて理論的に計算された値（１．４０４）を用いた。
Figure 2023504648000011
 （*Extinction Coefficient（０．１％）：タンパク質の濃度が０．１％（１g／Ｌ）であり、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ上のすべてのシステイン（Cysteine）が酸化されてジスルフィド結合（Disulfide bond）を形成すると仮定する時、２８０ｎｍでの理論的な吸光度である。ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ（https://web.expasy.org/protparam/）により計算された。）
精製された目的タンパク質は、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳを用いて、タンパク質のＮ Ｔｅｒｍ部分でシグナルペプチド（Signal Peptide）の誤切断（mis-cleavage）を確認した（図６）。１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、ＰＮＧａｓｅＦを処理し、６Ｍ グアニジンとＤＴＴを処理した後、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ（ＲＭＭ－ＭＴ－００１：ACQUITY UPLC+Q-TOF SYNAPT G2（Waters））にロードした。
その結果、予測された切断部位（cleavage site）で１００％切断（cleavage）されることを確認した。
これにより、本発明のＣＨＯ細胞由来タンパク質分泌因子であるシグナルペプチドは、組換えタンパク質の発現量を増加させて生産性を向上させ、質量（Ｍａｓｓ）分析を通じて予測した切断部位（cleavage site）で１００％切断（cleavage）されることを確認することで、既存のタンパク質分泌因子の問題である誤切断（mis-cleavage）を解決することができる強力な遺伝子ツールになりうることを示唆する。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、制限的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (19)

  1. 配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子。
  2. 前記タンパク質が、内在タンパク質または外来タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質分泌因子。
  3. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセット。
  4. 前記目的タンパク質が、抗体、抗体断片（ＦａｂまたはＳｃＦｖ）、融合タンパク質（Fusion Protein）、足場タンパク質（Protein Scaffold）、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、α- 、β-またはγ-インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ホルモン、カルシトニン(calcitonin)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(Calcitonin Gene Related Peptide、ＣＧＲＰ)、エンケファリン(enkephalin)、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、成長分化因子(Growth differentiation factor)、細胞接着タンパク質（Cell adhesion protein）、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（growth hormone releasing peptide；ＧＨＰＲ）、胸腺体液性因子（thymic humoral factor；ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルコロニダーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の発現カセット。
  5. 前記配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５である、請求項３に記載の発現カセット。
  6. 前記発現カセットが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子のいずれか１つをコード化する核酸配列をさらに含むものである、請求項３に記載の発現カセット。
  7. 前記発現カセットが、細胞内で発現される時、分泌因子をコード化する核酸配列が除去された付加的アミノ酸が追加されていない目的タンパク質のまま発現するものである、請求項３に記載の発現カセット。
  8. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む、目的タンパク質分泌用発現ベクター。
  9. 前記目的タンパク質が、抗体、抗体断片（ＦａｂまたはＳｃＦｖ）、融合タンパク質（Fusion Protein）、足場タンパク質（Protein Scaffold）、ヒト成長ホルモン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、α- 、β-またはγ-インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ホルモン、カルシトニン(calcitonin)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(Calcitonin Gene Related Peptide、ＣＧＲＰ)、エンケファリン(enkephalin)、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、成長分化因子(Growth differentiation factor)、細胞接着タンパク質（Cell adhesion protein）、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノーゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（growth hormone releasing peptide；ＧＨＰＲ）、胸腺体液性因子（thymic humoral factor；ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及びグルコロニダーゼからなる群から選択されるものである、請求項８に記載の発現ベクター。
  10. 前記配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５である、請求項８に記載の発現ベクター。
  11. 前記発現ベクターが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子のいずれか１つをコード化する核酸配列をさらに含むものである、請求項８に記載の発現ベクター。
  12. 前記発現ベクターが、細胞内で発現される時、分泌因子をコード化する核酸配列が除去された付加的アミノ酸が追加されていない目的タンパク質のまま発現するものである、請求項８に記載の発現ベクター。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載の発現ベクターが宿主細胞に導入された形質転換体細胞。
  14. 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項１３に記載の形質転換体細胞。
  15. ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子をコード化する核酸配列；及び目的タンパク質をコード化する遺伝子；が作動可能に連結された発現カセットを含む、目的タンパク質分泌用発現ベクターを含む形質転換体細胞を培養する段階；及び
    ｉｉ）前記培養された細胞の培養物または培養上清液から目的タンパク質を回収する段階を含む、目的タンパク質を生産する方法。
  16. 前記回収した目的タンパク質を精製する段階をさらに含むものである、請求項１５に記載の目的タンパク質を生産する方法。
  17. 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項１５に記載の目的タンパク質を生産する方法。
  18. 前記配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質分泌因子が、前記目的タンパク質のＮ末端の切断部位で切断されるものである、請求項１５に記載の目的タンパク質を生産する方法。
  19. 前記目的タンパク質が、タンパク質分泌因子をコード化する核酸配列が除去された付加的アミノ酸が付加されていない目的タンパク質自体である、請求項１５に記載の目的タンパク質を生産する方法。
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