KR20210069001A - Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 - Google Patents

Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR20210069001A
KR20210069001A KR1020200165910A KR20200165910A KR20210069001A KR 20210069001 A KR20210069001 A KR 20210069001A KR 1020200165910 A KR1020200165910 A KR 1020200165910A KR 20200165910 A KR20200165910 A KR 20200165910A KR 20210069001 A KR20210069001 A KR 20210069001A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
seq
ser
gly
glu
Prior art date
Application number
KR1020200165910A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102559048B1 (ko
Inventor
민병은
김연철
박영삼
정샘
Original Assignee
주식회사 엘지화학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지화학 filed Critical 주식회사 엘지화학
Publication of KR20210069001A publication Critical patent/KR20210069001A/ko
Priority to KR1020230094054A priority Critical patent/KR102680148B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102559048B1 publication Critical patent/KR102559048B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4728—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/03—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with oxygen as acceptor (1.8.3)
    • C12Y108/03002—Thiol oxidase (1.8.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01034—Lipoprotein lipase (3.1.1.34)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22001—Cathepsin B (3.4.22.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 CHO 세포 유래 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체 세포 및 상기 형질전환체 세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

CHO 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 {CHO cells-derived protein secretory factors and expression vectors comprising the same}
본 발명은 CHO 세포 유래 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체 세포 및 상기 형질전환체 세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질은 생체 내에서 수득하기 어려운 유용한 단백질 성분을 유전자 재조합 기술을 통해 미생물이나 동물세포 시스템을 이용하여 대량생산할 수 있다. 재조합 단백질은 세포 내에서 발현시키거나 세포 외로 분비되도록 조절할 수 있다. 다만, 세포 내 발현은 불용성 덩어리로 단백질이 축적되는 경우가 많고, 분리 정제의 어려움으로 생산성이 저하되는 단점이 있다. 반면, 세포 외 분비는 정확한 단백질 접힘을 지닌 가용성 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 이에, 단백질의 생산수율 및 품질 관리에서 더 적합한 세포 외 분비를 위해, 최적화된 재조합 단백질 발현 시스템이 중요하다.
재조합 단백질 생산을 위해서 숙주세포, 목적 유전자, 발현 벡터, 선택적 마커, 프로모터, 신호 펩타이드 서열 등의 구성요소가 필수적으로 요구된다. 상기 구성요소의 선택에 따라 재조합 단백질의 품질 및 생산성이 달라진다.
신호 펩타이드의 경우, 생산하고자 하는 재조합 단백질 N-말단 부위에 위치하여 재조합 단백질 발현량에 관여하며, 또한 세포 외로 분비될 수 있도록 하는 구성요소이다. 어떤 신호 펩타이드를 사용하는가에 따라서 발현량의 차이가 보이며, 또한 신호 펩타이드가 오절단(mis-cleavage)되어 단백질 N-말단에 신호 펩타이드 서열이 일부 남아있어 재조합 단백질의 품질에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 오절단(mis-cleavage)이 일어나지 않으며, 고발현을 유도할 수 있는 신호 펩타이드를 선정하는 것이 중요하다.
한편, 종래의 신호 펩타이드는 대부분 인간 유래의 신호 펩타이드를 사용하며 발현 숙주 세포로 주로 CHO 세포를 사용하고 있다. 숙주 세포 간 신호 펩타이드를 겸용하여 사용하여도 무방하나, 품질 측면에서 문제가 생길 수도 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 CHO 세포에서 발현량을 높이고 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 CHO 세포 유래의 17 내지 31개의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드인 신호 펩타이드를 개발하였고, 상기 신호 펩타이드는 현저히 증가된 발현량과 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단되어 오절단을 방지함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 CHO 세포 유래의 신규한 단백질 분비 인자를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 제공한다. 보다 구체적으로, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "단백질 분비 인자"는 목적 단백질과 연결되어 목적 단백질이 세포 외로 분비될 수 있도록 유도하는 인자를 의미하며, 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 상기 단백질 분비 인자는 목적 단백질, 즉 내재 단백질 및/또는 외래 단백질의 분비를 촉진하는 것일 수 있으며, 특히 항체의 경사슬 및/또는 중사슬의 세포 외 분비를 촉진시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 단백질 분비 인자는 "신호서열" 또는 "신호 펩타이드(signal peptide; SP)"와 혼용될 수 있다.
본 발명의 단백질 분비 인자는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추가적으로 본 발명의 단백질 분비 인자는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 단백질 분비 인자는 CHO 세포 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 "CHO 세포"는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포로서, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환용 숙주 세포일 수 있다. 또한, 숙주세포인 CHO 세포에서 발현량을 높이기 위해 CHO 세포 유래의 단백질 분비 인자를 선정할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 카젭신 B(Cathepsin B; Cat)일 수 있고, 본 발명에서 Cat 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine; CC)일 수 있으며, 본 발명에서 CC 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2; Nuc)일 수 있고, 본 발명에서 Nuc 분비서열과 혼용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비인자는 클러스테린(Clusterin; Clus)일 수 있고, 본 발명에서 Clus 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig)일 수 있고, 본 발명에서 Pig 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco)일 수 있으며, 본 발명에서 Proco 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf)일 수 있고, 본 발명에서 Sulf 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip)일 수 있고, 본 발명에서 Lip 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 니도젠-1(Nidogen-1; Nid)일 수 있으며, 본 발명에서 Nid 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro)일 수 있고, 본 발명에서 Pro 분비서열과 혼용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 카젭신 B(Cathepsin B) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
추가로, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 클러스테린(Clusterin) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 니도젠-1(Nidogen-1; Nid) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 단백질 분비 인자는 '특정 서열로 구성된 분비 인자'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 분비 인자와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열의 앞뒤의 무의미한 서열의 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재적 돌연변이(silent mutation)을 제외하는 것은 아니며, 이러한 서열의 추가 또는 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위에 속하는 것이 자명하다.
그 예로, 상기 폴리뉴클레오티드로 이루어진 핵산 분자와 동일하거나 상응하게 신호 펩타이드로 작용할 수 있다면, 상기 서열과 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성 및/또는 동일성을 나타내는 염기 서열도 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 "상동성" 또는 "동일성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며, 백분율로 표시될 수 있다. 상기 용어, 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)을 나타낸다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "목적 단백질"은 숙주 세포에 내재적으로 발현되는 단백질이거나 외래에서 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질일 수 있으며, 본 발명의 신호 펩타이드 서열에 의해 세포 외 분비 효율이 증진되는 한 제한되지 않는다.
상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편 (Fab, ScFv 등), 융합단백질 (Fusion Protein), 스캐폴드 단백질 (Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자 (Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 또는 글루코우로니다제일 수 있으며, 구체적으로 항체의 중사슬 또는 경사슬 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "작동 가능하게 연결"은 본 발명의 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열과 프로모터 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열 및 신호 펩타이드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 위치-특이적 DNA 연결은 당업계의 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "발현 카세트"는 하나 이상의 유전자 및 이들의 발현을 조절하는 서열, 예를 들어 다양한 cis-작용 전사 조절 요소들의 임의의 조합을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현 카세트에는 단백질 분비 인자 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열뿐 아니라, 발현 조절에 필요하다고 당업계에서 인정되는 다양한 요소들, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등의 핵산 서열들을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 유전자의 발현, 즉 이의 전사 및 그 전사 생산물의 발현을 조절하는 서열은 통상 조절 유닛(unit)으로 지칭된다. 조절 유닛의 대부분은 목적 유전자의 코딩 서열의 상류에 작동 가능하게 연결되어 위치한다. 또한, 상기 발현 카세트는 3' 말단에 폴리아데닐화(poly-adenylation) 부위를 포함하는 3' 비번역 영역(3' non-transcriptional region)을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결되어, 숙주 세포에서 목적 단백질을 세포 외로 분비 발현시키는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열인 서열번호 11 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결" 및 "발현 카세트"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명에서 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 카젭신 B(Cathepsin B; Cat)일 수 있고, 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine; CC)일 수 있고, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2; Nuc)일 수 있고, 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 클러스테린(Clusterin; Clus)일 수 있고, 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig)일 수 있고, 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco)일 수 있고, 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf)일 수 있고, 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip)일 수 있고, 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 니도젠-1(Nidogen-1; Nid)일 수 있으며, 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결"및 "발현 카세트"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "목적 단백질 분비용 발현벡터"는 단백질 분비 인자와 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결되어, 해당 벡터를 숙주 세포에 도입한 후 발현 시 목적 단백질의 세포 외 분비를 유도하는 발현벡터를 의미한다.
본 발명의 "발현벡터"는 목적 단백질을 암호화하는 DNA(목적 DNA)의 단편이 삽입된 캐리어(carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 당업계에서 단백질을 발현하는데 사용되는 발현벡터는 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포 내에 있으면, 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 삽입된 목적 DNA가 발현될 수 있다. 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 세포 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야 한다.
본 발명에서 사용되는 발현벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 pTZ계 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, pTz-D1G1 vector(대한민국 등록특허 제10-1038126호의 프로모터를 포함하는 변형체)를 기반으로 하여 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열과 생산하고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결하여, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제조하였다(실시예 4).
상기 발현벡터는 추가로 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포를 제공한다.
본 발명의 "발현벡터"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 말한다.
형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 하면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 유전자총(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 또는 초산 리튬-DMSO법 일 수 있으며, 구체적으로 전기천공법(electroporation)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "숙주 세포"는 본 발명의 단백질 분비 인자의 활성을 갖는 핵산 분자가 도입되어 신호 펩타이드로 작동할 수 있는 진핵 세포를 말한다. 상기 숙주 세포는 예를 들어, 효모와 같은 주지의 진핵 숙주일 수 있으며, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 등의 동물 세포 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 숙주 세포는 그 예로 동물 숙주 세포일 수 있으며, 구체적으로 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell, CHO cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 숙주 세포로 재조합 단백질 생산에 널리 사용되는 CHO 세포를 사용하였다(실시예 4).
본 발명의 "형질전환체"는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩타이드 및 목적단백질을 포함하는 발현벡터를 상기 숙주세포인 CHO 세포 내로 도입하여 형질전환된 동물세포를 말한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 형질전환체는 목적 단백질인 항체인 펨브롤리주맙(pembrolizumab)의 경사슬 및 중사슬의 발현량이 증대되는 것을 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결", "발현 카세트", "목적 단백질 분비용 발현벡터", "숙주 세포" 및 "형질전환체"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "배양"은 상기 형질전환체 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 CHO 세포를 숙주 세포로 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나, 조건에 따라 변경이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 재조합 발현벡터 pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem 및 pCB-CC-Pem를 숙주 세포인 CHO 세포(ExpiCHO-STM 세포)에 도입하고, ExpiCHO Expression Medium(CHO 발현 배지) 30mL에서 12일 동안 배치 공정(Fed-Batch culture)으로 배양하였다(실시예 4).
본 발명의 목적 단백질을 제조하는 방법은, 배양물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 "회수"는 배양물로부터 목적 단백질을 수득하는 것으로서 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다. 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질인 경우 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 분비 인자 등이 제거되는 등 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.
본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 목적 단백질의 N-말단 절단 부위에서 정확하게 절단되는 분비 인자일 수 있다.
신호 펩타이드는 생산하고자 하는 재조합 단백질의 N-말단 부위에 위치하며 목적 단백질이 분비(translocation) 되면, 신호 펩타이드 분해효소(signal peptidase)에 의해 분해된다. 그러나, 기존의 단백질 분비 인자는 종종 오절단(mis-cleavage) 문제로 인해 목적 단백질의 품질(quality)을 떨어뜨릴 수 있다. 상기 "오절단"은 신호 펩타이드가 정확한 위치에서 완전히 분해되지 않고, 목적 단백질의 N-말단에 신호 펩타이드 서열이 일부 남아있는 것을 말한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 정제된 목적 단백질들을 Q-TOF MS 질량분석기를 이용하여 단백질 분비 인자(Signal Peptide)의 절단 여부를 확인하였다. 그 결과, 예측한 절단 부위(Cleavage Site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인하였다.
이에, 본 발명의 단백질 분비 인자(Signal Peptide; 신호 펩타이드)를 포함하는 발현벡터는 재조합 단백질의 효율적인 발현 및 분비를 통해 목적 단백질의 생산성을 증대시키며, 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하는 강력한 유전자 도구가 될 수 있다.
본 발명의 단백질 분비인자 즉, 신호 펩타이드는 고발현을 통하여 재조합 단백질의 생산성을 현저히 증대시킬 수 있으며, 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단됨을 통해 종래의 신호 펩타이드의 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하는 강력한 유전자 도구로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 SignalP4.1을 이용하여 신호 펩타이드(Signal Peptide)를 예측한 도이다.도 2는 임시발현을 통한 신호 펩타이드(Signal Peptide)-mCherry의 발현량을 확인한 도이다.
도 3은 위치 특이적(Site Specific) Integration 용 벡터 지도(Vector Map)를 나타낸 도이다.
도 4는 위치 특이적으로 통합(Site Specific Integration)된 세포에서 mCherry의 발현량을 비교한 도이다.
도 5은 SP7.2와 Clus fusion된 anti-PD-1 항체의 cleavage 여부를 확인한 Mass data를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. CHO 세포 유래의 신규한 신호 펩타이드 서열의 제조
1-1. CHO HCP Mass 분석
트립신(trypsin)을 처리한 CHO 세포(DXB11) 배양액에 다음과 같이 4 종류(ADH, BSA, PHO, ENL)의 MassPREPTM Protein Digest Standard를 넣어주었다. 4 종류의 MassPREPTM Protein Digest Standard 중 PHO를 각 HCP(Host Cell Protein)의 농도를 계산하기 위한 Internal Standard로 사용하였다. 각 시료는 2D LC (high pH RP/Low pH RP)-Q-TOF (UDMSe) 방법으로 숙주세포 단백질(Host cell protein; HCP)을 분석하였다.
2D Column에서 Q-TOF MS로 바로 주입(injection)하여 각 fraction 별로 MS data(UDMSe)를 수득하였다. 상기 방식으로 수득된 10개의 fraction의 MS data (UDMSe)들은 ProteinLynx Global SERVER (PLGS, Ver. 3.0.2) Software를 이용하여 하나의 data로 merge 하였다. 이후, 각 시료의 merged data와 Chinese Hamster Protein Database를 이용하여 HCP를 ID 하였고, PHO를 Internal Standard로 사용하여 각 HCP의 농도를 구하였다.
1-2. CHO HCP data로부터 신호 펩타이드 선정
HCP 농도가 높은 순으로 배열하였고, 각 protein의 아미노산 서열을 CHO Genome Database (http://chogenome.org)에서 확인하였다. 확보된 아미노산 서열을 SignalP4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)에 입력하여 분비 단백질(Secretion Protein) 여부 및 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열을 예측하였다(표 1, 도 1 및 표 4).
SignalP4.1로 예측한 HCP Secretion Protein
Protein 서열번호 SP(Signal Peptide) Sequence 서열번호 DNA Sequence
Cathepsin B (Cat) 1 MWWSLIPLSC LLALASA

 11 ATG TGG TGG TCC TTG ATT CCG CTC TCT TGC CTG CTG GCA CTG GCA AGT GCC
C-C motif chemokine 2 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLA 12 ATG CAG TTC TCC GCA AGA ACG CTT CTG TGC CTG CTA CTC ACA GTT GCT GCC TGT AGC ATC TAT GTG CTG GCC
Nucleobindin-2 (Nuc) 3 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEA 13 ATG AGG TGG AAG ATC ATC CAG CTA CAG TAC TGT TTT CTT TTG GTC CCG TGC ATG CTT ACT GCT CTG GAA GCT
Clusterin (Clus) 4 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL G 14 ATG AAG ATT CTC CTG TTG TGC GTG GGG CTG CTG CTG ACC TGG GAC AAT GGC ATG GTC CTG GGA
Pigment epithelium-derived factor (Pig) 5 MQALVLLLWT GALLGHGSS 15 ATG CAG GCC CTG GTG CTA CTC CTC TGG ACA GGA GCC CTG CTT GGG CAT GGC AGC AGC
Procollagen C-endopeptidase enhancer 1(Proco) 6 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARG 16 ATG CTG CCT GCT GTC CTA ACC TCC CTC CTG GGG CCA TTC CTT GTG GCC TGG GTA CTG CCT CTT GCC CGA GGC
Sulfhydryl oxidase (Sulf) 7 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG A 17 ATG AGG AGG TGC GGC CGC CAC TCG GGG TCG CCG TCG CAG ATG CTA CTG CTG CTG CTG CCG CCG CTG CTG CTC GCG GTG CCC GGC GCT GGC GCG
Lipoprotein lipase (Lip) 8 MESKALLLVA LGVWLQSLTA 18 ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC CTG GTG GCT CTG GGA GTG TGG CTC CAG AGT TTG ACC GCC
Nidogen-1 (Nid) 9 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS 19 ATG CTG GAC GCG AGC GGC TGG AAG CCC GCG GCG TGG ACA TGG GTG CTG CTG CTG CAG CTA TTG CTG GCG GGG CCC GGA GAC TGC CTG AGC
Protein disulfide-isomerase (Pro) 10 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QG 20 ATG GAT GAT CGG CTC CTG ACA GTG TTG CTG CTC CTG CTG GGT GTC TCA GGC CCA TGG GGA CAG GGA
실시예 2. 임시 발현을 통한 CHO 유래 고효율 신호 펩타이드(Signal Peptide) 선정
2-1. 임시 발현용 재조합 단백질 발현 벡터의 제작
실시예 1에서 선정된 10종의 신호 펩타이드(Signal Peptide)가 범용적인 분비인자로 이용될 수 있는지 확인하기 위해, 목적 단백질로 mCherry(pmCherry Vector, Clontech, 632522) 단백질을 선정하였다.
상기 mCherry 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드의 서열은 표 2와 같다.
Protein 서열번호 Amino Acid Sequence 서열번호 DNA Sequence
mCherry 31 MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK 32 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
상기 mCherry 단백질을 코딩하는 유전자를 기반으로 CHO HCP Mass Data로부터 확인한 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열과 KpnI/XhoI이 포함된 프라이머(Primer)로 각각 PCR 하여 상기 10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열에 의해 발현되는 mCherry를 제작하였다.
신호 펩타이드(Signal Peptide)의 길이가 긴 경우에는 프라이머(Primer)를 2개로 나누어 2 번에 걸쳐 PCR을 수행하였다. 상기 10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열이 포함된 mCherry PCR Product를 KpnI과 XhoI으로 절단(Cut)하여 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20) 에 클로닝(Cloning)하여 발현 벡터를 제작하였다.
또한, 양성 대조군(Positive Control)으로 사용하기 위하여 기존의 공지된 분비인자인 SP7.2 Signal Peptide (한국공개특허 10-2015-0125402 A)가 융합된 mCherry 단백질 발현 벡터를 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 SP7.2 Signal Peptide의 서열은 표 3과 같다.
Protein 서열번호 SP Sequence 서열번호 DNA Sequence
SP7.2 33 MHRPEAMLLL LTLALLGGPT WA
34 ATGCACCGGCCAGAGGCCATGCTGCTGCTGCTCACGCTTGCCCTCCTGGGGGGCCCCACCTGGGCA
Protein GeneBank No. Amino Acid Seqence Expected SP Sequence from SignalP4.1 DNA Sequence
Clusterin XP_007643887.1 1 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL GEQEVSDNEL KEMSTQGSRY INKEIQNAVQ GVKQIKTLIE
61 KTNEERKSLL NSLEEAKKKK EDALDDTRDT EMKLKAFPEV CNETMMALWE ECKPCLKQTC
121 MKFYARVCRS GSGLVGRQLE EFLNQSSPFY FWMNGDRIDS LMESDRQQSQ VLDAMQDSFT
181 RASGIMDMLF QDRFFTHEPQ DTHYFSPFGF PHRRPHFLYP KSRLVRSLIP LSHYGPPSFH
241 DMFQPFLEMI HQAQQAMDVQ FHRPAFQFPD KGLREGEDDR AVCKEIRHNS TGCLKMKGQC
301 EKCQEILSVD CSANNPAQAH LRQELNDSLQ MAERLTQQYN ELLHSLQTKM LNTSSLLEQL
361 NEQFNWVSQL ANLTQGEDQY YLRVSTVTTH SNNSEEPSRV TEVVVKLFDS DPITVVLPEE
421 VSKDNPKFMD TVAEKALQEY RKKSRAE		 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL G ATG AAG ATT CTC CTG TTG TGC GTG GGG CTG CTG CTG ACC TGG GAC AAT GGC ATG GTC CTG GGA
Sulfhydryl oxidase XP_007639037.1 1 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG AVQVSVLYSS SDPVTVLNAN TVRSTVLRSN
61 GAWAVEFFAS WCGHCIAFAP TWKELAYDVR EWRPVLNLAV LDCAEETNTA VCRDFNISGF
121 PTVRFFKAFS KNGSGITLPV ADASVETLRR KLIDALESHS DMWSSSRPKL KPAKLVEINE
181 FFAETNEDYL VLIFEDKDSY VGREVTLDLF QHHIPVHRVL NTERNAVSKF GVVEFPSCYL
241 LFRNGSFSRV PVVMESRLFY TSYLKGMSGP ILVDPPTTTI STDAPVTTDV VPTVWKVANH
301 ARIYMADLES SLHYIFLVEV GKFSVLEGQR LLALKKLVAV LAKYFPGRPL AQNFLHSIHD
361 WLQRQQRKKI PYKFFRAALD NRKEGIVLTE KVNWVGCQGS KPHFRGFPCS LWILFHFLTV
421 QASRYSENHP QEPADGQEVL QAMRSYVQWF FGCRDCAEHF ENMAASTMHR VRSPTSAVLW
481 LWTSHNKVNA RLSGAPSEDP YFPKVQWPLR ELCFDCHNEI NGREPVWDLE ATYRFLKAHF
541 SSENIILDTP VAGLATQRNP QILGATPEPH M		 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG A ATG AGG AGG TGC GGC CGC CAC TCG GGG TCG CCG TCG CAG ATG CTA CTG CTG CTG CTG CCG CCG CTG CTG CTC GCG GTG CCC GGC GCT GGC GCG
Cathepsin B XP_003498026.1 1 MWWSLIPLSC LLALASAHNK PSFHPLSDDL INYINKRNTT WQAGRNFHNV DISYLKRLCG
61 TIMGGPKLPE RVAFAEDMEL PENFDAREQW SNCPTIKQIR DQGSCGSCWA FGAVGAMSDR
121 LCIHTNGHVN VEVSAEDLLT CCGSQCGDGC NGGYPSGAWN FWIKKGLVSG GLYNSHVGCL
181 PYTIPPCEHH VNGSRPQCTG EGDTPKCTKS CEAGYSPSYK EDKHYGYTSY SVSNNEKEIM
241 AEIYKNGPVE GAFTVFSDFL TYKSGVYKHE AGDIMGGHAI RILGWGVENS VPYWLVANSW
301 NVDWGDNGLF KILRGEDHCG IESEIVAGIP RTDLYWGRF		 MWWSLIPLSC LLALASA ATG TGG TGG TCC TTG ATT CCG CTC TCT TGC CTG CTG GCA CTG GCA AGT GCC
Nucleobindin-2 XP_003513452.1 1 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEAVPIDVD KTKVHNTEPV ESARIDPPDT GLYYDEYLKQ
61 VIDVLETDQH FREKLQKADI EEIRSGRLSK ELDLVSHHVR TKLDELKRQE VARLRMLIKA
121 KLDSLQDTGM NHHLLLKQFE HLNHQNPDTF ESSDLDMLIK AATADLEQYD RTRHEEFKKY
181 EMMKEHERRE YLKTLNEEKR KEEESKFEEM KRKHENHPKV NHPGSKDQLK EVWEEADGLD
241 PNDFDPKTFF KLHDVNNDGF LDEQELEALF TRELEKVYDP RNAEDDMIEM EEERLRMREH
301 VMNEIDNNKD RLVTLEEFLR ATEKKEFLEP DSWETLGQQQ LFTEEELKEY ESIIAMQENE
361 LKKRADELQK QKEELQRQHD HLEAQKQEYQ QAVQQLEHKK FQQGIAPSGP AGELEFKPRM		 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEA ATG AGG TGG AAG ATC ATC CAG CTA CAG TAC TGT TTT CTT TTG GTC CCG TGC ATG CTT ACT GCT CTG GAA GCT
Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 XP_003510679.1 1 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARGQTPNYT RPVFLCGGDV TGESGYVASE GFPNLYPPNK
61 KCIWTITVPE GQTVSLSFRV FDMELHPSCR YDALEVFAGS GTSGQRLGRF CGTFRPAPVV
121 APGNQVTLRM TTDEGTGGRG FLLWYSGRAT SGTEHQFCGG RMEKAQGTLT TPNWPESDYP
181 PGISCSWHII APSDQVIMLT FGKFDVEPDT YCRYDSVSVF NGAVSDDSKR LGKFCGDKAP
241 SPISSEGNEL LVQFVSDLSV TADGFSASYK TLPRDAVEKE LAPSPGEDVQ LGPQSRSDPK
301 TGTGPKVKPP SKPKFQPAEK PEVSPDTQET PVAPDPPSAT CPKQYKRLGT LQSNFCASSL
361 VVTGTVKTMV RGPGEGLTVT ISLLGVYKSG GLDLPSPPTD TSLKLYVPCR QMPPMKKGAS
421 YLLMGQVEEN RGPILPPESF LVPYKPNQDQ ILNNLRKRKC PSQPRPAA		 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARG ATG CTG CCT GCT GTC CTA ACC TCC CTC CTG GGG CCA TTC CTT GTG GCC TGG GTA CTG CCT CTT GCC CGA GGC
C-C motif chemokine XP_003495840.1 1 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLAQPDAVN SPLTCCYSFT AKRIPEKRLE SYKRITSSKC
61 PKEAVIFITK LKREICADPK QDWVQTYTKK LDQSQAKSEA ATVYKTAPLN ANLTHESAVN
121 ASTTAFPTTD LRTSVRVTSM TVN		 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLA ATG CAG TTC TCC GCA AGA ACG CTT CTG TGC CTG CTA CTC ACA GTT GCT GCC TGT AGC ATC TAT GTG CTG GCC
Lipoprotein lipase XP_003499976.1 1 MESKALLLVA LGVWLQSLTA SQGXAAADGG RDFTDIESKF ALRTPDDTAE DNCHLIPGIA
61 ESVSNCHFNH SSKTFVVIHG WTVTGMYESW VPKLVAALYK REPDSNVIVV DWLYRAQQHY
121 PVSAGYTKLV GNDVARFINW MEEEFNYPLD NVHLLGYSLG AHAAGVAGSL TNKKVNRITG
181 LDPAGPNFEY AEAPSRLSPD DADFVDVLHT FTRGSPGRSI GIQKPVGHVD IYPNGGTFQP
241 GCNIGEAIRV IAERGLGDVD QLVKCSHERS IHLFIDSLLN EENPSKAYRC NSKEAFEKGL
301 CLSCRKNRCN NVGYEINKVR AKRSSKMYLK TRSQMPYKVF HYQVKIHFSG TESDKQLNQA
361 FEISLYGTVA ESENIPFTLP EVSTNKTYSF LIYTEVDIGE LLMMKLKWKS DSYFSWSDWW
421 SSPGFVIEKI RVKAGETQKK VIFCAREKVS HLQKGKDSAV FVKCHDKSLK KSG		 MESKALLLVA LGVWLQSLTA ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC CTG GTG GCT CTG GGA GTG TGG CTC CAG AGT TTG ACC GCC
Nidogen-1 XP_003507635.2 1 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS RQELFPFGPG QGDLELEAGD DVVSPALELI
61 GELSFYDRSD ITSVYVTTNG IIAMSEPPAR ESHPGTFPPS FGSVAPFLAD LDTTDGLGNV
121 YYREDLSPSI MQMAAEYVQR GFPEVPFQPT SVVVVTWESV APYEGPSGSS AQEGKRNTFQ
181 AVLASSNSSS YAIFLYPEDG LQFFTTFSKK DENQVPAMVG FSQGLVGFLW RSDGAYNIFA
241 NDRESIENLA KSSNAGHQGV WVFEIGSPAT AKGVVSADVN LGLDDDGSDY EDEEYDLATS
301 HLGLEDMATQ PFPSPSPRRG NTHPHDVPRV LSPSYEATER PHGIPTERTR TFQLPAERFH
361 QQHPQVIDVD EVEETGIVFS YNIGSQQTCA NNRHQCSVHA ECRDYATGFC CRCVANYTGN
421 GRQCVAEGSP QRVNGKVKGR IFVGNSQVPV VFENTDLHSY VVMNHGRSYT AISTIPETVG
481 YSLLPLAPIG GIIGWMFAVE QNGFKNGFSI TGGEFTRQAE VTFLGHPGKL VLKQHFSGID
541 EHGHLTINTE LDGRVPQIPY GSSVHIEPYT ELYHYSSSVI TSSSTREYTV TEPDPDGTAP
601 SHTHVYQWRQ TITFQECVHD DSRPALPSTQ QLSVDSVFVL YNQEERILRY ALSNSIGPVR
661 EGSPDALQNP CYIGTHGCDS NAACRPGPGT QFTCECSIGF RGDGQTCYDI DECSEQPSRC
721 GNHAACNNSP GAYLCECVEG YHFSDGGICV ADVDQRPINY CETGLHNCDI PQRAQCIYMG
781 GSSYTCSCLP GFSGDGRACQ DVDECQLSRC HPDAFCYNTP GSFTCQCKPG YQGDGFQCVP
841 GEVGKTRCQL EREHILGASG VADAQQPRLL GMYVPQCDEY GHYEPTQCHH GTGYCWCVDR
901 DGRELEGTRT QPGMRPPCLS TVAPPIHQRP VVPTAVIPLP PGTHLLFAQT GKIERLPLEG
961 NTMKKTEAKA FFHIPAKVII GLAFDCVDKV VYWTDISEPS IGRASLHGGE PTTIIRQDLG
1021 SPEGIALDHL GRNIFWTDSQ LDRIEVARMD GTQRRVLFDT GLVNPRGIVT DSVGGNLYWT
1081 DWNRENPKIE TSYMDGTNRR ILAQDNLGLP NGLTFDAFSS QLCWVDAGTH RAECLNPAQP
1141 SSRKVLEGLQ YPFAVTSYGK NLYYTDWKTN SVIAMDLAIS KEMDAFTPTS RPGYMASPLP
1201 CPNALKATTT AQ		 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS ATG CTG GAC GCG AGC GGC TGG AAG CCC GCG GCG TGG ACA TGG GTG CTG CTG CTG CAG CTA TTG CTG GCG GGG CCC GGA GAC TGC CTG AGC
Pigment epithelium-derived factor XP_003515170.1 1 MQALVLLLWT GALLGHGSSQ NVASSSEEGS PAPDSTGEPV EEEEDPFFKV PVNKLAAAVS
61 NFGYDLYRLR SSASPTANVL LSPLSVATAL SALSLGAEQR TESIIHRALY YDLISNSDIH
121 STYKELLASV TAPEKSLKSA SRIVFERKLR VRSSFVAPLE KSYGTRPRIL TGNPRIDLQE
181 INNWIQAQMK GKLARSTREM PSAISILLLG VAYFKGQWVT KFDSRKTSLQ DFHLDEDRTV
241 KVPMMSEPKA ILRYGLDSDL NCKVWEHGGW EGSERGRVSS IRKSIWGYSK IHELQSLFES
301 PDFSKITGKP VKLTQVEHRA AFEWNEEGVE TSPNPGLQPV RLTFPLDYHL NQPFIFVLRD
361 TDTGALLFIG KILDPRGT		 MQALVLLLWT GALLGHGSS ATG CAG GCC CTG GTG CTA CTC CTC TGG ACA GGA GCC CTG CTT GGG CAT GGC AGC AGC
Protein disulfide-isomerase XP_003501525.1 1 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QGQEPEGPSE VLPEESSGEE VPKEDGILVL SHHTLSLALQ
61 EHPALMVEFY APWCGHCKAL APEYSKAAAL LAAESASVTL AKVDGPAEPE LTKEFGVVGY
121 PTLKFFQNGN RTNPEEYTGP QKAEGIAEWL RRRVGPSAKR LEDEEDVQAL TDKWEVVVIG
181 FFQDLQGEDV ATFLALARDA LDITFGFTDQ PQLFQKFGLT KDTVILFKKF DEGRADFPVD
241 KDTGLDLGDL SRFLVTHSMH LVTEFNSQTS PKIFAAKILN HLLLFVNKTL AQHRELLTDF
301 REAAPPFRGQ VLFVMVDVAA DNDHVLNYFG LKAEEAPTLR LINVETTKKY APTGLVPITA
361 ASVAAFCQAV LHGQVKPYLL SQEIPPDWDE RPVKTLVGKN FEQVAFDETK NVFVKFYAPW
421 CSHCKEMAPA WEALAEKYRD REDIVIAELD ATANELEAFS VHGYPTLKFF PAGPDRKVIE
481 YKSTRDLETF SKFLDSGGNL PEEEPKEPAI STPEIQDNST VGPKEEL		 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QG ATG GAT GAT CGG CTC CTG ACA GTG TTG CTG CTC CTG CTG GGT GTC TCA GGC CCA TGG GGA CAG GGA
2-2. 임시 발현
10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide)로부터 발현되는 mCherry 발현 벡터 각각을 CHO-S 세포주 Amaxa 4D-Nucleofector Protocol에 따라 Transfection (1mL)을 진행하였다. 이후, 2 일차와 6 일차에 세포 내 형광과 배양액으로부터 분비된 형광 단백질의 형광 값을 측정하였다(도 3).
세포 내 형광의 경우, FACS (Accuri)를 이용하여 음성 대조군(Negative control; 공벡터, pMaxGFP) 보다 높은 부분의 히스토그램에서 평균값으로 측정하였다.
배양액으로 분비된 형광 단백질의 형광 값의 경우는 2 일차와 6 일차에 100ul을 샘플링(sampling) 한 후 원심분리(centrifugation) 하여 상등액(supernatant)만을 수득하고, Fluorescence 587/610nm 에서 다중 분석기(Multiple Reader)를 이용하여 측정하였다.
상기 배양액에서 측정된 형광값이 높은 신호 펩타이드(Signal Peptide)는 Cat, CC, Nuc, Clus, Pig 임을 확인하였고, 양성대조군 SP7.2 보다 높은 발현을 보인 분비 인자 4 종류(Clus, Pig, Nuc, CC)와 양성대조군(positive control)으로 쓰일 SP7.2와 세포 내에서 형광값이 높은 신호 펩타이드 1 종류(Proco)를 음성대조군(negative control)으로 선정하였다.
실시예 3. Site-Specific Integration을 통한 발현의 비교
3-1. Site-Specific Integration 을 위한 발현 벡터 제작
상기 실시예 2에서 선정된 5 종류의 신호 펩타이드(Clus, Pig, Nuc, CC, Proco) 및 대조군인 SP7.2를 포함한 mCherry 서열을 CHO Genome 특정 위치에 동일하게 삽입하여 정량적으로 발현량을 비교하였다(도 4 및 도 5).
삽입 위치는 Hprt Site로 정하였고, J.S Lee et al., 2015 , "Site-Specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway", Sci. Rep., 5를 참고하여 Homology Arm 서열과 sgRNA 서열을 design 하였다.
5' Homology Arm의 경우, CHO-S Genome을 주형(Template)으로 하여 Bg1Ⅱ와 NruI Enzyme Site가 포함된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR 한 뒤 Bg1Ⅱ/NruI으로 Digestion 한 pcDNA3.1(+) 벡터(Vector)에 클로닝(Cloning) 하였다.
3' Homology Arm의 경우, 동일하게 CHO-S Genome을 주형(Template)으로 하여 SalI site가 각각 포함된 프라이머(Primer)로 PCR 한 후, 5'Homology Arm이 삽입된 벡터(Vector)와 함께 SalI Single Cut 하여 NeoR Gene Downstream 쪽에 Cloning 하였다(pcDNA3.1_hprt).
Homology Recombination 되어 Genome 상에 삽입된 것만 확인하기 위해 Double Selection을 위해 5'Homology Arm Upstream 부분에 Cmy-GFP-BHG pA Fragment를 제작하여 SpeI 과 Bg1Ⅱ로 삽입하였다(pcDNA3.1_G_hprt).
GFP Fragment의 경우, 먼저 pcDNA3.1(+) Vector에 NcoI/XbaI으로 MCS 에 삽입한 후 SpeI과 Bg1Ⅱ Restriction site가 포함된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR 후 Homology가 포함된 Vector (pcDNA_hprt)에 SpeI가 Bg1Ⅱ site를 이용하여 삽입하였다.
완성된 pcDNA3.1_G_hprt Vector를 이용하여 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열이 포함된 mCherry 유전자 서열을 KpnI과 XhoI으로 절단(Cut)하여 MCS 부분에 삽입하였다.
그 결과, CMV-EGFP-pA-5' Hprt Homology Arm - CMV - Signal Peptide 후보 - mCherry - BGH pA - NeoR Selection Marker Cassette - 3'Hprt Homology Arm 형태의 발현 카세트가 포함된 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터를 제작하였다.
3-2. 위치 특이적(Site-Specific) Integration
상기 제작한 6 종류의 Site Specific Integration 용 Vector를 CHO-S Genome 내 Hprt Site에 삽입하기 위해 CRISPR-Cas9을 이용하여 Knock In 하였다. sgRNA 240 ng, cas9 Protein 1250 ng, Donor Vector 1 ㎍을 Nucleofector Solution 과 섞어 50 ㎕ Mixture를 각각 제조하였다.
CHO-S 1x106 cell을 Nucleofector 50 ㎕에 풀어 먼저 제작한 Mixture와 섞은 후, 최종 100 ㎕를 전기 천공법(Electrophoration)을 진행하였다.
전기 천공법(Electrophoration)을 진행한 후, 0.5㎖ 배지와 섞은 후, 2.5㎖ 배지에 첨가하여 6 well plate에서 36.5℃, CO2 5%의 조건으로 배양하였다.
2일 후, Zeneticin (0.5 mg/L)이 포함된 CD CHO Media에서 Selection 진행 한 후, Viability가 90% 회복할 때까지 계대 배양을 진행하였다.
Viability 90% 회복 후, 3x105 cells/mL로 cell 농도를 맞추어 6 well에 각각 4 mL을 Duplicate로 배양하고, 2~3 일 간격으로 Vi-Cell 측정 및 배지 형광값 (587 nm/610 nm)을 측정하였다(도 5).
그 결과, CC, Clus, Pig 분비 서열이 대조군 SP7.2 보다 높게 발현됨을 확인하였다.
실시예 4. Anti PD-1 Antibody 발현 및 Mass 분석
4-1. Anti PD1 항체 생산을 위한 발현 벡터의 제작
Site Specific Integration을 통해 신호 펩타이드(Signal Peptide)의 발현능을 비교한 뒤, 발현이 높은 CC, Clus, Pig를 포함하는 4 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide; (CC, Pig, Clus, SP7.2))가 융합된 Anti-PD-1 항체를 발현시키고자 하였다. 목적 단백질로는 Pembrolizumab (Keytruda®) 항체 서열을 사용하였다.
경사슬(Light Chain)과 중사슬(Heavy Chain)의 아미노산 서열과 일치하는 DNA 서열을 합성한 후, Overlap PCR을 통해 각각의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열과 융합한 형태의 서열을 제작하였다.
상기 경사슬(Light Chain)의 경우 BamHI 과 XhoI으로, 중사슬(Heavy Chain)의 경우 AscI과 NotI으로 restriction 한 후, pcDNA3.1(+)의 변형체인 pTz-D1G1 Vector (KR 10-1038126B1의 promoter를 포함)에 삽입하였다.
pCB_SP7.2_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 33) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 33) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_Clus_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 4) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 4) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_CC_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 2) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 2) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_Pig_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 5) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 5) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
4-2. Anti-PD1 항체의 발현
상기 준비된 재조합 발현 벡터 pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem 및 pCB-CC-Pem을 ExpiCHO-STM 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 도입하고, ExpiCHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific; 30 mL)에서 12일 동안 배양(Fed-Batch Culture; Day 1 & Day 5 Feeding)하여, 상기 융합 폴리펩타이드 Pembrolizumab을 발현시켰다.
4-3. Anti-PD1 항체 정제 및 Mass 분석
상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드를 ProteinA 정제하였다. 구체적으로, 회수한 배양액은 0.22 ㎛ 필터로 여과한 뒤 ProteinA 레진이 패킹되어 있는 칼럼 (Hitrap MSS, GE Healthcare, 11-0034-93)을 AKTATM Avant25 (GE Healthcare Life Sciences)에 장착하고 PBS 버퍼를 흘려주어 칼럼(column)을 평형화였다.
상기 여과한 배양액을 칼럼(column)에 주입한 후 다시 PBS 버퍼를 흘려주어 칼럼(column)을 세척하였다. 상기 칼럼(column)의 세척 작업이 끝난 후 용출 버퍼 (Citrate Buffer, pH 3.5)를 칼럼(column)에 흘려주어 목적 단백질을 용출시켰다.용출액은 Amicon Ultra Filter Device (MWCO 30K, Merck)와 원심분리기를 이용하여 농축을 수행한 후 PBS로 버퍼교환을 실시하였다.
융합폴리펩타이드의 정량 분석은 UV Spectrophotometer (G113A, Agilent Technologies)에서 280 nm와 340 nm의 흡광도를 측정하고, 하기 계산식을 통해 실시하였다. 각 물질의 흡광계수는 아미노산 서열을 이용하여 이론적으로 계산된 값(1.404)을 사용하였다.
Figure pat00001
(*Extinction Coefficient (0.1%): 단백질의 농도가 0.1% (1 g/L)이고, Primary Sequence 상의 모든 시스테인(Cysteine)이 산화되어 이황화결합(Disulfide bond)를 형성한다고 가정할 때, 280nm에서의 이론적인 흡광도임. ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)을 통해 계산됨.)
정제된 목적 단백질들은 Q-TOF MS를 이용해 단백질의 N Term 부분에서 신호 펩타이드(Signal Peptide)의 Mis-Cleavage 여부를 확인하였다(도 6). 1 mg/mL 농도로 희석 후 PNGaseF를 처리하고, 6M Guanidine과 DTT를 처리한 후 Q-TOF MS (RMM-MT-001: ACQUITY UPLC+Q-TOF SYNAPT G2 (Waters))에 Loading 하였다.
그 결과, 예측된 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 CHO 세포 유래 단백질 분비인자인 신호 펩타이드는 재조합 단백질의 발현량을 증가시켜 생산성을 향상시키고, 질량(Mass) 분석을 통해 예측한 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인함으로써 기존 단백질 분비 인자의 문제점인 오절단(mis-cleavage)을 해결할 수 있는 강력한 유전자 도구가 될 수 있음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> CHO cells-derived protein secretory factors and expression vectors comprising the same <130> KPA190690-KR-P1 <150> KR 10-2019-0158447 <151> 2019-12-02 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Cathepsin B (Cat) <400> 1 Met Trp Trp Ser Leu Ile Pro Leu Ser Cys Leu Leu Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ala <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of C-C motif chemokine (CC) <400> 2 Met Gln Phe Ser Ala Arg Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ser Ile Tyr Val Leu Ala 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Nucleobindin-2 (Nuc) <400> 3 Met Arg Trp Lys Ile Ile Gln Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Val Pro 1 5 10 15 Cys Met Leu Thr Ala Leu Glu Ala 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Clusterin (Clus) <400> 4 Met Lys Ile Leu Leu Leu Cys Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gly Met Val Leu Gly 20 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Pigment epithelium-derived factor (Pig) <400> 5 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Trp Thr Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 Gly Ser Ser <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 (Proco) <400> 6 Met Leu Pro Ala Val Leu Thr Ser Leu Leu Gly Pro Phe Leu Val Ala 1 5 10 15 Trp Val Leu Pro Leu Ala Arg Gly 20 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Sulfhydryl oxidase (Sulf) <400> 7 Met Arg Arg Cys Gly Arg His Ser Gly Ser Pro Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Gly Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Lipoprotein lipase (Lip) <400> 8 Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Gly Val Trp Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ala 20 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Nidogen-1 (Nid) <400> 9 Met Leu Asp Ala Ser Gly Trp Lys Pro Ala Ala Trp Thr Trp Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gln Leu Leu Leu Ala Gly Pro Gly Asp Cys Leu Ser 20 25 30 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal Peptide of Protein disulfide-isomerase (Pro) <400> 10 Met Asp Asp Arg Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Pro Trp Gly Gln Gly 20 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Cathepsin B (Cat) <400> 11 atgtggtggt ccttgattcc gctctcttgc ctgctggcac tggcaagtgc c 51 <210> 12 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of C-C motif chemokine (CC) <400> 12 atgcagttct ccgcaagaac gcttctgtgc ctgctactca cagttgctgc ctgtagcatc 60 tatgtgctgg cc 72 <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Nucleobindin-2 (Nuc) <400> 13 atgaggtgga agatcatcca gctacagtac tgttttcttt tggtcccgtg catgcttact 60 gctctggaag ct 72 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Clusterin (Clus) <400> 14 atgaagattc tcctgttgtg cgtggggctg ctgctgacct gggacaatgg catggtcctg 60 gga 63 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Pigment epithelium-derived factor (Pig) <400> 15 atgcaggccc tggtgctact cctctggaca ggagccctgc ttgggcatgg cagcagc 57 <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 (Proco) <400> 16 atgctgcctg ctgtcctaac ctccctcctg gggccattcc ttgtggcctg ggtactgcct 60 cttgcccgag gc 72 <210> 17 <211> 93 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Sulfhydryl oxidase (Sulf) <400> 17 atgaggaggt gcggccgcca ctcggggtcg ccgtcgcaga tgctactgct gctgctgccg 60 ccgctgctgc tcgcggtgcc cggcgctggc gcg 93 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Lipoprotein lipase (Lip) <400> 18 atggagagca aagccctgct cctggtggct ctgggagtgt ggctccagag tttgaccgcc 60 60 <210> 19 <211> 90 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Nidogen-1 (Nid) <400> 19 atgctggacg cgagcggctg gaagcccgcg gcgtggacat gggtgctgct gctgcagcta 60 ttgctggcgg ggcccggaga ctgcctgagc 90 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of Signal Peptide of Protein disulfide-isomerase (Pro) <400> 20 atggatgatc ggctcctgac agtgttgctg ctcctgctgg gtgtctcagg cccatgggga 60 caggga 66 <210> 21 <211> 339 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Cathepsin B (Cat) <400> 21 Met Trp Trp Ser Leu Ile Pro Leu Ser Cys Leu Leu Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ala His Asn Lys Pro Ser Phe His Pro Leu Ser Asp Asp Leu Ile Asn 20 25 30 Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly Arg Asn Phe His 35 40 45 Asn Val Asp Ile Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Gly Thr Ile Met Gly 50 55 60 Gly Pro Lys Leu Pro Glu Arg Val Ala Phe Ala Glu Asp Met Glu Leu 65 70 75 80 Pro Glu Asn Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Ser Asn Cys Pro Thr Ile 85 90 95 Lys Gln Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly 100 105 110 Ala Val Gly Ala Met Ser Asp Arg Leu Cys Ile His Thr Asn Gly His 115 120 125 Val Asn Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly Ser 130 135 140 Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Asn 145 150 155 160 Phe Trp Ile Lys Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Asn Ser His 165 170 175 Val Gly Cys Leu Pro Tyr Thr Ile Pro Pro Cys Glu His His Val Asn 180 185 190 Gly Ser Arg Pro Gln Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys Thr 195 200 205 Lys Ser Cys Glu Ala Gly Tyr Ser Pro Ser Tyr Lys Glu Asp Lys His 210 215 220 Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ser Val Ser Asn Asn Glu Lys Glu Ile Met 225 230 235 240 Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Thr Val Phe 245 250 255 Ser Asp Phe Leu Thr Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Lys His Glu Ala Gly 260 265 270 Asp Ile Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu 275 280 285 Asn Ser Val Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Val Asp Trp 290 295 300 Gly Asp Asn Gly Leu Phe Lys Ile Leu Arg Gly Glu Asp His Cys Gly 305 310 315 320 Ile Glu Ser Glu Ile Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Leu Tyr Trp 325 330 335 Gly Arg Phe <210> 22 <211> 143 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> C-C motif chemokine (CC) <400> 22 Met Gln Phe Ser Ala Arg Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ser Ile Tyr Val Leu Ala Gln Pro Asp Ala Val Asn Ser Pro 20 25 30 Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr Ala Lys Arg Ile Pro Glu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala 50 55 60 Val Ile Phe Ile Thr Lys Leu Lys Arg Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys 65 70 75 80 Gln Asp Trp Val Gln Thr Tyr Thr Lys Lys Leu Asp Gln Ser Gln Ala 85 90 95 Lys Ser Glu Ala Ala Thr Val Tyr Lys Thr Ala Pro Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Leu Thr His Glu Ser Ala Val Asn Ala Ser Thr Thr Ala Phe Pro Thr 115 120 125 Thr Asp Leu Arg Thr Ser Val Arg Val Thr Ser Met Thr Val Asn 130 135 140 <210> 23 <211> 420 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Nucleobindin-2 (Nuc) <400> 23 Met Arg Trp Lys Ile Ile Gln Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Val Pro 1 5 10 15 Cys Met Leu Thr Ala Leu Glu Ala Val Pro Ile Asp Val Asp Lys Thr 20 25 30 Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Ser Ala Arg Ile Asp Pro Pro 35 40 45 Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val Ile Asp Val 50 55 60 Leu Glu Thr Asp Gln His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile 65 70 75 80 Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser 85 90 95 His His Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Ala 100 105 110 Arg Leu Arg Met Leu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ser Leu Gln Asp Thr 115 120 125 Gly Met Asn His His Leu Leu Leu Lys Gln Phe Glu His Leu Asn His 130 135 140 Gln Asn Pro Asp Thr Phe Glu Ser Ser Asp Leu Asp Met Leu Ile Lys 145 150 155 160 Ala Ala Thr Ala Asp Leu Glu Gln Tyr Asp Arg Thr Arg His Glu Glu 165 170 175 Phe Lys Lys Tyr Glu Met Met Lys Glu His Glu Arg Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Thr Leu Asn Glu Glu Lys Arg Lys Glu Glu Glu Ser Lys Phe Glu 195 200 205 Glu Met Lys Arg Lys His Glu Asn His Pro Lys Val Asn His Pro Gly 210 215 220 Ser Lys Asp Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu Ala Asp Gly Leu Asp 225 230 235 240 Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Thr Phe Phe Lys Leu His Asp Val Asn 245 250 255 Asn Asp Gly Phe Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu Ala Leu Phe Thr Arg 260 265 270 Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Arg Asn Ala Glu Asp Asp Met Ile 275 280 285 Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu His Val Met Asn Glu 290 295 300 Ile Asp Asn Asn Lys Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Arg 305 310 315 320 Ala Thr Glu Lys Lys Glu Phe Leu Glu Pro Asp Ser Trp Glu Thr Leu 325 330 335 Gly Gln Gln Gln Leu Phe Thr Glu Glu Glu Leu Lys Glu Tyr Glu Ser 340 345 350 Ile Ile Ala Met Gln Glu Asn Glu Leu Lys Lys Arg Ala Asp Glu Leu 355 360 365 Gln Lys Gln Lys Glu Glu Leu Gln Arg Gln His Asp His Leu Glu Ala 370 375 380 Gln Lys Gln Glu Tyr Gln Gln Ala Val Gln Gln Leu Glu His Lys Lys 385 390 395 400 Phe Gln Gln Gly Ile Ala Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Leu Glu Phe 405 410 415 Lys Pro Arg Met 420 <210> 24 <211> 447 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Clusterin (Clus) <400> 24 Met Lys Ile Leu Leu Leu Cys Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gly Met Val Leu Gly Glu Gln Glu Val Ser Asp Asn Glu Leu Lys Glu 20 25 30 Met Ser Thr Gln Gly Ser Arg Tyr Ile Asn Lys Glu Ile Gln Asn Ala 35 40 45 Val Gln Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu 50 55 60 Glu Arg Lys Ser Leu Leu Asn Ser Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys Lys 65 70 75 80 Glu Asp Ala Leu Asp Asp Thr Arg Asp Thr Glu Met Lys Leu Lys Ala 85 90 95 Phe Pro Glu Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu Cys 100 105 110 Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val Cys 115 120 125 Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu Asn 130 135 140 Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp Ser 145 150 155 160 Leu Met Glu Ser Asp Arg Gln Gln Ser Gln Val Leu Asp Ala Met Gln 165 170 175 Asp Ser Phe Thr Arg Ala Ser Gly Ile Met Asp Met Leu Phe Gln Asp 180 185 190 Arg Phe Phe Thr His Glu Pro Gln Asp Thr His Tyr Phe Ser Pro Phe 195 200 205 Gly Phe Pro His Arg Arg Pro His Phe Leu Tyr Pro Lys Ser Arg Leu 210 215 220 Val Arg Ser Leu Ile Pro Leu Ser His Tyr Gly Pro Pro Ser Phe His 225 230 235 240 Asp Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Gln Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Met Asp Val Gln Phe His Arg Pro Ala Phe Gln Phe Pro Asp Lys Gly 260 265 270 Leu Arg Glu Gly Glu Asp Asp Arg Ala Val Cys Lys Glu Ile Arg His 275 280 285 Asn Ser Thr Gly Cys Leu Lys Met Lys Gly Gln Cys Glu Lys Cys Gln 290 295 300 Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Ala Asn Asn Pro Ala Gln Ala His 305 310 315 320 Leu Arg Gln Glu Leu Asn Asp Ser Leu Gln Met Ala Glu Arg Leu Thr 325 330 335 Gln Gln Tyr Asn Glu Leu Leu His Ser Leu Gln Thr Lys Met Leu Asn 340 345 350 Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser 355 360 365 Gln Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu Arg Val 370 375 380 Ser Thr Val Thr Thr His Ser Asn Asn Ser Glu Glu Pro Ser Arg Val 385 390 395 400 Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr Val Val 405 410 415 Leu Pro Glu Glu Val Ser Lys Asp Asn Pro Lys Phe Met Asp Thr Val 420 425 430 Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys Ser Arg Ala Glu 435 440 445 <210> 25 <211> 378 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Pigment epithelium-derived factor (Pig) <400> 25 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Trp Thr Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gln Asn Val Ala Ser Ser Ser Glu Glu Gly Ser Pro Ala 20 25 30 Pro Asp Ser Thr Gly Glu Pro Val Glu Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe 35 40 45 Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr 50 55 60 Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ala Asn Val Leu 65 70 75 80 Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly 85 90 95 Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp 100 105 110 Leu Ile Ser Asn Ser Asp Ile His Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Ala 115 120 125 Ser Val Thr Ala Pro Glu Lys Ser Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val 130 135 140 Phe Glu Arg Lys Leu Arg Val Arg Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu 145 150 155 160 Lys Ser Tyr Gly Thr Arg Pro Arg Ile Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ile 165 170 175 Asp Leu Gln Glu Ile Asn Asn Trp Ile Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys 180 185 190 Leu Ala Arg Ser Thr Arg Glu Met Pro Ser Ala Ile Ser Ile Leu Leu 195 200 205 Leu Gly Val Ala Tyr Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser 210 215 220 Arg Lys Thr Ser Leu Gln Asp Phe His Leu Asp Glu Asp Arg Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Ser Glu Pro Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Gly Leu 245 250 255 Asp Ser Asp Leu Asn Cys Lys Val Trp Glu His Gly Gly Trp Glu Gly 260 265 270 Ser Glu Arg Gly Arg Val Ser Ser Ile Arg Lys Ser Ile Trp Gly Tyr 275 280 285 Ser Lys Ile His Glu Leu Gln Ser Leu Phe Glu Ser Pro Asp Phe Ser 290 295 300 Lys Ile Thr Gly Lys Pro Val Lys Leu Thr Gln Val Glu His Arg Ala 305 310 315 320 Ala Phe Glu Trp Asn Glu Glu Gly Val Glu Thr Ser Pro Asn Pro Gly 325 330 335 Leu Gln Pro Val Arg Leu Thr Phe Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln 340 345 350 Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe 355 360 365 Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg Gly Thr 370 375 <210> 26 <211> 468 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 (Proco) <400> 26 Met Leu Pro Ala Val Leu Thr Ser Leu Leu Gly Pro Phe Leu Val Ala 1 5 10 15 Trp Val Leu Pro Leu Ala Arg Gly Gln Thr Pro Asn Tyr Thr Arg Pro 20 25 30 Val Phe Leu Cys Gly Gly Asp Val Thr Gly Glu Ser Gly Tyr Val Ala 35 40 45 Ser Glu Gly Phe Pro Asn Leu Tyr Pro Pro Asn Lys Lys Cys Ile Trp 50 55 60 Thr Ile Thr Val Pro Glu Gly Gln Thr Val Ser Leu Ser Phe Arg Val 65 70 75 80 Phe Asp Met Glu Leu His Pro Ser Cys Arg Tyr Asp Ala Leu Glu Val 85 90 95 Phe Ala Gly Ser Gly Thr Ser Gly Gln Arg Leu Gly Arg Phe Cys Gly 100 105 110 Thr Phe Arg Pro Ala Pro Val Val Ala Pro Gly Asn Gln Val Thr Leu 115 120 125 Arg Met Thr Thr Asp Glu Gly Thr Gly Gly Arg Gly Phe Leu Leu Trp 130 135 140 Tyr Ser Gly Arg Ala Thr Ser Gly Thr Glu His Gln Phe Cys Gly Gly 145 150 155 160 Arg Met Glu Lys Ala Gln Gly Thr Leu Thr Thr Pro Asn Trp Pro Glu 165 170 175 Ser Asp Tyr Pro Pro Gly Ile Ser Cys Ser Trp His Ile Ile Ala Pro 180 185 190 Ser Asp Gln Val Ile Met Leu Thr Phe Gly Lys Phe Asp Val Glu Pro 195 200 205 Asp Thr Tyr Cys Arg Tyr Asp Ser Val Ser Val Phe Asn Gly Ala Val 210 215 220 Ser Asp Asp Ser Lys Arg Leu Gly Lys Phe Cys Gly Asp Lys Ala Pro 225 230 235 240 Ser Pro Ile Ser Ser Glu Gly Asn Glu Leu Leu Val Gln Phe Val Ser 245 250 255 Asp Leu Ser Val Thr Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ser Tyr Lys Thr Leu 260 265 270 Pro Arg Asp Ala Val Glu Lys Glu Leu Ala Pro Ser Pro Gly Glu Asp 275 280 285 Val Gln Leu Gly Pro Gln Ser Arg Ser Asp Pro Lys Thr Gly Thr Gly 290 295 300 Pro Lys Val Lys Pro Pro Ser Lys Pro Lys Phe Gln Pro Ala Glu Lys 305 310 315 320 Pro Glu Val Ser Pro Asp Thr Gln Glu Thr Pro Val Ala Pro Asp Pro 325 330 335 Pro Ser Ala Thr Cys Pro Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Gly Thr Leu Gln 340 345 350 Ser Asn Phe Cys Ala Ser Ser Leu Val Val Thr Gly Thr Val Lys Thr 355 360 365 Met Val Arg Gly Pro Gly Glu Gly Leu Thr Val Thr Ile Ser Leu Leu 370 375 380 Gly Val Tyr Lys Ser Gly Gly Leu Asp Leu Pro Ser Pro Pro Thr Asp 385 390 395 400 Thr Ser Leu Lys Leu Tyr Val Pro Cys Arg Gln Met Pro Pro Met Lys 405 410 415 Lys Gly Ala Ser Tyr Leu Leu Met Gly Gln Val Glu Glu Asn Arg Gly 420 425 430 Pro Ile Leu Pro Pro Glu Ser Phe Leu Val Pro Tyr Lys Pro Asn Gln 435 440 445 Asp Gln Ile Leu Asn Asn Leu Arg Lys Arg Lys Cys Pro Ser Gln Pro 450 455 460 Arg Pro Ala Ala 465 <210> 27 <211> 571 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Sulfhydryl oxidase (Sulf) <400> 27 Met Arg Arg Cys Gly Arg His Ser Gly Ser Pro Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Gly Ala Val 20 25 30 Gln Val Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ser Asp Pro Val Thr Val Leu Asn 35 40 45 Ala Asn Thr Val Arg Ser Thr Val Leu Arg Ser Asn Gly Ala Trp Ala 50 55 60 Val Glu Phe Phe Ala Ser Trp Cys Gly His Cys Ile Ala Phe Ala Pro 65 70 75 80 Thr Trp Lys Glu Leu Ala Tyr Asp Val Arg Glu Trp Arg Pro Val Leu 85 90 95 Asn Leu Ala Val Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ala Val Cys 100 105 110 Arg Asp Phe Asn Ile Ser Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala 115 120 125 Phe Ser Lys Asn Gly Ser Gly Ile Thr Leu Pro Val Ala Asp Ala Ser 130 135 140 Val Glu Thr Leu Arg Arg Lys Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His Ser 145 150 155 160 Asp Met Trp Ser Ser Ser Arg Pro Lys Leu Lys Pro Ala Lys Leu Val 165 170 175 Glu Ile Asn Glu Phe Phe Ala Glu Thr Asn Glu Asp Tyr Leu Val Leu 180 185 190 Ile Phe Glu Asp Lys Asp Ser Tyr Val Gly Arg Glu Val Thr Leu Asp 195 200 205 Leu Phe Gln His His Ile Pro Val His Arg Val Leu Asn Thr Glu Arg 210 215 220 Asn Ala Val Ser Lys Phe Gly Val Val Glu Phe Pro Ser Cys Tyr Leu 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asn Gly Ser Phe Ser Arg Val Pro Val Val Met Glu Ser 245 250 255 Arg Leu Phe Tyr Thr Ser Tyr Leu Lys Gly Met Ser Gly Pro Ile Leu 260 265 270 Val Asp Pro Pro Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asp Ala Pro Val Thr Thr 275 280 285 Asp Val Val Pro Thr Val Trp Lys Val Ala Asn His Ala Arg Ile Tyr 290 295 300 Met Ala Asp Leu Glu Ser Ser Leu His Tyr Ile Phe Leu Val Glu Val 305 310 315 320 Gly Lys Phe Ser Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Ala Leu Lys Lys 325 330 335 Leu Val Ala Val Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Ala Gln 340 345 350 Asn Phe Leu His Ser Ile His Asp Trp Leu Gln Arg Gln Gln Arg Lys 355 360 365 Lys Ile Pro Tyr Lys Phe Phe Arg Ala Ala Leu Asp Asn Arg Lys Glu 370 375 380 Gly Ile Val Leu Thr Glu Lys Val Asn Trp Val Gly Cys Gln Gly Ser 385 390 395 400 Lys Pro His Phe Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Ile Leu Phe His 405 410 415 Phe Leu Thr Val Gln Ala Ser Arg Tyr Ser Glu Asn His Pro Gln Glu 420 425 430 Pro Ala Asp Gly Gln Glu Val Leu Gln Ala Met Arg Ser Tyr Val Gln 435 440 445 Trp Phe Phe Gly Cys Arg Asp Cys Ala Glu His Phe Glu Asn Met Ala 450 455 460 Ala Ser Thr Met His Arg Val Arg Ser Pro Thr Ser Ala Val Leu Trp 465 470 475 480 Leu Trp Thr Ser His Asn Lys Val Asn Ala Arg Leu Ser Gly Ala Pro 485 490 495 Ser Glu Asp Pro Tyr Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Leu Arg Glu Leu 500 505 510 Cys Phe Asp Cys His Asn Glu Ile Asn Gly Arg Glu Pro Val Trp Asp 515 520 525 Leu Glu Ala Thr Tyr Arg Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Ser Glu Asn 530 535 540 Ile Ile Leu Asp Thr Pro Val Ala Gly Leu Ala Thr Gln Arg Asn Pro 545 550 555 560 Gln Ile Leu Gly Ala Thr Pro Glu Pro His Met 565 570 <210> 28 <211> 473 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Lipoprotein lipase (Lip) <400> 28 Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Gly Val Trp Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ala Ser Gln Gly Xaa Ala Ala Ala Asp Gly Gly Arg Asp 20 25 30 Phe Thr Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Asp Asp Thr 35 40 45 Ala Glu Asp Asn Cys His Leu Ile Pro Gly Ile Ala Glu Ser Val Ser 50 55 60 Asn Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Val Val Ile His Gly 65 70 75 80 Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val Ala 85 90 95 Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp Trp 100 105 110 Leu Tyr Arg Ala Gln Gln His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr Lys 115 120 125 Leu Val Gly Asn Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu 130 135 140 Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly 145 150 155 160 Ala His Ala Ala Gly Val Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val Asn 165 170 175 Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala Glu 180 185 190 Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu 195 200 205 His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln Lys 210 215 220 Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro 225 230 235 240 Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly Leu 245 250 255 Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His 260 265 270 Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala Tyr 275 280 285 Arg Cys Asn Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser Cys 290 295 300 Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Val Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val Arg 305 310 315 320 Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met Pro 325 330 335 Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr Glu 340 345 350 Ser Asp Lys Gln Leu Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly Thr 355 360 365 Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser Thr 370 375 380 Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly Glu 385 390 395 400 Leu Leu Met Met Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser Trp 405 410 415 Ser Asp Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Val Ile Glu Lys Ile Arg Val 420 425 430 Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ala Arg Glu Lys 435 440 445 Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Asp Ser Ala Val Phe Val Lys Cys 450 455 460 His Asp Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly 465 470 <210> 29 <211> 1212 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Nidogen-1 (Nid) <400> 29 Met Leu Asp Ala Ser Gly Trp Lys Pro Ala Ala Trp Thr Trp Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gln Leu Leu Leu Ala Gly Pro Gly Asp Cys Leu Ser Arg Gln 20 25 30 Glu Leu Phe Pro Phe Gly Pro Gly Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Ala 35 40 45 Gly Asp Asp Val Val Ser Pro Ala Leu Glu Leu Ile Gly Glu Leu Ser 50 55 60 Phe Tyr Asp Arg Ser Asp Ile Thr Ser Val Tyr Val Thr Thr Asn Gly 65 70 75 80 Ile Ile Ala Met Ser Glu Pro Pro Ala Arg Glu Ser His Pro Gly Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Ser Phe Gly Ser Val Ala Pro Phe Leu Ala Asp Leu Asp 100 105 110 Thr Thr Asp Gly Leu Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Glu Asp Leu Ser Pro 115 120 125 Ser Ile Met Gln Met Ala Ala Glu Tyr Val Gln Arg Gly Phe Pro Glu 130 135 140 Val Pro Phe Gln Pro Thr Ser Val Val Val Val Thr Trp Glu Ser Val 145 150 155 160 Ala Pro Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Ser Ser Ala Gln Glu Gly Lys Arg 165 170 175 Asn Thr Phe Gln Ala Val Leu Ala Ser Ser Asn Ser Ser Ser Tyr Ala 180 185 190 Ile Phe Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Leu Gln Phe Phe Thr Thr Phe Ser 195 200 205 Lys Lys Asp Glu Asn Gln Val Pro Ala Met Val Gly Phe Ser Gln Gly 210 215 220 Leu Val Gly Phe Leu Trp Arg Ser Asp Gly Ala Tyr Asn Ile Phe Ala 225 230 235 240 Asn Asp Arg Glu Ser Ile Glu Asn Leu Ala Lys Ser Ser Asn Ala Gly 245 250 255 His Gln Gly Val Trp Val Phe Glu Ile Gly Ser Pro Ala Thr Ala Lys 260 265 270 Gly Val Val Ser Ala Asp Val Asn Leu Gly Leu Asp Asp Asp Gly Ser 275 280 285 Asp Tyr Glu Asp Glu Glu Tyr Asp Leu Ala Thr Ser His Leu Gly Leu 290 295 300 Glu Asp Met Ala Thr Gln Pro Phe Pro Ser Pro Ser Pro Arg Arg Gly 305 310 315 320 Asn Thr His Pro His Asp Val Pro Arg Val Leu Ser Pro Ser Tyr Glu 325 330 335 Ala Thr Glu Arg Pro His Gly Ile Pro Thr Glu Arg Thr Arg Thr Phe 340 345 350 Gln Leu Pro Ala Glu Arg Phe His Gln Gln His Pro Gln Val Ile Asp 355 360 365 Val Asp Glu Val Glu Glu Thr Gly Ile Val Phe Ser Tyr Asn Ile Gly 370 375 380 Ser Gln Gln Thr Cys Ala Asn Asn Arg His Gln Cys Ser Val His Ala 385 390 395 400 Glu Cys Arg Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Cys Cys Arg Cys Val Ala Asn 405 410 415 Tyr Thr Gly Asn Gly Arg Gln Cys Val Ala Glu Gly Ser Pro Gln Arg 420 425 430 Val Asn Gly Lys Val Lys Gly Arg Ile Phe Val Gly Asn Ser Gln Val 435 440 445 Pro Val Val Phe Glu Asn Thr Asp Leu His Ser Tyr Val Val Met Asn 450 455 460 His Gly Arg Ser Tyr Thr Ala Ile Ser Thr Ile Pro Glu Thr Val Gly 465 470 475 480 Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Gly Gly Ile Ile Gly Trp Met 485 490 495 Phe Ala Val Glu Gln Asn Gly Phe Lys Asn Gly Phe Ser Ile Thr Gly 500 505 510 Gly Glu Phe Thr Arg Gln Ala Glu Val Thr Phe Leu Gly His Pro Gly 515 520 525 Lys Leu Val Leu Lys Gln His Phe Ser Gly Ile Asp Glu His Gly His 530 535 540 Leu Thr Ile Asn Thr Glu Leu Asp Gly Arg Val Pro Gln Ile Pro Tyr 545 550 555 560 Gly Ser Ser Val His Ile Glu Pro Tyr Thr Glu Leu Tyr His Tyr Ser 565 570 575 Ser Ser Val Ile Thr Ser Ser Ser Thr Arg Glu Tyr Thr Val Thr Glu 580 585 590 Pro Asp Pro Asp Gly Thr Ala Pro Ser His Thr His Val Tyr Gln Trp 595 600 605 Arg Gln Thr Ile Thr Phe Gln Glu Cys Val His Asp Asp Ser Arg Pro 610 615 620 Ala Leu Pro Ser Thr Gln Gln Leu Ser Val Asp Ser Val Phe Val Leu 625 630 635 640 Tyr Asn Gln Glu Glu Arg Ile Leu Arg Tyr Ala Leu Ser Asn Ser Ile 645 650 655 Gly Pro Val Arg Glu Gly Ser Pro Asp Ala Leu Gln Asn Pro Cys Tyr 660 665 670 Ile Gly Thr His Gly Cys Asp Ser Asn Ala Ala Cys Arg Pro Gly Pro 675 680 685 Gly Thr Gln Phe Thr Cys Glu Cys Ser Ile Gly Phe Arg Gly Asp Gly 690 695 700 Gln Thr Cys Tyr Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Gln Pro Ser Arg Cys 705 710 715 720 Gly Asn His Ala Ala Cys Asn Asn Ser Pro Gly Ala Tyr Leu Cys Glu 725 730 735 Cys Val Glu Gly Tyr His Phe Ser Asp Gly Gly Ile Cys Val Ala Asp 740 745 750 Val Asp Gln Arg Pro Ile Asn Tyr Cys Glu Thr Gly Leu His Asn Cys 755 760 765 Asp Ile Pro Gln Arg Ala Gln Cys Ile Tyr Met Gly Gly Ser Ser Tyr 770 775 780 Thr Cys Ser Cys Leu Pro Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Cys Gln 785 790 795 800 Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Ser Arg Cys His Pro Asp Ala Phe Cys 805 810 815 Tyr Asn Thr Pro Gly Ser Phe Thr Cys Gln Cys Lys Pro Gly Tyr Gln 820 825 830 Gly Asp Gly Phe Gln Cys Val Pro Gly Glu Val Gly Lys Thr Arg Cys 835 840 845 Gln Leu Glu Arg Glu His Ile Leu Gly Ala Ser Gly Val Ala Asp Ala 850 855 860 Gln Gln Pro Arg Leu Leu Gly Met Tyr Val Pro Gln Cys Asp Glu Tyr 865 870 875 880 Gly His Tyr Glu Pro Thr Gln Cys His His Gly Thr Gly Tyr Cys Trp 885 890 895 Cys Val Asp Arg Asp Gly Arg Glu Leu Glu Gly Thr Arg Thr Gln Pro 900 905 910 Gly Met Arg Pro Pro Cys Leu Ser Thr Val Ala Pro Pro Ile His Gln 915 920 925 Arg Pro Val Val Pro Thr Ala Val Ile Pro Leu Pro Pro Gly Thr His 930 935 940 Leu Leu Phe Ala Gln Thr Gly Lys Ile Glu Arg Leu Pro Leu Glu Gly 945 950 955 960 Asn Thr Met Lys Lys Thr Glu Ala Lys Ala Phe Phe His Ile Pro Ala 965 970 975 Lys Val Ile Ile Gly Leu Ala Phe Asp Cys Val Asp Lys Val Val Tyr 980 985 990 Trp Thr Asp Ile Ser Glu Pro Ser Ile Gly Arg Ala Ser Leu His Gly 995 1000 1005 Gly Glu Pro Thr Thr Ile Ile Arg Gln Asp Leu Gly Ser Pro Glu Gly 1010 1015 1020 Ile Ala Leu Asp His Leu Gly Arg Asn Ile Phe Trp Thr Asp Ser Gln 1025 1030 1035 1040 Leu Asp Arg Ile Glu Val Ala Arg Met Asp Gly Thr Gln Arg Arg Val 1045 1050 1055 Leu Phe Asp Thr Gly Leu Val Asn Pro Arg Gly Ile Val Thr Asp Ser 1060 1065 1070 Val Gly Gly Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Asn Arg Glu Asn Pro Lys 1075 1080 1085 Ile Glu Thr Ser Tyr Met Asp Gly Thr Asn Arg Arg Ile Leu Ala Gln 1090 1095 1100 Asp Asn Leu Gly Leu Pro Asn Gly Leu Thr Phe Asp Ala Phe Ser Ser 1105 1110 1115 1120 Gln Leu Cys Trp Val Asp Ala Gly Thr His Arg Ala Glu Cys Leu Asn 1125 1130 1135 Pro Ala Gln Pro Ser Ser Arg Lys Val Leu Glu Gly Leu Gln Tyr Pro 1140 1145 1150 Phe Ala Val Thr Ser Tyr Gly Lys Asn Leu Tyr Tyr Thr Asp Trp Lys 1155 1160 1165 Thr Asn Ser Val Ile Ala Met Asp Leu Ala Ile Ser Lys Glu Met Asp 1170 1175 1180 Ala Phe Thr Pro Thr Ser Arg Pro Gly Tyr Met Ala Ser Pro Leu Pro 1185 1190 1195 1200 Cys Pro Asn Ala Leu Lys Ala Thr Thr Thr Ala Gln 1205 1210 <210> 30 <211> 527 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Protein disulfide-isomerase (Pro) <400> 30 Met Asp Asp Arg Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Pro Trp Gly Gln Gly Gln Glu Pro Glu Gly Pro Ser Glu Val Leu 20 25 30 Pro Glu Glu Ser Ser Gly Glu Glu Val Pro Lys Glu Asp Gly Ile Leu 35 40 45 Val Leu Ser His His Thr Leu Ser Leu Ala Leu Gln Glu His Pro Ala 50 55 60 Leu Met Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu 65 70 75 80 Ala Pro Glu Tyr Ser Lys Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala Glu Ser Ala 85 90 95 Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Asp Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Thr 100 105 110 Lys Glu Phe Gly Val Val Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Phe Phe Gln Asn 115 120 125 Gly Asn Arg Thr Asn Pro Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Gln Lys Ala Glu 130 135 140 Gly Ile Ala Glu Trp Leu Arg Arg Arg Val Gly Pro Ser Ala Lys Arg 145 150 155 160 Leu Glu Asp Glu Glu Asp Val Gln Ala Leu Thr Asp Lys Trp Glu Val 165 170 175 Val Val Ile Gly Phe Phe Gln Asp Leu Gln Gly Glu Asp Val Ala Thr 180 185 190 Phe Leu Ala Leu Ala Arg Asp Ala Leu Asp Ile Thr Phe Gly Phe Thr 195 200 205 Asp Gln Pro Gln Leu Phe Gln Lys Phe Gly Leu Thr Lys Asp Thr Val 210 215 220 Ile Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu Gly Arg Ala Asp Phe Pro Val Asp 225 230 235 240 Lys Asp Thr Gly Leu Asp Leu Gly Asp Leu Ser Arg Phe Leu Val Thr 245 250 255 His Ser Met His Leu Val Thr Glu Phe Asn Ser Gln Thr Ser Pro Lys 260 265 270 Ile Phe Ala Ala Lys Ile Leu Asn His Leu Leu Leu Phe Val Asn Lys 275 280 285 Thr Leu Ala Gln His Arg Glu Leu Leu Thr Asp Phe Arg Glu Ala Ala 290 295 300 Pro Pro Phe Arg Gly Gln Val Leu Phe Val Met Val Asp Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Asn Asp His Val Leu Asn Tyr Phe Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 325 330 335 Pro Thr Leu Arg Leu Ile Asn Val Glu Thr Thr Lys Lys Tyr Ala Pro 340 345 350 Thr Gly Leu Val Pro Ile Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Phe Cys Gln 355 360 365 Ala Val Leu His Gly Gln Val Lys Pro Tyr Leu Leu Ser Gln Glu Ile 370 375 380 Pro Pro Asp Trp Asp Glu Arg Pro Val Lys Thr Leu Val Gly Lys Asn 385 390 395 400 Phe Glu Gln Val Ala Phe Asp Glu Thr Lys Asn Val Phe Val Lys Phe 405 410 415 Tyr Ala Pro Trp Cys Ser His Cys Lys Glu Met Ala Pro Ala Trp Glu 420 425 430 Ala Leu Ala Glu Lys Tyr Arg Asp Arg Glu Asp Ile Val Ile Ala Glu 435 440 445 Leu Asp Ala Thr Ala Asn Glu Leu Glu Ala Phe Ser Val His Gly Tyr 450 455 460 Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Gly Pro Asp Arg Lys Val Ile Glu 465 470 475 480 Tyr Lys Ser Thr Arg Asp Leu Glu Thr Phe Ser Lys Phe Leu Asp Ser 485 490 495 Gly Gly Asn Leu Pro Glu Glu Glu Pro Lys Glu Pro Ala Ile Ser Thr 500 505 510 Pro Glu Ile Gln Asp Asn Ser Thr Val Gly Pro Lys Glu Glu Leu 515 520 525 <210> 31 <211> 236 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mCherry <400> 31 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 32 <211> 711 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of mCherry <400> 32 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660 cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> SP7.2 <400> 33 Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Thr Trp Ala 20 <210> 34 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gene of SP7.2 <400> 34 atgcaccggc cagaggccat gctgctgctg ctcacgcttg ccctcctggg gggccccacc 60 tgggca 66 <210> 35 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat_SP_F <400> 35 agggggtacc gccaccatgt ggtggtcctt gattccgctc tcttgcctgc tggcactggc 60 aagtgccgtg agcaagggcg aggaggat 88 <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC_SP_F1 <400> 36 acagttgctg cctgtagcat ctatgtgctg gccgtgagca agggcgagga ggat 54 <210> 37 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC_SP_F2 <400> 37 agggggtacc gccaccatgc agttctccgc aagaacgctt ctgtgcctgc tactcacagt 60 tgctgcctgt agcatcta 78 <210> 38 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuc_SP_F1 <400> 38 ggtcccgtgc atgcttactg ctctggaagc tgtgagcaag ggcgaggagg at 52 <210> 39 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuc_SP_F2 <400> 39 agggggtacc gccaccatga ggtggaagat catccagcta cagtactgtt ttcttttggt 60 cccgtgcatg cttactgctc t 81 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clus_SP_F1 <400> 40 gggctgctgc tgacctggga caatggcatg gtcctgggag tgagcaaggg cgaggaggat 60 60 <210> 41 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clus_SP_F2 <400> 41 agggggtacc gccaccatga agattctcct gttgtgcgtg gggctgctgc tgacctggga 60 caatg 65 <210> 42 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pig_SP_F <400> 42 ggtaccgcca ccatgcaggc cctggtgcta ctcctctgga caggagccct gcttgggcat 60 ggcagcagcg tgagcaaggg cgaggaggat 90 <210> 43 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proco_SP_F1 <400> 43 ccttgtggcc tgggtactgc ctcttgcccg aggcgtgagc aagggcgagg aggat 55 <210> 44 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proco_SP_F2 <400> 44 agggggtacc gccaccatgc tgcctgctgt cctaacctcc ctcctggggc cattccttgt 60 ggcctgggta ctgcct 76 <210> 45 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sulf_SP_F1 <400> 45 atgctactgc tgctgctgcc gccgctgctg ctcgcggtgc ccggcgctgg cgcggtgagc 60 aagggcgagg aggat 75 <210> 46 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sulf_SP_F2 <400> 46 agggggtacc gccaccatga ggaggtgcgg ccgccactcg gggtcgccgt cgcagatgct 60 actgctgctg ctgccgccgc t 81 <210> 47 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip_SP_F1 <400> 47 ggtggctctg ggagtgtggc tccagagttt gaccgccgtg agcaagggcg aggaggat 58 <210> 48 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip_SP_F2 <400> 48 agggggtacc gccaccatgg agagcaaagc cctgctcctg gtggctctgg gagtgtggct 60 cc 62 <210> 49 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nid_SP_F1 <400> 49 gggtgctgct gctgcagcta ttgctggcgg ggcccggaga ctgcctgagc cgtgagcaag 60 ggcgaggagg at 72 <210> 50 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nid_SP_F2 <400> 50 agggggtacc gccaccatgc tggacgcgag cggctggaag cccgcggcgt ggacatgggt 60 gctgctgctg cagctattgc tgg 83 <210> 51 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro_SP_F1 <400> 51 tgttgctgct cctgctgggt gtctcaggcc catggggaca gggagtgagc aagggcgagg 60 aggat 65 <210> 52 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro_SP_F2 <400> 52 agggggtacc gccaccatgg atgatcggct cctgacagtg ttgctgctcc tgctgggtgt 60 ctcag 65 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry XhoR <400> 53 agggctcgag tttacttgta cagctcgtcc atgccg 36 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl_Hprt 5'F <400> 54 agggagatct caccagtttt cattttctgt gtgaga 36 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hprt 5'_NruR <400> 55 agggtcgcga attaggaata caaaataaat ctaggtcata gc 42 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal_Hprt 3'F <400> 56 aggggtcgac cactatgtcg aggatttgga aaagg 35 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hprt 3'_SalR <400> 57 aggggtcgac gaggatggga gtgagagtga actg 34 <210> 58 <211> 218 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Light chain of Pembrolizumab <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 59 <211> 447 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Heavy chain of Pembrolizumab <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims (19)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 내재 단백질 또는 외래 단백질인 것인, 단백질 분비 인자.
  3. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편(Fab 또는 ScFv), 융합단백질(Fusion Protein), 스캐폴드 단백질(Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자(Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 발현 카세트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15인 것인, 발현 카세트.
  6. 제3항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 발현 카세트.
  7. 제3항에 있어서, 상기 발현 카세트는 세포 내에서 발현 시 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그대로 발현시키는 것인, 발현 카세트.
  8. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편(Fab 또는 ScFv), 융합단백질(Fusion Protein), 스캐폴드 단백질(Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자(Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 발현벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15인 것인, 발현벡터.
  11. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 발현벡터.
  12. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 세포 내에서 발현 시 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그대로 발현시키는 것인, 발현벡터.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell)인 것인, 형질전환체 세포.
  15. i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 회수한 목적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell)인 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 상기 목적 단백질의 N-말단 절단 부위에서 절단되는 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 목적 단백질은 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그 자체인 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
KR1020200165910A 2019-12-02 2020-12-01 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 KR102559048B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020230094054A KR102680148B1 (ko) 2019-12-02 2023-07-19 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190158447 2019-12-02
KR20190158447 2019-12-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230094054A Division KR102680148B1 (ko) 2019-12-02 2023-07-19 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210069001A true KR20210069001A (ko) 2021-06-10
KR102559048B1 KR102559048B1 (ko) 2023-07-26

Family

ID=76221771

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200165910A KR102559048B1 (ko) 2019-12-02 2020-12-01 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터
KR1020230094054A KR102680148B1 (ko) 2019-12-02 2023-07-19 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230094054A KR102680148B1 (ko) 2019-12-02 2023-07-19 Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230234995A1 (ko)
EP (1) EP4063379A4 (ko)
JP (1) JP7531589B2 (ko)
KR (2) KR102559048B1 (ko)
CN (1) CN114761418A (ko)
BR (1) BR112022010460A2 (ko)
MX (1) MX2022006522A (ko)
TW (1) TWI841809B (ko)
WO (1) WO2021112540A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130141001A (ko) * 2012-06-15 2013-12-26 한국표준과학연구원 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템
KR20150125402A (ko) * 2014-04-30 2015-11-09 주식회사 엘지생명과학 고효율 분비능을 가지는 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10342794A1 (de) * 2003-09-16 2005-04-21 Basf Ag Sekretion von Proteinen aus Hefen
CN101300346B (zh) * 2005-06-24 2013-04-24 帝人制药株式会社 新型生理物质nesfatin及其相关物质、以及它们的用途
US20110263835A1 (en) * 2008-10-07 2011-10-27 The Regents Of The University Of California Recombinant nell protein production
KR101038126B1 (ko) 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
CN106119286A (zh) * 2016-08-10 2016-11-16 吴江近岸蛋白质科技有限公司 表达载体及其高效表达和制备人胱抑素c蛋白的方法
EP3323826A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-23 Danmarks Tekniske Universitet Native chinese hamster ovary cell secretion signal peptides for production of recombinant polypeptides
CN111727256A (zh) * 2017-09-08 2020-09-29 波赛达治疗公司 用于嵌合配体受体（clr）-介导的条件性基因表达的组合物和方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130141001A (ko) * 2012-06-15 2013-12-26 한국표준과학연구원 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템
KR20150125402A (ko) * 2014-04-30 2015-11-09 주식회사 엘지생명과학 고효율 분비능을 가지는 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022010460A2 (pt) 2022-09-06
EP4063379A4 (en) 2023-07-26
CN114761418A (zh) 2022-07-15
TWI841809B (zh) 2024-05-11
MX2022006522A (es) 2022-09-12
KR102680148B1 (ko) 2024-07-03
JP2023504648A (ja) 2023-02-06
JP7531589B2 (ja) 2024-08-09
KR20230115276A (ko) 2023-08-02
KR102559048B1 (ko) 2023-07-26
TW202128735A (zh) 2021-08-01
EP4063379A1 (en) 2022-09-28
US20230234995A1 (en) 2023-07-27
WO2021112540A1 (ko) 2021-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dukkipati et al. BacMam system for high-level expression of recombinant soluble and membrane glycoproteins for structural studies
JP5076084B2 (ja) 組み換えタンパク質の大量生産のための新規ベクターおよび発現細胞株と、これを用いた組み換えタンパク質の生産方法
EP1819725B1 (en) Production of proteins
CN108165593A (zh) 胶原蛋白7及相关方法
CN102648286A (zh) 在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法
JP2022516572A (ja) 合成分子フィードバック回路及びその使用方法
US20220307037A1 (en) Systems and methods for protein expression
JP6064915B2 (ja) 発現ベクターおよび蛋白質の製造方法
Bae et al. A novel fusion partner for enhanced secretion of recombinant proteins in Saccharomyces cerevisiae
KR20020071476A (ko) 단백질 제조 방법
Hino et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli, wheat germ, and rabbit reticulocytes
KR102680148B1 (ko) Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터
Li et al. Expression, purification, and characterization of recombinant human pancreatic duodenal homeobox-1 protein in Pichia pastoris
US9476081B2 (en) Method for producing protein
Maleki et al. High expression of methylotrophic yeast-derived recombinant human erythropoietin in a pH-controlled batch system
KR20050077399A (ko) 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 이를 이용한ｌｋ8 단백질의 생산방법
Zhou-Chou et al. Expression, purification and characterisation of secreted recombinant glycoprotein PsA in Dictyostelium discoideum
US9315565B2 (en) Method for producing protein
JPH0984582A (ja) 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法
Li et al. The effects of AtEXO70E2 overexpression on the secretion and production of recombinant proteins in tobacco BY-2 suspension cells
CN115820618A (zh) Sc1-70抗原截短体、其制备方法和应用
CN112126650A (zh) 一种ca125蛋白、编码基因及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right