WO2021112540A1 - Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 - Google Patents

Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 Download PDF

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김연철
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    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a CHO cell-derived protein secretion factor, a nucleic acid sequence encoding the protein secretion factor; and a gene encoding a target protein; an expression cassette operably linked to, an expression vector comprising the expression cassette, a transformant cell into which the expression vector is introduced, and a method for producing a target protein using the transformant cell is about
  • Recombinant proteins can be mass-produced using microorganisms or animal cell systems through genetic recombination technology to produce useful protein components that are difficult to obtain in vivo.
  • Recombinant proteins can be regulated to be expressed intracellularly or to be secreted extracellularly.
  • intracellular expression often accumulates proteins as insoluble masses, and there are disadvantages in that productivity is lowered due to difficulties in separation and purification.
  • extracellular secretion can readily yield soluble proteins with correct protein folding. Therefore, for more suitable extracellular secretion in the production yield and quality control of the protein, an optimized recombinant protein expression system is important.
  • components such as host cells, target genes, expression vectors, selective markers, promoters, and signal peptide sequences are essential.
  • the quality and productivity of the recombinant protein vary according to the selection of the components.
  • the signal peptide In the case of the signal peptide, it is located at the N-terminal site of the recombinant protein to be produced, is involved in the expression level of the recombinant protein, and is a component that allows it to be secreted out of the cell. A difference in expression level is seen depending on which signal peptide is used, and the signal peptide is mis-cleaved and some signal peptide sequences remain at the N-terminus of the protein, which may affect the quality of the recombinant protein.
  • a signal peptide which is a polypeptide consisting of a 17 to 31 amino acid sequence derived from a novel CHO cell.
  • the present invention was completed by confirming that the signal peptide was 100% cleaved at the significantly increased expression level and the cleavage site to prevent erroneous cleavage.
  • One object of the present invention is to provide a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding a target protein; to provide an expression cassette operably linked to.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding the target protein; to provide an expression vector for secretion of the target protein, comprising an expression cassette to which the target protein is operably linked.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant cell in which the expression vector is introduced into a host cell.
  • Another object of the present invention is i) a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding a target protein; culturing a transformant cell comprising an expression vector for secretion of the target protein comprising an expression cassette to which the target protein is operably linked; And ii) to provide a method for producing a target protein comprising the step of recovering the target protein from the culture or culture supernatant of the cultured cells.
  • the protein secretion factor of the present invention that is, the signal peptide, can significantly increase the productivity of the recombinant protein through high expression, and through 100% cleavage at the cleavage site, mis-cleavage of the conventional signal peptide It is expected that it can be used as a powerful genetic tool to solve problems.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating prediction of a signal peptide using SignalP4.1.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the expression level of signal peptide-mCherry through temporary expression.
  • Figure 3 is a diagram showing a vector map (Vector Map) for location-specific (Site Specific) Integration.
  • Figure 4 is a diagram comparing the expression level of mCherry in the site-specific integration (Site Specific Integration) cells.
  • 5 is a view showing the mass data confirming the cleavage of the anti-PD-1 antibody fused with SP7.2 and Clus.
  • protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 provides More specifically, it may be SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • Protein secretion factor refers to a factor that is linked to a target protein and induces the target protein to be secreted out of cells, and may consist of a polypeptide.
  • the protein secretion factor may promote secretion of a target protein, that is, an intrinsic protein and/or a foreign protein, and in particular, may promote the extracellular secretion of a light chain and/or heavy chain of an antibody, but is not limited thereto. .
  • the protein secretion factor may be used interchangeably with “signal sequence” or “signal peptide (SP)”.
  • the protein secretion factor of the present invention may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the protein secretion factor of the present invention may further include a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 However, it is not limited thereto.
  • the protein secretion factor may be derived from CHO cells, but is not limited thereto.
  • the "CHO cell” of the present invention is a Chinese Hamster Ovary cell, and may be a host cell for transformation commonly used in the art.
  • CHO cell-derived protein secretion factors can be selected.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be cathepsin B (Cat), and may be used interchangeably with the Cat secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be a C-C motif chemokine (CC), and may be used interchangeably with the CC secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be nucleobindin-2 (Nuc), and may be used interchangeably with the Nuc secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 of the present invention may be clusterin (Clus), and may be used interchangeably with the Clus secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be Pigment epithelium-derived factor (Pig), and may be used interchangeably with the Pig secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may be Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 (Proco), and may be used interchangeably with the Proco secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be Sulfhydryl oxidase (Sulf), and may be used interchangeably with the Sulf secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 may be lipoprotein lipase (Lip), and may be used interchangeably with the Lip secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 may be Nidogen-1 (Nid), and may be used interchangeably with the Nid secretion sequence in the present invention.
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be protein disulfide-isomerase (Pro), and may be used interchangeably with the secretion sequence of Pro in the present invention.
  • the nucleic acid sequence encoding the cathepsin B signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and the CC motif chemokine consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 )
  • the nucleic acid sequence encoding the signal peptide may be the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, and the nucleic acid sequence encoding the nucleobindin-2 signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 13 It may be a polynucleotide sequence.
  • nucleic acid sequence encoding the clusterin signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, and the pigment epithelial inducing factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the nucleic acid sequence encoding the Pigment epithelium-derived factor; Pig) signal peptide may be the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, and the procollagen C-endopeptidase enhancer 1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (Procollagen C-endopeptidase) enhancer 1; Proco)
  • the nucleic acid sequence encoding the signal peptide may be the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, and the nucleic acid sequence encoding the sulfhydryl oxidase (Sulf) signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be the polynu
  • the protein secretion factor of the present invention is described as a 'secretory factor composed of a specific sequence', if it has the same or corresponding activity as the secretion factor composed of the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO: Addition of meaningless sequences before and after the sequence Or, naturally occurring mutations, or latent mutations thereof are not excluded, and it is apparent that addition or mutation of such sequences falls within the scope of the present application.
  • nucleotide sequence showing 99% or more homology and/or identity may be included without limitation. Also, if it is a nucleotide sequence having such homology, it is obvious that a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the present invention.
  • homology refers to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related to each other, and can be expressed as a percentage.
  • homology and identity are often used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially, homologous or identical sequences are generally at least about 50%, 60%, 70%, 80% of the entire or full-length sequence under moderate or high stringent conditions. or more than 90% hybrid. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotides.
  • GAP program is defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the term “homology” or “identity” refers to a relevance between sequences.
  • Another aspect of the present invention is a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding a target protein; provides an expression cassette operably linked to.
  • protein secretion factor of the present invention is as described above.
  • the "protein of interest" of the present invention may be a protein expressed internally in a host cell or a protein expressed by an exogenously introduced gene, and is not limited as long as extracellular secretion efficiency is enhanced by the signal peptide sequence of the present invention. .
  • the target protein is an antibody, antibody fragment (Fab, ScFv, etc.), fusion protein, scaffold protein (Protein Scaffold), human growth hormone, serum protein, immunoglobulin, cytokine, ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -Interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), platelet derived growth factor (PDGF), phospholipase-activating protein (PLAP), insulin, tumor necrosis factor (TNF), growth factor, hormone, calcitonin, Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP), enkephalin, somatomedin, erythropoietin, hypothalamic secretion factor, growth differentiation factor, cell adhesion protein, prolactin, chronic Gonadotropin, tissue plasminogen activator, growth hormone releasing peptide (GHPR), thymic humoral factor (THF), asparaginase, arginase, arginine deaminase, Adenosine deaminase, peroxid
  • operably linked of the present invention means that the nucleic acid sequence encoding the protein secretion factor of the present invention and the promoter sequence initiate and mediate transcription of the gene encoding the protein of interest, such that the gene sequence, the promoter sequence and the signal peptide sequence are It means that they are functionally connected.
  • the operable linkage may be prepared using a genetic recombination technique known in the art, and the site-specific DNA linkage may be made using a ligation enzyme in the art, but is not limited thereto.
  • expression cassette of the present invention is meant a nucleic acid sequence comprising one or more genes and sequences that regulate their expression, eg, any combination of various cis-acting transcriptional regulatory elements.
  • the expression cassette of the present invention may further include a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor and a target protein, as well as various elements recognized in the art necessary for expression control, for example, nucleic acid sequences such as promoters and enhancers.
  • can Sequences that control the expression of a gene, ie its transcription and expression of its transcription product, are commonly referred to as regulatory units. Most of the regulatory units are located operably linked upstream of the coding sequence of the gene of interest.
  • the expression cassette may include a 3' non-transcriptional region including a poly-adenylation site at the 3' end.
  • the expression cassette of the present invention comprises a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding the protein of interest; it may be a combination of polynucleotides that are operably linked and secretly express the protein of interest to the outside of the cell in the host cell.
  • Another aspect of the present invention is a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 20, which is a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor; and a gene encoding a target protein; provides an expression cassette operably linked to.
  • Protein secretion factor "Protein secretion factor”, "protein of interest”, “operably linked” and "expression cassette” of the present invention are as described above.
  • the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 may be cathepsin B (Cat), and the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 is a CC motif chemokine (CC motif).
  • Cat cathepsin B
  • CC motif CC motif chemokine
  • the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 may be Nucleobindin-2 (Nuc), and secrete the protein encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 14
  • the factor may be clusterin (Clus), and the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 may be Pigment epithelium-derived factor (Pig), and the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 16
  • the protein secretion factor encoded by the nucleotide sequence may be Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 (Proco), and the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is sulfhydryl It may be oxidase (Sulfhydryl oxidase; Sulf), and the protein secretion factor encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • Another aspect of the present invention is a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding the protein of interest; it provides an expression vector for secretion of the protein of interest, comprising an expression cassette to which is operably linked.
  • Protein secretion factor "Protein secretion factor”, "protein of interest”, “operably linked” and "expression cassette” of the present invention are as described above.
  • a protein secretion factor and a gene encoding the target protein are operably linked, and the vector is introduced into a host cell and then expressed to induce extracellular secretion of the target protein.
  • the "expression vector” of the present invention generally refers to a double-stranded DNA fragment as a carrier into which a fragment of DNA (target DNA) encoding a target protein is inserted.
  • Expression vectors used to express proteins in the art may be used without limitation.
  • the expression vector When the expression vector is in a host cell, it can replicate regardless of host chromosomal DNA, and the inserted target DNA can be expressed.
  • the gene To increase the expression level of a transfected gene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational regulatory sequences that function in the selected expression host cell.
  • the expression vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors
  • pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based plasmid vectors may be used.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based vectors may be used, and specifically, pTZ-based vectors may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • protein secretion consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 based on the pTz-D1G1 vector (the variant containing the promoter of Korean Patent Registration No. 10-1038126)
  • An expression vector for secreting the target protein was prepared by operatively linking the nucleic acid sequence encoding the factor and the gene encoding the target protein to be produced (Example 4).
  • the expression vector may further include a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • Another aspect of the present invention provides a transformant cell in which the expression vector is introduced into a host cell.
  • the "expression vector" of the present invention is as described above.
  • Transformation refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide includes all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located extrachromosomally, as long as they can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell and expressed in any form, as long as it can be expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette usually includes a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the method for transforming the vector of the present invention includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, particle bombardment, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran It may be a method, a cationic liposome method, or a lithium acetate-DMSO method, and specifically may be an electroporation method, but is not limited thereto.
  • the "host cell” of the present invention refers to a eukaryotic cell into which a nucleic acid molecule having the activity of the protein secretion factor of the present invention can be introduced to act as a signal peptide.
  • the host cell may be, for example, a known eukaryotic host such as yeast, an insect cell such as Spodoptera frugiperda, or an animal cell such as CHO, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10, etc. , but not limited thereto.
  • the host cell may be, for example, an animal host cell, specifically, a Chinese Hamster Ovary cell (CHO cell), but is not limited thereto.
  • an animal host cell specifically, a Chinese Hamster Ovary cell (CHO cell), but is not limited thereto.
  • CHO cell Chinese Hamster Ovary cell
  • CHO cells widely used for recombinant protein production were used as the host cell (Example 4).
  • the "transformant" of the present invention comprises an expression vector comprising a signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. Refers to animal cells transformed by introducing into
  • Another aspect of the present invention is i) a nucleic acid sequence encoding a protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5; and a gene encoding a target protein; culturing a transformant cell comprising an expression vector for secretion of the target protein comprising an expression cassette to which the target protein is operably linked; And ii) recovering the target protein from the culture or culture supernatant of the cultured cells, it provides a method for producing a target protein.
  • Protein secretion factor Protein of interest
  • protein of interest protein of interest
  • expression cassette expression vector for secretion of the protein of interest
  • host cell host cell
  • transformant of the present invention
  • “Cultivation” of the present invention means growing the transformant cells in an appropriately artificially controlled environmental condition.
  • a method for producing a target protein using a CHO cell as a host cell may be performed using a method well known in the art.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process, but is not limited thereto.
  • sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid , fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, organic acids such as gluconic acid, acetic acid, and pyruvic acid, but is not limited thereto. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that may be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, However, the present invention is not limited thereto. The nitrogen sources can also be used individually or as a mixture.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • precursors suitable for the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously by a method suitable for the culture during the culture process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid may be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester may be used to inhibit the formation of bubbles.
  • Oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the temperature of the culture may be usually 20 °C to 45 °C, preferably 25 °C to 40 °C, but it can be changed depending on the conditions, but is not limited thereto.
  • the recombinant expression vectors pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem and pCB-CC-Pem are used as host cells in CHO cells (ExpiCHO-S TM cells). Introduced to, and cultured in 30 mL of ExpiCHO Expression Medium (Cho expression medium) in a batch process (Fed-Batch culture) for 12 days (Example 4).
  • the method for producing the target protein of the present invention may include recovering the target protein from the culture.
  • the "recovery" of the present invention is to obtain a target protein from a culture, and methods known in the art, such as centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC, may be used, but are not limited thereto.
  • the recovery step may include a purification process, and a person skilled in the art may select and utilize it according to need among various known purification processes. Examples include immunoaffinity chromatography, receptor affinity chromatography, hydrophobic action chromatography, lectin affinity chromatography, size exclusion chromatography, cation or anion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and reversed phase HPLC, etc. It can be separated from the culture supernatant or culture of the host cell by a conventional chromatographic method. In addition, when the desired protein is a fusion protein having a specific tag, label or chelating moiety, there is a method for purification by a specific binding partner or agent.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the purified protein may be cleaved into a desired protein portion, such as a secretory factor or the like, or may remain as it is. Cleavage of the fusion protein can produce a desired protein form with additional amino acids during the cleavage process.
  • a desired protein portion such as a secretory factor or the like
  • the protein secretion factor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 of the present invention may be a secretion factor that is precisely cleaved at the N-terminal cleavage site of the target protein.
  • the signal peptide is located at the N-terminal site of the recombinant protein to be produced, and when the target protein is translocated, it is degraded by a signal peptidase.
  • the existing protein secretion factors can often reduce the quality of the target protein due to a problem of mis-cleavage.
  • the "miscleavage" means that the signal peptide is not completely degraded at the correct position, and a part of the signal peptide sequence remains at the N-terminus of the target protein.
  • the expression vector containing the protein secretion factor (Signal Peptide; signal peptide) of the present invention increases the productivity of the target protein through efficient expression and secretion of the recombinant protein, and is a powerful solution to solve the problem of mis-cleavage. It can be a genetic tool.
  • MassPREPTM Protein Digest Standard 4 types (ADH, BSA, PHO, ENL) of MassPREPTM Protein Digest Standard were added to the trypsin-treated CHO cell (DXB11) culture medium as follows. Among the 4 types of MassPREPTM Protein Digest Standard, PHO was used as an internal standard for calculating the concentration of each HCP (Host Cell Protein). Each sample was analyzed for host cell protein (HCP) by 2D LC (high pH RP/Low pH RP)-Q-TOF (UDMSe) method.
  • HCP host cell protein
  • MS data was obtained for each fraction by direct injection into Q-TOF MS in a 2D column.
  • MS data (UDMSe) of 10 fractions obtained in this way were merged into one data using ProteinLynx Global SERVER (PLGS, Ver. 3.0.2) Software. Thereafter, HCPs were identified using the merged data of each sample and Chinese Hamster Protein Database, and the concentration of each HCP was calculated using PHO as an internal standard.
  • Example 1 In order to confirm that the 10 types of signal peptides selected in Example 1 can be used as universal secretion factors, mCherry (pmCherry Vector, Clontech, 632522) protein was selected as the target protein.
  • mCherry pmCherry Vector, Clontech, 632522
  • PCR was performed with a signal peptide sequence identified from CHO HCP Mass Data and a primer containing KpnI/XhoI, respectively, to the 10 types of signal peptide sequences.
  • PCR was performed twice by dividing the primer into two.
  • the mCherry PCR product containing the 10 types of signal peptide sequences was cut with KpnI and XhoI and cloned into pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20), An expression vector was constructed.
  • FACS Accuri
  • the signal peptides with high fluorescence values measured in the culture medium were Cat, CC, Nuc, Clus, and Pig, and four secretory factors (Clus, Pig, Nuc, CC), SP7.2 to be used as a positive control, and a signal peptide with a high fluorescence value in the cell (Proco) were selected as negative controls.
  • the mCherry sequences including the five signal peptides (Clus, Pig, Nuc, CC, Proco) selected in Example 2 and the control SP7.2 were equally inserted at specific positions in the CHO Genome, and the expression levels were compared quantitatively. (FIGS. 4 and 5).
  • the insertion site was determined as Hprt Site, JS Lee et al., 2015 , "Site-Specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway", Sci. Referring to Rep., 5, the Homology Arm sequence and sgRNA sequence were designed.
  • PCR was performed using a primer containing Bg1II and NruI Enzyme Site using CHO-S Genome as a template, and then pcDNA3.1(+) vector digested with Bg1II/NruI ( Vector) was cloned.
  • PCR is performed with primers each containing SalI sites using the CHO-S Genome as a template, and then SalI Single together with the vector into which the 5' Homology Arm is inserted. It was cut and cloned into the NeoR Gene Downstream (pcDNA3.1_hprt).
  • NcoI/XbaI is inserted into pcDNA3.1(+) Vector into MCS, and then PCR is performed using a primer containing SpeI and Bg1II restriction site, and then SpeI is added to the vector (pcDNA_hprt) containing Homology. was inserted using the Bg1II site.
  • the mCherry gene sequence containing the signal peptide sequence was cut with KpnI and XhoI and inserted into the MCS part.
  • CHO-S 1x10 6 cells were dissolved in 50 ⁇ l of Nucleofector and mixed with the previously prepared mixture, and then the final 100 ⁇ l was subjected to electroporation.
  • the mixture was mixed with 0.5 ml medium, added to 2.5 ml medium, and incubated in a 6-well plate at 36.5° C., CO 2 5%.
  • CC, Pig, Clus, SP7.2 4 types of signal peptides (CC, Pig, Clus, SP7.2) including high-expression CC, Clus, and Pig (Signal Peptide; (CC, Pig, Clus, SP7.2)) ) to express the fused Anti-PD-1 antibody.
  • the target protein the Pembrolizumab (Keytruda®) antibody sequence was used.
  • the prepared recombinant expression vectors pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem and pCB-CC-Pem were introduced into ExpiCHO-S TM cells (Thermo Fisher Scientific), and ExpiCHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific; 30 mL) was cultured for 12 days (Fed-Batch Culture; Day 1 & Day 5 Feeding) to express the fusion polypeptide Pembrolizumab.
  • the fusion polypeptide produced through the recombinant vector expression was purified by ProteinA. Specifically, the recovered culture solution was filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and a column packed with ProteinA resin (Hitrap MSS, GE Healthcare, 11-0034-93 ) was mounted on AKTA TM Avant25 (GE Healthcare Life Sciences), and PBS buffer was added. The column was equilibrated by flow.
  • elution buffer (Citrate Buffer, pH 3.5) was flowed into the column to elute the target protein.
  • the eluate was prepared using an Amicon Ultra Filter Device (MWCO 30K, Merck) and a centrifuge. After concentration was carried out using a buffer exchange with PBS.
  • Quantitative analysis of the fusion polypeptide was performed by measuring the absorbance at 280 nm and 340 nm in a UV Spectrophotometer (G113A, Agilent Technologies), and using the following formula. For the extinction coefficient of each material, a theoretically calculated value (1.404) using the amino acid sequence was used.
  • the purified target proteins were checked for mis-cleavage of the signal peptide in the N-Term portion of the protein using Q-TOF MS (FIG. 6). After dilution to a concentration of 1 mg/mL, PNGaseF was treated, 6M guanidine and DTT were treated, and then loaded in Q-TOF MS (RMM-MT-001: ACQUITY UPLC+Q-TOF SYNAPT G2 (Waters)).
  • the signal peptide which is a CHO cell-derived protein secretion factor of the present invention, improves productivity by increasing the expression level of the recombinant protein, and 100% cleavage at the cleavage site predicted through mass analysis. ), suggesting that it can be a powerful genetic tool to solve the problem of mis-cleavage of existing protein secretion factors.

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Abstract

본 발명은 CHO 세포 유래 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체 세포 및 상기 형질전환체 세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

CHO 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터
본 발명은 CHO 세포 유래 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체 세포 및 상기 형질전환체 세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질은 생체 내에서 수득하기 어려운 유용한 단백질 성분을 유전자 재조합 기술을 통해 미생물이나 동물세포 시스템을 이용하여 대량생산할 수 있다. 재조합 단백질은 세포 내에서 발현시키거나 세포 외로 분비되도록 조절할 수 있다. 다만, 세포 내 발현은 불용성 덩어리로 단백질이 축적되는 경우가 많고, 분리 정제의 어려움으로 생산성이 저하되는 단점이 있다. 반면, 세포 외 분비는 정확한 단백질 접힘을 지닌 가용성 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 이에, 단백질의 생산수율 및 품질 관리에서 더 적합한 세포 외 분비를 위해, 최적화된 재조합 단백질 발현 시스템이 중요하다.
재조합 단백질 생산을 위해서 숙주세포, 목적 유전자, 발현 벡터, 선택적 마커, 프로모터, 신호 펩타이드 서열 등의 구성요소가 필수적으로 요구된다. 상기 구성요소의 선택에 따라 재조합 단백질의 품질 및 생산성이 달라진다.
신호 펩타이드의 경우, 생산하고자 하는 재조합 단백질 N-말단 부위에 위치하여 재조합 단백질 발현량에 관여하며, 또한 세포 외로 분비될 수 있도록 하는 구성요소이다. 어떤 신호 펩타이드를 사용하는가에 따라서 발현량의 차이가 보이며, 또한 신호 펩타이드가 오절단(mis-cleavage)되어 단백질 N-말단에 신호 펩타이드 서열이 일부 남아있어 재조합 단백질의 품질에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 오절단(mis-cleavage)이 일어나지 않으며, 고발현을 유도할 수 있는 신호 펩타이드를 선정하는 것이 중요하다.
한편, 종래의 신호 펩타이드는 대부분 인간 유래의 신호 펩타이드를 사용하며 발현 숙주 세포로 주로 CHO 세포를 사용하고 있다. 숙주 세포 간 신호 펩타이드를 겸용하여 사용하여도 무방하나, 품질 측면에서 문제가 생길 수도 있다.
본 발명자들은 CHO 세포에서 발현량을 높이고 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 CHO 세포 유래의 17 내지 31개의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드인 신호 펩타이드를 개발하였고, 상기 신호 펩타이드는 현저히 증가된 발현량과 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단되어 오절단을 방지함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 단백질 분비인자 즉, 신호 펩타이드는 고발현을 통하여 재조합 단백질의 생산성을 현저히 증대시킬 수 있으며, 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단됨을 통해 종래의 신호 펩타이드의 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하는 강력한 유전자 도구로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 SignalP4.1을 이용하여 신호 펩타이드(Signal Peptide)를 예측한 도이다.도 2는 임시발현을 통한 신호 펩타이드(Signal Peptide)-mCherry의 발현량을 확인한 도이다.
도 3은 위치 특이적(Site Specific) Integration 용 벡터 지도(Vector Map)를 나타낸 도이다.
도 4는 위치 특이적으로 통합(Site Specific Integration)된 세포에서 mCherry의 발현량을 비교한 도이다.
도 5은 SP7.2와 Clus fusion된 anti-PD-1 항체의 cleavage 여부를 확인한 Mass data를 나타낸 도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 CHO 세포 유래의 신규한 단백질 분비 인자를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 제공한다. 보다 구체적으로, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "단백질 분비 인자"는 목적 단백질과 연결되어 목적 단백질이 세포 외로 분비될 수 있도록 유도하는 인자를 의미하며, 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 상기 단백질 분비 인자는 목적 단백질, 즉 내재 단백질 및/또는 외래 단백질의 분비를 촉진하는 것일 수 있으며, 특히 항체의 경사슬 및/또는 중사슬의 세포 외 분비를 촉진시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 단백질 분비 인자는 "신호서열" 또는 "신호 펩타이드(signal peptide; SP)"와 혼용될 수 있다.
본 발명의 단백질 분비 인자는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추가적으로 본 발명의 단백질 분비 인자는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 단백질 분비 인자는 CHO 세포 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 "CHO 세포"는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포로서, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환용 숙주 세포일 수 있다. 또한, 숙주세포인 CHO 세포에서 발현량을 높이기 위해 CHO 세포 유래의 단백질 분비 인자를 선정할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 카젭신 B(Cathepsin B; Cat)일 수 있고, 본 발명에서 Cat 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine; CC)일 수 있으며, 본 발명에서 CC 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2; Nuc)일 수 있고, 본 발명에서 Nuc 분비서열과 혼용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비인자는 클러스테린(Clusterin; Clus)일 수 있고, 본 발명에서 Clus 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig)일 수 있고, 본 발명에서 Pig 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco)일 수 있으며, 본 발명에서 Proco 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf)일 수 있고, 본 발명에서 Sulf 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip)일 수 있고, 본 발명에서 Lip 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 니도젠-1(Nidogen-1; Nid)일 수 있으며, 본 발명에서 Nid 분비서열과 혼용될 수 있다. 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro)일 수 있고, 본 발명에서 Pro 분비서열과 혼용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 카젭신 B(Cathepsin B) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
추가로, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 클러스테린(Clusterin) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있고, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 니도젠-1(Nidogen-1; Nid) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro) 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 단백질 분비 인자는 '특정 서열로 구성된 분비 인자'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 분비 인자와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열의 앞뒤의 무의미한 서열의 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재적 돌연변이(silent mutation)을 제외하는 것은 아니며, 이러한 서열의 추가 또는 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위에 속하는 것이 자명하다.
그 예로, 상기 폴리뉴클레오티드로 이루어진 핵산 분자와 동일하거나 상응하게 신호 펩타이드로 작용할 수 있다면, 상기 서열과 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성 및/또는 동일성을 나타내는 염기 서열도 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 "상동성" 또는 "동일성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며, 백분율로 표시될 수 있다. 상기 용어, 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)을 나타낸다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "목적 단백질"은 숙주 세포에 내재적으로 발현되는 단백질이거나 외래에서 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질일 수 있으며, 본 발명의 신호 펩타이드 서열에 의해 세포 외 분비 효율이 증진되는 한 제한되지 않는다.
상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편 (Fab, ScFv 등), 융합단백질 (Fusion Protein), 스캐폴드 단백질 (Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자 (Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 또는 글루코우로니다제일 수 있으며, 구체적으로 항체의 중사슬 또는 경사슬 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "작동 가능하게 연결"은 본 발명의 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열과 프로모터 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열 및 신호 펩타이드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 위치-특이적 DNA 연결은 당업계의 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "발현 카세트"는 하나 이상의 유전자 및 이들의 발현을 조절하는 서열, 예를 들어 다양한 cis-작용 전사 조절 요소들의 임의의 조합을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현 카세트에는 단백질 분비 인자 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열뿐 아니라, 발현 조절에 필요하다고 당업계에서 인정되는 다양한 요소들, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등의 핵산 서열들을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 유전자의 발현, 즉 이의 전사 및 그 전사 생산물의 발현을 조절하는 서열은 통상 조절 유닛(unit)으로 지칭된다. 조절 유닛의 대부분은 목적 유전자의 코딩 서열의 상류에 작동 가능하게 연결되어 위치한다. 또한, 상기 발현 카세트는 3' 말단에 폴리아데닐화(poly-adenylation) 부위를 포함하는 3' 비번역 영역(3' non-transcriptional region)을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결되어, 숙주 세포에서 목적 단백질을 세포 외로 분비 발현시키는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열인 서열번호 11 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결" 및 "발현 카세트"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명에서 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 카젭신 B(Cathepsin B; Cat)일 수 있고, 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 C-C 모티프 케모카인(C-C motif chemokine; CC)일 수 있고, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 뉴클레오빈딘-2(Nucleobindin-2; Nuc)일 수 있고, 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 클러스테린(Clusterin; Clus)일 수 있고, 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 색소상피유도인자(Pigment epithelium-derived factor; Pig)일 수 있고, 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1; Proco)일 수 있고, 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 설프하이드릴 옥시다제(Sulfhydryl oxidase; Sulf)일 수 있고, 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 지질단백질 리파아제(Lipoprotein lipase; Lip)일 수 있고, 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 니도젠-1(Nidogen-1; Nid)일 수 있으며, 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 단백질 분비 인자는 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein disulfide-isomerase; Pro)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결"및 "발현 카세트"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "목적 단백질 분비용 발현벡터"는 단백질 분비 인자와 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결되어, 해당 벡터를 숙주 세포에 도입한 후 발현 시 목적 단백질의 세포 외 분비를 유도하는 발현벡터를 의미한다.
본 발명의 "발현벡터"는 목적 단백질을 암호화하는 DNA(목적 DNA)의 단편이 삽입된 캐리어(carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 당업계에서 단백질을 발현하는데 사용되는 발현벡터는 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포 내에 있으면, 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 삽입된 목적 DNA가 발현될 수 있다. 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 세포 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야 한다.
본 발명에서 사용되는 발현벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 pTZ계 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, pTz-D1G1 vector(대한민국 등록특허 제10-1038126호의 프로모터를 포함하는 변형체)를 기반으로 하여 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열과 생산하고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결하여, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 제조하였다(실시예 4).
상기 발현벡터는 추가로 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포를 제공한다.
본 발명의 "발현벡터"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 말한다.
형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 하면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 유전자총(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 또는 초산 리튬-DMSO법 일 수 있으며, 구체적으로 전기천공법(electroporation)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "숙주 세포"는 본 발명의 단백질 분비 인자의 활성을 갖는 핵산 분자가 도입되어 신호 펩타이드로 작동할 수 있는 진핵 세포를 말한다. 상기 숙주 세포는 예를 들어, 효모와 같은 주지의 진핵 숙주일 수 있으며, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 등의 동물 세포 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 숙주 세포는 그 예로 동물 숙주 세포일 수 있으며, 구체적으로 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell, CHO cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 숙주 세포로 재조합 단백질 생산에 널리 사용되는 CHO 세포를 사용하였다(실시예 4).
본 발명의 "형질전환체"는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩타이드 및 목적단백질을 포함하는 발현벡터를 상기 숙주세포인 CHO 세포 내로 도입하여 형질전환된 동물세포를 말한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 형질전환체는 목적 단백질인 항체인 펨브롤리주맙(pembrolizumab)의 경사슬 및 중사슬의 발현량이 증대되는 것을 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 "단백질 분비 인자", "목적 단백질", "작동 가능하게 연결", "발현 카세트", "목적 단백질 분비용 발현벡터", "숙주 세포" 및 "형질전환체"는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 "배양"은 상기 형질전환체 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 CHO 세포를 숙주 세포로 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나, 조건에 따라 변경이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 재조합 발현벡터 pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem 및 pCB-CC-Pem를 숙주 세포인 CHO 세포(ExpiCHO-STM 세포)에 도입하고, ExpiCHO Expression Medium(CHO 발현 배지) 30mL에서 12일 동안 배치 공정(Fed-Batch culture)으로 배양하였다(실시예 4).
본 발명의 목적 단백질을 제조하는 방법은, 배양물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 "회수"는 배양물로부터 목적 단백질을 수득하는 것으로서 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다. 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질인 경우 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 분비 인자 등이 제거되는 등 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.
본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 목적 단백질의 N-말단 절단 부위에서 정확하게 절단되는 분비 인자일 수 있다.
신호 펩타이드는 생산하고자 하는 재조합 단백질의 N-말단 부위에 위치하며 목적 단백질이 분비(translocation) 되면, 신호 펩타이드 분해효소(signal peptidase)에 의해 분해된다. 그러나, 기존의 단백질 분비 인자는 종종 오절단(mis-cleavage) 문제로 인해 목적 단백질의 품질(quality)을 떨어뜨릴 수 있다. 상기 "오절단"은 신호 펩타이드가 정확한 위치에서 완전히 분해되지 않고, 목적 단백질의 N-말단에 신호 펩타이드 서열이 일부 남아있는 것을 말한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 정제된 목적 단백질들을 Q-TOF MS 질량분석기를 이용하여 단백질 분비 인자(Signal Peptide)의 절단 여부를 확인하였다. 그 결과, 예측한 절단 부위(Cleavage Site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인하였다.
이에, 본 발명의 단백질 분비 인자(Signal Peptide; 신호 펩타이드)를 포함하는 발현벡터는 재조합 단백질의 효율적인 발현 및 분비를 통해 목적 단백질의 생산성을 증대시키며, 오절단(mis-cleavage) 문제를 해결하는 강력한 유전자 도구가 될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. CHO 세포 유래의 신규한 신호 펩타이드 서열의 제조
1-1. CHO HCP Mass 분석
트립신(trypsin)을 처리한 CHO 세포(DXB11) 배양액에 다음과 같이 4 종류(ADH, BSA, PHO, ENL)의 MassPREPTM Protein Digest Standard를 넣어주었다. 4 종류의 MassPREPTM Protein Digest Standard 중 PHO를 각 HCP(Host Cell Protein)의 농도를 계산하기 위한 Internal Standard로 사용하였다. 각 시료는 2D LC (high pH RP/Low pH RP)-Q-TOF (UDMSe) 방법으로 숙주세포 단백질(Host cell protein; HCP)을 분석하였다.
2D Column에서 Q-TOF MS로 바로 주입(injection)하여 각 fraction 별로 MS data(UDMSe)를 수득하였다. 상기 방식으로 수득된 10개의 fraction의 MS data (UDMSe)들은 ProteinLynx Global SERVER (PLGS, Ver. 3.0.2) Software를 이용하여 하나의 data로 merge 하였다. 이후, 각 시료의 merged data와 Chinese Hamster Protein Database를 이용하여 HCP를 ID 하였고, PHO를 Internal Standard로 사용하여 각 HCP의 농도를 구하였다.
1-2. CHO HCP data로부터 신호 펩타이드 선정
HCP 농도가 높은 순으로 배열하였고, 각 protein의 아미노산 서열을 CHO Genome Database (http://chogenome.org)에서 확인하였다. 확보된 아미노산 서열을 SignalP4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)에 입력하여 분비 단백질(Secretion Protein) 여부 및 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열을 예측하였다(표 1, 도 1 및 표 4).
SignalP4.1로 예측한 HCP Secretion Protein
Protein 서열번호 SP(Signal Peptide) Sequence 서열번호 DNA Sequence
Cathepsin B (Cat) 1 MWWSLIPLSC LLALASA

 11 ATG TGG TGG TCC TTG ATT CCG CTC TCT TGC CTG CTG GCA CTG GCA AGT GCC
C-C motif chemokine 2 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLA 12 ATG CAG TTC TCC GCA AGA ACG CTT CTG TGC CTG CTA CTC ACA GTT GCT GCC TGT AGC ATC TAT GTG CTG GCC
Nucleobindin-2 (Nuc) 3 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEA 13 ATG AGG TGG AAG ATC ATC CAG CTA CAG TAC TGT TTT CTT TTG GTC CCG TGC ATG CTT ACT GCT CTG GAA GCT
Clusterin (Clus) 4 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL G 14 ATG AAG ATT CTC CTG TTG TGC GTG GGG CTG CTG CTG ACC TGG GAC AAT GGC ATG GTC CTG GGA
Pigment epithelium-derived factor (Pig) 5 MQALVLLLWT GALLGHGSS 15 ATG CAG GCC CTG GTG CTA CTC CTC TGG ACA GGA GCC CTG CTT GGG CAT GGC AGC AGC
Procollagen C-endopeptidase enhancer 1(Proco) 6 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARG 16 ATG CTG CCT GCT GTC CTA ACC TCC CTC CTG GGG CCA TTC CTT GTG GCC TGG GTA CTG CCT CTT GCC CGA GGC
Sulfhydryl oxidase (Sulf) 7 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG A 17 ATG AGG AGG TGC GGC CGC CAC TCG GGG TCG CCG TCG CAG ATG CTA CTG CTG CTG CTG CCG CCG CTG CTG CTC GCG GTG CCC GGC GCT GGC GCG
Lipoprotein lipase (Lip) 8 MESKALLLVA LGVWLQSLTA 18 ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC CTG GTG GCT CTG GGA GTG TGG CTC CAG AGT TTG ACC GCC
Nidogen-1 (Nid) 9 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS 19 ATG CTG GAC GCG AGC GGC TGG AAG CCC GCG GCG TGG ACA TGG GTG CTG CTG CTG CAG CTA TTG CTG GCG GGG CCC GGA GAC TGC CTG AGC
Protein disulfide-isomerase (Pro) 10 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QG 20 ATG GAT GAT CGG CTC CTG ACA GTG TTG CTG CTC CTG CTG GGT GTC TCA GGC CCA TGG GGA CAG GGA
실시예 2. 임시 발현을 통한 CHO 유래 고효율 신호 펩타이드(Signal Peptide) 선정
2-1. 임시 발현용 재조합 단백질 발현 벡터의 제작
실시예 1에서 선정된 10종의 신호 펩타이드(Signal Peptide)가 범용적인 분비인자로 이용될 수 있는지 확인하기 위해, 목적 단백질로 mCherry(pmCherry Vector, Clontech, 632522) 단백질을 선정하였다.
상기 mCherry 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드의 서열은 표 2와 같다.
Protein 서열번호 Amino Acid Sequence 서열번호 DNA Sequence
mCherry 31 MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK 32 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
상기 mCherry 단백질을 코딩하는 유전자를 기반으로 CHO HCP Mass Data로부터 확인한 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열과 KpnI/XhoI이 포함된 프라이머(Primer)로 각각 PCR 하여 상기 10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열에 의해 발현되는 mCherry를 제작하였다.
신호 펩타이드(Signal Peptide)의 길이가 긴 경우에는 프라이머(Primer)를 2개로 나누어 2 번에 걸쳐 PCR을 수행하였다. 상기 10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열이 포함된 mCherry PCR Product를 KpnI과 XhoI으로 절단(Cut)하여 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20) 에 클로닝(Cloning)하여 발현 벡터를 제작하였다.
또한, 양성 대조군(Positive Control)으로 사용하기 위하여 기존의 공지된 분비인자인 SP7.2 Signal Peptide (한국공개특허 10-2015-0125402 A)가 융합된 mCherry 단백질 발현 벡터를 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 SP7.2 Signal Peptide의 서열은 표 3과 같다.
Protein 서열번호 SP Sequence 서열번호 DNA Sequence
SP7.2 33 MHRPEAMLLL LTLALLGGPT WA
34 ATGCACCGGCCAGAGGCCATGCTGCTGCTGCTCACGCTTGCCCTCCTGGGGGGCCCCACCTGGGCA
Protein GeneBank No. Amino Acid Seqence Expected SP Sequence from SignalP4.1 DNA Sequence
Clusterin XP_007643887.1 1 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL GEQEVSDNEL KEMSTQGSRY INKEIQNAVQ GVKQIKTLIE
61 KTNEERKSLL NSLEEAKKKK EDALDDTRDT EMKLKAFPEV CNETMMALWE ECKPCLKQTC
121 MKFYARVCRS GSGLVGRQLE EFLNQSSPFY FWMNGDRIDS LMESDRQQSQ VLDAMQDSFT
181 RASGIMDMLF QDRFFTHEPQ DTHYFSPFGF PHRRPHFLYP KSRLVRSLIP LSHYGPPSFH
241 DMFQPFLEMI HQAQQAMDVQ FHRPAFQFPD KGLREGEDDR AVCKEIRHNS TGCLKMKGQC
301 EKCQEILSVD CSANNPAQAH LRQELNDSLQ MAERLTQQYN ELLHSLQTKM LNTSSLLEQL
361 NEQFNWVSQL ANLTQGEDQY YLRVSTVTTH SNNSEEPSRV TEVVVKLFDS DPITVVLPEE
421 VSKDNPKFMD TVAEKALQEY RKKSRAE		 MKILLLCVGL LLTWDNGMVL G ATG AAG ATT CTC CTG TTG TGC GTG GGG CTG CTG CTG ACC TGG GAC AAT GGC ATG GTC CTG GGA
Sulfhydryl oxidase XP_007639037.1 1 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG AVQVSVLYSS SDPVTVLNAN TVRSTVLRSN
61 GAWAVEFFAS WCGHCIAFAP TWKELAYDVR EWRPVLNLAV LDCAEETNTA VCRDFNISGF
121 PTVRFFKAFS KNGSGITLPV ADASVETLRR KLIDALESHS DMWSSSRPKL KPAKLVEINE
181 FFAETNEDYL VLIFEDKDSY VGREVTLDLF QHHIPVHRVL NTERNAVSKF GVVEFPSCYL
241 LFRNGSFSRV PVVMESRLFY TSYLKGMSGP ILVDPPTTTI STDAPVTTDV VPTVWKVANH
301 ARIYMADLES SLHYIFLVEV GKFSVLEGQR LLALKKLVAV LAKYFPGRPL AQNFLHSIHD
361 WLQRQQRKKI PYKFFRAALD NRKEGIVLTE KVNWVGCQGS KPHFRGFPCS LWILFHFLTV
421 QASRYSENHP QEPADGQEVL QAMRSYVQWF FGCRDCAEHF ENMAASTMHR VRSPTSAVLW
481 LWTSHNKVNA RLSGAPSEDP YFPKVQWPLR ELCFDCHNEI NGREPVWDLE ATYRFLKAHF
541 SSENIILDTP VAGLATQRNP QILGATPEPH M		 MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG A ATG AGG AGG TGC GGC CGC CAC TCG GGG TCG CCG TCG CAG ATG CTA CTG CTG CTG CTG CCG CCG CTG CTG CTC GCG GTG CCC GGC GCT GGC GCG
Cathepsin B XP_003498026.1 1 MWWSLIPLSC LLALASAHNK PSFHPLSDDL INYINKRNTT WQAGRNFHNV DISYLKRLCG
61 TIMGGPKLPE RVAFAEDMEL PENFDAREQW SNCPTIKQIR DQGSCGSCWA FGAVGAMSDR
121 LCIHTNGHVN VEVSAEDLLT CCGSQCGDGC NGGYPSGAWN FWIKKGLVSG GLYNSHVGCL
181 PYTIPPCEHH VNGSRPQCTG EGDTPKCTKS CEAGYSPSYK EDKHYGYTSY SVSNNEKEIM
241 AEIYKNGPVE GAFTVFSDFL TYKSGVYKHE AGDIMGGHAI RILGWGVENS VPYWLVANSW
301 NVDWGDNGLF KILRGEDHCG IESEIVAGIP RTDLYWGRF		 MWWSLIPLSC LLALASA ATG TGG TGG TCC TTG ATT CCG CTC TCT TGC CTG CTG GCA CTG GCA AGT GCC
Nucleobindin-2 XP_003513452.1 1 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEAVPIDVD KTKVHNTEPV ESARIDPPDT GLYYDEYLKQ
61 VIDVLETDQH FREKLQKADI EEIRSGRLSK ELDLVSHHVR TKLDELKRQE VARLRMLIKA
121 KLDSLQDTGM NHHLLLKQFE HLNHQNPDTF ESSDLDMLIK AATADLEQYD RTRHEEFKKY
181 EMMKEHERRE YLKTLNEEKR KEEESKFEEM KRKHENHPKV NHPGSKDQLK EVWEEADGLD
241 PNDFDPKTFF KLHDVNNDGF LDEQELEALF TRELEKVYDP RNAEDDMIEM EEERLRMREH
301 VMNEIDNNKD RLVTLEEFLR ATEKKEFLEP DSWETLGQQQ LFTEEELKEY ESIIAMQENE
361 LKKRADELQK QKEELQRQHD HLEAQKQEYQ QAVQQLEHKK FQQGIAPSGP AGELEFKPRM		 MRWKIIQLQY CFLLVPCMLT ALEA ATG AGG TGG AAG ATC ATC CAG CTA CAG TAC TGT TTT CTT TTG GTC CCG TGC ATG CTT ACT GCT CTG GAA GCT
Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 XP_003510679.1 1 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARGQTPNYT RPVFLCGGDV TGESGYVASE GFPNLYPPNK
61 KCIWTITVPE GQTVSLSFRV FDMELHPSCR YDALEVFAGS GTSGQRLGRF CGTFRPAPVV
121 APGNQVTLRM TTDEGTGGRG FLLWYSGRAT SGTEHQFCGG RMEKAQGTLT TPNWPESDYP
181 PGISCSWHII APSDQVIMLT FGKFDVEPDT YCRYDSVSVF NGAVSDDSKR LGKFCGDKAP
241 SPISSEGNEL LVQFVSDLSV TADGFSASYK TLPRDAVEKE LAPSPGEDVQ LGPQSRSDPK
301 TGTGPKVKPP SKPKFQPAEK PEVSPDTQET PVAPDPPSAT CPKQYKRLGT LQSNFCASSL
361 VVTGTVKTMV RGPGEGLTVT ISLLGVYKSG GLDLPSPPTD TSLKLYVPCR QMPPMKKGAS
421 YLLMGQVEEN RGPILPPESF LVPYKPNQDQ ILNNLRKRKC PSQPRPAA		 MLPAVLTSLL GPFLVAWVLP LARG ATG CTG CCT GCT GTC CTA ACC TCC CTC CTG GGG CCA TTC CTT GTG GCC TGG GTA CTG CCT CTT GCC CGA GGC
C-C motif chemokine XP_003495840.1 1 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLAQPDAVN SPLTCCYSFT AKRIPEKRLE SYKRITSSKC
61 PKEAVIFITK LKREICADPK QDWVQTYTKK LDQSQAKSEA ATVYKTAPLN ANLTHESAVN
121 ASTTAFPTTD LRTSVRVTSM TVN		 MQFSARTLLC LLLTVAACSI YVLA ATG CAG TTC TCC GCA AGA ACG CTT CTG TGC CTG CTA CTC ACA GTT GCT GCC TGT AGC ATC TAT GTG CTG GCC
Lipoprotein lipase XP_003499976.1 1 MESKALLLVA LGVWLQSLTA SQGXAAADGG RDFTDIESKF ALRTPDDTAE DNCHLIPGIA
61 ESVSNCHFNH SSKTFVVIHG WTVTGMYESW VPKLVAALYK REPDSNVIVV DWLYRAQQHY
121 PVSAGYTKLV GNDVARFINW MEEEFNYPLD NVHLLGYSLG AHAAGVAGSL TNKKVNRITG
181 LDPAGPNFEY AEAPSRLSPD DADFVDVLHT FTRGSPGRSI GIQKPVGHVD IYPNGGTFQP
241 GCNIGEAIRV IAERGLGDVD QLVKCSHERS IHLFIDSLLN EENPSKAYRC NSKEAFEKGL
301 CLSCRKNRCN NVGYEINKVR AKRSSKMYLK TRSQMPYKVF HYQVKIHFSG TESDKQLNQA
361 FEISLYGTVA ESENIPFTLP EVSTNKTYSF LIYTEVDIGE LLMMKLKWKS DSYFSWSDWW
421 SSPGFVIEKI RVKAGETQKK VIFCAREKVS HLQKGKDSAV FVKCHDKSLK KSG		 MESKALLLVA LGVWLQSLTA ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC CTG GTG GCT CTG GGA GTG TGG CTC CAG AGT TTG ACC GCC
Nidogen-1 XP_003507635.2 1 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS RQELFPFGPG QGDLELEAGD DVVSPALELI
61 GELSFYDRSD ITSVYVTTNG IIAMSEPPAR ESHPGTFPPS FGSVAPFLAD LDTTDGLGNV
121 YYREDLSPSI MQMAAEYVQR GFPEVPFQPT SVVVVTWESV APYEGPSGSS AQEGKRNTFQ
181 AVLASSNSSS YAIFLYPEDG LQFFTTFSKK DENQVPAMVG FSQGLVGFLW RSDGAYNIFA
241 NDRESIENLA KSSNAGHQGV WVFEIGSPAT AKGVVSADVN LGLDDDGSDY EDEEYDLATS
301 HLGLEDMATQ PFPSPSPRRG NTHPHDVPRV LSPSYEATER PHGIPTERTR TFQLPAERFH
361 QQHPQVIDVD EVEETGIVFS YNIGSQQTCA NNRHQCSVHA ECRDYATGFC CRCVANYTGN
421 GRQCVAEGSP QRVNGKVKGR IFVGNSQVPV VFENTDLHSY VVMNHGRSYT AISTIPETVG
481 YSLLPLAPIG GIIGWMFAVE QNGFKNGFSI TGGEFTRQAE VTFLGHPGKL VLKQHFSGID
541 EHGHLTINTE LDGRVPQIPY GSSVHIEPYT ELYHYSSSVI TSSSTREYTV TEPDPDGTAP
601 SHTHVYQWRQ TITFQECVHD DSRPALPSTQ QLSVDSVFVL YNQEERILRY ALSNSIGPVR
661 EGSPDALQNP CYIGTHGCDS NAACRPGPGT QFTCECSIGF RGDGQTCYDI DECSEQPSRC
721 GNHAACNNSP GAYLCECVEG YHFSDGGICV ADVDQRPINY CETGLHNCDI PQRAQCIYMG
781 GSSYTCSCLP GFSGDGRACQ DVDECQLSRC HPDAFCYNTP GSFTCQCKPG YQGDGFQCVP
841 GEVGKTRCQL EREHILGASG VADAQQPRLL GMYVPQCDEY GHYEPTQCHH GTGYCWCVDR
901 DGRELEGTRT QPGMRPPCLS TVAPPIHQRP VVPTAVIPLP PGTHLLFAQT GKIERLPLEG
961 NTMKKTEAKA FFHIPAKVII GLAFDCVDKV VYWTDISEPS IGRASLHGGE PTTIIRQDLG
1021 SPEGIALDHL GRNIFWTDSQ LDRIEVARMD GTQRRVLFDT GLVNPRGIVT DSVGGNLYWT
1081 DWNRENPKIE TSYMDGTNRR ILAQDNLGLP NGLTFDAFSS QLCWVDAGTH RAECLNPAQP
1141 SSRKVLEGLQ YPFAVTSYGK NLYYTDWKTN SVIAMDLAIS KEMDAFTPTS RPGYMASPLP
1201 CPNALKATTT AQ		 MLDASGWKPA AWTWVLLLQL LLAGPGDCLS ATG CTG GAC GCG AGC GGC TGG AAG CCC GCG GCG TGG ACA TGG GTG CTG CTG CTG CAG CTA TTG CTG GCG GGG CCC GGA GAC TGC CTG AGC
Pigment epithelium-derived factor XP_003515170.1 1 MQALVLLLWT GALLGHGSSQ NVASSSEEGS PAPDSTGEPV EEEEDPFFKV PVNKLAAAVS
61 NFGYDLYRLR SSASPTANVL LSPLSVATAL SALSLGAEQR TESIIHRALY YDLISNSDIH
121 STYKELLASV TAPEKSLKSA SRIVFERKLR VRSSFVAPLE KSYGTRPRIL TGNPRIDLQE
181 INNWIQAQMK GKLARSTREM PSAISILLLG VAYFKGQWVT KFDSRKTSLQ DFHLDEDRTV
241 KVPMMSEPKA ILRYGLDSDL NCKVWEHGGW EGSERGRVSS IRKSIWGYSK IHELQSLFES
301 PDFSKITGKP VKLTQVEHRA AFEWNEEGVE TSPNPGLQPV RLTFPLDYHL NQPFIFVLRD
361 TDTGALLFIG KILDPRGT		 MQALVLLLWT GALLGHGSS ATG CAG GCC CTG GTG CTA CTC CTC TGG ACA GGA GCC CTG CTT GGG CAT GGC AGC AGC
Protein disulfide-isomerase XP_003501525.1 1 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QGQEPEGPSE VLPEESSGEE VPKEDGILVL SHHTLSLALQ
61 EHPALMVEFY APWCGHCKAL APEYSKAAAL LAAESASVTL AKVDGPAEPE LTKEFGVVGY
121 PTLKFFQNGN RTNPEEYTGP QKAEGIAEWL RRRVGPSAKR LEDEEDVQAL TDKWEVVVIG
181 FFQDLQGEDV ATFLALARDA LDITFGFTDQ PQLFQKFGLT KDTVILFKKF DEGRADFPVD
241 KDTGLDLGDL SRFLVTHSMH LVTEFNSQTS PKIFAAKILN HLLLFVNKTL AQHRELLTDF
301 REAAPPFRGQ VLFVMVDVAA DNDHVLNYFG LKAEEAPTLR LINVETTKKY APTGLVPITA
361 ASVAAFCQAV LHGQVKPYLL SQEIPPDWDE RPVKTLVGKN FEQVAFDETK NVFVKFYAPW
421 CSHCKEMAPA WEALAEKYRD REDIVIAELD ATANELEAFS VHGYPTLKFF PAGPDRKVIE
481 YKSTRDLETF SKFLDSGGNL PEEEPKEPAI STPEIQDNST VGPKEEL		 MDDRLLTVLL LLLGVSGPWG QG ATG GAT GAT CGG CTC CTG ACA GTG TTG CTG CTC CTG CTG GGT GTC TCA GGC CCA TGG GGA CAG GGA
2-2. 임시 발현
10 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide)로부터 발현되는 mCherry 발현 벡터 각각을 CHO-S 세포주 Amaxa 4D-Nucleofector Protocol에 따라 Transfection (1mL)을 진행하였다. 이후, 2 일차와 6 일차에 세포 내 형광과 배양액으로부터 분비된 형광 단백질의 형광 값을 측정하였다(도 3).
세포 내 형광의 경우, FACS (Accuri)를 이용하여 음성 대조군(Negative control; 공벡터, pMaxGFP) 보다 높은 부분의 히스토그램에서 평균값으로 측정하였다.
배양액으로 분비된 형광 단백질의 형광 값의 경우는 2 일차와 6 일차에 100ul을 샘플링(sampling) 한 후 원심분리(centrifugation) 하여 상등액(supernatant)만을 수득하고, Fluorescence 587/610nm 에서 다중 분석기(Multiple Reader)를 이용하여 측정하였다.
상기 배양액에서 측정된 형광값이 높은 신호 펩타이드(Signal Peptide)는 Cat, CC, Nuc, Clus, Pig 임을 확인하였고, 양성대조군 SP7.2 보다 높은 발현을 보인 분비 인자 4 종류(Clus, Pig, Nuc, CC)와 양성대조군(positive control)으로 쓰일 SP7.2와 세포 내에서 형광값이 높은 신호 펩타이드 1 종류(Proco)를 음성대조군(negative control)으로 선정하였다.
실시예 3. Site-Specific Integration을 통한 발현의 비교
3-1. Site-Specific Integration 을 위한 발현 벡터 제작
상기 실시예 2에서 선정된 5 종류의 신호 펩타이드(Clus, Pig, Nuc, CC, Proco) 및 대조군인 SP7.2를 포함한 mCherry 서열을 CHO Genome 특정 위치에 동일하게 삽입하여 정량적으로 발현량을 비교하였다(도 4 및 도 5).
삽입 위치는 Hprt Site로 정하였고, J.S Lee et al., 2015 , "Site-Specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway", Sci. Rep., 5를 참고하여 Homology Arm 서열과 sgRNA 서열을 design 하였다.
5' Homology Arm의 경우, CHO-S Genome을 주형(Template)으로 하여 Bg1Ⅱ와 NruI Enzyme Site가 포함된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR 한 뒤 Bg1Ⅱ/NruI으로 Digestion 한 pcDNA3.1(+) 벡터(Vector)에 클로닝(Cloning) 하였다.
3' Homology Arm의 경우, 동일하게 CHO-S Genome을 주형(Template)으로 하여 SalI site가 각각 포함된 프라이머(Primer)로 PCR 한 후, 5'Homology Arm이 삽입된 벡터(Vector)와 함께 SalI Single Cut 하여 NeoR Gene Downstream 쪽에 Cloning 하였다(pcDNA3.1_hprt).
Homology Recombination 되어 Genome 상에 삽입된 것만 확인하기 위해 Double Selection을 위해 5'Homology Arm Upstream 부분에 Cmy-GFP-BHG pA Fragment를 제작하여 SpeI 과 Bg1Ⅱ로 삽입하였다(pcDNA3.1_G_hprt).
GFP Fragment의 경우, 먼저 pcDNA3.1(+) Vector에 NcoI/XbaI으로 MCS 에 삽입한 후 SpeI과 Bg1Ⅱ Restriction site가 포함된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR 후 Homology가 포함된 Vector (pcDNA_hprt)에 SpeI가 Bg1Ⅱ site를 이용하여 삽입하였다.
완성된 pcDNA3.1_G_hprt Vector를 이용하여 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열이 포함된 mCherry 유전자 서열을 KpnI과 XhoI으로 절단(Cut)하여 MCS 부분에 삽입하였다.
그 결과, CMV-EGFP-pA-5' Hprt Homology Arm - CMV - Signal Peptide 후보 - mCherry - BGH pA - NeoR Selection Marker Cassette - 3'Hprt Homology Arm 형태의 발현 카세트가 포함된 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터를 제작하였다.
3-2. 위치 특이적(Site-Specific) Integration
상기 제작한 6 종류의 Site Specific Integration 용 Vector를 CHO-S Genome 내 Hprt Site에 삽입하기 위해 CRISPR-Cas9을 이용하여 Knock In 하였다. sgRNA 240 ng, cas9 Protein 1250 ng, Donor Vector 1 ㎍을 Nucleofector Solution 과 섞어 50 ㎕ Mixture를 각각 제조하였다.
CHO-S 1x106 cell을 Nucleofector 50 ㎕에 풀어 먼저 제작한 Mixture와 섞은 후, 최종 100 ㎕를 전기 천공법(Electrophoration)을 진행하였다.
전기 천공법(Electrophoration)을 진행한 후, 0.5㎖ 배지와 섞은 후, 2.5㎖ 배지에 첨가하여 6 well plate에서 36.5℃, CO2 5%의 조건으로 배양하였다.
2일 후, Zeneticin (0.5 mg/L)이 포함된 CD CHO Media에서 Selection 진행 한 후, Viability가 90% 회복할 때까지 계대 배양을 진행하였다.
Viability 90% 회복 후, 3x105 cells/mL로 cell 농도를 맞추어 6 well에 각각 4 mL을 Duplicate로 배양하고, 2~3 일 간격으로 Vi-Cell 측정 및 배지 형광값 (587 nm/610 nm)을 측정하였다(도 5).
그 결과, CC, Clus, Pig 분비 서열이 대조군 SP7.2 보다 높게 발현됨을 확인하였다.
실시예 4. Anti PD-1 Antibody 발현 및 Mass 분석
4-1. Anti PD1 항체 생산을 위한 발현 벡터의 제작
Site Specific Integration을 통해 신호 펩타이드(Signal Peptide)의 발현능을 비교한 뒤, 발현이 높은 CC, Clus, Pig를 포함하는 4 종류의 신호 펩타이드(Signal Peptide; (CC, Pig, Clus, SP7.2))가 융합된 Anti-PD-1 항체를 발현시키고자 하였다. 목적 단백질로는 Pembrolizumab (Keytruda®) 항체 서열을 사용하였다.
경사슬(Light Chain)과 중사슬(Heavy Chain)의 아미노산 서열과 일치하는 DNA 서열을 합성한 후, Overlap PCR을 통해 각각의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 서열과 융합한 형태의 서열을 제작하였다.
상기 경사슬(Light Chain)의 경우 BamHI 과 XhoI으로, 중사슬(Heavy Chain)의 경우 AscI과 NotI으로 restriction 한 후, pcDNA3.1(+)의 변형체인 pTz-D1G1 Vector (KR 10-1038126B1의 promoter를 포함)에 삽입하였다.
pCB_SP7.2_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 33) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 33) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_Clus_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 4) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 4) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_CC_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 2) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 2) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
pCB_Pig_Pem
'(N-말단) - [BamHI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 5) - Pem Light Chain (서열번호 58) - XhoI 제한 부위] - (C-말단)' / '(N-말단) - [AscI 제한 부위 - 신호 펩타이드 (서열번호 5) - Pem Heavy Chain (서열번호 59) - NotI 제한 부위] - (C-말단)'
4-2. Anti-PD1 항체의 발현
상기 준비된 재조합 발현 벡터 pCB-SP7.2-Pem, pCB-Clus-Pem, pCB-Pig-Pem 및 pCB-CC-Pem을 ExpiCHO-STM 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 도입하고, ExpiCHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific; 30 mL)에서 12일 동안 배양(Fed-Batch Culture; Day 1 & Day 5 Feeding)하여, 상기 융합 폴리펩타이드 Pembrolizumab을 발현시켰다.
4-3. Anti-PD1 항체 정제 및 Mass 분석
상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드를 ProteinA 정제하였다. 구체적으로, 회수한 배양액은 0.22 ㎛ 필터로 여과한 뒤 ProteinA 레진이 패킹되어 있는 칼럼 (Hitrap MSS, GE Healthcare, 11-0034-93)을 AKTATM Avant25 (GE Healthcare Life Sciences)에 장착하고 PBS 버퍼를 흘려주어 칼럼(column)을 평형화였다.
상기 여과한 배양액을 칼럼(column)에 주입한 후 다시 PBS 버퍼를 흘려주어 칼럼(column)을 세척하였다. 상기 칼럼(column)의 세척 작업이 끝난 후 용출 버퍼 (Citrate Buffer, pH 3.5)를 칼럼(column)에 흘려주어 목적 단백질을 용출시켰다.용출액은 Amicon Ultra Filter Device (MWCO 30K, Merck)와 원심분리기를 이용하여 농축을 수행한 후 PBS로 버퍼교환을 실시하였다.
융합폴리펩타이드의 정량 분석은 UV Spectrophotometer (G113A, Agilent Technologies)에서 280 nm와 340 nm의 흡광도를 측정하고, 하기 계산식을 통해 실시하였다. 각 물질의 흡광계수는 아미노산 서열을 이용하여 이론적으로 계산된 값(1.404)을 사용하였다.
Figure PCTKR2020017413-appb-I000001
(*Extinction Coefficient (0.1%): 단백질의 농도가 0.1% (1 g/L)이고, Primary Sequence 상의 모든 시스테인(Cysteine)이 산화되어 이황화결합(Disulfide bond)를 형성한다고 가정할 때, 280nm에서의 이론적인 흡광도임. ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)을 통해 계산됨.)
정제된 목적 단백질들은 Q-TOF MS를 이용해 단백질의 N Term 부분에서 신호 펩타이드(Signal Peptide)의 Mis-Cleavage 여부를 확인하였다(도 6). 1 mg/mL 농도로 희석 후 PNGaseF를 처리하고, 6M Guanidine과 DTT를 처리한 후 Q-TOF MS (RMM-MT-001: ACQUITY UPLC+Q-TOF SYNAPT G2 (Waters))에 Loading 하였다.
그 결과, 예측된 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 CHO 세포 유래 단백질 분비인자인 신호 펩타이드는 재조합 단백질의 발현량을 증가시켜 생산성을 향상시키고, 질량(Mass) 분석을 통해 예측한 절단 부위(cleavage site)에서 100% 절단(cleavage)됨을 확인함으로써 기존 단백질 분비 인자의 문제점인 오절단(mis-cleavage)을 해결할 수 있는 강력한 유전자 도구가 될 수 있음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 내재 단백질 또는 외래 단백질인 것인, 단백질 분비 인자.
  3. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편(Fab 또는 ScFv), 융합단백질(Fusion Protein), 스캐폴드 단백질(Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자(Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 발현 카세트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15인 것인, 발현 카세트.
  6. 제3항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 발현 카세트.
  7. 제3항에 있어서, 상기 발현 카세트는 세포 내에서 발현 시 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그대로 발현시키는 것인, 발현 카세트.
  8. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 항체 단편(Fab 또는 ScFv), 융합단백질(Fusion Protein), 스캐폴드 단백질(Protein Scaffold), 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 성장 분화 인자(Growth differentiation factor), 세포부착 단백질(Cell adhesion protein), 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 발현벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15인 것인, 발현벡터.
  11. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 발현벡터.
  12. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 세포 내에서 발현 시 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그대로 발현시키는 것인, 발현벡터.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 발현벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell)인 것인, 형질전환체 세포.
  15. i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질 분비용 발현벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 상기 배양된 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 회수한 목적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell)인 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분비 인자는 상기 목적 단백질의 N-말단 절단 부위에서 절단되는 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 목적 단백질은 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열이 제거된 부가적인 아미노산이 추가되지 않은 목적 단백질 그 자체인 것인, 목적 단백질을 생산하는 방법.
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