WO2016153221A1 - L-아스파르트산 유도체를 생산하는 변이미생물 및 이를 이용한 l-아스파르트산 유도체의 제조방법 - Google Patents

L-아스파르트산 유도체를 생산하는 변이미생물 및 이를 이용한 l-아스파르트산 유도체의 제조방법 Download PDF

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송찬우
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    • C12Y403/01001—Aspartate ammonia-lyase (4.3.1.1), i.e. aspartase
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Definitions

  • the gene encoding the glyoxalate shunt regulator and the gene encoding fumarase are deleted, and L-aspartic acid (overexpressing the gene encoding aspartase (compartment) as compared to the wild-type strain) aspartic acid)
  • the present invention relates to a mutant microorganism having a derivative-generating ability and a method for preparing L-aspartic acid derivative using the same.
  • L-aspartic acid is achieved through the enzymatic conversion method using aspartase, which uses fumaric acid and ammonia as substrates.
  • L-aspartic acid is not only valuable in itself, but also through biological methods L-Alanine, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Threonine, Lysine, Methionine, 3-Hydroxypropionic acid, Cadaverin It can be said that its useful value is high because it can be converted into various derivative chemicals such as 5-Aminovaleric acid.
  • the production of L-aspartic acid derivatives was performed through a route for producing L-aspartic acid from oxaloacetate using aspartate aminotransferase.
  • the coupling reaction involves the conversion of L-glutamic acid to ⁇ -kegluglutaric acid during the production of L-aspartic acid from oxaloacetate.
  • the reaction is again coupled with a NAD (P) H consuming reaction to regenerate L-glutamic acid from ⁇ -keroglutaric acid (Salixo et al., Eur. J. Biochem., 121: 511, 1982).
  • the reaction using Aspartate aminotransferase is a complex enzymatic reaction to use as a major route to produce the desired chemicals, and it is a reaction that consumes additional reducing power.
  • the efficiency is lower than that of the aspartase reaction, which produces L-aspartic acid.
  • the present inventors have developed a strain having a fumaric acid producing ability, a precursor of L-aspartic acid, and by increasing the expression of aspartase in the strain, the aspartate pathway is the production path of the major L- aspartic acid
  • the mutant microorganism used as a microorganism
  • one of the derivatives of L-aspartic acid, 3-aminopropionic acid (beta alanine), 3-hydroxypropionic acid and 1,3-diaminopropane can be efficiently generated using the mutant microorganism. It was confirmed that the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a mutant microorganism using the aspartase pathway as a production pathway of major L-aspartic acid.
  • Aspartase pathway and aspartate transaminases for producing 3-aminopropionic acid, 3-hydroxypropionic acid and 1,3-diaminopropane, which are derivatives of L-aspartic acid, in an embodiment of the present invention.
  • Aspartate transaminase pathways are compared.
  • a strain having a production ability of fumaric acid is prepared, and a new metabolic circuit capable of efficient conversion of sugar to L-aspartic acid by overexpressing aspartase in the strain is established, and biologically derived from L-aspartic acid.
  • the method was developed for producing L-aspartic acid derivatives.
  • a method for increasing the activity of aspartase is to replace the native promoter of the aspA gene present on the genome with trc, tac, T7, lac, trp promoter, etc., which are more powerful promoters. And transforming the strain by cloning the gene encoding aspartase on the expression vector.
  • the sugar is selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, including Glucose, Sucrose, Galactose, Lactose, Maltose, Xylose, Glycerol, Fructose, and Sugar cane, which microorganisms can utilize as carbon sources. can do.
  • the promoter of the aspA gene on the genome was replaced with a strong trc promoter.
  • This enables the production of mutant microorganisms capable of efficient supply of L-aspartic acid from glucose through aspartase activity, and additionally producing strains capable of producing 3-aminopropionic acid from glucose through the introduction of aspartate- ⁇ -decarboxylase.
  • 2-ketoglutarate 4-aminotransferase and L-2,4-diaminobutyrate decarboxylase were introduced to prepare strains capable of producing 1,3-diaminopropane (FIG. 2).
  • the present invention comprises the steps of culturing the mutant microorganisms in a sugar-containing medium to produce L- aspartic acid derivatives; And it relates to a method for producing a L- aspartic acid derivative comprising the step of recovering the generated L- aspartic acid derivative.
  • the L-aspartic acid derivative refers to a chemical substance that can be converted from L-aspartic acid through a biological pathway, and refers to all chemicals that can be converted through enzymatic reaction from L-aspartic acid in vivo. Include.
  • L-aspartic acid derivatives include amino acids Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleucine, etc., which can be used as precursors of polymers, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 5 -Aminovaleric acid, 3-Hydroxypropionic acid, and the like.
  • the L-aspartic acid derivative is composed of Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleusine, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 3-Hydroxypropionic acid and 5-Aminovaleric acid It may be characterized in that selected from, but is not limited thereto.
  • 3-aminopropionic acid is not produced at all in wild type E. coli W3110, and 0.3 g / L of 3-aminopropionic acid is produced when pTac15k panD expression vector is introduced into E. coli W3110.
  • strain E. coli W3110 the iclR gene, fumA, fumB, fumC, ptsG (Phosphotransferase system) gene, lacI gene were deleted, and the pTac15k panD expression vector was transferred to a strain in which the promoter of the aspA gene was substituted with a strong trc promoter.
  • the present invention provides a gene encoding the iclR gene and the fumarase, an overexpression of the aspA gene compared to the wild type strain, a gene encoding aspartate decarboxylase, a gene encoding beta alanine pyruvate transaminase, and 3- Genes encoding the hydroxypropionate / 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase or malonic semialdehyde reductase are introduced from the sugar characterized in that the 3-Hydroxypropionic acid-producing mutant microorganism and the mutant microorganisms are cultured in a medium containing carbon source to produce 3-Hydroxypropionic acid Making a step; And it relates to a method for producing 3-Hydroxypropionic acid comprising the step of recovering the generated 3-Hydroxypropionic acid.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. However, the present invention includes other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are based on, for example, pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
  • DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed or transfected with the above-described expression vectors constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • binding method binding method
  • panning method panning method
  • film emulsion method film emulsion method
  • substantially pure in the definition of the present invention is meant that the polypeptide according to the present invention and the DAN sequence encoding the polypeptide are substantially free of other proteins derived from bacteria.
  • Host cells for expressing recombinant proteins are widely used by prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtillis, which are capable of culturing high concentration cells in a short time, are easily genetically engineered, and whose genetic and physiological characteristics are well known. Has been.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtillis
  • yeast strains Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha
  • E. coli W3110 was used as a host microorganism, but it is also obvious to those skilled in the art that other E. coli, bacteria, yeast, and mold can be used.
  • genes derived from specific strains are exemplified as genes to be introduced, but it will be apparent to those skilled in the art that there are no limitations as long as they are expressed in host cells to be introduced and exhibit the same activity.
  • E. coli W3110 (ATTC 39936)
  • the iclR gene was deleted using a one step inactivation method (Warner et al., PNAS, 6; 97 (12): 6640-6645, 2000) using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2. , Antibiotic resistance was eliminated.
  • E. coli W3110-I prepared in 1-1 the fumC gene was deleted by one step inactivation using the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4, and antibiotic resistance was removed.
  • E. coli W3110-IC prepared in 1-2 the fumA gene was deleted by one step inactivation using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6, and antibiotic resistance was removed.
  • E. coli W3110-ICA prepared in 1-3 the fumB gene was deleted by one step inactivation using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, and antibiotic resistance was removed.
  • E. coli W3110-ICAB prepared in 1-4 by using a one step inactivation method using the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, the ptsG gene was deleted and antibiotic resistance was removed.
  • E. coli W3110-ICABP prepared in 1-5 by using a one step inactivation method using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12, the lacI gene was deleted and antibiotic resistance was removed.
  • E. coli W3110-ICABPI prepared in 1-6 the aspA native promoter was replaced with a strong trc promoter using a one step inactivation method using the primers of SEQ ID NOs.
  • a chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum strain (ATCC 13032) was used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 to prepare panD gene segments encoding aspartate-decarboxylase. .
  • the prepared panD fragment was treated with a restriction enzyme (EcoRI and SacI) to a pTac15k plasmid that undergoes strong gene expression with a tac promoter, followed by conjugation with a T4 DNA ligase to prepare a recombinant plasmid pTac15k panD. (FIG. 3).
  • a chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) was used as a template, PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 to prepare panD gene segments encoding aspartate--decarboxylase, and strains of Bacilus cereus (ATCC 14579) strains.
  • a chromosome DNA was used as a template, PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 to prepare a bce4042 gene fragment encoding 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase, and a chromosome DNA of Pseudomonas aeroginosa PA01 was used as a template. PCR was performed with primers of to prepare a pae0132 gene fragment encoding beta alanine pyruvate transaminase.
  • panD, bce4042, and pae0132 fragments prepared above were restricted to the p100-99A plasmids that were subjected to gene expression with the p100 promoter (ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc: SEQ ID NO: 23).
  • ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc SEQ ID NO: 23
  • T4 DNA ligase a recombinant plasmid p100-99ApanDbce4042pae0132 was produced.
  • Codon-optimized dat gene was used as a template for artificially synthesized E. coli, and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 23 and 24 to prepare a dat gene fragment encoding 2-ketoglutarate 4-aminotransferase.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 25 and 26 to prepare a ddc gene fragment encoding L-2,4-diaminobutanolate decarboxylase.
  • COddc F 5'-AGACAGGGTACCTTTCACACAGGAAACAGAC-3 '
  • COddc R 5'-AGACAGCTGCAGTTAGTCTATGGGCGGCACGT-3 '
  • the p100-99ApanDbce4042pae0132 plasmid prepared in Example 2-2 was introduced into a strain suitable for the production of L-aspartic acid derivatives via the aspartase pathway prepared in Examples 1-7, and the p100-99A panD bce4042 pae0132 plasmid was introduced.
  • One E. coli W3110 was used as a control strain.
  • Mutant microorganisms with the ability to produce 3-hydroxypropionic acid were screened in LB plate medium supplemented with 50 ⁇ g / ml of Ampicillin.
  • the transformed strains were inoculated in 10 LB medium and precultured at 37 ° C. for 12 hours. Thereafter, 3 ml of the precultured culture was inoculated into 50 ml of modified MR medium in a 350 ml flask and cultured.
  • the modified MR medium contains 15g glucose, 9g (NH4) 2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4) 2HPO4, 3.0g Yeast extract, 2g NaHCO3, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO47H2O, A medium consisting of 0.01 g CaCl22H20, 5 ml trace metal solution (10 g FeSO47H2O, 2.2 g ZnSO44H2O, 0.58 g MnSO44H2O, 1 g CuSO45H2O, 0.1 g (NH4) 6Mo7O244H2O, 0.02 g Na2B4O710H2O) per liter of distilled water).
  • the culture was performed in a shaking incubator operating at 37 ° C. and 220 rpm for 24 hours. After the incubation, the culture was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant was collected and subjected to liquid chromatography analysis to measure the production of 3-hydroxypropionic acid.
  • the p15COdatddc plasmid prepared in Example 2-3 was introduced into a strain suitable for the production of L-aspartic acid derivative through the aspartase pathway prepared in Examples 1-7, and E. coli WL3110 introduced with p15COdatddc plasmid was used as a control strain. Used.
  • Mutant microorganisms with 1,3-diaminopropane-producing ability were screened in LB plate medium supplemented with kanamycin (30 ⁇ g / ml).
  • the transformed strains were inoculated in 10 LB medium and precultured at 37 ° C. for 8 hours. Thereafter, 1.5 ml of the pre-cultured culture was inoculated into 50 ml of modified MR medium in a 350 ml flask and cultured.
  • the modified MR medium (pH 7.0) contains 10 g glucose, 3 g (NH 4) 2 SO 4, 6.67 g KH 2 PO 4, 4.0 g (NH 4) 2 HPO 4, 3.0 g Yeast extract, 2 g NaHCO 3, 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 47 H 2 O, A medium consisting of 0.01 g CaCl22H20, 5 ml trace metal solution (10 g FeSO47H2O, 2.2 g ZnSO44H2O, 0.58 g MnSO44H2O, 1 g CuSO45H2O, 0.1 g (NH4) 6Mo7O244H2O, 0.02 g Na2B4O710H2O) per liter of distilled water).
  • the culture was carried out in a shaking incubator operating at 37 °C and 220rpm for 36 hours. After the incubation, the culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant was collected and subjected to liquid chromatography analysis to measure the production of 1,3-diaminopropane.

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Abstract

본 발명은 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자 및 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 L-아스파르트산 유도체 생성능을 가지는 변이미생물 및 이를 이용한 L-아스파르트산 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 생물학적 방법으로, L-Alanine, 3-Aminopropionic acid, Threonine, 1,3-Diaminopropane, Lysine, Methionine, 3-Hydroxypropionic acid, Cadaverin, 5-aminovaleric acid 등의 다양한 아스파르트산 유도체를 제조할 수 있다.

Description

L-아스파르트산 유도체를 생산하는 변이미생물 및 이를 이용한 L-아스파르트산 유도체의 제조방법
본 발명은 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자 및 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 L-아스파르트산 (aspartic acid) 유도체 생성능을 가지는 변이미생물 및 이를 이용한 L-아스파르트산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
L-아스파르트산의 산업적인 생산은 푸마르산과 암모니아(ammonia)를 기질로 이용하는 아스파르테이즈를 이용한 효소전환방법을 통해 이루어진다. L-아스파르트산은 그 자체로도 이용가치가 클 뿐만 아니라, 생물학적인 방법을 통해 L-Alanine, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Threonine, Lysine, Methionine, 3-Hydroxypropionic acid, Cadaverin, 5-Aminovaleric acid 등의 다양한 유도체 화학물질로의 전환이 가능하기 때문에 그 이용가치가 크다고 할 수 있다.
기존의 대사공학적 균주개량 방법에 있어서는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase)를 이용하여 옥살로아세테이트(Oxaloacetate) 로부터 L-아스파르트산을 만드는 경로를 통하여 L-아스파르트산 유도체의 생산이 이루어 졌다. 하지만, 이 경로의 경우 커플링반응으로써, 옥살로아세테이트로부터 L-아스파르트산이 생성되는 과정에서 L-글루탐산 (glutamic acid)이 α-케로글루타르산 (Ketoglutaric acid) 로 전환되는 과정이 수반되며, 이 반응은 다시 α-케로글루타르산 로부터 L-글루탐산을 재생시키기 위한 NAD(P)H 소모 반응과 커플링되어있다 (Salerno et al., Eur. J. Biochem., 121:511, 1982). 이와같은 효소반응의 특성으로 인해 Aspartate aminotransferase를 이용한 반응은 원하는 화학물질을 생산하는 주요경로로 이용하기에는 복잡한 효소반응이며 환원력이 추가로 소모되는 반응이므로, 환원력을 필요로 하지 않고, 암모니아가 바로 푸마르산과 반응해서 L-아스파르트산을 만드는 아스파르테이즈 반응에 비하여 그 효율성이 떨어진다고 볼 수 있다.
이에, 본 발명자들은 L-아스파르트산의 전구체인 푸마르산 생산능을 가지는 균주를 개발하고, 상기 균주에서 아스파르테이즈의 발현양을 증가시킴으로써, 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산의 생성경로로 이용하는 변이미생물을 제작하는 경우, 상기 변이미생물을 이용하여 L-아스파르트산의 유도체 중 하나인 3-aminopropionic acid (beta alanine), 3-hydroxypropionic acid, 1,3-diaminopropane 을 효율적으로 생성할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산의 생성경로로 이용하는 변이미생물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자 및 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 L-아스파르트산 유도체 생성능을 가지는 변이미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 L-아스파르트산 유도체를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 L-아스파르트산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아스파르트산 유도체의 제조방법을 제공한다.
도 1은 아스파르테이즈 경로를 주요 대사경로로 이용하여 글루코오스를 L-아스파르트산로 전환하는 변이미생물의 대사회로를 제작하는 방법을 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 실시예에서 L-아스파르트산의 유도체인 3-aminopropionic acid, 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-diaminopropane 을 생산하기 위한 아스파르테이즈(Aspartase) 경로와 아스파르테이트 트랜스아미네이즈 (Aspartate transaminase) 경로를 비교한 것이다.
도 3은 3-aminopropionic acid를 생산하기 위한 panD 유전자가 삽입된 pTac15k panD 과발현 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 4은 3-hydroxypropionic acid를 생산하기 위한 panD 유전자, bce4042 유전자 및 pae0132 유전자가 삽입된 p100-99ApanDbce4042pae0132 과발현 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 5은 1,3-diaminopropane을 생산하기 위한 dat 유전자와 ddct 유전자가 삽입된 p15COdatddc 과발현 플라스미드를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 먼저 푸마르산의 생성능을 가지는 균주를 제작하고, 상기 균주에 아스파르테이즈를 과발현시킴으로써 당을 L-아스파르트산으로의 효율적인 전환이 가능한 새로운 대사회로를 확립하고, L-아스파르트산으로부터 생물학적인 방법을 통해 L-아스파르트산 유도체를 생산하는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자 및 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 당으로부터 L-아스파르트산 유도체 생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 글리옥살레이트 션트(Glyoxlyate shunt)로의 대사흐름을 조절하는 로컬 레귤레이터(local regulator)유전자를 결실시키고, 푸마레이즈 활성을 가지는 유전자를 결실시킨 후, 아스파테이즈 활성을 가지는 유전자를 과발현시켜, 당으로 부터 아스파테이즈에 의해 촉매되는 반응을 L-아스파르트산 주요 생성경로로 이용하고, 이를 통해 L-아스파르트산 유도체를 생산할 수 있는 시스템을 확립하였다.
본 발명에서, 아스파테이즈의 활성을 증가시키기 위한 방법으로는 유전체 상에 존재하는 aspA 유전자의 자연 프로모터 (Native promoter) 를 강력한 보다 강력한 프로모터인 trc, tac, T7, lac, trp promoter 등으로 치환하는 것을 포함하고, 발현벡터 상에 아스파테이즈를 암호화하는 유전자를 클로닝하여 균주를 형질전환 시키는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 박테리아는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당은 미생물이 탄소원으로써 활용가능한 Glucose, Sucrose, Galactose, Lactose, Maltose, Xylose, Glycerol, Fructose 및 Sugar cane을 포함하는 단당류, 이당류, 다당류로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, Glyoxylate shunt의 local regulator를 코딩하는 유전자는 iclR 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 푸마레이즈를 코딩하는 유전자는 fumA, fumB, fumC 인 것을 특징으로 할 수 있고, 아스파테이즈를 코딩하는 유전자는 aspA 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 변이 미생물을 이용하여 L-아스파르트산의 유도체를 생산하는 것은, 글루코오스로부터 전환된 푸마르산이 높은 아스파테이즈 활성에 의해 L-아스파르트산으로 전환이 되고, 이어서 추가 도입된 L-아스파르트산 유도체 합성을 위한 유전자에 의해 L-아스파르트산 유도체로 전환되는 것을 특징으로 한다 (도 1).
본 발명의 일 실시예에서는, 아스파테이즈 에 의해 촉매되는 반응을 주요 L-아스파르트산 유도체 생산 경로로 이용하여 3-aminopropionic acid, 3-hydroxypropionic acid, 그리고 1,3-diaminopropane의 생산이 가능한 변이 미생물을 제조하기 위하여 대장균 W3110에서 iclR (Glyoxylate shunt local regulator) 유전자 및 알려진 푸마레이즈 유전자인 fumA, fumB, fumC 유전자를 결실 시켰으며, 부산물의 생성을 줄이기 위한 목적으로 ptsG (Phosphotransferase system) 유전자를 결실하였고, 항시발현시스템의 구축을 위하여 lacI 유전자를 추가로 결실하였다. 추가적으로 유전체상의 aspA 유전자의 프로모터를 강력한 trc promoter로 치환하였다. 이를 통해 글루코오스로부터 아스파테이즈 활성을 통해 L-아스파르트산의 효율적인 공급이 가능한 변이 미생물의 제작이 가능하며, 추가적으로 aspartate-α-decarboxylase의 도입을 통하여 글루코오스로부터 3-aminopropionic acid의 생산이 가능한 균주를 제작하였고, 2-ketoglutarate 4-aminotransferase와 L-2,4-diaminobutyrate decarboxylase를 도입하여 1,3-diaminopropane 의 생산이 가능한 균주를 제작하였다 (도 2).
또한, 상기 3-aminopropionic acid의 생산이 가능한 균주에서, 추가적으로 beta alanine pyruvate transaminase와 3-hydroxypropionate / 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase 또는 malonic semialdehyde reductase를 도입시켜 글루코오스로부터 3-hydroxypropionic acid의 생산이 가능한 균주를 제작하였다 (도 2).
다른 관점에서, 본 발명은 상기 변이미생물을 당 함유 배지에서 배양하여 L-아스파르트산 유도체를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 L-아스파르트산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아스파르트산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 L-아스파르트산 유도체란, L-아스파르트산으로부터 생물학적인 경로를 통하여 전환이 가능한 화학물질을 통틀어 일컫는 개념으로, 생체 내에서 L-아스파르트산으로부터 효소반응을 통해 전환이 가능한 모든 화학물질을 포함한다.
대표적인 L-아스파르트산 유도체로는 아미노산인 Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleucine 등을 포함하고, 폴리머의 전구체로 이용이 가능한 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 5-Aminovaleric acid, 3-Hydroxypropionic acid 등을 포함할 수 있다.
따라서, 상기 L-아스파르트산 유도체는 Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleusine, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 3-Hydroxypropionic acid 및 5-Aminovaleric acid 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서는 본 발명에 따라서 제조된 변이 미생물을 배양하여 L-아스파르트산의 유도체로써 3-aminopropionic acid, 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-diaminopropane을 생산하는 균주만을 예로써 제작하였으나, 본 발명은 상기 화학물질 이외에도 당으로부터 아스파테이즈 경로를 이용하여 L-아스파르트산을 공급하고, 이로부터 생물학적인 방법을 통해 전환이 가능한 다양한 L-아스파르트산 유도체 생산에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 iclR 유전자 및 fumarase를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, aspartate dehydroxylase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 3-Aminopropionic acid 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 3-Aminopropionic acid 을 생성시키는 단계; 및 상 3-Aminopropionic acid 을 회수하는 단계를 포함하는 3-Aminopropionic acid 의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일양태에서는 야생형 대장균 W3110에서는 3-aminopropionic acid가 전혀 생산되지 않는 것을 확인 할 수 있었으며, 대조군으로 대장균 W3110에 pTac15k panD 발현벡터를 도입한 경우는 0.3g/L의 3-aminopropionic acid가 생산되었으나, 본원발명이 균주인 대장균 W3110에서 iclR 유전자 및 fumA, fumB, fumC, ptsG (Phosphotransferase system) 유전자, lacI 유전자가 결실되고, aspA 유전자의 프로모터를 강력한 trc promoter로 치환한 균주에 pTac15k panD 발현벡터를 도입한 경우 0.85 g/L의 3-aminopropionic acid가 생산되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터, 푸마르산 생성능을 기본으로하여 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산 생성 경로로 이용하는 경우가, 야생형 균주 및 아스파르테이즈에 의한 촉매반응을 주요 L-아스파르트산 생성경로로 활용하지 않는 균주에 비하여 L-아스파르트산 유도체 중의 하나인 3-aminopropionic acid 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 iclR 유전자 및 fumarase를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, 2-ketoglutarate 4-aminotransferase와 L-2,4-diaminobutyrate decarboxylase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 1,3-diaminopropane 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 1,3-diaminopropane를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 1,3-diaminopropane를 회수하는 단계를 포함하는 1,3-diaminopropane의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 야생형 대장균 W3110에서는 1,3-diaminopropane가 전혀 생산되지 않는 것을 확인 할 수 있었으며, 대조군으로 대장균 W3110에 p15COdatddc 발현벡터를 도입한 경우 0.21 g/L 의 1,3-diaminopropane이 생성되는 것을 확인할 수 있었으나, 본원발명이 균주인 대장균 W3110에서 iclR 유전자 및 fumA, fumB, fumC, ptsG (Phosphotransferase system) 유전자, lacI 유전자가 결실되고, aspA 유전자의 프로모터를 강력한 trc promoter로 치환한 균주에 p15COdatddc 발현벡터를 도입한를 도입한 경우, 0.39 g/L의 1,3-diaminopropane이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 iclR 유전자 및 fumarase를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, aspartate decarboxylase를 코딩하는 유전자, beta alanine pyruvate transaminase를 코딩하는 유전자 및 3-hydroxypropionate/ 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase 또는 malonic semialdehyde reductase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 3-Hydroxypropionic acid 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 3-Hydroxypropionic acid를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 3-Hydroxypropionic acid를 회수하는 단계를 포함하는 3-Hydroxypropionic acid의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 야생형 대장균 W3110에서는 3-hydroxyproionic acid가 전혀 생산되지 않는 것을 확인 할 수 있었으며, 대조군으로 대장균 W3110에 p100-99ApanDbce4042pae0132 발현벡터를 도입한 경우 0.08 g/L 의 3-hydroxypropionic acid가 생성되는 것을 확인할 수 있었으나, 본원발명이 균주인 대장균 W3110에서 iclR 유전자 및 fumA, fumB, fumC, ptsG (Phosphotransferase system) 유전자, lacI 유전자가 결실되고, aspA 유전자의 프로모터를 강력한 trc promoter로 치환한 균주에 p100-99ApanDbce4042pae0132 발현벡터를 도입한를 도입한 경우, 0.2 g/L의 3-hydroxypropionic acid가 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 푸마르산 생성능을 기본으로하여 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산 생성 경로로 이용하는 경우가, 야생형 균주에 비하여 L-아스파르트산 유도체 중의 하나인 3-hydroxypropionic acid 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 결실이란 해당유전자의 일부 또는 전체염기를 변이, 치환 또는 삭제시키는 방법을 통해 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성 경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 과발현이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환 시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.
본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능 하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질 감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 NSP 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용할 수 있는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다. 또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래의 유전자만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1
1-1 iclR 유전자의 결실 (W3110-I의 제작)
대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, iclR 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 1] iclR k/o F:
5-AGAAAACCCGCCGTTGCCACCGCACCAGCGACTGGACAGGTTCAGTCTTTGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 2] iclR k/o R:
5-TCGCCGCTTTAATCACCATCGCGCCAAACTCGGTCACGCGGTCATCGGTACCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-2 fumC 유전자의 결실 (W3110-IC의 제작)
상기 1-1에서 제작된 대장균 W3110-I에서, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, fumC 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 3] fumC k/o F:
5-GTTGTCTGAAGAGAAAGCGAGCGCCATTCGTCAGGCGGCGGATGAAGTACGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 4] fumC k/o R:
5-ATTGGACGGAAGACGTTCAGTTCAAAGTTACCGGAAGCGCCCCCCATGTTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-3 fumA 유전자의 결실 (W3110-ICA의 제작)
상기 1-2에서 제작된 대장균 W3110-IC에서, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, fumA 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 5] fumA k/o F:
5-TGATACTGAGTATTACCTGCTAACCAGCGAACACGTTAGCGTATCTGAATGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 6] fumA k/o R:
5-ACGCCGGGAAATCTTCCACTTCAATTTTCCAGATGGCTTCCATTCCCAGTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-4 fumB 유전자의 결실 (W3110-ICAB의 제작)
상기 1-3에서 제작된 대장균 W3110-ICA에서, 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, fumB 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 7] fumB k/o F:
5-GCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATGTGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 8] fumB k/o R:
5-CGCATTTTCTCGACGAGGAAGTTTTTCAGTTTGCCGGGAGTCAGCAGGGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-5 ptsG 유전자의 결실 (W3110-ICABP의 제작)
상기 1-4에서 제작된 대장균 W3110-ICAB에서, 서열번호 9 및 10의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, ptsG 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 9] ptsG k/o F:
5-CCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGAGAACGTAAAAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 10] ptsG k/o R:
5-GAGAGAAGGTCTGGATTGCAGAACCAATCGGCGGCCAAATGAAGGACAGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-6 lacI 유전자의 결실 (W3110-ICABPI의 제작)
상기 1-5에서 제작된 대장균 W3110-ICABP에서, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 11] lacI k/o F:
5-CGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGGACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 12] lacI k/o R:
5-CCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3
1-7 aspA유전자의 native promoter를 강력한 trc 프로모터로 치환 (W3110-ICABPI-Apr의 제작)
상기 1-6에서 제작된 대장균 W3110-ICABPI에서, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법을 이용하여, aspA native promoter를 강력한 trc promoter로 치환하였다.
[서열번호 13] aspA p/r F:
5-GGTAACCAGCGCAAAGGTTTCTCCTGTAATAGCAGCCGGTTAACCCCGGC GACACTATAGAACGCGGCCG-3
[서열번호 14] aspA p/r R:
5-GGAACTTCCCTGGTACCCAACAGATCTTCTTCGATACGAATGTTGTTTGACATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA-3
실시예 2
2-1 L-Aspartic acid로부터 3-Aminopropionic acid의 생산을 위한 pTac15k panD 벡터의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주 (ATCC 13032)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15와 16의 프라이머로 PCR을 수행하여, aspartate--decarboxylase를 코딩하는 panD 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 15] panD F:
5'-AGACAGGAATTCATGCTGCGCACCATCCTCG-3'
[서열번호 16] panD R:
5'-AGACAGGAGCTCCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAGC-3'
다음으로, 상기 제조된 panD 절편을 tac promoter로 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15k 플라스미드에 제한효소 (EcoRI 및 SacI)를 처리한 후, T4 DNA라이게이즈로 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pTac15k panD를 제작하였다 (도 3).
2-2 L-Aspartic acid로부터 3-Hydroxypropionic acid의 생산을 위한 p100-99A panD bce4042 pae0132 벡터의 제작
Corynebacterium glutamicum(ATCC 13032) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17와 18의 프라이머로 PCR을 수행하여, aspartate--decarboxylase를 코딩하는 panD 유전자 절편을 제작하였고, Bacilus cereus (ATCC 14579) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19와 20의 프라이머로 PCR을 수행하여 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase를 코딩하는 bce4042 유전자 절편을 제작하였으며, Pseudomonas aeroginosa PA01 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21와 22의 프라이머로 PCR을 수행하여 beta alanine pyruvate transaminase를 코딩하는 pae0132 유전자 절편을 제작하였다
[서열번호 17] panD F:
5'-AGACAGGAATTCATGCTGCGCACCATCCTCG-3'
[서열번호 18] panD R:
5'-AGACAGGAGCTCCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAGC-3'
[서열번호 19] bce4042 F:
5'-AGACAGGAGCTCACAGGAAACAGACCATGGAACATAAAACTTTATCAATAGGTTTC-3'
[서열번호 20] bce4042 R:
5'-AGACAGTCTAGATTACCCCCTTATATATTTTTTATATAGTACTTGTG-3'
[서열번호 21] pae0132 F:
5'-AGACAGTCTAGAGAAAGCCCGAGGATCGAACGA-3'
[서열번호 22] pae0132 R:
5'-AGACAGCCTGCAGGTCAGGCGATGCCGTTGAGC-3'
다음으로, 상기 제조된 panD, bce4042 및 pae0132 단편을 p100 promoter (ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc:서열번호 23) 로 유전자 발현을 진행하는 p100-99A 플라스미드에 제한효소 (EcoRI 및 SacI), (SacI 및 XbaI) 및 (XbaI 및 SbfI) 으로 각각 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈로 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 p100-99ApanDbce4042pae0132를 제작하였다
2-3 L-Aspartic acid로부터 1,3-diaminopropane의 생산을 위한 p15COdatddc 벡터의 제작
인위로 합성된 대장균에 코돈 최적화된 dat 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 23와 24의 프라이머로 PCR을 수행하여, 2-ketoglutarate 4-aminotransferase를 코딩하는 dat 유전자 절편을 제작하였고, 인위로 합성된 대장균에 코돈 최적화된 ddc 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 25와 26의 프라이머로 PCR을 수행하여 L-2,4-diaminobutanolate decarboxylase를 코딩하는 ddc 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 23] COdat F: 5'-AGACAGGAATTCATGTCGGTTACATCTGTCA-3'
[서열번호 24] COdat R: 5'-AGACAGGGTACCTTACGCGCCCCG-3'
[서열번호 25] COddc F: 5'-AGACAGGGTACCTTTCACACAGGAAACAGAC-3'
[서열번호 26] COddc R: 5'-AGACAGCTGCAGTTAGTCTATGGGCGGCACGT-3'
다음으로, 상기 제조된 dat 및 ddc 단편을 tac promoter로 유전자 발현을 진행하는 pTac15K 플라스미드에 제한효소 (EcoRI 및 KpnI), 및 (KpnI 및 PstI) 으로 각각 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈로 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 p15COdatddc를 제작하였다
실시예 3: 변이미생물의 3-aminopropionic acid 생성능의 측정
실시예 2-1에서 제작한 pTac15k panD 플라스미드를 상기 실시예 1-7에서 제작한 아스파르테이즈 경로를 통한 L-아스파르트산 유도체 생산에 적합한 균주에 도입하였으며, aspA 유전자의 프로모터 치환을 수행하지 않은 상기 실시예 1-6 균주에 pTac15k panD 플라스미드를 도입한 균주와 대장균 W3110을 대조군 균주로 사용하였다.
3-aminopropionic acid 생성능을 가지는 변이미생물들은 카나마이신(kanamycin) 이 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 전배양한 배양액 3㎖을 350㎖ 플라스크에 50㎖의 변형 MR배지에 접종하여 배양하였다.
변형MR배지 (pH 6.5)의 조성은 증류수 1리터당 15g glucose, 9g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 3.0g Yeast extract, 2g NaHCO3, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO47H2O, 0.01g CaCl22H20, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO47H2O, 2.2g ZnSO44H2O, 0.58g MnSO44H2O, 1g CuSO45H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g Na2B4O710H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 배양은 24시간동안 37℃와 220rpm으로 작동하는 shaking incubator에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 액체크로마토그래피(liquid chromatography)분석을 수행함으로써, 3-aminopropionic acid의 생산을 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 3-aminopropionic acid가 전혀 생산되지 않는 것을 확인 할 수 있었으며, 야생형 대장균 W3110에 pTac15k panD 발현벡터를 도입한 대조군에서는 0.3 g/L 의 3-aminopropionic acid가 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 1-6 균주에 pTac15k panD 발현벡터를 도입한 대조군에서는 3-aminopropionic acid가 전혀 생산되지 않음을 확인할 수 있었으나, aspA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 실시예 1-7에 pTac15k panD 발현벡터를 도입한 경우 0.85 g/L의 3-aminopropionic acid가 생산됨을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 푸마르산 생성능을 기본으로하여 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산 생성 경로로 이용하는 경우가, 야생형 균주 및 아스파르테이즈에 의한 촉매반응을 주요 L-아스파르트산 생성경로로 활용하지 않는 균주에 비하여 L-아스파르트산 유도체 중의 하나인 3-aminopropionic acid 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2016002736-appb-T000001
실시예 4: 변이미생물의 3-Hydroxypropionic acid 생성능의 측정
실시예 2-2에서 제작한 p100-99ApanDbce4042pae0132 플라스미드를 실시예 1-7에서 제작한 아스파르테이즈 경로를 통한 L-아스파르트산 유도체 생산에 적합한 균주에 도입하였으며, p100-99A panD bce4042 pae0132 플라스미드를 도입한 대장균 W3110을 대조군 균주로 사용하였다.
3-hydroxypropionic acid 생성능을 가지는 변이미생물들은 엠피실린(Ampicillin) 이 50㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 전배양한 배양액 3㎖을 350㎖ 플라스크에 50㎖의 변형 MR배지에 접종하여 배양하였다.
변형 MR배지 (pH 6.5)의 조성은 증류수 1리터당 15g glucose, 9g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 3.0g Yeast extract, 2g NaHCO3, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO47H2O, 0.01g CaCl22H20, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO47H2O, 2.2g ZnSO44H2O, 0.58g MnSO44H2O, 1g CuSO45H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g Na2B4O710H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 배양은 24시간동안 37℃와 220rpm으로 작동하는 shaking incubator에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 액체크로마토그래피(liquid chromatography)분석을 수행함으로써, 3-hydroxypropionic acid의 생산을 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 전혀 3-hydroxypropionic acid가 생산이 되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 야생형 대장균 W3110에 p100-99ApanDbce4042pae0132 발현벡터를 도입한 경우 0.08 g/L 의 3-hydroxypropionic acid가 생성되는 것을 확인할 수 있었으나, aspA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 실시예 1-7에 p100-99ApanDbce4042pae0132 발현벡터를 도입한 경우 0.2 g/L의 3-hydroxypropionic acid가 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 푸마르산 생성능을 기본으로하여 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산 생성 경로로 이용하는 경우가, 야생형 균주에 비하여 L-아스파르트산 유도체 중의 하나인 3-hydroxypropionic acid 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2016002736-appb-T000002
실시예 5: 변이미생물의 1,3-diaminopropane 생성능의 측정
실시예 2-3에서 제작한 p15COdatddc 플라스미드를 실시예 1-7에서 제작한 아스파르테이즈 경로를 통한 L-아스파르트산 유도체 생산에 적합한 균주에 도입하였으며, p15COdatddc 플라스미드를 도입한 대장균 WL3110을 대조군 균주로 사용하였다.
1,3-diaminopropane 생성능을 가지는 변이미생물들은 카나마이신(kanamycin) 이 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10 LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 전배양한 배양액 1.5㎖을 350㎖ 플라스크에 50㎖의 변형 MR배지에 접종하여 배양하였다.
변형 MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 10g glucose, 3g (NH4)2SO4, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 3.0g Yeast extract, 2g NaHCO3, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO47H2O, 0.01g CaCl22H20, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO47H2O, 2.2g ZnSO44H2O, 0.58g MnSO44H2O, 1g CuSO45H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g Na2B4O710H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 배양은 36시간동안 37℃와 220rpm으로 작동하는 shaking incubator에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 액체크로마토그래피(liquid chromatography)분석을 수행함으로써, 1,3-diaminopropane의 생산을 측정하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 WL3110에서는 전혀 1,3-diaminopropane 생산이 되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 야생형 대장균 WL3110에 p15COdatddc 발현벡터를 도입한 경우 0.21 g/L 의 3-hydroxypropionic acid가 생성되는 것을 확인할 수 있었으나, aspA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 실시예 1-7에 p15COdatddc 발현벡터를 도입한 경우 0.39 g/L의 1,3-diaminopropane이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 푸마르산 생성능을 기본으로하여 아스파르테이즈 경로를 주요 L-아스파르트산 생성 경로로 이용하는 경우가, 야생형 균주에 비하여 L-아스파르트산 유도체 중의 하나인 1,3-diaminopropane 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2016002736-appb-T000003
본 발명에 따르면, 생물학적 방법으로, 글루코오스, 수크로오스, 갈락토오스, 락토오스, 말토오스, 글리세롤, 프록토오스 등의 탄소원으로부터 L-Alanine, 3-Aminopropionic acid, 1,3-Diaminopropane, Acrylic acid, Threonine, Lysine, Methionine, 3-Hydroxypropionic acid, Cadaverin, 5-Aminovaleric acid 등의 다양한 아스파르트산 유도체를 제조할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (17)

  1. 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자 및 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 당으로부터 L-아스파르트산 유도체 생성능을 가지는 변이미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스파테이즈를 코딩하는 유전자의 과별현은 모균주의 염색체 상에서 야생형 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 아스파테이즈를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 도입시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리옥살레이트 션트 레귤레이터를 코딩하는 유전자는 iclR 유전자인 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 푸마레이즈(fumarase)를 코딩하는 유전자 fumA, fumB 및 fumC로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아스파테이즈(aspartase)를 코딩하는 유전자는 aspA인 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 강력한 프로모터는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 L-아스파르트산 유도체는 Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleusine, Acrylic acid, 3-Aminopropionic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 3-Hydroxypropionic acid 및 5-Aminovaleric acid로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 당은 미생물이 탄소원으로써 활용가능한 글루코오스, 수크로오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스 및 슈가케인(sugar cane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 L-아스파르트산 유도체를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 L-아스파르트산 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아스파르트산 유도체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 L-아스파르트산 유도체는 Threonine, Methionine, Lysine, L-Alanine, Isoleusine, 3-Aminopropionic acid, Acrylic acid, 1,3-Diaminopropane, Cadaverine, 3-hydroxypropionic acid 및 5-Aminovaleric acid로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. iclR 유전자 및 fumarse를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, aspartate decarboxylase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 3-Aminopropionic acid 생성능을 가지는 변이 미생물.
  13. iclR 유전자 및 fumarase를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, 2-ketoglutarate 4-aminotransferase와 L-2,4-diaminobutanolate decarboxylase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 1,3-diaminopropane 생성능을 가지는 변이 미생물.
  14. iclR 유전자 및 fumarase를 암호화하는 유전자가 결실되어 있고, 야생형 균주에 비하여 aspA 유전자가 과발현되어 있고, aspartate decarboxylase를 코딩하는 유전자, 3-hydroxypropionate / 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase 또는 malonic semialdehyde reductase를 코딩하는 유전자 및 beta alanine pyruvate transaminase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 당으로부터 3-Hydroxypropionic acid 생성능을 가지는 변이 미생물.
  15. 제12항의 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 3-Aminopropionic acid를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 3-Aminopropionic acid를 회수하는 단계를 포함하는 3-Aminopropionic acid의 제조방법.
  16. 제13항의 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 1,3-diaminopropane를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 1,3-diaminopropane를 회수하는 단계를 포함하는 1,3-diaminopropane의 제조방법.
  17. 제14항의 변이미생물을 탄소원 함유 배지에서 배양하여 3-Hydroxypropionic acid를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 3-Hydroxypropionic acid를 회수하는 단계를 포함하는 3-Hydroxypropionic acid의 제조방법.
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