WO2010093150A2 - 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 - Google Patents

글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 Download PDF

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전용재
송효학
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한국과학기술원
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity, and to a method for producing succinic acid using the same, and more particularly, to produce succinic acid at a high concentration by efficiently using low-cost glycerol as a cell carbon source. It relates to a recombinant microorganism and a method for producing succinic acid using the same.
  • glycerol Although there are some microorganisms that do not have the ability to consume glycerol and use it as a carbon source, many types of microorganisms have been reported that can use glycerol as a primary or secondary carbon source.
  • glycerol with a chemical formula of C 3 H 8 O 3 has a higher reducing power than glucose, which is used as a carbon source for bio-based energy and chemical production through microbial fermentation, resulting in higher yield and productivity compared to raw materials of materials requiring high reducing power. It has the advantage of being able to improve.
  • studies on the use of glycerol using E. coli which has undergone the most metabolic characteristics and genetic studies, in particular, studies to produce more reduced energy and chemicals using glycerol (Dharmadi et al., Biotechnol). Bioeng ., 94: 822, 2006).
  • the second possible route is the introduction of glycerol by a glycerol intracellular transport promoter ( glpF ), followed by digestion with dihydroxyacetone (DHA) in the cell, which is digested with dihydroxyacetone phosphate (DHAP) If headed.
  • DHA dihydroxyacetone
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • succinic acid was produced in the MG1655 strain which deleted the dhaK gene and introduced a recombinant vector containing dhaKL of Citrobacter freundii , but the yield of succinic acid was low and the cell growth rate was low.
  • the disadvantage is the production of other fermentation by-products, including formic acid.
  • the present inventors have made efforts to improve succinic acid production by improving the ability of the glycerol of the strain, and as a result, a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase ( glpABC ) or glycerol dehydrogenase ( As a result of introducing sldAB ) into a host cell having succinic acid production ability, it was confirmed that the introduction of the glycerol related gene resulted in an improvement in glycerol metabolism and succinic acid production capacity in the host cell, thereby completing the present invention.
  • glpABC glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • glycerol dehydrogenase As a result of introducing sldAB ) into a host cell having succinic acid production ability, it was confirmed that the introduction of the glycerol related gene resulted in an improvement in glycerol metabolism and succinic acid production capacity in the host
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing succinic acid using the recombinant microorganism.
  • the present invention encodes a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or glycerol dehydrogenase to a microorganism having a succinic acid production ability
  • a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity into which a recombinant vector containing a gene is introduced.
  • the present invention also provides a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase on a chromosome of a microorganism having succinic acid production ability.
  • a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase on a chromosome of a microorganism having succinic acid production ability Provided are recombinant microorganisms with improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity.
  • the present invention also relates to a microorganism having a succinic acid producing ability, comprising a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase.
  • a method for producing a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity characterized by introducing a recombinant vector.
  • the present invention also provides a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase on a chromosome of a microorganism having succinic acid production ability.
  • a method for producing a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity characterized in that the insertion.
  • the present invention also comprises the steps of culturing the recombinant microorganism in a culture medium containing glycerol as a carbon source; And it provides a method for producing succinic acid comprising the step of recovering succinic acid from the culture.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the pathway of ingesting and digesting glycerol from the succinic acid-producing lumen bacterial strain Mannheimia succiniciproducens and metabolizing it through glycolysis (thin line: shows the metabolic pathway of glycolysis originally possessed by recombinant Maniamia. Line: indicates the metabolic pathway expected to be governed by glycerol metabolism-related enzymes from Gluconobacter oxydans introduced).
  • 2 is a cleavage map of the recombinant vector pFglpABC.
  • 3 is a cleavage map of the recombinant vector pEglpA.
  • 5 is a cleavage map of the recombinant vector pAFK.
  • 6 is a cleavage map of the recombinant vector pSDGOX.
  • FIG. 7 is a graph comparing the results of batch fermentation on glycerol medium of parent strains MBEL55E and JYJM01 strains.
  • a graph comparing batch fermentation results on glycerol medium of PALKpMS3 as a control group (A) shows the overall glycerol uptake rate per total cell weight, the unit is g / L / h / g DCW (B) is a graph showing the final succinic acid production, the unit is g / L, (C) is a graph showing the amount of glycerol consumed, the unit is g / L.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of batch fermentation on glycerol medium of M. succiniciproducens PALK / ACRP (JYJM03) strains.
  • the present invention is a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or glycerol dehydrogenase to a microorganism having succinic acid production ability
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity, into which a recombinant vector containing a gene is introduced.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of the current vector, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication, including several to hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) selection of host cells transformed with plasmid vectors. It has a structure that includes an antibiotic resistance gene that allows it to be used and a restriction enzyme cleavage site (c) into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA. After ligation, the vector should be transformed into the appropriate host cell. Transformation can be readily accomplished using calcium chloride methods or electroporation (Neumann et al., EMBO J. , 1: 841, 1982) and the like.
  • an expression vector known in the art may be used as the vector used for overexpression of the gene according to the present invention.
  • Sequences are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • “operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and present within the reading frame. However, enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the chosen expression host.
  • the expression control sequence and the corresponding gene will be included in one recombinant vector containing the bacterial selection marker and the replication origin. If the host cell is a eukaryotic cell, the recombinant vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed with the recombinant vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means that DNA is introduced into a host such that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or a gene encoding glycerol dehydrogenase is introduced into the genome of a host cell to exist as a chromosome factor. It can be characterized by. It will be apparent to those skilled in the art that the present invention may have the same effect as when the recombinant vector is introduced into the host cell even when the gene is inserted into the genomic chromosome of the host cell.
  • the present invention provides a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase or glycerol dehydrogenase on a chromosome of a microorganism having succinic acid production ability.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved glycerol metabolism and succinic acid production capacity, into which a gene encoding the gene is inserted.
  • the method for inserting the gene on the chromosome of the host cell in the present invention can be used a commonly known genetic engineering method, for example, retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, herpes simplex virus vector , Poxvirus vectors, lentiviral vectors or non-viral vectors.
  • retrovirus vector for example, retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, herpes simplex virus vector , Poxvirus vectors, lentiviral vectors or non-viral vectors.
  • the present inventors have investigated the overall genetic information and metabolic characteristics of succinic acid producing strain M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) identified from the rumen of Hanwoo (Hong et al., Nature Biotechnol ., 22: 1275, 2004), and the present invention.
  • glpABC glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • GlpABC glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • MS1993-1995 glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • glpA (CAC1322: SEQ ID NO: 3), a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase, was isolated from Clostridium acetobutylicum ATCC824, which is known to have a metabolic ability to use glycerol as a carbon source, and E. coli K- 12 glpF (B3927: SEQ ID NO: 4), a gene encoding the glycerol uptake facilitator, an enzyme that promotes diffusion of glycerol into cells from MG1655, and an enzyme that converts the glycerol into glycerol-3-phosphate.
  • GlpK (B3926: SEQ ID NO: 5), a gene encoding glycerol kinase, was isolated.
  • sldAB (GOX0854, 0855: SEQ ID NO: 6)
  • gene dhaK (GOX2222: SEQ ID NO: 7), which encodes glycerol dehydrogenase, are also isolated from G. oxydans . It was.
  • a recombinant vector pFglpABC comprising a glpABC gene (SEQ ID NO: 1) was prepared, and a transgenic strain M. succiniciproducens MBEL55E / pFglpABC (JYJM01) strain was prepared.
  • the recombinant vector pEglpA containing the glpA gene was introduced to prepare a transforming strain M.
  • succiniciproducens PALK / pEglpA JYJM02
  • a recombinant vector M a recombinant vector M.
  • PALK / ACRP JYJM03
  • KCTC11458BP succiniciproducens PALK / ACRP
  • KCTC11458BP was prepared by constructing pACRP, a recombinant vector containing glpA and crp genes, and introducing a recombinant vector including glpA , glpF and glpK genes. is to prepare a transgenic pAFK introducing them strains M.
  • succiniciproducens PALK / AFK (JYJM04) (KCTC11459BP) were prepared, to produce a recombinant vector containing the pSDGOX sldAB and dhaK gene, a transformant strain introduced it M.
  • succiniciproducens was prepared PALK / SDGOX (JYJM05) (KCTC11460BP ). All of the strains were deposited on January 23, 2009 with the accession number to the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology Center Gene
  • glpA a glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene derived from Clostridium sp., But not Menheimia sp., Is introduced into M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP), a strain that produces succinic acid. Glycerol uptake efficiency, succinic acid production, and glycerol consumption of one M. succiniciproducens PALK / pEglpA (JYJM02) strain were measured, and it was also confirmed that glycerol metabolism and succinic acid production increased.
  • Glycerol metabolism and succinic acid production were increased not only by overexpressing the -3-phosphate dehydrogenase gene but also by introducing and expressing the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene isolated from other strains. .
  • the present invention preferably further includes a gene encoding a glycerol uptake facilitator, a gene encoding a glycerol kinase, a gene encoding a cAMP receptor, and a dihydroxy acetone kinase ( It may be characterized in that it additionally contains any one or more of genes encoding dehydroxy aceton kinase.
  • Participation in the succinic acid metabolic pathway of the enzyme protein expressed by introducing into the host cell having succinic acid production ability can be predicted by the above experimental results and studies on genetic information and metabolic characteristics, as shown in FIG.
  • the host cell having the succinic acid production capacity is preferably composed of genus Mannheimia , genus Actinobacillus and genus Anaerobiospillium . Characterized in that the microorganism selected from the group. In particular, strains of the genus Actinobacillus and Unarrow biophyllium are known to have the same succinic acid production metabolic pathway and genetic information as those of the genus Maniemia (Zeikus et al., Appl Microbiol. Biotechnol ., 51: 545 , 1999; McKinlay et al., Appl Microbiol.Biotechnol.
  • ldhA and lflA which are lactic acid dehydrogenase genes
  • pfl which are pyruvate-formate degradase genes
  • M. succiniciproducens MBEL55E KCTC 0769BP
  • M. succiniciproducens MBEL55E as host cells in order to obtain more desirable glycerol metabolism and succinic acid production .
  • succiniciproducens LPK strain improves the acid producing ability
  • M. succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP) (LEE et al., Appl. Environ.Microbiol., 72: 1939, 2006)
  • M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP)
  • One may be selected from the group consisting of a mutant M.
  • the recombinant microorganism according to the present invention has an excellent succinic acid production effect
  • the present invention in another aspect, the step of culturing the recombinant microorganism with improved succinic acid production capacity in a culture medium containing glycerol as a carbon source; And it relates to a production method of succinic acid comprising the step of recovering succinic acid from the culture.
  • the culture is preferably carried out under anaerobic conditions.
  • succinic acid is well formed under anaerobic conditions containing carbon dioxide
  • the anaerobic conditions are preferably anaerobic conditions including carbon dioxide, and saturated with carbon dioxide and hydrogen mixed gases, carbon dioxide and nitrogen mixed gases, as well as anaerobic conditions saturated with carbon dioxide only. May be an anaerobic condition.
  • the glycerol in the culture medium may be characterized in that it is contained together with other carbon sources other than glycerol, wherein the other carbon source other than the glycerol may be characterized in that sucrose (sucrose).
  • Mannheimia succiniciproducens was tested as a host cell, and the effect of improving succinic acid production was confirmed, but other strains of genus Actinobacillus (genus Actinobacillus ) and unarrow biospill having the same succinic acid-producing metabolic pathway It will be clear to those skilled in the art that the same result can be obtained by using the strain of genus Anaerobiospirillum as a host cell.
  • succinic acid can be obtained even by culturing recombinant microorganisms by fed-batch and continuous culture methods. Will be called.
  • M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)
  • glpABC which is a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • crp which are genes encoding a cAMP receptor (receptor) protein
  • a promoter of the fumC gene which is used as a strong promoter in Manhattan by using genomic DNA of M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) as a template and performing PCR using primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 and 10 and 11 DNA and glpABC (MS1993,1994,1995) DNA of operon genes were amplified, and the mixtures were subjected to overlapping PCR (overlapping PCR) using primers of SEQ ID NOs: 8 and 11 as templates. Similarly, PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 12 and 13 and 14 and 15 to amplify the DNA of crp (MS1934) and the promoter DNA of the Enolase gene, a strong promoter in Manhattan. Using overlapping PCR using primers of SEQ ID NOs: 12 and 15, glpABC and crp were isolated.
  • Clostridium acetobutylicum strain ATCC824 C. was isolated a gene encoding a glycerol-3-phosphate in glpA dihydro centipede rise.
  • the genomic DNA of C. acetobutylicum ATCC824 was used as a template, and the DNA of the glpA (CAC1322) gene was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 18 and 19, and the primers of SEQ ID NOs: 16 and 17 were used as described in Example 1-1.
  • the promoter DNA of the Mannheimia Enolase gene was amplified. These mixtures were subjected to overlapping PCR using primers of SEQ ID NOs: 16 and 19 as templates to isolate glpA .
  • sldAB a strain of the genus Gluconobacter, sldAB , a gene encoding glycerol dehydrogenase, and dhaK , a gene encoding dihydroxyacetone kinase, were isolated as follows.
  • sldAB GOX0854,0855
  • D-sorbitol dehydrogenase subunit SldA, subunit SldB quinoprotein glucose dehydrogenase
  • oxydans was used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 22 and 23 and SEQ ID NOs: 24 and 25 to amplify DNA of sldAB (GOX0854,0855) and dhaK (GOX2222) genes, respectively. It was.
  • the PCR fragment containing the amplified glpABC (MS1993,1994,1995) gene in Example 1-1 was digested with PstI and BamHI and pME19-2 (Kim et. al., FEMS Microbiol Lett ., 278: 78-85, 2008) to prepare pME19-2FglpABC (MSU), which was named pFglpABC.
  • MSU pME19-2FglpABC
  • the produced vector is as shown in the cleavage map of FIG.
  • the pME19-2 vector was isolated from p-MVSCS1 (Kehrenberg et al., J. Antimicrob. Chemother ., 49: 383, 2002) and E. coli vector puc19 (New England Biolabs). It was prepared using the E. coli shuttle vector pME19-2. First, puc19 containing E. coli ori and ampicillin resistance gene was restricted to AatII , and then the recovered fragment and the origin fragment (1.96 kb; SEQ ID NO: 26) obtained from pMVSCS1 were converted to AatII . After restriction, the recovered fragment was conjugated using T4 DNA ligase to prepare a maniamia / E. Coli shuttle vector pME19-2 (4.7 kb).
  • Example 1-2 The DNA fragment obtained in Example 1-2 was cleaved with HindIII and PstI , and combined with pME19-2, a manheimia-E. Coli shuttle vector cut with the same cleavage enzyme, to prepare pME19-2glpA (CAC), which was called pEglpA. Named it.
  • CAC pME19-2glpA
  • the produced vector is as shown in the cleavage map of FIG.
  • Expression vectors containing glpA , a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase derived from Clostridium genus and crp , a gene encoding cAMP receptor protein derived from the genus Manheimia were prepared as follows. .
  • PCR fragment containing the amplified crp (MS1932) gene in Example 1-1 was cleaved with SacI and NdeI , and bound to pEglpA prepared in Example 2-2 cut with the same cleavage enzyme to pME19-2glpA (CAC) crp (MSU) was constructed and named pACRP.
  • the produced vector is as shown in the cleavage map of FIG.
  • GlpA a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase derived from Clostridium genus, glpF and glycerol kinase, genes encoding glycerol uptake facilitator from E. coli
  • Example 1-2 DNA fragments obtained in Example 1-2 were digested with HindIII and PstI , respectively, and were combined with pMS3, a maniamia-E. Coli shuttle vector cut with the same cleavage enzyme, to prepare pMS3EglpA (CAC).
  • DNA fragments containing amplified glpF (B3927) and glpK (B3926) simultaneously in Example 1-3 were cleaved with XbaI and PstI , and then combined with the expression vector pMS3EglpA (CAC) cut with the same cleavage enzyme to form pMS3EglpA.
  • CAC glpF (B3927) glpK (B3926) was constructed and termed pAFK.
  • the produced vector is as shown in the cleavage map of FIG.
  • Expression vectors containing sldAB (GOX0854,0855), a gene encoding glycerol dehydrogenase derived from Gluconobacter genus, and dhaK (GOX2222), a gene encoding dihydroxyacetone kinase were prepared as follows.
  • PCR fragments containing the DNA of the sldAB (GOX0854,0855) gene amplified in Examples 1-4 were digested with EcoRI and KpnI , respectively, and pMS3 (Jang et al. , APPL. Environ.Microbiol., 73 (17) 5411-5420, 2007) to prepare pMS3sldAB.
  • dhaK (GOX2222) DNA fragments amplified in Examples 1-4 were cleaved with KpnI and SphI and combined with an expression vector pMS3sldAB cut with the same cleavage enzyme to prepare pMS3sldABdhaK, which was named pSDGOX.
  • the produced vector is as shown in the cleavage map of FIG.
  • a recombinant strain was prepared by introducing pFglpABC, an expression vector containing glpABC (MS1993, 1994 , 1995), a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase, as follows.
  • pFglpABC an expression vector containing glpABC
  • glpABC MS1993, 1994 , 1995
  • a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase as follows.
  • the following experiment was carried out as a model microorganism using M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) strain having poor glycerol metabolism as a host cell.
  • M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP was plated in LB-glucose solid medium containing 10 g / L glucose and incubated at 37 ° C. for 36 hours, and colonies were inoculated in 10 mL of LB-glucose liquid medium and incubated for 12 hours.
  • the grown medium was inoculated 1% in 100 mL of LB-glucose liquid medium and incubated in a shaker at 200 rpm at 37 ° C. After about 4-5 hours, when the OD600 reached 0.3-0.4, 4 ° C., 4,500 rpm, 20 minutes.
  • the cells were obtained by centrifugation under conditions, and the cells were resuspended with 200 mL of a 10% glycerol solution at 4 ° C. The cells were obtained by centrifugation at 4 ° C., 5,500 rpm, and 20 minutes. The glycerol solution used was reduced in half and run twice in succession, and then the cells were resuspended so that the volume ratio of the glycerol solution was 1: 1, thereby obtaining a cell concentrate.
  • PFglpA The expression vectors were introduced into cultured M. succiniciproducens MBEL55E by mixing BC and then performing electroporation at 2.5 kV, 25 ⁇ F, 400 ohms.
  • M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP) was prepared in the same manner as described in Example 3-1 using pEglpA, pACRP, pAFK and pSDGOX prepared in Examples 2-2, 2-3, 2-4 and 2-5 And transformed them into M. succiniciproducens PALK / pEglpA (JYJM02), M. succiniciproducens PALK / ACRP (JYJM03), M. succiniciproducens PALK / AFK (JYJM04) and the M. succiniciproducens PALK / SDGOX (strain), named JJJ, Among these, M.
  • succiniciproducens PALK / ACRP JYJM03
  • M. succiniciproducens PALK / AFK JYJM04
  • M. succiniciproducens PALK / SDGOX JYJM05
  • M. succiniciproducens PALK pMS3 strain was prepared by transforming pMS3 with M. succiniciproducens PALK as a control in the same manner.
  • Example 4 Comparison of Glycerol Fermentation and Succinic Acid Production Patterns between M. succiniciproducens MBEL55E / pFglpABC (JYJM01) Strains and Parent strain (MBEL55E)
  • the recombinant JYJM01 strain prepared in Example 2-1 was incubated for about 8 hours in a BHI (BactoTM Brain Heart Infusion; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) culture medium, and then 1 ml was obtained to obtain 20 ml of MH5 glycerol culture medium (liter).
  • the M. succiniciproducens MBEL55E / pFglpABC (JYJM01) strain culture medium of the flask was inoculated in 2.25L of the mixed medium of Table 1 and then subjected to batch fermentation. Fermentation conditions were 5 g / L initial glycerol concentration, pH 6.8, the culture temperature 39 °C for 44 hours. Ammonia water was used for the adjustment of pH during fermentation, and the concentration of antibiotic ampicillin was 100 ⁇ g / L as described above.
  • M. succiniciproducens MBEL55E KCTC0769BP
  • glycerol uptake facilitator glycerol uptake facilitator
  • MS1990 glycerol uptake facilitator
  • MS1990 glycerol strain
  • MS1988 a recombinant vector each kinase glpK
  • the recombinant vector comprising glpF (MS1990) and the recombinant vector comprising glpK (MS1988) were prepared as in Example 1-1.
  • the fumC gene is used as a strong promoter in Manhattan by performing genomic DNA of M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) as a template and performing PCR using primers of SEQ ID NOs: 27 and 28 and 29 and 30.
  • Promoter DNA and DNA of the glpF (MS1990) operon gene were amplified, and a mixture of these was carried out using an overlapping PCR using primers of SEQ ID NOs: 27 and 30 as templates.
  • PCR of the primers of SEQ ID NOs: 31 and 32 and 33 and 34 was performed to enhance the promoter DNA and the glpK (MS1988) operon gene of the fumC gene, which is used as a strong promoter in Mania .
  • DNA was amplified, and the mixtures were subjected to overlapping PCR (overlapping PCR) using primers of SEQ ID NOs: 31 and 34 as templates.
  • an expression vector containing glpF (MS1990), a gene encoding a glycerol uptake promoter derived from Maniaia , cleaves PCR fragments containing the amplified glpF (MS1990) gene with SacI and HindIII, and cuts the same.
  • PME19-2 (Kim et al., FEMS Microbiol Lett ., 278: 78-85, 2008)
  • an Enzyme-cut, Escherichia coli shuttle vector was constructed to produce pME19-2FglpF (MSU), which was named pFglpF. It was.
  • PCR fragments containing the amplified glpK (MS1988) gene were cleaved with SalI and PstI , and pME19-2 (Kim et al., FEMS Microbiol Lett . 278: 78-85, 2008) to prepare pME19-2FglpK (MSU), which was named pFglpK.
  • the two vectors prepared above were introduced into M. succiniciproducens PALK strain, respectively, and the results were examined.
  • Example 5 M. succiniciproducens PALK / pEglpA (JYJM02), M. succiniciproducens PALK / ACRP (JYJM03), M. succiniciproducens PALK / AFK (JYJM04) and M. succiniciproducens PALK / SDGOX fermentation and succinic acid production of JYJM05 Aspect analysis
  • the experiment was based on PALK (KCTC 10973BP), a genome-engineered strain metabolically modified based on M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP).
  • M. succiniciproducens PALK / pEglpA (JYJM02), M. succiniciproducens PALK / ACRP (JYJM03), M. succiniciproducens PALK / AFK (JYJM04), and M. succiniciproducens PALK JYJM05) strain and control PALKpMS3 strains were subjected to batch fermentation. Fermentation medium was as shown in Table 1 above, and proceeded using double glycerol 110mM as a carbon source.
  • the M. succiniciproducens PALK / ACRP (JYJM03) strain which introduced a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase and a gene encoding a cAMP receptor protein, was much faster than other strains.
  • Metabolizing 8.06 g / L of glycerol for 15 hours showed a maximum OD 600 of 2.31, an increase in biomass.
  • a gene encoding a glycerol uptake facilitator, a gene encoding a glycerol kinase, and a cAMP receptor protein are encoded. Introducing the gene together to increase the ability of glycerol metabolism and succinic acid production.
  • the recombinant microorganism with improved glycerol metabolic ability and succinic acid production capacity according to the present invention and a method for producing succinic acid using the same propose a method of efficiently using low-cost glycerol as a carbon source of cells, and succinic acid has high production efficiency. This is useful because it enables production through excellent bioprocessing, which can lead to reduced production prices.
  • the recombinant microorganism according to the present invention is useful because it has the advantage of producing 100% pure succinic acid without the production of by-products.

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Abstract

본 발명은 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하여 숙신산을 고농도로 생산할 수 있도록 개량된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 현재 화학공정으로 생산되고 있는 유용물질인 숙신산을 종래 화학공정을 대체하여 생산효율이 우수하면서 환경친화적인 생물공정을 통해 생산할 수 있게 함으로써 숙신산과 같은 목적 대사산물의 생산가격 절감을 가져올 수 있으므로 유용하다. 더욱이 본 발명에 따른 재조합 미생물은 종래 기술에서는 단순히 약간의 아세트산, 젖산, 포름산, 피루브산 등의 부산물의 저감효과만을 얻었던 것과 달리, 부산물의 생산 없이 100% 순수한 숙신산을 생산할 수 있게 하는 장점이 있다.

Description

글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
본 발명은 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하여 숙신산을 고농도로 생산할 수 있도록 개량된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
과도한 화석원료 물질의 사용으로 인한 고유가와 환경오염 등의 문제를 해결하기 위한 방안으로 재생가능한 원료물질을 이용한 에너지 및 화학물질 생산기술의 개발이 요구되고 있다. 특히 재생 가능한 식물유래 오일을 이용한 바이오디젤 생산이 주목받고 있으나, 상기의 공정은 바이오디젤 합성과정에서 전체무게의 약 10%에 해당하는 글리세롤이 부산물로 발생한다는 단점이 있다. 최근 들어 전 세계적인 바이오디젤 생산 산업의 급격한 성장과 함께, 이의 부산물로 발생하는 글리세롤의 공급 과잉으로 인하여 가격이 하락하고 있으며, 이의 적절한 처리방법의 개발도 요구되고 있다 (McCoy M., Chem. Eng. News., 84:7, 2006). 이에 가격이 저렴하면서 환원력이 높은 글리세롤을 고가의 포도당을 대신할 탄소원으로 사용하여 미생물 발효를 위한 원료물질로 사용하거나, 화학물질을 생산하기 위한 기술의 개발이 주목되고 있다.
비록 글리세롤을 섭취하여 이를 탄소원으로 사용할 수 있는 능력을 보유하지 않은 일부의 미생물들이 존재하지만, 글리세롤을 주 탄소원 혹은 보조 탄소원으로 사용할 수 있는 많은 종류의 미생물들이 보고되고 있다. 특히 화학구조식이 C3H8O3인 글리세롤은 미생물 발효를 통한 바이오 기반 에너지 및 화학물질 생산에 있어서 탄소원으로 사용되는 포도당보다 환원력이 높아서, 높은 환원력을 요구하는 물질의 원료물질 대비 수율 및 생산성을 향상시킬 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이에 대사특성 및 유전학적 연구가 가장 많이 진행된 대장균을 이용하여 글리세롤 사용에 관한 연구, 특히 글리세롤을 사용하여 보다 환원된 에너지 및 화학물질을 생산하는 연구가 활발히 진행되고 있다 (Dharmadi et al., Biotechnol. Bioeng., 94:822, 2006).
Escherichia coli K-12 MG1655 균주의 글리세롤 대사 관련 유전자로 알려진 glpF, glpK 및 glpD를 함유하는 재조합 벡터를 개발하여 글리세롤을 탄소원으로서 사용하는 대사능력을 가지지 않는 Corynebacterium glutamicum에 도입함으로써, 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 lysine과 glutamate 등의 아미노산을 생산을 시도한 보고가 있다 (Doris Rittmann et al., Appl. Environ. Microbiol., 74(20):6216, 2008). 상기의 연구는 호기 조건하에서 진행되었으며, 연구에 사용된 GlpD는 대장균에서 호기조건에서만 작용한다고 알려진 단백질이다.
두 번째 가능한 경로는 글리세롤을 글리세롤 세포 내 수송 촉진자(glpF)에 의해 도입한 후, 세포 내에서 디하이드록시아세톤(DHA)로 분해하고, 이를 디하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 분해하여 해당경로로 향하는 경우이다. 현재까지, 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK를 함유하는 재조합 벡터를 개발하여 대장균에 도입하므로써 혐기조건에서 글리세롤 발효를 통해 숙신산 합성을 시도한 예(Ramon Gonzalez et al., Metabolic Engineering, 10:234, 2008)가 있다. 하지만, 상기 대장균의 경우, dhaK 유전자를 결실시키고, Citrobacter freundii의 dhaKL를 함유하는 재조합 벡터를 도입한 MG1655 균주에서 숙신산 생산을 제시하였으나, 숙신산 생산 수율이 낮고, 세포 성장 속도가 느린 단점이 낮으며, 포름산을 포함한 다른 발효 부산물을 생산한다는 단점이 있다.
현재까지 글리세롤 조절자(regulator) 관련 효소인 cAMP receptor protein에 대하여 대장균에서 글로벌 조절자로서의 특정 부위와 결합으로 전사를 촉진하는 메커니즘을 규명하고, 다른 glycerol과 다른 탄소원들을 사용할 때 생기는 catabolite repression에 관련된 연구가 진행되었다(Hanamura A. et al., Mol. Microbiol., 6(17):2489, 1992; Boris Gorke et al., Nature Reviews Microbiology, 6:613, 2008). 하지만, 맨하이미아 속, 액티노바실러스 속의 루멘박테리아 군에서의 crp 유전자의 기능 규명은 이루어 있지 않고, crp를 함유하는 재조합 벡터를 상기 숙주세포에 도입하였을 때 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 혐기 조건에서 발효를 통한 숙신산 생산을 증가시킨 예는 보고된바 없다. 이는 대다수의 미생물들이 글리세롤을 세포 내로 수송한 후 이를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관련된 효소들의 조절(repressor, activator)에 관련된 메커니즘을 완전히 가지고 있지 않고, 글리세롤 대사 경로가 전혀 없거나 혹은 불완전하게 가지고 있음으로 글리세롤을 탄소원으로 이용할 수 없기 때문이다. 비록 대장균의 crp 유전자의 연구는 많이 이루어져 있으나, 글리세롤을 분해하는 속도가 느리고, 숙신산과 같은 혐기 발효를 통해 생산되는 목적 대사산물을 효율적으로 생산할 수 없는 것으로 알려져 있다.
한편, 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 대사능력을 가지는 Anaerobiospirillum succiniciproducens 균주를 글리세롤을 함유한 배지에서 배양함으로써 숙신산 생산수율 증대를 시도한 예가 보고된 바가 있으나 (한국등록특허 제10-0313134호), 이는 부산물로서 발생하는 초산의 생성이 억제된 결과이다. 또한, 상기 균주의 혐기성 발효 시 초산 이외에 부산물로서 생성되는 포름산, 피루브산, 에탄올 등의 억제에 관한 연구 (미국등록특허 US 5,143,834A)가 보고되었으나, 글리세롤 대사에 관계하는 유전자를 조작하여 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 균주를 제작하여 100% 순수한 숙신산 생산에 성공한 예는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 균주의 글리세롤의 이용능을 향상시켜 숙신산 생산을 향상시키고자 예의 노력한 결과, 글리세롤 관련 유전자인 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glpABC) 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자(sldAB)를 숙신산 생성능을 가지는 숙주세포에 도입한 결과, 상기 글리세롤 관련 유전자의 도입이 숙주세포에서 글리세롤 대사능 및 숙신산 생성능의 향상을 가져옴을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 보다 빠르고 효율적으로 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 숙신산의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 숙신산 생산 루멘 박테리아 균주인 Mannheimia succiniciproducens 에서 글리세롤을 섭취하고 분해되어 해당과정을 통해 대사되는 경로를 나타내는 모식도이다 (가는 선: 재조합 맨하이미아가 원래 가지고 있는 해당과정의 대사경로를 나타냄. 굵은 선: 도입한 Gluconobacter oxydans 유래의 글리세롤 대사관련 효소들에 의해 관장될 것으로 예상되는 대사경로를 나타냄).
도 2는 재조합 벡터 pFglpABC의 개열 지도이다.
도 3은 재조합 벡터 pEglpA의 개열 지도이다.
도 4는 재조합 벡터 pACRP의 개열 지도이다.
도 5는 재조합 벡터 pAFK의 개열 지도이다.
도 6은 재조합 벡터 pSDGOX의 개열 지도이다.
도 7은 모균주 MBEL55E와 JYJM01균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과의 비교하는 그래프이다.
도 8은 pFglpF를 도입한 M. succiniciproducens PALK pFglpF 균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 재조합 균주인 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04), M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 및 대조군인 PALKpMS3 균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과를 비교한 그래프로, (A)는 전체 균체 무게당 글리세롤 업테이크 속도(Overall glycerol uptake rate)을 나타내며, 그 단위는 g/L/h/g DCW이고, (B)는 최종 숙신산 생산 (Final succinic acid production)을 나타내는 그래프로, 그 단위는 g/L이며, (C)는 소비된 글리세롤의 양을 나타내는 그래프이며, 그 단위는 g/L이다.
도 10은 M. succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03) 균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과를 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입한 결과, 상기 유전자가 도입된 숙주세포의 글리세롤 대사능과 숙신산 생성능의 향상을 가져옴을 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
이때, 본원에서, “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결(operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
아울러, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명자들은 한우의 반추위로부터 동정한 숙신산 생성 균주인 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)의 전체 유전정보 및 대사특성을 규명하였으며 (Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004), 본 발명의 일 실시예에서는 상기 균주의 유전정보 및 대사특성을 바탕으로 다른 균주와의 유사성 비교방법을 통하여 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (GlpABC,MS1993-1995)를 코딩하는 유전자 glpABC (MS1993-1995: 서열번호 1) 및 glpF, glpK, glpABC 오페론의 프로모터 특정부위에 전사 활성자로 기능하는 것으로 알려진 cAMP 수용체(cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 crp (MS1934: 서열번호 2)를 분리하였다.
또한, 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 대사능력을 가진 것으로 알려진 Clostridium acetobutylicum ATCC824로부터 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA (CAC1322: 서열번호 3)를 분리하였고, E. coli K-12 MG1655로부터 글리세롤을 세포 내로 확산시키는 것을 촉진하는 효소인 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자인 glpF (B3927: 서열번호 4) 및 상기 글리세롤을 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키는 효소인 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK (B3926: 서열번호 5)를 분리하였다. 또한, G. oxydans로부터 역시 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB (GOX0854, 0855: 서열번호 6) 및 디하이드록시아세톤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자 dhaK (GOX2222: 서열번호 7)을 분리하였다.
아울러 본 발명의 일 실시예에서는 상기 분리한 유전자를 이용하여, glpABC 유전자 (서열번호 1)를 포함하는 재조합 벡터 pFglpABC를 제작하여 이를 도입한 형질전환 균주 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주를 제조하였고, glpA 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pEglpA를 도입하여 형질전환 균주 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02)를 제조하였다. 또한, glpA 및 crp 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pACRP를 제작하여 이를 도입한 형질전환 균주 M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP)를 제조하고, glpA, glpF 및 glpK 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pAFK를 제조하여 이를 도입한 형질전환균주인 M. succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04) (KCTC11459BP)를 제조하였으며, sldAB 및 dhaK 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pSDGOX를 제작하여 이를 도입한 형질전환균주인 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP)를 제조하였다. 상기 균주는 모두 2009년 1월 23일자에 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 상기 기탁번호로 기탁되었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주와 이의 모균주인 M. succiniciproducens MBEL55E를 대비하여 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력을 측정한 결과, 모균주에 비하여 본 발명에 따른 균주인 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 현저히 향상된 것으로 나타났으며, 이에 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자인 glpABC의 도입이 숙신산을 생산하는 숙주세포를 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상되도록 형질전환시킴을 확인하였다. 아울러, 이와 달리 다른 글리세롤 대사 관련 유전자인 글리세롤 업테이크 촉진자를 코딩하는 유전자인 glpF나 글리세롤 카이네이즈인 glpK의 단독 도입은 오히려 숙주세포에 부정적인 영향을 가져오는 것으로 나타났다. 이에 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자의 도입이 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력 향상에 필수적이며 단순히 글리세롤 대사관련 유전자를 도입이 바로 글리세롤 대사능력이 향상을 가져온다는 의미가 아님을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 멘하이미아 속 균주가 아닌 클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자인 glpA를 숙신산을 생산하는 균주인 M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP)에 도입한 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02) 균주의 글리세롤 업테이크 효율, 숙신산 생산량, 글리세롤 소비량을 측정한 결과, 역시 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가함을 확인하여 숙신산을 생산하는 맨하이미아 균주의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네즈 유전자를 과발현시키는 경우뿐만 아니라, 타 속의 균주에서 분리한 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자를 도입하여 발현시키는 경우에도 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가함을 보였다.
아울러, 상기 M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) (KCTC11459BP) 및 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP)의 글리세롤 업테이크 효율, 숙신산 생산량, 글리세롤 소비량을 측정한 결과, 역시 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 현저히 증가됨을 확인하였다. 이에 본 발명은 바람직하게는 추가적으로 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자, cAMP 수용체 (cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시 아세톤 카이네이즈(dehydroxy aceton kinase)를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상을 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 균주 중 M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP)균주의 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
숙신산 생산능을 가지는 숙주세포에 도입하여 발현된 효소 단백질의 숙신산 대사경로 참여는 상기와 같은 실험결과 및 유전정보와 대사특성에 관한 연구로 예측될 수 있으며, 이는 도 1과 같다.
이때, 본 발명에 있어서, 상기 숙신산 생산능을 가지는 숙주세포는 바람직하게는 맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물임을 특징으로 할 수 있다. 특히 액티노바실러스 속 및 언애로우바이오스필리움 속의 균주의 경우 맨하이미아 속의 균주와 동일한 숙신산 생산 대사경로와 유전정보를 가짐이 알려져 있는 바(Zeikus et al., Appl Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; McKinlay et al., Appl Microbiol. Biotechnol., 76:727, 2007), 본 발명의 실시예에서는 맨하이미아 속의 균주를 이용하여 실험하였으나, 동일한 숙신산 대사경로를 가지는 액티노바실러스 속 및 언애로우바이오스필리움 속의 균주를 숙주세포로 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
또한, 보다 바람직한 글리세롤 대사능 향상 및 숙신산 생산효과를 얻기 위하여 숙주세포로서 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), M. succiniciproducens MBEL55E로부터 젖산 탈수소화효소 유전자인 ldhA와 피르브산-개미산 분해효소 유전자인 pfl을 결실시켜 숙신산 생성능을 향상시킨 M. succiniciproducens LPK (KCTC 10558BP), M. succiniciproducens LPK 균주에서 추가적으로 포스포트랜스아세틸화효소 유전자인 pta와 아세트산 키나제 유전자인 ackA를 결실시켜 숙신산 생성능을 향상시킨 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP) (LEE et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:1939, 2006), M. succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP), M. succiniciproducens PALK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자 pta를 과발현시킨 M. succiniciproducens ALK 및 M. succiniciproducens MBEL55E로부터 젖산 탈수소화효소 유전자 ldhA와 아세트산키나제 유전자 ackA를 결실시킨 변이균주 M. succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 맨하이미아 속의 균주는 모두 동일한 숙신산 생산의 대사경로, 즉 PEP 카복시카이네이즈 대사경로(PEP carboxy kinase pathway)에 의하여 숙신산을 생산하는 바 이에 한정되지 않고 맨하이미아 속에서 선택된 숙주세포를 사용하는 경우 본 발명에 따른 재조합 미생물을 수득할 수 있음은 자명하다고 할 것이다.
한편, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 우수한 숙신산 생산효과를 가지는바, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 숙신산 생성능이 향상된 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산방법에 관한 것이다. 이때, 본 발명에서 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈로 glpABC를 도입하여 사용하는 경우 혐기조건에서 작용하는바, 상기 배양은 혐기조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 숙신산은 이산화탄소를 포함하는 혐기조건에서 잘 생성되므로, 혐기조건은 이산화탄소를 포함하는 혐기조건이 바람직하며, 이산화탄소만으로 포화된 혐기조건 뿐 아니라, 이산화탄소와 수소의 혼합기체, 이산화탄소와 질소의 혼합기체로 포화된 혐기조건일 수 있다.
또한, 상기 배양배지에서 글리세롤은 글리세롤 이외의 다른 탄소원과 함께 함유되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, 상기 글리세롤 이외의 다른 탄소원은 수크로오스(sucrose)인 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 Mannheimia succiniciproducens를 숙주세포로 하여 실험하여 숙신산 생성능 향상 효과를 확인하였으나, 다른 맨하이미아 속 균주 및 동일한 숙신산 생산 대사경로를 가지는 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospirillum)의 균주를 숙주세포로 사용하여서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
또한, 숙신산 생산을 위한 배양에 있어 회분식 배양만을 예시하였으나, 역시 유가식과 연속식 배양방법에 의하여 재조합 미생물을 배양하여서도 숙신산을 수득할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자의 분리
1-1: 맨하이미아 유래 glpABC 및 crp 유전자의 분리
맨하이미아 속 균주인 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP) 로부터 다음과 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC 및 cAMP 수용체(receptor) 단백질을 코딩하는 유전자인 crp를 분리하였다.
M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 다음의 서열번호 8 및 9와, 10 및 11의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpABC(MS1993,1994,1995) 오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 8과 11의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다. 마찬가지로, 서열번호 12 및 13와, 14 및 15의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 맨하이미아 속에서 강한 프로모터인 Enolase 유전자의 프로모터 DNA와 crp(MS1934)의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 12과 15의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR을 수행하여 glpABC 및 crp를 분리하였다.
서열번호 8: 5’-TATACTGCAGACATCGGCATCAGTTATATCG-3’
서열번호 9: 5’-CGCAACCCAACATTGTATCACCTCATTGTAATA-3’
서열번호 10: 5’-TGAGGTGATACAATGTTGGGTTGCGTATTTTA-3’
서열번호 11: 5’-TATGGGATCCTTATTGGTTTATTGACATAG-3’
서열번호 12: 5’-TAGTGAGCTCTACTCTGTTACCGCAAATTG-3’
서열번호 13: 5’-TTGTTCTAGCATTTTTATTTTCCTCTTAGTTA-3’
서열번호 14: 5’-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’
서열번호 15: 5’-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’
1-2: 클로스트리디움 아세토부틸리컴 유래 glpA 유전자의 분리
클로스트리디움 속 균주인 C. acetobutylicum ATCC824로부터 다음과 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA를 분리하였다.
먼저 C. acetobutylicum ATCC824의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 18 및 19의 프라이머들을 이용해 glpA(CAC1322) 유전자의 DNA를 증폭하였고, 서열번호 16 및 17의 프라이머를 이용해 실시예 1-1에 기재된 것과 같이, 맨하이미아 Enolase 유전자의 프로모터 DNA를 증폭하였다. 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 16과 19의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR을 수행하여 glpA를 분리하였다.
서열번호 16: 5’-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’
서열번호 17: 5’-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’
서열번호 18: 5’-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’
서열번호 19: 5’-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’
1-3: 대장균 유래 glpF 및 glpK 유전자의 분리
에스케리키아 속 균주인 E. coli K-12 MG1655로부터 다음과 같이, 글리세롤 업테이크 촉진자 (Glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자인 glpF 및 글리세롤 카이네이즈 (Glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK 유전자를 분리하였다. 즉, E. coli K-12 MG1655의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20 및 21의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 glpF(B3927)와 glpK(B3926) 유전자들을 포함하는 DNA를 증폭하였다.
서열번호 20: 5’-TGTGTCTAGAATGAGTCAAACATCAACCTT-3’
서열번호 21: 5’-TATACTGCAGACATTATTCGTCGTGTTCTT-3’
1-4: 글루코노박터 옥시단스 유래 sldAB , dhaK 유전자의 분리
글루코노박터 속 균주인 G. oxydans로부터 다음과 같이, 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB 및 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK를 분리하였다. sldAB(GOX0854,0855)는 관용명으로는 디-소비톨 디하이드로지네이즈 혹은 퀴노프로테인 글루코즈 디하이드로지네이즈 (D-sorbitol dehydrogenase subunit SldA, subunit SldB)이지만, 글리세롤 디하이드로지네이즈로써도 기능하는 유전자이다. 즉, G. oxydans의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22 및 23와 서열번호 24 및 25의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 각각 sldAB(GOX0854,0855)와 dhaK(GOX2222) 유전자의 DNA를 증폭하였다.
서열번호 22: 5’-TCCGAATTCATGCCGAATACTTATGGCAGC-3’
서열번호 23: 5'-TATTGGTACCTTTCTCAGCCCTTGTGATCA-3’
서열번호 24: 5’- TATAGGTACCCTGGGGAGAATATCATGACCAAGATCTGCGGTGA-3’
서열번호 25: 5’-TATTGCATGCGGACGGGCTATAGATTACCG-3’
실시예 2: 재조합 벡터의 제조
2-1: 재조합 벡터 pFglpABC의 제조
맨하이미아 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
실시예 1-1에서 증폭된 glpABC(MS1993,1994,1995)유전자를 포함하는 PCR 절편을 PstI 과 BamHI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et al., FEMS Microbiol Lett., 278:78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpABC(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpABC라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 2의 개열지도에 나타난 바와 같다.
이때, 상기 pME19-2 벡터는, 맨하이미아로부터 분리 보고된 pMVSCS1 (Kehrenberg et al., J. Antimicrob. Chemother., 49:383, 2002)과 대장균 벡터 puc19 (New England Biolabs)으로부터 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME19-2를 이용하여 제조하였는데, 먼저 대장균 ori와 암피실린 내성유전자를 포함하는 puc19를 AatII으로 제한한 후, 회수한 단편과 pMVSCS1로부터 얻은 origin 단편(1.96kb; 서열번호 26)을 AatII으로 제한한 후 회수한 단편을 T4 DNA ligase를 이용하여 접합하여 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME19-2(4.7kb)를 제작하였다.
2-2: 재조합 벡터 pEglpA의 제작
클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
실시예 1-2에서 얻은 DNA 단편을 HindIII와 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2와 결합시켜 pME19-2glpA(CAC)를 제작하고, 이를 pEglpA라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 3의 개열지도에 나타난 바와 같다.
2-3: 재조합 벡터 pACRP의 제작
클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA 및 맨하이미아 속 유래의 cAMP 수용체(receptor) 단백질을 코딩하는 유전자인 crp를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
실시예 1-1에서 증폭된 crp(MS1932) 유전자를 포함하는 PCR 절편을 SacI 과 NdeI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 실시예 2-2에서 제작된 pEglpA 에 결합시켜 pME19-2glpA(CAC)crp(MSU)를 제작하고, 이를 pACRP라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 4의 개열지도에 나타난 바와 같다.
2-4: 재조합 벡터 pAFK의 제작
클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA와, 대장균 유래의 글리세롤 업테이크 촉진자(Glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자인 glpF 및 글리세롤 카이네이즈 (Glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK 유전자를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
먼저, 실시예 1-2에서 얻은 DNA 단편을 각각 HindIII와 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pMS3와 결합시켜 pMS3EglpA(CAC)를 제작하였다. 다음으로, 실시예 1-3에서 증폭된 glpF(B3927)와 glpK(B3926)를 동시에 포함하는 DNA 조각을 XbaI과 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 발현벡터 pMS3EglpA(CAC)와 결합시켜 pMS3EglpA(CAC)glpF(B3927)glpK(B3926)를 제작하고, 이를 pAFK라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 5의 개열지도에 나타난 바와 같다.
2-5: 재조합 벡터 pSDGOX의 제작
글루코노박터 속 유래의 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB(GOX0854,0855) 및 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK(GOX2222)를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
실시예 1-4에서 증폭된 sldAB(GOX0854,0855) 유전자의 DNA를 포함하는 PCR 절편을 각각 EcoRI 과 KpnI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pMS3 (Jang et al., APPL. Environ. Microbiol., 73(17) 5411-5420, 2007)와 결합시켜 pMS3sldAB를 제작하였다.
다음으로, 실시예 1-4에서 증폭된 dhaK(GOX2222) DNA 조각을 KpnI과 SphI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 발현벡터 pMS3sldAB와 결합시켜 pMS3sldABdhaK를 제작하고, 이를 pSDGOX라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 6의 개열지도에 나타난 바와 같다.
실시예 3: 재조합 균주의 제조
3-1: M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 제작
글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 포함한 발현벡터인 pFglpABC를 다음과 같이 도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 균주의 제작을 위하여 숙주세포로는 글리세롤 대사능이 미약한 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP) 균주를 모델 미생물로 하기의 실험을 진행하였다.
M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP를 10g/L의 포도당을 함유한 LB-포도당 고체배지에 도말하여 36시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB-포도당 액체배지 10 mL에 접종하여 12 시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-포도당 액체배지 100 mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 약 4~5 시간 후, OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면 4℃, 4,500 rpm, 20분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 세포를 재현탁하였다. 그리고 4℃, 5,500 rpm, 20 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 이를 두 번 연속 실행한 후, 세포와 글리세롤 용액 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다. 상기 수득된 세포 농축액과 상기 실시예 2-1에서 제작된 pFglpABC를 혼합한 다음, 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행함으로써, 상기 발현 벡터를 배양된 M. succiniciproducens MBEL55E에 도입시켰다.
전기충격 후, LB-포도당 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 항생제 암피실린(최종농도 50 ㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를 암피실린 항생제가 함유된 LB-포도당 액체배지에서 12시간 이상 배양하여, M. succiniciproducens MBEL55E pFglpABC를 준비하였고, 이를 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주라고 명명하였다.
3-2: M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04), M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 및 M. succiniciproducens PALK pMS3균주의 제작
실시예 3-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 M. succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)를 실시예 2-2, 2-3, 2-4 및 2-5 에서 제작된 pEglpA, pACRP, pAFK 및 pSDGOX를 이용하여 형질전환시켰고, 이들을 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 균주라고 명명하고, 이 중 M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05)를 각각 한국생명공학연구원 생물자원센서 유전자은행에 2009년 1월 23일자에 각각 기탁번호 KCTC11458BP, KCTC11459BP 및 KCTC11460BP로 기탁하였다. 또한, 같은 방법으로 대조군으로 pMS3를 M. succiniciproducens PALK로 형질전환을 수행하여 M. succiniciproducens PALK pMS3 균주를 준비하였다.
실시예 4: M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주 및 모균주(MBEL55E)간의 글리세롤 발효 및 숙신산 생산 양상 비교
글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 도입한 본 발명에 따른 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능의 향상 여부를 살피기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
실시예 2-1에서 만들어진 재조합 JYJM01 균주를 BHI (BactoTM Brain Heart Infusion; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) 배양배지에서 8시간 정도 배양한 다음, 1ml을 수득하여 20ml의 MH5 글리세롤 배양 배지 (liter 당: 2.5g of yeast extract, 2.5g of polypeptone, 1g of NaCl, 8.7g of K2HPO4, 10g of NaHCO3, 0.02g of CaCl22H2O, 0.2g of MgCl26H2O 및 5g of glycerol)에서 혐기조건으로 39℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 4번 정도 계대 배양하였다. 이를 다시 같은 조성의 250ml의 배양배지가 들어있는 플라스크에 5ml 옮겨 39℃에서 약 16시간 배양하였다. 이때 모든 배양 과정에서 항생제로 100μg/L 암피실린을 첨가하였다.
그 다음 상기 플라스크의 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주 배양액을 표 1의 복합배지 2.25L에 접종한 다음 회분식 발효를 수행하였다. 발효조건은 44시간 동안 5g/L 초기 글리세롤 농도, pH 6.8, 배양 온도 39℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 암모니아수를 사용하였으며, 항생제 암피실린의 농도는 상기와 같이 100μg/L로 하였다.
발효 중 샘플은 주기적으로 채취하였으며, 배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD600의 값으로 측정하였다(1 OD600=0.451gDCWL-1; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol., 72(3): 1939-1948, 2006). 채취된 시료는 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액의 글리세롤 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 한편, 대조군으로서 모균주(M. succiniciproducens MBEL55E)를 동일한 조건으로 회분식 발효를 수행하여 분석하였다.
표 1
Figure PCTKR2010000755-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2010000755-appb-T000002
그 결과, 표 2 및 도 7에 나타난 바와 같이, 상기와 같은 혐기조건에서 44시간 동안 본 발명에 따른 균주인 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 경우 4.02 g/L의 글리세롤을 소모하였고, 그 결과 4.68 g/L의 숙신산, 1.41 g/L의 아세트산을 생산하였다. 또한, 전체 균체 무게당 글리세롤 업테이크 속도(overall glycerol uptake rate)는 대조군인 모균주 MBEL55E에 비해 약 2배 정도 향상되었다.
이러한 실험 결과는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈의 도입이 글리세롤의 업테이크 속도를 향상시키면서 숙신산의 생산능은 증가시켰음을 보여준다. 또한, 모균주와 대비하여 M. succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 생장능 역시 향상된 것으로 나타난 바, glpABC 유전자의 과발현이 글리세롤 배지상에서 생장에도 효과적임을 알 수 있다.
한편, M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)로부터 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 glpF(MS1990) 및 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 glpK(MS1988)의 재조합벡터를 각각 도입한 균주에 상기와 같은 동일한 실험을 수행하였다. 상기 glpF(MS1990)를 포함하는 재조합 벡터와 glpK(MS1988)를 포함하는 재조합벡터는 실시예 1-1과 동일하게 다음과 같이 제조하였다.
먼저, M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 다음의 서열번호 27 및 28과, 29 및 30의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpF(MS1990)오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 27과 30의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로, 다음의 서열번호 31 및 32와, 33 및 34의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpK(MS1988)오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 31과 34의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다.
서열번호 27: 5’-TATAGAGCTCACATCGGCATCAGTTATATC-3’
서열번호 28: 5’-GAAAAGAGGCAATGTATCACCTCATTGTAATA-3’
서열번호 29: 5’-TGAGGTGATACATTGCCTCTTTTCTTTTATTT-3’
서열번호 30: 5’-GTAGAAGCTTGTTATATATTTGTGATTTTA-3’
서열번호 31: 5’-TAACGGATCCACATCGGCATCAGTTATATC-3’
서열번호 32: 5’-AATATGTGTTCAATGTATCACCTCATTGTAATA-3’
서열번호 33: 5’-TGAGGTGATACATTGAACACATATTTTATAAA-3’
서열번호 34: 5’-TACGCTGCAGTTATTCCACGTCTTCTTTCG-3’
그 다음, 맨하이미아 유래의 글리세롤 업테이크 촉진자를 코딩하는 유전자인 glpF(MS1990)를 포함한 발현벡터는, 증폭된 glpF(MS1990)유전자를 포함하는 PCR 절편을 SacI과 HindIII으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et al., FEMS Microbiol Lett., 278: 78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpF(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpF라고 명명하였다.
또한, 증폭된 glpK(MS1988)유전자를 포함하는 PCR 절편을 SalI 과 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et al., FEMS Microbiol Lett., 278: 78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpK(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpK라고 명명하였다.
상기 제작된 두 벡터는 각각 M. succiniciproducens PALK 균주에 도입하여 그 결과를 살펴보았다.
그 결과, glpF를 단독으로 도입한 경우 도 8과 같이 글리세롤 업테이크 효율과 숙신산 생산 효율이 본 발명에 따른 균주처럼 현저히 증가하지 않음을 확인할 수 있었다. 더욱이, 이를 pMS3 벡터만을 도입한 M. succiniciproducens PALK pMS3 균주와 대비 시 오히려 숙신산 생산효율이 좋지 않은 것으로 나타났다.
또한, glpK를 단독으로 도입한 경우 세포 용해(cell lysis)가 발생하여 회분식 발효자체가 불가능하였으며, 이는 글리세롤에서 glpK의 과발현이 세포 성장에 부정적인 영향을 준다는 보고 (Marie M. Zhu et al., Biotechnol. Prog., 18:694, 2002)와 일치하는 것으로 보인다.
이러한 실험 결과는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자의 도입이 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능 향상에 필수적임을 보여준다.
실시예 5: M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 균주의 글리세롤 발효 및 숙신산 생산 양상 분석
추가적으로 멘하이미아 속 균주 유래 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC 이외의 다른 속의 균주 유래 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자를 도입한 경우에도 동일하게 글리세롤 대사능 및 숙신산 향상 효과를 가져오는지 확인하기 위하여, 실시예 4의 클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA를 도입한 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02) 균주에 대하여 실험하였다.
또한, 추가적으로 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 도입한 경우의 글리세롤 대사능 및 숙신산 향상 효과를 살펴보기 위하여, 실시예 4의 M. succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 M. succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 균주에 대하여 실험을 수행하였다.
실험은 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)를 기반으로 대사공학적으로 개량된 genome-engineered 균주인 PALK(KCTC 10973BP)를 모델로 하여 진행하였다. 실시예 4에서 설명한 방법과 같은 방법으로, 상기의 M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04), M. succiniciproducens PALK/SDGOX (JYJM05) 균주 및 대조군인 PALKpMS3 균주들을 회분식 발효를 수행하였다. 발효 배지는 상기 표 1에 나타난 바와 같으며, 이중 글리세롤 110mM를 탄소원으로 사용하여 진행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 글리세롤을 단일 탄소원으로 포함한 MH5 복합배지에서 대조군인 PALK pMS3균주에 비하여, M. succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), M. succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03), M. succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04), M. succiniciproducens PALK/SDGOX (JYJM05) 균주의 글리세롤 업테이크 효율과 소비율, 숙신산 생산능 모두 더 우수함을 확인할 수 있었다.
특히 도 10에 나타난 바와 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 M. succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03) 균주는, 다른 균주들보다 훨씬 빠른 15시간 동안 8.06 g/L의 글리세롤을 대사하여, Maximum OD600이 2.31로 바이오매스의 증가를 보였다.
또한, M. succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03) 균주는 30시간 동안 8.78g/L의 글리세롤을 소모하며, 최종적으로 숙신산을 11.42g/L 생산하였다. 이는, 1.30 g Succinic acid/g Glycerol의 수율로 생산한다는 것을 의미하며, 이론치에 근접한 상당히 높은 수율이다. 이때, 부산물인 아세트산, 젖산, 포름산, 피루브산이 전혀 생산되지 않아, 100% 순수한 숙신산이 생산해 낼 수 있었다.
이러한 실험결과는 숙신산을 생산하는 맨하이미아 균주에서 자체 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네즈 유전자를 과발현시키는 경우뿐만 아니라, 타 속의 균주에서 분리한 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 유전자를 도입하여 발현시키는 경우에도 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가하는 것을 의미한다.
또한, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 유전자 이외에 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 도입하여 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법은 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하는 방안을 제시하고, 숙신산을 생산효율이 우수한 생물공정을 통해 생산할 수 있게 하여 생산가격 절감을 가져올 수 있으므로 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 부산물의 생산 없이 100% 순수한 숙신산을 생산할 수 있게 하는 장점이 있으므로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람 직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (20)

  1. 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  2. 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자, cAMP 수용체 (cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시 아세톤 카이네이즈(dehydroxy aceton kinase)를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 맨하이미아 속은 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), Mannheimia succiniciproducens LPK (KCTC 10558BP), Mannheimia succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP), Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP), Mannheimia succiniciproducens ALK 및 Mannheimia succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 미생물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 속(genus Clostridium) 또는 맨하이미아 속(genus Mannheimia)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 글루코노박터 속(genus Gluconobacter)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 속(genus Clostridium), 에스케리키아 속(genus Escherichia), 맨하이미아 속(genus Mannheimia) 및 글루코노박터 속(genus Gluconobacter)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 glpABC 또는 glpA임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 sldAB임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01), Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) (KCTC11459BP) 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  12. 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법.
  13. 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법.
  14. 제1항 또는 제2항의 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배양은 혐기조건에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 글리세롤은 배양배지에서 단일 탄소원으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 글리세롤은 배양배지에서 글리세롤 이외의 다른 탄소원과 함께 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 글리세롤 이외의 다른 탄소원은 수크로오스(sucrose)인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphatede hydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자, cAMP 수용체 (cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시 아세톤 카이네이즈 (dehydroxy aceton kinase)를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
    Figure PCTKR2010000755-appb-I000001
    Figure PCTKR2010000755-appb-I000002
    Figure PCTKR2010000755-appb-I000003
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