WO2015163682A1 - 2，3－부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2，3－부탄디올의 생산 방법 - Google Patents

2，3－부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2，3－부탄디올의 생산 방법 Download PDF

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acetolactate
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converting
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박종명
라트나싱첼라두랄
송효학
양택호
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지에스칼텍스 주식회사
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having enhanced production capacity of 2,3-butanediol and a method for producing 2,3-butanediol using the same.
  • 2,3-butanediol one of the alcohols with four carbons and two hydroxyl groups (-OH) (CH3CHOHCHOHCH3), is a raw material of synthetic rubber manufacturing process, 1,3-butadiene (1,3-Butadiene) and fuel Chemical catalytic conversion is possible with methyl ethyl ketone (MEK) used as additives and solvents (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011).
  • MEK methyl ethyl ketone
  • 2,3-butanediol is an industrially important intermediate because it can be mixed with gasoline and applied as an octane booster (Celinska et al., Biotechnol. Adv., 27: 715, 2009).
  • 2,3-butanediol can be produced through chemical synthesis and microbial fermentation.
  • production of 2,3-butanediol on a commercial scale has not been achieved because the production price of 2,3-butanediol through the process is very high.
  • bio-based 2,3-butanediol through microbial fermentation due to the rapid increase in the price of fossil raw materials and tightening regulations on international environmental pollution The interest in production and the importance of research and development are increasing.
  • Bio-based 2,3-butanediol production method is to convert renewable biomass into 2,3-butanediol through fermentation of microorganisms having 2,3-butanediol production capacity.
  • 2,3-butanediol is Klebsiella, Enterobacter, Bacillus. Produced by a variety of microorganisms, including the Serratia Species (Maddox IS, Biotechnol., 6: 269, 1996).
  • Serratia Species Maddox IS, Biotechnol., 6: 269, 1996.
  • K. pneumoniae K.
  • Penibacillus polymyxa produce relatively large amounts of 2,3-butanediol, in particular Kleb Ciella pneumoniae and Klebsiella oxytoca have the advantage of easy cultivation, fast growth rate, and production of 2,3-butanediol from various bio raw materials including pentose derived from wood. et al., Biotechnol.Adv., 29: 351, 2011; Chandel et al., Sustainable Biotechnol., 63, 2010; Jansen et al., Biotechnol.Bioeng., 26: 362, 1984; Jansen et al., Adv Biochem. Eng., 27: 85, 1983).
  • Bio-based 2,3-butanediol production research through microbial fermentation process is divided into fermentation process optimization (temperature, pH, dissolved oxygen, etc.) and microbial development (microbial discovery, physiological characterization, mutation, genetic manipulation, etc.) have.
  • fermentation process optimization various conditions such as temperature, pH, and dissolved oxygen concentration to efficiently produce 2,3-butanediol have been identified (Ji et al., Bioresour. Technol., 100: 3410, 2009; Nakashimada et al. , J. Biosci. Bioeng., 90: 661, 2000; Nakashimada et al., Biotechnol. Lett., 20: 1133, 1998).
  • the present inventors found that recombinant microorganisms incorporating specific genes had high selectivity and productivity of 2,3-butanediol while researching recombinant microorganisms having high productivity, concentration and yield of 2,3-butanediol, and completed the present invention. It was.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism having enhanced production capacity of 2,3-butanediol and a method for producing 2,3-butanediol using the same.
  • It provides a method for producing 2,3-butanediol comprising culturing the recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism of the present invention has a high productivity of 2,3-butanediol.
  • 3 shows the pGSC-budAB plasmid.
  • Example 7 is a fermentation result of the recombinant Klebsiella oxytoca strain of Example 1 (K. oxytoca wild type + pGSC-budRABC).
  • Example 10 is a fermentation result of the recombinant Klebsiella oxytoca strain of Example 4 (K. oxytoca ⁇ ldhA ⁇ pflB + pGSC-budRABC).
  • It relates to a method for producing 2,3-butanediol comprising culturing the recombinant microorganism.
  • 2,3-butanediol producing microorganisms are recombinant microorganisms with increased activity of at least one enzyme selected from the group consisting of acetolactate synthase, acetolactate dicarboxylase and acetoin reductase.
  • 2,3-butanediol producing microorganisms it is a recombinant microorganism with increased activity of at least two enzymes selected from the group consisting of acetolactate synthase, acetolactate dicarboxylase and acetoin reductase.
  • 2,3-butanediol producing microorganisms it is a recombinant microorganism with increased activity of acetolactate synthase, acetolactate dicarboxylase and acetoin reductase.
  • It may be a recombinant microorganism for producing 2,3-butanediol.
  • the recombinant microorganism of the present invention is a 2,3-butanediol producing microorganism
  • the recombinant microorganism of the present invention is 2,3-butanediol producing microorganism
  • the pathway for converting pyruvate to alpha-acetolactate and the pathway for converting alpha-acetolactate to acetoin may be facilitated.
  • the recombinant microorganism of the present invention is 2,3-butanediol producing microorganism
  • the pathway for converting pyruvate to alpha-acetolactate, the pathway for converting alpha-acetolactate to acetoin, and the pathway for converting acetoin to 2,3-butanediol may be promoted.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be a recombinant microorganism in which the activity of pyruvate-formate lyase and lactate dehydrogenase is suppressed and the activity of acetolactate synthase is increased in 2,3-butanediol producing microorganism.
  • the recombinant microorganism of the present invention inhibits the activity of pyruvate-formate lyase and lactate dehydrogenase in 2,3-butanediol producing microorganism, and activates acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase. This may be an increased recombinant microorganism
  • the recombinant microorganism of the present invention inhibits the activity of pyruvate-formate lyase and lactate dehydrogenase in 2,3-butanediol producing microorganisms, acetolactate synthase, acetolactate dicarboxylase and aceto It may be a recombinant microorganism with increased phosphorus reductase activity
  • the recombinant microorganism of the present invention has high selectivity, yield, concentration and productivity of 2,3-butanediol.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be the ability to produce by-products such as formic acid, lactate and the like than the wild-type microorganism due to the recombination.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be a recombinant microorganism prepared using a 2,3-butanediol producing microorganism having an acetylcoei and lactate biosynthetic pathway.
  • Acetyl-CoA biosynthetic pathway of the present invention refers to the pathway by which the acetyl-coay is synthesized from a specific metabolite in the microorganism.
  • the acetyl coa biosynthetic pathway of the present invention may be a pathway for synthesizing the acetyl coa from pyruvate.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be a recombinant microorganism prepared using a 2,3-butanediol producing microorganism having an acetylcoei and lactate biosynthetic pathway.
  • the lactate biosynthetic pathway of the present invention refers to a pathway in which lactate is synthesized from a specific metabolite in a microorganism.
  • the lactate biosynthesis route of the present invention may be a route through which lactate is synthesized from pyruvate.
  • the recombinant microorganism of the present invention is a recombinant microorganism prepared by genetically recombining 2,3 butanediol producing microorganism.
  • the 2,3 butanediol producing microorganism may be, for example, a microorganism of the genus Klebsiella, Bacillus, Serratia, or Enterobacter, preferably Klebsiella oxytoca. (K. oxytoca), Klebsiella pneumoniae, and the like, most preferably Klebsiella oxytoca (K. oxytoca).
  • the production of recombinant microorganisms of the present invention using Klebsiella oxytoca is advantageous for the industrial scale production of 2,3 butanediol than using Klebsiella pneumoniae.
  • Pyruvate-formate lyase regulates the conversion of pyruvate to acetyl coay.
  • the pathway for converting pyruvate to acetyl coay can be inhibited.
  • Inhibition of the pyruvate-formate lyase may be achieved by inhibition of expression of pyruvate-formate lyase, inhibition of enzymatic activity of pyruvate-formate lyase, and the like.
  • deletion of pflB, a gene encoding pyruvate-formate lyase, or mutation to the gene mutantations such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to suppress the expression of normal genes.
  • mutations such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to suppress the expression of normal genes.
  • one of ordinary skill in the art such as controlling gene expression during transcription or translation, can choose an appropriate method to inhibit pyruvate-formate lyase.
  • Pyruvate-formate lyase regulates the conversion of pyruvate to formic acid.
  • the pathway to convert pyruvate to formic acid can be inhibited.
  • Inhibition of the pyruvate-formate lyase may be achieved by inhibition of expression of pyruvate-formate lyase, inhibition of enzymatic activity of pyruvate-formate lyase, and the like. For example, deletion of pflB, a gene encoding pyruvate-formate lyase, or mutation to the gene (mutations such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to suppress the expression of normal genes).
  • one of ordinary skill in the art such as controlling gene expression during transcription or translation, can choose an appropriate method to inhibit pyruvate-formate lyase.
  • Lactate dehydrogenase regulates the conversion of pyruvate to lactate.
  • the pathway to convert pyruvate to lactate can be inhibited.
  • Inhibition of the lactate dehydrogenase may be achieved by inhibiting the expression of lactate dehydrogenase, inhibiting the enzyme activity of the lactate dehydrogenase, and the like. For example, it may be possible to delete ldhA, a gene encoding lactate dehydrogenase, or to cause mutations (mutations such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to suppress the expression of normal genes). Alternatively, one of ordinary skill in the art, such as controlling gene expression during transcription or translation, may choose appropriate methods to inhibit lactate dehydrogenase.
  • Acetolactate synthase regulates the conversion of pyruvate to alpha-acetolactate, which is involved in the production of alpha-acetolactate.
  • By increasing the activity of the acetolactate synthase it is possible to promote the route to convert pyruvate to alpha-acetolactate.
  • Increasing the activity of the acetolactate synthase may be achieved by amplified expression of the gene of acetolactate synthase, increased enzyme activity of acetolactate synthase, and the like.
  • budB a gene encoding acetolactate synthase
  • a mutation mutation such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to amplify the expression of a gene.
  • one of ordinary skill in the art such as regulating gene expression during transcription or translation, may select appropriate methods to increase the activity of acetolactate synthase.
  • Acetolactate decarboxylase regulates the conversion of alpha-acetolactate to acetoin, which is involved in acetoin production.
  • Increasing the activity of the acetolactate dicarboxylates may facilitate the pathway to convert alpha-acetolactate to acetoin.
  • the increase in activity of the acetolactate dicarboxylates may be achieved by amplified expression of a gene of acetolactate dicarboxylates, an increase in the enzyme activity of acetolactate dicarboxylates, and the like.
  • budA a gene encoding acetolactate dicarboxylase
  • a mutation may be made to the gene (mutation such as mutation, substitution or deletion of some bases or introduction of some bases to amplify expression of the gene).
  • the person skilled in the art can increase the activity of acetolactate dicarboxylase by selecting a suitable method, such as generating genes or regulating gene expression during transcription or translation.
  • Acetoin reductase regulates the conversion of acetoin to 2,3-butanediol, which is involved in the production of 2,3-butanediol.
  • By increasing the activity of the acetoin reductase it is possible to promote the pathway to convert acetoin reductase to 2,3-butanediol.
  • the increase in the activity of the acetoin reductase may be achieved by amplified expression of the gene of acetoin reductase, increased enzyme activity of acetoin reductase, and the like.
  • introducing a budC, a gene encoding acetoin reductase, into a microorganism or causing a mutation can increase the activity of acetoin reductase by selecting appropriate methods, such as controlling gene expression during transcription or translation.
  • the method for producing 2,3-butanediol of the present invention includes the steps of culturing the recombinant microorganism of the present invention; and recovering 2,3-butanediol from the culture solution.
  • Cultivation of the recombinant microorganism of the present invention is carried out under aerobic conditions, preferably under microaerobic conditions.
  • the culturing is carried out while supplying oxygen, that is, air at the time of culturing, and as a specific example, this may be performed through stirring, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism of the present invention can be cultured in a complex medium, and the type of the complex medium is not particularly limited, and it is apparent to those skilled in the art that a commercially available complex medium can be appropriately selected and used.
  • the wild type strain Klebsiella oxytoca KCTC 12132BP was prepared and used as the strain of Comparative Example 1.
  • recombinant microorganisms were prepared using the following ⁇ 1-1> to ⁇ 1-3>.
  • Bacterial recombination mechanisms were used to inactivate the target genes of Klebsiella oxytoca, and homologous regions of the genes to be removed were amplified by PCR. Then, the DNA fragment containing the homologous region is transferred to the bacteria, and then the target gene is recombined by a recombinase mechanism between the homologous region of the gene in the DNA fragment and the gene on the chromosome of Klebsiella oxytoca. Will be removed.
  • homologous region 1 (SEQ ID NO: 2) of the target gene ldhA (SEQ ID NO: 1) was amplified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 for cloning lactate dehydrogenase of Klebsiella oxytoca. .
  • Homologous region 2 (SEQ ID NO: 5) was also amplified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 6 and 7. Thereafter, homologous regions 1 and 2 were simultaneously amplified by PCR to complete DNA fragments (SEQ ID NO: 8) containing homologous regions 1 and 2.
  • homologous region 1 SEQ ID NO: 10 of pflB (SEQ ID NO: 9), a target gene, was PCR using primers of SEQ ID NOs: 11 and 12. Amplified by.
  • homologous region 2 SEQ ID NO: 13 was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 14 and 15. Thereafter, homologous regions 1 and 2 were simultaneously amplified by PCR to prepare homologous regions 1 and 2 valent DNA fragments (SEQ ID NO: 16) (Table 1).
  • the completed DNA fragment may include an antibiotic resistance gene, and the like, and may include a sacB gene encoding a levansukraase enzyme to remove the antibiotic resistance gene recombined in the chromosome. .
  • the DNA fragments thus prepared were transferred to Klebsiella oxytoca KCTC 12132BP using electroporation (25 uF, 200 ⁇ , 18 kV / cm), and the target gene could be removed using a recombinant mechanism of microorganisms. there was.
  • a recombinant Klebsiella oxytoca from which the ldhA gene was removed was prepared by delivering a DNA fragment containing the homologous region of the ldhA gene to the Klebsiella oxytoca wild type. After removing the ldhA gene from the Klebsiella oxytoca wild type, a DNA fragment including the homologous region of the pflB gene was delivered to prepare a Klebsiella oxytoca from which the pflB gene was further removed from the ldhA gene.
  • K. oxytoca KCTC 12132BP recombinant microorganism hereinafter, “Comparative Example 2”, “K. oxytoca ⁇ ldhA ⁇ pflB”), which were thus prepared with ldhA and pflB. .
  • PBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802, 1994) containing restriction enzyme sites, multiple cloning sites, and chloramphenicol resistance genes to produce recombinant vectors that amplify target gene expression of Klebsiella oxytoca.
  • the gene to be amplified into the plasmid should be cloned. After cloning the plasmid into bacteria, gene expression is amplified by the replication mechanism of the plasmid in the cell.
  • acetolactate dicarboxylates enzyme of Klebsiella oxytoca (budA, SEQ ID NO: 17), genes encoding acetolactate synthase enzyme (budB, SEQ ID NO: 18) and acetoin reductase enzyme
  • the target gene was amplified by PCR to clone the gene encoding (budC, SEQ ID NO: 19) (Table 2).
  • budR a regulator gene, was also introduced together (SEQ ID NO: 20). Amplification was performed using primers containing restriction enzyme sites (XbaI, ApaI, etc.) present in multiple cloning sites of the plasmid.
  • DNA fragments containing the respective genes and plasmids were treated identically with restriction enzymes located at the multiple cloning sites, and then the two fragments were conjugated with T4 DNA ligase to complete pGSC-budA, pGSC-budAB and pGSC-budABC plasmids. (FIGS. 2-4).
  • acetolactate dicarboxylase enzyme (budA), acetolactate synthase enzyme (budB) and acetoin reductase enzyme (budC) from Klebsiella oxytoca was amplified.
  • PGSC-budA plasmid, pGSC-budAB plasmid and pGSC-budABC plasmid prepared in ⁇ 1-2> using Comparative Example 1 and Comparative Example using electroporation (electroporation, 25 uF, 200 ⁇ , 18 kV / cm) Cloned into 2 recombinant Klebsiella oxytoca.
  • electroporation electroporation, 25 uF, 200 ⁇ , 18 kV / cm
  • the pGSC-budABC plasmid was cloned into wild-type Klebsiella oxytoca KCTC 12132BP (Comparative Example 1) to complete the recombinant Klebsiella oxytoca amplified by the expression of the genes (hereinafter, Example 1, “K”).
  • the recombinant Klebsiella oxytoca were stabilized by incubating at 30 ° C. for 1 hour, and then cultured by spreading at 37 ° C. in LB complex solid medium containing chloramphenicol. Then, colonies were picked up in solid medium containing chloramphenicol. And plasmids in the colonies were picked out (Miniprep) and confirmed the cloning of the gene through electrophoresis. As a result, the following recombinant microorganisms were prepared (Table 3).
  • the production fermentation capacity of 2,3-butanediol was evaluated using the wild type Klebsiella of Comparative Example 1 and the recombinant Klebsiella strain of Comparative Example 2, in which ldhA and pflB were simultaneously removed.
  • the microorganisms were inoculated in 250 ml complex medium containing 9 g / L glucose (50mM, glucose) and incubated at 37 ° C. for 16 hours, and then the culture solution was inoculated in 3 L complex medium, and the fermentation conditions were performed.
  • Silver micro-aerobic conditions aserobic rate 1 vvm, stirring speed 150 rpm
  • 90 g / L initial glucose concentration pH 6.5
  • the culture temperature was 37 °C.
  • 25 mg / L chloramphenicol was added to the medium. 5N NaOH was used for the adjustment of pH during fermentation.
  • Specific fermentation process is as follows.
  • the recombinant microorganisms to be tested were inoculated in 250 ml of complex medium containing 9 g / L glucose (50 mM, glucose) and incubated at 37 ° C. for 16 hours, and then the culture was inoculated in 3 L complex medium.
  • Silver micro-aerobic conditions aserobic rate 1 vvm, stirring speed 150 rpm
  • 90 g / L initial glucose concentration pH 6.5
  • the culture temperature was 37 °C.
  • 25 mg / L chloramphenicol was added to the medium. 5N NaOH was used for the adjustment of pH during fermentation.
  • the recombinant microorganisms were sampled during fermentation, growth rate was measured by measuring the optical density (OD600) of the collected sample, and the sample was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, followed by metabolism of the supernatant. Product and 2,3-butanediol concentrations were analyzed by liquid chromatography (HPLC).
  • Example 4 when compared to Example 1 in which the genes pflB and ldhA were not removed from Example 1 in which the genes pflB and ldhA were not removed, Example 4 was superior in reducing by-products such as lactic acid and 2,3-butanediol compared to Example 1 It was confirmed that the yield, concentration, and productivity of the superior (see Table 4, Figure 7 and Figure 10)
  • the recombinant microorganism of Example 2 was found to significantly increase the yield and productivity of 2,3-butanediol compared to the recombinant microorganism (K. oxytoca ⁇ ldhA ⁇ pflB) of Comparative Example 2.
  • the recombinant microorganisms of Example 2 and Example 3 it was confirmed that the production performance of 2,3-butanediol even when amplifying budB as well as budA.
  • the recombinant microorganisms of Example 3 and Example 4 it was confirmed that the production performance of 2,3-butanediol even when amplified budC.
  • the present invention provides a path for converting pyruvate to alpha-acetolactate, a path for converting alpha-acetolactate to acetoin, or 2,3-butanediol for 2,3-butanediol producing microorganism. To recombinant microorganisms for the production of 2,3-butanediol.
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of ldhA, a gene encoding lactate dehydrogenase of Klebsiella oxytoca.
  • SEQ ID NO: 2 is homology region 1 of ldhA, and SEQ ID NOs: 3 and 4 are primers for PCR amplification of homology region 1 of ldhA.
  • SEQ ID NO: 5 is homology 2 of ldhA, and SEQ ID NOs 6 and 7 are primers for PCR amplification of homology 2 of ldhA.
  • SEQ ID NO: 8 is a DNA fragment amplified by PCR using the homologous sites 1 and 2 of ldhA simultaneously as templates.
  • SEQ ID NO: 9 is the nucleotide sequence of pflB, a gene encoding pyruvate formate lyase of Klebsiella oxytoca.
  • SEQ ID NO: 10 is homology region 1 of pflB, and SEQ ID NOs: 11 and 12 are primers for PCR amplification of homology region 2 of pflB.
  • SEQ ID NO: 13 is homology 2 of pflB, and SEQ ID NOs: 14 and 15 are primers for PCR amplification of homology 2 of pflB.
  • SEQ ID NO: 16 is a DNA fragment amplified by PCR using the homologous sites 1 and 2 of pflB as a template at the same time.
  • SEQ ID NO: 17 is a nucleotide sequence of budA, a gene encoding acetolactate dicarboxylase enzyme of Klebsiella oxytoca
  • SEQ ID NO: 18 is a nucleotide sequence of budB, a gene encoding acetolactate synthase enzyme
  • SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence of budC, a gene encoding acetoin reductase enzyme
  • SEQ ID NO: 20 is the nucleotide sequence of budR, a regulator gene.

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Abstract

본 발명은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된, 2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.

Description

2，3－부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2，3－부탄디올의 생산 방법
본 발명은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.
네 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH3CHOHCHOHCH3)인 2,3-부탄디올은 합성고무 제조 공정의 원료물질인 1,3-부타디엔(1,3-Butadiene)과 연료 첨가제 및 용매로 사용되는 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK)으로 화학적 촉매 전환이 가능하다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011). 또한, 2,3-부탄디올은 가솔린(Gasoline)과 혼합하여 octane booster로 적용할 수 있어 산업적으로 매우 중요한 중간체이다(Celinska et al., Biotechnol. Adv., 27: 715, 2009).
2,3-부탄디올은 화학적 합성 공정과 미생물 발효 공정을 통하여 생산할 수 있다. 하지만 상기 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 가격이 매우 높기 때문에 상업적 규모로의 2,3-부탄디올 생산은 이루어지지 않고 있다. 한편, 최근 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 기술의 비약적인 발전과 함께, 화석원료 물질의 급격한 가격 상승과 국제적인 환경오염에 대한 규제가 강화됨에 따라 미생물 발효를 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산에 대한 관심과 연구 개발의 중요성이 증대되고 있다.
바이오 기반 2,3-부탄디올 생산 방법은 2,3-부탄디올 생산능을 보유한 미생물의 발효를 통하여, 재생 가능한 바이오 원료물질(Biomass)을 2,3-부탄디올로 전환하는 것이다. 2,3-부탄디올은 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로벡터(Enterobacter), 바실러스(Bacillus). 세라티아(Serratia) 종(Species) 등 다양한 종류의 미생물에 의하여 생산된다(Maddox IS, Biotechnol., 6: 269, 1996). 특히, 클렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)가 상대적으로 많은 양의 2,3-부탄디올을 생산하며, 특히 클렙시엘라 뉴모니에와 클렙시엘라 옥시토카는 배양이 용이하고 생장 속도가 빠르며, 목질계 유래의 5탄당을 포함하는 다양한 종류의 바이오 원료물질로부터 2,3-부탄디올 생산할 수 있다는 장점이 있다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011; Chandel et al., Sustainable Biotechnol., 63, 2010; Jansen et al., Biotechnol. Bioeng., 26: 362, 1984; Jansen et al., Adv. Biochem. Eng., 27: 85, 1983).
미생물 발효 공정을 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산 연구는 발효 공정 최적화(온도, pH, 용존산소 등)와 미생물 개발 (미생물 발굴, 생리학적 특성 파악, 돌연변이, 유전자 조작 등) 분야로 나누어서 진행되고 있다. 발효 공정 최적화 측면에 있어서는 2,3-부탄디올을 효율적으로 생산할 수 있는 온도, pH, 용존산소 농도 등 다양한 조건들이 규명되었다(Ji et al., Bioresour. Technol., 100: 3410, 2009; Nakashimada et al., J. Biosci. Bioeng., 90: 661, 2000; Nakashimada et al., Biotechnol. Lett., 20: 1133, 1998). 그러나 상기 조건에서의 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산은 여전히 생산성(Productivity) 및 수율(Yield)이 낮아 상업 공정에 직접 적용하기 어려운 문제가 있다. 또한 발효 과정에서 2,3-부탄디올과 함께 젖산을 포함하는 유기산들(Organic acids)과 에탄올을 포함하는 알코올들(Alcohols)등 다양한 부산물들(By-products)이 생성되는 단점이 있다. 부산물 생성은 바이오 원료물질에 대한 2,3-부탄디올의 수율을 낮출 뿐 아니라 배양액으로부터 2,3-부탄디올 회수 과정에서 막대한 분리 및 정제 비용을 요구한다.
그러므로 2,3-부탄디올 생산에 관련된 미생물 개발 연구는 주로 부산물을 감소시키는 방향으로 진행되어 왔다. 대표적으로 Ji 등은 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주에 물리/화학적 돌연변이 방법의 일종인 UV를 노출시켜 부산물인 유기산들의 생성을 일부 억제시키는 것에 성공하였다(Ji et al., Biotechnol. Lett., 30: 731, 2008). 그 외, 이온 주사(Ion beam) 방식을 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 적용하여 바이오매스의 소모 속도를 증가시킴으로써 2,3-부탄디올 생산을 향상시키는 시도도 있다(Ma et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 49, 2009). 그러나 상기의 개발된 균주들은 2,3-부탄디올 생산성, 최종농도(Concentration) 및 수율 측면에서 상업 공정에 직접 적용하기에 여전히 부족한 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 2,3-부탄디올의 생산성, 농도 및 수율이 높은 재조합 미생물을 연구하던 중 특정 유전자들을 도입시킨 재조합 미생물이 2,3-부탄디올의 선택도 및 생산성이 높은 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,
2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생산성이 높다.
도 1은 2,3-부탄디올 생성 균주에서 2,3-부탄디올의 생합성 경로를 나타낸다.
도 2는 pGSC-budA 플라스미드를 나타낸다.
도 3은 pGSC-budAB 플라스미드를 나타낸다.
도 4는 pGSC-budABC 플라스미드를 나타낸다.
도 5는 비교예 1의 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca wild type)의 발효 결과이다.
도 6은 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB)의 발효 결과이다.
도 7은 실시예 1의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca wild type + pGSC-budRABC)의 발효 결과이다.
도 8은 실시예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주 K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRA)의 발효 결과이다.
도 9는 실시예 3의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRAB)의 발효 결과이다.
도 10은 실시예 4의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRABC)의 발효 결과이다.
본 발명은,
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,
2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
2,3-부탄디올 생성능이 증가된 재조합 미생물
본 발명의 재조합 미생물은
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,
2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물이다.
또한 본 발명의 재조합 미생물은,
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제로부터 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.
또한 본 발명의 재조합 미생물은,
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제로부터 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 효소의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.
또한 본 발명의 재조합 미생물은,
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.
또한, 본 발명의 재조합 미생물은
2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 또는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,
2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
이 경우 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다
또한, 이 경우 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로 및 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다
또한, 이 경우 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 및 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다
또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다
또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제 및 아세토락테이트 디카복실레이즈의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다
또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다
또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 선택도, 수율, 농도 및 생산성이 높다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 상기 재조합으로 인하여 야생형 미생물보다 포름산, 락테이트 등과 같은 부산물의 생성능이 억제된 것일 수 있다.
아세틸 코에이 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 아세틸 코에이 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 2,3-부탄디올 생산 미생물을 이용하여 제조한 재조합 미생물일 수 있다. 본 발명의 아세틸 코에이(Acetyl-CoA) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다.
락테이트 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 아세틸 코에이 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 2,3-부탄디올 생산 미생물을 이용하여 제조한 재조합 미생물일 수 있다. 본 발명의 락테이트(lactate) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 락테이트가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 락테이트 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 락테이트가 합성되는 경로 등이 될 수 있다.
2,3 부탄디올 생산 미생물
본 발명의 재조합 미생물은 2,3 부탄디올 생산 미생물을 유전적으로 재조합하여 제조한 재조합 미생물이다. 상기 2, 3 부탄디올 생산 미생물은 예컨대, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 세라티아(Serratia) 속 또는 엔테로벡터 (Enterobacter) 속의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 등이며, 가장 바람직하게는 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca)이다. 클렙시엘라 옥시토카를 이용하여 본 발명의 재조합 미생물을 제조하는 것이 클렙시엘라 뉴모니아를 이용하는 것보다 2,3 부탄디올의 산업적 규모의 생산에 유리하다.
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로의 억제
피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 피루베이트의 아세틸 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.
피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로의 억제
피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 피루베이트의 포름산으로의 전환을 조절한다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.
피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로의 억제
락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 디하이드로게나제를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 디하이드로게나제의 억제는 락테이트 디하이드로게나제의 발현 억제, 락테이트 디하이드로게나제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 디하이드로게나제를 억제할 수 있다.
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로의 촉진
아세토락테이트 신타제(acetolactate synthase)는 피루베이트의 알파-아세토락테이트로의 전환을 조절하여, 알파-아세토락테이트의 생성에 관여한다. 상기 아세토락테이트 신타제의 활성을 증가시킴으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토락테이트 신타제의 활성 증가는 아세토락테이트 신타제의 유전자의 증폭 발현, 아세토락테이트 신타제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토락테이트 신타제의 활성을 증가시킬 수 있다.
알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로의 촉진
아세토락테이트 디카복실실레이즈(acetolactate decarboxylase)는 알파-아세토락테이트의 아세토인으로의 전환을 조절하여, 아세토인 생성에 관여한다. 상기 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성을 증가시킴으로써 알파-아세토락테이트을 아세토인으로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성 증가는 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 유전자의 증폭 발현, 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성을 증가시킬 수 있다.
아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로의 촉진
아세토인 리덕타제(acetoin reductase)는 아세토인의 2,3-부탄디올로의 전환을 조절하여, 2,3-부탄디올의 생성에 관여한다. 상기 아세토인 리덕타제의 활성을 증가시킴으로써 아세토인 리덕타제를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토인 리덕타제의 활성 증가는 아세토인 리덕타제의 유전자의 증폭 발현, 아세토인 리덕타제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토인 리덕타제의 활성을 증가시킬 수 있다.
2,3-부탄디올의 생산 방법
본 발명의 2,3-부탄디올의 생산 방법은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함한다.
배양
본 발명의 재조합 미생물의 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건(microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 미생물은 복합 배지에서 배양될 수 있으며, 복합 배지의 종류는 특별히 제한되지 않고 당업자는 일반적으로 시판, 사용되는 복합 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다는 것은 자명하다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
야생형 균주인 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP를 준비하여 이를 비교예 1의 균주로 사용하였다. 또한 이를 이용하여 하기 <1-1> 내지 <1-3>에서 재조합 미생물을 제조하였다.
클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12132BP
수탁일자 : 2012년 2월 8일
-2,3-부탄디올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄디올의 양
-2,3-부탄디올 수율(g/g): 2,3-부탄디올 생산량(g)/탄소원(g) × 100
-2,3-부탄디올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄디올의 양
<1-1> ldhA 및 pflB가 결실된 재조합 K. 옥시토카의 제조
표적 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편 제작
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자를 불활성화 시키기 위하여 박테리아의 재조합 기작을 이용하였고, 제거하고자 하는 유전자의 상동 부위 (homologous region)를 PCR로 증폭하였다. 그 후 상동 부위를 포함하는 해당 DNA 단편을 박테리아에 전달한 후, DNA 단편에 있는 유전자의 상동 부위와 클렙시엘라 옥시토카의 염색체에 있는 유전자 사이에 재조합 효소 (recombinase)에 의한 재조합 기작으로 표적 유전자를 제거하게 된다.
먼저, 클렙시엘라 옥시토카의 락테이트 디하이드로게나제 클로닝하기 위해 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2이 포함된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다.
한편, 클렙시엘라 옥시토카의 피루베이트 포르메이트 리아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 pflB(서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다(표 1). 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
표 1
Figure PCTKR2015003991-appb-T000001
Figure PCTKR2015003991-appb-I000001
Figure PCTKR2015003991-appb-I000002
Figure PCTKR2015003991-appb-I000003
ldhA 및 pflB가 결실된 재조합 K. 옥시토카의 제조
상기 제작된 DNA 단편들을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP에 전달하였으며, 미생물의 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거할 수 있었다.
클렙시엘라 옥시토카 야생형에 ldhA 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 ldhA 유전자를 제거한 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 제조하였다. 그리고, 클렙시엘라 옥시토카 야생형에서 ldhA 유전자를 제거한 후, pflB 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 ldhA 유전자에 추가로 pflB 유전자가 제거된 클렙시엘라 옥시토카를 제조하였다.
이렇게 제조된 ldhA 및 pflB가 결실된 K. 옥시토카 KCTC 12132BP 재조합 미생물(이하, “비교예 2”, “K. oxytoca △ldhA △pflB”라 함)를 이용하여 하기 재조합 공정 및 발효 실험들을 수행하였다.
<1-2> pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카 유래의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소 (budA)와 아세토락테이트 신타제 효소 (budB)와 아세토인 리덕타제 효소 (budC)를 코딩하는 유전자의 발현 증폭에 사용할 재조합 플라스미드를 제조하였다.
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위해서 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site), 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802, 1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하여야 한다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소를 코딩하는 유전자 (budA, 서열번호 17)와 아세토락테이트 신타제 효소를 코딩하는 유전자 (budB, 서열번호 18)와 아세토인 리덕타제 효소를 코딩하는 유전자 (budC, 서열번호 19)를 클로닝하기 위하여 표적 유전자를 PCR로 증폭하였다 (표 2). 이 때, regulator 유전자인 budR도 각각 함께 도입하였다(서열번호 20). 증폭 시에는 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 각각의 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소 로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 상기 두 단편을 접합하여 pGSC-budA와 pGSC-budAB와 pGSC-budABC 플라스미드를 완성하였다 (도 2 내지 4).
표 2
Figure PCTKR2015003991-appb-T000002
Figure PCTKR2015003991-appb-I000004
<1-3> 아세토락테이트 디카복실실레이즈, 아세토락테이트 신타제, 및 아세토인 리덕타제를 코딩하는 유전자의 발현 증폭
클렙시엘라 옥시토카 유래의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소 (budA), 아세토락테이트 신타제 효소 (budB) 및 아세토인 리덕타제 효소 (budC)를 코딩하는 유전자의 발현을 증폭하였다.
상기 <1-2>에서 제조한 pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 비교예 1 및 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 클로닝하였다. 구체적으로는 야생형 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP (비교예 1)에 pGSC-budABC 플라스미드를 클로닝하여, 상기 유전자들의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 완성하였다(이하, 실시예 1, “K. oxytoca wild type + pGSC-budABC”이라 함). 또한 ldhA와 pflB를 동시에 제거한 재조합 미생물인 비교예 2의 클렙시엘라 옥시토카에 pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드를 각각 클로닝하여, 상기 유전자들의 발현이 각각 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 완성하였다(실시예 2 내지 4). 이 때, regulator 유전자인 budR도 각각 함께 도입하였다. 전기 천공법 다음에 상기 재조합 클렙시엘라 옥시토카들을 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 각각 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통해 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 그 결과, 하기의 재조합 미생물들이 제조되었다(표 3).
표 3
Figure PCTKR2015003991-appb-T000003
<실험예 1> 야생형 미생물 및 ldhA 및 pflB이 결실된 재조합 미생물의 2,3-부탄디올 생산능
비교예 1의 야생형 클렙시엘라 및 ldhA와 pflB가 동시에 제거된 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 균주를 이용하여, 2,3-부탄디올의 생산 발효능을 평가하였다.
비교예 1의 야생형 클렙시엘라 옥시토카와 ldhA와 pflB가 동시에 제거된 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 대해 발효를 수행하였다. 상기 미생물들의 배양은 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 상기 미생물들을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 150 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다. 배지 내에는 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클레비시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다
그 결과, 클렙시엘라 옥시토카에 젖산 탈수소화 효소 (ldhA)와 피루브산-포름산 분해 효소 (pflB)가 제거된 경우, 2,3-부탄디올 생산량은 39.49 g/L이었고, 2,3-부탄디올 생산 수율 (2,3-부탄디올 g/ 포도당 g)은 0.45였다. 상기 비교예 2의 재조합 미생물의 생산성 (g/L/h)는 0.58이었다. 비교예 1의 야생형 균주와 비교하였을 때, 비교예 2의 재조합 미생물은 젖산, 포름산, 에탄올 생산이 현저히 감소하면서 2,3-부탄디올의 생산능이 좋아지면서 2,3-부탄디올 생산 농도, 생산 수율, 생산성, 선택도가 모두 개선되었다(표 4)(도 5 및 도 6).
표 4
Figure PCTKR2015003991-appb-T000004
<실험예 2> budA, budAB, budABC 유전자가 선택적으로 증폭 발현된 재조합 미생물의 2,3-부탄디올 생산능
상기 <1-3>에서 제조한 실시예 1 내지 4의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 대하여 발효를 수행하였다.
구체적인 발효 과정은 하기와 같다. 실험 대상인 재조합 미생물들을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 150 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다. 배지 내에는 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 재조합 미생물들에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다
그 결과, 야생형에 budABC를 증폭 발현하였을 경우 (실시예 1), 비교예 1(야생형)에 비하여 2,3-부탄디올의 수율, 농도가 증가한 것을 알 수 있었다. 하지만, 여전히 젖산 (lactate) 등 부산물의 생산량이 2,3-부탄디올에 비해 많다는 것을 알 수 있었다.
한편, 유전자 pflB 및 ldhA을 제거하지 않은 실시예1을 유전자 pflB 및 ldhA을 제거한 실시예4와 대비하여 볼 때 실시예4가 실시예1 대비 젖산 등의 부산물 저감 효과가 뛰어나고, 2,3-부탄디올의 수율 및 농도, 생산성이 보다 우수함을 확인할 수 있었다(표4, 도 7 및 도 10 참조)
또한, 실시예 2의 재조합 미생물은 비교예 2의 재조합 미생물(K. oxytoca △ldhA △pflB)에 비하여 2,3-부탄디올의 수율 및 생산성이 유의하게 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 실시예 2 및 실시예 3의 재조합 미생물들을 서로 비교하여 보면, budA뿐만 아니라 budB를 증폭하였을 때에도 2,3-부탄디올의 생산 성능이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 실시예 3 및 실시예 4의 재조합 미생물들을 비교하여 보면, budC를 증폭하였을 때에도 2,3-부탄디올의 생산 성능이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로는 budABC를 모두 증폭 발현한 실시예 4의 재조합 미생물이 비교예 2의 재조합 미생물과 비교하였을 때 2,3-부탄디올 생산 성능이 가장 개선되었음을 알 수 있었다.
그러므로 2,3-부탄디올 생산에 있어서는 부산물 저감을 위한 유전자 pflB 및 ldhA의 제거뿐만 아니라, 클렙시엘라의 아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자, 아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자, 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자의 발현을 증폭하는 것이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다(표 5, 도 7 내지 도 10, 도 7: 실시예 1, 도 8: 실시예 2, 도 9: 실시예 3, 도 10: 실시예 4).
표 5
Figure PCTKR2015003991-appb-T000005
본 발명은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된, 2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.
서열번호 1은 클렙시엘라 옥시토카의 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA의 염기서열이다. 서열번호 2는 ldhA의 상동부위 1이고, 서열번호 3 및 4는 ldhA의 상동부위 1의 PCR 증폭을 위한 프라이머이다. 서열번호 5는 ldhA의 상동부위 2이고, 서열번호 6 및 7은 ldhA의 상동부위 2의 PCR 증폭을 위한 프라이머이다. 서열번호 8은 ldhA의 상기 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭한 DNA 단편이다.
서열번호 9는 클렙시엘라 옥시토카의 피루베이트 포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB의 염기서열이다. 서열번호 10은 pflB의 상동부위 1이고, 서열번호 11 및 12는 pflB의 상동부위 2의 PCR 증폭을 위한 프라이머이다. 서열번호 13은 pflB의 상동부위 2이고, 서열번호 14 및 15은 pflB의 상동부위 2의 PCR 증폭을 위한 프라이머이다. 서열번호 16은 pflB의 상기 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭한 DNA 단편이다.
서열번호 17은 클렙시엘라 옥시토카의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소를 코딩하는 유전자인 budA의 염기서열이고, 서열번호 18은 아세토락테이트 신타제 효소를 코딩하는 유전자인 budB의 염기서열이고, 서열번호 19는 아세토인 리덕타제 효소를 코딩하는 유전자인 budC의 염기서열이며, 서열번호 20은 regulator 유전자인 budR의 염기서열이다.
Figure PCTKR2015003991-appb-I000005

Claims (16)

  1. 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
    피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,
    2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물.
  2. 제 1항에 있어서,
    아세토락테이트 신타제의 활성이 증가함으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제 1항에 있어서,
    아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB의 발현이 증가함으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제 1항에 있어서,
    아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성이 증가함으로써 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제 1항에 있어서,
    아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA의 발현이 증가함으로써 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제 1항에 있어서,
    아세토인 리덕타제의 활성이 증가함으로써 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제 1항에 있어서,
    아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC의 발현이 증가함으로써 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제 1항에 있어서,
    피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 또는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제 8항에 있어서,
    피루베이트-포르메이트 리아제가 억제됨으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 또는 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제 8항에 있어서,
    락테이트 디하이드로게나제가 억제됨으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제 8항에 있어서,
    피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB 및 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA 중 어느 하나 이상이 결실 또는 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 클렙시엘라인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 클렙시엘라 옥시토카인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생산성이 락테이트의 생산성보다 높은 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 제 1항에 있어서,
    아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB, 아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA 및 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 유전자의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
    상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법.
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