KR102133193B1 - 혼합당 동시발효능을 갖는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 다이올 생성능을 갖는 재조합 미생물에 대한 것이다.

Description

혼합당 동시발효능을 갖는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM CAPABLE OF STIMULTANEOUS FERMENTATION OF SACCHARIDE MIXTURE AND PRODUCTION METHOD OF DIOL USING THE SAME}
본 발명은 혼합당 동시발효능을 갖는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법에 대한 것이다.
다이올은 산업적으로 널리 사용될 뿐 아니라, 다양한 종류의 케미칼 중간체로도 이용되는 화합물로, 그 효용성이 매우 크다. 예컨대, 2,3-부탄다이올은 합성고무(Synthetic rubber)의 주요한 원료물질인 1,3-부타디엔(1,3-Butadiene)과 용매인 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK)의 전구체(Precursor)로 사용이 가능한 산업적으로 잠재성이 매우 높은 화학물질이다. 또한 2,3-부탄다이올은 어는점이 매우 낮아 부동액(Antifreezing agent)으로 직접 사용이 가능하고 옥탄가(Octane number)가 높아 기존의 가솔린(Gasoline)과 혼합하여 octane booster로서 사용이 가능하다. 또한 1,3-프로판다이올은 폴리에스테르나 폴리우레탄 등 고분자의 단량체로 사용 가능하며, 또한, 화장품 및 개인 위생용품 등의 성질개선 용도로의 첨가제로 사용 가능하다. 특히 1,3-프로판디올과 테레프탈릭산 (terephthalic acid)의 중합 반응에 의해 생성되는 직선성의 방향족 폴리에스터인 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT, polytrimethylene terephthalate)는 semi-crystal 분자 구조 상에서 발생하는 킨크(kink)라 불리는 독특한 꼬임이 고분자 사슬 상에 존재하여 형태 안정성이 우수하며, 이러한 구조적 특성으로 인해 섬유, 포장 및 필름, 부직포 구조물, 엔지니어링 플라스틱 등 폭넓고 다양한 분야에 적용이 가능하다.
상기 다이올들은 화학적 합성 공정이나 미생물 발효 공정을 통하여 생산할 수 있다. 하지만 화학적 합성 공정은 공정 과정에서 환경오염물질이 발생하거나 합성 비용이 많이 드는 문제가 있다. 한편, 재생 가능한 자원으로부터 미생물의 발효를 통한 다이올의 생산은 친환경적이라는 장점은 있으나, 산업적으로 이용하기에는 곡물 가격의 상승, 낮은 균주의 발효 수율, 낮은 생산성 등의 문제점이 있다.
예컨대, 셀룰로오식 바이오매스(나무, empty fruit bunch(EFB), 옥수수대, 볏짚등의 목본계 및 초본계 (이하 통칭하여 “목질계” 라고 함) 바이오매스를 이용하는 경우, 이것들은 비식용 바이오매스이기 때문에, 식용 바이오매스(곡물 등)과 경쟁하지 않고 저가로 생산할 수 있어 산업용 바이오 원료로 장점이 있다. 그러나 목질계 유래 바이오매스에는 오탄당 및 육탄당이 혼합되어 있는데, 미생물은 이화산물 억제(catabolite repression) 기작에 의하여 육탄당을 먼저 대사에 이용한 후 오탄당을 대사에 이용하게 된다. 그러므로 당 소모 속도가 느려져 발효 시간이 증가하며 생산성이 낮아지게 된다. 또한, 발효액 중에 자일로스와 같은 오탄당이 잔존하는 경우 다이올의 분리 및 정제가 어려워진다.
이에 본 발명자들은 목질계 바이오매스를 효율적으로 이용하여 대사할 수 있는 미생물에 대하여 연구하던 중 오탄당 및 육탄당의 동시발효능이 우수한 재조합 미생물을 발명하였다.
본 발명의 목적은 오탄당 및 육탄당의 동시발효능이 우수한 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 다이올을 생산하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고,
또한 다이올 생성능을 갖는 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
둘 이상의 당을 포함하는 배지를 준비하는 단계;
상기 배지에 상기 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 다이올의 생산 방법을 제공한다.
혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법을 제공한다.
도 1은 클렙시엘라 옥시토카의 육탄당 및 오탄당 대사 경로를 개략적으로 나타낸다.
도 2는 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 3은 비교예 1의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 6은 실시예 3의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 7은 실시예 4의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 8은 실시예 5의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 9는 실시예 6의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 10은 실시예 7의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 11은 실시예 8의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 12는 실시예 9의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 13은 비교예 1의 재조합 균주를 모사액을 이용하여 회분식 발효한 결과이다.
도 14는 실시예 3의 재조합 균주를 모사액을 이용하여 회분식 발효한 결과이다.
도 15는 실시예 3의 재조합 균주를 억새 유래 당화액을 이용하여 회분식 발효한 결과이다.
도 16은 실시예 3의 재조합 균주를 나무 유래 당화액을 이용하여 회분식 발효한 결과이다.
도 17은 비교예 1의 재조합 균주를 모사액을 이용하여 유가식 발효한 결과이다.
도 18은 실시예 3의 재조합 균주를 모사액을 이용하여 유가식 발효한 결과이다.
도 19는 실시예 3의 재조합 균주를 나무 유래 당화액을 이용하여 유가식 발효한 결과이다.
도면들에서 사용된 기호는 다음을 나타낸다:
■ : 글루코스
◆ : 자일로스
● : 2,3 부탄다이올
▲ : 락테이트
본 발명은,
목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고,
또한 다이올 생성능을 갖는 재조합 미생물에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
둘 이상의 당을 포함하는 배지를 준비하는 단계;
상기 배지에 상기 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 다이올의 생산 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
목질계 당화액
본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액에 내성을 가지며, 또한 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 상기 목질계 당화액은 목질계 원료 (예를 들면, 나무, EFB(empty fruit bunch), 옥수수대, 사탕수숫대, 갈대, 억새, 볏짚 등)를 가수분해한 가수분해물이며, 바람직하게는 목질계 원료를 가수분해한 후 리그닌을 제거하고 남은 가수분해물이다. 상기 목질계 당화액 내에는 혼합당이 포함되어 있는데, 상기 혼합당은 둘 이상의 당을 포함한다. 바람직하게는 상기 당화액 내에는 글루코스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스, 아라비노스, 셀로바이오스 등 오탄당, 글루코스 등 육탄당 및 2당류들이 포함되어 있으며, 특히 글루코스 및 자일로스의 함량이 높다.
목질계 당화액 내성
본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액에 내성을 갖는다. 목질계 당화액에 내성을 갖는다는 것은 상기 재조합 미생물이 당화액 포함 배지에서 성장이 가능하며, 당화액 내 성분에 의하여 미생물의 성장 저해가 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
동시발효능
본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 동시발효능이란 하나의 당이 또 다른 당보다 우선하여 발효되지 않는다는 의미이다. 본 발명의 재조합 미생물은 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖기 때문에 동시발효능의 대상이 되는 당들 간에는 어느 한 당에 의하여 또 다른 당의 대사가 저해되는 현상(즉, 이화산물 억제(catabolite repression)) 이 방지된다.
재조합 미생물의 동시발효능
본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스의 동시발효능을 갖는다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 자일로스의 동시발효률이 90% 이상이며, 바람직하게는 95% 이상이다.
동시발효률(%)={(총 투입 당(g) - 발효 후 총 잔류 당(g))/총 투입 당(g)} X 100
예) 자일로스 동시발효률(%)
자일로스 동시발효률={(총 투입 자일로스량(g) - 발효 후 잔류 자일로스량(g))/(총 투입 자일로스 량(g))} X 100
다이올
본 발명의 다이올은 탄소 수 5 이하의 다이올이다. 바람직하게는 본 발명의 다이올은 부탄다이올이고, 더욱 바람직하게는 2,3-부탄다이올이다.
재조합 미생물
본 발명은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 다이올 생성능을 갖는 재조합 미생물에 대한 것이다. 상기 재조합 미생물은 목질계 당화액에 대하여 내성을 가지며, 좀더 바람직하게는 목질계 당화액 내 미생물 성장 저해물질에 대하여 내성을 갖는다. 또한 상기 재조합 미생물은 육탄당 및 오탄당의 동시발효능을 가지며, 바람직하게는 글루코스 및 자일로스의 동시발효능을 갖는다.
상기 재조합 미생물은 바람직하게는 재조합 클렙시엘라(Klebsiella)이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 재조합 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)이다.
본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 이화산물(catabolite) 억제 기작이 억제된 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 PTS (Phosphotransferase system)의 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIA(Glucose-specific phosphotransferase enzyme IIA component of PTS 또는 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIBC 요소 (Glucose-specific phosphotransferase enzyme IIBC component of PTS )이 억제된 것이다.
본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 자일로스를 자일룰로스(xylulose)를 거쳐 자일룰로스(xylulose)-5-P 또는 리불로오스(Ribulose)-5-P 또는 리보오스(Ribose)-5-P 또는 프룩토스(Fructose)-6-P 또는 에리스로스-4-P(erythrose-4-P) 또는 글리세알데히드(Glyceraldehyde)-3-P로 전환시키는 경로가 증진된 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 자일로즈 이소머레이즈, 지룰로카이네이즈, D-리불로오스-5-포스페이트 3-에피머라제, 리보오스 5-포스페이트 이소메라제, 트랜스알돌라아제, 및 트랜스케톨라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 활성이 증진된 것이다.
본 발명의 재조합 미생물은 cAMP (cyclic adenosine monophosphate)의 수용체 단백질의 cAMP 수용체 활성이 억제된 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 cAMP-활성화된 글로벌 트랜스크립션 팩터를 코드하는 유전자에 돌연변이가 있어, 상기 유전자의 발현이 억제되거나, 돌연변이된 유전자가 과발현되어 cAMP 수용체 활성이 억제되는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되는 것이 바람직하다. 락테이트 탈수소화효소 (lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 탈수소화효소를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 탈수소화효소의 억제는 락테이트 탈수소화효소의 발현 억제, 락테이트 탈수소화 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 탈수소화효소를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 탈수소화효소를 억제할 수 있다.
또한 본 발명의 재조합 미생물은 피루베이트를 아세틸 코에이 및 포름산으로 전환하는 경로가 억제되는 것이 바람직하다. 피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 통성 혐기 조건에서 피루베이트를 아세틸 코에이와 포름산으로의 전환을 촉매한다 (경로 1).
<경로 1>
피루베이트 → 아세틸 코에이 + 포름산
상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 및 포름산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에서 야생형 균주에 비하여 증진 또는 억제되는 경로 및 상기 경로를 통제하는데 이용한 효소의 유전자들을 나타낸다. Lactate, formate, ethanol과 같은 부산물을 저감하기 위해서 ldhA, pflB 유전자를 제거하였다. 이화산물 억제 기작에 관여하는 경로 (crr, ptsG, crp)를 억제하였고, 자일로스 (5탄당)의 활용 (uptake) 및 대사에 관여하는 경로 (xylA, xylB, rpe, rpiA, tktAB, talB)를 증폭 발현하였다.
둘 이상의 당을 포함하는 배지
둘 이상의 당을 포함하는 배지는 목질계 유래 당화액을 포함하는 배지인 것이 바람직하다. 상기 배지는 자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스를 포함할 수 있다. 이 때, 당화액 내 글루코스와 자일로스는 5.5 : 4.5 내지 9 : 1의 중량비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 5.5 : 4.5 내지 8.0 : 2.0의 중량비로 포함될 수 있다.
재조합 미생물의 다이올 생성능
본 발명의 재조합 미생물의 다이올 생성능은 하기와 같이 계산하였다.
- 다이올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 다이올의 양
(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 다이올 생산성은 exponential phase 기준임, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적된 다이올의 양을 기준으로 계산함)
- 2,3-부탄다이올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄다이올의 양
(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 2,3-부탄다이올 생산성은 exponential phase 기준임, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적된 2,3-부탄다이올의 양을 기준으로 계산함)
-수율(%): {2,3-부탄다이올 생산량(g)/탄소원(g)} × 100
-농도(g/L): 단위 부피 당 생산되는 대사 산물의 양
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
야생형 균주로는 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP 균주 (2012년 2월 8일 기탁, 한국생명공학연구원)를 사용하였다.
당 분석은 액체크로마토그래피를 이용하였다. 이때 사용한 이동상은 0.01N H2SO4 용액이며 칼럼은 Bio-Rad사의 Aminex87H를 이용하였다.
본 발명의 실험예에서 사용한 나무 유래 당화액은 하기의 방법으로 제조하였다.
황산 70%를 포함하는 반응기에 폐목재를 잘게 썰어서 첨가하고 이를 약 100℃ 정도로 30분 교반하면서 반응시켜 전처리하였다. 전처리된 슬러리에 물을 적당히 첨가하여 가수분해하였다. 이렇게 가수분해된 용액에는 셀룰로오스(cellulose) 및 헤미셀룰로오스(hemicelluloses) 로부터 유래된 포도당, 자일로스를 포함하여 여러 당들이 혼합물들의 형태로 존재한다(상기 당들의 혼합물을 이하 “혼합당”이라 한다). 상기 가수분해 용액을 필터프레스를 이용하여 약 3bar 정도로 압착하면 액에는 혼합당이 포함되고 필터내부에는 리그닌이 고형으로 분리된다. 이렇게 가수분해용액으로부터 리그닌을 제거하고, 남은 용액(혼합당이 포함되어 있음)으로부터 음이온교환수지를 이용하여 황산을 분리하고 약 100g/L 의 혼합당 농도를 갖는 나무 유래 당화액을 생산하였다. 이렇게 생산된 나무 유래 당화액을 다시 혼합당 농도가 약 200g/L 되도록 농축하여, 상기 농축물을 연속배양을 위한 배양액으로 이용하였다.
본 발명의 실험예에서 사용한 억새 유래 당화액은 하기의 방법으로 제조하였다.
황산 70%를 포함하는 반응기에 억새를 잘게 썰어서 첨가하고 이를 약 100℃ 정도로 30분 교반하면서 반응시켜 전처리하였다. 전처리된 슬러리에 물을 적당히 첨가하여 가수분해하였다. 이렇게 가수분해된 용액에는 셀룰로오스(cellulose) 및 헤미셀룰로오스(hemicelluloses) 로부터 유래된 포도당, 자일로스를 포함하여 여러 당들이 혼합물들의 형태로 존재한다(상기 당들의 혼합물을 이하 “혼합당”이라 한다). 상기 가수분해 용액(혼합당이 포함되어 있음)으로부터 음이온교환수지를 이용하여 황산을 분리하고 약 100g/L 의 혼합당 농도를 갖는 억새 유래 당화액을 생산하였다. 이렇게 생산된 억새 유래 당화액을 다시 혼합당 농도가 약 200g/L 되도록 농축하여, 상기 농축물을 연속배양을 위한 배양액으로 이용하였다.
<실험예 1> 재조합 균주들의 제조
<비교예 1> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB 의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 락테이트 디하이드로게나제와 피루베이트 포르메이트 리아제를 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)와 pflB (서열번호 2)의 상동 부위를 PCR로 증폭하였다(표 1).
이 때, 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 증폭된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 나중에 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위하여 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.
Figure 112017120479319-pat00001
Figure 112017120479319-pat00002
상기 제작된 DNA 단편들을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω,18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP에 전달하였다. 이 때, ldhA 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 ldhA 유전자를 제거한 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 제조하였다. 그 후 상기 ldhA 유전자가 제거된 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 pflB 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하였다.
그 결과, 표적 유전자인 ldhA 및 pflB가 제거된 재조합 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca ΔldhA ΔpflB)가 제조되었다.
<실시예 1> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB Δcrr의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIA(Glucose-specific phosphotransferase enzyme IIA component of PTS)을 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 crr(서열번호 3) 의 상동 부위를 PCR로 증폭하였다.
Figure 112017120479319-pat00003
이 때, 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 증폭된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 나중에 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위하여 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 제작된 crr 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω,18 kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 전달하였다.
그 결과, 표적 유전자인 crr이 추가로 제거된 재조합 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca ΔldhA ΔpflB Δcrr)가 제조되었다.
<실시예 2> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB ΔptsG 의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 PTS의 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIBC 요소 (glucose-specific phosphotransferase enzyme IIBC component of PTS)을 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 ptsG(서열번호 4)의 상동 부위를 PCR로 증폭하였다(표 3).
이 때, 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 증폭된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 나중에 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위하여 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.
Figure 112017120479319-pat00004
상기 제작된 ptsG 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω,18 kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 전달하였다.
그 결과, 표적 유전자인 ptsG이 추가로 제거된 재조합 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca ΔldhA ΔpflB ΔptsG)가 제조되었다.
<실시예 3> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-xylAB의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site) 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 D-자일로즈 이소머레이즈(xylose isomerase) 효소를 코딩하는 유전자 (xylA, 서열번호 5)와 지룰로카이네이즈(xylulokinase) 효소를 코딩하는 유전자 (xylB, 서열번호 6)를 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 xylA 및 xylB를 각각 PCR로 증폭하였다. 이 때 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 4).
Figure 112017120479319-pat00005
Figure 112017120479319-pat00006
각각의 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 상기 두 단편을 접합하여 pGSC-xylAB 플라스미드를 제조하였다.
자일로즈 이소머레이즈 효소와 지룰로카이네이즈 효소의 발현 증폭
상기 제조한 pGSC-xylAB 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써, xylAB 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-xylAB을 제조하였다.
전기 천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-xylAB를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 그 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통하여 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 4> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpe의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site) 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 D-리불로오스-5-포스페이트 3-에피머라제 (D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase)를 코딩하는 유전자 (rpe, 서열번호 7)을 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 rpe를 PCR로 증폭하였다. 이 때 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 5).
Figure 112017120479319-pat00007
상기 rpe 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 접합하여 pGSC-rpe 플라스미드를 제조하였다.
D-리불로오스-5-포스페이트 3-에피머라제 효소의 발현 증폭
상기 제조한 pGSC-rpe 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써, rpe 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpe를 제조하였다.
전기 천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpe를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 그 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통하여 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 5> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpiA의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site) 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 리보오스 5-포스페이트 이소메라제 (ribose 5-phosphate isomerase)를 코딩하는 유전자 (rpiA, 서열번호 8)을 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 rpiA를 PCR로 증폭하였다. 이 때 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 6).
Figure 112017120479319-pat00008
상기 rpiA 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 접합하여 pGSC-rpiA 플라스미드를 제조하였다.
리보오스 5-포스페이트 이소메라제 효소의 발현 증폭
상기 제조한 pGSC-rpiA 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써, rpiA 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpiA를 제조하였다.
전기 천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-rpiA를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 그 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통하여 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 6> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-talB의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site) 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 트랜스알돌라아제 B (transaldolase B)를 코딩하는 유전자 (talB, 서열번호 9)를 클로닝하기 위하여, 표적 유전자인 talB를 PCR로 증폭하였다. 이 때 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 7).
Figure 112017120479319-pat00009
상기 talB 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 접합하여 pGSC- talB 플라스미드를 제조하였다.
트랜스알돌라아제 B 효소의 발현 증폭
상기 제조한 pGSC- talB 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써, talB 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-talB를 제조하였다.
전기 천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-talB를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 그 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통하여 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 7> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-tktAB의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site) 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 트랜스케톨라아제 (transketolase)를 코딩하는 유전자 tktA(서열번호 10) 및 tktB (서열번호 11)를 동시에 클로닝하기 위하여(이하, “tktAB”라 함), 표적 유전자인 tktAB (서열번호 12)를 PCR로 증폭하였다(표 8). 이 때 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
Figure 112017120479319-pat00010
Figure 112017120479319-pat00011
Figure 112017120479319-pat00012
Figure 112017120479319-pat00013
상기 tktAB 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 접합하여 pGSC-tktAB 플라스미드를 제조하였다.
트랜스케톨라아제 효소의 발현 증폭
상기 제조한 pGSC-tktAB 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써, talB 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-tktAB를 제조하였다.
전기 천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-tktAB를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 그 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통하여 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 8> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)01의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카 유래의 cAMP 수용체 단백질인 cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터 (cAMP-activated global transcription factor)를 코딩하는 유전자인 crp의 일부 DNA 서열이 변경된 유전자의 발현을 증폭하는 데 사용할 재조합 플라스미드를 제조하였다.
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site), 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하여야 한다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 cAMP 수용체 단백질인 cAMP-activated global transcription factor를 코딩하는 유전자인 crp(in)01을 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 crp(in)01 (서열번호 13)을 PCR로 증폭하였다. 상기 crp(in)01 유전자는 catabolite repression에 관여하는 유전자인 crp 유전자의 DNA 서열 중 일부가 다르게 변형한 것이다. 일부 서열이 다르기 때문에 catabolite repression이 작동하지 않게 하여, glucose (C6)와 xylose (C5)를 동시에 대사하게 하여 2,3-부탄다이올 생산성을 증가시켰다. 이 때, 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)에 변경된 DNA 서열을 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 9).
Figure 112017120479319-pat00014
상기 crp(in)01 유전자를 포함하는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 상기 두 단편을 접합하여, pGSC-crp(in)01 플라스미드를 제조하였다. 그리고 상기 pGSC-crp(in)01 플라스미드를 과발현 플라스미드로 이용하였다.
cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터의 발현 증폭
클렙시엘라 옥시토카 유래의 cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터를 코딩하는 유전자인 crp(in)01의 발현을 증폭시켰다.
상기 제조한 pGSC-crp(in)01 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써 crp(in)01 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)01를 제조하였다.
전기천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)01를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통해 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실시예 9> K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)02의 제조
과발현 플라스미드의 제조
클렙시엘라 옥시토카 유래의 cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터 (cAMP-activated global transcription factor)를 코딩하는 유전자인 crp의 일부 DNA 서열이 변경된 유전자의 발현을 증폭하는 데 사용할 재조합 플라스미드를 제조하였다.
클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위하여, 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site), 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802,1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하여야 한다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.
클렙시엘라 옥시토카의 cAMP 수용체 단백질인 cAMP-activated global transcription factor를 코딩하는 유전자인 crp(in)02을 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 crp(in)02 (서열번호 14)를 PCR로 증폭하였다. 상기 crp(in)02 유전자는 catabolite repression에 관여하는 유전자인 crp 유전자의 DNA 서열 중 일부가 다르게 변형한 것이다. 일부 서열이 다르기 때문에 catabolite repression이 작동하지 않게 하여, glucose (C6)와 xylose (C5)를 동시에 대사하게 하여 2,3-부탄다이올 생산성을 증가시켰다. 이 때, 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)에 변경된 DNA 서열을 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 10).
Figure 112017120479319-pat00015
상기 crp(in)02 유전자를 포함하는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 상기 두 단편을 접합하여, pGSC-crp(in)02 플라스미드를 제조하였다. 그리고 상기 pGSC-crp(in)02 플라스미드를 과발현 플라스미드로 이용하였다.
cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터의 발현 증폭
클렙시엘라 옥시토카 유래의 cAMP-액티베이티드 글로벌 트랜스크립션 팩터를 코딩하는 유전자인 crp(in)02의 발현을 증폭시켰다.
상기 제조한 pGSC-crp(in)02 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18kV/cm)을 이용하여 <비교예 1>의 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB에 클로닝하였다. 이로써 crp(in)02 유전자의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카인 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)02를 제조하였다.
전기천공법을 수행한 후 상기 K. oxytoca ΔldhA ΔpflB+pGSC-crp(in)02를 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통해 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.
<실험예 2> 회분식 발효시 글루코스와 자일로스의 동시발효능 평가
야생형 균주인 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP, 비교예 1 및 실시예 1 내지 9의 재조합 K. 옥시토카들에 대하여, 글루코스와 자일로스의 동시발효 성능을 회분식 발효를 통해 평가하였다. 이들 균주들을 9 g/L 글루코스 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 550 rpm), 60 g/L 초기 글루코스 농도, 40 g/L 초기 자일로스 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
이 때, 실시예 3 내지 9의 재조합 균주들의 경우, 배지 내에 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하여 발효를 수행하였다.
그 결과, 실시예 1 내지 9의 재조합 균주들은 글루코스와 자일로스의 동시발효능이 우수한 것으로 나타났다. 이를 구체적으로 살펴보면, 야생형 균주는 Catabolite repression에 의하여 글루코스를 대사한 후 자일로스를 대사하였으며, 발효 시간이 상당히 긴 것으로 나타났다(도 2). 한편, 비교예 1의 균주는 이산화물의 억제 기작을 통하여 글루코스 소모 후 자일로스를 소모하는 것으로 나타났다(도 3). 실시예 1 및 실시예 2의 재조합 균주는 글루코스와 자일로스를 동시에 대사하였다(도 4: 실시예 1, 도 5: 실시예 2). 실시예 3 내지 7의 재조합 균주들의 경우 자일로스 대사 관련 유전자들이 과발현되어 자일로스 이용이 개선되었다(도 6: 실시예 3, 도 7: 실시예 4, 도 8: 실시예 5, 도 9: 실시예 6, 도 10: 실시예 7). 실시예 8 및 9의 재조합 균주 역시 글루코스와 자일로스를 동시에 대사하였는데, 이는 돌연변이된 crp 유전자의 과발현으로 인하여 이산화물 억제 기작이 억제되어, 글루코스와 자일로스의 동시 대사가 이루어지는 것으로 판단되었다(도 11: 실시예 8, 도 12: 실시예 9)(표 11). 또한 이들 균주들의 발효 부산물들은 하기 표 12와 같다.
Figure 112017120479319-pat00016
Figure 112017120479319-pat00017
<실험예 3> 목질계 바이오매스 종류에 따른 글루코스와 자일로스의 동시발효능 평가
목질계 바이오매스의 종류 및 당화액 내 당 비율에 따른 본 발명의 재조합 균주의 글루코스와 자일로스의 동시발효능을 평가하였다.
<3-1> 모사액 이용 시 글루코스와 자일로스의 동시발효능 평가
비교예 1 및 실시예 3의 재조합 K. 옥시토카에 대하여, 글루코스와 자일로스의 동시발효 성능을 모사액을 이용한 회분식 발효를 통해 평가하였다. 이들 균주들을 9 g/L 글루코스 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 550 rpm), 60 g/L 초기 글루코스 농도,, 40 g/L 초기 자일로스 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다(글루코스 : 자일로스가 6 : 4의 중량비로 혼합). 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
이 때, 실시예 3의 경우, 배지 내에 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하여 발효를 수행하였다.
그 결과, 비교예 1의 균주는 글루코스와 자일로스를 모두 소모하는데 46 시간 이상이 소요되었다(도 13). 반면, 실시예 3의 균주는 글루코스와 자일로스를 모두 소모하는데 30 시간이 소요되었는바(도 14), 혼합당을 빠른 속도로 이용하여, 대사를 하는 것으로 확인되었다.
<3-2> 억새 유래 당화액 이용 시 글루코스와 자일로스의 동시발효능 평가
비교예 1 및 실시예 3의 재조합 K. 옥시토카에 대하여, 글루코스와 자일로스의 동시발효 성능을 억새를 이용한 목질계 당화액의 회분식 발효를 통해 평가하였다. 이들 균주들을 9 g/L 글루코스 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 550 rpm), 100 g/L 초기 억새 유래 당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다(글루코스 : 자일로스가 7 : 3의 중량비로 포함, 70 g/L 글루코스, 30 g/L 자일로스). 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 실시예 3의 균주는 글루코스와 자일로스를 모두 소모하는데 20 시간이 소요되었는바(도 15), 혼합당을 빠른 속도로 이용하여, 대사를 하는 것으로 확인되었다.
<3-3> 나무 유래 당화액 이용 시 글루코스와 자일로스의 동시발효능 평가
비교예 1 및 실시예 3의 재조합 K. 옥시토카에 대하여, 글루코스와 자일로스의 동시발효 성능을 나무를 이용한 목질계 당화액의 회분식 발효를 통해 평가하였다. 이들 균주들을 9 g/L 글루코스 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 550 rpm), 100 g/L 초기 억새 유래 당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다(글루코스 : 자일로스가 7 : 3의 중량비로 포함, 70 g/L 글루코스, 30 g/L 자일로스). 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 실시예 3의 균주는 글루코스와 자일로스를 모두 소모하는데 22 시간이 소요되었는바(도 16), 혼합당을 빠른 속도로 이용하여, 대사를 하는 것으로 확인되었다.
<실험예 4> 유가식 배양 시 글루코스 및 자일로스의 동시발효능 평가
<4-1> 모사액을 이용한 유가식 배양
비교예 1 및 실시예 3의 재조합 균주을 모사액(글루코스: 자일로스가 6:4의 중량비로 혼합)을 이용하여 유가식 배양하여, 글루코스 및 자일로스의 동시 발효능을 평가하였다. 이 때, 배양 방법은 글루코스나 자일로스 농도가 20 g/L 이하로 떨어졌을 때 글루코스 및 자일로스의 혼합액 50 g/L를 Feeding Solution으로서 투입한 것을 제외하면, 상기 <3-1>과 동일하였다.
그 결과, 비교예 1의 경우 1의 경우 배양 시간이 경과할수록 자일로스가 축적되었는데, 배양 70 시간 경과 후에는 140 g/L 이상까지 자일로스 양이 축적되었다. 2,3-부탄다이올은 83.5 g/L 생산되었고, 시간 당 생산성은 1.67 g/L/h였다(도 17). 실시예 3의 재조합 균주의 경우 2,3-부탄다이올은 93 g/L 생산되었고, 시간 당 생산성은 2.02 g/L/h, 수율은 40% (0.4 g 2,3-BDO/g 총 당량과 동일)였다. 자일로스는 축적되지 않았고, 글루코스와 함께 소모되었다(도 18).
<4-2> 나무 유래 당화액을 이용한 유가식 배양
실시예 3의 재조합 균주를 나무 유래 당화액(글루코스 : 자일로스가 7 : 3의 중량비로 포함) 을 이용하여 유가식 배양하여, 글루코스 및 자일로스의 동시 발효능을 평가하였다. 이 때, 배양 방법은 글루코스나 자일로스 농도가 20 g/L 이하로 떨어졌을 때 글루코스 및 자일로스의 혼합액 50 g/L를 Feeding Solution으로서 투입한 것을 제외하면, 상기 <3-3>과 동일하였다.
그 결과, 실시예 3의 재조합 균주의 경우 2,3-부탄다이올은 75 g/L 생산되었고, 시간 당 생산성은 1.63 g/L/h, 수율은 40% (0.4 g 2,3-BDO/g 총 당량과 동일)였다. 자일로스는 축적되지 않았고, 글루코스와 함께 소모되었다(도 19).
<서열목록 프리텍스트>
서열번호 1: ldhA의 상동부위의 염기 서열이다.
서열번호 2: pflB의 상동부위의 염기 서열이다.
서열번호 3: crr의 상동부위의 염기 서열이다.
서열번호 4: ptsG의 상동부위의 염기 서열이다.
서열번호 5: xylA의 염기 서열이다.
서열번호 6: xylB의 염기 서열이다.
서열번호 7: rpe의 염기 서열이다.
서열번호 8: rpiA의 염기 서열이다.
서열번호 9: talB의 염기 서열이다.
서열번호 10: tktA의 염기 서열이다.
서열번호 11: tktB의 염기 서열이다.
서열번호 12: tktAB의 염기 서열이다.
서열번호 13: crp(in)01의 염기 서열이다.
서열번호 14: crp(in)02의 염기 서열이다.
한국생명공학연구원 KCTC12132BP 20120208
<110> GS CALTEX <120> RECOMBINANT MICROORGANISM CAPABLE OF STIMULTANEOUS FERMENTATION OF SACCHARIDE MIXTURE AND PRODUCTION METHOD OF DIOL USING IT <130> DNP170016 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 1 atgaaaatcg ctgtgtatag tacaaaacag tacgacaaga agtatctgca gcatgttaat 60 gatgcatatg gctttgaact ggagtttttt gacttcctgc taaccgaaaa aaccgccaaa 120 accgccaacg gctgtgaagc ggtgtgtatc ttcgtaaacg atgacggtag ccgcccggta 180 cttgaagaac tgaaagccca cggcgtgcag tacatcgcgc tgcgctgcgc ggggttcaac 240 aacgttgacc tcgatgccgc caaagagctg ggcctgcggg tggtgcgcgt cccggcctac 300 tcgccggaag cggtcgctga gcacgcgatc ggcatgatga tgtcgctgaa ccgccgcatt 360 caccgtgcct atcagcgcac ccgcgacgcg aacttctctc tggaagggct gaccggtttc 420 accatgcacg gtaaaaccgc cggcgttatt ggcaccggta aaatcggcgt cgccgcgctg 480 cgcattctta aaggcttcgg tatgcgtctg ctggcgtttg atccctaccc aagcgccgcc 540 gcgctggata tgggcgtgga gtatgtcgat cttgaaaccc tgtaccggga gtccgatgtt 600 atctcactgc actgcccact gaccgatgaa aactaccatt 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360 atggctcgtc gtctgcaggt catctctgag aaagtgggta acctcgcctt cctcgacgtt 420 accggtcgta tcacccagac gctgctgaac ctggctaaac agccggatgc gatgacccac 480 ccggacggta tgcaaattaa aattacccgc caggaaatcg gtcagatcgt cggatgctcc 540 cgcgagaccg ttggccgtat cctgaaaatg ctggaagatc aaaacctgat ctccgcgcac 600 ggtaaaacta tcgtcgtcta cggtacccgt taa 633 <210> 14 <211> 633 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 14 atggtgcttg gcaaaccgca aacagaccct acccttgaat ggttcttgtc tcattgccac 60 attcataagt acccatcaaa gagcacgctg atccaccagg gtgagaaagc agaaacgttg 120 tactacatcg ttaaaggctc cgtggctgta ctcatcaagg atgaagaagg taaagagatg 180 atcctctctt acctcaatca gggcgatttc atcggtgcat taggcttgtt tgaagaaggc 240 caggagcgta gcgcttgggt acgtgcgaaa accgcatgtg aagtggccga aatctcctac 300 aaaaaattcc gtcagctgat ccaggttaac ccggacatcc tgatgcgtct ctcttcgcag 360 atggctcgtc gtctgcaggt cacgtctgag aaagtgggta acctcgcctt cctcgacgtt 420 accggtcgta tcacccagac gctgctgaac ctggctaaac agccggatgc gatgacccac 480 ccggacggta tgcaaattaa aattacccgc caggaaatcg gtcagatcgt cggatgctcc 540 cgcgagaccg ttggccgtat cctgaaaatg ctggaagatc aaaacctgat ctccgcgcac 600 ggtaaaacta tcgtcgtcta cggtacccgt taa 633

Claims (12)

  1. 배지 내 글루코스 및 자일로스에 대하여 동시발효능을 갖고,
    또한 2,3-부탄다이올 생성능을 갖는 재조합 미생물로,
    상기 재조합 미생물은 재조합 클렙시엘라이며,
    상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로를 조절하는 락테이트 탈수소화효소 및 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로를 조절하는 피루베이트-포르메이트 리아제가 억제되고,
    상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 PTS (Phosphotransferase System)의 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIA 요소(Glucose-specific phosphotransferase enzyme IIA component) 또는 글루코스-특이적 포스포트랜스페라제 효소 IIBC 요소가 억제되거나, 또는, 야생형 미생물보다 자일로스를 자일룰로스(xylulose)를 거쳐 자일룰로스(xylulose)-5-P 또는 리불로오스(Ribulose)-5-P 또는 리보오스(Ribose)-5-P 또는 프룩토스(Fructose)-6-P 또는 에리스로스-4-P 또는 글리세알데히드(Glyceraldehyde)-3-P로 전환시키는 경로가 증진된 재조합 미생물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 배지는 목질계 당화액을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제 1항에 있어서,
    야생형 미생물보다 이화산물(catabolite) 억제 기작이 억제된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    자일로즈 이소머레이즈, 지룰로카이네이즈, D-리불로오스-5-포스페이트 3-에피머라제, 리보오스 5-포스페이트 이소메라제, 트랜스알돌라아제, 및 트랜스케톨라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 활성이 증진된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제 1항에 있어서,
    cAMP의 수용체 단백질의 활성이 억제된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 삭제
  10. 글루코스 및 자일로스를 포함하는 배지를 준비하는 단계;
    상기 배지에 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 7항 및 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
    상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올의 생산 방법.
  11. 삭제
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 배지는 목질계 당화액을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160298144A1 (en) * 2013-11-22 2016-10-13 Toray Industries, Inc. Method of producing 2,3-butanediol

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101457211B (zh) * 2008-08-04 2011-09-07 山东大学 一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2,3-丁二醇中的应用
WO2013076144A2 (en) * 2011-11-21 2013-05-30 Metabolic Explorer Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol
KR101516786B1 (ko) * 2012-04-25 2015-05-04 한국생명공학연구원 글리세롤 발효 미생물 변이체를 이용한 디올 화합물의 제조방법
CN102643869B (zh) * 2012-05-04 2014-04-16 天津科技大学 一种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法
KR101581504B1 (ko) * 2013-03-18 2015-12-31 지에스칼텍스 주식회사 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
DE102013216658A1 (de) * 2013-08-22 2015-02-26 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme
JP2016077262A (ja) * 2014-10-22 2016-05-16 東レ株式会社 ２，３−ブタンジオールの製造方法
KR101590993B1 (ko) * 2013-12-12 2016-02-02 서울대학교산학협력단 재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법
KR102109763B1 (ko) * 2014-04-21 2020-05-13 지에스칼텍스 주식회사 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법
CN104046586B (zh) * 2014-07-02 2016-08-17 山东大学 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
KR101548480B1 (ko) * 2015-02-11 2015-08-31 지에스칼텍스 주식회사 혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법
CN105199976B (zh) * 2015-11-05 2020-12-18 山东大学 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
CN112226399B (zh) * 2020-12-11 2021-02-26 中国科学院上海高等研究院 一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株及工程菌和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160298144A1 (en) * 2013-11-22 2016-10-13 Toray Industries, Inc. Method of producing 2,3-butanediol

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xiao-Jun Ji 등. Applied Microbiology and Biotechnology. Vol. 89, No. 4, 페이지 1119-1125 (2010.10.19.) 1부.*

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