BR112012000599B1 - Processo para a produção fermentativa de etanol a partir de uma composição de açúcar com o emprego de uma cepa de levedura recombinante - Google Patents

Processo para a produção fermentativa de etanol a partir de uma composição de açúcar com o emprego de uma cepa de levedura recombinante Download PDF

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Abstract

PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE ETANOL A PARTIR DE GLICOSE, GALACTOSE E ARABINOSE COM O EMPREGO DE UMA CEPA DE LEVEDURA RECOMBINANTE. A presente invenção está relacionada a um processo para a produção de um ou mais produtos de fermentação a partir de uma composição de açúcar, que compreende as seguintes etapas: a) fermentação da composição de açúcar na presença de uma levedura que pertence aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia, e b) recuperação do produto de fermentação, em que a levedura compreende os genes araA, araB e araD e a composição de açúcar compreende glicose, galactose e arabinose.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção está relacionada à fermentação de açúcares mistos, em particular à fermentação de uma composição de açúcar que compreende glicose, galactose e arabinose. A composição de açúcar pode se originar de material lignocelulósico.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A maioria do etanol produzido como alternativa aos combustíveis fósseis é atualmente da fermentação de amido de milho e sacarose à base de cana de açúcar. A fim de atingir os objetivos ambiciosos para a produção de combustíveis renováveis, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas para a conversão de biomassa não alimentícia em produtos de fermentação como, por exemplo, etanol. Saccharomyces cerevisiae é o organismo de escolha na indústria do etanol, mas ele não pode utilizar açúcares de cinco carbonos contidos no componente de hemicelulose de matérias-primas de biomassa. A hemicelulose pode constituir até 20-30% de biomassa, com xilose e arabinose sendo os açúcares C5 mais abundantes. A expressão heteróloga de uma xilose isomerase (XI) é uma opção para permitir que células de levedura metabolizem e fermentem xilose. Do mesmo modo, a expressão de genes bacterianos araA, araB e araD em cepas de S. cerevisiae resulta na utilização e fermentação alcoólica eficiente de arabinose. A galactose é um açúcar C6 que também é um açúcar que está freqüentemente presente em lignocelulose, freqüentemente em quantidades (aproximadamente 4% dos açúcares totais) que não devem ser negligenciadas por razões econômicas. J. van den Brink e cols., Microbiology (2009) 155, 1.340-1.350, revelam que a glicose é uma fonte de carbono favorecida para Saccharomyces cerevisiae e que, após mudança de condições de fermentação com glicose limitada para condição de excesso de galactose sob condição anaeróbica, a galactose não era consumida.
Até agora, nenhum processo foi revelado para converter galactose no produto de fermentação no mesmo processo com glicose e um ou mais açúcares C5. Um objetivo da invenção é, portanto, fornecer um processo para converter galactose no produto de fermentação no mesmo processo com glicose e um ou mais açúcares C5.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece um processo para a produção de um ou mais produtos de fermentação a partir de uma composição de açúcar, que compreende as seguintes etapas: a) fermentação da composição de açúcar na presença de uma levedura que pertence aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia, e b) recuperação do produto de fermentação, em que a levedura compreende os genes araA, araB e araD e a composição de açúcar compreende glicose, galactose e arabinose.
Vantajosamente, os açúcares glicose, galactose e arabinose são convertidos no produto de fermentação.
De preferência, a célula de açúcares mistos é do gênero Saccharomyces, mais preferivelmente um Saccharomyces cerevisiae.
A invenção ainda está relacionada ao uso de genes araA, araB e araD, para conferir, por meio da expressão daqueles genes, em uma cepa que fermenta glicose, a habilidade para fermentar anaerobicamente galactose na presença de arabinose.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 apresenta um mapa físico do plasmídeo pPWT006.
A Figura 2 apresenta um mapa físico do plasmídeo pPWT018.
A Figura 3 apresenta uma auto-radiografia de Southern blot. O DNA cromossômico da cepa do tipo selvagem CEN.PK113-7D (raia 1) e BIE104A2 (raia 2) foi digerido com EcoRI e HindIII. O blot foi hibridizado com a sonda SIT2 específica.
A Figura 4 apresenta mapas físicos do lócus de S/T2 do tipo selvagem (painel a) e após introdução dos genes ara por integração do plasmídeo pPWT018, seguida por recombinação intramolecular que leva à perda de vetor e seqüências de marcador selecionável (painel b). A hibridização da sonda está indicada.
A Figura 5 apresenta um mapa físico do plasmídeo pPWT080, cuja seqüência é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 4.
A Figura 6 apresenta um mapa físico do lócus GRE3 do tipo selvagem (painel a) e uma integração de uma cópia de PWT080 no lócus GRE3 (painel b, que mostra onde os iniciadores se ligam, e painel c, que mostra onde a sonda RKI1 se liga).
A Figura 7 apresenta um mapa físico do lócus GRE3, em que a região codificadora do gene GRE3 foi substituída pela integração dos genes da PPP TAL1, TKL1, RKI1 e RPE1. O painel a mostra onde os iniciadores do ID. DE SEQ. N°: 5 e 6 se ligam, o painel b mostra onde a sonda RKI1 se liga.
A Figura 8 apresenta curvas de crescimento sob condições aeróbicas de BIE104P1A2 em diferentes meios. A cepa BIE104A2P1 foi pré-desenvolvida em galactose 2% YNB. A curva de crescimento foi iniciada em galactose 2% e arabinose 1%, seguida pelo evento indicado no gráfico por (1) transferência para YNB com arabinose 2% como a única fonte de carbono. Após alcançar uma OD600 de mais de 1, a cultura foi transferida para meio fresco com uma OD600 de partida de 0,2. Após três transferências em meio de arabinose puro, a cepa resultante foi designada BIE104P1A2c.
A Figura 9 apresenta curvas de crescimento sob condições anaeróbicas de BIE104P1A2c em arabinose 2% YNB como a única fonte de carbono. Após alcançar uma OD600 maior do que 1, a cultura foi transferida para meio fresco com uma OD600 de partida de 0,2. Após várias transferências, a cepa resultante foi denominada BIE104P1A2d (= BIE201).
A Figura 10 apresenta conversão de açúcar e formação de produto de BIE104 em meio de modelo de fibra de milho sintética. A produção de CO2 foi medida constantemente. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura. A pré-cultura foi desenvolvida em glicose 2%.
A Figura 11 apresenta conversão de açúcar e formação de produto de BIE104P1A2c em meio de modelo de fibra de milho sintética. A produção de CO2 foi medida constantemente. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura. A pré- cultura foi desenvolvida em glicose 2%.
A Figura 12 apresenta conversão de açúcar e formação de produto de BIE201 em meio de modelo de fibra de milho sintética. A produção de CO2 foi medida constantemente. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura. A pré-cultura foi desenvolvida em glicose 2%.
A Figura 13 apresenta conversão de açúcar e formação de produto de BIE104A2 em meio de modelo de fibra de milho sintética. A produção de CO2 foi medida constantemente. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura. A pré-cultura foi desenvolvida em glicose 2%.
A Figura 14 apresenta conversão de açúcar e formação de produto de BIE105A2 em meio de modelo de fibra de milho sintética. A produção de CO2 foi medida constantemente. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura. A pré-cultura foi desenvolvida em glicose 2%.
A Figura 15 apresenta um mapa físico do plasmídeo pPWT007.
A Figura 16 apresenta um mapa físico do plasmídeo pPWT042.
A Figura 17 apresenta um mapa físico do lócus S/T4 do tipo selvagem (painel a) e a integração de uma cópia de PWT080 no lócus S/T4 (painel b, que mostra onde os iniciadores se ligam).
A Figura 18 apresenta uma representação gráfica de curvas de crescimento da cepa BIE104A2P1Y9 em diferentes meios. Painel a: cepa BIE104A2P1Y9 desenvolvida em glicose, seguida por eventos indicados no gráfico por (1) transferência para arabinose 1% + xilose 1% e (2) transferência para xilose 2% + arabinose 0,2%. Painel b:cepa BIE104A2P1Y9 desenvolvida em galactose, seguida por (1) transferência para arabinose 1% + xilose 1% e (2) transferência para xilose 2% + arabinose 0,2%.
A Figura 19 apresenta o crescimento em meio de Verduyn suplementado com xilose 2% da cepa BIE104A2P1Y9. Duas colônias independentes foram testadas. Após alcançar uma OD600 de 2, as cepas foram transferidas para meio fresco e imediatamente começaram a crescer em xilose.
A Figura 20 apresenta um mapa físico do plasmídeo pGBS416ARAABD.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
O ID. DE SEQ. N°: 1 apresenta a seqüência de xylose isomerase do tipo selvagem de Bacteroides uniformis ATCC 8492. N° de Acesso no Genbank AAYH02000036. O ID. DE SEQ. N°: 2 apresenta uma seqüência com códons otimizados derivada do ID. DE SEQ. N°: 1. O ID. DE SEQ. N°: 3 apresenta a seqüência de aminoácidos de xilose isomerase de Bacteroides uniformis ATCC 8492. O ID. DE SEQ. N°: 4 apresenta a seqüência do plasmídeo pPWT080. O ID. DE SEQ. N°: 5 apresenta a seqüência do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 6 apresenta a seqüência do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 7 apresenta a seqüência do iniciador multifuncional direto para PCR diagnóstica. O ID. DE SEQ. N°: 8 apresenta a seqüência do iniciador multifuncional reverso para PCR diagnóstica. O ID. DE SEQ. N°: 9 apresenta a seqüência da sonda RKI1 do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 10 apresenta a sonda RKI1 da seqüência do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 11 apresenta o cassete kanMX da seqüência do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 12 apresenta o cassete kanMX da seqüência do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 13 apresenta a seqüência do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 14 apresenta a seqüência do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 15 apresenta a seqüência do iniciador multifuncional direto para PCR diagnóstica. O ID. DE SEQ. N°: 16 apresenta a seqüência do iniciador multifuncional reverso para PCR diagnóstica. O ID. DE SEQ. N°: 17 apresenta a seqüência de seqüência do plasmídeo pPWT018. O ID. DE SEQ. N°: 18 apresenta a seqüência do pPWT018 de integração do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 19 apresenta a seqüência do pPWT018 de integração do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 20 apresenta a seqüência da sonda SIT2 do iniciador direto. O ID. DE SEQ. N°: 21 apresenta a seqüência da sonda SIT2 do iniciador reverso. O ID. DE SEQ. N°: 22 apresenta a seqüência do iniciador direto para amplificar o cassete de expressão de araABD. O ID. DE SEQ. N°: 23 apresenta a seqüência do iniciador reverso para amplificar o cassete de expressão de araABD.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Ao longo da presente especificação e nas reivindicações que a acompanham, as palavras “compreender” e “incluir” e variações como, por exemplo, “compreende”, “que compreende”, “inclui” e “que inclui”, devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras visam englobar a inclusão possível de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, quando o contexto permitir.
Os artigos “a”, “o” “uma” e “um” são aqui usados para se referir a um ou a mais de um (ou seja, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Apenas como exemplo, “um elemento” pode significar um elemento ou mais de um elemento.
As várias modalidades da invenção aqui descritas podem ser combinadas de forma cruzada.
A composição de açúcar
A composição de açúcar de acordo com a invenção compreende glicose, arabinose e galactose. No processo da invenção, vantajosamente os açúcares glicose, galactose e arabinose são convertidos no produto de fermentação.
Qualquer composição de açúcar que preencha aqueles critérios pode ser usada na invenção. Em uma modalidade preferida, a composição de açúcar é um hidrolisado de um ou mais materiais lignocelulósicos. O termo “lignocelulose” aqui usado inclui hemicelulose e partes de hemicelulose de biomassa. Além disso, lignocelulose inclui frações lignocelulósicas de biomassa. Materiais lignocelulósicos adequados podem ser encontrados na seguinte lista: restos de pomares, chaparral, resíduos de moagem, resíduos urbanos de madeira, resíduos municipais, resíduos de corte de árvores, resíduos de florestas, talhadias de curta rotação, lixo industrial, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linhaça, cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, farelo de glúten de milho, cascas de aveia, cana de açúcar, forragem de milho, colmos de milho, espigas de milho, palha de milho, grama perene, miscanto, sorgo doce, caules de canola, caules de soja, grama do prado, gamagrass, capim rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de sementes, dejetos celulósicos de animais, recortes de gramados, algodão, erva marinha, árvores, madeiras moles, madeiras duras, álamo, pinheiro, arbustos, gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, palha de milho, sabugos de milho, caroço de milho, fibra de caroços, produtos e subprodutos da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos municipais sólidos, papel usado, resíduos de quintais, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos municipais sólidos, papel usado, polpa, resíduos de papel triturado, galhos, arbustos, canas, milho, palha de milho, uma plantações energéticas, florestas, uma fruta, uma flor, um grão, uma grama, uma safra herbácea, uma folha, casca, uma folha de pinheiro, uma lenha, uma raiz, uma muda, um arbusto, grama perene, uma árvore, um vegetal, casca de fruta, uma vinha, polpa de beterraba, triguilhos, cascas de aveia, madeira dura ou mole, dejetos de material orgânico gerado por um processo agrícola, resíduos florestais de madeira, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes.
Uma visão geral de algumas composições de açúcar adequadas derivadas de lignocelulose e da composição de açúcar de seus hidrolisados é apresentada na tabela 1. As lignoceluloses listadas incluem: espigas de milho, fibra de milho, cascas de arroz, cascas de melão, polpa de beterraba, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, madeira, grama e mostos de oliva.Tabela 1: Visão geral de composições de açúcar de materiais lignocelulósicos. Gal = galactose, Xyl = xilose, Ara = arabinose, Man = manose, Glu = glutamato, Rham = ramnose. A percentagem de galactose (% Gal) e a fonte literatura são fornecidas.
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Fica claro a partir da tabela 1 que, nessas lignoceluloses, uma quantidade considerável de açúcar (na média 3,8%) é galactose. A conversão de galactose no produto de fermentação é, dessa forma, de grande importância econômica.
A célula de açúcares mistos
A célula de açúcares mistos compreende os genes araA, araB e araD, como aqui definido posteriormente. Ela é capaz de fermentar glicose, arabinose e galactose. Em uma modalidade da invenção, a célula de açúcares mistos é capaz de fermentar um ou mais açúcares adicionais, preferivelmente açúcar C5 e/ou C6. Em uma modalidade da invenção, a célula de açúcares mistos compreende um ou mais de: um gene xylA e/ou um gene XKS1, para permitir que a célula de açúcares mistos fermente xilose; deleção do gene de aldose redutase (GRE3); superexpressão de genes da PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via de pentose fosfato na célula.
Em uma modalidade da invenção, a célula de açúcares mistos é capaz de fermentar um ou mais açúcares adicionais, preferivelmente açúcares C5 e/ou C6. Em uma modalidade da invenção, a célula de açúcares mistos compreende um ou mais de: um gene xylA, gene XYL1 e gene XYL2 e/ou gene XKS1, para permitir que a célula de açúcares mistos fermente xilose; deleção do gene de aldose redutase (GRE3); superexpressão de genes da PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via de pentose fosfato na célula.
Em uma modalidade, a célula de açúcares mistos é uma célula industrial, mais preferivelmente uma levedura industrial. Uma célula industrial e uma célula de levedura industrial podem ser definidas da forma seguinte. Os ambientes vivos de células (levedura) em processos industriais são significativamente diferentes daqueles no laboratório. Células de levedura industrial devem ser capazes de ter bom desempenho sob múltiplas condições ambientais que podem variar durante o processo. Essas variações incluem alteração nas fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio etc., as quais, juntas, possuem impacto potencial sobre o crescimento celular e produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae. Sob condições industriais adversas, as cepas ambientalmente tolerantes devem permitir crescimento e produção robustos. As cepas de levedura industrial são geralmente mais robustas em relação a essas alterações nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações nas quais são usadas, como, por exemplo, na indústria de panificação, indústria cervejeira, produção de vinhos e na indústria do etanol. Em uma modalidade, a célula industrial de açúcares mistos é construída com base em uma célula hospedeira industrial, em que a construção é realizada como aqui descrito posteriormente. Exemplos de levedura industrial (S. cerevisiae) são Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).
Em uma modalidade, a célula de açúcares mistos é tolerante ao inibidor. Tolerância ao inibidor é a resistência aos compostos inibidores. A presença e o nível de compostos inibidores na lignocelulose podem variar amplamente com variação da matéria-prima, método de pré- tratamento, processo de hidrólise. Exemplos de categorias de inibidores são ácidos carboxílicos, furanos e/ou compostos fenólicos. Exemplos de ácidos carboxílicos são ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico. Exemplos de furanos são furfural e hidróxi-metilfurfural. Exemplos de compostos fenólicos são vanilina, ácido siríngico, ácido ferúlico e ácido cumárico. As quantidades típicas de inibidores são: para ácidos carboxílicos, várias gramas por litro, até 20 gramas por litro ou mais, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise; para furanos, várias centenas de miligramas por litro até várias gramas por litro, dependendo da matéria- prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise; para fenólicos, várias dezenas de miligramas por litro, até um grama por litro, dependendo da matéria-prima, do pré- tratamento e das condições de hidrólise.
As cepas de açúcares mistos de acordo com a invenção são tolerantes ao inibidor, ou seja, elas podem suportar inibidores comuns no nível no qual elas tipicamente possuem com condições comuns de pré-tratamento e hidrólise, de tal forma que as cepas de açúcares mistos podem encontrar uma aplicação ampla, ou seja, elas possuem aplicabilidade elevada para diferentes matérias-primas, diferentes métodos de pré-tratamento e diferentes condições de hidrólise.
Em uma modalidade, a célula industrial de açúcares mistos é construída com base em uma célula hospedeira tolerante ao inibidor, em que a construção é realizada como aqui descrito posteriormente. Células hospedeiras tolerantes ao inibidor podem ser selecionadas por triagem de cepas quanto ao crescimento em materiais que contêm inibidores, como ilustrado em Kadar e cols., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, em que uma cepa de S. cerevisiae tolerante ao inibidor ATCC 26602 foi selecionada.
Em uma modalidade, a célula de açúcares mistos é livre de marcador. Como aqui usado, o termo “marcador” se refere a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção, ou a triagem, de uma célula hospedeira que contém o marcador. O termo “livre de marcador” significa que marcadores estão basicamente ausentes na célula de açúcar misto. Ser livre de marcador é particularmente vantajoso quando marcadores antibióticos foram usados na construção da célula de açúcares mistos e são removidos posteriormente. A remoção de marcadores pode ser feita com o uso de qualquer metodologia adequada técnica estabelecida, por exemplo, recombinação intramolecular. Um método adequado de remoção do marcador é ilustrado nos exemplos.
Uma célula de açúcares mistos pode ser capaz de converter biomassa de planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol, por exemplo, em açúcares fermentáveis. Conseqüentemente, uma célula de açúcares mistos pode expressar uma ou mais enzimas como, por exemplo, uma celulase (uma endocelulase ou uma exocelulase), uma hemicelulase (uma endo- ou exoxilanase ou arabinase) necessárias à conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glicurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter amido em monômeros de glicose.
A célula de açúcares mistos pode ainda compreender aquelas atividades enzimáticas necessárias à conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado como, por exemplo, etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina.
Em uma modalidade, a célula de açúcares mistos é uma célula que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula de açúcares mistos preferivelmente possui uma tolerância elevada ao etanol, uma tolerância elevada ao pH baixo (ou seja, capaz de crescimento em um pH mais baixo do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2,5) e contra ácidos orgânicos e/ou uma tolerância elevada às temperaturas elevadas.
Qualquer uma das características ou atividades de uma célula de açúcares mistos acima pode estar naturalmente presente na célula ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética.
Construção da cepa de açúcares mistos
Os genes podem ser introduzidos na célula de açúcares mistos por introdução em uma célula hospedeira: a) um agrupamento que consiste em genes da PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1, sob controle de promotores fortes, b) um agrupamento que consiste em um gene xylA e o gene XKS1, ambos sob controle de promotores constitutivos, c) um agrupamento que consiste nos genes araA, araB e araD e/ou um agrupamento do gene xylA e/ou o gene XKS1; e d) deleção de um gene de aldose redutase e evolução adaptativa para produzir a célula de açúcar misto. A célula acima pode ser construída usando técnicas de expressão recombinante.
Expressão recombinante
A célula da invenção é uma célula recombinante. Ou seja, uma célula da invenção compreende, ou é transformada com ou é modificada geneticamente com uma seqüência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula em questão.
Metodologias para a expressão recombinante de enzimas em uma célula, bem como para as modificações genéticas adicionais de uma célula da invenção, são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Tipicamente, essas técnicas envolvem a transformação de uma célula com uma construção de ácido nucléico que compreende a seqüência relevante. Esses métodos são conhecidos, por exemplo, por livros-textos padronizados como, por exemplo, Sambrook e Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a Edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel e cols., eds., “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing e Wiley Interscience, Nova York (1987). Métodos para transformação e modificação genética de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, por EP-A-0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO 90/14423, EP-A-0481008, EP-A- 0635574 e US 6.265.186.
Tipicamente, a construção de ácido nucléico pode ser um plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo de cópia baixa ou um plasmídeo de cópia elevada. A célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma única cópia ou múltiplas cópias da seqüência de nucleotídeos que codifica uma enzima, por exemplo, por múltiplas cópias de uma construção de nucleotídeo ou por uso da construção que possui múltiplas cópias da seqüência da enzima.
A construção de ácido nucléico pode ser mantida de forma epissômica e, dessa forma, compreender uma seqüência para replicação autônoma, por exemplo, uma seqüência de replicação autossômica. Uma construção de ácido nucléico epissômica adequada pode ser baseada, por exemplo, nos plasmídeos de levedura 2 μ ou pKD1 (Gleer e cols. , 1991, Biotechnology 9: 968-975), ou nos plasmídeos AMA (Fierro e cols., 1995, Curr. Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construção de ácido nucléico pode ser integrada em uma ou mais cópias no genoma da célula. A integração no genoma da célula pode ocorrer aleatoriamente por recombinação não homóloga, mas, preferivelmente, a construção de ácido nucléico pode ser integrada no genoma da célula por recombinação homóloga, como é bem conhecido na técnica (veja, por exemplo, WO 90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186).
A maioria dos plasmídeos epissômicos ou 2μ é relativamente instável, sendo perdidas aproximadamente 10-2 ou mais células após cada geração. Até mesmo sob condições de crescimento seletivo, apenas 60% a 95% das células retêm o plasmídeo epissômico. O número de cópia da maioria dos plasmídeos epissômicos varia de 10-40 por célula de hospedeiros cir+. No entanto, os plasmídeos não são distribuídos igualmente entre as células, e há uma grande variância no número de cópia por célula em populações. Cepas transformadas com plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, até mesmo na ausência de pressão seletiva. No entanto, a perda do plasmídeo pode ocorrer em freqüências de aproximadamente 10-3 a 10-4 por recombinação homóloga entre DNA repetido em tandem, levando à perda da espiral da seqüência do vetor. De preferência, o design do vetor, no caso de integração estável, é tal que, mediante perda dos genes de marcador de seleção (o que também ocorre por recombinação intramolecular, homóloga), aquela perda da espiral da construção integrada já não é mais possível. De preferência, os genes são, dessa forma, integrados estavelmente. O termo “integração estável” é aqui definido como integração no genoma, em que a perda da espiral da construção integrada já não é mais possível. De preferência, marcadores de seleção estão ausentes. Tipicamente, a seqüência que codifica a enzima será ligada operacionalmente a uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos, capazes de fornecer ou auxiliar a transcrição e/ou tradução da seqüência da enzima.
O termo “ligado operacionalmente” se refere a uma justaposição na qual os componentes descritos estão em um relacionamento que os permite funcionar da forma desejada. Por exemplo, quando um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora, o referido promotor ou intensificador afeta a transcrição da seqüência codificadora.
Como aqui usado, o termo “promotor” se refere a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados upstream com relação à direção de transcrição dos sítios de iniciação da transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA polimerase DNA- dependente, sítios de iniciação da transcrição e quaisquer outras seqüências de DNA conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Um promotor “constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor “indutível” é um promotor que é ativo sob regulação ambiental e de desenvolvimento.
O promotor que poderia ser usado para obter a expressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma enzima de acordo com a presente invenção pode não ser nativo para a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima a ser expressa, ou seja, um promotor que é heterólogo para a seqüência de nucleotídeos (seqüência codificadora) à qual está ligado operacionalmente. O promotor, no entanto, pode ser homólogo, ou seja, endógeno,para a célula hospedeira.
Promotores são amplamente disponíveis e conhecidos para aqueles habilitados na técnica. Exemplos adequados desses promotores incluem, por exemplo, promotores de genes glicolíticos, por exemplo, os promotores de fosfofrutoquinase (PFK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes sobre esses promotores de leveduras podem ser encontrados em WO 93/03159. Outros promotores úteis são promotores do gene que codifica proteína ribossômica, o promotor do gene de lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADH1, ADH4, e semelhantes) e o promotor de enolase (ENO). Outros promotores, tanto constitutivos quanto indutíveis, e intensificadores ou seqüências de ativação upstream, serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os promotores usados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Promotores adequados nesse contexto incluem promotores naturais tanto constitutivos quanto indutíveis, bem como promotores modificados geneticamente, que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Promotores adequados em células hospedeiras eucarióticas podem ser GAL7, GAL10 ou GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADG1, TRP1, URA3, LEU2,ENO1, TPI1 e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 e TDH3.
Em uma célula da invenção, a extremidade 3’ da seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima preferivelmente está ligada operacionalmente a uma seqüência terminadora da transcrição. De preferência, a seqüência terminadora é operacional em uma célula hospedeira de escolha como, por exemplo, a espécie de levedura de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é crucial; ele pode, por exemplo, ser de qualquer gene de levedura, embora terminadores possam algumas vezes funcionar se de um gene que não é de levedura, eucariótico. Normalmente, uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima compreende um terminador. De preferência, esses terminadores são combinados com mutações que evitam a degradação mediada por mRNA não senso na célula hospedeira da invenção (veja, por exemplo: Shirley e cols., 2002, Genetics 161: 1.465-1.482).
A seqüência de terminação da transcrição ainda compreende preferivelmente um sinal de poliadenilação.
Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente em uma construção de ácido nucléico adequada para uso na invenção. Como aqui usado, o termo “marcador” se refere a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem de uma célula hospedeira que contém o marcador. O gene marcador pode ser um gene de resistência antibiótica, pelo qual o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar as células transformadas entre as células que não são transformadas. Exemplos de marcadores de resistência antibiótica adequados incluem, por exemplo, diidrofolato redutase, higromicina-B- fosfotransferase, 3’-O-fosfotransferase II (resistência à canamicina, neomicina e G418). Marcadores de resistência antibiótica podem ser mais convenientes para a transformação de células hospedeiras diplóides. Além disso, marcadores que não são de resistência antibiótica podem ser usados como, por exemplo, marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) ou o gene TPI de S. pombe (descrito por Russell P.R., 1985, Gene 40: 125-130). Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras transformadas com as construções de ácido nucléico são livres de gene marcador. Métodos para a construção de células hospedeiras microbianas recombinantes livres de gene marcador são revelados em EP-A-O 635 574 e são baseados no uso de marcadores bidirecionais como, por exemplo, o gene amdS de A. nidulans (acetamidase) ou os genes de levedura URA3 e LYS2. Alternativamente, um marcador selecionável como, por exemplo, proteína fluorescente verde, lacL, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glucuronidase, pode ser incorporado nas construções de ácido nucléico da invenção, permitindo a seleção de células transformadas.
Elementos adicionais opcionais que podem estar presentes nas construções de ácido nucléico adequadas para uso na invenção incluem, sem limitação, uma ou mais seqüências líderes, intensificadores, fatores de integração e/ou genes repórteres, seqüências de íntron, centrômeros, telômeros e/ou seqüências de adesão à matriz (MAR). As construções de ácido nucléico da invenção podem ainda compreender uma seqüência para replicação autônoma, por exemplo, uma seqüência ARS.
O processo de recombinação pode, dessa forma, ser executado com técnicas de recombinação conhecidas. Vários meios são conhecidos por aqueles habilitados na técnica para expressão e superexpressão de enzimas em uma célula da invenção. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa por aumento do número de cópia do gene que codifica a enzima na célula hospedeira, por exemplo, por integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, por expressão do gene por um vetor de expressão epissômico multicópias ou por introdução de um vetor de expressão epissômico que compreende múltiplas cópias do gene.
Alternativamente, a superexpressão de enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser obtida por utilização de um promotor que não é nativo à seqüência que codifica a enzima a ser superexpressa, ou seja, um promotor que é heterólogo à seqüência codificadora à qual está ligado operacionalmente. Embora o promotor preferivelmente seja heterólogo à seqüência codificadora à qual está ligado operacionalmente, prefere-se também que o promotor seja homólogo, ou seja, endógeno à célula hospedeira. De preferência, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível do estado de equilíbrio maior do transcrito que compreende a seqüência codificadora (ou é capaz de produzir mais moléculas do transcrito, ou seja, moléculas de mRNA, por unidade de tempo) do que o promotor que é nativo à seqüência codificadora. Promotores adequados nesse contexto incluem promotores naturais tanto constitutivos quanto indutíveis, além de promotores modificados geneticamente.
Em uma modalidade, a célula de açúcares mistos é livre de marcador, o que significa que nenhum marcador auxotrófico ou dominante, em particular marcadores de resistência antibiótica, está presente no genoma ou extracromossomicamente.
A seqüência codificadora usada para superexpressão das enzimas mencionadas acima pode preferivelmente ser homóloga à célula hospedeira da invenção. No entanto, seqüências codificadoras que são heterólogas à célula hospedeira da invenção podem ser usadas.
A superexpressão de uma enzima, quando se refere à produção da enzima em uma célula modificada geneticamente, significa que a enzima é produzida em um nível de atividade enzimática específica maior, quando comparada com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Normalmente, isso significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou proteínas, no caso de enzimas de multi- subunidades) é produzida em quantidades maiores, ou então em um nível do estado de equilíbrio maior, quando comparada com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Similarmente, isso normalmente significa que o mRNA que codifica a proteína enzimaticamente ativa é produzido em quantidades maiores, ou então novamente em um nível do estado de equilíbrio maior, quando comparada com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. De preferência, em uma célula hospedeira da invenção, uma enzima a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, quando comparada com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto quanto à modificação genética que causa a superexpressão. Deve-se entender que esses níveis de superexpressão podem se aplicar ao nível do estado de equilíbrio da atividade da enzima, ao nível do estado de equilíbrio da proteína da enzima, bem como ao nível do estado de equilíbrio do transcrito que codifica a enzima.
Adaptação
Adaptação é um processo evolucionário pelo qual uma população se torna mais bem adequada (adaptada) ao seu habitat ou habitats. Esse processo ocorre ao longo de muitas gerações, e é um dos fenômenos básicos da biologia.
O termo adaptação também pode ser referir a uma característica que é especialmente importante para a sobrevida de um organismo. Essas adaptações são produzidas em uma população variável pelas formas mais bem adequadas que se reproduzem com mais sucesso, por seleção natural.
Mudanças nas condições ambientais alteram o resultado final da seleção natural, afetando os benefícios seletivos de adaptações subseqüentes que aumentam a adequabilidade de um organismo sob novas condições. No caso de uma mudança ambiental extrema, o aparecimento e a fixação de adaptações benéficas podem ser essenciais para a sobrevida. Um grande número de fatores diferentes como, por exemplo, disponibilidade de nutrientes, temperatura, a disponibilidade de oxigênio etc., pode conduzir a evolução adaptativa.
Adequabilidade
Há um relacionamento nítido entre adaptabilidade (o grau no qual um organismo é capaz de viver e reproduzir em certo conjunto de habitats) e adequabilidade. A adequabilidade é uma estimativa e um previsor da taxa de seleção natural. Pela aplicação da seleção natural, as freqüências relativas de fenótipos alternativos irão variar no tempo, caso sejam herdáveis.
Alterações genéticas
Quando a seleção natural atua sobre a variabilidade genética da população, as alterações genéticas são o mecanismo subjacente. Por esse meio, a população se adapta geneticamente às suas circunstâncias. As alterações genéticas podem resultar em estruturas visíveis, ou podem se ajustar à atividade fisiológica do organismo em uma forma que se adapta ao habitat alterado.
A evolução adaptativa
As células de açúcares mistos são, em sua preparação, submetidas à evolução adaptativa. Uma célula da invenção pode ser adaptada para a utilização de açúcar por seleção de mutantes, tanto espontânea quanto induzida (por exemplo, por radiação ou substâncias químicas), para crescimento no açúcar desejado, preferivelmente como a única fonte de carbono e, mais preferivelmente, sob condições anaeróbicas. A seleção de mutantes pode ser realizada por técnicas que incluem transferência serial de culturas como, por exemplo, descritas por Kuyper e cols. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655664) ou por cultivo sob pressão seletiva em uma cultura chemostat. Por exemplo, em uma célula hospedeira preferida da invenção, pelo menos uma das modificações genéticas descritas acima, incluindo modificações obtidas por seleção de mutantes, confere à célula hospedeira a habilidade para crescer na xilose como fonte de carbono, preferivelmente como a única fonte de carbono e, preferivelmente, sob condições anaeróbicas. De preferência, a célula basicamente não produz xilitol, por exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou, por exemplo, menos de cerca de 5, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5 ou cerca de 0,3% do carbono consumido em termos molares.
A evolução adaptativa também é descrita, por exemplo, em Wisselink H.W. e cols., Applied and Environmental Microbiology, Agosto de 2007, páginas 4.881-4.891.
Em uma modalidade de evolução adaptativa, é aplicado um regime que consiste em cultivo em batelada repetido com ciclos repetidos de crescimento consecutivo em meios diferentes, por exemplo, três meios com composições diferentes (glicose, xilose e arabinose; xilose e arabinose). Veja Wisselink e cols. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Fevereiro de 2009, páginas 907914.
Transformação e estabilidade genética de leveduras
A engenharia genética, ou seja, a transformação de células de levedura com DNA recombinante, tornou-se factível pela primeira vez em 1978 [Beggs, 1978; Hinnen e cols., 1978]. A tecnologia de DNA recombinante em leveduras se estabeleceu desde então. Uma diversidade de construções de vetor diferentes está disponível. Geralmente, esses vetores de plasmídeo, denominados vetores shuttle, contêm material genético derivado de vetores de E. coli que consistem em uma origem de replicação e um marcador selecionável (freqüentemente o gene de β-lactamase, ampR), o que os permite ser propagado em E. coli antes da transformação em células de levedura. Adicionalmente, os vetores shuttle contêm um marcador selecionável para seleção em leveduras. Marcadores podem ser genes que codificam enzimas para a síntese de um aminoácido ou nucleotídeo em particular, de tal forma que as células que carregam a deleção (ou mutação) genômica correspondente sejam complementadas para auxotrofia ou autotrofia. Alternativamente, esses vetores contêm marcadores de resistência heterólogos dominantes, o que fornece resistência às células recombinantes de levedura (ou seja, as células que recolheram o DNA e expressam o marcador gene) contra certos antibióticos, como g418 (geneticina), higromicina B ou fleomicina. Além disso, esses vetores podem conter uma seqüência de sítios de restrição (combinados) (sítio múltiplo de clonagem ou MCS) que permitirão a clonagem de DNA estranho nesses sítios, embora também existam métodos alternativos.
Tradicionalmente, quatro tipos de vetores shuttle podem ser distinguidos pela ausência ou presença de elementos genéticos adicionais: - Plasmídeos integrativos (Ylp) que, por recombinação homóloga, são integrados no genoma do hospedeiro no lócus do marcador ou outro gene, quando este é aberto por restrição e o DNA linearizado é usado para transformação das células de levedura. Isso geralmente resulta na presença de uma cópia do DNA estranho inserido nesse sítio em particular no genoma. - Plasmídeos epissômicos (YEp), que carregam parte da seqüência do DNA de plasmídeo 2 μ necessária para replicação autônoma em células de levedura. Múltiplas cópias do plasmídeo transformado são propagadas na célula de levedura e mantidas como epissomos. - Plasmídeos que se replicam autonomamente (YRp), que carregam uma origem de replicação de levedura (ARS, seqüência replicada autonomamente) que permite que os plasmídeos transformados sejam propagados várias centenas de vezes. - Plasmídeos CEN (YCp), que carregam, além de uma seqüência ARS, uma seqüência centromérica (derivada de um dos cromossomos nucleares), o que normalmente garante segregação mitótica estável e normalmente reduz o número de cópia de plasmídeo auto-replicado a apenas uma.
Esses plasmídeos estão sendo introduzidos nas células de levedura por transformação. A transformação de células de levedura pode ser obtida por várias técnicas diferentes, por exemplo, permeabilização de células com acetato de lítio (Ito e cols., 1983) e métodos de eletroporação.
Na aplicação comercial de microorganismos recombinantes, a instabilidade do plasmídeo é o problema mais importante. A instabilidade é a tendência das células transformadas para perder suas propriedades criadas geneticamente de alterações para, ou perda de, plasmídeos.
Essa questão é discutida em detalhe por Zhang e cols. (“Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae”. Biotechnology Advances, Vol. 14, N° 4, páginas 401-435, 1996). As cepas transformadas com plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, até mesmo na ausência de pressão seletiva (Sherman, F. http:/dbb.urmcrochester.edu/labs/sherinan_f/yeast19.html e referências citadas).
O DNA heterólogo é normalmente introduzido no organismo na forma de plasmídeos extracromossômicos (YEp, YCp e YRp). Infelizmente, verificou-se, tanto com bactérias quanto com leveduras, que as novas características podem não ser retidas, especialmente se a pressão de seleção não for aplicada continuamente. Isso é causado pela instabilidade segregacional do plasmídeo híbrido quando as células recombinantes crescem por um período de tempo longo. Isso leva à heterogeneidade da população e variabilidade clonal, e eventualmente a uma população de células na qual a maioria das células perdeu as propriedades que foram introduzidas por transformação. Se vetores com marcadores auxotróficos estão sendo usados, o cultivo em meios ricos freqüentemente leva à perda rápida do vetor, na medida em que o vetor só é retido em meios mínimos. A alternativa, o uso de marcadores de resistência antibiótica dominantes, freqüentemente não é compatível com os processos de produção. O uso de antibióticos pode não ser desejado do ponto de vista do registro (a possibilidade de que quantidades mínimas do antibiótico terminem no produto final) ou por razões econômicas (custos do uso de antibióticos em escala industrial).
A perda de vetores leva a problemas em situações de produção em larga escala. Métodos alternativos para a introdução de DNA existem para leveduras, por exemplo, o uso de plasmídeos de integração (Ylp). O DNA é integrado no genoma do hospedeiro por recombinação, resultando em estabilidade elevada (Caunt, P. “Stability of recombinant plasmids in yeast”. Journal of Biotechnology 9(1988) 173192). Verificamos que um método de integração que utiliza os transposons do hospedeiro é uma boa alternativa.
Transposons
Em uma modalidade da invenção, a célula pode compreender mais de uma cópia de gene(s) desejado(s). Por exemplo, dois ou mais genes de xilose isomerase ou genes de xilose redutase e genes de xilitol desidrogenase podem ser integrados no genoma da célula de açúcares mistos. Isso pode ser executado por qualquer forma conhecida na técnica que leve à introdução dos genes. Em uma modalidade preferida, isso pode ser obtido por utilização de um vetor com partes homólogas às seqüências repetidas (transposons), da célula hospedeira. Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura, seqüências repetidas adequadas são as repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecido como seqüência delta.
Os elementos Ty se enquadram em duas subfamílias bem similares denominadas Ty1 e Ty2. Esses elementos possuem cerca de 6 quilobases (kb) de comprimento e são delimitados por repetições terminais longas (LTR), seqüências de cerca de 335 pares de bases (Boeke J.D. e cols., “The
Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfuncional Copies of Transposon Ty1”. Molecular and Cellular Biology, Abril de 1988, páginas 1.432-1.442 Vol. 8, No. 4). Na cepa de S. cerevisiae totalmente seqüenciada, S288c, os transposons mais abundantes são Ty1 (31 cópias) e Ty2 (13 cópias) (Gabriel A., Dapprich J., Kunkel M., Gresham D., Pratt S.C., e cols. (2006) “Global mapping oftransposon localization”. PLoS Genet. 2(12):e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Esses transposons consistem em dois quadros de leitura aberta (ORFS) superpostos, cada um dos quais codificando várias proteínas. As regiões codificadoras são flanqueadas pelas LTRs quase idênticas mencionadas anteriormente. Outros elementos Ty mais distintos, mas menos abundantes, em S. cerevisiae compreendem Ty3, Ty4 e Ty5. Para cada família de elementos Ty de comprimento total, há uma ordem de magnitude de mais elementos LTR isolados dispersos pelo genoma. Acredita-se que estas surgem por recombinação LTR-LTR de elementos de comprimento total, com perda da espiral das regiões que codificam a proteína interna.
O mecanismo de retrotransposição do retrotransposon Ty foi explorado para integrar múltiplas cópias pelo genoma (Boeke e cols., 1988; Jacobs e cols., 1988). As repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecidas como seqüências delta, também são bons alvos para integração por recombinação homóloga, na medida em que existe em cerca de 150-200 cópias que são sítios associados ao Ty ou sítios isolados (Boeke, 1989; Kingsman e Kingsman, 1988) (Parekh R.N. (1996), “An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae”. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 1621).
A célula hospedeira
A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira adequada à produção de um produto útil. Uma célula da invenção pode ser qualquer célula adequada, por exemplo, uma célula procariótica, por exemplo, uma bactéria, ou uma célula eucariótica. Tipicamente, a célula será uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso.
Leveduras são aqui definidas como microorganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, Em: “Introductory Mycology”, John Wiley & Sons, Inc., Nova York) que crescem predominantemente em forma unicelular.
Leveduras podem crescer por brotamento de um talo unicelular ou podem crescer por fissão do organismo. Uma levedura preferida como uma célula da invenção pode pertencer aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. De preferência, a levedura é aquela capaz de fermentação anaeróbica ou com oxigênio limitado, mais preferivelmente aquela capaz de fermentação alcoólica anaeróbica.
Fungos filamentosos são aqui definidos como microorganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Esses fungos são caracterizadas por um micélio vegetativo composto por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos adequados para uso como uma célula da presente invenção são distintos morfologicamente, fisiologicamente e geneticamente de leveduras. Células fúngicas filamentosas podem ser vantajosamente usadas, já que a maioria dos fungos não necessita de condições estéreis para propagação e é insensível às infecções por bacteriófago. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é por alongamento de hifa e o catabolismo de carbono da maioria dos fungos filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Fungos filamentosos preferidos como uma célula hospedeira da invenção podem pertencer ao gênero Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium ou Penicillium. Mais preferivelmente, a célula fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, de Penicillium chrysogenum ou Rhizopus oryzae.
Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser levedura.
De preferência, o hospedeiro é um hospedeiro industrial, mais preferivelmente uma levedura industrial. Um hospedeiro industrial e uma célula de levedura industrial serão definidos a seguir. Os ambientes vivos de células de levedura em processos industriais são significativamente diferentes daquele no laboratório. Células de levedura industrial devem ser capazes de ter bom desempenho sob múltiplas condições ambientais que podem variar durante o processo. Essas variações incluem alteração nas fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio etc., as quais, juntas, possuem impacto potencial sobre o crescimento celular e a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae. Sob condições industriais adversas, as cepas ambientalmente tolerantes devem permitir crescimento e produção robustos. As cepas de levedura industrial são geralmente mais robustas em relação a essas alterações nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações nas quais são usadas como, por exemplo, na indústria de panificação, indústria cervejeira, produção de vinhos e na indústria do etanol. Exemplos de levedura industrial (S. cerevisiae) são Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).
Em uma modalidade, o hospedeiro é tolerante ao inibidor. Células hospedeiras tolerantes ao inibidor podem ser selecionadas por avaliação de cepas quanto ao crescimento em materiais que contêm inibidores, como ilustrado em Kadar e cols., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, em que uma cepa de S. cerevisiae tolerante ao inibidor ATCC 26602 foi selecionada. De preferência, a célula hospedeira é industrial e tolerante ao inibidor.
Genes AraA, AraB e AraD
Uma célula da invenção é capaz de usar arabinose. Uma célula da invenção é, portanto, capaz de converter L- arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, um daqueles aqui mencionados.
Organismos, por exemplo, cepas de S. cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos por modificação de uma célula que introduz os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L- ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Esses genes podem ser introduzidos em uma célula da invenção a fim de que sejam capazes de usar arabinose. Uma abordagem desse tipo é apresentada e descrita em WO 2003/095627. Genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados em WO 2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são revelados em EP1499708. Em outra modalidade, genes araA, araB e araD podem ser derivados de pelo menos um dos gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e/ou Gramella forsetii, como revelado em WO 2009011591.
Genes da PPP
Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato. Em particular, a modificação genética (ou modificações genéticas) pode levar a um fluxo aumentado através da parte não oxidativa da via de pentose fosfato. Uma modificação genética que causa um fluxo aumentado da parte não oxidativa da via de pentose fosfato é aqui subentendida como significando uma modificação que aumenta o fluxo por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, quando comparado com o fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto quanto à modificação genética que causa o fluxo aumentado. O fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato pode ser medido por crescimento do hospedeiro modificado em xilose como a única fonte de carbono, determinação da taxa de consumo específico de xilose e subtração da taxa de produção específica de xilitol da taxa de consumo específico de xilose, se algum xilitol é produzido. No entanto, o fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato é proporcional à taxa de crescimento com xilose como a única fonte de carbono, preferivelmente com a taxa de crescimento anaeróbico com xilose como a única fonte de carbono. Há uma relação linear entre a taxa de crescimento com xilose como a única fonte de carbono (μmax) e o fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato. A taxa de consumo específico de xilose (QS) é igual à taxa de crescimento (μ) dividida pelo rendimento de biomassa em açúcar (YXS), pois o rendimento de biomassa em açúcar é constante (sob certo conjunto de condições: anaeróbicas, meio de crescimento, pH, base genética da cepa etc.; ou seja, QS = μ/YXS). Portanto, o fluxo aumentado da parte não oxidativa da via de pentose fosfato pode ser deduzido a partir do aumento na taxa de crescimento máxima sob essas condições, salvo transporte (a captação é limitante).
Uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de várias formas. Estas incluem, por exemplo, a obtenção de níveis maiores de atividade no estado de equilíbrio de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não oxidativa da via de pentose fosfato e/ou um nível reduzido de atividade de aldose redutase não específica do estado de equilíbrio. Essas alterações nos níveis de atividade no estado de equilíbrio podem ser efetuadas por seleção de mutantes (espontâneos ou induzidos por substâncias químicas ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente, de genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam esses genes.
Em uma célula hospedeira preferida, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo menos uma enzima (parte não oxidativa) da via de pentose fosfato. De preferência, a enzima é selecionada do grupo que consiste nas enzimas que codificam ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Várias combinações de enzimas (parte não oxidativa) da via de pentose fosfato podem ser superexpressas. Por exemplo, as enzimas que são superexpressas podem ser pelo menos as enzimas ribulose-5- fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose 5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase. Em uma modalidade da invenção, cada uma das enzimas ribulose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase é superexpressa na célula hospedeira. É mais preferida uma célula hospedeira na qual a modificação genética compreende pelo menos superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase, já que, dessa forma, uma célula hospedeira já é capaz de crescimento anaeróbico em xilose. Na verdade, sob algumas condições, células hospedeiras que superexpressam apenas a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbico em xilose que a das células hospedeiras que superexpressam todas as quatro enzimas, ou seja, a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Além disso, células hospedeiras que superexpressam ambas as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas em relação às células hospedeiras que superexpressam apenas a isomerase ou apenas a epimerase, já que a superexpressão de apenas uma dessas enzimas pode produzir desequilíbrios metabólicos.
A enzima “ribulose 5-fosfato epimerase” (EC 5.1.3.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a epimerização de D-xilulose 5-fosfato em D-ribulose 5-fosfato e vice- versa. A enzima também é conhecida como fosforribulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose 3-epimerase; xilulose fosfato 3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; ribulose 5-fosfato 3-epimerase; D-ribulose fosfato-3-epimerase; D-ribulose 5-fosfato epimerase; D- ribulose-5-P 3-epimerase; D-xilulose-5-fosfato 3-epimerase; pentose-5-fosfato 3-epimerase; ou D-ribulose-5-fosfato 3- epimerase. Uma ribulose 5-fosfato epimerase pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma ribulose 5-fosfato epimerase pode ser definida por uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica a ribulose 5-fosfato epimerase. A seqüência de nucleotídeos que codifica ribulose 5-fosfato epimerase é aqui designada RPE1.
A enzima “ribulose 5-fosfato isomerase” (EC 5.3.1.6) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-ribose 5-fosfato em D-ribulose 5-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosfopentosisomerase; fosforriboisomerase; ribose fosfato isomerase; 5-fosforibose isomerase; D-ribose 5-fosfato isomerase; D-ribose-5-fosfato cetol-isomerase; ou D-ribose- 5-fosfato aldose-cetose-isomerase. Uma ribulose 5-fosfato isomerase pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma ribulose 5-fosfato isomerase pode ser definida por uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica uma ribulose 5- fosfato isomerase. A seqüência de nucleotídeos que codifica ribulose 5-fosfato isomerase é aqui designada RKI1.
A enzima “transcetolase” (EC 2.2.1.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: D-ribose 5-fosfato + D-xilulose 5-fosfato <-> sedoheptulose 7-fosfato + D- gliceraldeído 3-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como glicolaldeídotransferase ou sedoheptulose-7- fosfato:D-gliceraldeído-3-fosfato glicolaldeídotransferase. Uma transcetolase pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma transcetolase pode ser definida por uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica uma transcetolase. A seqüência de nucleotídeos que codifica transcetolase é aqui designada TKL1.
A enzima “transaldolase” (EC 2.2.1.2) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: sedoheptulose 7- fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato <-> D-eritrose 4- fosfato + D-frutose 6-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como diidroxiacetonatransferase; diidroxiacetona sintase; formaldeído transcetolase; ou sedoheptulose-7-fosfato; D-gliceraldeído-3-fosfato gliceronetransferase. Uma transaldolase pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma transaldolase pode ser definida por uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica uma transaldolase. A seqüência de nucleotídeos que codifica transcetolase é aqui designada TAL1.
Genes de xilose isomerase ou xilose redutase e xilitol desidrogenase
De acordo com a invenção, uma, duas ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase e/ou um ou mais genes de xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidos no genoma da célula hospedeira. A presença desses dois ou mais elementos genéticos confere à célula a habilidade para converter xilose por isomerização ou redução.
Em uma modalidade, uma, duas ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase são introduzidas no genoma da célula hospedeira.
Uma “xilose isomerase” (EC 5.3.1.5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D- xilose em D-xilulose e/ou vice-versa. A enzima também é conhecida como a D-xilose cetoisomerase. Uma xilose isomerase nesta especificação também pode ser capaz de catalisar a conversão entre D-glicose e D-frutose (e, conseqüentemente, pode, portanto, ser denominada uma glicose isomerase). Uma xilose isomerase nesta especificação pode necessitar de um cátion bivalente, por exemplo, magnésio, manganês ou cobalto como co-fator.
Conseqüentemente, uma célula de açúcares mistos desse tipo é capaz de isomerizar xilose em xilulose. A habilidade de isomerização de xilose em xilulose é conferida à célula hospedeira por transformação da célula hospedeira com uma construção de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase definida. Uma célula de açúcares mistos isomeriza xilose em xilulose pela isomerização direta de xilose em xilulose.
Uma unidade (U) de atividade de xilose isomerase pode aqui ser definida como a quantidade de enzima que produz 1 nmol de xilulose por minuto, sob condições como descritas por Kuyper e cols. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78). O gene de xilose isomerase pode ter várias origens como, por exemplo, Pyromyces sp., como revelado em WO 2006/009434. Outras origens adequadas são Bacteroides, em particular Bacteroides uniformis, como descrito em PCT/EP2009/52623, Bacillus, em particular Bacillus stearothermophilus, como descrito em PCT/EP2009/052625.
Em outra modalidade, as duas ou mais cópias de um ou mais genes de xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidas no genoma da célula hospedeira. Nessa modalidade, a conversão de xilose é realizada em uma conversão em duas etapas de xilose em xilulose por meio de um intermediário de xilitol, catalisada por xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente. Em uma modalidade, xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH) e xiloquinase (XK) podem ser superexpressas e, opcionalmente, um ou mais dos genes que codificam enzimas que produzem NADPH são supra-regulados e um ou mais dos genes que codificam enzimas que consumem NADH são supra- regulados, como revelado em WO 2004085627.
Gene de XKS1
Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica. De preferência, a modificação ou modificações genéticas causam superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo, por superexpressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma xilulose quinase. O gene que codifica a xilulose quinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à célula hospedeira. Uma seqüência de nucleotídeos usada para superexpressão de xilulose quinase na célula hospedeira da invenção é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilulose quinase.
A enzima “xilulose quinase” (EC 2.7.1.17) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação ATP + D- xilulose = ADP + D-xilulose 5-fosfato. A enzima também é conhecida como a xiluloquinase de fosforilação, D- xiluloquinase ou ATP:D- xilulose 5-fosfotransferase. Uma xilulose quinase da invenção pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma xilulose quinase pode ser definida por uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica uma xilulose quinase.
Em uma célula da invenção, uma modificação ou modificações genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica podem ser combinadas com qualquer uma das modificações que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato, como descrito acima. Isso, no entanto, não é essencial.
Dessa forma, uma célula hospedeira da invenção pode compreender apenas uma modificação ou modificações genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica. Os vários meios disponíveis na técnica para obtenção e análise da superexpressão de uma xilulose quinase nas células hospedeiras da invenção são os mesmos descritos acima para enzimas da via de pentose fosfato. De preferência, nas células hospedeiras da invenção, uma xilulose quinase a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, quando comparada com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto quanto à modificação genética (ou modificações genéticas) que causa a superexpressão. Deve-se entender que esses níveis de superexpressão podem se aplicar ao nível do estado de equilíbrio da atividade da enzima, ao nível do estado de equilíbrio da proteína da enzima, bem como ao nível do estado de equilíbrio do transcrito que codifica a enzima.
Deleção do gene de aldose redutase (GRE3)
Na modalidade na qual XI é usado como gene para converter xilose, pode ser vantajoso reduzir a atividade de aldose redutase. Uma célula da invenção pode, portanto, compreender uma ou mais modificações genéticas que reduzem a atividade de aldose redutase não específica na célula hospedeira. De preferência, a atividade de aldose redutase não específica é reduzida na célula hospedeira por uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão ou que inativam um gene que codifica uma aldose redutase não específica. De preferência, a modificação genética (ou modificações genéticas) reduz ou inativa a expressão de cada cópia endógena de um gene que codifica uma aldose redutase não específica na célula hospedeira (aqui denominada deleção de GRE3). As células hospedeiras podem compreender múltiplas cópias de genes que codificam aldose redutase não específica como resultado de di-, poli- ou aneuploidia e/ou a célula hospedeira pode conter várias (iso)enzimas diferentes com atividade de aldose redutase que diferem em termos de seqüência de aminoácidos e que são, cada uma, codificadas por um gene diferente. Além disso, nesses casos, preferivelmente a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase não específica é reduzida ou inativada. De preferência, o gene é inativado por deleção de pelo menos parte do gene ou por uma ruptura do gene, em que, nesse contexto, o termo gene também inclui qualquer seqüência não codificadora upstream ou downstream da seqüência codificadora, a deleção ou inativação (parcial), a qual resulta em uma redução da expressão de atividade de aldose redutase não específica na célula hospedeira.
Uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma aldose redutase cuja atividade deve ser reduzida na célula hospedeira da invenção é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de aldose redutase.
Dessa forma, uma célula hospedeira da invenção que compreende apenas uma modificação ou modificações genéticas que reduzem a atividade de aldose redutase não específica na célula hospedeira está especificamente incluída na invenção.
A enzima “aldose redutase” (EC 1.1.1.21) é aqui definida como qualquer enzima que é capaz de reduzir xilose ou xilulose em xilitol. No contexto da presente invenção, uma aldose redutase pode ser qualquer aldose redutase não específica que seja nativa (endógena) a uma célula hospedeira da invenção e que é capaz de reduzir xilose ou xilulose em xilitol. Aldose redutases não específicas catalisam a reação: aldose + NAD(P)H + H+ θ alditol + NAD(P) +
A enzima possui uma ampla especificidade e é também conhecida como aldose redutase; poliol desidrogenase (NADP+); alditol:NADP oxidorredutase; alditol:NADP+ 1- oxidorredutase; NADPH-aldopentose redutase; ou NADPH-aldose redutase.
Um exemplo particular de uma aldose redutase não específica desse tipo é endógena a S. cerevisiae e é codificada pelo gene GRE3 (Traff e cols., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5.668-74). Dessa forma, uma aldose redutase da invenção pode ainda ser definida por sua seqüência de aminoácidos. Da mesma forma, uma aldose redutase pode ser definida pelas seqüências de nucleotídeos que codificam a enzima, bem como por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para uma seqüência de nucleotídeos de referência que codifica uma aldose redutase.
Identidade de seqüência
A identidade de seqüência (ou similaridade de seqüência) é aqui definida como um relacionamento entre duas ou mais seqüências de aminoácidos (polipeptídeos ou proteínas) ou duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos (polinucleotídeos), como determinada por comparação das seqüências. Normalmente, identidades ou similaridades de seqüência são comparadas, tipicamente ao longo de todo o comprimento das seqüências comparadas. No entanto, seqüências podem ser comparadas ao longo de janelas de comparação mais curtas. Na técnica, “identidade” também significa o grau de afinidade de seqüência entre seqüências de aminoácidos ou de ácidos nucléicos, dependendo do caso, como determinado pela combinação entre trechos dessas seqüências.
Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para gerar a maior combinação entre as seqüências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Métodos de programas computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, por exemplo, os programas BestFit, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S.F. e cols., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), disponíveis publicamente por NCBI e outras fontes (“BLAST Manual”, Altschul, S., e cols., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Os parâmetros preferidos para comparação de seqüências de aminoácidos com o uso de BLASTP são abertura da lacuna (gap) de 11.0, extensão de lacuna de 1, matriz Blossum 62. Parâmetros preferidos para comparação de seqüências de ácidos nucléicos usando BLASTP são abertura de lacuna de 11.0, extensão de lacuna de 1, matriz completa de DNA (matriz de identidade de DNA).
Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácidos, aqueles habilitados na técnica também podem levar em conta as denominadas substituições “conservadoras” de aminoácidos, como ficará evidente para aqueles habilitados na técnica.
Substituições de aminoácidos conservadoras se referem à permutabilidade de resíduos que possuem cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais alifáticas-hidroxil é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais que contêm amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais que contêm enxofre é cisteína e metionina.
Grupos de substituições de aminoácidos conservadoras preferidas são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina- glutamina. Variantes de substituição da seqüência de aminoácidos aqui reveladas são aquelas nas quais pelo menos um resíduo nas seqüências reveladas foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. De preferência, a alteração de aminoácido é conservadora. Substituições conservadoras preferidas para cada um dos aminoácidos de ocorrência natural são as seguintes: Ala por ser; Arg por lys; Asn por gln ou his; Asp por glu; Cys por ser ou ala; Gln por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn ou gln; He por leu ou val; Leu por ile ou val; Lys por arg; gln ou glu; Met por leu ou ile; Phe por met, leu ou tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp ou phe; e Val por ile ou leu.
Condições rigorosas de hibridização são aqui definidas como condições que permitem que uma seqüência de ácidos nucléicos de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100, e mais preferivelmente ainda, de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize em uma temperatura de cerca de 65°C em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) ou qualquer outra solução que possua uma força iônica comparável, e lavagem a 65°C em uma solução que compreende cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução que possua uma força iônica comparável. De preferência, a hibridização é realizada de um dia para o outro, ou seja, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Essas condições normalmente permitirão a hibridização específica de seqüências que possuem cerca de 90% ou mais de identidade de seqüência.
Condições moderadas são aqui definidas como condições que permitem que uma seqüência de ácidos nucléicos de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize em uma temperatura de cerca de 45°C em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução que possua uma força iônica comparável, e lavagem em temperatura ambiente em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução que possua uma força iônica comparável. De preferência, a hibridização é realizada de um dia para o outro, ou seja, pelo menos por 10 horas e, preferivelmente, lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Essas condições normalmente permitirão a hibridização específica de seqüências que possuem até 50% de identidade de seqüência. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de modificar essas condições de hibridização a fim de identificar especificamente seqüências que variam em termos de identidade entre 50% e 90%.
Para aumentar a probabilidade de que a enzima introduzida se expresse em forma ativa em uma célula da invenção, a seqüência de nucleotídeos codificadora correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso de códons com aquele da célula de levedura escolhida. Vários métodos para otimização de códons são conhecidos na técnica. Um método preferido para otimizar o uso de códons das seqüências de nucleotídeos àquele da levedura é uma tecnologia de otimização de par de códons, como revelado em WO 2006/077258 e/ou WO 2008/000632. WO 2008/000632 aborda uma otimização de par de códons. A otimização de par de códons é um método em que as seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo são modificadas com relação ao seu uso de códons, em particular os pares de códons que são usados, para obter uma expressão aprimorada da seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo e/ou a produção aumentada do polipeptídeo codificado. Os pares de códons são definidos como um conjunto de dois tripletos subseqüentes (códons) em uma seqüência codificadora.
Como uma medida simples para a expressão gênica e eficiência de tradução, aqui, o Índice de Adaptação de Códons (CAI), como descrito em Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics 2007: 3 53-58, é usado. O índice usa um conjunto de referência de genes altamente expressos de uma espécie para avaliar os méritos relativos de cada códon, e uma pontuação para um gene é calculada a partir da freqüência de uso de todos os códons naquele gene. O índice avalia a extensão à qual a seleção foi eficaz na moldagem do padrão de uso de códons. Em relação a isso, é útil prever o nível de expressão de um gene, para avaliação da adaptação de genes virais aos seus hospedeiros, e para produção de comparações de uso de códons em organismos diferentes. O índice também pode gerar uma indicação aproximada do sucesso provável da expressão do gene heterólogo. Nos genes com pares de códons otimizados de acordo com a invenção, o CAI é de 0,6 ou mais, 0,7 ou mais, 0,8 ou mais, 0,85 ou mais, 0,87 ou mais, 0,90 ou mais, 0,95 ou mais, ou cerca de 1,0.
Uma célula da invenção é, dessa forma, uma célula que compreende, ou seja, foi transformada com, uma construção de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica os genes araA, araB e araD, como definido acima. A construção de ácido nucléico que compreende a seqüência codificadora de araA preferivelmente é capaz de expressão dos genes araA na célula hospedeira.
De preferência, os genes são expressos no citosol. A expressão citosólica pode ser obtida por deleção ou modificação de um sinal de direcionamento mitocondrial ou peroxissomal.
Produção de bioprodutos
Ao longo dos anos, foram feitas sugestões para a introdução de vários organismos para a produção de bioetanol a partir de açúcares cultivados. Na prática, no entanto, todos os processos principais de bioprodução de etanol continuaram a utilizar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtoras de etanol. Isso é devido às muitas características atrativas da espécie Saccharomyces para processos industriais, ou seja, uma capacidade de tolerância osmótica, ao ácido e ao etanol elevadas, capacidade de crescimento anaeróbico e, evidentemente, sua alta capacidade fermentativa alcoólica. Espécies de leveduras preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis.
Uma célula da invenção pode ser capaz de converter biomassa de planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol, por exemplo, em açúcares fermentáveis. Conseqüentemente, uma célula da invenção pode expressar uma ou mais enzimas como, por exemplo, uma celulase (uma endocelulase ou uma exocelulase), uma hemicelulase (uma endo- ou exoxilanase ou arabinase) necessárias à conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glicurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter amido em monômeros de glicose.
A célula preferivelmente ainda compreende aquelas atividades enzimáticas necessárias à conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado como, por exemplo, etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, uma aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina.
Uma célula da invenção preferida é uma célula que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula da invenção preferivelmente possui uma tolerância elevada ao etanol, uma tolerância elevada ao pH baixo (ou seja, capaz de crescimento em um pH mais baixo do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, ou cerca de 2,5) e contra ácidos orgânicos como ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico e/ou produtos da degradação de açúcar como, por exemplo, furfural e hidróxi-metilfurfural e/ou uma tolerância elevada às temperaturas elevadas.
Qualquer uma das características ou atividades acima de uma célula da invenção pode estar naturalmente presente na célula ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética.
Uma célula da invenção pode ser uma célula adequada à produção de etanol. Uma célula da invenção, no entanto, pode ser adequada à produção de produtos de fermentação diferentes de etanol. Esses produtos de fermentação não etanólicos incluem, em princípio, qualquer substância química volumosa ou fina que seja produzível por um microorganismo eucariótico como, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso.
Esses produtos de fermentação podem ser, por exemplo, butanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina. Uma célula da invenção preferida para produção de produtos de fermentação não etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que resulta em atividade diminuída de álcool desidrogenase.
Em um aspecto adicional, a invenção está relacionada aos processos de fermentação nos quais as células da invenção são usadas para a fermentação de uma fonte de carbono que compreende uma fonte de xilose, por exemplo, xilose. Além de uma fonte de xilose, a fonte de carbono no meio de fermentação também pode compreender uma fonte de glicose. A fonte de xilose ou glicose pode ser xilose ou glicose, ou pode ser qualquer polímero ou óligo de carboidrato que compreende unidades de xilose ou glicose como, por exemplo, lignocelulose, xilanas, celulose, amido, e semelhantes. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose por esses carboidratos, carboidrases apropriadas (como, por exemplo, xilanases, glucanases, amilases, e semelhantes) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula. Nesse último caso, a célula pode ser modificada geneticamente para produzir e excretar essas carboidrases. Uma vantagem adicional da utilização de fontes oligoméricas ou poliméricas de glicose é que ela permite manter uma concentração mais baixa de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, por utilização de quantidades limitantes da taxa das carboidrases. Isso, por sua vez, evitará a repressão de sistemas necessários ao metabolismo e transporte de açúcares não-glicose como, por exemplo, xilose.
Em um processo preferido, a célula fermenta tanto xilose quanto glicose, de preferência simultaneamente, quando então preferivelmente é usada uma célula que é insensível à repressão de glicose para evitar o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá o ingrediente apropriado necessário ao crescimento da célula. Composições de meios de fermentação para o crescimento de microorganismos como, por exemplo, leveduras, são bem conhecidas na técnica. O processo de fermentação é um processo para a produção de um produto de fermentação como, por exemplo, etanol, butanol, ácido lático, ácido 3- hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico de β-lactama, por exemplo, penicilina G ou penicilina V, e derivados fermentativos destes, e uma cefalosporina.
Lignocelulose
Lignocelulose, que pode ser considerada como uma matéria-prima renovável potencial, geralmente compreende os polissacarídeos celulose (glucanos) e hemiceluloses (xilanas, heteroxilanas e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente como glicomananas, por exemplo, em matérias-primas derivadas de madeiras. A hidrólise enzimática desses polissacarídeos em açúcares solúveis, incluindo tanto monômeros quanto multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glicurônico e outras hexoses e pentoses, ocorre sob a ação de diferentes enzimas que atuam coordenadamente.
Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas como, por exemplo, arabinanas, podem constituir uma proporção considerável da massa seca de paredes celulares tipicamente de tecidos de plantas não lenhosas (cerca de um quarto da massa seca pode ser de pectinas).
Pré-tratamento
O pré-tratamento pode ser desejável para liberar açúcares que podem ser fermentados de acordo com a invenção a partir de material lignocelulósico (incluindo hemicelulósico). Essas etapas podem ser executadas com métodos convencionais, por exemplo:
Hidrólise enzimática
A hidrólise enzimática pode ser executada com métodos convencionais.
Fermentação
O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/l/h, mais preferivelmente 0 mmol/l/h é consumido (ou seja, consumo de oxigênio não é detectável), e em que moléculas orgânicas servem tanto como dadoras de elétrons quanto como aceptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e formação de biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para solucionar esse problema, muitos microorganismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétrons e hidrogênio, regenerando, dessa forma, NAD+.
Dessa forma, em um processo de fermentação anaeróbico preferido, piruvato é usado como um aceptor de elétrons (e hidrogênio) e é reduzido em produtos de fermentação como, por exemplo, etanol, butanol, ácido lático, ácido 3- hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico de β-lactama e uma cefalosporina.
O processo de fermentação é preferivelmente executado em uma temperatura que é ótima para a célula. Dessa forma, para a maioria das leveduras ou células hospedeiras fúngicas, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura que é menor do que cerca de 42°C, preferivelmente menor do que cerca de 38°C. Para leveduras ou células hospedeiras fúngicas filamentosas, o processo de fermentação é realizado preferivelmente em uma temperatura que é mais baixa do que cerca de 35, cerca de 33, cerca de 30 ou cerca de 28°C, e em uma temperatura que é maior do que cerca de 20, cerca de 22 ou cerca de 25°C.
O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose no processo preferivelmente é de pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma percentagem do rendimento máximo teórico.
A invenção também está relacionada a um processo para a produção de um produto de fermentação.
Os processos de fermentação podem ser realizados em modo de batelada, semibatelada ou contínuo. Um processo de hidrólise e fermentação separadas (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para produtividade ótima.
O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado sob condições aeróbicas e anaeróbicas. De preferência, o processo é realizado sob condições microaerofílicas ou de oxigênio limitado.
Um processo de fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/l/h, e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétrons quanto aceptoras de elétrons.
Um processo de fermentação com oxigênio limitado é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, bem como pelas reais propriedades da mistura/transferência de massa do equipamento de fermentação usado. De preferência, em um processo sob condições de oxigênio limitado, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos cerca de 5,5, mais preferivelmente pelo menos cerca de 6, por exemplo, pelo menos 7 mmol/l/h. Um processo da invenção compreende recuperação do produto de fermentação.
Em um processo preferido, a célula fermenta tanto xilose quanto glicose, de preferência simultaneamente, quando então preferivelmente é usada uma célula que é insensível à repressão de glicose para evitar o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação ainda compreenderá o ingrediente apropriado necessário ao crescimento da célula. Composições de meios de fermentação para o crescimento de microorganismos como, por exemplo, leveduras, são bem conhecidas na técnica.
Os processos de fermentação podem ser realizados em modo de batelada, semibatelada ou contínuo. Um processo de hidrólise e fermentação separadas (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para produtividade ótima. Esses processos serão aqui descritos posteriormente com mais detalhes.
Modo de SSF
Para o modo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), o tempo de reação para a etapa de liquefação/hidrólise ou pré-sacarificação depende do tempo para efetuar um rendimento desejado, ou seja, conversão de celulose em glicose. Este é realizado preferivelmente tão elevado quanto possível, preferivelmente 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, até mesmo 99,5% ou mais ou 99,9% ou mais.
De acordo com a invenção, concentrações de açúcar muito elevadas em modo de SHF e concentrações de (por exemplo, etanol) produto muito elevadas em modo de SSF são obtidas. Na operação por SHF, a concentração de glicose é de 25 g/l ou mais, 30 g/l ou mais, 35 g/l ou mais, 40 g/l ou mais, 45 g/l ou mais, 50 g/l ou mais, 55 g/l ou mais, 60 g/l ou mais, 65 g/l ou mais, 70 g/l ou mais, 75 g/l ou mais, 80 g/l ou mais, 85 g/l ou mais, 90 g/l ou mais, 95 g/l ou mais, 100 g/l ou mais, 110 g/l ou mais, 120 g/l ou mais, ou pode ser, por exemplo, de 25 g/l-250 g/l, 30 g/l-200 g/l, 40 g/l-200 g/l, 50 g/l-200 g/l, 60 g/l-200 g/l, 70 g/l-200 g/l, 80 g/l-200 g/l, 90 g/l, 80 g/l-200 g/l.
Concentração de produto em modo de SSF
Na operação por SSF, a concentração de produto (g/l) depende da quantidade de glicose produzida, mas isso não é visível, já que os açúcares são convertidos em produto no SSF, e as concentrações de produto podem estar relacionadas à concentração subjacente de glicose por multiplicação com o rendimento máximo teórico (Yps max em gramas de produto por grama de glicose).
O rendimento máximo teórico (Yps max em gramas de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado a partir de um livro-texto de bioquímica. Para etanol, 1 mole de glicose (180 g) gera, de acordo com via normal de fermentação de glicólise em leveduras, 2 moles de etanol (= 2 x 46 = 92 gramas de etanol). O rendimento máximo teórico de etanol em glicose é, portanto, 92/180 = 0,511 grama de etanol/grama de glicose.
Para Butanol (MW 74 g/mole) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mole de butanol por mole de glicose. Portanto, Yps max para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 grama de (iso-)butanol/grama de glicose.
Para ácido lático, o rendimento da fermentação para fermentação homolática é de 2 moles de ácido lático (MW = 90 g/mole) por mole de glicose. De acordo com essa estequiometria, o Yps max = 1 grama de ácido lático/grama de glicose.
Para outros produtos de fermentação, pode ser feito um cálculo similar.
Modo de SSF
Na operação por SSF, a concentração de produto é de 25 * Yps g/l ou mais, 30 * Yps g/l ou mais, 35 * Yps g/l ou mais, 40 * Yps g/l ou mais, 45 * Yps g/l ou mais, 50 * Yps g/l ou mais, 55 * Yps g/l ou mais, 60 * Yps g/l ou mais, 65 * Yps g/l ou mais, 70 * Yps g/l ou mais, 75 * Yps g/l ou mais, 80 * Yps g/l ou mais, 85 * Yps g/l ou mais, 90 * Yps g/l ou mais, 95 * Yps g/l ou mais, 100 * Yps g/l ou mais, 110 * Yps g/l ou mais, 120 g/l * Yps ou mais, ou pode ser, por exemplo, de 25 * Yps g/l-250 * Yps g/l, 30 * Yps gl/L- 200 * Yps g/l, 40 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 50 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 60 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 70 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 90 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l.
Conseqüentemente, a invenção fornece um método para a preparação de um produto de fermentação, cujo método compreende: a. a degradação de lignocelulose usando um método como aqui descrito; e b. fermentação do material resultante para preparar, dessa forma, um produto de fermentação.
Produto de fermentação
O produto de fermentação da invenção pode ser qualquer produto útil. Em uma modalidade, ele é um produto selecionado do grupo que consiste em etanol, n-butanol, isobutanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, ácido maléico, ácido cítrico, ácido adípico, um aminoácido como, por exemplo, lisina, metionina, triptofano, treonina e ácido aspártico, 1,3-propano diol, etileno, glicerol, um antibiótico de β- lactama e uma cefalosporina, vitaminas, substâncias farmacêuticas, suplementos de ração animal, especialidades químicas, matérias-primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, incluindo biocombustíveis e biogás ou polímeros orgânicos e uma enzima industrial, por exemplo, uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase.
Recuperação do produto de fermentação
Para a recuperação do produto de fermentação, são usadas tecnologias existentes. Para produtos de fermentação diferentes, diferentes processos de recuperação são apropriados. Os métodos de recuperação de etanol existentes de misturas aquosas comumente usam técnicas de fracionamento e adsorção. Por exemplo, um destilador de cerveja pode ser usado para processar um produto fermentado que contém etanol em uma mistura aquosa, para produzir uma mistura enriquecida contendo etanol que é então submetida ao fracionamento (por exemplo, destilação fracionada ou outras técnicas semelhantes). A seguir, as frações que contêm as maiores concentrações de etanol podem ser passadas através de um adsorvedor para remover a maior parte, se não toda, a água restante do etanol.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção:
EXEMPLOS
Salvo indicação em contrário, os métodos usados são técnicas bioquímicas padronizadas. Exemplos de livros-texto de metodologia geral adequados incluem Sambrook e cols., “Molecular Cloning, a Laboratory Manual” (1989) e Ausubel e cols., “Current Protocols in Molecular Biology” (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Transformação de S. cerevisiae
A transformação de S. cerevisiae foi feita como descrito por Gietz e Woods (2002; “Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method”. “Methods in Enzymology” 350: 87-96).
PCR de colônia
Um único isolado da colônia foi escolhido com um cotonete plástico e ressuspenso em 50 μl de água milliQ. A amostra foi incubada por 10 minutos a 99°C. Cinco μl da amostra incubada foram usados como um modelo para a reação de PCR, usando DNA polimerase Phusion® (Finnzymes) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Condições da reação de PCR:
Figure img0003
Composição do meio
Experimentos de crescimento: cepas de Saccharomyces cerevisiae são desenvolvidas em meio que possui a seguinte composição: 0,67% (p/v) de base nitrogenada de levedura ou meio sintético (Verduyn e cols., Yeast 8: 501-517, 1992) e glicose, arabinose, galactose ou xilose, ou uma combinação desses substratos (veja abaixo). Para placas de ágar, o meio é suplementado com 2% (p/v) de ágar bacteriológico.
Produção de etanol: os cultivos foram realizados a 30°C em 100 ml de meio-modelo sintético (meio de Verduyn (Verduyn e cols., Yeast 8: 501-517, 1992) com glicose 5%, xilose 5%, arabinose 3,5% e galactose 1-1,5%) no BAM (“Biological Activity Monitor”, Halotec, Holanda). O pH do meio foi ajustado até 4,2 com 2 M de NaOH/H2SO4 antes da esterilização. O meio sintético para cultivo anaeróbico foi suplementado com 0,01 g de I-1 ergosterol e 0,42 g de I-1 Tween 80 dissolvido em etanol (Andreasen e Stier. J. Cell Physiol. 41: 23-36, 1953; e Andreasen e Stier. J. Cell Physiol. 43: 271-281, 1954). As culturas foram agitadas por um agitador magnético. As condições anaeróbicas se desenvolveram rapidamente durante a fermentação, já que a cultura não era aerada. A produção de CO2 foi monitorada constantemente. Conversão de açúcar e formação de produto foram analisadas por RNM. O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura a 600 nm em um espectrofotômetro LKB Ultrospec K.
Pré-culturas foram preparadas por inoculação de 25 ml de meio de Verduyn (Verduyn e cols., Yeast 8: 501-517, 1992) suplementado com glicose 2% em um frasco de agitação de 100 ml com uma cultura de estoque congelada ou uma única colônia da placa de ágar. Após incubação a 30°C em uma agitadora orbitária (200 rpm) por aproximadamente 24 horas, essa cultura foi coletada e usada para inoculação do BAM em uma OD600 de aproximadamente 2.
Exemplo 1 Introdução dos genes araA, araB e araD no genoma de S. cerevisiae 1.1 Construção de um vetor de expressão que contém os genes para a via de arabinose
O plasmídeo pPWT018, como apresentado na figura 2, foi construído da seguinte forma: vetor pPWT006 (figura 1), que consiste em um lócus S/T2 (Gottlin-Ninfa e Kaback (1986) Molecular and Cell Biology vol. 6, N° 6, 2.185-2.197) e nos marcadores que permitem a seleção de transformantes no antibiótico G418 e a habilidade para crescer em acetamida (vide supra), foi digerido com as enzimas de restrição BsiWI e MluI. O marcador kanMX, que confere resistência a G418, foi isolado de p427TEF (Dualsystems Biotech) e um fragmento contendo o marcador amdS foi descrito na literatura (Swinkels, B.W., Noordermeer, A.C.M. e Renniers, A.C.H.M (1995) “The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant, bidirectional selectable marker for yeast transformation”. Yeast Volume 11, Número 1995A, página S579; e US 6051431). Os genes que codificam arabinose isomerase (araA), L-ribuloquinase (araB) e L- ribulose 5-fosfato-4-epimerase (araD) de Lactobacillus plantarum, como revelado no Pedido de Patente WO 2008/041840, foram sintetizados por BaseClear (Leiden, Holanda). Um fragmento grande foi sintetizado, abrigando os três genes de arabinose mencionados acima, sob controle de (ou ligado operacionalmente aos) promotores fortes de S. cerevisiae, ou seja, o promotor TDH3 que controla a expressão do gene araA, o promotor ENO1 que controla o gene araB e o promotor PG/1 que controla o gene araD. Esse fragmento era circundado pelas enzimas de restrição únicas Acc651 e MluI. A clonagem desse fragmento em pPWT006 digerido com MluI e BsiWI resultou no plasmídeo pPWT018 (figura 2). A seqüência do plasmídeo pPWT018 é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 17.
1.2 Transformação de leveduras
CEN.PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) foi transformada com o plasmídeo pPWT018, que foi previamente linearizado com SfiI (New England Biolabs), de acordo com as instruções do fornecedor. Um sítio SfiI sintético foi designado no flanco 5’ do gene SIT2 (veja figura 2). As misturas de transformação foram plaqueadas em YPD-ágar (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de ágar) contendo 100 μg de G418 (Sigma Aldrich) por ml. Após dois a quatro dias, colônias apareceram nas placas, enquanto o controle negativo (ou seja, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas de YPD/G418 vazias. A integração do plasmídeo pPWT018 é dirigida ao lócus SIT2. Os transformantes foram caracterizados usando PCR e técnicas de Southern blotting.
As reações de PCR, que são indicativas para a integração correta de uma cópia do plasmídeo pPWT018, foram realizadas com os iniciadores indicados pelos IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 15, e 15 e 14 (veja figura 4). Com os pares de iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 15, a integração correta no lócus S/T2 foi verificada. Se o plasmídeo pPWT018 estiver integrado em múltiplas cópias (integração da cabeça à cauda), o par de iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 15 e 14 gerará um produto de PCR. Se o último produto de PCR estiver ausente, isso é indicativo para integração de uma cópia de pPWT018. Uma cepa na qual uma cópia do plasmídeo pPWT018 foi integrado no lócus S/T2 foi designada BIE104R2.
1.3 Resgate do marcador
A fim de ser capaz de transformar a cepa de levedura com outras construções, usando os mesmos marcadores de seleção, é necessário remover os marcadores selecionáveis. O design do plasmídeo pPWT018 era tal que, mediante integração de pPWT018 no cromossomo, seqüências homólogas estão muito próximas umas às outras. Esse design permite que os marcadores selecionáveis sejam perdidos por recombinação intramolecular espontânea dessas regiões homólogas.
Mediante crescimento vegetativo, ocorrerá recombinação intramolecular, embora em uma freqüência baixa. A freqüência dessa recombinação depende do comprimento da homologia e do lócus no genoma (resultados não publicados). Mediante transferência seqüencial de uma subfração da cultura para fresco de meio, recombinantes intramoleculares irão se acumular com o tempo.
Para essa finalidade, a cepa BIE104R2 foi cultivada em meio YPD (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose), partindo de um isolado de colônia única. Vinte e cinco μl de uma cultura de um dia para o outro foram usados para inocular meio YPD fresco. Após pelo menos cinco dessas transferências seriais, a densidade óptica da cultura foi determinada, e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5.000 por ml. Cem μl da suspensão de células foram plaqueados em meio-base de carbono de levedura (Difco) contendo 30 mM de KPi (pH 6,8), (NH4)2SO4 0,1%, 40 mM de flúor-acetamida (Amersham) e agar 1,8% (Difco). Células idênticas às células da cepa BIE104R2, ou seja, sem recombinação intracelular, ainda contêm o gene amdS. Para aquelas células, flúor-acetamida é tóxica. Essas células não serão capazes de crescer e não formarão colônias em um meio que contém flúor-acetamida. No entanto, se a recombinação intramolecular tiver ocorrido, variantes de BIE104R2 que perderam os marcadores selecionáveis serão capazes de crescer em meio de flúor- acetamida, na medida em que são incapazes de converter flúor-acetamida em compostos inibidores do crescimento. Aquelas células formarão colônias nesse meio de ágar.
As colônias resistentes à flúor-acetamida assim obtidas foram submetidas à análise por PCR usando os iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 15, e 14 e 19. Os iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 5 gerarão uma banda se a recombinação dos marcadores selecionáveis tiver ocorrido como desejado. Como resultado, o cassete com os genes araA, araB e araD sob controle dos promotores de levedura fortes foi integrado no lócus S/T2 do genoma da cepa hospedeira. Naquele caso, uma reação de PCR usando os iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 14 e 19 não deve resultar em um produto de PCR, já que o iniciador 14 inicia em uma região que deve ser perdida em função da recombinação. Se uma banda é obtida com os últimos iniciadores, isso é indicativo da presença do plasmídeo pPWT018 completo no genoma e, portanto, não ocorreu nenhuma recombinação.
Se os iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 15 não resultam em um produto de PCR, ocorreu recombinação, mas de tal forma que os plasmídeo pPWT018 completo se recombinou fora do genoma. Não somente os marcadores selecionáveis se perderam, mas também os genes de arabinose. Na verdade, a levedura do tipo selvagem foi resgatada.
Isolados que mostraram resultados de PCR de acordo com a integração de uma cópia de pPWT018 foram submetidos à análise Southern blot. O DNA cromossômico de cepas CEN.PK113-7D e os recombinantes corretos foram digeridos com EcoRI e HindIII (digestão dupla). Uma sonda de S/T2 foi preparada com iniciadores dos IDS. DE SEQ. Nos: 20 e 21, usando DNA cromossômico de CEN.PK113-7D como um modelo. O resultado do experimento de hibridização é mostrado na figura 3. O padrão de hibridização esperado pode ser deduzido a partir dos mapas físicos, como apresentados na figura 4 (painéis a e b).
Na cepa do tipo selvagem, uma banda de 2,35 kb é observada, o que está de acordo com o tamanho esperado do gene do tipo selvagem (figura 4, painel a). Com a integração e perda parcial por recombinação do plasmídeo pPWT018, uma banda de 1,06 kb era esperada (figura 4, painel b). Na verdade, essa banda é observada, como mostrado na figura 3 (raia 2).
Uma das cepas que mostraram o padrão correto de bandas no Southern blot (como pode ser deduzido a partir da figura 3) é a cepa designada como BIE104A2.
1.4 Introdução de quatro genes expressos constitutivamente da via não oxidativa de pentose fosfato
Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, que expressa os genes araA, araB e araD constitutivamente, foi transformada com o plasmídeo pPWT080 (figura 5). A seqüência do plasmídeo pPWT080 é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 4. Os procedimentos para transformação e seleção, após seleção de uma cópia transformante, são os mesmos descritos acima nas seções 1.1, 1.2 e 1.3. Resumidamente, BIE104A2 foi transformado com pPWT080 digerido com SfiI. As misturas de transformação foram plaqueadas em YPD-ágar (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de ágar) contendo 100 μg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Após dois a quatro dias, colônias apareceram nas placas, enquanto o controle negativo (ou seja, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas de YPD/G418 vazias.
A integração do plasmídeo pPWT080 é dirigida ao lócus GRE3. Os transformantes foram caracterizados usando PCR e técnicas de Southern blotting.
Um transformante que mostra integração correta de uma cópia do plasmídeo pPWT080, de acordo com o padrão de hibridização esperado, foi designado BIE104A2F1.
A fim de ser capaz de introduzir os genes que codificam xilose isomerase e xiluloquinase (exemplo 5), é necessário remover os marcadores de seleção introduzidos pela integração do plasmídeo pPWT080. Para essa finalidade, a cepa BIE104A2F1 foi cultivada em meio YPD, partindo de um isolado da colônia. Vinte e cinco μl de uma cultura de um dia para o outro foram usados para inocular meio YPD fresco. Após cinco transferências seriais, a densidade óptica da cultura foi determinada, e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5.000 por ml. Cem μl da suspensão de células foram plaqueados em meio-base de carbono de levedura (Difco) contendo 30 mM de KPi (pH 6,8), (NH4)2SO4 0,1%, 40 mM de flúor-acetamida (Amersham) e ágar 1,8% (Difco). As colônias resistentes à flúor-acetamida foram submetidas à análise por PCR e, no caso de perfis de PCR corretos, análise Southern blot (seção 1.3 do exemplo 1). Uma das cepas que mostravam o padrão correto de bandas no Southern blot é a cepa designada como BIE104A2P1.
Exemplo 2 Evolução adaptativa 2.1 Evolução adaptativa (aerobicamente)
Isolado de colônia única da cepa BIE104A2P1 foi usado para inocular meio YNB (Difco) suplementado com galactose 2%. A pré-cultura foi incubada por aproximadamente 24 horas a 30°C e 280 rpm. Células foram coletadas e inoculadas em meio YNB contendo galactose 1% e arabinose 1% em uma OD600 de partida de 0,2 (figura 8). As células foram desenvolvidas a 30°C e 280 rpm. A densidade óptica a 600 nm foi monitorada regularmente.
Quando a densidade óptica alcançou um valor de 5, uma alíquota da cultura foi transferida para meio YNB fresco contendo o mesmo meio. A quantidade de células adicionadas era tal que a OD600 de partida da cultura foi de 0,2. Após alcançar uma OD600 de 5 novamente, uma alíquota da cultura foi transferida para meio YNB contendo arabinose 2% como a única fonte de carbono (evento indicado por (1) na figura 8).
Mediante transferência para YNB com arabinose 2% como a única fonte de carbono, o crescimento podia ser observado após aproximadamente duas semanas. Quando a densidade óptica a 600 nm alcançou um valor de pelo menos 1, as células foram transferidas para um frasco em agitação com meio YNB fresco suplementado com arabinose 2% em uma OD600 de partida de 0,2 (figura 8).
A transferência seqüencial foi repetida três vezes, como apresentado na figura 8. A cepa resultante que era capaz de crescer rápido em arabinose foi designada BIE104A2P1c.
2.2 Evolução adaptativa (anaerobicamente)
Após adaptação em crescimento em arabinose sob condições aeróbicas, uma única colônia da cepa BIE104A2P1c foi inoculada em meio YNB suplementado com glicose 2%. A pré-cultura foi incubada por aproximadamente 24 horas a 30°C e 280 rpm.
Células foram coletadas e inoculadas em meio YNB contendo arabinose 2%, com densidade óptica OD600 de 0,2. Os frascos foram fechados com waterlocks, assegurando condições anaeróbicas de crescimento após o oxigênio ser exaurido do meio e headspace. Após alcançar uma OD600 mínima de 3, uma alíquota da cultura foi transferida para meio YNB fresco contendo arabinose 2% (figura 9), cada uma com densidade óptica OD600 de 0,2.
Após várias transferências, a cepa resultante foi designada BIE104A2P1d (=BIE201).
Exemplo 3 Determinação da capacidade fermentativa
Isolados de colônia única das cepas BIE104, BIE104A2P1c e BIE201 foram usados para inocular meio YNB (Difco) suplementado com glicose 2%. As pré-culturas foram incubadas por aproximadamente 24 horas a 30°C e 280 rpm. Células foram coletadas e inoculadas em um meio-modelo sintético (Verduyn e cols., Yeast 8: 501-517, 1992; glicose 5%, xilose 5%, arabinose 3,5%, galactose 1%) em uma OD600 inicial de aproximadamente 2 no BAM. A produção de CO2 foi monitorada constantemente. A conversão de açúcar e a formação de produto foram analisadas por RNM. Os dados representam a quantidade residual de açúcares no substrato indicado (glicose, arabinose, galactose e xilose em gramas por litro) e a formação de (sub)produtos (etanol, glicerol). O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura a 600 nm (figuras 10, 11, 12). O experimento foi executado por aproximadamente 140 horas.
Os experimentos mostram claramente que a cepa de referência BIE104 converteu glicose rapidamente, mas não foi capaz de converter nem arabinose nem galactose em até 140 horas (figura 10). No entanto, as cepas BIE104A2P1c e BIE201 foram capazes de converter arabinose e galactose (figuras 11 e 12, respectivamente). A utilização de galactose e arabinose começou imediatamente após a depleção de glicose após menos de 20 horas. Ambos os açúcares foram convertidos simultaneamente. No entanto, a cepa BIE201, que era aprimorada para crescimento de arabinose sob condições anaeróbicas, consumiu ambos os açúcares mais rapidamente (figura 12). Em todas as fermentações, somente glicerol foi gerado como subproduto. Os dados da fermentação de BIE201 são apresentados na tabela 2. Tabela 2: Concentrações de açúcar e concentrações de etanol (g/l) da fermentação de BIE201, como mostrado na figura 12.
A concentração máxima de etanol é calculada por multiplicação das concentrações por 0,51 para cada açúcar e resumindo-se. A concentração de etanol em 136 h (39,2 g/l) significa um rendimento de etanol de 0,45 g de etanol/g de açúcar. Esse rendimento mostra que todos os açúcares foram convertidos em etanol. Concentrações em g/l
Figure img0004
Concentrações máximas de etanol (em g/l) a partir de:
Figure img0005
Rendimento experimental de etanol: 0,45 g de etanol/g de açúcar.
A partir desse cálculo, fica claro que os açúcares glicose, galactose e arabinose são convertidos em etanol.
Exemplo 4 Efeito dos genes da PPP sobre a conversão de açúcar
Para testar o efeito dos genes da PPP sobre conversão de açúcar, colônias únicas da cepa BIE104A2 e BIE105A2 foram inoculadas em meio YNB (Difco) suplementado com glicose 2%. Ambas as cepas contêm os genes de arabinose e foram desenvolvidas para crescimento em arabinose (como descrito no exemplo 2, seção 2.1). A cepa BIE105A2 possui a base de uma cepa industrial. No entanto, ela foi transformada com os mesmos métodos e construções descritos anteriormente (exemplo 1, seção 1.2).
Pré-culturas foram coletadas e inoculadas em meio de modelo de fibra de milho sintética (Verduyn e cols., Yeast 8: 501-517, 1992; glicose 5%, xilose 5%, arabinose 3,5%,galactose 1,5%) com uma OD600 de partida de aproximadamente 2 no BAM. A produção de CO2 foi monitorada constantemente. A conversão de açúcar e a formação de produto foram analisadas por RNM. Os dados representam a quantidade residual de açúcares no substrato indicado (glicose, arabinose, galactose e xilose em gramas por litro) e a formação de (sub)produtos (etanol, glicerol). O crescimento foi monitorado por acompanhamento da densidade óptica da cultura a 600 nm. O experimento foi executado por aproximadamente 160 horas.
Os experimentos mostram que ambas as cepas são capazes de converter arabinose e galactose imediatamente após depleção de glicose, sem a superexpressão dos genes da PPP (figura 13 e 14).
Exemplo 5 Introdução de genes expressos constitutivamente que codificam xilose isomerase e xiluloquinase 5.1 Transformação de leveduras
A cepa BIE104A2P1 (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 SIT2::[TDH3-araA, ENO1-araB, PGI1-araD] ΔGRE3::[TPI1p- TAL1, ADH1p-TKL1, PGI1p-RPE1, ENO1p-RKI1]) foi transformada com o plasmídeo pPWT042 (figura 16). O plasmídeo pPWT042 se deriva do vetor pPWT007 (figura 15). Ele contém a xiluloquinase com par de códons otimizada de S. cerevisiae e a xilose isomerase com par de códons otimizada de Bacteroides uniformis (SEQ 2), como revelado no Pedido de Patente PCT/EP2009/52623.
Antes da transformação de BIE104A2P1, pPWT042 foi linearizado usando a enzima de restrição SfiI, de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. As misturas de transformação foram plaqueadas em YPD-ágar (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de ágar) contendo 100 μg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Após dois a quatro dias, colônias apareceram nas placas, enquanto o controle negativo (ou seja, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas de YPD/G418 em branco.
Após digestão do plasmídeo pPWT042 com SfiI, sua integração é direcionada ao lócus S/T4 (Gottlin-Ninfa e Kaback (1986) “Molecular and Cellular Biology” Vol. 6, N° 6, 2.185-2.197) no genoma (figura 17). Os transformantes foram caracterizados usando PCR e técnicas de Southern blotting, como descrito no exemplo 1 (seção 1.2).
Uma cepa com uma cópia do plasmídeo pPWT042 integrada no genoma foi designada BIE104A2P1Y9.
5.2 Experimentos de crescimento
Isolados de colônia única das cepas BIE104A2P1Y9 foram usados para inocular meio YNB (Difco) suplementado com glicose 2% ou galactose 2%. Os frascos inoculados foram incubados a 30°C e 280 rpm até que a densidade óptica a 600 nm alcançasse um valor de pelo menos 2,0.
Meio YNB suplementado com arabinose 1% e xilose 1% foi inoculado com as culturas de um dia para o outro em uma OD600 de partida de 0,2. As células foram desenvolvidas a 30°C e 280 rpm. A densidade óptica a 600 nm foi monitorada regularmente. Quando a densidade óptica alcançou um valor maior do que 2,0, uma alíquota da cultura foi transferida para meio YNB fresco contendo xilose 2% e arabinose 0,2%. A quantidade de células adicionadas era tal que a OD600 de partida da cultura foi de 0,2.
A densidade óptica foi monitorada regularmente. Os resultados são mostrados na figura 18, painel a (pré- culturas em galactose) e painel b (pré-culturas em glicose).
Os resultados mostram claramente que as cepas são capazes de utilizar glicose, galactose, arabinose e xilose.
5.3 Resgate de marcador
Para remover o marcador de seleção introduzido pela integração do plasmídeo pPWT042, a cepa BIE104A2P1Y9 foi cultivada em meio YPD, partindo de um isolado da colônia. Vinte e cinco μl de uma cultura de um dia para o outro foram usados para inocular meio YPD fresco.
Após transferências seriais, a densidade óptica da cultura foi determinada, e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5.000 por ml. Cem μl da suspensão de células foram plaqueados em meio-base de carbono de levedura (Difco) contendo 30 mM de KPi (pH 6,8), (NH4)2SO4 0,1%, 40 mM de flúor-acetamida (Amersham) e ágar 1,8% (Difco). As colônias resistentes à flúor-acetamida foram submetidas à análise por PCR e, no caso de perfis de PCR corretos, análise Southern blot (seção 1.3, exemplo 1). Uma das cepas que mostravam o padrão correto de bandas no Southern blot é a cepa designada como BIE104A2P1X9.
5.4 Experimentos de crescimento
Isolados de colônia única da cepa BIE104A2P1X9 (BIE104A2P1X9a1 e BIE104A2P1X9a2) foram usados para inocular meio de Verduyn (Difco) suplementado com glicose 2%. Os frascos inoculados foram incubados a 30°C e 280 rpm por aproximadamente 24 horas.
Meio de Verduyn suplementado com xilose 2% foi inoculado com as culturas de um dia para o outro em uma OD600 de partida de 0,2. As células foram desenvolvidas a 30°C e 280 rpm. A densidade óptica a 600 nm foi monitorada regularmente. Os resultados são mostrados na figura 19.
Os resultados mostram claramente que ambas as colônias independentes da cepa BIE104A2P1X9 ainda são capazes de utilizar xilose após resgate do marcador. Como já observado no exemplo 3, a cepa é capaz de utilizar glicose, arabinose e galactose (Fig. 11 e Fig. 12).
Exemplo 6 Transformação de S. cerevisiae para produção de ácido succínico em arabinose e galactose 6.1. Construções de expressão
A construção de expressão pGBS414PPK-3 que compreende uma fosfoenol piruvato carboxiquinase PCKa (E.C. 4.1.1.49) de Actinobacillus succinogenes e fumarato redutase glicossômica FRDg (E.C. 1.3.1.6) de Trypanosoma brucei, e uma construção de expressão pGBS415FUM3 que compreende uma fumarase (E.C. 4.2.1.2.) de Rhizopus oryzae e uma malato desidrogenase peroxissômica MDH3 (E.C. 1.1.1.37), é feita como descrito previamente em WO 2009/065778 nas páginas 1920, e 22-30, que são aqui incorporadas por referência, incluindo as figuras e a listagem de seqüências.
A construção de expressão pGBS416ARAABD que compreende os genes araA, araB e araD derivados de Lactobacillus plantarum é construída por clonagem de um produto de PCR, que compreende o cassete de expressão de araABD do plasmídeo pPWT018, no plasmídeo pRS416. O fragmento de PCR é gerado usando DNA polimerase Phusion® (Finnzymes) e iniciadores de PCR aqui definidos como o ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 23. O produto de PCR é cortado com as enzimas de restrição SalI e NotI, como plasmídeo pRS416. Após ligação e transformação de E. coli TOP10, as recombinantes corretas são selecionadas com base na análise da enzima de restrição. O mapa físico do plasmídeo pGBS416ARAABD é apresentado na figura 20.
6.2. Cepas de S. cerevisiae
Os plasmídeos pGBS414PPK-3, pGBS415-FUM-3 são transformados em S. cerevisiae cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trpl-289). Além disso, o plasmídeo pGBS416ARAABD é transformado nessa levedura para criar cepas de levedura prototróficas. Os vetores de expressão são transformados em levedura por eletroporação. As misturas de transformação são plaqueadas em base nitrogenada de levedura (YNB) w/o AA (Difco) + glicose 2%.
As cepas são submetidas à evolução adaptada (veja a seção 2) para crescimento em arabinose como a única fonte de carbono.
6.3. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico
Transformantes são inoculados em 20 ml de meio de pré- cultura que consiste em meio de Verduyn (Verduyn e cols., 1992, Yeast. Julho; 8(7): 501-17) que compreende galactose 2% (p/v) e desenvolvidos sob condições aeróbicas em frascos em agitação de 100 ml em uma incubadora em agitação a 30°C a 250 rpm. Após aproximadamente 24 horas, as células são transferidas para meio de Verduyn fresco contendo glicose 2%, galactose 2% ou arabinose 2%, ou misturas destas, em quatro vezes. Dois frascos são incubados sob condições aeróbicas, dois frascos são incubados sob condições anaeróbicas, por exemplo, por fechamento dos frascos usando um waterlock ou por incubação em uma agitadora orbitária anaeróbica. Em intervalos de tempo, são coletadas amostras da cultura. As amostras são centrifugadas por 5 minutos a 4.750 rpm. Um ml de sobrenadante é usado para medir os níveis de ácido succínico por HPLC, como descrito na seção 6.4.
6.4. Análise por HPLC
HPLC é realizada para a determinação de ácidos orgânicos e açúcares. O princípio da separação em uma coluna Phenomenex Rezex-RHM-Monossacarídeo se baseia na exclusão de tamanho, exclusão iônica e troca iônica usando mecanismos de fase reversa. A detecção ocorre por índice refrativo diferencial e detectores de ultravioleta.
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Claims (3)

1. Processo para a produção de etanol a partir de uma composição de açúcar, em que o referido processo emprega uma cepa de levedura recombinante compreendendo os genes araA, araB e araD caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) fermentação da composição de açúcar na presença de uma célula de Saccharomyces cerevisiae, que é a cepa BIE104A2, BIE105A2, BIE104A2P1c, BIE201, BIE104A2P1Y9, e/ou BIE104A2P1X, em que a fermentação é conduzida sob condições anaeróbicas ou limitadas por oxigênio, e b) recuperação de etanol, em que a composição de açúcar compreende glicose, galactose e arabinose, e em que os açúcares glicose, galactose e arabinose são convertidos em etanol.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que galactose e arabinose são convertidas simultaneamente.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição de açúcar é produzida a partir de material lignocelulósico por: c) pré-tratamento de um ou mais materiais lignocelulósicos para produzir material lignocelulósico pré-tratado; d) tratamento enzimático do material lignocelulósico pré-tratado para produzir a composição de açúcar.
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