JP2012532591A - 組み換え酵母株を用いたグルコース、ガラクトース、およびアラビノースからのエタノールの発酵生産 - Google Patents
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Abstract
a)糖組成物をサッカロミセス(Saccharomyces)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、分裂酵母(SchizoSaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)またはヤロウィア(Yarrowia)属に属する酵母の存在下で発酵させるステップと、b)発酵産物を回収するステップを含んでなり、酵母が遺伝子araA、araB、およびaraDを含んでなり、糖組成物がグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる、糖組成物から1つ以上の発酵産物を生成する方法に関する。
Description
本発明は、混合糖の発酵、特にグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる糖組成物の発酵に関する。糖組成は、リグノセルロース系材料が起源であってもよい。
化石燃料代替物として生産されるエタノールのほとんどは、目下、コーンスターチおよびサトウキビベースのスクロースの発酵に由来する。再生可能燃料を生産するという意欲的目標に到達するために、非食物バイオマスをエタノールなどの発酵産物に転換する新たな技術が開発されている。サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、エタノール産業において一般に好まれる生物であるが、それはバイオマス原材料のヘミセルロース構成要素に含有される五炭素糖を利用し得ない。ヘミセルロースは、バイオマスの20〜30%を構成し得て、キシロースおよびアラビノースが最も豊富なC5糖である。キシロースイソメラーゼ(XI)の異種性発現は、酵母細胞がキシロースを代謝して発酵できるようにするための一つの選択肢である。同様にS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)株中における細菌遺伝子araA、araB、およびaraDの発現は、アラビノースの利用と効率的なアルコール発酵をもたらす。ガラクトースはC6糖であり、それは頻繁に経済的理由のために無視できない量(全糖の約4%)でリグノセルロース中に存在することが多い糖でもある。
本発明は、
a)サッカロミセス(Saccharomyces)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、分裂酵母(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)またはヤロウィア(Yarrowia)属に属する酵母の存在下で糖組成物を発酵させるステップと、
b)発酵産物を回収するステップ
を含んでなる、糖組成物から1つ以上の発酵産物を生産する方法を提供し、酵母は遺伝子araA、araB、およびaraDを含んでなり、糖組成物はグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる。
配列番号1は、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)ATCC8492からの野生型キシロースイソメラーゼ配列を示す。Genbank登録番号AAYH02000036。
配列番号2は、配列番号1に由来するコドン最適化された配列を示す。
配列番号3は、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)ATCC8492からのキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、プラスミドpPWT080の配列を示す。
配列番号5は、順方向プライマーの配列を示す。
配列番号6は、逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号7は、診断PCRのための順方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号8は、診断PCRのための逆方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号9は、順方向プライマーRKI1プローブの配列を示す。
配列番号10は、逆方向プライマーRKI1プローブの配列を示す。
配列番号11は、順方向プライマーkanMX−カセットの配列を示す。
配列番号12は、逆方向プライマーkanMX−カセットの配列を示す。
配列番号13は、順方向プライマーの配列を示す。
配列番号14は、逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号15は、診断PCRのための順方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号16は、診断PCRのための逆方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号17は、プラスミドpPWT018の配列を示す。
配列番号18は、順方向プライマー組み込みpPWT018の配列を示す。
配列番号19は、逆方向プライマー組み込みpPWT018の配列を示す。
配列番号20は、順方向プライマーSIT2プローブの配列を示す。
配列番号21は、逆方向プライマーSIT2プローブの配列を示す。
配列番号22は、araABD発現カセットを増幅する順方向プライマーの配列を示す。
配列番号23は、araABD発現カセットを増幅する逆方向プライマーの配列を示す。
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通じて、語句「含んでなる(comprise)」および「含む(include)」、および「含んでなる(comprises)」、「含んでなる(comprising)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」などのバリエーションは、包括的に解釈されるものとする。すなわちこれらの語句は、文脈が許せば、具体的に列挙されないその他の要素または整数の可能な包含を伝えることが意図される。
本発明に従った糖組成物は、グルコース、アラビノース、およびガラクトースを含んでなる。本発明の方法では、有利には、糖グルコース、ガラクトース、およびアラビノースは、発酵産物に変換される。
混合糖細胞は、以下で定義されるように、遺伝子araA、araB、およびaraDを含んでなる。これはグルコース、アラビノース、およびガラクトースを発酵できる。本発明の一実施態様では、混合糖細胞は、好ましくはC5および/またはC6糖である1つ以上の追加的糖を発酵できる。本発明の実施態様では、混合糖細胞は、以下の1つ以上を含んでなる:混合糖細胞がキシロースを発酵できるようにするxylA遺伝子および/またはXKS1遺伝子;アルドース還元酵素(GRE3)遺伝子の欠失;細胞中のペントースリン酸経路を通じた流量を増大させるPPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1およびRKI1の過剰発現。
遺伝子は、
a)強力なプロモーター制御下のPPP遺伝子、TAL1、TKL1、RPE1、およびRKI1からなるクラスター;
b)どちらも構成的プロモーター制御下のxylA遺伝子およびXKS1遺伝子からなるクラスター;
c)遺伝子araA、araB、およびaraDからなるクラスターおよび/またはxylA遺伝子および/またはXKS1遺伝子のクラスター;および
d)アルドース還元酵素遺伝子の欠失
の宿主細胞への導入と、混合糖細胞を生じる適応進化によって、混合糖細胞に導入されてもよい。上記細胞は、組み換え発現技術を使用して構築されてもよい。
本発明の細胞は、組み換え細胞である。すなわち本発明の細胞は、問題となっている細胞中では天然では生じないヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによって形質転換され、またはそれによって遺伝子改変されている。
適応は、それによって集団がその生息環境または複数の生息環境により良く適する(順応する)進化の過程である。この過程は、数世代から多世代にわたって起き、基本的な生物学的現象の1つである。
適応(生物が特定の生息環境内で生きて繁殖できる程度)と適合の間には、明らかな関係がある。適合は、自然淘汰率の推定および予測である。自然淘汰の適用によって、代替の表現型の相対頻度は、それらが遺伝性であるならば経時的に変動する。
自然淘汰が集団の遺伝的変動に作用する場合、遺伝的変化が根底にある機序である。これは集団が、その状況に遺伝的に適応することを意味する。遺伝的変化は、生息環境の変化に適するように、可視的構造をもたらしてもよく、または生物の生理学的活性を調節してもよい。
混合糖細胞は、それらの調製中に適応進化を被る。本発明の細胞は、好ましくは唯一の炭素源としての所望の糖の上での、より好ましくは嫌気的条件下における成長について、自然発生または誘発的(例えば放射線または化学薬品による)いずれかの変異体を選択することで、糖利用のために適応させてもよい。変異体の選択は、例えばKuyperら(2004,FEMS Yeast Res.4:655−664)によって記述される継代培養をはじめとする技術によって、またはケモスタット培養中の選択的圧力下における培養によって実施されてもよい。例えば本発明の好ましい宿主細胞中で、変異体の選択によって得られる改変をはじめとする上述の遺伝子改変の少なくとも1つは、炭素源として、好ましくは唯一の炭素源としてキシロース上で、好ましくは嫌気的条件下で、生育する能力を宿主細胞にもたらす。好ましくは細胞は本質的にキシリトールを生成せず、例えば生成するキシリトールが検出限界未満であり、または例えばモル基準で消費される炭素の約5、約2、約1、約0.5、または約0.3%未満である。
組み換えDNAを用いた酵母細胞の遺伝子操作、すなわち形質転換は、1978年に初めて実行可能になった[Beggs,1978;Hinnen et al.,1978]。酵母中の組み換えDNA技術は、それ以来地位を確立した。多数の異なるベクターコンストラクトが利用可能である。一般にシャトルベクターと称されるこれらのプラスミドベクターは、酵母細胞への形質転換に先だって、それらが大腸菌(E.coli)中で増殖できるようにする、複製起点と選択可能なマーカー(βラクタマーゼ遺伝子、ampRであることが多い)からなる、大腸菌(E.coli)ベクターに由来する遺伝物質を含有する。さらにシャトルベクターは酵母中における選択のための選択可能なマーカーを含有する。マーカーは、対応するゲノムの欠失(または突然変異)を保有する細胞が、栄養要求性または独立栄養性について補足されるような、特定のアミノ酸またはヌクレオチド合成のための酵素をコードする遺伝子であり得る。代案としては、これらのベクターは、g418(Geneticin)、ハイグロマイシンBまたはフレオマイシンのような特定の抗生物質に対する耐性を組み換え酵母細胞(すなわちDNAを取り込んでマーカー遺伝子を発現する細胞)に提供する、異種性顕性耐性マーカーを含有する。さらにこれらのベクターは、外来性DNAをこれらの部位にクローンできるようにする(組み合わされた)制限部位(多重クローニング部位またはMCS)配列を含有してもよいが、代案の方法もまた存在する。
●組み込みプラスミド(YIp)。限定酵素によって開裂され、酵母細胞の形質転換のために直線化DNAが使用される場合は、これはマーカーまたは別の遺伝子の遺伝子座において、相同的組換えにより宿主ゲノムに組み込まれる。これは一般に、ゲノム中のこの特定部位に挿入された外来性DNAの1コピーの存在をもたらす。
●エピソームプラスミド(YEp)。これは酵母細胞中の自律複製に必要な2μプラスミドDNA配列の部分を保有する。複数コピーの形質転換プラスミドが酵母細胞中で増殖され、エピソームとして維持される。
●自己複製プラスミド(YRp)。これは形質転換プラスミドを数百倍に増殖できるようにする、酵母複製起点(ARS、自律的複製配列)を保有する。
●CENプラスミド(YCp)。これはARS配列に加えて、常態では安定した有糸分裂分離を保証し、通常は自己複製プラスミドのコピー数を1つだけに減少させるセントロメア配列(核染色体の1つに由来する)を保有する。
本発明の実施態様では、細胞は、所望の遺伝子の1つを超えるコピーを含んでなってもよい。例えば2つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子またはキシロース還元酵素遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼが、混合糖細胞ゲノムに組み込まれてもよい。これは遺伝子の導入をもたらすことが当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、実施されてもよい。好ましい実施態様では、これは宿主細胞の反復配列(トランスポゾン)と相同的な部分がある、ベクターを使用して達成されてもよい。宿主細胞が酵母細胞である場合、適切な反復配列はδ配列として知られているTy因子の長い末端反復(LTR)である。
宿主細胞は、有用な生成物の生産に適したあらゆる宿主細胞であってもよい。本発明の細胞は、細菌などの原核細胞、または真核細胞などのあらゆる適切な細胞であってもよい。典型的に細胞は、例えば酵母または糸状菌などの真核細胞である。
本発明の細胞は、アラビノースを使用できる。したがって本発明の細胞は、L−アラビノースをL−リブロースおよび/またはキシルロース−5−リン酸、および/または例えば本明細書で言及されるものなどの所望の発酵産物に転換できる。
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路の流量を増大させる1つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。特に遺伝子改変は、非酸化的部分ペントースリン酸経路を通じて、流量の増大をもたらしてもよい。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の増大を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、流量の増大を引き起こす遺伝子改変以外は、遺伝的に同一の株中の流量と比較して、流量を少なくとも約1.1、約1.2、約1.5、約2、約5、約10または約20倍増大させる改変を意味するものと理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、いくらかでもキシリトールが生成される場合は、唯一の炭素源としてのキシロース上で改変宿主を成長させてキシロース特異的消費速度を判定し、キシロース特異的消費速度からキシリトール特異的生成速度を差し引くことによって測定されてもよい。しかしペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、唯一の炭素源としてのキシロース上での成長速度、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロース上での嫌気的成長速度と比例する。唯一の炭素源としてのキシロース上での成長速度(μmax)とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の間には直線関係がある。(嫌気性、増殖培地、pH、株の遺伝的背景などの所定の条件の組の下では)糖の上でのバイオマス収率は一定であるので、キシロースの比消費速度(Qs)は、糖の上でのバイオマス収率(Yxs)で除した成長速度(μ)に等しい(すなわちQs=μ/Yxs)。したがってペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の増大は、輸送(取り込)みが制限されない限り、これらの条件下の最大成長速度の増大から推定されてもよい。
本発明に従って、1つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子および/または1つ以上のキシロース還元酵素およびキシリトールデヒドロゲナーゼのコピーの1つ、2つまたはそれ以上のコピーが、宿主細胞のゲノムに導入される。これらの2つ以上の遺伝要素の存在は、細胞に異性化または還元によってキシロースを転換する能力を与える。
本発明の細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増大させる、1つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。好ましくは1つまたは複数の遺伝子改変は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によってキシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は宿主細胞に内在性であってもよく、または宿主細胞に異種性のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞中におけるキシルロースキナーゼ過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性があるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
XIがキシロースを転換する遺伝子として使用される実施態様では、アルドース還元酵素活性を低下させることが都合良いこともあり得る。したがって本発明の細胞は、宿主細胞の非特異的アルドース還元酵素活性を低下させる、1つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。好ましくは、非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を低下させまたは不活性化する1つ以上の遺伝子改変によって、宿主細胞中で非特異的アルドース還元酵素活性が低下する。好ましくは遺伝子改変は、宿主細胞中で非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の各内在性コピーの発現を低下させまたは不活性化する(本明細書中でGRE3欠失と称する)。宿主細胞は二倍性、倍数性または異数性の結果として、非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の複数コピーを含んでなってもよく、および/または宿主細胞はアミノ酸配列が異なり、それぞれ異なる遺伝子によってコードされるアルドース還元酵素活性があるいくつかの異なる酵素(アイソザイム)を含有してもよい。またこのような場合、好ましくは、非特異的アルドース還元酵素をコードする各遺伝子の発現が低下し、または不活性化される。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、または遺伝子中断によって不活性化され、この文脈では、遺伝子という用語は、その(部分的)欠失または不活性化が宿主細胞中における非特異的アルドース還元酵素活性の発現低下をもたらすコード配列の上流または下流にある、いかなる非コード配列もまた含む。
アルドース+NAD(P)H+H+←→アルジトール+NAD(P)+
本明細書で配列同一性(または配列類似性)とは、2つ以上のアミノ酸(ポリペプチドまたはタンパク質)配列または2つ以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列を比較して判定される、配列間の関係と定義される。通常、配列アイデンティティまたは類似性が比較され、典型的に全長にわたって配列が比較される。しかし配列は、より短い比較ウィンドウにわたって比較されてもよい。当該技術分野で「アイデンティティ」はまた、場合によってはそのような配列のストリング間のマッチによって判定される。アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。
長年にわたって、糖科作物からバイオエタノールを生産するために、様々な生物の導入が提案されてきた。しかし実際には、全ての主要なバイオエタノール製造工程は、エタノール生産菌としてサッカロミセス(Saccharomyces)属の酵母を使用し続けている。これは工業的方法のための、サッカロミセス(Saccharomyces)種の数多くの魅力的な特徴、すなわち高い酸、エタノール、および浸透圧耐性、嫌気的成長能力、そしてもちろんその高いアルコール発酵能力のためである。宿主細胞として好ましい酵母種としては、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ディアスタティカス(S.diastaticus)、K.ラクチス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)、またはK.フラギリス(K.fragilis)が挙げられる。
潜在的な再生可能原材料とみなされてもよいリグノセルロースは、一般に多糖類セルロース(グルカン)およびヘミセルロース(キシラン、ヘテロキシラン、およびキシログルカン)を含んでなる。これに加えて例えば木材由来原材料の中に、ある種のヘミセルロースがグルコマンナンとして存在してもよい。例えばこれらの多糖類のグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、果糖、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルクロン酸、およびその他のヘキソースおよび五炭糖などのモノマーおよび多量体の双方をはじめとする可溶性糖への酵素加水分解は、協調して作用する異なる酵素作用の下で起きる。
(ヘミセルロース系をはじめとする)リグノセルロース系材料から、本発明に従って発酵させてもよい糖を放出させるために前処理が望ましいこともあり得る。このステップは、例えば以下のような従来の方法で実施してもよい。
酵素加水分解は、従来の方法で実施してもよい。
発酵工程は、好気的または嫌気的発酵工程であってもよい。嫌気的発酵工程は、本明細書で、酸素不在下で進行する発酵工程、またはその中で実質的に酸素が消費されず、好ましくは約5、約2.5または約1mmol/L/h未満、より好ましくは0mmol/L/h未満が消費され(すなわち酸素消費が検出可能でない)、その中で有機分子が電子供与体および電子受容体の双方の役割を果たす発酵工程と定義される。酸素の不在下で、解糖およびバイオマス形成中に生じるNADHは、酸化的リン酸化によって酸化され得ない。この問題を解決するために、多数の微生物は、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の1つを使用し、それによってNAD+を再生する。
同時糖化および発酵(SSF)様式では、液化/加水分解または前糖化工程のための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースからグルコースへの収率を実現する時間に左右される。このような収率は、好ましくは可能な限り高く、好ましくは60%以上、65%以上、70%以上、75%以上80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上または99.9%以上でさえある。
SSF操作では、生成物濃度(g/L)は生成されるグルコース量に左右されるが、糖はSSF中で生成物に転換され、生成物濃度は、理論的な最小収率の増大により根底にあるグルコース濃度に関連し得る(Yps maxは、グルコース1グラム当たりの生成物グラムである)ので、これは目に見えない。
SSF操作では、生成物濃度は、25g*Yps g/L/L以上、30*Yps g/L以上、35g*Yps/L以上、40*Yps g/L以上、45*Yps g/L以上、50*Yps g/L以上、55*Yps g/L以上、60*Yps g/L以上、65*Yps g/L以上、70*Yps g/L以上、75*Yps g/L以上、80*Yps g/L以上、85*Yps g/L以上、90*Yps g/L以上、95*Yps g/L以上、100*Yps g/L以上、110*Yps g/L以上、120g/L*Yps以上であり、または例えば25*Yps g/L〜250*Yps g/L、30*Yps gl/L〜200*Yps g/L、40*Yps g/L〜200*Yps g/L、50*Yps g/L〜200*Yps g/L、60*Yps g/L〜200*Yps g/L、70*Yps g/L〜200*Yps g/L、80*Yps g/L〜200*Yps g/L、90*Yps g/L、80*Yps g/L〜200*Yps g/Lであってもよい。
a.本明細書に記載される方法を使用してリグノセルロースを分解するステップと;
b.得られた物質を発酵し、
それによって発酵産物を調製するステップ
を含んでなる。
本発明の発酵産物は、いかなる有用な生成物であってもよい。一実施態様では、これは、エタノール;n−ブタノール;イソブタノール;乳酸;3−ヒドロキシ−プロピオン酸;アクリル酸;酢酸;コハク酸;フマル酸;リンゴ酸;イタコン酸;マレイン酸;クエン酸;アジピン酸;リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸などのアミノ酸;1,3−プロパン−ジオール;エチレン;グリセロール;β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン;ビタミン;医薬品;動物飼料補給剤;特殊化学薬品;化学原料;プラスチック;溶剤;生物燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーをはじめとする燃料;およびプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシド還元酵素、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される生成物である。
発酵生成物の回収のためには、既存の技術が使用される。異なる発酵産物では、異なる回収工程が適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分留および吸着技術を使用する。例えばビール蒸留缶を使用して、エタノールを水性混合物中に含有する発酵産物を処理して濃縮エタノール含有混合物を生成し、次に分留(例えば分別蒸留またはその他の類似技術)を実施し得る。次に最高濃度のエタノールを含有する留分を吸収材に通過させ、エタノールから残りの水の全部ではないが大部分を除去し得る。
特に断りのない限り、使用された方法は標準生化学的技術である。適切な一般方法の教科書は例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989)and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons,Inc.を含む。
S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)の形質転換は、Gietz and Woods(2002;Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Methods in Enzymology 350:87−96)に記載されるようにして実施した。
単一コロニー分離株をプラスチック爪楊枝で拾って50μlミリQ水に再懸濁した。サンプルを99℃で10分間インキュベートした。5μlのインキュベートしたサンプルをPhusion(登録商標)DNAポリメラーゼ(Finnzymes)を使用したPCR反応のためのテンプレートとして、供給元によって提供される使用説明書に従って使用した。
成長実験:サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)株を以下の組成を有する培地上で成長させた。0.67%(w/v)酵母窒素ベースまたは合成培地(Verduyn et al.,Yeast 8:501−517,1992)およびグルコース、アラビノース、ガラクトースまたはキシロースのいずれか、またはこれらの基質の組み合わせ(下記参照)。寒天プレートでは、培地に2%(w/v)細菌用寒天を添加した。
培養は、30℃でBAM(Biological Activity Monitor;オランダ国(The Netherlands)のHalotec)内において、100mlの合成モデル培地(5%グルコース、5%キシロース、3.5%アラビノースおよび1〜1.5%ガラクトースを添加したVerduyn培地(Verduyn et al.,Yeast 8:501−517,1992))中で実施した。滅菌に先だって、培地のpHを2MのNaOH/H2SO4で4.2に調節した。嫌気的培養のための合成培地に、エタノールに溶解させた0.01g/Lのエルゴステロールおよび0.42g/LのTween80を添加した(Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.41:23−36,1953;およびAndreasen and Stier.J.Cell Physiol.43:271−281,1954)。培養物を磁気撹拌機によって撹拌した。培養物に通気しなかったために、嫌気的条件は発酵中に迅速に発生した。CO2の生成を絶えずモニターした。糖転換および生成物形成をNMRによって分析した。培養物の光学濃度をLKB Ultrospec K分光光度計上で600nmで追跡することにより、成長をモニターした。
「S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ゲノムへの遺伝子araA、araB、およびaraDの導入]
[1.1 アラビノース経路の遺伝子を含有する発現ベクターの構築]
図2に記載されるプラスミドpPWT018を次のようにして構築した。ベクターpPWT006(図1、SIT2遺伝子座からなる(Gottlin−Ninfa and Kaback(1986)Molecular and Cell Biology vol.6,no.6,2185−2197))と、抗生物質G418上およびアセトアミド上で成長する能力(上記参照)により形質転換体を選択できるようにするマーカーとを制限酵素BsiWIおよびMluIで消化した。G418耐性をもたらすkanMX−マーカーは、p427TEF(Dualsystems Biotech)から単離され、amdSマーカーを含有する断片については文献で記載されている(Swinkels,B.W.,Noordermeer,A.C.M.and Renniers,A.C.H.M(1995)The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant,bidirectional selectable marker for yeast transformation.Yeast Volume 11,Issue 1995A,page S579;および米国特許第6051431号明細書)。国際公開第2008/041840号パンフレットで開示されるような、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)からのアラビノースイソメラーゼ(araA)、L−リブロキナーゼ(araB)、およびL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ(araD)をコードする遺伝子は、のBaseClear(オランダ国ライデン(Leiden,The Netherlands))によって合成された。S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)からの強力なプロモーター、すなわちaraA遺伝子の発現を制御するTDH3プロモーター、araB遺伝子を制御するENO1プロモーター、およびaraD遺伝子を制御するPGI1プロモーターの制御下にある(またはそれらと作動可能に結合している)上述の3つのアラビノース遺伝子を含む、1個の大きな断片が合成された。この断片は、ユニークな制限酵素Acc65lおよびMluIで取り囲まれた。この断片のpPWT006へのクローニング、BsiWIおよびMluIによる消化は、プラスミドpPWT018をもたらした(図2)。プラスミドpPWT018の配列を配列番号17で記載する。
供給元によって提供される使用説明書に従って、あらかじめSfiI(New England Biolabs)で直線化したプラスミドpPWT018でCEN.PK113−7D[MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2−8 SUC2)を形質転換した。合成SfiI部位をSIT2遺伝子の5’−flank中にデザインした(図2参照)。形質転換混合物を1ml当たり100μgのG418(シグマアルドリッチ(Sigma Aldrich))を含有するYPD−寒天(1リットル当たり10グラムの酵母抽出物、1リットル当たり20グラムのペプトン、1リットル当たり20グラムのデキストロース、20グラムの寒天)上に播種した。2〜4日後にはコロニーがプレート上に出現したが、陰性対照(すなわち形質転換実験中でDNA添加なし)はブランクのYPD/G418プレートをもたらした。プラスミドpPWT018の組み込みは、SIT2遺伝子座を対象とする。質転換体は、PCRおよびサザンブロット技術を使用して特性決定した。
同一選択マーカーを使用して、酵母株をその他のコンストラクトで形質転換できるようにするためには、選択可能なマーカーを除去することが必要である。プラスミドpPWT018のデザインによって、染色体へのpPWT018組み込みに際し、相同的な配列が互いにごく接近するようになる。このデザインは、これらの相同領域の突発性分子内組み換えによって、選択可能なマーカーが喪失できるようにする。
遺伝子araA、araB、およびaraDを構成的に発現するサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)BIE104A2をプラスミドpPWT080で形質転換した(図5)。プラスミドpPWT080の配列は、配列番号4に記載される。1コピーの形質転換体を選択した後の形質転換および選択手順は、1.1、1.2、および1.3節で上述したのと同じであった。手短に言えば、BIE104A2をSfiI消化pPWT080で形質転換した。形質転換混合物を1mlあたり100μgのG418(シグマアルドリッチ)を含有するYPD寒天(1リットル当たり10グラムの酵母抽出物、1リットル当たり20グラムのペプトン、1リットル当たり20グラムのデキストロース、20グラムの寒天)上に播種した。
[適応進化]
[2.1 適応進化(好気的)]
BIE104A2P1株の単一コロニー分離株を使用して、2%ガラクトースを添加したYNB培地(ディフコ)に接種した。前培養を30℃および280rpmでおよそ24時間インキュベートした。細胞を収集して、0.2の開始OD600で1%ガラクトースおよび1%アラビノースを含有するYNB培地に接種した(図8)。細胞を30℃および280rpmで成長させた。600nmでの光学濃度を定期的にモニターした。
好気的条件下におけるアラビノース上での成長適応後、BIE104A2P1c株からの単一コロニーを2%グルコースを添加したYNB培地上に接種した。前培養を30℃および280rpmでおよそ24時間インキュベートした。
[発酵能力測定]
BIE104、BIE104A2P1c、およびBIE201株の単一コロニー分離株を使用して、2%グルコースを添加したYNB培地(ディフコ)に接種した。前培養を30℃および280rpmでおよそ24時間インキュベートした。細胞を収集し、BAM内で合成モデル培地(Verduyn et al.,Yeast 8:501−517、1992;5%グルコース、5%キシロース、3.5%アラビノース、1%ガラクトース)におよそ2の開始OD600で接種した。CO2生成を絶えずモニターした。糖転換および生成物形成をNMRによって分析した。データは指定の糖の残留量(1リットルあたりのグルコース、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースのグラム数)および(副)生成物形成(エタノール、グリセロール)を表す。600nmで培養物の光学濃度を追跡して成長をモニターした(図10、11、12)。実験はおよそ140時間実施した。
グルコース 21.8
アラビノース 16.1
ガラクトース 6.6
合計 44.5
実験的エタノール収率0.45gエタノール/g糖
[糖転換に対するPPP遺伝子の影響]
PPP遺伝子が糖転換におよぼす影響を試験するために、BIE104A2およびBIE105A2株からの単一コロニーを2%グルコースを添加したYNB培地(ディフコ)に接種した。どちらの株もアラビノース遺伝子を含有し、アラビノース上での成長のために進化させた(実施例2、2.1節に記載されるように)。BIE105A2株は工業株のバックグラウンドを有する。しかしこれは前述したのと同じ方法およびコンストラクトで形質転換された(実施例1、1.2節)。
[キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする構成的に発現される遺伝子の導入]
[5.1 酵母形質転換]
BIE104A2P1株(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2−8 SUC2 SIT2::[TDH3−araA、ENO1−araB、PGI1−araD] ΔGRE3::[TPI1p−TAL1、ADH1p−TKL1、PGI1p−RPE1、ENO1 P−RKI1])をプラスミドpPWT042で形質転換した(図16)。プラスミドpPWT042は、ベクターpPWT007に由来する(図15)。それはPCT欧州特許第2009/52623号明細書で開示されるように、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)からのコドンペア最適化されたキシルロキナーゼ、およびバクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)からのコドンペア最適化されたキシロースイソメラーゼ(配列番号Q2)を含有する。BIE104A2P1の形質転換に先だって、供給元が提供する使用説明書に従って、制限酵素SfiIを使用してpPWT042を直線化した。形質転換混合物を1mlあたり100μgのG418(シグマアルドリッチ)を含有するYPD寒天(1リットル当たり10グラムの酵母抽出物、1リットル当たり20グラムのペプトン、1リットル当たり20グラムのデキストロース、20グラムの寒天)上に播種した。
BIE104A2P1Y9株の単一コロニー分離株を使用して、2%グルコースまたは2%ガラクトースを添加したYNB培地(ディフコ)に接種した。接種されたフラスコは、600nmでの光学濃度が少なくとも2.0の値に達するまで、30℃および280rpmでインキュベートした。
プラスミドpPWT042の組み込みによって導入された選択マーカー除去するために、コロニー分離株から開始して、BIE104A2P1Y9株をYPD培地中で培養した。25μlの一晩培養物を使用して新鮮なYPD培地に接種した。連続的移動後、培養物の光学濃度を測定し、1ml当たりおよそ5000個の濃度に細胞を希釈した。100μlの細胞懸濁液を30mMのKPi(pH6.8)、0.1%の(NH4)2SO4、40mMのフルオロ−アセトアミド(アマシャム)、および1.8%の寒天(ディフコ)を含有する酵母炭素ベース培地(ディフコ)に播種した。フルオロアセトアミド抵抗性コロニーにPCR分析を実施して、正確なPCRプロフィールの場合は、サザンブロット分析を実施した(実施例1、1.3節)。サザンブロット法で正確なバンドパターンを示す株の1つは、BIE104A2P1X9と命名された株である。
BIE104A2P1X9(BIE104A2P1X9a1およびBIE104A2P1X9a2)株の単一コロニー分離株を使用して、2%グルコースを添加したVerduyn培地(ディフコ)に接種した。接種したフラスコを30℃および280rpmでおよそ24時間インキュベートした。
[アラビノースおよびガラクトース上のコハク酸生成のためのS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)形質転換]
[6.1. 発現コンストラクト]
アクチノバチルス・サクシノジェネス(Actinobacillus succinogenes)からのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼPCKa(E.C.4.1.1.49)と、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)からのグリコソームフマル酸還元酵素FRDg(E.C.1.3.1.6)とを含んでなる発現コンストラクトpGBS414PPK−3、およびリゾプス・オリゼー(Rhizopus oryzae)からのフマラーゼ(E.C.4.2.1.2.)と、ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼMDH3(E.C.1.1.1.37)を含んでなる発現コンストラクトpGBS415FUM3を本明細書に図および配列表を含めて参照として組み込んだ国際公開第2009/065778号パンフレットの19〜20および22〜30頁で既述されたようにして作成する。
プラスミドpGBS414PPK−3、pGBS415−FUM−3をS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)株CEN.PK113−6B[MATA ura3−52 Ieu2−112 trp1−289)に形質転換する。さらにプラスミドpGBS416ARAABDをこの酵母に形質転換して、原栄養酵母株を作り出す。発現ベクターを電気穿孔によって酵母に形質転換する。形質転換混合物を酵母窒素ベース(YNB)w/o AA(ディフコ)+2%グルコース上に播種する。
形質転換体を2%ガラクトース(w/v)を含んでなるVerduyn培地(Verduyn et al.,1992,Yeast.Jul;8(7):501−17)からなる20mlの前培養液に接種して、好気的条件下で振盪恒温器内の100ml振盪フラスコ内で30℃および250rpmで成長させる。およそ24時間後、細胞を2%グルコース、2%ガラクトースまたは2%アラビノース、またはそれらの混合物のいずれかを含有する新鮮なVerduyn培地に4連で移す。2本のフラスコは好気的条件下でインキュベートし、2本のフラスコは、例えばウォーターロックを使用してフラスコを閉鎖して、または嫌気性軌道振盪機内でのインキュベーションによって、嫌気的条件下でインキュベートする。周期的に培養サンプルを採取する。サンプルを4750rpmで5分間遠心分離する。1mlの上清を使用し、6.4.節に記載されるようにしてHPLCによりコハク酸レベルを測定する。
有機酸および糖の定量のためにHPLCを実施する。Phenomenex Rezex−RHM−単糖類カラムの分離の原理は、逆相機序を使用した、サイズ排除、イオン排除、およびイオン交換に基づく。検出を示差屈折率および紫外線検出器によって実施する。
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Claims (15)
- a)サッカロミセス(Saccharomyces)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、分裂酵母(SchizoSaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)またはヤロウィア(Yarrowia)属に属する酵母の存在下で糖組成物を発酵させるステップと、
b)発酵産物を回収するステップを含んでなり、
前記酵母が遺伝子araA、araB、およびaraDを含んでなり、前記糖組成物がグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる、
糖組成物から1つ以上の発酵産物を生成する方法。 - 前記グルコース、ガラクトース、およびアラビノース糖が発酵産物に変換される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の発酵産物がエタノールである、請求項1または2に記載の方法。
- a)1つ以上のリグノセルロース系材料を前処理して前処理されたリグノセルロース系材料を生成するステップと;
b)前記前処理されたリグノセルロース系材料を酵素処理して前記糖組成物を生成するステップ
によって、前記糖組成物がリグノセルロース系材料から生成される、請求項の1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 混合糖細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)属のものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合糖細胞がサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項5に記載の方法。
- 前記混合糖細胞がアルドース還元酵素遺伝子の欠失を含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵が嫌気的または酸素限定条件下で実施される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合糖細胞が、過剰発現されたPPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1、およびRKI1を含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合糖細胞がxylA遺伝子および/またはXKS1遺伝子を含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、
a)強力なプロモーター制御下のPPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1およびRKI1からなるクラスター;
b)どちらも構成的プロモーター制御下のxylA遺伝子およびXKS1遺伝子からなるクラスター;
c)遺伝子araA、araB、およびaraDからなるクラスターおよび/またはxylA遺伝子およびXKS1遺伝子のクラスター;
d)アルドース還元酵素遺伝子の欠失
の宿主細胞への導入と、前記混合糖細胞を生じる混合糖コンストラクトの適応進化によって、前記混合糖細胞に導入される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞が阻害物質抵抗性細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記宿主細胞が工業株である、請求項11または12に記載の方法。
- 前記発酵産物が、エタノール;n−ブタノール;イソブタノール;乳酸;3−ヒドロキシ−プロピオン酸;アクリル酸;酢酸;コハク酸;フマル酸;リンゴ酸;イタコン酸;マレイン酸;クエン酸;アジピン酸;リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸などのアミノ酸;1,3−プロパン−ジオール;エチレン;グリセロール;β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン;ビタミン;医薬品;動物飼料補給剤;特殊化学薬品;化学原料;プラスチック;溶剤;生物燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーを含む燃料;およびプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシド還元酵素、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 発現を通じて、サッカロミセス(Saccharomyces)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、分裂酵母(SchizoSaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)またはヤロウィア(Yarrowia)属に属するグルコース発酵酵母に、グルコースの枯渇後に、アラビノースの存在下でガラクトースを嫌気的に発酵する能力をもたらす、遺伝子araA、araB、およびaraDの使用。
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