JP2022516572A - 合成分子フィードバック回路及びその使用方法 - Google Patents

合成分子フィードバック回路及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

分子フィードバック回路、並びにかかる分子フィードバック回路をコードする核酸、及び主題の分子フィードバック回路で遺伝子改変された細胞が提供される。分子フィードバック回路を使用して細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する方法、及び分子フィードバック回路をコードする核酸を含有する細胞を投与することによって症状について対象を治療する方法も提供される。本開示の分子フィードバック回路の態様は、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質を含む。かかる回路は、シグナル伝達経路の出力に応答し、発現されると、不活性化ドメインをトリガーしてシグナル伝達分子を不活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された調節配列を含み得る。

Description

連邦政府の資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国防高等研究計画局によって授与された助成金番号ＨＲ００１１－１６－２－００４５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
相互参照
本出願は、２０１９年１月７日に出願された米国仮出願第６２／７８９，４０２号の利益を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
序論
従来、細胞活性の所望の調節は、ユーザが提供する細胞系への反復的な入力によって制御されてきた。例えば、いくつかの医学的処置の文脈においては、長期間にわたる対象の細胞出力の所望のレベルは、処置の過程にわたって、薬剤の投与、評価、再投与、及び再評価のサイクルを反復することによって達成される。同様に、生物生産用途及び代謝工学では、産生細胞に所望の収率で産生物を出力させるために、例えば、増殖因子を補充すること、及び／又は毒性副産物を取り除くことによって、増殖培地を繰り返し増強する。
所望のタスクを実行するための操作された細胞の能力、及びかかる操作された細胞を産生するための方法は、過去数十年間の間に大きく進歩した。例えば、合成生物学及びシステム代謝工学技術における最近の進歩は、再生可能なバイオマス資源から工業関連のバルク及びファインケミカルを環境に優しい方法で生産する微生物細胞工場の可能性をもたらす。さらに、ユーザが定義する様々な標的を対象とし得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法などのデザイナー細胞療法は、臨床において大いに期待されており、広く採用され、規制当局の承認を継続的に得ている。
例えば、上記のような様々な目的に使用される、このような操作された細胞の出力は、いったん対象に投与されるか、バイオリアクター内で発動すると、追加的なユーザ入力がなくても持続する。操作された細胞の出力を調節するための調整は、例えば、小分子の形での外部入力、又は、その他の刺激若しくはユーザが実行する操作を用いてなされる。
分子フィードバック回路、並びにかかる分子フィードバック回路をコードする核酸、及び主題の分子フィードバック回路で遺伝子改変された細胞が提供される。分子フィードバック回路を使用して細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する方法、及び分子フィードバック回路をコードする核酸を含有する細胞を投与することによって症状について対象を治療する方法も提供される。本開示の分子フィードバック回路の態様は、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質を含む。かかる回路は、シグナル伝達経路の出力に応答し、発現されると、不活性化ドメインをトリガーしてシグナル伝達分子を不活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された調節配列を含み得る。
任意の実施形態では、シグナル伝達タンパク質は、ケージドデグロンを含まない。言い換えれば、任意の実施形態において、シグナル伝達タンパク質は、（ａ）デグロン、（ｂ）５つのアルファヘリックスを含むロッカードメイン、及び（ｃ）アルファヘリックスを含むラッチドメインを含まず、（ｉ）キーポリペプチドの非存在下で、ロッカードメインと６ヘリックスバンドルを形成してデグロンをケージングし、シグナル伝達タンパク質の分解を防止し、（ｉｉ）キーポリペプチドの存在下で、デグロンがアンケージングされ、シグナル伝達タンパク質が分解され、ここで、キーポリペプチドは、ロッカードメインにラッチドメインよりも高い親和性で結合するアルファヘリックスを含み得る。かかるケージドデグロン分子は、米国仮出願第６２／７８９，４１８号（２０１９年１月７日出願）、第６２／８５０，３３６号（２０１９年５月２０日出願）、及び２０１９年１月７日に出願された第６２／７８９，３５１号に記載されており、これらの出願は参照により本明細書に組み込まれる。
図１は、本明細書に記載のシグナル伝達経路を概略的に示す図である。
図２は、本明細書に記載の図１のシグナル伝達経路の正の調節メンバーに結合した潜在性不活性化ドメインを有するシグナル伝達経路を概略的に示す図である。
図３は、本明細書に記載される図２の概略的に示されたシグナル伝達経路における潜在性不活性化ドメインの活性化を示す図である。
図４は、本明細書に記載の図１のシグナル伝達経路の負の調節メンバーに結合した潜在性不活性化ドメインを有するシグナル伝達経路を概略的に示す図である。
図５は、本明細書に記載の合成Ｎｏｔｃｈ受容体を用いる分子フィードバック回路ストラテジーを概略的に示す図である。
図６は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いる分子フィードバック回路ストラテジーを概略的に示す。
図７は、本開示に記載のフィードバック回路の例におけるフィードバックを制御するための様々なストラテジーを概略的に示す図である。
図８は、本明細書に記載の回路におけるフィードバックを制御するための隔離ベースのストラテジーの一例を概略的に示す図である。
図９は、本明細書に記載の回路におけるフィードバックを制御するための隔離ベースのストラテジーの一例の代替図である。
図１０は、本開示の隔離ベースのフィードバック回路の一例を使用したフィードバック制御を示す図である。
図１１は、ロイシンジッパー転写因子及びロイシンジッパー転写因子のドミナントネガティブ阻害因子を概略的に示す図である。
図１２は、本明細書に記載の回路におけるフィードバックを制御するための競合ベースのストラテジーの一例を概略的に示す図である。
図１３は、本開示の競合ベースのフィードバック回路の一例を使用したフィードバック制御を示す図である。
図１４は、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲベースのフィードバック回路又は生物学的経路の制御の概略図である。
図１５は、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲで試験した接合経路調節因子のパネルを提供する図である。
図１６は、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲモジュールが接合経路の合成フィードバック制御を成功裏に実施することを実証する図である。
図１７は、合成回路の制御によって定量化されたｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックモジュールの動作特性を示す図である。 図１７は、合成回路の制御によって定量化されたｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックモジュールの動作特性を示す図である。
図１８は、正又は負の外乱に応答した定常状態の解を提供する図である。
図１９は、Ｅ２の固定用量に対するＰｇの関数である回路挙動を示す図である。
図２０は、固定用量のＰｇに対するＥ２の関数である回路挙動を示す図である。
図２１は、異なる量のキーを構成的に発現させるときの回路挙動を示す図である。
図２２は、ＤｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ合成フィードバックストラテジーが予測どおりに調整可能であることを実証する図である。 図２２は、ＤｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ合成フィードバックストラテジーが予測どおりに調整可能であることを実証する図である。
図２３は、プロモーター強度又はキー長の変更がフィードバックゲインを調節することを実証する図である。
図２４は、フィードバック強度を調整すると回路出力の動的挙動が変化することを示す図である。
図２５は、接合経路における合成フィードバックの組み合わせ調整を示す図である。
図２６は、ｎｅｓＬＯＣＫＲを使用したタンパク質局在化の制御を示す図である。
図２７は、Ｋｅｙが発現される場合のｎｅｓＬＯＣＫＲの細胞質ゾル凝集を示す図である。
図２８は、ｔａｇＢＦＰの蛍光ヒストグラム（左パネル）及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光ヒストグラム（右パネル）を示す図である。
図２９は、フィードバックなしとフィードバックありの回路図（上のパネル）、及び、薬物の存在下の回路及び非存在下の回路の両方の出力及びキー蛍光を比較した代表的なヒストグラム（下のパネル）を示す図である。
図３０は、異なるフィードバック変異体の出力（左パネル）と、フィードバックなしの回路及びｍＣＭＶ－Ｋｅｙを有するフィードバック回路の正規化された出力（右パネル）との比較を示す図である。
定義
本明細書で使用される「合成の」、「キメラの」及び「操作された」という用語は、一般に、人工的に誘導されたポリペプチド、又はポリペプチドをコードする天然に存在しない核酸を指す。合成ポリペプチド及び／又は核酸は、例えば、単一アミノ酸や単一ヌクレオチドなどを含む塩基性サブユニットから新規に構築してもよく、又は、天然由来か、若しくは、例えば、遺伝子組換え手法によって人工的に誘導されたかにかかわらず、既存のポリペプチド又はポリヌクレオチドから誘導してもよい。キメラポリペプチド及び操作されたポリペプチド、又はポリペプチドをコードする核酸は、一般に、２つ以上の異なるポリペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸、又は、ポリペプチドドメイン若しくはポリペプチドドメインをコードする核酸の組み合わせ、接合、又は融合によって構築される。キメラポリペプチド及び操作されたポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸は、連結された２つ以上のポリペプチド又は核酸「部分」が異なるタンパク質（又は、異なるタンパク質をコードする核酸）に由来する場合、並びに、連結された部分が同じタンパク質（又は、タンパク質をコードする核酸）の異なる領域を含むが、当該部分が天然では起こり得ない態様で連結されている場合を含む。
本明細書で使用される「組換え体」という用語は、核酸分子、例えば、ゲノムのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡのポリヌクレオチド、ウイルスのポリヌクレオチド、半合成のポリヌクレオチド、及び／又は、その起源若しくは操作のために自然界でそれが関連するポリヌクレオチド配列の全部又は一部と関連していない合成起源のポリヌクレオチドを表す。タンパク質又はポリペプチドに関して使用される組換え体という用語は、組換えポリヌクレオチドからの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞又はウイルスに関して使用される組換え体という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞又はウイルスを意味する。組換え体はまた、材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）に関して、その材料が異種材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）の導入によって改変されていることを指すために本明細書で使用される。
「作動可能に連結された」という用語は、そのように説明される構成要素が、その意図された態様での機能を可能にする関係性をもって並置されていることを指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結された核酸配列は、隣接していてもよいが、必ずしもその必要はない。例えば、場合によって、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列は、プロモーターに隣接していてもよい。場合によって、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列は、コード配列及び非コード配列を含む１又はそれ以上の介在配列によって分離され得る。また、場合によって、３つ以上の配列が作動可能に連結されてもよく、例えば、２つ以上のコード配列が単一のプロモーターに作動可能に連結される場合が含まれるが、これに限定されない。
「生体試料」は、個体又は個体の集団から得られた様々な試料タイプを包含し、例えば、細胞又は生物学的分子の単離や診断アッセイなどを含む様々な方法で使用することができる。この定義は、生物由来の血液及び他の液体試料や、生検標本又は組織培養物又はそれらに由来する細胞及びそれらの子孫などの固体組織試料を包含する。この定義はまた、それらの調達後に何らかの方法、例えば、個々の試料の混合又は貯蔵、試薬による処理、可溶化、又は、特定の要素（例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）の濃縮などによって操作された試料も含む。「生体試料」という用語は臨床試料を包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織試料も含む。「生体試料」という用語は、尿、唾液、脳脊髄液、間質液、眼液、滑液、血液画分（例えば、血漿や血清）などを含む。「生体試料」という用語には、固体組織試料、組織培養試料、及び細胞試料も含まれる。したがって、生体試料は、細胞試料又は無細胞試料であり得る。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖若しくは多本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は、他の天然のヌクレオチド塩基、化学的若しくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これには、遺伝子コードアミノ酸及び非遺伝子コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、及び改変ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語は、融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無を問わない異種及び同種のリーダー配列を有する融合物、免疫学的にタグ付されたタンパク質などを含むが、これらに限定されない。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」が、細胞内で、結合したセグメントの複製をもたらすように結合することができるレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどである。
本明細書で互換的に使用される「ドメイン」及び「モチーフ」という用語は、１又はそれ以上の特定の機能を有する構造化ドメインと、構造化されていないが１又はそれ以上の特定の機能を保持するポリペプチドの非構造化セグメントの両方を指す。例えば、構造化ドメインは、ポリペプチドの特定の機能に寄与する三次元構造を含む折り畳まれたポリペプチドの中に、限定するものではないが、連続する又は不連続な複数のアミノ酸又はその一部を包含し得る。他の例では、ドメインは、２つ以上の複数のアミノ酸又はその一部を含み、折り畳まれていないか又は不規則なポリペプチドの特定の機能を維持する、ポリペプチドの非構造化セグメントを含み得る。この定義には、不規則又は非構造化であり得るが、標的又は結合パートナーと会合すると構造化され又は規則的になるドメインも包含される。本質的に構造化されていないドメイン及び本質的に構造化されていないタンパク質のドメインの非限定的な例は、例えば、Ｄｙｓｏｎ＆Ｗｒｉｇｈｔ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１９７－２０８に記載されている。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性の少なくとも１倍大きく、少なくとも２倍大きく、少なくとも３倍大きく、少なくとも４倍大きく、少なくとも５倍大きく、少なくとも６倍大きく、少なくとも７倍大きく、少なくとも８倍大きく、少なくとも９倍大きく、少なくとも１０倍大きく、少なくとも２０倍大きく、少なくとも３０倍大きく、少なくとも４０倍大きく、少なくとも５０倍大きく、少なくとも６０倍大きく、少なくとも７０倍大きく、少なくとも８０倍大きく、少なくとも９０倍大きく、少なくとも１００倍大きく、若しくは少なくとも１０００倍大きく、又はそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）から約０．１ｎＭ、約１００ｎＭから約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭから約１フェムトモル（ｆＭ）以上であり得る。
「結合」という用語は、例えば、共有結合性相互作用、静電性相互作用、疎水性相互作用、並びに、イオン結合及び／又は水素結合相互作用による２つの分子間の直接会合を指し、塩架橋や水架橋などの相互作用を含む。非特異的結合は、約１０－７Ｍ未満の親和性での結合を指し、例えば、１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍなどの親和性での結合を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であり得、並びに／又は、疾患及び／又はその疾患に起因する有害作用を部分的又は完全に治癒するという点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物（例えば、ヒト）の疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい素因を有する可能性があるが、その疾患があるとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）、及び、（ｃ）疾患を軽減すること（すなわち、疾患の退行を引き起こすこと）を含む、方法。
本明細書で互換的に使用される用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、限定するものではないが、マウス（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指す。
「治療有効量」又は「有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の対象に投与されるときに、その疾患のかかる治療を達成するのに十分な１つの薬剤の量、又は２つの薬剤を組み合わせた量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なる。
本明細書で互換的に使用される「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」という用語は、一般に、排他的にではないが、細胞外ドメイン（例えば、リガンド／抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び１又はそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、免疫細胞の活性化をトリガー又は阻害することができる人工マルチモジュール分子を指す。ＣＡＲという用語は、厳密には、ＣＡＲ分子に限定されず、ＣＡＲの変異体も含む。ＣＡＲ変異体には、ＣＡＲの細胞外部分（例えば、リガンド結合部分）及び細胞内部分（例えば、細胞内シグナル伝達部分）が２つの別個の分子上に存在する分割ＣＡＲが含まれる。ＣＡＲ変異体はまた、条件付きで活性化可能なＣＡＲであるオンスイッチＣＡＲを含み、例えば、その２つの部分の条件付きヘテロ二量体化が薬理学的に制御されている分割ＣＡＲ（例えば、国際公開第２０１４／１２７２６１号、及び米国特許出願公開第２０１５／０３６８３４２号に記載されているように、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。ＣＡＲ変異体には、一次ＣＡＲの活性を増幅又は阻害することができる二次ＣＡＲ結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲも含まれる。ＣＡＲ変異体には、例えば、二次ＣＡＲ結合ドメインの結合が一次ＣＡＲ活性化の阻害をもたらす二重特異性ＣＡＲ系の構成要素として使用され得る阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）も含まれる。ＣＡＲ分子及びその誘導体（すなわち、ＣＡＲ変異体）は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０１６５２７；Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１３）；５（２１５）：２１５ ｒａ １７２；Ｇｌｉｅｎｋｅら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１５）６：２１；Ｋａｋａｒｌａ＆Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ５２ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ（２０１４）２０（２）：１５１－５；Ｒｉｄｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ（２０１４）２０（２）：１４１－４；Ｐｅｇｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ（２０１４）２０（２）：１２７－３３；Ｃｈｅａｄｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）：９１－１０６；Ｂａｒｒｅｔｔら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ（２０１４）６５：３３３－４７；Ｓａｄｅｌａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ（２０１３）３（４）：３８８－９８；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）９５６３０４；に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。有用なＣＡＲには、ノバルティス（スイス、バーゼル）によって市販されているレンチウイルス搭載ＣＴＬ０１９（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）ＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現される抗ＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζＣＡＲも含まれる。用語「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」には、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲ及びＰＮＥ ＣＡＲも含まれる（例えば、Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ ２０１８ １７３：１４２６－１４３８及びＲｏｄｇｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１６ １１３：Ｅ ４５９－４６８を参照されたい）。
「Ｔ細胞受容体」及び「ＴＣＲ」という用語は、互換的に使用され、一般に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識する役割を果たす、Ｔ細胞又はＴリンパ球の表面に見られる分子を指す。ＴＣＲ複合体は、通常、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなるジスルフィド結合膜固定ヘテロ二量体タンパク質である。多くの天然ＴＣＲは、ヘテロ二量体αβ形態又はヘテロ二量体γδ形態で存在する。ヘテロ二量体αβ形態の完全な内因性ＴＣＲ複合体は、８本の鎖、すなわち、アルファ鎖（本明細書ではＴＣＲα又はＴＣＲアルファと呼ばれる）、ベータ鎖（本明細書ではＴＣＲβ又はＴＣＲベータと呼ばれる）、デルタ鎖、ガンマ鎖、２つのイプシロン鎖、及び２つのゼータ鎖を含む。いくつかの例では、ＴＣＲは、一般に、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のみへの言及として参照されるが、集合したＴＣＲ複合体は、内因性のデルタ鎖、ガンマ鎖、イプシロン鎖及び／又はゼータ鎖と会合し得るので、当業者は、細胞膜に存在するＴＣＲへの言及は、必要に応じて、完全に又は部分的に集合したＴＣＲ複合体への言及を含み得ることを容易に理解するであろう。
組換え体又は操作された個々のＴＣＲ鎖及びＴＣＲ複合体が開発されている。治療の文脈におけるＴＣＲの使用への言及は、個々の組換えＴＣＲ鎖を指す場合がある。したがって、操作されたＴＣＲは、個々の改変ＴＣＲα鎖又は改変ＴＣＲβ鎖、並びに、連結ポリペプチドによって単一のポリペプチドに連結された改変及び／又は非改変のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含む一本鎖ＴＣＲを含み得る。
本明細書で互換的に使用される「合成Ｎｏｔｃｈ受容体」、「ｓｙｎＮｏｔｃｈ」及び「ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体」という用語は、細胞外結合ドメイン、少なくとも１つのタンパク質分解性切断部位を含むＮｏｔｃｈ受容体の一部、及びシグナル伝達機能を提供する細胞内ドメインを少なくとも含む組換えキメラ結合トリガー転写スイッチを指す。ＳｙｎＮｏｔｃｈポリペプチド、その要素及びそれを使用する方法は、米国特許第９，８３４，６０８号及び同第９，６７０，２８１号、並びに、Ｔｏｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）３６１（６３９８）：１５６－１６；Ｒｏｙｂａｌ＆Ｌｉｍ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１７）３５：２２９－２５３；Ｌｉｍ＆Ｊｕｎｅ Ｃｅｌｌ．（２０１７）１６８（４）：７２４－７４０；Ｒｏｙｂａｌら、Ｃｅｌｌ．（２０１６）１６７（２）：４１９－４３２．ｅ １６；Ｒｏｙｂａｌら、Ｃｅｌｌ．（２０１６）１６４（４）：７７０－９；及びＭｏｒｓｕｔら、Ｃｅｌｌ．（２０１６）１６４（４）：７８０－９１；に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、説明された特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも併せて理解されたい。
値の範囲が提示される場合、その範囲の上限と下限との間に介在する、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各値、及び、宣言された範囲内の他の宣言された又は介在する任意の値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、これらもまた、宣言された範囲内で具体的に除外された任意の限界を条件として、本発明に包含される。宣言された範囲がその限界の一方又は両方を含む場合、その含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここでは、好ましい方法及び材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料が開示及び説明される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「回路」への言及は、複数のかかる回路を含み、「核酸」への言及は、当業者に公知の１又はそれ以上の核酸及びその均等物などへの言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることが知られている。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関して「もっぱら」、「のみ」などの排他的な用語を用いる場合、又は、「否定的な」限定を用いる場合に、先行的な根拠として機能することが意図されている。
明確にするために別々の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切な部分的組み合わせで提供されてもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含されており、あたかもその一つ一つの組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示されている。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含されており、あたかもそのような部分的組み合わせの一つ一つが個別に明示的に本明細書に開示されているかのように本明細書に開示されている。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に関してのみ提供される。本明細書のいかなる記載も、先行発明のせいで、本発明がかかる刊行物に先行する権利を付与されないということを承認していると解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、独立して確認する必要があり得る実際の公開日とは異なる場合がある。
詳細な説明
分子フィードバック回路、並びにかかる分子フィードバック回路をコードする核酸、及び主題の分子フィードバック回路で遺伝子改変された細胞が提供される。分子フィードバック回路を使用して細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する方法、及び分子フィードバック回路をコードする核酸を含有する細胞を投与することによって症状について対象を治療する方法も提供される。本開示の分子フィードバック回路の態様は、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質を含む。かかる回路は、シグナル伝達経路の出力に応答し、発現されると、不活性化ドメインをトリガーしてシグナル伝達分子を不活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された調節配列を含み得る。
分子回路
本開示の分子回路は、場合によって、全体的又は部分的に、核酸配列によってコードされ得る。かかる回路は、場合によって、発現ベクター及び／又は発現カセットに存在し得、かつ／又は、構成され得る。本発明の回路の主題の核酸は、場合によって、例えば、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むベクター内に含まれ得る。かかる回路は、場合によって、細胞（例えば、免疫細胞、幹細胞）内に存在してもよく、又は、例えば、ウイルスベクターの使用を含む様々な手段によって細胞に導入されてもよい。細胞は、場合によって、主題の回路を含有し、かつ／又は、コードするように遺伝子改変され得、かかる改変は、所望に応じて、実質的に永続的（例えば、組み込む）であってもよいし、かつ又は、一過性であってもよい。
その構成要素がモジュール式である本開示の回路は、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質を含み得る。本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」という用語は、一般に、以下でより詳細に説明する、天然及び合成のシグナル伝達経路を含むシグナル伝達経路のタンパク質を指す。任意の便利なシグナル伝達経路の任意の便利で好適なシグナル伝達タンパク質を使用することができる。一般に、シグナル伝達タンパク質は、シグナル伝達タンパク質が会合するシグナル伝達経路の入力によって活性化され得るタンパク質を含む。シグナル伝達経路は、シグナル伝達タンパク質の機能に依存するか、少なくともその機能に影響を受ける出力を生成し得る。かかる出力は、入力に対するシグナル伝達タンパク質の応答の直接的又は間接的な結果であり得る。有用なシグナル伝達タンパク質には、入力受容メンバー、中間メンバー及び出力産生メンバーを含む、シグナル伝達経路の任意の好都合で適切なポイントからのメンバーが含まれる。
本明細書で使用される「入力受容メンバー」とは、一般に、シグナル伝達経路に沿ってシグナル伝達を開始するための入力を受容するシグナル伝達経路の最初の構成要素を意味する。入力受容メンバーの例としては、例えば、細胞外受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体、プロテインキナーゼ、インテグリン、Ｔｏｌｌ様受容体、リガンド依存性イオンチャネルなど）及び細胞内受容体（例えば、核受容体、細胞質受容体など）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によって、入力受容メンバーは、シグナル伝達経路のリガンド入力などのシグナル伝達経路の入力に直接結合するタンパク質であり得る。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、入力受容メンバーであり得る。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、入力受容メンバーでなくてもよく、例えば、中間メンバー又は出力産生メンバーであってもよい。
本明細書で使用される「中間メンバー」とは、一般に、シグナル伝達に必要とされるか、又は少なくともそれに関与するが、シグナル伝達経路の初期入力を直接受け取らないか、又はシグナル伝達経路の最終出力を直接生成し若しくは引き起こすシグナル伝達経路の構成要素を意味する。シグナル伝達経路の中間メンバーの例としては、例えば、酵素、結合パートナー、タンパク質複合体サブユニット、足場タンパク質、輸送タンパク質、コアクチベーター、コリプレッサーなどが挙げられるが、これらに限定されない。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、中間メンバーであり得る。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、中間メンバーでなくてもよく、例えば、入力受容メンバー又は出力産生メンバーであってもよい。
本明細書で使用される「出力産生メンバー」とは、一般に、シグナル伝達経路の出力を直接生成するか、さもなければ、シグナル伝達経路の出力を生じさせるシグナル伝達経路の構成要素を意味する。シグナル伝達経路の出力産生メンバーの例としては、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、転写因子、酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、出力産生メンバーであり得る。場合によって、本開示の回路に潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質は、出力産生メンバーでなくてもよく、例えば、入力受容メンバー又は中間メンバーであってもよい。
シグナル伝達経路の図式化された例を図１に示す。示されるように、シグナル伝達経路は、経路の入力受容メンバー１０１を活性化する入力１００を含む。入力受容メンバー１０１の活性化により、経路の第１の中間メンバー１０２が正に調節され、これにより、経路の第２の中間メンバー１０３が正に調節される。図示の経路において、第２の中間メンバー１０３は、第３の中間メンバー１０４によって負に調節されている。第３の中間メンバー１０４による阻害がない場合、第２の中間メンバー１０３は、経路の出力産生メンバー１０５を正に調節する。したがって、第２の中間メンバー１０３による活性化がなされる場合は、出力産生メンバー１０５は活性であり、シグナル伝達経路の出力をコードする配列１０６に作動可能に連結された調節領域１０７に結合する。
有用なシグナル伝達タンパク質は、シグナル伝達タンパク質が関連する１又はそれ以上のシグナル伝達経路の調節因子であり得、シグナル伝達タンパク質がシグナル伝達経路の負の調節因子又はシグナル伝達経路の正の調節因子であり得る場合を含む。したがって、本開示の分子フィードバック回路は、正のフィードバック回路と負のフィードバック回路とを含む。
例えば、場合によって、本開示の回路で使用されるシグナル伝達タンパク質は、活性化されると、シグナル伝達経路の出力を駆動し得る。したがって、潜在性不活性化ドメインをトリガーしてシグナル伝達タンパク質を不活性化することは、シグナル伝達経路の出力を負に調節し、その結果、負のフィードバックをもたらし得る。場合によって、本開示の回路に使用されるシグナル伝達タンパク質は、活性化されると、シグナル伝達経路の出力を阻害し得る。したがって、潜在性不活性化ドメインをトリガーしてシグナル伝達タンパク質を不活性化することは、シグナル伝達経路の出力を正に調節し、その結果、正のフィードバックをもたらし得る。
図２は、経路を正に調節する第１の中間シグナル伝達メンバー１０２が潜在性不活性化ドメイン２００を含むように改変されている、図１に示されるシグナル伝達経路を示す。したがって、潜在性不活性化ドメイン２００が潜在状態のままである場合、シグナル伝達経路を介したシグナル伝達は、入力１００から、入力受容メンバー１０１を介して、経路の下流要素を正に調節する第１の中間シグナル伝達メンバー１０２に進み、それにより、第３の中間メンバー（図示せず）による阻害がない場合、出力産生メンバー１０５は、配列１０６によってコードされる産物の発現として示されるシグナル伝達経路の出力を駆動する。
図３に示されるように、発現されたスイッチポリペプチド３００は、潜在性不活性化ドメイン２００を活性化し、第１の中間メンバー１０２の不活性化をもたらし、その結果、第１の中間メンバー１０２から第２の中間メンバー１０３及び経路のその後のポイントへの正のシグナル伝達の欠如をもたらす。したがって、配列１０６からの出力は生成されないか、又は低減される。
図４に示される別の例において、潜在性不活性化ドメイン４００が、阻害性の第３の中間メンバー１０４に結合している。したがって、潜在性不活性化ドメイン４００が潜在状態のままである場合、第３の中間メンバー１０４の存在は、第２の中間メンバーを負に調節し、それにより、出力配列１０６によってコードされる産物の発現及び産生を抑制する。これに対応して、潜在性不活性化ドメイン４００が発現されたスイッチポリペプチド４０１によって活性化されると、第３の中間メンバー１０４が不活性化され、それにより、第３の中間メンバー１０４による負の調節が妨げられ、経路１００が正に調節されて、出力の生成、すなわち、少なくとも配列１０６によってコードされる産物の発現の増加が促進される。
その発現がシグナル伝達経路の出力によって駆動されるスイッチポリペプチドと一体化された場合、潜在性不活性化ドメインを当該経路のシグナル伝達タンパク質にカップリングさせることにより、所望に応じて、正又は負のフィードバックがもたらされ得る。例えば、潜在性不活性化ドメインを正のシグナル伝達調節因子にカップリングすると、経路に対する負のフィードバックが生じるのに対して、潜在性不活性化ドメインを負の調節因子にカップリングすると、経路に対する正のフィードバックが生じる。場合によって、負の経路フィードバックを使用して応答を減衰させることができる一方で、場合によって、正の経路フィードバックを使用して応答を増幅するか、又は過感受性を生じさせることができる。すぐわかるように、本開示のフィードバック回路は高度にモジュール式であり、それゆえに、本明細書に記載の回路は、所望に応じて、容易に改変することができ、かつ／又は、本質的には任意の好都合で適切なシグナル伝達経路（例えば、プロモーターを介した測定可能な出力を伴うシグナル伝達経路を含む）に適用することができる。
フィードバック制御は、外乱を除去することによって物理的処理のロバストで安定した実行を可能にする。フィードバック制御の実装は、一般に、（１）プロセスの出力を測定又は「感知」する能力、（２）所望の出力又は「設定値」と出力測定値の比較に基づいて補正シグナルを生成するコントローラ、及び（３）制御対象のプロセスに補正シグナルを入力するか、又は「作動」させる方法、を含み得る。本明細書では、発現されたスイッチポリペプチドによってトリガーされる潜在性不活性化ドメインベースのタンパク質スイッチを利用して、生物系のフィードバック制御を生成する設計回路が提供される。具体的には、上記のものと同様の３つのモジュール、すなわち、（１）目的のプロセスの出力によって活性化されるセンシングプロモーター、（２）（３）の分解を活性化するセンシングプロモーターによって産生されるスイッチペプチド、（３）潜在性不活性化ドメインに融合されるシグナル伝達タンパク質（すなわち、転写因子、キナーゼなど）。これらのモジュールの各々は、プロセスの所望のフィードバック制御を達成するために、所望に応じて、単純な操作を介して独立して調整することができる。
本開示の回路で使用され得るシグナル伝達タンパク質には、シグナル伝達経路の内因性要素、及びシグナル伝達経路の異種要素又は合成要素であるシグナル伝達タンパク質が含まれる。シグナル伝達経路のかかる内因性要素、異種要素、及び／又は合成要素は、本開示の回路で使用するために、以下により詳細に記載される潜在性不活性化ドメインを含むように改変され得る。「シグナル伝達経路の内因性要素」とは、一般に、細胞内で天然に生じるシグナル伝達経路の要素を意味する。
「シグナル伝達経路の異種要素」とは、一般に、シグナル伝達経路で機能するが、主題の回路で使用される細胞又はシグナル伝達経路以外の細胞又はシグナル伝達経路に由来する要素を意味する。異種要素は、主題の回路のシグナル伝達経路とは別のシグナル伝達経路に由来し得る。異種要素は、主題の回路において調節されるシグナル伝達経路の細胞及び／又は生物とは異なる種類の細胞及び／又は異なる生物に由来し得る。例えば、場合によって、第１の生物（例えば、マウス）由来のシグナル伝達経路の要素は、第２の生物（例えば、ヒト）の対応するシグナル伝達経路で使用され得る。
「シグナル伝達経路の合成要素」とは、一般に、シグナル伝達経路において機能するが、天然に由来しない要素を意味する。非天然由来要素としては、例えば、類似体、模倣物、融合物、変異体、切断型、断片などを含む組換え要素が挙げられる。シグナル伝達経路の合成要素の非限定的な例には、合成受容体、合成酵素、合成コアクチベーター、合成共抑制因子、合成結合パートナー、合成足場タンパク質、合成転写因子などが含まれる。
本開示の回路は、１又はそれ以上の調節配列を使用することができ、その制御は、シグナル伝達タンパク質が会合するシグナル伝達経路の要素に依存し得る。例えば、場合によって、本開示の回路は、シグナル伝達経路の出力に応答する調節配列を含み得る。調節配列は、主題の回路の１又はそれ以上の要素をコードする１又はそれ以上の核酸配列に作動可能に連結され得る。例えば、調節配列は、スイッチポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。
場合によって、回路は、シグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列を含み得る。主題の回路のシグナル伝達タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された調節配列は、多様であり得、内因性調節配列及び異種調節配列を含み得、例えば、天然プロモーター、天然エンハンサー、異種プロモーター、異種エンハンサー、合成調節配列などを含むがこれらに限定されない。シグナル伝達タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された調節配列は、所望に応じて、構成性のものであってもよいし、又は誘導性のものであってもよい。場合によって、シグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列は、シグナル伝達タンパク質の天然プロモーターである。
場合によって、調節配列は、アウトプットの転写因子（例えば、転写因子がシグナル伝達経路において機能する内因性、異種、又は合成の転写因子である場合を含む）に対する１又はそれ以上（例えば、１以上、２以上、２から１０、３から１０、４から１０、５から１０、２から６、３から６、４から６、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の結合部位を含み得る。
本開示の回路の調節配列は、シグナル伝達経路の出力によって制御され得、さもなければ、その出力に応答し得る。例えば、場合によって、主題の回路が影響を及ぼすように構成されているシグナル伝達経路の出力は、コード配列に作動可能に連結された調節配列を介してコード配列の発現を誘導し得る。本開示の回路の構成要素をコードする配列の調節をシグナル伝達経路の出力に接続することによって、本開示の回路は、出力に応答するフィードバックを提供し得る。
本開示の回路に使用される有用なシグナル伝達経路出力は、多様であり得、調節配列を介して発現に直接的又は間接的に影響を及ぼすように構成され得る本質的に任意の出力を含み得る。有用なシグナル伝達経路の出力の非限定的な例としては、例えば、転写因子の活性（例えば、活性化、抑制など）、転写因子の発現、転写因子の転座、酵素の活性（例えば、活性化、抑制など）、酵素の発現、シグナル伝達分子の産生、シグナル伝達分子の分泌、細胞活性化（例えば、限定するものではないが、例えば、免疫活性化、免疫抑制、増殖などの天然の細胞プログラムの活性化を含む）などが挙げられるが、これらに限定されない。
シグナル伝達経路は、１又はそれ以上の入力によって調節（例えば、活性化、抑制など）され得る。シグナル伝達経路の入力は、多様であり得、シグナル伝達経路の内因性の（例えば、天然の）入力及び異種の（例えば、操作された又は合成の）シグナル伝達経路入力を含み得る。シグナル伝達経路及びシグナル伝達経路出力が天然又は合成であり得るように、シグナル伝達経路入力は、同様に天然又は合成であり得る。
天然のシグナル伝達経路は、多くの場合、その経路の天然又は自然の受容体によって制御され得る。天然のシグナル伝達経路の非限定的な例としては、例えば、ＡＫＴシグナル伝達経路、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、エストロゲンシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、免疫活性化経路、免疫抑制経路、免疫細胞分化経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路、ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、ｐ５３シグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、ＴＧＦベータシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＴＮＦシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
合成シグナル伝達経路の非限定的な例としては、合成又は操作された受容体（例えば、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、ｓｙｎＮｏｔｃｈなどであるが、これらに限定されない）によって制御される経路が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達経路は、以下においてより詳細に説明されている。
本開示の回路を使用して合成ｓｙｎＮｏｔｃｈシグナル伝達経路及び合成ＣＡＲシグナル伝達経路を調節する工程の図式化された例をそれぞれ図５及び図６に示す。図５に示されるように、抗原結合ドメイン５０１、タンパク質分解的に切断可能なＮｏｔｃｈドメイン５０２、及び合成転写因子（ｓｙｎＴＦ）部分５０３及び潜在性不活性化ドメイン５０４を含む細胞内シグナル伝達ドメインを有するｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体５００は、抗原入力５０５によってトリガーされて細胞内シグナル伝達ドメインを放出する。抗原結合後のｓｙｎＮｏｔｃｈの細胞内シグナル伝達ドメインの放出は、ｓｙｎＴＦによって制御される所望の出力５０６の発現を誘導する。図示の実施形態では、ｓｙｎＴＦ出力はまた、スイッチポリペプチド５０８の発現５０７を制御する。したがって、放出されたｓｙｎＮｏｔｃｈの細胞内シグナル伝達ドメインがスイッチポリペプチドの発現を誘導すると、スイッチポリペプチド５０８は、潜在性不活性化ドメイン５０４を活性化して、ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体のｓｙｎＴＦ含有細胞内シグナル伝達ドメインを不活性化する。その結果、合成ｓｙｎＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を介して負のフィードバックを提供することによって、制御されたカスタム出力が生成される。
図６に示されるように、ＣＡＲ ６００は、抗原結合ドメイン６０２に結合する抗原入力６０１によってトリガーされて、内部シグナル伝達カスケードを誘導し、例えば、ＣＡＲ ６００のＣＤ３ｚドメイン６０３を介した免疫刺激シグナル伝達を介して免疫細胞活性化に導く。ＣＡＲ ６００はまた、結合した潜在性不活性化ドメイン６０４を含み、細胞は、内部シグナル伝達カスケードの要素に応答する、スイッチポリペプチドをコードする配列６０５に作動可能に連結された調節配列を含む。したがって、内部シグナル伝達カスケードの活性化は、所望の出力６０６（例えば、免疫細胞活性化及び／又はＣＡＲによって制御される所望の免疫因子の発現など）の発現を誘導する。しかしながら、図示された実施形態では、ＣＡＲ出力はまた、スイッチポリペプチド６０７の発現を制御する。したがって、シグナル伝達カスケードがスイッチポリペプチド６０７の発現を誘導すると、スイッチポリペプチド６０７は、潜在性不活性化ドメイン６０４を活性化し、ＣＡＲを不活性化する。その結果、合成ＣＡＲシグナル伝達経路を介して負のフィードバックを提供することによって、Ｔ細胞活性化が制御される。
すぐわかるように、合成シグナル伝達経路を使用するこれらの例は、限定することを意図するものではない。
潜在性不活性化ドメイン及びスイッチポリペプチド
先に要約したように、本開示の回路に使用されるシグナル伝達タンパク質は、潜在性不活性化ドメインを含み得る。本発明の回路の主題のシグナル伝達タンパク質に含まれる潜在性不活性化ドメインは、多種多様であり得、所望に応じて、シグナル伝達タンパク質に結合するか、又は、他の方法で組み込まれてもよい。潜在性不活性化ドメインを主題のシグナル伝達タンパク質に結合させる又は組み込む任意の簡便な方法が使用され得、例えば、潜在性不活性化ドメインがリンカーを介して結合される場合が挙げられるが、これに限定されない。
潜在性不活性化ドメインは、スイッチポリペプチドの非存在下では、潜在状態のままであり、これは、不活性化ドメインが、それが会合しているシグナル伝達タンパク質を不活性化しないことを意味する。スイッチポリペプチドの存在下で、潜在性不活性化ドメインが活性化され、続いて、それが会合しているシグナル伝達タンパク質を不活性化する。不活性化のためのストラテジーは様々であり、例えば、誘導性分解、誘導性局在化、タンパク質分割などを挙げることができるが、これらに限定されない。スイッチポリペプチドは、それに応じて多様であり得、例えば、潜在性不活性化ドメインの分解を誘導するポリペプチド、潜在性不活性化ドメインの局在化を誘導するポリペプチド、潜在性不活性化ドメインの分割を誘導するポリペプチドなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
先に要約したように、潜在性不活性化ドメインには、誘導性分解ドメインが含まれる。本明細書で使用される場合、「誘導性分解ドメイン」とは、一般に、スイッチポリペプチドの発現時に誘導性分解ドメインが結合しているか又は会合しているポリペプチド（シグナル伝達タンパク質など）の分解を調節する（例えば、増強する、増大する、など）ことができるドメインを意味する。誘導性分解ドメインは、対応するスイッチポリペプチドが発現されない場合、一般に、主題のシグナル伝達タンパク質の分解を調節（例えば、増強、増加など）しない。したがって、分解ドメインは、一般に、スイッチポリペプチドの発現によって活性化されて、それが結合又は会合しているポリペプチドの分解を誘導するまでは潜在的である。分解ドメインが結合又は会合しているシグナル伝達タンパク質などのポリペプチドの分解は、ポリペプチドを不活性化する。
誘導性分解ドメインを含む潜在性不活性化ドメインの構成は、対応するスイッチポリペプチドと同様に様々である。場合によって、分解ドメインはデグロンを含み得る。場合によって、誘導性分解ドメインは、分解ドメインに結合したポリペプチド（例えば、シグナル伝達タンパク質）の分解を防止する保護ドメインを含み得る。保護ドメインによって保護されている分解ドメインは、スイッチポリペプチドによって脱保護され得、その結果、分解ドメインが活性化されて、結合しているか、さもなければ会合しているポリペプチドの分解をトリガーする。
例えば、いくつかの実施形態では、シグナル伝達タンパク質に結合した分解ドメインは、スイッチポリペプチドに含まれるプロテアーゼによって切断可能なタンパク質分解性切断部位を含む保護ドメインによって保護され得る。スイッチポリペプチドの非存在下では、プロテアーゼは存在せず、保護ドメインは、分解ドメインがシグナル伝達タンパク質の分解がトリガーされるのを防止する。スイッチポリペプチドの存在下で、プロテアーゼはタンパク質分解切断部位を切断し、分解ドメインを脱保護し、シグナル伝達タンパク質の分解をトリガーする。
いくつかの実施形態では、スイッチポリペプチドは、プロテアーゼ、例えば、シグナル伝達タンパク質に結合した誘導性不活性化ドメイン上に存在するＮ末端配列又はＣ末端配列のいずれかを切断するタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼなどを含み得る。プロテアーゼによる切断は、次いでシグナル伝達タンパク質の分解をトリガーするＮ末端デグロン又はＣ末端デグロンのいずれかを露呈させる。したがって、ＴＥＶプロテアーゼ含有スイッチポリペプチドの非存在下では、デグロンは隠れたままであり、シグナル伝達タンパク質の分解を誘導しない。場合によって、プロテアーゼ誘導性分解ドメインシステムで使用され得る構成要素及び構成は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれるＧａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８；３６１（６４０８）：１２５２－１２５８に記載されているＣＨＯＭＰ（ハッキングされた直交モジュラープロテアーゼの回路）システムで使用されるものを含み得る。容易に理解されるように、場合によって、他のデグロン及び／又は他のコードされたプロテアーゼが、明示的に記載されたものに置換され得る。
いくつかの実施形態では、誘導された分解は、分解配列を標的シグナル伝達タンパク質にライゲーションすることによって達成され得る。例えば、場合によって、両方のペプチドが存在する場合に互いに結合する２つのペプチドを使用して、分解配列を誘導可能な態様で標的シグナル伝達分子にライゲーションすることができる。ペプチドの相互の結合は、場合によって、共有結合性であり得る。いくつかの実施形態では、タグ結合ドメインに結合するタグペプチドは、標的シグナル伝達タンパク質に組み込まれ得、スイッチタンパク質は、構成的デグロンなどの結合分解配列を有するタグ結合ドメインを含むように構成され得る。かかるスイッチタンパク質の発現時に、タグ及びタグ結合ドメインは互いに結合し、それによって分解配列を標的シグナル伝達タンパク質に結合させ、シグナル伝達タンパク質の分解を誘導する。容易に理解されるように、場合によって、タグ及びタグ結合ドメインは交換されてもよく、すなわち、タグペプチドに結合するタグ結合ドメインは、標的シグナル伝達タンパク質に組み込まれてもよく、スイッチタンパク質は、分解配列が結合したタグペプチドを含むように構成されてもよい。
これら及び同様の実施形態において使用され得る互いに結合するペプチドの有用な例としては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ及びＳｐｙＴａｇが挙げられる。「ＳｐｙＴａｇ」及び「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」（「Ｓｐｙ」は細菌化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）を指す）という用語は、一般的なタンパク質間相互作用よりも高い有効性で２つのポリペプチドを結合することができる便利なタンパク質カップリングツールを指す。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、不可逆的なペプチドライゲーションを生成するので、タンパク質を結合、標識又は固定化するために使用され得る。ＳｐｙＴａｇは、遺伝的にコードされたペプチドであり、の遺伝的にコードされたパートナーであるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに結合すると自発的なアミド結合を形成する。ＳｐｙＴａｇは、広範囲の条件下でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと反応し、反応後の生成物は極めて安定している。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ及びＳｐｙＴａｇは、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚａｋｅｒｉら、（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１２；１０９（１２）：Ｅ ６９０－７）及び国際公開第２０１７／１１２７８４号に記載されている。
本開示の回路において分解シグナルを標的シグナル伝達タンパク質に誘導的にライゲーションするか、さもなければ会合するように適合させることができるタンパク質カップリングストラテジーの有用な例として、ＰＲＯＴＡＣも挙げられる。プロテオリシス標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）は、標的タンパク質に結合する第１のドメインと、Ｅ３ユビキチンリガーゼに係合することができる第２のドメインとを含む双頭型高分子である。本明細書に記載の回路及び方法の使用に適合し得る、標的化分解のためにＰＲＯＴＡＣを使用する方法としては、限定するものではないが、例えば、Ｒａｉｎａ＆Ｃｒｅｗｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１０）２８５（１５）：１１０５７－６０；Ｒａｉｎａ＆Ｃｒｅｗｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１７）３９：４６－５３；Ｃｏｌｅｍａｎ＆Ｃｒｅｗｓ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１８）２：４１－５８；Ｂｏｎｄｅｓｏｎら、Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１８）２５（１）：７８－８７；Ｎｅｋｌｅｓａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．（２０１７）１７４：１３８－１４４；に記載される方法が挙げられ、これらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。ユビキボディ及びペプチドＰＲＯＴＡＣは、例えば、Ｌｕｄｗｉｃｋｉら、ＡＣＳ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１９ ５：８５２－８６６；Ｐｏｒｔｎｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４ ２８９：７８４４－７８５５；Ｆａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１４ １７：４７１ ４８０；及びＨｉｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１３ １１０：８９４２－８９４７に記載されている。
容易に理解されるように、本開示の回路において分解シグナルを標的シグナル伝達タンパク質に誘導可能にライゲーションするためのストラテジー及び構成要素は、本明細書に具体的に記載されるストラテジー及び構成要素に限定されず、場合によっては、記載される回路で使用するために他のタンパク質カップリングシステムを適合させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の回路で用いられる誘導分解ストラテジーは、標的シグナル伝達タンパク質に含まれるデグロンのリン酸化を含み得る。例えば、キナーゼによってリン酸化され得るデグロンは、標的シグナル伝達タンパク質に組み込まれ得、スイッチポリペプチドは、キナーゼを含み得る。したがって、スイッチポリペプチドの発現時に、キナーゼはデグロンをリン酸化し、標的シグナル伝達タンパク質の分解をトリガーする。これに対応して、スイッチポリペプチドが発現されない場合、キナーゼは存在せず、デグロンはリン酸化されず、標的シグナル伝達タンパク質は分解されない。
本開示の回路での使用に適合させることができるリン酸化ベースの誘導分解ストラテジーの有用な例としては、限定するものではないが、例えば、Ｇｏｒｄｌｅｙら、ＰＮＡＳ（２０１６）１１３（４７）：１３５２８－１３５３３で説明されているものなどのモジュール式ホスホデグロンストラテジーが挙げられ、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、モジュラーホスホデグロンは、Ｆｕｓ３マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）によってリン酸化され、酵母Ｃｄｃ４ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体に誘導可能に結合し、ユビキチン化を促進するさらなるポリリジン領域を含有する、Ｔｅｃ１転写因子の伸長領域を含み得る。ホスホデグロンは、ＭＡＰＫ活性化時に結合したポリペプチドの迅速な分解をもたらす変異的に最適化されたＣｄｃ結合領域を含み得る。したがって、標的シグナル伝達タンパク質は、モジュラーホスホデグロンを含むように構成され得、スイッチポリペプチドは、ＭＡＰＫを含むように構成され得る。したがって、スイッチポリペプチドの発現時に、ホスホデグロンはＭＡＰＫによってリン酸化され、続いて、ユビキチン化され、標的シグナル伝達タンパク質の分解をもたらす。スイッチポリペプチドが存在しない場合、ホスホデグロンはリン酸化されず、標的シグナル伝達タンパク質は分解されない。
容易に理解されるように、本開示の回路における標的シグナル伝達タンパク質のリン酸化依存性誘導性分解のためのストラテジー及び構成要素は、本明細書に具体的に記載されるストラテジー及び構成要素に限定されず、場合によっては、記載される回路で使用するために他のリン酸化依存性システムを適合させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の回路で用いられる誘導性分解ストラテジーは、直交プロテアソームシステムを含み得る。例えば、スイッチポリペプチドは、そのスイッチポリペプチドが発現される細胞型に対して異種であるプロテアソーム（すなわち、異種プロテアソーム）を含むように構成され得、標的化シグナル伝達タンパク質は、異種プロテアソームに特異的な分解タグを含むように構成され得る。したがって、プロテアソーム及び分解タグは、タグ付きシグナル伝達タンパク質が異種プロテアソームによってのみ分解されるように、直交ペアを構成し得る（すなわち、タグは、宿主由来（内因性）タンパク質分解機構による標的シグナル伝達タンパク質の分解を誘導しない）。
例えば、回路を含むように改変された細胞に応じて、様々な直交プロテアソーム／タグのペアを使用することができる。例えば、真核細胞において、直交するプロテアソーム／タグのペアは、原核生物プロテアソーム及び原核生物プロテアソームによる分解をシグナル伝達する原核生物分解タグを含み得る。原核細胞において、直交するプロテアソーム／タグのペアは、真核生物プロテアソーム及び真核生物プロテアソームによる分解をシグナル伝達する真核生物分解タグを含み得る。場合によって、直交するプロテアソーム／タグのペアは、例えば、プロテアソーム及び／又はタグの突然変異によって合成的に誘導され、ペアを直交させることができる。場合によって、種間プロテアソーム／タグのペアは、直交プロテアソームシステム、例えば、第２の種（例えば、第２の細菌種、第２の真核生物種など）で使用される第１の種（例えば、第１の細菌種、第１の真核生物種など）に由来するプロテアソームと分解タグなど、において使用され得る。
本開示の回路での使用に適合させることができる直交プロテアソームシステムの有用な例としては、例えば、細菌（例えば、大腸菌、Ｍ．ｆｌｏｒｕｍなど）に由来するもの、例えば、限定するものではないが、ＣｌｐＸＰプロテアソーム及びｓｓｒＡタグシステム、ｍｆＬｏｎプロテアソーム及びｐｄｔタグシステムなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の回路での使用に適合させることができる有用なシステム及び構成要素には、例えば、限定するものではないが、Ｃａｍｅｒｏｎ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（１２）：１２７６－１２８１及びＧｒｉｌｌｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；３：１２７に記載されているものが含まれ、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、場合によって、スイッチポリペプチドは、直交プロテアソーム／タグのペアのプロテアソームを含み得、標的化シグナル伝達タンパク質は、直交プロテアソーム／タグのペアの分解タグを含み得る。直交プロテアソーム／タグのペアを使用する回路は、プロテアソーム及び／又はタグが細胞に対して異種（すなわち、内因性ではない）である細胞に導入され得る。
容易に理解されるように、本開示の回路における標的シグナル伝達タンパク質の直交プロテアソームベースの誘導性分解のためのストラテジー及び構成要素は、本明細書に具体的に記載されるストラテジー及び構成要素に限定されず、場合によっては、記載される回路で使用するために他の直交プロテアソームシステムを適合させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の回路で用いられる誘導分解ストラテジーは、プロテアソームへの誘導局在化のシステムを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、スイッチポリペプチドは、発現されると、シグナル伝達タンパク質をプロテアソームへ局在化するか、又は局在化するように誘導することができ、それによってシグナル伝達タンパク質の分解を誘導するドメインを含み得る。プロテアソームへのシグナル伝達タンパク質の誘導された局在化は、場合によっては、ユビキチン非依存性であり得る。換言すれば、プロテアソームへのシグナル伝達タンパク質の誘導された局在化は、ユビキチン化の工程をバイパスする場合がある。
一例として、スイッチポリペプチドは、プロテアソームに融合した二量体化ペアの第１のメンバーを含むように構成され、標的シグナル伝達タンパク質は、二量体化ペアの第２のメンバーを含むように改変される。二量体化ペアの第１及び第２のメンバーは、互いに直接結合してもよく（すなわち、直接二量体化してもよい）、又は二量体化メディエーター（すなわち、二量体化剤）を介して二量体化してもよい。互いに複合体を形成することができる任意の２つの好都合なポリペプチドドメインを、第１及び第２の二量体化ドメインとして使用するために選択することができる。例えば、二量体化ペアの第１及び第２のメンバーが互いに直接結合する場合、プロテアソームに融合した二量体化ペアの第１のメンバーを含むスイッチポリペプチドの発現は、二量体化ペアの第１及び第２のメンバー間の直接結合によって標的シグナル伝達タンパク質のプロテアソームへの局在化を誘導し、それによってシグナル伝達タンパク質の分解をもたらす。スイッチポリペプチドが発現されない場合、標的シグナル伝達タンパク質はプロテアソームに局在化しない。
二量体化ペアの第１及び第２のメンバーが二量体化メディエーターによって二量体化される場合、（二量体化ペアの第２のメンバーを含む）標的化されたシグナル伝達タンパク質は、プロテアソームに融合された二量体化ペアの第１のメンバーを含むスイッチポリペプチド及び二量体化メディエーターの両方の存在下で、プロテアソームに局在化され得る。したがって、二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を用いてプロテアソーム融合スイッチポリペプチドと標的シグナル伝達タンパク質との二量体化を誘導する場合、ＣＩＤの存在又は非存在が、それぞれ、回路がフィードバックを生成することができるか、できないかを制御し得る。互いに直接結合する二量体化ドメインが使用される場合、フィードバックの生成は、任意の二量体化誘導分子の存在とは無関係であり得る。
誘導された分解のプロテアソームストラテジーへの誘導された局在化の非限定的な例として、Ｆｐｒ１（親油性マクロライドラパマイシンと高い親和性で結合することが示されているペプチド）をプロテアソームサブユニットに融合し（例えば、Ｃ末端融合）、（Ｆｐｒ１結合ラパマイシンに結合する）Ｔｏｒ１のリガンド結合ドメインを標的シグナル伝達タンパク質に融合する。ラパマイシンの存在下でのＦｐｒ１タグ付きプロテアソームのサブユニットの発現時に、Ｔｏｒ１タグ付きシグナル伝達タンパク質は、プロテアソームに局在化し、シグナル伝達タンパク質の局在化誘導性分解をもたらす。場合によっては、Ｆｐｒ１及びＴｏｒ１を、互いに直接結合する二量体化ドメインの代わりに用いることができ、それにより、二量体化メディエーター（例えば、ラパマイシン）の必要性がなくなる。場合によって、直接二量体化ペアの二量体化ドメインを代わりに用いてもよく、二量体化メディエーターの必要性がなくなる。本開示の回路での使用に適合させることができる誘導プロテアソーム局在化ストラテジー、並びに、Ｆｐｒ１及びＴｏｒ１ドメインの例としては、例えば、限定するものではないが、Ｊａｎｓｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（２０）：２１４１５－２０を挙げることができ、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
有用な二量体化ドメインの非限定的な例には、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ誘導性ホモ二量体（例えば、ＤｍｒＢ）及びヘテロ二量体システム（例えば、ＤｍｒＡ及びＤｍｒＣ）、並びに、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ逆二量体化システム（例えば、ＤｍｒＤ）（タカラバイオ株式会社）のタンパク質ドメインが含まれるが、これらに限定されない（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９８）Ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎ ＦＫＢＰ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｍｅｒｉｚｅｒｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１８）：１０４３７－１０４４２；Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９６）Ｔｈｒｅｅ－ｐａｒｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１（１１）：４１８－４２２；Ｊｉｎら、（２０００）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ－ｇｒｏｗｔｈ ｓｗｉｔｃｈ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６（１）：６４－６６；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏら、（１９９９）Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｄｃ４２ ｏｒ ＷＡＳＰ ｔｏ ａ ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｃｔｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｌｏｐｏｄｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９（７）：３５１－３６０；Ｃｒａｂｔｒｅｅら、（１９９７）Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒｌｉｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＺＡＰ７０．Ｅｍｂｏ．Ｊ．１６（１８）：５６１８－５６２８；Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙら、（１９９９）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＥｒｂＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｈｏｍｏ－ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１０）：６８４５－６８５７、も参照されたい）。当業者であれば容易に理解するように、様々な他の二量体化ドメインを使用し得る。
容易に理解されるように、本開示の回路における標的シグナル伝達タンパク質の誘導されたプロテアソーム局在化ベースの誘導性分解のためのストラテジー及び構成要素は、本明細書に具体的に記載されるストラテジー及び構成要素に限定されず、場合によっては、記載される回路で使用するために他の誘導されたプロテアソーム局在化システムを適合させることができる。
本明細書に記載の誘導性分解ストラテジーでは、様々なデグロンを使用することができる。デグロンは、デグロンが結合しているか、さもなければ会合している（例えば、グラフトされている）タンパク質にシグナルを伝達し、かつ／又は、これを分解の標的とする（さもなければ、その分解速度を増加させる）タンパク質の部分を含む。デグロンの非限定的な例としては、短いアミノ酸配列、構造モチーフ、露出アミノ酸などが挙げられる。デグロンは、原核生物又は真核生物由来であり得、天然に存在する形態又は天然に存在しない形態（すなわち、組換え体）で使用され得る。デグロンは、分解のためにタンパク質を標的とするように翻訳後に改変されてもよく、かかる翻訳後の改変としては、例えば、ユビキチン化、タンパク質分解切断、リン酸化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、アンピル化、脂質化、アルキル化、ニトロシル化、スクシニル化、スモイル化、ネジル化、イシル化などが挙げられるが、これらに限定されない。
有用なデグロンには、ユビキチン依存性デグロン及びユビキチン非依存性デグロンが含まれる。例えば、場合によって、タンパク質は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）デグロン（例えば、哺乳動物ＯＤＣ、例えば、げっ歯類ＯＤＣ（例えば、Ｃ末端マウスＯＤＣ（ｃＯＤＣ）が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない）の結合によって、ユビキチン非依存性プロテアソーム分解の標的とされ得る。場合によって、有用なデグロンには、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ（２００８）４１０：４０１－４０７、及び／又は、Ｍａｔｓｕｚａｗａら、ＰＮＡＳ（２００５）１０２（４２）：１４９８２－７に記載されるものが含まれ、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。場合によって、タンパク質は、デグロンの翻訳後改変（例えば、限定するものではないが、タンパク質分解切断、リン酸化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、アンピル化、脂質化、アルキル化、ニトロシル化、スクシニル化、スモイル化、ネジル化、イシル化などが挙げられる）によって、ユビキチン非依存性プロテアソーム分解の標的とされ得、かかる改変は、タンパク質の部分的若しくは完全なアンフォールディング、又はタンパク質の分解をもたらす他の機構を、直接的又は間接的にもたらす。
場合によって、本明細書に記載の回路で使用されるデグロンは、ユビキチン非依存性分解シグナルを含み得、かかるシグナルは、多様であり得る。例えば、場合によって、ユビキチン非依存性分解シグナルは、ジペプチドモチーフ、例えば、システイン－アラニン（すなわち、ＣＡ）ジペプチドモチーフなどを含み得る。場合によって、ユビキチン非依存性分解シグナルは、ジペプチドモチーフのみを含み得る。場合によって、ユビキチン非依存性分解シグナルは、ジペプチドモチーフに加えて、アミノ酸残基、例えば、限定するものではないが、ＬＸＭＳＣＡＱＥモチーフなどを含み得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸又はＬＸＭＳＣＡＱＥＳモチーフであり得、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。場合によって、ＬＸＭＳＣＡＱＥモチーフ又はＬＸＭＳＣＡＱＥＳモチーフは、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である場合を含み得る。
したがって、場合によって、デグロンの分解シグナルは、最後のＳがある又はないＬＰＭＳＣＡＱＥＳ、最後のＳがある又はないＬＡＭＳＣＡＱＥＳ、最後のＳがある又はないＬＶＭＳＣＡＱＥＳ、最後のＳがある又はないＬＳＭＳＣＡＱＥＳ、最後のＳがある又はないＬＥＭＳＣＡＱＥＳ、及び、最後のＳがある又はないＬＫＭＳＣＡＱＥＳから選択される配列を含み得る。場合によって、デグロンの分解シグナルは、ＭＳＣＡＱＥ配列又はＭＳＣＡＱＥＳ配列を含み得る。
ユビキチン依存性デグロンには、限定するものではないが、例えば、ＰＥＳＴ（プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ））配列含有デグロン、並びに、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｌｖｉｎら、（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．（２０１３）２９；８（１０）：ｅ７８０８２）に記載されるデグロンであって、Ｂｏｎｇｅｒとして同定されたデグロン、並びに、ＴＡＺ、ＨＩＦ－１α、ｉＮＯＳ、ＳＲＣ３、サイクリンＤ１、ＩＦＮＡＲ１、ｐ５３、及びβ－カテニンに由来すると記載されたデグロンが含まれる。
有用なデグロンには、Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインも含まれ得る。かかるデグロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼによって認識される基質部位として定義されることが多く、短いペプチドモチーフ及び特定の構造要素を含む様々なかかるデグロンの特性が明らかにされている。Ｅ３リガーゼ／デグロン及び対応するモチーフパターンの非限定的な例としては、ＡＰＣ／Ｃ（ＤＢＯＸ），ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．Ｒ．．Ｌ．．［ＬＩＶＭ］．；ＡＰＣ／Ｃ（ＫＥＮ），ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．ＫＥＮ．；ＡＰＣ／Ｃ（ＡＢＢＡ），ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＦＩＶＬ］．［ＩＬＭＶＰ］［ＦＨＹ］．［ＤＥ］．｛０，３｝［ＤＥＳＴ］；ＡＰＣＣ＿ＴＰＲ＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．［ＩＬＭ］Ｒ＄；ＣＢＬ（ＰＴＫ），ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＤＮ］．Ｙ［ＳＴ］．．Ｐ；ＣＢＬ（ＭＥＴ），ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＤＹＲ；ＣＯＰ１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＤＥ］［ＤＥ］．｛２，３｝ＶＰ［ＤＥ］；ＣＲＬ４＿ＣＤＴ２＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＮＱ］｛０，１｝．．［ＩＬＭＶ］［ＳＴ］［ＤＥＮ］［ＦＹ］［ＦＹ］．｛２，３｝［ＫＲ］｛２，３｝［＾ＤＥ］；ＣＲＬ４＿ＣＤＴ２＿２，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＮＱ］｛０，１｝．．［ＩＬＭＶ］Ｔ［ＤＥＮ］［ＨＭＦＹ］［ＦＭＹ］．｛２，３｝［ＫＲ］｛２，３｝［＾ＤＥ］；Ｋｅｌｃｈ＿ＫＥＡＰ１＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＤＮＳ］．［ＤＥＳ］［ＴＮＳ］ＧＥ；Ｋｅｌｃｈ＿ＫＥＡＰ１＿２，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＱＤ．ＤＬＧＶ；Ｋｅｌｃｈ＿ａｃｔｉｎｆｉｌｉｎ，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＡＰ］Ｐ［ＭＶ］［ＩＭ］Ｖ；Ｋｅｌｃｈ＿ＫＬＨＬ３，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ Ｅ．ＥＥ．Ｅ［ＡＶ］ＤＱＨ；ＭＤＭ２＿ＳＷＩＢ，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ Ｆ［＾Ｐ］Ｗ［＾Ｐ］｛２，３｝［ＶＩＬ］；Ｎｅｎｄ＿Ｎｂｏｘ＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＾Ｍ｛０，１｝［ＦＹＬＩＷ］［＾Ｐ］；Ｎｅｎｄ＿ＵＢＲｂｏｘ＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＾Ｍ｛０，１｝［ＲＫ］［＾Ｐ］．；Ｎｅｎｄ＿ＵＢＲｂｏｘ＿２，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＾Ｍ｛０，１｝（［ＥＤ］）．；Ｎｅｎｄ＿ＵＢＲｂｏｘ＿３，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＾Ｍ｛０，１｝（［ＮＱ］）．；Ｎｅｎｄ＿ＵＢＲｂｏｘ＿４，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ＾Ｍ｛０，１｝（Ｃ）．；ＯＤＰＨ＿ＶＨＬ＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＩＬ］Ａ（Ｐ）．｛６，８｝［ＦＬＩＶＭ］．［ＦＬＩＶＭ］；ＳＣＦ＿ＣＯＩ１＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．．［ＲＫ］［ＲＫ］．ＳＬ．．Ｆ［ＦＬＭ］．［ＲＫ］Ｒ［ＨＲＫ］．［ＲＫ］．；ＳＣＦ＿ＦＢＷ７＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＬＩＶＭＰ］．｛０，２｝（Ｔ）Ｐ．．（［ＳＴ］）；ＳＣＦ＿ＦＢＷ７＿２，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＬＩＶＭＰ］．｛０，２｝（Ｔ）Ｐ．．Ｅ；ＳＣＦ＿ＳＫＰ２－ＣＫＳ１＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．．［ＤＥ］．（Ｔ）Ｐ．Ｋ；ＳＣＦ＿ＴＩＲ１＿１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．［ＶＬＩＡ］［ＶＬＩ］ＧＷＰＰ［ＶＬＩ］．．．Ｒ．；ＳＣＦ－ＴＲＣＰ１，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ Ｄ（Ｓ）Ｇ．｛２，３｝（［ＳＴ］）；ＳＩＡＨ，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ．Ｐ．Ａ．Ｖ．Ｐ［＾Ｐ］；ＳＰＯＰ，ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｔｉｆ ［ＡＶＰ］．［ＳＴ］［ＳＴ］［ＳＴ］；が挙げられ、ここで、「．」は、任意のアミノ酸タイプを示し、「［Ｘ］」は、その位置で許容されるアミノ酸タイプを示し、パターンの先頭にある「＾Ｘ」は、その配列がアミノ酸タイプＸで始まることを示し、「［＾Ｘ］」は、その位置にタイプＸ以外の任意のアミノ酸を含めることができることを意味し、次の「Ｘ｛ｘ，ｙ｝」のように指定された数字で、ｘとｙは、その位置で必要な「Ｘ」アミノ酸タイプの最小数と最大数を示す。記号「＄」は、タンパク質鎖のＣ末端を意味する。Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインを含むデグロンは、Ｇｕｈａｒｏｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１６）７：１０２３９に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。場合によって、有用なデグロンとしては、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）に対するシグナルを含むデグロンを挙げることができ、例えば、限定するものではないが、Ｍａｕｒｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅｓ＆Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１６）６：１８５４－１８６６に記載されるデグロンが挙げられ、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。場合によっては、有用なデグロンとして、薬物誘導性デグロン、例えば、限定するものでないが、特異的Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）６（１２）：９１７－９２２に記載され、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれるもの）を利用するオーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）を挙げることもできる。
容易に理解されるように、Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインを含むデグロンは、様々であり、本開示の回路は、本明細書に具体的に記載されるそれらのＥ３ユビキチンデグロンの使用に限定されない。
場合によって、本開示の回路における誘導性分解は、アンケージングされると、アンケージングされたユビキチンを含有するポリペプチドをプロテアソームに局在化させるという、ユビキチンの直接ケージングを用いてもよい。例えば、デグロンは、デグロンの構成要素間の相対的な間隔を変更することによって調整することができる（例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｏｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７（３）、１６１－１６７を参照のこと）。したがって、かかる改変により、デグロンを非機能的に、又は少なくとも最小限の機能にすることができる。次いで、改変されたデグロンの分解機能は、潜在性不活性化ドメイン含有シグナル伝達タンパク質にユビキチンを直接局在化又はライゲーションする（例えば、二量化を介して）ことによって回復され得る。かかる実施形態では、ユビキチンタンパク質を改変デグロンにライゲーション／局在化する任意の簡便な方法を使用することができる。例えば、場合によって、二量体化剤ペアは、潜在性不活性化ドメインに存在するペアの一方のメンバー及びユビキチンタンパク質に結合した他方のメンバーと共に使用され得る。場合によって、ロイシンジッパーペアは、潜在性不活性化ドメインに存在するペアの一方のメンバー及びユビキチンタンパク質に結合した他方のメンバーと共に使用され得る。場合によって、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇペアは、潜在性不活性化ドメインに存在するペアの一方のメンバー及びユビキチンタンパク質に結合した他方のメンバーと共に使用され得る。かかる例は、例示のみを目的としており、限定することを意図するものではない。
本開示の回路での使用に適合した誘導性分解ストラテジーで用いることができるデグロンの他の有用な例には、例えば、Ｎ末端デグロン（例えば、限定するものではないが、ｔｈｏｓｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｔａｓａｋｉ＆Ｋｗｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００７）３２（１１）：５２０－５２８、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、非構造化領域（例えば、限定するものではないが、ｔｈｏｓｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｃｈｕｎｇら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１５；１１（９）：７１３－７２０、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、リガンド誘導分解（ＬＩＤ）ドメイン及び不安定化ドメイン（ＤＤ）ドメイン（例えば、限定するものではないが、ｔｈｏｓｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｂｏｎｇｅｒら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２；７（８）：５３１－５３７；Ｇｒｉｍｌｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００８）１８：７５９－７６１；及び、Ｃｈｕら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００８）１８：５９４１－５９４４；Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１７：９８１－９８８；これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、原核生物のプロテアソーム認識配列、例えば、ｓｓｒＡ及びｍｆ－Ｌｏｎなど（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（１２）：１２７６－１２８１に記載されるもの、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、などが挙げられるが、これらに限定されない。
主題の回路のフィードバック制御を実証する回路における使用に適合された誘導性分解システムの例は、発現されたキーポリペプチドによってアンケージングされたケージドデグロンを含むｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲシステムである。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲシステム、及びｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲを使用する回路は、同時係属中の米国仮出願第６２／７８９，４１８号（２０１９年１月７日出願）、同第６２／８５０，３３６号（２０１９年５月２０日出願）及び２０１９年１月７日に出願された同第６２／７８９，３５１号、並びに、米国特許仮出願第６２／７００，６８１号（２０１８年７月１９日出願）、同第６２／７８５，５３７号（２０１８年１２月２７日出願）及び同第６２／７８８，３９８号（２０１９年１月４日出願）に記載されており、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。場合によって、本開示の回路及び／又は方法は、ケージドデグロンシステム及び／又はケージドデグロンシステムの構成要素及び／又はｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲシステム及び／又はｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲシステムの構成要素の使用を除外する。したがって、場合によって、本開示の潜在性不活性化ドメインは、ケージドデグロンではない。場合によって、本開示の潜在性不活性化ドメインは、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲではない。場合によって、本開示の潜在性不活性化ドメインは、ＬＯＣＫＲドメインを含まない。場合によって、本開示の潜在性不活性化ドメインは、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲポリペプチドを含まない。
先に要約したように、場合によって、不活性化のための有用なストラテジーは、誘導可能な局在化を含み得る。したがって、本開示の回路の潜在性不活性化ドメインは、シグナル伝達タンパク質を不活性化する位置にシグナル伝達タンパク質を誘導可能に局在化するドメインを含み得る。換言すれば、スイッチポリペプチドの存在下では、潜在性不活性化ドメインは、活性化し得、その結果、不活性化ドメインが、結合したシグナル伝達タンパク質を、シグナル伝達タンパク質が不活性である細胞の一部に局在化させる。誘導性局在化ベースの不活性化のための様々な異なるストラテジーを、本明細書に記載の回路で使用することができる。
例えば、いくつかの実施形態では、スイッチポリペプチドは、隔離ドメインに連結された結合ペアの第１のメンバーを含むように構成され得、標的化されたシグナル伝達タンパク質は、結合ペアの第２のメンバーを含み得る。したがって、スイッチポリペプチドの発現及び結合ペアの第１及び第２のメンバーの結合時に、標的化されたシグナル伝達タンパク質は隔離され、不活性化され得る。スイッチポリペプチドの非存在下では、標的シグナル伝達タンパク質は隔離されず、したがって活性のままである（すなわち、不活性化されていない）。
本明細書で使用される場合、「隔離ドメイン」という用語は、一般に、ポリペプチドに結合して利用可能な状態（すなわち、ケージングされていないか、さもなければアクセスできない状態）である場合に、ポリペプチドがその主な機能を果たすことができない細胞内の位置へ局在化するに至る、任意のタンパク質ドメインを指す。例えば、ポリペプチドが転写因子であって、その主な機能が１又はそれ以上の標的遺伝子の発現を駆動することである場合、隔離ドメインは、１又はそれ以上の標的遺伝子の発現を駆動するその機能をポリペプチドが果たすのを防止するために、核から離れた細胞の位置にポリペプチドを局在化するように機能し得る。しかしながら、転写因子機能を有するポリペプチドは、スイッチポリペプチドの非存在下で、細胞の核に局在して、その標的遺伝子の１又はそれ以上の発現を駆動することができるように構成され得る。
誘導可能な局在化のために用いられるストラテジーは、ポリペプチドの作用機序に依存し得、有用なストラテジーは、転写因子を核から隔離することに限定されない。したがって、様々な隔離ドメインが、本明細書中に記載される誘導性局在化ベースの不活性化ストラテジーにおいて使用され得る。例えば、場合によって、使用される隔離ドメインは、例えば、限定するものではないが、原形質膜、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、アクチン細胞骨格などを含む細胞の様々な位置に結合したポリペプチドを局在化させ得る。したがって、隔離ドメインは、それが存在し、アクセス可能である場合に、結合したポリペプチドの細胞内の特定の位置への局在化を誘導するタグを含み得る。かかるタグの有用な例としては、例えば、原形質膜標的化タグ、ミトコンドリア膜標的化タグ、ペルオキシソーム標的化タグ、液胞標的化タグ、アクチン細胞骨格標的化タグなどが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の回路のいくつかの実施形態では、標的化シグナル伝達タンパク質は、結合ペアの第１のメンバーを含み得、スイッチポリペプチドは、隔離ドメインに連結された結合ペアの第２のメンバーを含み得、例えば、限定するものではないが、隔離ドメインが、原形質膜標的化タグ、ミトコンドリア膜標的化タグ、ペルオキシソーム標的化タグ、液胞標的化タグ、アクチン細胞骨格標的化タグなどを含む場合を含む。場合によって、他の有用な標的化タグとして、例えば、核局在化タグ、核外輸送タグなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の回路で用いられる有用な誘導可能な局在化ストラテジーは、局在化タグに融合した第１のロイシンジッパードメインと、シグナル伝達経路の標的シグナル伝達タンパク質に融合した第２のロイシンジッパードメインとを含むスイッチポリペプチドを含み得る。例えば、標的シグナル伝達タンパク質は、限定するものではないが、シグナル伝達経路の転写因子メンバーであり得、局在化タグは、核以外の細胞位置、例えば、限定するものではないが、原形質膜などに局在化し得る。このように、転写因子標的シグナル伝達タンパク質の不活性化は、スイッチポリペプチドの存在によって制御され得る。スイッチポリペプチドの存在下で、第１のロイシンジッパーは、第２のロイシンジッパーに結合し、転写因子標的シグナル伝達タンパク質は、核から（例えば、核の外に）隔離され、それによって、シグナル伝達タンパク質を不活性化する。スイッチポリペプチドの非存在下では、シグナル伝達タンパク質は、隔離されず、不活性化は誘導されない。したがって、シグナル伝達タンパク質は、そのシグナル伝達機能を果たし得る。この誘導された隔離のストラテジーは、場合によっては、本明細書の他の箇所で「アンカーアウェイ（anchor away）」と呼ばれることがある。
場合によって、本開示の回路において用いられるアンカーアウェイストラテジーにおいて用いられ得る有用なロイシンジッパー結合ペア及び隔離ドメインとして、例えば、限定するものではないが、Ｃｈｅｎら、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．、２０１５，４（１１）：１２０５～１２１６に記載されているものが挙げられ、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。潜在性ヘテロ二量体化ドメインの例は、以下の刊行物に記載されている。これらのドメインは、デグロンをリクルートするために、タンパク質を局在化する（アンカーアウェイする）ために、又はドミナントネガティブとして使用することができる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２ １：１１８－１２９及びＣｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１９ ５６５：１０６－１１１を参照されたい。
誘導性局在化ストラテジーにおいて使用され得る有用な結合ペアは、ロイシンジッパードメインに限定されず、その有用なドメインは多様であり得る。結合ペアの第１及び第２のメンバーは、互いに直接結合してもよく（すなわち、直接結合してもよい）、又は結合メディエーターを介して結合してもよい。互いに複合体を形成することができる任意の２つの好都合なポリペプチドドメインを、結合ペアの第１のメンバー及び第２のメンバーとして使用するために選択することができる。場合によって、本明細書の他の箇所に記載されるものを含むがこれらに限定されないポリペプチド二量体化ドメインは、結合ペアの第１及び第２のメンバーとして使用され得、二量体化ペアの第１及び第２のメンバーが互いに直接結合する（すなわち、直接二量体化し得る）場合、又は二量体化メディエーター（すなわち、二量体化剤）を介して二量体化する場合を含む。
結合ペア並びにその第１及び第２のメンバーの有用な例としては、限定するものではないが、例えば、国際公開第２０１４／１２７２６１号明細書及び国際公開第２０１７／１２０５４６号明細書に記載されている特異的結合ペア及び二量体化ペアが挙げられ、これらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
場合によって、本開示の回路において用いられる誘導性局在化のためのストラテジーは、ケージド隔離ドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「ケージド隔離ドメイン」とは、一般に、局在化タグと、局在化タグが、局在化タグの正常な機能に従って、ポリペプチド及び任意の結合したタンパク質の局在化をトリガーするのを防ぐケージドメインとを含むマルチドメインポリペプチドを意味する。例えば、原形質膜標的化タグを含むケージド隔離ドメインを含むポリペプチドは、タグがケージングされたままである場合には、原形質膜に局在化し得ないが、タグがアンケージングされている場合には、ポリペプチド及び任意の結合タンパク質を原形質膜に局在化し得る。
別の例では、核局在化タグ（例えば、限定するものではないが、核局在化配列（ＮＬＳ）など）を含むケージド隔離ドメインを含むポリペプチドは、タグがケージングされたままである場合には、核に局在化し得ないが、タグがアンケージングされている場合には、ポリペプチド及び任意の結合タンパク質を核に局在化し得る。場合によって、この誘導された局在化のためのストラテジーは、シグナル伝達タンパク質が、細胞の核外のシグナル伝達経路、例えば、細胞質及び／又は原形質膜における機能を標的とする用途を見出すことができる。かかる実施形態では、任意の好都合な核局在化配列を使用することができる。
別の例では、核外輸送タグ（例えば、限定するものではないが、核外輸送配列（ＮＥＳ）など）を含むケージド隔離ドメインを含むポリペプチドは、タグがケージングされたままである場合には、核に局在化し得るが、タグがアンケージングされている場合には、ポリペプチド及び任意の結合タンパク質を核外に局在化し得る。場合によって、この誘導された局在化のためのストラテジーは、シグナル伝達タンパク質が細胞の核における機能を標的とする場合に用途を見出すことができる。かかる実施形態では、任意の好都合な核外輸送配列を使用することができる。場合によって、核外輸送タグを含むケージド隔離ドメインは、ＬＯＣＫＲドメインを除外する場合があり、例えば、ケージド隔離ドメインがｎｅｓＬＯＣＫＲポリペプチドを含まない場合を含むが、これに限定されない。
関連する実施形態では、局在化タグのケージング／アンケージングのための任意の有用なストラテジーを用いることができる。例えば、スイッチポリペプチドに含まれるプロテアーゼによって切断可能なタンパク質分解切断部位を含むドメインによる局在化タグの保護が挙げられるが、これに限定されない。例えば、局在化タグは、シグナル伝達タンパク質に結合され得、局在化タグは、スイッチポリペプチドに含まれるプロテアーゼによって切断可能なタンパク質分解性切断部位を含む保護ドメインによってケージングされ得る。スイッチポリペプチドの非存在下では、プロテアーゼは存在せず、保護ドメインは、局在化タグがシグナル伝達タンパク質の局在化をトリガーするのを防止する。スイッチポリペプチドの存在下で、プロテアーゼは、タンパク質分解切断部位を切断し、局在化タグをアンケージングするか、さもなければ脱保護し、局在化タグに従ってシグナル伝達タンパク質の局在化をトリガーする。
いくつかの実施形態では、ＬＯＣＫＲベースのケージを、本開示の回路の誘導性局在化ストラテジーに使用することができる。例えば、場合によって、シグナル伝達タンパク質は、ＬＯＣＫＲによってケージングされ、キーポリペプチドを含むスイッチポリペプチドによってアンケージングされ得る局在化タグ（例えば、限定するものではないが、ＮＬＳ又はＮＥＳなど）を含むように構成され得る。いくつかの実施形態では、ＬＯＣＫＲベースのケージは、本開示の回路の誘導性局在化ストラテジーに使用しなくてもよい。例えば、場合によって、シグナル伝達タンパク質は、ＬＯＣＫＲドメインによってケージングされていない局在化タグ（例えば、限定するものではないが、ＮＬＳ又はＮＥＳなど）を含むように構成され得、潜在性不活性化ドメイン含有タンパク質は、ＬＯＣＫＥＲドメイン、例えばｎｅｓＬＯＣＫＲ又はｎｌｓＬＯＣＫＥＲを含まなくてもよい。ＬＯＣＫＲドメイン及びＬＯＣＫＲシステムを使用する回路は、２０１９年１月７日に出願された代理人整理番号ＵＣＳＦ－５７８ ＰＲＶ及びＭＢＨＢ １８－１７８３－ＰＲＯによって識別される同時係属中の仮出願、並びに、米国特許仮出願第６２／７００，６８１号（２０１８年７月１９日出願）、同第６２／７８５，５３７号（２０１８年１２月２７日出願）、及び同第６２／７８８，３９８号（２０１９年１月４日出願）に記載されており、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
先に要約したように、本開示の回路のシグナル伝達タンパク質の誘導された不活性化のための有用なストラテジーは、タンパク質分割を含み得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質分割」とは、一般に、ポリペプチドを非機能的にするか又はポリペプチドの少なくとも１つの機能を無効化するためにポリペプチドを分割することを意味する。場合によって、ポリペプチドは、ポリペプチドの分割部分を再結合させてポリペプチドを機能的にするか、又は、分割によって廃止されたポリペプチドの少なくとも１つの機能を回復させることができるように可逆的に分割され得る。場合によって、ポリペプチドは、ポリペプチドの分割部分が再結合してポリペプチドを機能的にすることができないように、又は、分割によって廃止されたポリペプチドの機能を回復することができないように不可逆的に分割され得る。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達タンパク質のポリペプチドは分割され（シグナル伝達タンパク質の少なくとも１つの機能を無効にし）、分割されたポリペプチドの各半分は、結合ペアのメンバーの結合時に分割されたシグナル伝達タンパク質が再構成され得るように、結合ペアのメンバーに融合される。例えば、シグナル伝達タンパク質は、第１の半分と第２の半分とに分割され得、第１の半分は、結合ペアの第１のメンバーに融合され得、分割されたシグナル伝達タンパク質の第２の半分は、結合ペアの第２のメンバーに使用され得る。結合ペアの第１及び第２のメンバーが互いに結合すると、シグナル伝達タンパク質は再構成され、廃止されたシグナル伝達タンパク質の少なくとも１つの機能を回復する。
本開示の回路において、スイッチポリペプチドは、分割ポリペプチドを再構成するために使用される結合ペアメンバーの一方又は両方を競合的に排除（outcompete）する結合ペアメンバーを含むように構成され得る。したがって、スイッチポリペプチドの存在下では、結合ペアの第１及び第２のメンバーの結合は、スイッチポリペプチドによって中断され得、それにより、シグナル伝達タンパク質の再構成が妨げられ、シグナル伝達タンパク質の不活性化がもたらされる。
かかる場合、スイッチポリペプチドの結合ドメインを、本明細書では「ドミナントネガティブ」ドメインと呼ぶ場合がある。ドミナントネガティブドメインは、本開示の回路のシグナル伝達タンパク質に結合しているか、さもなければ組み込まれている潜在性不活性化ドメインのドメイン間の結合を競合的に排除（outcompete）することができる。したがって、場合によって、潜在性不活性化ドメインは、シグナル伝達タンパク質のドメインと非共有結合的に結合する競合的結合ドメインを含んでいると言うことができる。かかる「競合的結合ドメイン」は、スイッチポリペプチドの結合ドメインの存在下で置換され得、その結果、シグナル伝達タンパク質の不活性化をもたらし得る。スイッチポリペプチドの非存在下では、競合的結合ドメインは、分割シグナル伝達タンパク質のその結合パートナーに結合し、シグナル伝達タンパク質を再構成し、それをシグナル伝達経路においてその機能を果たすことができるようにする。
いくつかの実施形態では、転写因子又はキナーゼなどのシグナル伝達タンパク質は、タンパク質の分割部分が互いに会合していない場合に、シグナル伝達タンパク質がその機能を果たさない（すなわち、標的の転写を誘導しない、標的のリン酸化を触媒しない、など）ように分割され得る。分割されたシグナル伝達タンパク質の第１の半分は第１のロイシンジッパーに融合され得、分割されたシグナル伝達タンパク質の第２の半分は第２のロイシンジッパーに融合され得、その結果、第１のロイシンジッパーが第２のロイシンジッパーに結合するとシグナル伝達タンパク質が再構成され得る。ドミナントネガティブロイシンジッパー、すなわち、第１又は第２のロイシンジッパーのいずれかに、第１及び第２の間の相互作用よりも高い親和性で結合する第３のロイシンジッパーが、スイッチポリペプチドに組み込まれる。したがって、スイッチポリペプチドは、それを非機能性にする（例えば、転写因子機能を実行不能にする、キナーゼ機能を実行不能にする、など）分割シグナル伝達タンパク質の半分を競合的に排除（outcompete）することができる。ロイシンジッパー及び２つの低親和性ロイシンジッパーの結合を競合的に排除（outcompete）するためのドミナントネガティブロイシンジッパーの使用の有用な例として、例えば、限定するものではないが、Ｂｕｃｈｌｅｒ＆Ｃｒｏｓｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）５：２７２に記載されている異種哺乳動物ｂＺＩＰ（ＣＥＢＰα）トランス活性化因子及び高親和性３ＨＦドミナントネガティブ阻害因子が挙げられ、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、有用なタンパク質分割ストラテジーは、分割シグナル伝達タンパク質の一部を二量体化してシグナル伝達タンパク質を再構成する二量体化ドメイン間に配置されたプロテアーゼ切断部位の切断を含む。例えば、シグナル伝達タンパク質は、二量体化ペアの第１のメンバーを有する第１の部分と、二量体化ペアの第２のメンバーを含む第２の部分とに分割され得る。二量体化ペアのメンバーの一方又は両方は、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼ切断部位を含むように構成され得る。したがって、プロテアーゼを含むスイッチポリペプチドの発現時に、プロテアーゼ切断部位が切断され、再構成されたシグナル伝達タンパク質が分割され、それによってそれが不活性になる。
場合によって、二量体化ペアは、分割シグナル伝達タンパク質を二量体化する逆平行ロイシンジッパーなどのロイシンジッパーを含む。したがって、シグナル伝達タンパク質は、逆平行ロイシンジッパーペアの第１のロイシンジッパーを有する第１の部分と、ペアの第２のロイシンジッパーを含む第２の部分とに分割される。ペアのロイシンジッパーの一方又は両方は、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼ切断部位を含むように構成され得る。したがって、プロテアーゼを含むスイッチポリペプチドの発現時に、プロテアーゼ切断部位が切断され、再構成されたシグナル伝達タンパク質が分割され、それによってそれが不活性になる。
使用され得るプロテアーゼストラテジーの有用な例としては、例えば、スイッチポリペプチドが、分割シグナル伝達タンパク質の二量体化ドメインに存在するプロテアーゼ切断部位を切断するＴＥＶプロテアーゼを含み得る場合が挙げられるが、これに限定されない。ＴＥＶプロテアーゼによる切断は、二量体化ドメインが分割シグナル伝達タンパク質を再構成する能力を破壊し、それによって再構成された分割シグナル伝達タンパク質を不活性化して再分割する。したがって、ＴＥＶプロテアーゼ含有スイッチポリペプチドの非存在下では、プロテアーゼ切断部位は未切断のままであり、分割シグナル伝達タンパク質は再構成されて活性のままである。場合によって、シグナル伝達タンパク質をタンパク質分解的に切断して、不活性化された分割されたシグナル伝達タンパク質をもたらし得る構成要素及び構成は、Ｇａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８；３６１（６４０８）：１２５２～１２５８に記載されているＣＨＯＭＰ（ハッキングされた直交モジュラープロテアーゼの回路）システムで使用されるものを含み得、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。容易に理解されるように、場合によって、他のコードされたプロテアーゼ、対応するプロテアーゼ切断部位、及び／又は二量体化ドメインが、明示的に記載されたものに代替し得る。
また、容易に理解されるように、タンパク質分割を使用するシグナル伝達タンパク質の誘導された不活性化の様々な構成を、本開示の回路において使用し得る。
先に要約したように、本開示の回路は、スイッチポリペプチドを含み得、その発現は、スイッチポリペプチドをコードする配列が作動可能に連結された調節配列によって制御され得る。本明細書で使用される「スイッチポリペプチド」という用語は、一般に、対応する潜在性不活性化ドメインの存在下で発現されると、潜在性活性化ドメインを活性化するポリペプチドを指す。潜在性不活性化ドメインを活性化すると、それにより、不活性化ドメインが連結されているか、さもなければ組み込まれているポリペプチド、及び任意の他の結合したタンパク質、例えば、結合したシグナル伝達タンパク質の不活性化をトリガーする。スイッチポリペプチドの構成は、例えば、スイッチが活性化するように設計されている潜在要素によって異なる。
特定の潜在性不活性化ドメインと共に機能するように構成されたスイッチポリペプチドは、場合によって、直交系として構成され得る。「直交系」とは、一般に、特定のスイッチポリペプチドが特定の潜在性不活性化ドメインと共に機能することを意味するが、スイッチポリペプチドは、必ずしも他の潜在性不活性化ドメインと共に機能するとは限らず、及び／又は、潜在性不活性化ドメインは、必ずしも他のスイッチポリペプチドと共に機能するとは限らない。したがって、スイッチポリペプチド及び潜在性不活性化ドメインの２つ以上の異なる直交系は、干渉することなく、同じ生物又は細胞内で一緒に（例えば、同時に）機能し得る。換言すれば、第１の直交系の第１のスイッチポリペプチドは、第１の系の第１の潜在性不活性化ドメインを活性化するように機能し得る一方で、当該スイッチポリペプチドは、第２の直交系の任意の要素（例えば、第２のスイッチポリペプチド、第２の潜在性不活性化ドメインなど）の機能に実質的に干渉しない。場合によって、直交系を使用して、２つ以上の分子フィードバック回路（例えば、それぞれが異なるシグナル伝達経路を調節する２つ以上の分子フィードバック回路、それぞれが同じシグナル伝達経路の異なる要素を調節する２つ以上の分子フィードバック回路などを含む）の並列動作を可能にすることできる。
各スイッチポリペプチド及び潜在性不活性化ドメインは、必ずしも直交ペアに構成する必要はない。例えば、場合によって、２つ以上の異なるスイッチポリペプチドが、同じ潜在性不活性化ドメインを活性化するように機能し得る。これに対応して、場合によって、２つ以上の異なる潜在性不活性化ドメインが、同じスイッチポリペプチドによって活性化されるように構成され得る。
リンカー
本開示の回路に使用されるポリペプチドは、ペプチドリンカーを含んでも含まなくてもよい。例えば、場合によって、対象のポリペプチドの２つのドメインは、ペプチドリンカーによって連結され得る。これに対応して、本開示の回路の構成要素をコードする核酸配列は、ペプチドリンカーをコードする配列によって連結され得る。
ペプチドリンカーは、約３アミノ酸（ａａ）以下から約２００ａａ以上の長さで変動し得、３ａａから１０ａａ、５ａａから１５ａａ、１０ａａから２５ａａ、２５ａａから５０ａａ、５０ａａから７５ａａ、７５ａａから１００ａａ、１００ａａから１２５ａａ、１２５ａａから１５０ａａ、１５０ａａから１７５ａａ、又は１７５ａａから２００ａａを含み得るが、これらに限定されない。ペプチドリンカーは、３ａａから３０ａａの長さ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ａａの長さを有することができる。ペプチドリンカーは、５ａａから５０ａａの長さ、例えば、５ａａから４０ａａ、５ａａから３５ａａ、５ａａから３０ａａ、５ａａから２５ａａ、５ａａから２０ａａ、５ａａから１５ａａ、又は５ａａから１０ａａの長さを有することができる。
適切なリンカーは、容易に選択することができ、いくつかの適切な長さのうちのいずれか、例えば、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸、３アミノ酸から１２アミノ酸であり得、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸、又は７アミノ酸から８アミノ酸を含み得、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸であり得る。
例示的なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で公知の他の可動性リンカーが挙げられ、さらに、グリシン及びグリシン－セリンポリマーを使用することができ、Ｇｌｙ及びＳｅｒは、いずれも比較的構造化されていないので、構成要素間において中立のテザーとして機能し得る。グリシンポリマーを使用することができ、グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的なリンカーは、ＧＧＳＧ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７）、ＧＳＳＳＧ（配列番号８）などのアミノ酸配列を含み得るが、これらに限定されない。
シグナル伝達経路
先に要約したように、本明細書に記載の分子回路を使用して、天然及び合成シグナル伝達経路を含む様々なシグナル伝達経路を調節することができる。好適なシグナル伝達経路には、１又はそれ以上の入力によって調節されて（例えば、活性化、抑制など）１又はそれ以上の出力を生成するものが含まれる。シグナル伝達経路の入力及び出力は多様であり得、シグナル伝達経路の内因性（例えば、天然）入力又は出力、並びに、異種（例えば、操作された又は合成の）シグナル伝達経路の入力及び出力を含み得る。
場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の入力は、細胞内シグナルを含み得、例えば、経路の出力が細胞内又は細胞間であり得る場合を含む。場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の出力は、細胞内シグナルを含み得、例えば経路の入力が細胞内又は細胞間であり得る場合を含む。場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の入力は、細胞間シグナルを含み得、例えば、経路の出力が細胞内又は細胞間であり得る場合を含む。場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の出力は、細胞間シグナルを含み得、例えば、経路の入力が細胞内又は細胞間であり得る場合を含む。
場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の入力及び出力はいずれも、細胞内シグナルを含み得る。場合によって、本開示の回路に関連するシグナル伝達経路の入力及び出力はいずれも、細胞間シグナルを含み得る。
本開示の回路を使用して調節され得る天然のシグナル伝達経路の好適で非限定的な例としては、例えば、ＡＫＴシグナル伝達経路、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、エストロゲンシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、免疫活性化経路、免疫抑制経路、免疫細胞分化経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路、ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、ｐ５３シグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、ＴＧＦベータシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＴＮＦシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
その要素が本明細書中に記載される潜在性不活性化ドメインを含むように改変され得る経路の好適で非限定的な例としては、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔの一部として記載されるＰＡＮＴＨＥＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＮａｌｙｓｉｓ ＴＨｒｏｕｇｈ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）経路も含まれ、その説明（かかる経路の要素の説明を含む）は、ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ．においてオンラインで利用可能である非限定的な例としては、２－アラキドノイルグリセロール生合成、５ＨＴ１型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ２型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ３型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ４型受容体媒介シグナル伝達経路、５－ヒドロキシトリプタミン生合成、５－ヒドロキシトリプタミン分解、酢酸利用、アクチビンベータシグナル伝達経路、アデニン及びヒポキサンチンサルベージ経路、アドレナリン及びノルアドレナリン生合成、アラニン生合成、アラントイン分解、ＡＬＰ２３Ｂシグナル伝達経路、アルファアドレナリン受容体シグナル伝達経路、アルツハイマー病－アミロイドセクレターゼ経路、アルツハイマー病－プレセニリン経路、アミノ酪酸分解、アナンダミド生合成、アナンダミド分解、アンドロゲン／エストロジーン／プロゲステロン生合成、血管新生経路、Ｇタンパク質及びベータアレスチンを介したアンギオテンシンＩＩ刺激シグナル伝達、アポトーシスシグナル伝達経路、アルギニン生合成、アスコルビン酸分解、アスパラギン及びアスパラギン酸生合成、ＡＴＰ合成、ネトリンを介した軸索ガイダンス、セマフォリンを介した軸索ガイダンス、スリット／ロボを介した軸索ガイダンス、Ｂ細胞活性化経路、Ｂｅｔａ１アドレナリン受容体シグナル伝達経路、Ｂｅｔａ２アドレナリン受容体シグナル伝達経路、Ｂｅｔａ３アドレナリン受容体シグナル伝達経路、ビオチン生合成、血液凝固、ＢＭＰ／アクチビンシグナル伝達経路、ブプロピオン分解、カドヘリンシグナル伝達経路、コエンザイムＡ結合カルニチン代謝、カルニチン代謝、ＣＣＫＲシグナル伝達、細胞周期、コレステロール生合成、コリスメート生合成、サーカディアンクロックシステム、コバラミン生合成、コエンザイムＡ生合成、コルトコトロピン放出因子受容体シグナル伝達経路、システイン生合成、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅによる細胞骨格調節、デノボプリン生合成、デノボピリミジンデオキシリボヌクレオチド生合成、デノボピリミジンリボヌクレオチド生合成、ＤＮＡ複製、ドーパミン受容体媒介シグナル伝達経路、ＤＰＰ－ＳＣＷシグナル伝達経路、ＤＰＰシグナル伝達経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、内因性カンナビノイドシグナル伝達、エンドテリンシグナル伝達経路、エンケファリン放出、ＦＡＳシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、フラビン生合成、テトラヒドロ葉酸生合成、ホルミルテトラヒドロホルメート生合成、フルクトースガラクトース代謝、ＧＡＢＡ－Ｂ受容体ＩＩシグナル伝達、ガンマアミノ酪酸合成、ＧＢＢシグナル伝達経路、ＲＮＡポリメラーゼＩによる一般的な転写、一般的な転写調節、グルタミングルタミン酸変換、糖分解、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ヘム生合成、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路－Ｇｉアルファ及びＧｓアルファ媒介経路、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路－Ｇｑアルファ及びＧｏアルファ媒介経路、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路－ロッド外側セグメント光変換、ヒスタミンＨ１受容体を介したシグナル伝達経路、ヒスタミンＨ２受容体を介したシグナル伝達経路、ヒスタミン合成、ヒスチジン生合成、ハンチントン病経路、ＨＩＦ活性化を介した低酸素反応、ケモカイン及びサイトカインシグナル伝達経路を介した炎症、インスリン／ＩＧＦ経路－マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ／ＭＡＰキナーゼカスケード、インスリン／ＩＧＦ経路－プロテインキナーゼＢシグナル伝達カスケード、インテグリンシグナル伝達経路、インターフェロンガンマシグナル伝達経路、インターロイキンシグナル伝達経路、イオノトロピックグルタミン酸受容体経路、イソロイシン生合成、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ロイシン生合成、リポエート生合成、リジン生合成、マンノース代謝、代謝型グルタミン酸受容体グループＩＩＩ経路、代謝型グルタミン酸受容体グループＩＩ経路、代謝型グルタミン酸受容体グループＩ経路、メチオニン生合成、クエン酸メチルサイクル、メチルマロニル経路、ｍＲＮＡスプライシング、ムスカリン性アセチルコリン受容体１及び３シグナル伝達経路、ムスカリン性エチルコリン受容体２及び４シグナル伝達経路、ＭＹＯシグナル伝達経路、Ｎ－アセチルグルコサミン代謝、ニコチン分解、ニコチン薬物動態経路、ニコチンアセチルコリン受容体シグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、Ｏ－抗原生合成、オピオイドプロジノルフィン経路、オピオイドプロエンケファリン経路、オピオイドプロオピオメラノコルチン経路、オルニチン分解、酸化ストレス応答、オキシトシン受容体媒介シグナル伝達経路、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路、ｐ５３経路、グルコース欠乏によるｐ５３経路、Ｐ５３経路フィードバックループ１、ｐ５３経路フィードバックループ２、パントテン酸生合成、パーキンソン病、ＰＤＧＦシグナル伝達経路、ペントースリン酸経路、ペプチドグリカン生合成、フェニル酢酸分解、フェニルアラニン生合成、フェニルエチルアミン分解、フェニルプロピオン酸分解、ＰＩ３キナーゼ経路、プラスミノーゲン活性化カスケード、ピリドキサール－５－リン酸生合成、プロリン生合成、ＰＲＰＰ生合成、プリン代謝、ピリドキサールリン酸サルベージ経路、ピリミジン代謝、ピルビン酸代謝、ラス経路、Ｓ－アデノシルメチオニン生合成、サルベージピリミジンデオキシリボヌクレオチド、サルベージピリミジンリボヌクレオチド、ＳＣＷシグナル伝達経路、セリングリシン生合成、コハク酸からプロピオン酸への変換、硫酸固定、シナプス小胞の輸送、ＴＣＡサイクル、Ｔ細胞活性化経路、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達経路、チアミン生合成、チアミン代謝、スレオニン生合成、チロトロピン放出ホルモン受容体シグナル伝達経路、トール経路、トール受容体シグナル伝達経路、転写調節ｂＺＩＰ転写因子、トリアシルグリセロール代謝、トリプトファン生合成、チロシン生合成、ユビキチンプロテアソーム経路、バリン生合成、バソプレシン合成、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、ビタミンＢ６生合成、ビタミンＢ６代謝、ビタミンＤ代謝及び経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、キサンチン及びグアニンサルベージ経路などが挙げられる。
シグナル伝達経路のさらなる非限定的な例、及びその説明としては、以下のもの、すなわち、ＡＫＴシグナル伝達経路（ＡＫＴは、アポトーシスの阻害などの様々な生物学的応答の媒介に関与するセリン／スレオニンキナーゼである）、アンギオポイエチン－ＴＩＥ２シグナル伝達（アンギオポイエチンは、ＴＩＥ２／ＴＥＫ ＲＴＫ（受容体チロシンキナーゼ）に結合する成長因子リガンドの新しいファミリーである）、ＭＨＣによる抗原処理及び提示（抗原処理及び提示は、タンパク質とＴ細胞による認識のための主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との結合をもたらすプロセスである）、死受容体を介したアポトーシス（特定の細胞には、細胞外死シグナルの存在を検出し、細胞の固有のアポトーシス機構を迅速に点火する、死受容体（ＤＲ）と呼ばれる独自のセンサがある）、ＡＰＲＩＬ経路（免疫応答において、ＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞とＴ細胞の増殖の共刺激因子として機能し、クラススイッチをサポートする）、Ｂ細胞開発経路（Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体は、通常、２つのＩｇ重鎖、２つのＩｇ軽鎖、及びシグナル伝達サブユニットで構成される抗原結合サブユニットで構成される）、ＢＭＰ経路（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーの大きなサブクラスである）、がん免疫編集（免疫系は腫瘍の成長を抑制しようとするが、腫瘍細胞がこの免疫圧を逃れるか弱めることがある）、マクロファージのＣＣＲ５経路（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体タイプ５（ＣＣＲ５）は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーのケモカイン受容体サブクラスのメンバーである）、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞系統（各成熟Ｔ細胞は、通常、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）結合特性に一致する結合特性を有する共受容体分子（ＣＤ４又はＣＤ８）の発現を保持する）、細胞アポトーシス経路（アポトーシスは、細胞がプログラムされた細胞死に誘導される自然発生プロセスである）、ＣＴＬ媒介アポトーシス（キラーＴ細胞としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、外来エピトープを示す体細胞を除去するように設計された細胞性免疫中に産生される）、ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路（共刺激ＣＴＬＡ４経路は、Ｔ細胞の活性化を減衰又はダウンレギュレートする。ＣＴＬＡ４は、外来エピトープを示す体細胞を除去するように設計されている）、サイトカインネットワーク（サイトカインは、免疫細胞への影響に応じて、炎症誘発性又は抗炎症性サイトカインへの生物学的応答に基づいて分類されている）、ＥｒｂＢファミリー経路（膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＥｒｂＢファミリーは、臓器の成長と発達中に重要な役割を果たす）、Ｆａｓシグナル伝達（ＦＡＳ（ＡＰＯ１又はＣＤ９５とも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのデスドメイン含有メンバーである）、ＦＧＦ経路（血管新生の最もよく特徴付けられたモジュレーターの１つはヘパリン結合線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である）、顆粒球接着及び透析（顆粒球の接着と血管外漏出は、主に非リンパ性内皮細胞との関連で分析されている）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ経路（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ（ＧｚｍＡ）は、アポトーシスの形態学的特徴を備えたカスパーゼ非依存性細胞死経路を活性化する）、ＧＳＫ３シグナル伝達（ＧＳＫ３は、すべての真核生物に見られる、遍在的に発現し、高度に保存された、セリン／スレオニンプロテインキナーゼである）、多能性幹細胞からの造血（造血幹細胞は、自己複製能力の程度に基づいて、長期、短期、及び多能性の前駆細胞に分類される）、多能性幹細胞からの造血（多能性幹細胞は、人間に見られるほぼすべての想定し得る組織タイプを形成することができる）、活性化及び静止Ｔ細胞におけるＩＬ－２遺伝子発現（ＩＬ－２は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びその他の免疫細胞の成長、増殖及び分化を刺激するサイトカインである）、ＩＬ－６経路（ＩＬ－６は、免疫系及び様々な器官の多くの生理学的事象に影響を与える多面的サイトカインである）、ＩＬ－１０経路（ＩＬ－１０は、重要な免疫調節機能を持つ多面性サイトカインであり、その活性が多くの免疫細胞タイプに影響を与える）、ＩＬ－２２経路（ＩＬ－２２は、ＩＬ－１０ファミリーのサイトカインのメンバーであり、免疫系において複数の効果を発揮する）、インターフェロン経路（インターフェロンは、ウイルス感染に対する細胞抵抗性を誘導する能力で最もよく知られている多面性サイトカインである）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、シグナル伝達カスケードであり、その進化的に保存された役割には細胞増殖及び造血が含まれる）、ＭＡＰＫファミリー経路（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、酵母やヒトなどの多様な生物で保存されているセリン／スレオニンプロテインキナーゼの大きなファミリーに属している）、哺乳類のＥＳＣ多能性におけるＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧは、多能性幹細胞で転写され、細胞分化時にダウンレギュレートされる転写因子である）、ｐ５３を介したアポトーシス経路（腫瘍タンパク質ｐ５３は、遺伝毒性又は細胞ストレスに応答したアポトーシス、成長停止、又は老化に関与する多様な遺伝子の発現を調節する核転写因子である）、リウマチ性関節炎の病因（リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、主に手足の小さな関節に影響を与える慢性対称多関節関節疾患である）、Ｂリンパ球におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達（ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、細胞の成長、分化、生存、増殖、移動、及び代謝を含む多くの生物学的プロセスを調節する）、ＲＡＮＫ経路（ＲＡＮＫＬとその受容体ＲＡＮＫは、骨リモデリングの重要な調節因子であり、破骨細胞の発達と活性化に不可欠である）、破骨細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達（ＲＡＮＫＬは、破骨細胞前駆細胞の分化を誘導し、成熟破骨細胞の吸収機能と生存を刺激する）、ＴＧＦベータ経路（形質転換成長因子（ＴＧＦ）ベータファミリーのメンバーは、ほとんどの組織の発達、ホメオスタシス、及び修復において重要な役割を果たす）、ＴＨＣ分化経路（１型（ＴＨ１）及び２型（ＴＨ２）のＴヘルパー細胞は、Ｔヘルパー細胞に由来し、生来の免疫系と適応免疫系の両方の細胞を助ける）、ＴＮＦシグナル伝達経路（腫瘍破骨細胞（ＴＮＦ）は、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性、及び内皮機能に影響を与える多機能の炎症誘発性サイトカインである）、ＴＮＦスーパーファミリー経路（腫瘍壊骨因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである２９の受容体を介してシグナル伝達する１９のメンバーで構成されている）、白血球の経内皮移動（内皮を通過する血漿タンパク質及び溶質の輸送には、２つの異なる経路（経細胞及び傍細胞接合部）が関与する）、肝ＮＫ細胞の殺腫瘍効果（肝臓は、腫瘍の形成及び転移の主要部位である）、ＴＷＥＡＫ経路（ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する細胞表面関連タンパク質であり、複数の生物学的活性を有する）、リガンドのＶＥＧＦファミリーと受容体の相互作用（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、単純な系から複雑な系に進化した高度に保存された遺伝子経路である）などが挙げられる。
先に要約したように、シグナル伝達経路のメンバーの不活性化がスイッチポリペプチドの発現によって制御され得るように、シグナル伝達経路（本明細書に記載の経路を含むが、これに限定されない）の要素を、潜在性不活性化ドメインを含むように改変することができる。使用することができる好適な経路構成要素としては、例えば、入力受容メンバー、中間メンバー、及び出力産生メンバーが挙げられ、例えば、先に列挙された経路の対応するメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
同様に、本明細書に記載の分子回路を使用することにより、本質的には、任意の合成経路を調節することができる。本開示の回路を使用して調節することができる合成シグナル伝達経路の好適で非限定的な例としては、合成又は操作された受容体、例えば、限定するものではないが、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、ｓｙｎＮｏｔｃｈなどによって制御される経路が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、本開示の回路を使用して調節される経路は、免疫調節経路、例えば、免疫活性化経路又は免疫抑制経路を含み得る。かかる免疫調節経路は、天然又は合成の経路であり得、回路が使用される細胞に対して内因性であり得、又は回路が使用される細胞に対して異種であり得る。
本開示の回路を使用して調節され得る合成シグナル伝達経路の好適で非限定的な例として、生合成及び／又は生物生産経路も挙げられる。生合成及び／又は生物生産経路は、天然又は合成の経路であり得、経路が内因性又は異種である細胞及び／又は生物において使用され得る。
本開示の回路を使用して調節され得る生合成経路の非限定的な例としては、ホルモン産生経路（例えば、インスリン産生経路、エストロゲン／プロゲステロン産生経路、アンドロゲン産生経路、成長ホルモン産生経路など）、オピオイド産生経路、イソブタノール産生経路、非リボソームポリケチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）産生経路、抗生物質産生経路、化学療法剤産生経路、アルテミシン酸産生経路、テルペノイド産生経路、ポリケチド産生経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
合成生合成経路の非限定的な例としては、例えば、合成ホルモン産生経路、合成オピオイド産生経路、合成抗生物質産生経路、合成化学療法剤産生経路、合成アルテミシン酸産生経路、合成テルペノイド産生経路、合成ポリケチド産生経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸
先に要約したように、本開示は、分子フィードバック回路をコードする核酸も提供する。主題の核酸としては、例えば、スイッチポリペプチドをコードする配列、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質をコードする配列などが挙げられる。かかる核酸は、１又はそれ以上の配列が調節配列に作動可能に連結されるように構成され得る。例えば、核酸は、スイッチポリペプチドをコードする配列が、シグナル伝達経路の出力に応答する調節配列に作動可能に連結されるように構成され得る。潜在性不活性化ドメインを使用する本質的には任意の回路（本明細書に具体的に記載される回路を含むがこれらに限定されない）をコードする核酸が提供される。主題の回路をコードする単離された核酸、及びかかる核酸を含む様々な構造、例えば、ベクター（例えば、発現カセット、組換え発現ベクター、ウイルスベクターなど）が包含される。
本開示の組換え発現ベクターには、１又はそれ以上の記載された核酸を含むものが含まれる。本開示の回路の構成要素の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＤＮＡであり、例えば、組換え発現ベクターを含む。本開示の回路の構成要素の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡであり、例えば、インビトロ合成ＲＮＡである。
先に要約したように、場合によって、主題の回路は、転写制御要素（例えば、プロモーターやエンハンサーなど）などの調節配列に作動可能に連結されたコード核酸（例えば、スイッチポリペプチド又は潜在性不活性化ドメイン結合シグナル伝達タンパク質をコードする核酸）を利用し得る。場合により、転写制御エレメントは誘導性である。場合により、転写制御エレメントは構成的である。場合により、プロモーターは真核細胞において機能的である。場合により、プロモーターは原核細胞において機能的である。場合により、プロモーターは細胞型特異的プロモーターである。場合により、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多くの好適な転写及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかを、発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６～５４４を参照のこと）。
プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態にあるプロモーター）であり得、それは、誘導性プロモーター（すなわち、その状態、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」が外部刺激、例えば、特定の温度、化合物又はタンパク質の有無によって制御されるプロモーター）であり得、それは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど、例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得、そして、それは、時間的に制限されたプロモーターであり得る（すなわち、当該プロモーターは、胚発生の特定の段階の間に、又は生物学的プロセスの特定の段階、例えば、哺乳動物における細胞周期、毛包周期、哺乳動物における概日周期などの間に、「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にある）。
好適なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当技術分野で公知である。細菌細胞における発現のための、好適なプロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ及びｔｒｃが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞における発現のための好適なプロモーターとしては、酵母プロモーター（例えば、酵母接合経路遺伝子のプロモーター、酵母ガラクトース誘導性プロモーターなど）、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター、及びエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、及び当技術分野で公知の様々な組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、様々な強度の転写制御要素を使用することができる。例を挙げると、例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターといった様々な強度のプロモーター（例えば、弱プロモーター、中間プロモーター及び強プロモーター）使用することができ、例えば、構成的プロモーターｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２などを使用することができるが、これらに限定されない。場合によって、プロモーターの強度は、プロモーター内の結合部位（例えば、ＤＢＤ結合部位）の数をそれぞれ減少又は増加させることによって調節することができ、例えば、弱くしたり、強くしたりすることができる。したがって、対象のプロモーター中に存在する結合部位の数は、多様であり得、１～６以上の範囲であり得、例えば、１、２、３、４、５、６などが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、本明細書に記載される核酸の転写制御要素は、シス作用性調節配列を含み得る。任意の好適なシス作用性調節配列を、本明細書に記載の核酸に使用することができる。例えば、場合によって、シス作用性調節配列は、上流活性化配列若しくは上流活性化配列（ＵＡＳ）であり得、又はそれらを含み得る。場合によって、本明細書に記載の核酸のＵＡＳは、Ｇａｌ４応答性ＵＡＳであり得る。場合によって、有用な転写制御要素には、限定するものではないが、例えば、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーターの核因子などの免疫関連転写制御要素が含まれ得る。
場合によって、本開示の回路の転写制御は、合成転写因子に応答する１又はそれ以上の調節エレメントの使用を含み得る。合成転写因子、及びそれに応答する調節エレメントは、様々であり、例えば、エストラジオールリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）ベースの合成転写因子、プロゲステロンＬＢＤベースの合成転写因子、ジンクフィンガーベースの合成転写因子などを挙げることができるが、これらに限定されない。合成転写因子は、キメラによるものであり得、様々なドメイン、例えばＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、活性化ドメイン、ジンクフィンガードメインなどを含み得る。有用なドメイン、例えば、ＬＢＤ、ＤＢＤ、活性化ドメインなどは様々であり、例えば、Ｇａｌ４ｐ ＤＢＤ、Ｚｉｆ２６８転写因子ＤＢＤ、ウイルス活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４など）、Ｍｓｎ２ｐ活性化ドメインなどを挙げることができるが、これらに限定されない。有用な合成転写因子の非限定的な例としては、例えば、ＧＥＭ（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン－エストラジオールホルモン結合ドメイン－Ｍｓｎ２活性化ドメイン）、Ｚ３ＰＭ（Ｚ３ジンクフィンガー－プロゲステロンホルモン結合ドメイン－Ｍｓｎ２活性化ドメイン）などが挙げられるが、これらに限定されない。これに対応して、有用な調節エレメントは、様々であり、合成転写因子に応答するプロモーターを含み得、例えば、ｐＺプロモーター、ｐＺ３プロモーター、ｐＧＡＬ１プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーター及び合成転写因子の例としては、例えば、本明細書に記載されるものや、Ａｒａｎｄａ－Ｄｉａｚら、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．（２０１７）６（３）：５４５～５５４（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどが挙げられる。
好適なプロモーターは、場合によって、好適な可逆的プロモーターを含み得る。可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物及び原核生物から単離され、誘導され得る。第２の生物（例えば、第１の原核生物及び第２の真核生物、第１の真核生物及び第２の原核生物など）で使用するために、第１の生物に由来する可逆的プロモーターを改変することは、当技術分野で周知である。かかる可逆的プロモーター、及び、かかる可逆的プロモーターに基づくが、さらなる制御タンパク質も含む系としては、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーターなど）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦなどを含むプロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラット糖質コルチコイドレセプタープロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系など）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、大豆熱ショックプロモーターなど）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
使用に適した誘導性プロモーターには、本明細書に記載されているか、又は当業者に知られている任意の誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例としては、化学的／生化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーター、例えば、アルコール調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、及び、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）及びテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む他のテトラサイクリン応答性プロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、蛾エクジソン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、酵母、マウス及びヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合して封鎖するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーター）、病因調節プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン又はベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、及び、光調節プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、有用なプロモーターは免疫細胞プロモーターであり得る。例えば、回路の構成要素が免疫細胞において発現される実施形態では、免疫細胞プロモーターが使用され得る。好適な免疫細胞プロモーターとしては、例えば、ＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、及びＮＫ特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターを使用することができ、例えば、Ｓａｌｍｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７３９、及びＭａｒｏｄｏｎら（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：３４１６を参照されたい。別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを使用することができる。ＮＫ細胞特異的発現は、Ｎｃｒ１（ｐ４６）プロモーターの使用によって達成することができ、例えば、Ｅｃｋｅｌｈａｒｔら（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：１５６５を参照されたい。
場合によって、本開示の核酸の免疫細胞特異的プロモーターは、Ｂ２９遺伝子プロモーター、ＣＤ１４遺伝子プロモーター、ＣＤ４３遺伝子プロモーター、ＣＤ４５遺伝子プロモーター、ＣＤ６８遺伝子プロモーター、ＩＦＮ－β遺伝子プロモーター、ＷＡＳＰ遺伝子プロモーター、Ｔ細胞受容体β鎖遺伝子プロモーター、Ｖ９γ（ＴＲＧＶ９）遺伝子プロモーター、Ｖ２δ（ＴＲＤＶ２）遺伝子プロモーターなどのプロモーターであり得る。
場合により、本開示の回路又はその１又はそれ以上の要素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換え発現ベクターであるか、又は、組換え発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などである。場合により、本開示の回路をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、又はその１又はそれ以上の要素は、組換えレンチウイルスベクターである。場合により、本開示の回路又はその１又はそれ以上の要素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換えＡＡＶベクターである。
好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９、１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４、１９９９；Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４、１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７、１９９９；国際公開第９４／１２６４９号；国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号；及び国際公開第９５／００６５５号を参照されたい）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６、１９９８；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１、１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３、１９９７；Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０、１９９７；Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８、１９９９；Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４、１９９６；国際公開第９３／０９２３９号のＳｒｉｖａｓｔａｖａ；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５；及びＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６、１９９９を参照）に基づくウイルスベクター）；並びに、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルス）に由来するベクター）、などが含まれるが、これらに限定されない。場合により、ベクターはレンチウイルスベクターである。また、トランスポゾン媒介ベクター、例えば、ピギーバックベクター及びｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターも適している。
場合によって、本開示の核酸は、２つ以上のポリペプチドをコードする単一の配列を有し得、その場合、２つ以上のポリペプチドの発現は、個々のコード領域の間に、個々のポリペプチドの個別の発現を容易にする配列要素が存在することによって可能になる。かかる配列要素は、本明細書ではバイシストロニック促進配列と呼ばれることがあり、２つのコード領域間にバイシストロニック促進配列が存在する場合、単一の核酸配列中に存在する各コード領域から別個のポリペプチドの発現が可能になる。場合によって、核酸は、コード領域間にバイシストロニック促進配列を有する単一の核酸中に存在する２つのポリペプチドをコードする２つのコード領域を含み得る。単一の核酸配列から複数の個々のポリペプチドを個別に発現させるために、任意の好適な方法を使用することができ、同様に、バイシストロニック発現の任意の好適な方法を使用することができる。
場合によって、バイシストロニック促進配列は、切断可能な連結ポリペプチドによって一時的に連結される単一の核酸配列からの２つのポリペプチドの発現を可能にし得る。かかる場合、バイシストロニック促進配列は、１又はそれ以上のコードされたペプチド切断部位を含み得る。好適なペプチド切断部位には、自己切断性ペプチドのもの、並びに、別個の酵素によって切断されるものが含まれる。場合によって、バイシストロニック促進配列のペプチド切断部位は、フリン切断部位を含み得る（すなわち、バイシストロニック促進配列は、フリン切断部位をコードし得る）。
場合によって、バイシストロニック促進配列は、自己切断性ペプチド配列をコードし得る。有用な自己切断性ペプチド配列としては、例えば、ペプチド２Ａ配列、例えば、限定するものではないが、Ｔ２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、バイシストロニック促進配列は、１又はそれ以上のスペーサーコード配列を含み得る。スペーサーをコードする配列は、一般に、場合によってペプチドタグとも呼ばれるアミノ酸スペーサーをコードする。有用なスペーサーをコードする配列には、例えば、Ｖ５ペプチドタグをコードする配列を含む、Ｖ５ペプチドコード配列が含まれるが、これらに限定されない。
単一の核酸配列からの複数のコード配列の多重又はバイシストロン性発現は、限定するものではないが、フリン切断、Ｔ２Ａ及びＶ５ペプチドタグ配列を用いる方法を利用し得る。例えば、場合によって、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ベースのシステムが使用され得る。バイシストロニック発現の任意の好適な方法を使用することができ、例えば、Ｙａｎｇら（２００８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１５（２１）：１４１１－１４２３、及びＭａｒｔｉｎら（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．６：４（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
細胞
先に要約したように、本開示はまた、分子フィードバック回路をコードする核酸を含有する細胞を提供する。１又はそれ以上の分子フィードバック回路、及び／又は、その１又はそれ以上の構成要素をコードする１又はそれ以上の核酸を含むように改変された細胞は、本明細書では遺伝子改変されていると見なされ、かかる改変は、所望に応じて、安定的又は一過性であり得る。有用な細胞としては、原核細胞及び真核細胞を挙げることができ、例えば、細菌細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、ヒト細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な細胞としては、幹細胞、前駆細胞、並びに、部分的及び完全に分化した細胞が挙げられる。好適な細胞としては、ニューロン、肝細胞、腎臓細胞、免疫細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肺細胞などが挙げられる。
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞など）、体細胞、例えば、線維芽細胞、乏突起膠細胞、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞などが挙げられる。
好適な細胞としては、ヒト胚性幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自己形質転換拡大心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種異系細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
場合により、細胞は幹細胞である。場合により、細胞は人工多能性幹細胞である。場合により、細胞は間葉系幹細胞である。場合により、細胞は造血幹細胞である。場合により、細胞は成体幹細胞である。
好適な細胞としては、気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ）、バルジ上皮幹細胞（ｂＥＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ＣＥＳＣ）、心幹細胞（ＣＳＣ）、表皮神経堤幹細胞（ｅＮＣＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、肝卵形細胞（ＨＯＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、膵臓幹細胞（ＰＳＣ）、網膜幹細胞（ＲＳＣ）、及び皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）が挙げられる。
場合によって、細胞は免疫細胞である。好適な哺乳動物免疫細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。場合によって、細胞は不死化細胞株ではなく、その代わりに個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、場合により、細胞は、個体から得られる免疫細胞、免疫細胞前駆体、又は免疫幹細胞である。一例として、細胞は、個体から得られるリンパ系細胞、例えば、リンパ球又はその前駆体である。別の例として、細胞は、個体から得られる細胞傷害性細胞又はその前駆体である。別の例として、細胞は、個体から得られる幹細胞又は前駆細胞である。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、一般に、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血細胞（白血球）を含む。「免疫細胞」としては、例えば、リンパ系細胞、すなわち、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が挙げられる。「Ｔ細胞」としては、ＣＤ３を発現するすべての種類の免疫細胞が挙げられ、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、及びガンマデルタＴ細胞が挙げられる。「細胞傷害性細胞」としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球が挙げられ、これらの細胞は、細胞傷害性応答を媒介することができる。「Ｂ細胞」としては、Ｂ細胞系統の成熟細胞及び未成熟細胞が挙げられ、例えば、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞及び形質芽細胞などのＣＤ１９を発現する細胞が挙げられる。免疫細胞としては、プロＢ細胞などのＢ細胞前駆細胞及び形質細胞などのＢ細胞系統誘導体が挙げられる。
本開示の回路を符号化する細胞は、任意の都合の良い方法によって生成することができる。主題の回路の１又はそれ以上の要素をコードする核酸は、主題の免疫細胞に安定的に又は一時的に導入され得、主題の核酸が単に一時的に存在するか、染色体外に維持されるか、又は宿主ゲノムに組み込まれる場合を含む。主題の核酸の導入及び／又は主題の免疫細胞の遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで行うことができる。
場合により、主題の核酸の導入及び／又は遺伝子改変は、エクスビボで行われる。例えば、免疫細胞、幹細胞などは、個体から得られ、個体から得られた細胞は、本開示の回路の構成要素を発現するように改変される。したがって、改変された細胞は、導入された核酸上に存在する１又はそれ以上の分子フィードバック回路によって定義されるように、１又はそれ以上の最適なシグナル伝達経路への制御フィードバックによって改変され得る。場合により、改変された細胞は、エクスビボで調節される。他の場合では、細胞は、（例えば、細胞を取得した個体）に導入され、及び／又は、個体に既に存在し、細胞は、例えば、核酸又はベクターを個体にインビボで投与することによって、インビボで調節される。
場合によって、本開示のフィードバック回路を使用する細胞は、対象の細胞療法に有用な治療用細胞であり得る。例えば、免疫細胞を使用する細胞療法などの用途では、免疫細胞は、目的の治療ペイロードを人体に送達するように操作される。これらの操作された細胞の出力が高すぎる場合、毒性作用が起こり得る（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法で観察されるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）など）が、他方、低すぎる出力では、治療は効果がない可能性がある。治療用細胞は、十分に制御された実験室条件下で所望のレベルの出力（すなわち、設定点）を達成するように微調整することができる。しかしながら、操作された治療用細胞が機能する動的環境では、出力が時間の経過と共に一定に保たれることを保証することが困難になる。フィードバック制御を実施するために本明細書に記載の分子回路を使用して、操作された細胞は、環境に遭遇する外乱（例えば、出力をドリフトさせる外乱を含む）を自動的に補正する能力を有する。一態様では、自己調節操作された細胞は、インビボのシナリオにおいてより堅牢であり、その結果、合成生物学の既存の細胞療法の適用を改善する。
場合によって、ＣＡＲ Ｔ細胞又は合成受容体（例えば、ＳｙｎＮｏｔｃｈ）有効Ｔ細胞などの細胞治療は、安全機構としてのフィードバック制御から大きな恩恵を受ける。ＣＡＲ Ｔ細胞のフィードバックコントローラは、Ｔ細胞活性化のレベルを調節し得、免疫細胞の過剰刺激に起因するＣＲＳなどの毒性作用を阻害し得る。同様に、ＳｙｎＮｏｔｃｈ Ｔ細胞において、例えば、フィードバック制御は、操作された細胞に対してどのような外乱が存在するか又は導入されるにかかわらず、目的のペイロードを正確な濃度で送達することを可能にし得る。容易に理解されるように、治療用細胞におけるフィードバック制御の使用は、これらのアプローチに限定されず、他のアプローチも含む。
本開示の回路を使用することができる有用な細胞は、治療用細胞に限定されない。例えば、場合によって、生物生産に使用される細胞を使用することができる。本明細書で使用される「生物生産」とは、一般に、例えば、工業、商業、生物医学、研究などの様々な用途のために、細胞を用いて所望の要素を産生するプロセスを意味する。生物生産プロセスで生産される生物学的産物は多様であり得、かかる産物は、その生産に使用される細胞及び／又は生物にとって内因性又は異種であり得る。場合によって、対象となる生物学的産物としては、組換え治療用タンパク質、ウイルス（例えば、遺伝子治療のための組換えウイルス）、ワクチン、抗体、タンパク質及びペプチド（例えば、酵素、成長因子など）、多糖類、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）、細胞、並びに栄養産物が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の回路及び／又は方法は、当技術分野で公知のいくつかの異なる産生技術、例えば、バイオリアクターにおける細胞（例えば、哺乳動物、酵母、細菌及び／又は昆虫細胞）を使用した生物学的産物の産生、トランスジェニック動物（例えば、ヤギ又はニワトリ）の使用を含む方法、トランスジェニック植物（例えば、タバコ、種子又はコケ）の使用を含む方法、及び当業者に公知の他の方法などと併せて使用することができる。
使用する場合において、生物生産に適した細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＢ２／０細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。有用な細胞は、原核生物起源（例えば、細菌）又は真核生物起源（例えば、哺乳動物、酵母、植物などを含む）のものであり得、場合によって、確立された細胞培養株であり得る。好適な細胞には、場合によって、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞なども含まれ得る。
場合によって、有用な生物産生細胞には酵母細胞が含まれ得る。好適な酵母細胞としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラマエ（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・オパンチエ（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクテリア（Pichia salictaria）、ピキア・ゲルキュウム（Pichia guercuum）、ピキア・ピジェペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スチプチス（Pichia stiptis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア属種（Pichia sp.）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス属種（Saccharomyces sp.）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クリベロマイセス属種（Kluyveromyces sp.）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フサリウム属種（Fusarium sp.）、フサリウム・グラミニウム（Fusarium gramineum）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）などが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、有用な生物生産細胞は原核細胞を含み得る。好適な原核細胞としては、大腸菌、ラクトバチルス属種、サルモネラ種、赤痢菌種などの様々な実験室株のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１７６－１１８１、米国特許第６，４４７，７８４号、及びＳｉｚｅｍｏｒｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９－３０２を参照されたい。使用することができるサルモネラ株の例としては、限定するものではないが、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）及びサルモネラ・チフィリウム（S.typhimurium）が挙げられる。好適な赤痢菌株としては、限定するものではないが、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）及びシゲラ・ディセンテリア（Shigella disenteriae）が挙げられる。典型的には、実験室株は非病原性の株である。他の好適な細菌の非限定的な例としては、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas pudita）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニ（Pseudomonas mevalonii）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドコッカス属種（Rhodococcus sp.）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は大腸菌である。
場合によって、フィードバック制御は、代謝経路中の酵素のバランスが産生物の最適な力価を得るために必須である代謝工学に使用される細胞にとって有用である。代謝経路の中間体、又はその最終生成物ですら、宿主細胞に対して少なくともある程度のレベルの毒性を有することがよく知られている。したがって、効果的な細胞増殖を維持しながら産生される産生物の量を最大化するためには、酵素の比を最適化することが有益である。さらに、工業的発酵で使用される反応器のサイズが大きいために、発酵中において、細胞は、非常に変わりやすい環境を経験する可能性があり、異なるレベルの様々な異なるストレス要因にさらされる可能性がある。これらの外乱は、酵素の活性をシフトさせ、経路活性の「リバランス」を余儀なくさせる可能性がある。本開示の分子回路を使用するフィードバックコントローラは、外乱の影響を緩和し、酵素比を動的にリバランスすることによって力価を最大化する。
方法
先に要約したように、本開示はまた、潜在性不活性化ベースの分子フィードバック回路を使用する方法を提供する。かかる方法としては、例えば、細胞が潜在性不活性化ベースの分子フィードバック回路で遺伝子改変されているか又は遺伝子改変されていた、その細胞のシグナル伝達経路を調節する方法が挙げられるが、これに限定されない。上述の回路及びその構成要素のいずれも、本明細書に記載の方法で使用することができる。
様々な不活性化ストラテジーを使用して、本開示の方法で使用される回路のシグナル伝達タンパク質を不活性化することができる。例えば、場合によって、シグナル伝達タンパク質の不活性化は、例えば、使用される不活性化ドメインがシグナル伝達タンパク質の分解をもたらす場合を含む、分解ベースのストラテジーを使用し得る。場合によって、不活性化ドメインは、分解ドメインであり得るか、又は分解ドメインを含み得る。
場合によって、シグナル伝達タンパク質の不活性化は、例えば、潜在性不活性化ドメインが、プロテアーゼであるか又はプロテアーゼを含むスイッチポリペプチドによって媒介されるタンパク質分解性切断イベントによって活性化される場合を含む、プロテアーゼベースのストラテジーを使用し得る。場合によって、シグナル伝達タンパク質は、発現されたプロテアーゼによって不活性化され得、例えば、シグナル伝達タンパク質がプロテアーゼによって分割される場合が含まれるが、これに限定されない。
場合によって、シグナル伝達タンパク質の不活性化は、局在化ベースのストラテジーを用いることができ、例えば、不活性化ドメインによるシグナル伝達タンパク質の不活性化が、スイッチポリペプチドによって媒介されるシグナル伝達タンパク質の再局在化を含む場合を含む。場合によって、不活性化ドメインによるシグナル伝達タンパク質の不活性化は、シグナル伝達タンパク質を隔離することを含む。場合によって、シグナル伝達タンパク質の再局在化は、局在化シグナルをシグナル伝達タンパク質と関連付ける結合イベントを伴う場合がある。例えば、いくつかの場合によって、不活性化ドメインは、結合ペアの第１のメンバーを含み得、スイッチドメインは、隔離ドメインに連結された結合ペアの第２のメンバーを含み得る。
場合によって、シグナル伝達タンパク質の不活性化は、シグナル伝達タンパク質のドミナントネガティブ抑制を使用し得、例えば、スイッチポリペプチドがドミナントネガティブドメインを含む場合を含む。例えば、主題の方法は、結合ペアの２つのメンバーの結合によって再構成される分割シグナル伝達タンパク質を含み得、ここで、スイッチポリペプチドは、ドミナントネガティブドメインを含むか又はそれに連結された結合ペアのメンバーを含む。かかる方法では、スイッチポリペプチドの結合は、分割シグナル伝達タンパク質の半分の再会合を破壊し、それによって分割シグナル伝達タンパク質を不活性化し得る。したがって、場合によって、シグナル伝達タンパク質のドミナントネガティブ抑制には、シグナル伝達タンパク質に連結され、さもなければ組み込まれた結合ペアのメンバーへの非共有結合ドメインの競合的結合が含まれ得るが、必ずしもこれに限定されない。
先に説明したように、場合によって、本開示の様々な方法において使用され得る結合ペアの有用なメンバーは、ロイシンジッパー結合ペアのメンバーを含み得、すなわち、結合ペアの第１及び第２のメンバーは、ロイシンジッパーの第１及び第２の部分を含み得る。
細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節するために使用される方法は、様々な目的を果たし得る。例えば、場合によって、本開示の回路は、目的のシグナル伝達経路のフィードバック制御を提供する方法で使用され得る。場合によって、フィードバック制御は、数ある態様の中でもとりわけ、例えば、特定の経路出力が閾値レベル以上で生成及び／又は生成される場合に、経路が活性のまま維持されることを防止することができる負のフィードバック制御を含み得る。場合によって、フィードバック制御は、数ある態様の中でもとりわけ、例えば、特定の経路出力を増幅し得る正のフィードバック制御を含み得る。場合によって、フィードバック制御によって、シグナル伝達経路のより安定した出力が得られる場合があり、これには、例えば、経路のシグナル伝達出力が、例えば、環境因子及び環境入力などの不確定要素から隔絶される場合が含まれるが、これに限定されない。
先に説明したように、本開示の方法の細胞は、多様であり得、本明細書に記載の１又はそれ以上の回路の１又はそれ以上の構成要素をコードする１又はそれ以上の核酸で遺伝子改変されたインビトロ及び／又はエクスビボ細胞を含み得る。場合によって、細胞は、対象から得られた初代細胞である。場合によって、細胞は細胞培養物から得られる。
したがって、本開示の方法は、当該方法に使用される細胞を取得することを含み得、これには、かかる細胞が未改変である場合、又は、かかる細胞が本開示の回路を含むように既に遺伝子改変されている場合が含まれ得る。場合によって、本開示の方法は、遺伝子改変を行うことを含み得る。場合によって、本開示の方法は、細胞を収集することを含み得、これには、遺伝子改変の前及び／又は後に細胞が収集される場合が含まれ得る。細胞を収集する方法は、多様であり得、例えば、細胞培養物から細胞を収集すること、目的の細胞を含む対象から細胞試料を収集することなどを含み得る。
場合によっては、本開示の方法は、シグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する（例えば、増加させる及び／又は減少させる）ことを含み得、かかる調節は、潜在性不活性化ドメインを活性化して、経路のシグナル伝達タンパク質の不活性化を引き起こすことを含む。本明細書で説明したように、本開示の回路は、正及び負のフィードバックを含むフィードバックを含み得る。本方法のフィードバックは、少なくとも部分的に、シグナル伝達経路の出力に依存し得る。したがって、いったん回路が導入され、及び／又は、回路を含む細胞が送達されると、回路によるシグナル伝達経路の調節は、さらなる操作を必要としない場合があり、言い換えると、回路によるシグナル伝達経路のフィードバック調節は、本質的に自動であり得る。
したがって、本開示の分子フィードバック回路を含む細胞を使用する方法では、場合によって、細胞を対象に投与することができ、回路のさらなる操作を行う必要はない。例えば、対象が本開示の分子フィードバック回路を含む細胞で治療される場合、その治療は、細胞を対象に投与することを含み得、これには、かかる投与が対象を治療するための唯一の治療介入である場合が含まれ得る。
かかる方法では、投与し得る細胞として、例えば、免疫細胞が挙げられるが、これに限定されない。かかる方法では、本回路は、場合によって、免疫細胞の天然又は合成シグナル伝達経路（例えば、限定するものではないが、免疫活性化経路又は免疫抑制経路など）のシグナル伝達を調節するように構成され得る。好適な免疫活性化経路の非限定的な例としては、天然又は合成の手段によって調節されるか否かにかかわらず、サイトカインシグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路などが挙げられる。好適な免疫抑制経路の非限定的な例としては、天然又は合成の手段によって調節されるか否かにかかわらず、阻害性免疫チェックポイント経路などが挙げられる。
本開示の方法は、治療剤を発現する細胞を対象に投与することを含み得る。かかる細胞は、本開示の分子フィードバック回路を含んでもよく、免疫細胞であってもなくてもよい。例えば、場合によって、方法は、治療薬を内因的又は異種的に産生する非免疫細胞を対象に投与することを含み得、この場合、治療薬の産生は、分子フィードバック回路によって全体的又は部分的に制御される。場合によって、方法は、治療薬を内因的又は異種的に産生する免疫細胞を対象に投与することを含み得、この場合、治療薬の産生は、分子フィードバック回路によって全体的又は部分的に制御される。好適なコードされた治療剤の非限定的な例としては、ホルモン又はホルモン産生経路の要素、例えば、インスリン又はインスリン産生経路の要素、エストロゲン／プロゲステロン又はエストロゲン／プロゲステロン産生経路の要素、テストステロン又はアンドロゲン産生経路の要素、成長ホルモン又は成長ホルモン産生経路の要素などが挙げられるが、これらに限定されない。
かかる方法は、場合によって、ある状態（例えば、代謝又はホルモンの欠乏である場合を含む）について対象を治療するために使用され得る。かかる場合、分子フィードバック回路は、分子フィードバック回路の出力が、全体的又は部分的に、代謝又はホルモンの産生及び／又は分泌を制御するように構成され得る。
場合によって、本方法は、細胞を、回路をコードする１又はそれ以上の核酸と接触させることであって、かかる接触が核酸を細胞に導入するのに十分であることを含み得る。核酸を細胞に導入する任意の簡便な方法は、本明細書において用途を見出すことができ、それには、ウイルストランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、照射、化学的形質転換、形質導入性担体（例えば、形質導入可能な担体タンパク質）の使用などが含まれるが、これらに限定されない。核酸は、インビトロ又はエクスビボで維持又は培養された細胞に導入され得る。核酸はまた、例えば、核酸を細胞に送達する１又はそれ以上のベクター（例えば、ウイルスベクター）を使用することによって、対象の外部の細胞を単離、培養又は維持する必要なしに、インビボで生きている対象の細胞に導入することができる。
構成要素をコードする回路を送達する任意の簡便な方法が、主題の方法において使用され得る。場合によって、主題の回路は、回路を発現する細胞を対象に投与することによって送達され得る。場合によって、主題の回路は、回路をコードする１又はそれ以上のヌクレオチド配列を含む核酸を対象に投与することによって送達され得る。対象に回路をコードする核酸を投与することは、核酸が発現されていてもまだ発現されていなくてもよい、核酸を含有する細胞を対象に投与することを含み得る。場合によって、回路をコードする核酸を対象に投与することは、核酸を細胞に送達するように設計されたベクターを対象に投与することを含み得る。
主題の方法は、治療薬をコードする核酸配列を含有する細胞を、それを必要とする対象に導入することを含み得、その発現は、分子フィードバック回路によって少なくとも部分的に制御される。当該治療薬は、がんの処置のための治療薬であり得る。導入される細胞は、例えば、骨髄系細胞又はリンパ系細胞を含む免疫細胞であり得る。
治療され得るがんの非限定的な例としては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫など）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん（肝外）、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫など）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫など）、乳がん（例、女性の乳がん、男性の乳がん、小児乳がんなど）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、がん様腫瘍（例えば、小児期、胃腸など）、原発不明のがん、心臓（心臓）腫瘍、中枢神経系（例えば、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、胚性腫瘍、胚細胞腫瘍、リンパ腫など）、子宮頸がん、小児がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳管（例えば、胆管、肝外など）、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（例えば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫など）、骨の線維性組織球腫（例えば、悪性、骨肉腫など）、胆嚢がん、胃がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣など）、妊娠性栄養芽細胞性疾患、神経膠腫、毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症（例えば、ランゲルハンス細胞など）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍（例えば、膵臓神経内分泌腫瘍など）、カポシ肉腫、腎臓がん（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍、小児腎臓腫瘍など）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病（例えば、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、毛状細胞など）、唇及び口腔がん、肝がん（原発性）、非浸潤性小葉がん（ＬＣＩＳ）、肺がん（例えば、非小細胞、小細胞など）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）など）、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンシュトレームなど）、男性の乳がん、骨及び骨肉腫の悪性線維性組織球腫、メラノーマ、メルケル細胞がん、中皮腫、潜在性原発性の転移性扁平上皮がん、ＮＵＴ正中線がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群を伴う正中線路がん、多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生物、真菌症真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病（例えば、慢性（ＣＭＬ）など）、骨髄性白血病（例えば、急性（ＡＭＬ）など）、骨髄増殖性新生物（例えば、慢性など）、鼻腔及び傍鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔がん（例えば、唇など）、口腔咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん（例えば、上皮、生殖細胞腫瘍、低悪性の潜在的腫瘍など）、膵臓がん、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、フェオクロモサイトーマ、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎骨盤及び尿管、移行細胞がん、網膜芽細胞腫、ラブドミオ肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、ユーイング、カポシ、骨肉腫、ラブドミオ肉腫、軟組織、子宮など）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、小児期、メラノーマ、メルケル細胞がん、非黒色腫など）、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、扁平頸部がん（例えば、潜在性原発性、転移性などを伴う）、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、喉がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎骨盤及び尿管の移行細胞がん、尿管及び腎骨盤がん、尿道がん、子宮がん（例えば、子宮内膜など）、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍などが挙げられる。
場合によって、本開示の方法は、免疫機能障害（例えば、症状が自己免疫疾患である場合が含まれるが、これに限定されない）について対象を処置するために使用され得る。例えば、場合によって、本開示の分子フィードバック回路は、自己免疫疾患について対象を治療するために、自己免疫疾患を有する対象の免疫活性化レベルを調節し、その結果、対象の自己免疫応答を制御するように構成され得る。場合によって、自己免疫疾患を有する対象に、本開示の分子フィードバック回路であって、その出力が免疫抑制である分子フィードバック回路を含むように構成された細胞を投与し得る。
本開示は、本明細書に記載の方法で使用される核酸、回路、及び細胞を作製する方法をさらに含む。主題の核酸及び回路並びにそれらの構成要素を作製する際に、核酸操作、改変及び増幅（例えば、「クローニング」と総称される）のうちで、都合の良い任意の方法を使用することができる。記載された回路をコードする核酸を含む主題の細胞を作製する際に、トランスフェクション、形質導入、培養などのうちで、都合の良い方法を使用することができる。
本開示の回路の構成要素の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター及び／又はクローニングベクター中に存在し得る。主題の回路又はその構成要素が２つ以上の別個のポリペプチド間で分割される場合、２つ以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同じベクター又は別個のベクターにクローニングすることができる。発現ベクターは、選択マーカー、複製起点、及びベクターの複製及び／又は維持を提供する他の特徴を含み得る。好適な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
多数の好適なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、多くは、主題の組換え構築物を作製するために市販されている。例として、以下のベクターを示す。細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ １７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列を挿入するのに好都合な、プロモーター配列の近くに位置する制限部位を有する。発現宿主において作動可能な選択マーカーが存在していてもよい。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９、１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４、１９９９；Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４、１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７、１９９９；国際公開第９４／１２６４９号；国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号；及び国際公開第９５／００６５５号を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６、１９９８；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１、１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３、１９９７；Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０、１９９７；Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８、１９９９；Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４、１９９６；国際公開第９３／０９２３９号のＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５；及びＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３、１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６、１９９９を参照されたい）に基づくウイルスベクター）、並びに、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及び、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、などが挙げられるが、これらに限定されない。
上記のように、いくつかの実施形態では、本開示の回路又はその構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、インビトロ合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、インビトロ合成ＲＮＡ、組換えＲＮＡなどである。ＤＮＡ／ＲＮＡのインビトロ合成方法は、当技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用して、所望の配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡを合成することができる。ＤＮＡ／ＲＮＡを宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知である。ＤＮＡ／ＲＮＡの宿主細胞への導入は、インビトロ、又はエクスビボ、又はインビボで行うことができる。例えば、宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球など）に、本開示の回路の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡをインビトロ又はエクスビボで形質導入、トランスフェクト又は電気穿孔することができる。
本開示の方法は、本開示の回路をコードするように遺伝子改変された細胞を培養することをさらに含み得、例えば、投与前に細胞を培養すること、インビトロ又はエクスビボ（例えば、１又はそれ以上の抗原の存在又は非存在）で細胞を培養することなどを含み得るが、これらに限定されない。細胞培養について任意の便利な方法が使用され得るが、かかる方法は、様々な要因、限定するものではないが、例えば、培養する細胞の種類、細胞の使用目的（例えば、細胞が研究目的又は治療目的のために培養されるかどうか）など、に基づいて異なる。場合によって、本開示の方法は、細胞培養物の一般的なプロセスをさらに含み得、例えば、細胞培養物の播種、細胞培養物の供給、細胞培養物の継代、細胞培養物の分割、細胞培養物の分析、細胞培養物の薬物による処理、細胞培養物の採取などを含み得るが、これらに限定されない。
本開示の方法は、場合によって、主題の方法で使用される細胞を取得すること及び／又は収集することをさらに含み得る。場合によって、細胞は、対象から収集される。対象から細胞を収集することは、対象から組織試料を得ること、並びに、組織試料から細胞を濃縮、単離及び／又は増殖させることを含み得る。細胞の単離及び／又は濃縮は、例えば、培養による単離／濃縮（例えば、接着培養、懸濁培養など）、細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ、マイクロフルイディクスなど）などを含む、任意の好都合な方法を用いて行うことができる。細胞は、例えば、血液（例えば、末梢血、臍帯血などを含む）、骨髄、生検、皮膚試料、頬スワブなどを含むがこれらに限定されない任意の便利な細胞組織試料から収集することができる。場合によって、細胞は、例えば、血液バンク、組織バンクなどを含む供給源から得る。得られた細胞は、前もって単離されたものであってもよく、又は、組織試料の一部として取得したものであってもよく、例えば、単離／濃縮は、細胞を得た後、使用前に行われ得る。特定の例では、得られた細胞は、例えば、培養細胞株の細胞を含む非初代細胞であり得る。本明細書に記載の方法で使用するのに適した細胞を、本明細書でさらに詳述する。
本開示の非限定的な態様の例
上述の本主題の態様（実施形態を含む）は、単独で、又は１若しくはそれ以上の他の態様又は実施形態と組み合わせて、有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１－［ｘｘｘ］の番号が付けられた本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかなように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、先行する又は後続する個々に番号付けされた態様のいずれかと一緒に使用する又は組み合わせることができる。これは、すべてのかかる態様の組み合わせをサポートすることを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
１．シグナル伝達経路の入力によって活性化されると前記シグナル伝達経路の出力を駆動するシグナル伝達タンパク質であって、潜在性不活性化ドメインを含むシグナル伝達タンパク質と、
前記出力に応答する調節配列であって、発現すると前記不活性化ドメインをトリガーして前記シグナル伝達分子を不活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列と
を含む分子フィードバック回路。
２．前記入力若しくは前記出力又はその両方が、細胞内シグナルを含む、態様１に記載の回路。
３．前記入力若しくは前記出力又はその両方が、細胞間シグナルを含む、態様１に記載の回路。
４．前記不活性化ドメインが、分解ドメインである、態様１から３のいずれかに記載の回路。
５．前記分解ドメインが、デグロンを含む、態様４に記載の回路。
６．前記潜在性不活性化ドメインが、前記シグナル伝達タンパク質の分解を防止し、前記スイッチポリペプチドによって脱保護されている保護ドメインを含む、態様４又は５に記載の回路。
７．前記スイッチポリペプチドが、プロテアーゼを含む、態様６に記載の回路。
８．前記不活性化ドメインが、結合ペアの第１のメンバーを含む、態様１から３のいずれかに記載の回路。
９．前記スイッチポリペプチドが、隔離ドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、態様８に記載の回路。
１０．前記隔離ドメインが、原形質膜標的化タグ、ミトコンドリア膜標的化タグ、ペルオキシソーム標的化タグ、液胞標的化タグ、又はアクチン細胞骨格標的化タグを含む、態様９に記載の回路。
１１．前記スイッチドメインが、ドミナントネガティブドメインを含む前記結合ペアの第２のメンバーを含む、態様８に記載の回路。
１２．前記潜在性不活性化ドメインが、前記結合ペアの前記第１のメンバーに非共有結合的に結合した競合的結合ドメインを含む、態様１１に記載の回路。
１３．前記結合ペアの前記第１及び第２のメンバーが、ロイシンジッパーの第１及び第２の部分を含む、態様８から１２のいずれかに記載の回路。
１４．前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の正の調節因子である、態様１から１３のいずれかに記載の回路。
１５．前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の負の調節因子である、態様１から１４のいずれかに記載の回路。
１６．前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の中間メンバー又は転写因子である、態様１から１５のいずれかに記載の回路。
１７．前記転写因子が、合成転写因子である、態様１６に記載の回路。
１８．前記調節配列が、前記出力の転写因子に対する結合部位を含む、態様１から１７のいずれかに記載の回路。
１９．前記調節配列が、前記転写因子のための複数の結合部位を含む、態様１８に記載の回路。
２０．前記複数の結合部位が、２から１０個の結合部位である、態様１９に記載の回路。
２１．前記出力が、前記転写因子の発現である、態様１６から２０のいずれかに記載の回路。
２２．前記シグナル伝達タンパク質が受容体であり、前記入力が前記受容体に対するリガンドである、態様１から１５のいずれかに記載の回路。
２３．前記シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、エストロゲンシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、免疫活性化経路、免疫抑制経路、免疫細胞分化経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路、ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、ｐ５３シグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、ＴＧＦベータシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＴＮＦシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、及びＷｎｔシグナル伝達経路からなる群から選択される、態様１から２２のいずれかに記載の回路。
２４．前記シグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列をさらに含む、態様１から２３のいずれかに記載の回路。
２５．前記シグナル伝達タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された前記調節配列が、前記シグナル伝達タンパク質の天然プロモーターである、態様２４に記載の回路。
２６．前記シグナル伝達経路が、合成シグナル伝達経路である、態様１から２２のいずれかに記載の回路。
２７．前記受容体が、合成受容体である、態様２６に記載の回路。
２８．前記合成受容体が、ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体である、態様２７に記載の回路。
２９．前記合成受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、態様２７に記載の回路。
３０．前記出力が、免疫活性化又は免疫抑制である、態様２９に記載の回路。
３１．態様１から３０のいずれかの分子フィードバック回路をコードする１又はそれ以上の核酸分子。
３２．態様３１に記載の１又はそれ以上の核酸分子を含むように遺伝子改変された細胞。
３３．真核細胞である、態様３２に記載の細胞。
３４．症状について対象を治療する方法であって、態様３３に記載の真核細胞の有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
３５．前記症状ががんであり、前記分子フィードバック回路の前記出力が免疫活性化である、態様３４に記載の方法。
３６．前記症状が自己免疫疾患であり、前記分子フィードバック回路の前記出力が免疫抑制である、態様３４に記載の方法。
３７．前記症状が代謝又はホルモンの欠乏であり、前記分子フィードバック回路の前記出力が前記代謝又は前記ホルモンの産生及び／又は分泌である、態様３４に記載の方法。
３８．細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する方法であって、
前記細胞を分子フィードバック回路で遺伝子改変する工程を含み、
前記分子フィードバック回路が、
前記シグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列であって、前記シグナル伝達タンパク質が潜在性不活性化ドメインを含む、核酸配列と、
前記シグナル伝達経路の出力に応答する調節配列であって、発現されると潜在性不活性化ドメインを活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列とを含み、
前記活性化された不活性化ドメインが前記シグナル伝達タンパク質を不活性化し、それによって、前記シグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する、方法。
３９．前記調節することが、負のフィードバックを含む、態様３８に記載の方法。
４０．前記調節することが、正のフィードバックを含む、態様３８に記載の方法。
４１．前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質の分解を含む、態様３８から４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記不活性化ドメインが、分解ドメインである、態様４１に記載の方法。
４３．前記潜在性不活性化ドメインが、前記スイッチポリペプチドによって媒介されるタンパク質分解的切断イベントによって活性化される、態様４１又は４２に記載の方法。
４４．前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質の隔離を含む、態様３８から４０のいずれかに記載の方法。
４５．前記不活性化ドメインが、結合ペアの第１のメンバーを含み、前記スイッチドメインが、隔離ドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、態様４４に記載の方法。
４６．前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質のドミナントネガティブ抑制を含む、態様３８から４０のいずれかに記載の方法。
４７．前記スイッチドメインが、ドミナントネガティブドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、態様４６記載の方法。
４８．前記潜在性不活性化ドメインが、前記結合ペアの前記第１のメンバーに非共有結合的に結合した競合的結合ドメインを含む、態様４６又は４７に記載の方法。
４９．前記結合ペアの前記第１及び第２のメンバーが、ロイシンジッパーの第１及び第２の部分を含む、態様４５から４８のいずれかに記載の方法。
５０．前記細胞が、インビトロ細胞又はエクスビボ細胞である、態様３８から４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記シグナル伝達経路が、前記細胞の天然のシグナル伝達経路である、態様３８から５０のいずれかに記載の方法。
５２．前記天然のシグナル伝達経路が、天然の生合成経路である、態様５１に記載の方法。
５３．前記天然の生合成経路が、ホルモン産生経路である、態様５２に記載の方法。
５４．前記ホルモン産生経路が、インスリン産生経路、エストロゲン／プロゲステロン産生経路、アンドロゲン産生経路、及び成長ホルモン産生経路からなる群から選択される、態様５３に記載の方法。
５５．前記細胞が免疫細胞であり、前記天然のシグナル伝達経路が免疫活性化経路又は免疫抑制経路である、態様４４に記載の方法。
５６．前記免疫活性化経路が、サイトカインシグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、及びＴ細胞受容体シグナル伝達経路からなる群から選択される、態様４８に記載の方法。
５７．前記免疫抑制経路が、阻害性免疫チェックポイント経路である、態様４８に記載の方法。
５８．前記シグナル伝達経路が、合成シグナル伝達経路である、態様３８から５０のいずれかに記載の方法。
５９．前記シグナル伝達タンパク質がｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体であり、前記出力が前記ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインの放出である、態様５８に記載の方法。
６０．前記細胞が免疫細胞であり、前記シグナル伝達経路が合成免疫活性化経路又は合成免疫抑制経路である、態様５８に記載の方法。
６１．前記免疫細胞が、骨髄系細胞又はリンパ系細胞である、態様６０に記載の方法。
６２．前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるリンパ系細胞である、態様６１に記載の方法。
６３．前記シグナル伝達タンパク質が、合成免疫受容体である、態様６０から６２のいずれかに記載の方法。
６４．前記合成免疫受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、態様６３に記載の方法。
６５．前記出力が、免疫活性化又は免疫抑制である、態様５８から６４のいずれかに記載の方法。
６６．前記合成シグナル伝達経路が、合成生合成経路である、態様５８に記載の方法。
６７．前記合成生合成経路が、ホルモン産生経路、オピオイド産生経路、抗生物質産生経路、化学療法剤産生経路、アルテミシン酸産生経路、テルペノイド産生経路、及びポリケチド産生経路からなる群から選択される、態様６６に記載の方法。
以下の実施例は、当業者に本発明を構成し使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されており、本発明者らが彼らの本発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされてはいるが、いくつかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はその近傍である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内の（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（腹腔内に）；ｓ．ｃ．、皮下の（皮下に）；などが使用される場合がある。
実施例１：シグナル伝達経路の構成要素の潜在性不活性化を使用するフィードバック回路ストラテジー
シグナル伝達経路の構成要素の潜在性不活性化を使用するフィードバック回路を構築するために、様々なストラテジーを用いた。これらの例で「生物学的ネットワーク」と呼ばれるシグナル伝達経路の図式化された例を図７の左パネルに示す。示されるように、シグナル伝達経路の構成要素であるシグナル伝達タンパク質「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｚ」は、入力を変換して転写の「出力」をもたらす。用いたストラテジーの例としては、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバック（図７、第２パネル）、隔離フィードバック（図７、第３パネル）、及び競合フィードバック（図７、第４パネル）を使用した誘導分解が挙げられる。場合によっては、以下に説明するように、ＬＯＣＫＲベースのシステム（例えば、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ、ｎｅｓＬＯＣＫＲ、及びｎｌｓＬＯＣＫＲ）を使用する例は、本明細書に記載の回路で使用される潜在性不活性化の一般的なストラテジーの概念実証を提供する。しかしながら、かかる例では、ＬＯＣＫＲベースのシステムの使用は、単なる例示及び／又は比較であり、本開示を考慮すると、ＬＯＣＫＲ非依存性システム（すなわち、ＬＯＣＫＲを一般的に使用しないシステム、又は、例えば、特に、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ、ｎｅｓＬＯＣＫＲ若しくはｎｌｓＬＯＣＫＲを使用しないシステム）に容易に代替することができる。
ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバック例では、ケージドデグロンがシグナル伝達タンパク質「Ｂ」に結合するように回路が構成されている。回路は、キーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された調節配列を有する核酸を含むようにさらに構成される。図示のように、使用される調節配列は、シグナル伝達経路の中間要素に応答性である。したがって、シグナル伝達経路がシグナルを伝達し、シグナル伝達経路の中間要素が発現されるか、さもなければ活性化されると、キーポリペプチドが発現される。キーポリペプチドの発現は、ケージドデグロンをアンケージングし、シグナル伝達経路要素「Ｂ」の分解及び経路シグナル伝達に対する負のフィードバックをもたらす。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックのさらなる例は、実施例４に提供されている。
隔離フィードバックの例では、回路は、「獲物（prey）」とも呼ばれる結合ペアの第１のメンバーがシグナル伝達タンパク質「Ｂ」に結合するように構成される。回路は、原形質膜（ＰＭ）に局在するタンパク質モチーフに結合した、図７で「えさ（bait）」と呼ばれる結合ペアの第２のメンバーをコードする配列に作動可能に連結された調節配列を有する核酸を含むようにさらに構成される。図示のように、使用される調節配列は、シグナル伝達経路の中間要素に応答性である。したがって、シグナル伝達経路がシグナルを伝達し、シグナル伝達経路の中間要素が発現されるか、さもなければ活性化されると、「えさＰＭ」ポリペプチドが発現される。発現されたえさＰＭポリペプチドは、シグナル伝達経路要素「Ｂ」に結合した獲物ドメインに結合する。その結果、シグナル伝達経路要素「Ｂ」は、要素「Ｂ」がシグナル伝達経路内で機能する細胞内の位置から離れて原形質膜に隔離される。したがって、要素「Ｂ」の隔離は、経路シグナル伝達に対する負のフィードバックをもたらす。隔離フィードバックの一例は、以下でより詳細に説明する「アンカーアウェイ」回路を含む。
競合フィードバック例では、シグナル伝達経路の要素「Ｂ」が分割され、各分割部分に組み込まれたロイシンジッパードメインによって分割部分が再会合するように回路が構成される。その結果、再構成された分割タンパク質は、分割されていない要素「Ｂ」に対応する要素と同様にシグナル伝達経路においてシグナルを伝達することができる。回路は、ドミナントネガティブロイシンジッパードメインをコードする配列に作動可能に連結された調節配列を有する核酸を含むようにさらに構成される。ドミナントネガティブロイシンジッパードメインは、要素「Ｂ」ロイシンジッパードメインが結合する親和性よりも高い親和性で要素「Ｂ」ロイシンジッパードメインの一方又は両方に結合する。したがって、それが存在する場合、ドミナントネガティブロイシンジッパードメインは、要素「Ｂ」の分割部分の再会合を競合的に排除（outcompete）する。したがって、シグナル伝達経路要素「Ｂ」は、ドミナントネガティブロイシンジッパードメインが発現されると不活性化され、経路シグナル伝達に対する負のフィードバックをもたらす。競合フィードバックの一例は、以下の実施例３に記載される回路を含む。
実施例２：アンカーアウェイ：隔離ベースのフィードバック回路
「アンカーアウェイ」と名付けられた隔離ベースのフィードバック回路を図８に概略的に示すように構成した。具体的には、合成転写因子（「ＳｙｎＴＦ」）ＧＥＭをロイシンジッパー（「獲物」）の半分に融合させ、Ｅ２によって誘導してｐＧＡＬ１プロモーターからの転写を活性化した。ＧＥＭは、センサとしてＺ３ＰＭやＲＦＰの生成を活性化させる。Ｚ３ＰＭは、Ｐｇによって誘導され、ｐＺ３プロモーターからの転写を活性化する。Ｚ３ＰＭは、ＹＦＰ及び形質膜標的化ドメイン（「えさＰＭ」）に融合されたロイシンジッパーの他の半分の産生を活性化する。フィードバックは、ＧＥＭを原形質膜に局在化させ、それが転写を活性化するのを妨げる。回路の「アンカー」、「コントローラ」、「プロセス」、及び「制御出力」部分を示すアンカーアウェイ回路の代替図が図９に提供されている。
回路出力を測定するために、アンカーアウェイフィードバック回路を、ＹＦＰを使用する対応する「フィードバックなし」制御回路と組み合わせて構成して試験した。図１０では、プロゲステロンの関数としての定常状態のＹＦＰ出力がアンカーアウェイフィードバックについて示されており、フィードバックなしの挙動が上段に示されている。プロモーター強度の増加（上から下）は、阻害因子（すなわち、えさ）を活性化するＺ３結合部位の数の増加に対応する。これらのデータは、より強いプロモーターがより大きなフィードバック効果をもたらし、最大出力がより低くなり、示されたフィードバック曲線の傾きも変化したことを示す。
実施例３：競合ベースのフィードバック
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）は、ＧＣＡＡＴプロモーターを二量体化して活性化するロイシンジッパー転写因子である。「ＤＮ」は、ＣＥＢＰαモノマーに高い親和性で結合し、転写因子がＤＮＡに結合するのを防ぎ、転写を活性化するドミナントネガティブである（図１１、併せて、Ｂｕｃｈｌｅｒ＆Ｃｒｏｓｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）５：２７２を参照されたく、この開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
アンカーアウェイフィードバック回路は、図１２に概略的に示すように、隔離ベースのフィードバックを競合ベースのフィードバックのための構成要素に置き換えるように再設計された。ＧＥＭ（及びＥ２）は、ＣＥＢＰαの産生を介して回路の設定値を決定する。ＣＥＢＰαは、Ｚ３ＰＭの転写を活性化する。Ｚ３ＰＭは、Ｐｇによって誘導され、ｐＺ３プロモーターからの転写を活性化する。Ｚ３ＰＭは、ＹＦＰと、ＣＥＢＰαＴＦ二量体を分割するロイシンジッパー（ＤＮ）の他の半分の産生を活性化する。したがって、フィードバックはＣＥＢＰαを不活性化し、出力が増加するにつれてＺ３ＰＭの生成を調整する。
図１２に示す閉ループフィードバック回路を構築して、回路出力を測定すべく、ＹＦＰを使用して対応する開ループフィードバック回路と比較した。図１３では、プロゲステロンの関数としての定常状態のＹＦＰ出力が、フィードバックあり（左）及びフィードバックなし（右）で示されている。示されるように、Ｅ２の量を増加させると、回路の出力が増加した。フィードバックは回路の最大出力を減少させ、Ｐｇへの依存性の勾配も減少させた。まとめると、データは、ＤＮを使用する閉ループフィードバック回路が、フィードバックなしの対応する回路（開ループ）と比較して、Ｐｇ用量応答の勾配を変化させることを示している。この実施例は、ドミナントネガティブ産生を使用して、競合ベースのフィードバック回路におけるロイシンジッパー転写因子に対する負のフィードバックを実装し得ることを実証している。
実施例４：デノボタンパク質スイッチを使用したモジュール式で調整可能な生物学的フィードバック制御
この実施例では、モジュール接続性及び予測可能な調整性を有する宿主非認識部分を介して設計された新規のタンパク質スイッチであるｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲを使用して、酵母Ｓ．セレビシエにおける内因性経路及び合成回路に対するフィードバック制御を実施する。
ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ装置は、ＬＯＣＫＲ（Ｌａｔｃｈｉｎｇ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃａｇｅ Ｋｅｙ ｐＲｏｔｅｉｎｓ）技術に基づいており、デザイナーであるｄｅｇＳｗｉｔｃｈとキータンパク質からなる。ｄｅｇＳｗｉｔｃｈは、不安定化した６番目のヘリックス（ラッチ）に埋め込まれたｃＯＤＣデグロンを有する６ヘリックスバンドルであり、これは５ヘリックス足場（ケージ）との相互作用を介して閉塞される。遺伝的にコードされたペプチドであるキーは、ケージとの結合に関してラッチを競合的に排除することができる。これにより、ｃＯＤＣデグロンが露呈し、その結果、分解のためにｄｅｇＳｗｉｔｃｈ及び任意の融合カーゴをプロテアソームに標的化する。タンパク質分解が翻訳後調節のための普遍的な方法であることから、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲは、合成生物学のための強力なデバイスである。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲは、転写因子の安定性を調節することによって遺伝子発現を制御できることが示されている。ここで、この機能は、ネットワークの出力（図１４、パネルａ）の関数としてキーを表現することによってｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲを使用して生物学的ネットワーク上でモジュール式フィードバック制御を実施するために利用される。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックストラテジーは、フィードバック制御を実施するための他のアプローチに勝るいくつかの利点を提供する。第１に、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲのモジュール性により、ｄｅｇＳｗｉｔｃｈを目的の任意のタンパク質に直接融合してオンターゲット効果を生じさせることが可能になる。ｄｅｇＳｗｉｔｃｈで内因性遺伝子を改変すると、シグナル伝達タンパク質の天然の転写及び翻訳調節も維持される。最後に、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲは完全にデノボ設計されたタンパク質であり、それゆえ、その特性を調整するための予測どおりの改変が可能になる。
内因性酵母経路におけるｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ合成負のフィードバック
定性的な概念実証として、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲを使用して、多くの内因性フィードバックループを有する複雑なシグナル伝達経路である酵母ＭＡＰＫ接合経路（図１４、パネルｂ）における合成負のフィードバックを実施した。経路出力を調節するｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲの能力を、ΔＦＡＲ１ ΔＢＡＲ１バックグラウンド株におけるいくつかの正の経路分子の内因性遺伝子座にｄｅｇＳｗｉｔｃｈを付加することによって試験し、誘導性システム（Ａｒａｎｄａ－Ｄｉａｚら、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．６，５４５－５５４（２０１７））を使用してキーを発現させた（図１４、パネルｃ）。キーは、核局在化配列を使用して、細胞質ゾル又は核のいずれかに標的化され、細胞の特定の区画における各分子の分解を引き起こした（図１５）。この局所的な誘導性分解は、細胞における位置特異的作用を可能にするｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲの固有の特徴である。接合経路を飽和用量のα因子（１００ｎＭ）で刺激し、ｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣ（ＭｃＣｕｌｌａｇｈら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２，９５４－９６２（２０１０））転写レポーター（ｃＯＤＣ ｄｅｇｒｏｎ（Ｈｏｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１２１３５－１２１４３（２００３））は、長寿命の蛍光レポーターを不安定化し、動態を観察することを可能にする）を使用して経路活性をモニターした。ＳＴＥ２０（ＭＡＰＫＫＫＫ）、ＳＴＥ１１（ＭＡＰＫＫＫ）及びＦＵＳ３（ＭＡＰＫ）の分解は、中程度の効果を有したが、ＳＴＥ１２（ＴＦ）の分解は、接合経路の出力を完全に排除した（図１４、パネルｃ、下）。これらのデータは、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲが内因性経路を調節するための有効なツールであることを示している。
次に、内因性ＳＴＥ１２をｄｅｇＳｗｉｔｃｈに融合した株（図１６、パネルａ）において、接合経路応答プロモーター（ｐＦＩＧ１）からキー－ＣＦＰ－ＮＬＳを発現させることによって、接合経路の合成負のフィードバック制御を実施した。このフィードバックの効果を、ＳＴＥ１２が依然としてｄｅｇＳｗｉｔｃｈに融合されているが、キーが構成的プロモーターによって駆動されるフィードバックのない株と比較した。自動化フローサイトメトリーを使用して、高用量（２５ｎＭ）、中用量（６．２５ｎＭ）及び低用量（３．１３ｎＭ）のα因子（図１６、パネルｂ）で刺激した後、ｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣ動態を追跡した。比較のために、フィードバックのない株（ｐＲＥＶ１－ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）を同時に測定した。各用量のアルファ因子で刺激した後、合成フィードバック株の出力とフィードバックのない株の出力は、最初は互いに近接して追随していた。約２時間後、合成フィードバックの出力が減少し始める一方で、フィードバックなしの出力は、様々な用量のα因子に対応する様々な定常状態になるまで増加した。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ合成フィードバックを有する株は、α因子の用量が大きいほど、より大きい一過性のオーバーシュートを示したが、最終的には、入力のサイズに関係なく、同じ定常状態出力に収束した。これらのデータは、合成フィードバックが、定常状態の出力を、この入力レジームにおける接合経路のα因子に対して脱感作することを示唆している。この結果は、観察された一過性現象が異なるため、シグナル伝達の飽和によるものではない可能性が高い。
合成フィードバック株及びフィードバックなし株の定常状態の挙動のより全体的な比較を得るために、それぞれの出力用量応答をα因子の関数として測定した。フィードバック株は、用量応答の線形領域において、最大出力振幅の減衰と勾配の減少を示した（図１６、パネルｃ）。合成フィードバック株を様々な構成的プロモーター強度を有するフィードバックなし株と比較すると（Ｌｅｅら、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．４，９７５－９８６（２０１５））（ｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２）、フィードバックによって生成された挙動は、異なる構成量のキーを発現させることでは達成できないことがわかる。まとめると、動的適応挙動及び用量応答は、合成負のフィードバックの効果と、複雑な内因性シグナル伝達経路の迅速な再配線のためのツールとしてのｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲの有用性を明確に実証している。
合成転写カスケードにおけるｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバック
次に、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックモジュールの定量的能力及び操作範囲を、２つの誘導性合成転写因子からなる単純な合成転写カスケード（Ａｒａｎｄａ－Ｄｉａｚら）を使用してマッピングした（図１７、パネルａ）。第１に、ＧＥＭ（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン－エストラジオールホルモン結合ドメイン－Ｍｓｎ２活性化ドメイン）は、エストラジオール（Ｅ２）によって誘導され、ｐＧＡＬ１を活性化してＺ３ＰＭ（Ｚ３ジンクフィンガー－プロゲステロンホルモン結合ドメイン－Ｍｓｎ２活性化ドメイン）を産生する。次いで、Ｚ３ＰＭは、プロゲステロン（Ｐｇ）によって誘導され、ｐＺ３－ＹＦＰ－ｃＯＤＣの転写を活性化する。フィードバックを実装するために、接合経路の制御に成功したのと同じモジュール式ストラテジーを用いた。すなわち、ｄｅｇＳｗｉｔｃｈにＧＥＭを融合し、ｐＺ３を使用してｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳを発現させた（合成フィードバック）。キーの産生量、ひいてはＧＥＭの劣化速度がＺ３ＰＭ活性の関数であるため、フィードバックにより、ＧＥＭの濃度はＺ３ＰＭの出力に依存する。Ｐｇの添加、又はＺ３ＰＭに融合した青色光誘導性デグロン（ｐｓｄ）（Ｒｅｎｉｃｋｅら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０，６１９－６２６（２０１３））の誘導によって回路が摂動され、出力をそれぞれ増加又は減少させることができる。フィードバックは、Ｚ３ＰＭの濃度を調節することによって、これらの外乱を緩衝する。この種の外乱除去実験は、技術システムにおけるフィードバックの本質的な試験である。
本回路の単純な計算モデルは、Ｐｇを増加させると、フィードバックなしでは出力の単調な増加をもたらすのに対し（構成的に発現されるキー）、フィードバックは、出力の一過性の増加をもたらし、続いて、Ｐｇを同じように増加させた場合、フィードバックなしの回路よりも外乱前の値に近い値を有する定常状態に適応すること（図１７、パネルｂ、左）を予測する。フィードバックは、Ｚ３ＰＭの産生速度を減少させることによって、出力のＰｇ外乱への依存性を減衰させ、その結果、その濃度の減少に伴ってＰｇが増加した後のＺ３ＰＭ活性の増加を補償する（図１７、パネルｂ、右、図１８）。
これらの予測は、まず、７．５ｎＭのＥ２及び０．７８ｎＭのＰｇを有する細胞を誘導し、それらの出力が定常状態に達するまで増殖させることによって実験的に検証された（図１７、パネルｃ）。その時点で、細胞をＰｇの高（６．２５ｎＭ）、中（３．１３ｎＭ）又は低（１．５６ｎＭ）ステップ入力で摂動させ、ｐＺ３－ＹＦＰ－ｃＯＤＣの動態を、自動フローサイトメトリー及びオプトジェネティクス対応の連続培養プラットフォームを使用して測定した。コントロールとして、Ｅ２及びＰｇの外乱前の濃度におけるフィードバック株と同様のＹＦＰ定常状態出力を有するフィードバックなしの株（ｐＲＮＲ２発現キー）に対して同じ一連の誘導を行った。フィードバックがない場合、Ｐｇのステップ入力により、Ｚ３ＰＭの活性が増加し、その結果、出力が外乱に見合った新しい定常状態に達するまでＹＦＰの発現が増加した。対照的に、合成フィードバック回路は、Ｚ３ＰＭ活性が増加するにつれて、キーの発現を増加させ、ＧＥＭの劣化をもたらし、その結果、Ｚ３ＰＭ生成の減少をもたらした。この緩衝効果は、フィードバックなしの回路の出力が上昇し続けている一方で、合成フィードバック回路の出力が減少し始める、外乱の２時間後から明らかに始まっている。この適応挙動は、接合経路のために構築された合成の負のフィードバックループと質的に類似している。入力及び外乱が明確に定義されているために、外乱前出力によって正規化された外乱後出力と外乱前出力との間の絶対差の逆数をとることによって計算された精度メトリックを使用して適応を定量化することができる（Ｍａら、Ｃｅｌｌ １３８，７６０－７７３（２００９））（図１７、パネルｅ）。フィードバック回路は、Ｐｇの正の外乱に対するフィードバックのない回路よりもはるかに高い精度をもたらし、フィードバック制御の利点を示す。
同様の実験を行い、細胞を負の外乱にさらした。細胞を３０ｎＭ Ｅ２及び１．５７ｎＭ Ｐｇで定常状態まで増殖させ、次いで、青色光で誘導してＺ３ＰＭの分解を活性化した（図１７、パネルｄ）。コントロールとしては、外乱前の合成フィードバック回路の定常状態の発現と一致するように、ｐＲＰＬ１８Ｂから構成的に発現されたキーを有するコントロールとして、フィードバックのない回路を構築した。Ｚ３ＰＭの分解の結果として、合成フィードバック回路とフィードバックなし回路の両方でＹＦＰ発現が直ちに減少した後、フィードバックなし回路は、より低い新たな定常状態に落ち着いた。しかしながら、フィードバック回路は、わずかにオーバーシュートした後、フィードバックなし回路よりも外乱前の値に近い定常状態に復帰した。負の外乱に対する合成フィードバック回路における適応量は、正の外乱ほど劇的ではない（図１７、パネルｆ）。モデルシミュレーションは、負の外乱が回路の出力をより低い発現レベルに押し下げ、フィードバックのある回路とフィードバックのない回路との間の相対差がより小さくなることを示す。したがって、フィードバックが負の外乱に対して依然として能動的に緩衝している場合であっても、その影響を観察することはより困難である。このことは、いかなるフィードバック回路も、それが生物学的分子又は電子部品で構築されているかどうかにかかわらず、生産的なモジュラー使用を可能にするために徹底的なプロトタイピングを通して調査する必要がある特性を持っているという事実を強調している。
ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫフィードバックモジュールの特性をさらに描写するために、フィードバック回路及びフィードバックなし回路をＥ２及びＰｇ濃度の全範囲で誘導し、フローサイトメトリーを使用して定常状態におけるｐＺ３－ＹＦＰ－ｃＯＤＣ出力を測定した（図１９及び図２０）。これらの実験では、ｐＧＡＬ１－ＲＦＰを測定して、ＧＥＭの活性、すなわち、そのフィードバック作用に関するより近位の情報を得た。Ｅ２の固定濃度（７．５ｎＭのＥ２）では、Ｐｇを増加させると、飽和に達するまで、フィードバックなし回路のＹＦＰ出力が増加する（図２１、図１７、パネルｅ）。キーはこの株の構成的プロモーターから発現されるので、ＲＦＰ蛍光はＰｇに対して非感受性である。対照的に、合成フィードバック回路においては、ＲＦＰ蛍光は、Ｐｇの関数として減少し、これは、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲがＧＥＭの分解を誘発した結果である。この効果は、この濃度を超える一定のＲＦＰの発現によって示されるように、最終的に６．２５ｎＭ Ｐｇを超えて飽和する。これらの２つの動作領域間の差は、ＹＦＰ出力において明確に見ることができ、これは、アクティブフィードバックの領域においてＰｇに対する感度が低下し、フィードバックが飽和すると劇的に増加することを示している。これらの結果は、キーとｄｅｇＳｗｉｔｃｈとの間の複合体形成が飽和するときに飽和するフィードバックを示すモデルによって定性的に再現される（図１６及び図１７）。
次に、調整可能性ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバック制御を調査した。設計されたフィードバックコントローラの有用な特徴の１つは、アプリケーションに合うようにゲインを調整することができることである。フィードバックゲインを調整する２つの方法、すなわち、フィードバックプロモーターの強度を変更する方法と、キーとケージの結合親和性を変更する方法とを評価した。（図２２、パネルａ）。計算モデルは、フィードバックゲインを調整するためのいずれの方法も定性的に類似しており、そのため互換性があると予測する（図２２、パネルｂ）。これを試験するために、それぞれ４つ及び３つのＺ３結合部位（ＢＳ）を有するｐＺ３プロモーターの中程度の変異体及び弱い変異体を作製した。フィードバックプロモーターの強度を弱める効果を試験するために、異なる回路変異体のＥ２の固定濃度でのＰｇ用量応答を行った（図２２、パネルｂ）。プロモーターを弱めると、定常状態出力のＰｇへの依存性が実際に変化することが観察された。結合部位の数が減少するにつれて、フィードバック回路の出力用量応答は、フィードバックなしの回路に収束した（図２３）。次に、キーの長さを短くすることにより、キーのケージに対する親和性を低下させた。全長キーを４（中）残基又は１２（短）残基だけ切断し、各キーバリアントを、完全強度ｐＺ３プロモーター（６×Ｚ３ ＢＳ）を使用してフィードバック回路で試験した（図２２、パネルｃ、図２３）。フィードバックプロモーターの強度を低下させるのと同様に、キーの長さを短くすると、定常状態出力のＰｇに対する依存性が変化した（図２２、パネルｄ）。いずれかの方法によってフィードバックゲインの強度を減少させると、一過性現象がより大きくなり、適応が低下した（図２４）。キーの長さによってフィードバックゲインを調整することは、プロモーターエンジニアリングにとって魅力的な代替法であり、デノボタンパク質の独自の強みを示している。
これらの調整方法の一般化可能性を示すために、接合経路を修正し、フィードバックプロモーターの強度とキーの長さの両方を変更することによって、合成フィードバックループの組み合わせ調整を行った（図２２、パネルｄ）。ｐＡＧＡ１はｐＦＩＧ１よりもはるかに強力なプロモーターであるため、ｐＡＧＡ１を使用してキーを発現させると、アルファ因子による誘導後に発現パルスが生成された（図２２、パネルｅ）。パルスのサイズ、並びに、それに続く定常状態の出力は、両方とも、キーの長さを短くすることによって増加し、システム内のフィードバックの量が減少した。同様に、フィードバックを駆動するためにより弱いプロモーターｐＦＩＧ１を使用しながらキーの長さを減少させると、より大きな一過性出力と、より高い定常状態の出力が生じた。異なるプロモーター及びキーの長さについてのα因子の関数である定常状態の出力の測定値（図２２、パネルｆ、図２５）は、プロモーター強度又はキーの長さを減少させると、経路の定常状態の出力及び用量応答の傾きが増加して、フィードバックゲインの減少を示すことを明確に実証している。まとめると、これらのデータは、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックストラテジーの特徴である容易な調整可能性を実証している。
方法
ＤＮＡ回路の構築
階層的ゴールデンゲートアセンブリを使用して、Ｌｅｅら（２０１５）による酵母株構築のためのプラスミドを構築した。個々のパーツは、下流での組み立て及び直線化を容易にするために、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ及びＮｏｔＩ切断部位を除去した。パーツは、ＰＣＲによって生成するか、又はＩＤＴからｇＢｌｏｃｋｓとして購入した。次いで、これらの部分を、カセットプラスミド上の転写単位（プロモーター遺伝子ターミネーター）にアセンブルした。次いで、これらのカセットを一緒にアセンブルして、酵母ゲノムに挿入するための多重遺伝子プラスミドを形成した。
酵母株及び増殖培地
すべての実験で使用したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）であった。すべての酵母培養物をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇ／Ｌデキストロース）で増殖させた。栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、及び／又はＨＩＳ３）の選択を合成完全培地（６．７ｇ／Ｌアミノ酸なしのＢａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ窒素ベース、２ｇ／Ｌ完全補助アミノ酸ミックス、２０ｇ／Ｌデキストロース）で行った。
ＦＡＲ１及びＢＡＲ１のノックアウト
改変バージョンのＢＹ４７４１（ｙＡＨＮ７９７）を、Ｌｅｅらで概説されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用してノックアウトされたＦＡＲ１及びＢＡＲ１を用いて、接合経路実験のために作製した。まず、ＦＡＲ１を、各遺伝子のＯＲＦを標的とするように、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｙの設計ツールを使用して設計された２つのｓｇＲＮＡを用いて標的化した。これらのｓｇＲＮＡは、２つの核局在化配列を有するＣａｓ９及びＵＲＡ３栄養要求性マーカーを含むＣＥＮ６／ＡＲＳ４プラスミド上に発現させた。ＯＲＦの上流及び下流の５０ｂｐと相同性を有する修復ＤＮＡを、オリゴをアニーリングすることによって生成した。標準的な酢酸リチウム手順を使用して、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及び修復ＤＮＡを含有するプラスミドで酵母を形質転換した。ｓｇＲＮＡの有効性は、修復ＤＮＡを与えられた形質転換体のコロニー数を、修復ＤＮＡを与えられなかった形質転換体と比較することによって評価した。ノックアウトを検証するためにコロニーＰＣＲによってコロニーをスクリーニングし、成功したクローンをＹＰＤの一晩培養物中で増殖させた。次いで、５μｌの一晩培養物を、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を含有する合成完全培地にプレーティングして、ＣＥＮ６／ＡＲＳ４プラスミド上のＵＲＡ３栄養要求性マーカーを逆選択した。その後、ノックアウトプロセスを繰り返してＢＡＲ１をノックアウトした。
ｄｅｇＳｗｉｔｃｈの酵母ゲノムへの組み込み
オーバーラップ伸長ＰＣＲ法を使用して、５ｘＧＳリンカー及びＵＲＡ３栄養要求性マーカーを有するｄｅｇＳｗｉｔｃｈからなる線状ＤＮＡを生成した。次いで、この線状ＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用して、ＭＡＴ経路調節因子ＧＰＡ１、ＭＳＧ５、ＳＳＴ２、ＳＴＥ５、ＳＴＥ７、ＳＴＥ１１及びＳＴＥ５０の３’末端を標的とする８０ｂｐの相同性を付加した。次いで、個々の酢酸リチウム酵母の形質転換を、線状ＤＮＡ断片のそれぞれを使用して実施して、７つの遺伝子のそれぞれの下流のｄｅｇＳｗｉｔｃｈを親株ｙＡＨＮ７９７に挿入し、ウラシルを欠く合成完全培地に選択的にプレーティングした。挿入はコロニーＰＣＲを用いて確認した。
酵母細胞の培養及び誘導
適切な栄養要求性マーカーを含むＳＤＣプレート上、又は、栄養要求性マーカーが存在しない場合はＹＰＤプレート上のグリセロールストックから酵母株を画線培養した。これらのプレートからの個々のコロニーを使用して、ＹＰＤ中の培養物に接種し、１２～２４時間かけて飽和状態まで成長させた。
アルファ因子誘導
飽和培養物を新鮮なＹＰＤで１：５００希釈し、４５０μｌを２ｍＬの９６ウェルストレージブロック（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウェルに分注し、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中、３０℃及び９００ＲＰＭで３時間増殖させた。アルファ因子接合フェロモンを、５０ｕＭストック溶液（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からＹＰＤに適切な希釈を行うことによって１０倍濃度で調製した。３時間の増殖後、５０μｌのアルファ因子溶液を９６ウェルブロックに添加し、ブロックをシェーカーに戻して４時間増殖させた。
エストラジオール及びプロゲステロン誘導
飽和培養物を新鮮なＹＰＤで１：５００希釈し、４００μｌを２ｍＬの９６ウェルストレージブロック（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウェルに分注し、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中、３０℃及び９００ＲＰＭで３時間増殖させた。エストラジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロゲステロン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３．６ｍＭ（エストラジオール）及び３．２ｍＭ（プロゲステロン）ストック溶液からＹＰＤに適切に希釈することによって１０倍濃度で調製した。３時間の増殖後、５０μｌのエストラジオール及びプロゲステロンインデューサーを適切な組み合わせで９６ウェルブロックに添加し、ブロックをシェーカーに戻して１０時間増殖させた。
酵母培養
飽和培養物を、接合経路培養物については１：２００又は１：１００で、１０ｍＬ又は１５ｍＬのＹＰＤに希釈した。培養物をシェーカー中、３０℃のガラス管内で２時間増殖させた。次いで、培養物を０．０１ ＯＤ６００に希釈し、３０ｍＬ ＹＰＤの総体積で個々のファルコンチューブに分注した。３０℃のカスタムバイオリアクターでさらに１時間の増殖を行い、磁気制御撹拌棒で撹拌した。すべての培養物を、０．５×ペニシリンストレプトマイシンのＹＰＤ中で増殖させた。
ハードウェア
経時的な測定値を収集するために、自動フローサイトメトリー及び連続培養のためのプラットフォームを構築した。既存の自動化実験プラットフォームを、様々な濃度での小分子誘導及び長期培養を行うように適合させた。酵母培養物を、８つの温度制御された磁気撹拌チャンバーに保持された５０ｍＬの光学的に透明なコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）中で増殖させた。ＢＤハイスループットサンプラーの２つのシリンジポンプ（Ｃａｖｒｏ ＸＣａｌｉｂｕｒポンプ、ＴＥＣＡＮ）を用いて液体処理を行った。この設定により、測定のために個々の培養物からＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターへのサンプリングが可能になった。連続培養を達成するために、最初に特定の体積の培養物を廃棄し、異なる比率のホルモン培地と新鮮な培地を戻した。ＨＴＳに対するコマンドは、ＬＡＢＶＩＥＷ ２０１３を使用して制御した。
サンプリング期間は、３つの主要な工程、すなわち、試料、希釈体積の抽出、及び、それぞれのホルモン濃度での希釈体積の補充からなった。長時間の経時的実験の間、イベントレートをほぼ一定に保つためにサンプリング期間を選択した。倍加時間を９０分と仮定し、よって、４ｍＬの培養物を抽出し、次いで、２５分毎に新鮮な培地及びホルモンと交換した（希釈速度０．１６ｍＬｍｉｎ－１）。接合経路で行われたより短い実験は、連続培養では行われなかったため、１０分ごとのより高いサンプリング頻度を可能になった。
エストラジオール及びプロゲステロン誘導（１回の誘導）
実験を通して［Ｅ２］及び［Ｐｇ］濃度が同じまま維持される条件を試験するために、ただ１回のみの誘導が必要であった。３つのストック、すなわち、（１）インデューサー、（２）１Ｘ［Ｅ２］及び１Ｘ［Ｐｇ］濃度の補充ストック、並びに（３）ホルモンなしの補充ストック、を作製した。誘導時点の間、培養物を（１）と（３）の異なる比によってそれぞれの濃度に誘導した。培養物を、（２）と（３）の調整された比によってそれぞれの濃度で保持した。
エストラジオール及びプロゲステロン誘導（２回の誘導）
同じ［Ｅ２］であるが異なる［Ｐｇ］での外乱除去を試験するために、培養物を２回誘導した。最初の誘導により、すべての培養物を同じ外乱前濃度で定常状態まで増殖させることができた。培養物が定常状態に達した後（ｔ＝０時間）、培養物をより多くのＰｇで誘導するか、又は同じ濃度に保ち、再び定常状態まで増殖させた。４つのストック、すなわち、（１）外乱前濃度を達成するための誘導物質、（２）異なる外乱［Ｐｇ］を達成するための誘導物質、（３）所望の濃度を維持するための１Ｘ［Ｅ２］／［Ｐｇ］の補充ストック、及び（４）１Ｘ［Ｅ２］であるがＰｇを含まない補充ストック、を作製した。培養物をｔ＝－１０時間に（１）で誘導した。（３）と（４）が１：８の希釈液を補充することによって、すべての培養物を同じ外乱前濃度で１０時間保持した。ｔ＝０では、培養物を（２）と（４）の異なる比で誘導した。（３）と（４）の比を調整して濃度を維持することにより、最も高い外乱［Ｐｇ］が希釈なしで達成され、最も低い［Ｐｇ］が１：８希釈で維持された。
アルファ因子誘導
接合経路に対するｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ媒介性フィードバックの動的応答を試験するために、培養物をｔ０の入力（アルファ因子）で誘導した。異なる体積のＹＰＤ １×２５ｎＭアルファ因子ストック及びアルファ因子を含まないＹＰＤを組み合わせて、異なる濃度を達成した。
光誘導
各バイオリアクターは、ＵＳＢ制御可能なＬＥＤドライバ（Ｍｉｇｈｔｅｘ）に接続された個々の青色ＬＥＤを備えている。光誘導時点から開始して、培養物を飽和光用量（２５ｍＡの強度振幅で４５秒オン／１５秒オフ）に曝露した。この光レジームは、発現が定常状態に達するまで維持された。
フローサイトメトリー
蛍光タンパク質レポーター発現の分析を、ハイスループットサンプラーを備えたＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。培養物をＴＥで希釈した後、機器を通過させて許容可能な細胞密度を得た。ＦＩＴＣチャネルを用いてＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）蛍光を測定し、ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャネル（定常状態測定用）又はｍＣｈｅｒｒｙチャネル（動的測定用）を用いてＲＦＰ（ｍＫａｔｅ２）を測定し、ＤＡＰＩチャネルを用いてＣＦＰを測定した。定常状態の測定のために、試料ごとに５，０００～１０，０００件の結果を収集した。動的測定のために、試料ごとに２，０００～１０，０００件の結果を収集した。蛍光値を適切なチャネルの高さ（Ｈ）の測定値として計算し、側方散乱（ＳＳＣ－Ｈ）で割ることによって細胞サイズに正規化した。
図１４。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲは、生物学的経路を制御するためのモジュール式ツールである。ａ）ｄｅｇＳｗｉｔｃｈをエフェクター分子に融合し、ネットワークの出力からキーの発現を駆動することによって、内因性又は合成の生物学的ネットワークに対して合成フィードバック制御を実施するためのモジュール式ツールとしてのｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲの概略図。ｂ）複雑な内因性フィードバックを示さない酵母接合経路の簡略化された概略図。経路は、α因子の添加によって活性化され、シグナル伝達活性は、ｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣレポーターを使用して測定される。ｃ）ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲは、接合経路活性を制御するための正のシグナル伝達分子の分解を誘導した。示されたシグナル伝達分子の内因性コピーをｄｅｇＳｗｉｔｃｈに融合し、プロゲステロン誘導性システムを使用してキーを発現させた。細胞を飽和用量のα因子で誘導し、キーを用いた場合と用いない場合の経路活性を比較した。増殖の４時間後に、フローサイトメーターでｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣを測定した。データは、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図１６。ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲモジュールは、接合経路の合成フィードバック制御の実施に成功している。ａ）ＳＴＥ１２の内因性コピーをｄｅｇＳｗｉｔｃｈに融合し、経路レポーターｐＦＩＧ１（合成フィードバック）又は構成的プロモーター（フィードバックなし）のいずれかを使用してキー－ＣＦＰ－ＮＬＳを発現させる合成負のフィードバックの概略図。すべての出力測定は、ｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣに関する。ｂ）ｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣ動態の測定。合成フィードバック株及びフィードバックなし（ｐＲＥＶ１）株を、高（２５ｎＭ）、中（６．２５ｎＭ）又は低（３．１３ｎＭ）用量のα因子で時間ｔ＝０時間に誘導し、フローサイトメトリー測定（ポイント）を１０分ごとに実施した。線は、３つのデータ点にわたって取られた移動平均を表す。ｃ）合成フィードバック（ｐＦＩＧ１）株及び４つのフィードバックなし（キーなし、ｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２）株のα因子用量応答。α因子誘導の４時間後にフローサイトメトリーを用いてｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣ蛍光を測定した。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。実線は、データに適合するヒル関数である。（ｂ）の実験からの高用量、中用量及び低用量のα因子をグラフに示す。
図１７。合成回路の制御によって定量化されたｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲフィードバックモジュールの動作特性。ａ）合成フィードバック回路の概略図。ＧＥＭ－ｄｅｇＳｗｉｔｃｈは構成的に発現され、エストラジオール（Ｅ２）によって活性化されて、ｐＧＡＬ１－Ｚ３ＰＭ－ｐｓｄの発現を駆動する。Ｚ３ＰＭは、プロゲステロン（Ｐｇ）によって活性化されて、ｐＺ３からの発現を駆動する。青色光を使用してＺ３ＰＭ－ｐｓｄの分解を誘導することができる。ｐＺ３－ＹＦＰ－ｃＯＤＣは回路の測定出力であり、ｐＺ３－キー－ＣＦＰ－ＮＬＳは、ＧＥＭ－ｄｅｇＳｗｉｔｃｈの分解を活性化することによって、回路内のフィードバック（合成フィードバック）を駆動する。フィードバックのない回路では、構成的プロモーターを使用してキーＣＦＰ－ＮＬＳを発現させる。ｂ）フィードバック回路及びフィードバックなし回路のモデルシミュレーション（補足情報を参照されたい）。Ｐｇの外乱に続く出力のシミュレーションされた動態（左）及び定常状態の変化（右）は、フィードバックが、ＧＥＭを低下させ、Ｚ３ＰＭ濃度を低下させることによってＰｇ濃度の増加を緩衝することを示している。ｃ）正の外乱の後の合成フィードバック株及びフィードバックなし株（ｐＲＮＲ２－ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）に関する自動フローサイトメトリーを使用したｐＺ３－Ｖｅｎｕｓ－ｃＯＤＣの動的測定。細胞を０．７８ｎＭ Ｐｇ及び７．５ｎＭ Ｅ２で定常状態の発現まで増殖させた。時間０時間で、細胞を同じＰｇ濃度に保つか、又は１．５６ｎＭ（低）、３．１３ｎＭ（中）、又は６．２５ｎＭ（高）のＰｇの新しい最終濃度に誘導した。動態をさらに８時間測定した。実線は、３つのデータ点にわたって取られた移動平均を表す。ｄ）負の外乱後の合成フィードバック株及びフィードバックなし株（ｐＲＰＬ１８Ｂ－キー－ＣＦＰ－ＮＬＳ駆動キー）の自動フローサイトメトリーを使用したｐＺ３－Ｖｅｎｕｓ－ｃＯＤＣの動的測定。細胞を１．５７ｎＭ Ｐｇ及び３０ｎＭ Ｅ２で定常状態の発現まで増殖させ、次いで、０時間で青色光に曝露してｐｓｄを活性化した。動力学を外乱後８時間測定した。増殖及びサンプリング条件はｃ）と同様である。ｅ）各外乱に対するフィードバックなし回路に対する合成フィードバック回路の精度。ｆ）７．５ｎＭ Ｅ２の固定濃度でのＰｇの関数であるフィードバック（ｐＲＮＲ２－キー－ＣＦＰ－ＮＬＳ）がある場合とない場合の定常状態の回路挙動（刺激後１０時間）の比較。ＲＦＰ蛍光は、Ｚ３ＰＭ濃度の代用であり、ＹＦＰ蛍光は、回路の出力である。ｃ）の正の外乱に使用されるＰｇ用量が示されている。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図２２。ＤｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ合成フィードバック方法は、予測可能に調整可能である。ａ）（上）合成フィードバック回路のフィードバックゲインを調整するための様々な方法の検討。（下）キー生成速度又はキー／ケージ親和性を低下させることに関するＰｇ外乱の関数である回路出力及びＺ３ＰＭのモデルシミュレーション（補足情報を参照されたい）。ｂとｃ）調整の実験的検証。ｂ）（上）固定長のキーでｐＺ３上のＺ３結合部位の数を変えることによるフィードバックゲインの調整。（下）強（ｐＺ３－６ｘ）、中程度（ｐＺ３－４ｘ）、及び弱（ｐＺ３－３ｘ）のフィードバック株対フィードバックなし（ｐＲＥＶ１－ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）株に関するＰｇの関数であるＲＦＰ及びＹＦＰ蛍光。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。ｃ）（上）ｐＺ３－６ｘで固定されたフィードバックプロモーターの強度でキーの長さを変えることによるフィードバックゲインの調整。（下）フィードバックなし（ｐＲＥＶ１－ＮＬＳ－ｋｅｙ－ＣＦＰ）株に対する長（５５ａａ）、中（５１ａａ）及び短（４３ａａ）のキーのフィードバック株に関するＰｇの関数であるＲＦＰ及びＹＦＰ蛍光。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。ｄ）接合経路における合成負のフィードバックループにおいてフィードバックゲインを調整するためのプロモーター強度及びキー長の変更。ｐＡＧＡ１は、ｐＦＩＧ１よりも強力な接合経路のレポーターである。ｅ）（上）２５ｎＭ α因子で刺激した後の様々なフィードバック株及びフィードバック株なしに関するｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣの動的測定。点はフローサイトメトリー測定値を表し、線は３つのデータ点にわたって得られた移動平均を表す。（下）フィードバック株対フィードバックなし（ｐＲＥＶ１－ＮＬＳ－ｋｅｙ－ＣＦＰ）株のα因子用量応答。α因子を誘導して４時間後に、フローサイトメトリーを使用してＹＦＰ蛍光を測定した。点は、３つの生物学的複製物の平均を表し、エラーバーは、標準誤差を表す。実線は、データに適合するヒル関数である。動的実験で使用したα因子の用量（上）をグラフに示す。
図１５：ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲで試験した接合経路調節因子のパネル。ｄｅｇＳｗｉｔｃｈを各調節因子の内因性コピーのＣ末端に融合した。ＳＶ４０ ＮＬＳを有するキー又はＳＶ４０ ＮＬＳを有しないＫｅｙを、Ｐｇ誘導性システムを使用して発現させた。ＳＴＥ２０、ＳＴＥ１１及びＰＴＰ３は、細胞質キー（Ｋｅｙ－ＣＦＰ）を用いて分解され、ＳＴＥ１２、ＤＩＧ１及びＤＩＧ２は、核キー（Ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）を用いて分解された。ＭＳＧ５及びＦＵＳ３は、細胞質（ｃｙｔｏ）キー又は核（ｎｕｃ）キーのいずれかを用いて分解された。細胞を１ｎＭ（低）又は１００ｎＭ（高）のα因子及び５０ｎＭ又は０ｎＭのＰｇで誘導し、４時間増殖させた後、フローサイトメーターを用いてＹＦＰ蛍光を測定した。データは、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図１８：正又は負の外乱に応答した定常状態の解。ａ）プロゲステロン（Ｐｇ）又はｂ）ＺＰＭの分解速度（γＺ）としての定常値は、本発明者らのヒル型モデルに従って変化する。実線は、フィードバックシステム（ＦＢ）に対応し、一方、破線は、フィードバックが除去された例を示す（すなわち、Ｅｑ．１２の代わりにｆＫ＝μＫ＊、ＦＢなし）。灰色のボックスは、フィードバックが「アクティブ」であると見なされる領域の範囲を示し、これは、外乱の相対的変化（ａ）ΔＰ／Ｐ又はｂ）ΔγＺ／γＺのいずれか）に対する全ＧＥＭの相対的変化（Δ（Ｇ＋Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ））が０．１５よりも大きいことによって定義される。注目すべきことに、フィードバックがない場合、Δ（Ｇ＋Ｃ）は、キー又はＧＥＭの直接の合成又は劣化速度を除いて、いかなる外乱に対してもゼロに等しい。
図１９：Ｅ２の固定用量に関するＰｇの関数である回路挙動を示す図。フィードバック（ｐＲＮＲ２－キー－ＣＦＰ－ＮＬＳ）がある場合とない場合の、すべてのＥ２濃度におけるＰｇの関数である定常状態の回路挙動（刺激後１０時間）の比較。ＹＦＰ蛍光は回路の出力であり、ＲＦＰ蛍光はＺ３ＰＭ濃度の代用であり、ＢＦＰ蛍光は産生されたキーの量である。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図２０：固定用量のＰｇに関するＥ２の関数である回路挙動。フィードバック（ｐＲＮＲ２－ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）がある場合とない場合の、すべてのＰｇ濃度におけるＥ２の関数である定常状態の回路挙動（刺激後１０時間）の比較。ＹＦＰ蛍光は回路の出力であり、ＲＦＰ蛍光はＺ３ＰＭ濃度の代用であり、ＢＦＰ蛍光は産生されたキーの量である。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図２１：異なる量のキーを構成的に発現させるときの回路挙動。７．５ｎＭ Ｅ２の固定濃度におけるＰｇの関数である、フィードバックを伴う定常状態の回路挙動（刺激後１０時間）と、フィードバックを伴わない様々なレベルのキーの発現（ｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２、ｐＲＰＬ１８Ｂ）の比較。ＹＦＰ蛍光は回路の出力であり、ＲＦＰ蛍光はＺ３ＰＭ濃度の代用であり、ＢＦＰ蛍光は産生されたキーの量である。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図２３：プロモーター強度又はキー長を変更すると、フィードバックゲインが調節される。７．５ｎＭ Ｅ２の固定濃度における、様々なレベルのフィードバックゲイン（左、フィードバックプロモーター強度の変更による調整、右、キー長変更による調整）に関する、Ｐｇの関数である定常状態の回路挙動（刺激後１０時間）の比較。左、フィードバックプロモーター強度を変えることによる調整（ｘは、Ｚ３オペレーター部位の数を指す）。右、キーの長さを変えることによる調整（ｍは、キーのＣ末端から除去された残基の数を指す）。ＹＦＰ蛍光は回路の出力であり、ＲＦＰ蛍光はＺ３ＰＭ濃度の代用であり、ＢＦＰ蛍光は産生されたキーの量である。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。
図２４：フィードバック強度を調整すると回路出力の動的挙動が変化する。時間＝０時間で３．１３ｎＭのＰｇ及び７．５ｎＭのＥ２を用いて誘導した後の、様々なゲインを有する合成フィードバック株及びフィードバックなし株（ｐＲＥＶ１－ｋｅｙ－ＣＦＰ－ＮＬＳ）に関する自動フローサイトメトリーを使用したｐＺ３－Ｖｅｎｕｓ－ｃＯＤＣの動的測定。実線は、３つのデータ点にわたって取られた移動平均を表す。
図２５：接合経路における合成フィードバックの組み合わせ調整。（Ｔｏｐ）２５ｎＭ α因子による刺激後の様々なフィードバック株及びフィードバックなし（ｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２、ｐＲＰＬ１８Ｂ）株に関するｐＡＧＡ１－ＹＦＰ－ｃＯＤＣの動的測定。点はフローサイトメトリー測定値を表し、線は３つのデータ点にわたって得られた移動平均を表す。（下）フィードバック株対フィードバックなし（ｐＲＥＶ１、ｐＲＮＲ２、ｐＲＥＴ２、ｐＲＰＬ１８Ｂ）株のα因子の用量応答。α因子を誘導して４時間後に、フローサイトメトリーを使用してＹＦＰ蛍光を測定した。点は、３つの生物学的複製物の平均±ｓ．ｄ．を表す。実線は、データに適合するヒル関数である。
実施例５：誘導性核外輸送
この例では、核外輸送シグナルを使用した誘導可能な局在化が、フィードバック回路設計のための機能的ストラテジーとして示されている。
核内外の転写因子及びキナーゼの動的なシャトリングは、細胞機能において不可欠な役割を果たす。核局在化に対する誘導可能な制御を得るために、核外輸送配列（ＮＥＳ）を、インビボでＬＯＣＫＲの機能性をさらに拡張して、Ｓｗｉｔｃｈａにケージングした。ＮＥＳ配列（Ｇｕｔｔｌｅｒ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）１７：１３６７～１３７６）をｃＯＤＣに使用したのと同じストラテジーでケージングし、得られたｎｅｓＳｗｉｔｃｈａを強力な核局在化配列（Ｋｏｓｕｇｉ，Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８～４８５）を有するＹＦＰに融合した。ＲＦＰ－ヒストン融合物（ＨＴＡ２）を同じ細胞で構成的に発現させて、核マーカーとして作用させた（図２６、パネルａ）。ｎｅｓＬＯＣＫＲａのスイッチング能力を試験するために、キー発現がある場合とない場合でＹＦＰ局在化を比較した。ＹＦＰは、ｋｅｙａ－ＢＦＰの非存在下で、核内でＲＦＰと共局在することが見出された（図２６、パネルｂ、左）。ＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａをｋｅｙａ－ＢＦＰと共発現させた場合、ＹＦＰ蛍光はより細胞質ゾルに現れ、核外輸送シグナルのアンケージングを示した（図２６、パネルｂ、右）。ＮＬＳなしのＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａとｋｅｙａ－ＢＦＰの共発現は、同様のパターンをもたらすので（図２７、パネルａ、パネルｂ）、細胞質ゾルで観察されたＹＦＰ斑点は凝集に起因する可能性が高い。ＮＥＳのアンケージングは、ｋｅｙａ－ＢＦＰ上のＮＬＳの存在とは無関係である（図２７、パネルｃ、パネルｄ）。理論に拘束されるものではないが、核外でｎｅｓＬＯＣＫＲを維持するための機構は、核からの核外輸送と、細胞質ゾル中のキーによる新たに翻訳されたＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ又は残留ＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａのいずれかの捕捉との組み合わせであり得る。ｋｅｙａ－ＢＦＰの発現は常に、ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａとの共局在化をもたらす（図２７）。
次に、ｎｅｓＬＯＣＫＲを使用して、ＳｙｎＴＦの局在化を制御した。ｎｅｓＬＯＣＫＲの活性化は、転写を活性化するためにＳｙｎＴＦを核に局在化させる必要があるので、ｐＳｙｎＴＦプロモーターの出力の減少をもたらすと仮定された。二重誘導システム（図２６、パネルｃ）を使用して、異なる濃度のＳｙｎＴＦ－ＲＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ及びｋｅｙａ－ＢＦＰをｐＳｙｎＴＦ－ＹＦＰレポーターと同じ細胞で発現させ、フローサイトメトリーを使用して定常状態の蛍光を測定した（図２６、パネルｄ）。３１．２５ ｎＭのＥ２でのキーの誘導は、ＹＦＰシグナルの３３％の減少を引き起こし、ｎｅｓＬＯＣＫＲの活性化及び核からのＳｙｎＴＦの排除が成功したことを示した（図２６、パネルｅ）。これらの結果は、本明細書に記載の回路におけるフィードバック制御に関して局在化ベースのストラテジーを用いる能力をさらに実証している。
図２６。ｎｅｓＬＯＣＫＲを使用したタンパク質局在化の制御。ａ）ＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａのキー誘導核外輸送の概略図。核はヒストンＨＴＡ２－ＲＦＰによってマークされる。ｂ）Ｋｅｙａ－ＢＦＰが発現されていない場合に、ＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａと核ＨＴＡ２－ＲＦＰ蛍光が共局在化している（左）のに比べて、Ｋｅｙａ－ＢＦＰが発現されている場合には、核の外側でより拡散したＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ蛍光シグナルが観察されること（右）を示す蛍光顕微鏡観察。ｃ）合成転写因子（ＳｙｎＴＦ）に対するｎｅｓＬＯＣＫＲａの効果を調べるための二重誘導アッセイの概略図。Ｐｇは、Ｋｅｙａ－ＢＦＰの発現を誘導し、Ｅ２は、ＳｙｎＴＦ－ＲＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ融合物の発現を誘導する。ｐＳｙｎＴＦプロモーターは、ＳｙｎＴＦによって活性化され、ＹＦＰを発現する。ｄ）フローサイトメトリーによって測定したＥ２（０～１２５ｎＭ）及びＰｇ（０～５００ｎＭ）の関数であるＹＦＰ及びＲＦＰ蛍光のヒートマップ。ｅ）Ｐｇ誘導の関数である３１．２５ｎＭ Ｅ２でのＹＦＰ、ＳｙｎＴＦ－ＲＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ及びＫｅｙａ－ＢＦＰの蛍光を比較する折れ線プロット（図２６の黒い長方形、パネルｂ）。蛍光値を最大ＹＦＰ、ＲＦＰ又はＢＦＰ蛍光に対して正規化した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のｓ．ｄ．を表す。
図２７：Ｋｅｙが発現された場合のｎｅｓＬＯＣＫＲの細胞質ゾルの凝集。ａ）核マーカーＨＴＡ２－ＲＦＰを有する細胞質ゾルＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ及びＫｅｙ－ＢＦＰの概略図。ｂ）ＹＦＰ蛍光は、ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａがＮＬＳなしで発現される場合（左）、予想される細胞質ゾルの分布を示すが、ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ及びＫｅｙ－ＢＦＰの両方が細胞質ゾルで発現される場合には、ＹＦＰ蛍光の斑点が観察され、これはｎｅｓＳｗｉｔｃｈａの凝集によるものと推測される。Ｋｅｙ－ＢＦＰ蛍光は、ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ蛍光に共局在化する（右）。ｃ）核マーカーＨＴＡ２－ＲＦＰを有するＫｅｙ－ＢＦＰ－ＮＬＳを有するＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａの概略図。ｄ）ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａは、強い（ＳＶ４０）ＮＬＳで発現された場合、核に局在化する（左）。Ｋｅｙ－ＢＦＰを中程度に強いＮＬＳで発現させると、Ｋｅｙ－ＢＦＰをＮＬＳなしで発現させた場合と同じパターンのＹＦＰ局在化が観察され（図２６、パネルｂ）、ＮＥＳのアンケージングがＫｅｙ－ＢＦＰ局在とは無関係であることを示している。Ｋｅｙ－ＢＦＰ－ＮＬＳ蛍光は、ＮＬＳ－ＹＦＰ－ｎｅｓＳｗｉｔｃｈａ蛍光に共局在化している（右）。
実施例４：ヒト初代Ｔ細胞におけるｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲの機能
ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲがヒト初代Ｔ細胞において機能する能力は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を誘導的に分解することによって実証された。ｔ８トーホールド及びｃＯＤＣデグロンがラッチに埋め込まれた非対称の短い足場ｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈに融合したｍＣｈｅｒｒｙを含むレンチウイルストランスファー構築物を構築した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈ融合物を、ｐＰＧＫ構成的プロモーターを使用して発現させた。２番目のレンチウイルス構築物において、４つの異なる構成的プロモーター（ｐＰＧＫ、ｐＳＦＦＶ、ｐＣＭＶ（Ｇ）、ｐＣＭＶ（Ｄ））を使用して、ＫｅｙとｔａｇＢＦＰとの融合物を発現させた。
実験は、ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞で行った。細胞に、上述のレンチウイルスの異なる組み合わせを形質導入した。ある例では、細胞にｍＣｈｅｒｒｙ－ｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈのみを形質導入した。他の例では、細胞は、Ｋｅｙ－ｔａｇＢＦＰを発現するウイルスに加えて、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈウイルスの両方を受け取った。レンチウイルスを形質導入した後、フローサイトメトリーを使用して蛍光を測定した。分布を図２８に示す。本発明者らは、細胞に任意の量のＫｅｙ産生を含有するウイルスを同時形質導入した場合、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光がほぼ完全に消失したことを観察した（Ｋｅｙ産生はｔａｇＢＦＰ蛍光を使用して定量化した）。このデータは、ＫｅｙがｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈをトリガーし、ｍＣｈｅｒｒｙの分解を活性化し得ることを示す。
実施例５：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲ媒介性フィードバック機能
誘導性ヒト化合成転写因子ＺＦ３－ｐ６５－Ｅｒｔ２（ＺＰＥ）をモデルプロセスとして使用して、ｄｅｇｒｏｎＬＯＣＫＲによって媒介されるフィードバックがヒトＴ細胞（Ｍｏ Ｋｈａｌｉｌの誘導性ＴＦギフト、Ｂｏｓｔｏｎ Ｕ）において機能的であるかどうかを試験した。回路の出力は、ｐＺＦ３プロモーターによって産生されるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターであり、ｄｅｇｒｏｎＳｗｉｔｃｈに融合したＺＰＥは、ｐＳＦＦＶ構成的プロモーターによって駆動される。回路の２つのバージョンが構築され、１つはフィードバックがなく、もう１つはキーを介したフィードバックを有する。フィードバックを有する回路は、別個のｐＺＦ３プロモーターによって駆動されるキーを有し、ｍＥＧＦＰに融合される。このフィードバック回路のいくつかの変異体を、異なるｐＺＦ３プロモーター変異体とキーの長さを混合して適合させることによって試験した。これらの実験は、レンチウイルスを使用して構築物をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に安定的に組み込むことによって行った。回路を受け取った細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙポジティブ（ｐＺＦ３（４ｘ）ｍＣＭＶプロモーターはリーキーである）としてゲートアウトし、フィードバックバージョンでは、ＢＦＰポジティブとしてゲートアウトした。
この実験は、ＺＰＥ転写因子を核内に転座させることによってＺＰＥ転写因子を活性化する様々なタモキシフェン（４ＯＨＴ）で細胞を誘導することによって行った。細胞を、フローサイトメトリーを使用して誘導の５日後に測定した。フィードバックを有する回路の回路出力及びキー産生の試料分布を図２９に示す。
全範囲の４ＯＨＴ濃度について、フィードバックなし回路及びフィードバック回路の用量応答を比較した。フィードバックからの緩衝は、酵母で以前に観察された効果と同様に、プロモーター又はキーの長さを変えることによって調整することができるようである。完全な長さのキーを駆動するｍＣＭＶプロモーターからのフィードバックを観察すると、フィードバックの存在によって、最大定常状態出力が減少し、用量応答の傾きも減少することがわかる（図３０）。これらの特性は、フィードバックの典型的な特徴であり、本発明者らのフィードバック回路が回路に影響を及ぼしていることを示唆している。将来的には、ｍＣｈｅｒｒｙを目的のペイロードに置き換えることができる。本発明者らのフィードバック回路は、外乱除去を行い、Ｔ細胞の活性化（すなわち、ＣＡＲの産生）又は治療ペイロードの送達の動態を調整することができる。
本発明をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物を置き換えることができることは、当業者であれば当然に理解するところである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程又は工程を本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために、多くの修正を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。

Claims (65)

  1. シグナル伝達経路の入力によって活性化されると前記シグナル伝達経路の出力を駆動するシグナル伝達タンパク質であって、潜在性不活性化ドメインを含むがケージドデグロンを含まないシグナル伝達タンパク質と、
    発現すると前記不活性化ドメインをトリガーして前記シグナル伝達分子を不活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された、前記出力に応答する調節配列とを含む分子フィードバック回路。
  2. 前記入力若しくは前記出力又はその両方が、細胞内シグナルを含む、請求項１に記載の回路。
  3. 前記入力若しくは前記出力又はその両方が、細胞間シグナルを含む、請求項１に記載の回路。
  4. 前記不活性化ドメインが、分解ドメインである、請求項１から３のいずれか一項に記載の回路。
  5. 前記分解ドメインが、デグロンを含む、請求項４に記載の回路。
  6. 前記潜在性不活性化ドメインが、前記シグナル伝達タンパク質の分解を防止し、前記スイッチポリペプチドによって脱保護されている保護ドメインを含む、請求項４又は５に記載の回路。
  7. 前記スイッチポリペプチドが、プロテアーゼを含む、請求項６に記載の回路。
  8. 前記不活性化ドメインが、結合ペアの第１のメンバーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の回路。
  9. 前記スイッチポリペプチドが、隔離ドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、請求項８に記載の回路。
  10. 前記隔離ドメインが、原形質膜標的化タグ、ミトコンドリア膜標的化タグ、ペルオキシソーム標的化タグ、液胞標的化タグ、又はアクチン細胞骨格標的化タグを含む、請求項９に記載の回路。
  11. 前記スイッチドメインが、ドミナントネガティブドメインを含む前記結合ペアの第２のメンバーを含む、請求項８に記載の回路。
  12. 前記潜在性不活性化ドメインが、前記結合ペアの前記第１のメンバーに非共有結合的に結合した競合的結合ドメインを含む、請求項１１に記載の回路。
  13. 前記結合ペアの前記第１及び第２のメンバーが、ロイシンジッパーの第１及び第２の部分を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の回路。
  14. 前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の正の調節因子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の回路。
  15. 前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の負の調節因子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の回路。
  16. 前記シグナル伝達タンパク質が、前記シグナル伝達経路の中間メンバー又は転写因子である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の回路。
  17. 前記転写因子が、合成転写因子である、請求項１６に記載の回路。
  18. 前記調節配列が、前記出力の転写因子に対する結合部位を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の回路。
  19. 前記出力が、前記転写因子の発現である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の回路。
  20. 前記シグナル伝達タンパク質が受容体であり、前記入力が前記受容体に対するリガンドである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の回路。
  21. 前記シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、エストロゲンシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、免疫活性化経路、免疫抑制経路、免疫細胞分化経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路、ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、ｐ５３シグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、ＴＧＦベータシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＴＮＦシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、及びＷｎｔシグナル伝達経路からなる群から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の回路。
  22. 前記シグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の回路。
  23. 前記シグナル伝達タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された前記調節配列が、前記シグナル伝達タンパク質の天然プロモーターである、請求項２２に記載の回路。
  24. 前記シグナル伝達経路が、合成シグナル伝達経路である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の回路。
  25. 前記受容体が、合成受容体である、請求項２４に記載の回路。
  26. 前記合成受容体が、ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体である、請求項２５に記載の回路。
  27. 前記合成受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項２５に記載の回路。
  28. 前記出力が、免疫活性化又は免疫抑制である、請求項２７に記載の回路。
  29. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の分子フィードバック回路をコードする１又はそれ以上の核酸分子。
  30. 請求項１９に記載の１又はそれ以上の核酸分子を含むように遺伝子改変された細胞。
  31. 真核細胞である、請求項３０に記載の細胞。
  32. 症状について対象を治療する方法であって、請求項３１に記載の真核細胞の有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
  33. 前記症状ががんであり、前記分子フィードバック回路の前記出力が免疫活性化である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記症状が自己免疫疾患であり、前記分子フィードバック回路の前記出力が免疫抑制である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記症状が代謝又はホルモンの欠乏であり、前記分子フィードバック回路の前記出力が前記代謝又は前記ホルモンの産生及び／又は分泌である、請求項３２に記載の方法。
  36. 細胞のシグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する方法であって、前記細胞を分子フィードバック回路で遺伝子改変する工程を含み、
    前記分子フィードバック回路が、
    前記シグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列であって、前記シグナル伝達タンパク質が潜在性不活性化ドメインを含むが、ケージドデグロンを含まない、核酸配列と、
    前記シグナル伝達経路の出力に応答する調節配列であって、発現されると潜在性不活性化ドメインを活性化するスイッチポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列とを含み、
    前記活性化された不活性化ドメインが前記シグナル伝達タンパク質を不活性化し、それによって、前記シグナル伝達経路のシグナル伝達を調節する、方法。
  37. 前記調節することが、負のフィードバックを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記調節することが、正のフィードバックを含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質の分解を含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記不活性化ドメインが、分解ドメインである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記潜在性不活性化ドメインが、前記スイッチポリペプチドによって媒介されるタンパク質分解的切断イベントによって活性化される、請求項３９又は４０に記載の方法。
  42. 前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質の隔離を含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記不活性化ドメインが、結合ペアの第１のメンバーを含み、前記スイッチドメインが、隔離ドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記不活性化ドメインによる前記シグナル伝達タンパク質の不活性化が、前記シグナル伝達タンパク質のドミナントネガティブ抑制を含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記スイッチドメインが、ドミナントネガティブドメインに連結された前記結合ペアの第２のメンバーを含む、請求項４４記載の方法。
  46. 前記潜在性不活性化ドメインが、前記結合ペアの前記第１のメンバーに非共有結合的に結合した競合的結合ドメインを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記結合ペアの前記第１及び第２のメンバーが、ロイシンジッパーの第１及び第２の部分を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記細胞が、インビトロ細胞又はエクスビボ細胞である、請求項３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記シグナル伝達経路が、前記細胞の天然のシグナル伝達経路である、請求項３６から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記天然のシグナル伝達経路が、天然の生合成経路である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記天然の生合成経路が、ホルモン産生経路である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ホルモン産生経路が、インスリン産生経路、エストロゲン／プロゲステロン産生経路、アンドロゲン産生経路、及び成長ホルモン産生経路からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞が免疫細胞であり、前記天然のシグナル伝達経路が免疫活性化経路又は免疫抑制経路である、請求項４２に記載の方法。
  54. 前記免疫活性化経路が、サイトカインシグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、及びＴ細胞受容体シグナル伝達経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  55. 前記免疫抑制経路が、阻害性免疫チェックポイント経路である、請求項４６に記載の方法。
  56. 前記シグナル伝達経路が、合成シグナル伝達経路である、請求項３６から４８のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記シグナル伝達タンパク質がｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体であり、前記出力が前記ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインの放出である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記細胞が免疫細胞であり、前記シグナル伝達経路が合成免疫活性化経路又は合成免疫抑制経路である、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記免疫細胞が、骨髄系細胞又はリンパ系細胞である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるリンパ系細胞である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記シグナル伝達タンパク質が、合成免疫受容体である、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記合成免疫受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記出力が、免疫活性化又は免疫抑制である、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記合成シグナル伝達経路が、合成生合成経路である、請求項５６に記載の方法。
  65. 前記合成生合成経路が、ホルモン産生経路、オピオイド産生経路、抗生物質産生経路、化学療法剤産生経路、アルテミシン酸産生経路、テルペノイド産生経路、及びポリケチド産生経路からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
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