CN114592004B - 重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种重组表达载体系统，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域‑第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头‑转录因子转录活化结构域‑蛋白酶裂解位点‑降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达的转录活化效应物。本申请应用于干细胞定向诱导分化的监控中，通过限定不同的目的基因及对应的目的基因的启动子，能够实现对不同定向分化方向的监控，监控方法通用性高、可扩展性强。

Description

重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用
技术领域
本申请涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和多潜能细胞分化两个基本特性的细胞。干细胞的分化可归结为基因组中特定基因按一定顺序相继活化和表达的复杂生命过程。尽管这一过程是按遗传信息指令自然而然发生的，但基因表达的时间特异性和空间特异性、基因表达调控的多样性、基因表达受环境变化的诱导和阻遏、不同基因表达的协调调节、以及基因表达调控受顺式作用元件和反式作用因子共同调节等重要生物学事件的分子机制等尚未完全认识，给干细胞体外定向诱导分化和规模化培养的研究，以及临床治疗的应用研究带来不可克服性。由于干细胞的特殊生物学特性，人们期望干细胞的移植治疗应用于常规治疗效果较差的疾病，如肝病、白血病、糖尿病等，虽显示出巨大的应用前景。但目前仍亟待解决的问题是如何在体外规模化、定向诱导分化为特定方向的终末细胞。尽管已往的研究采用细胞/生长因子诱导法、转基因诱导法和细胞共培养法等取得了很多研究进展，但在细胞培养的过程中无法知晓细胞内发生了哪些生物学事件，获得规模化一致性的目的细胞仍是瓶颈问题。
发明内容
本申请的目的是，利用合成生物学技术为干细胞智能化的实现提供思路，具体是提供一种重组表达载体系统，并且该重组表达系统在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，提供一种重组表达载体系统，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域-第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头-转录因子转录活化结构域-蛋白酶裂解位点-降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达的转录活化效应物。
进一步地，所述重组表达载体采用真核表达载体。
可选择地，所述报告基因包括以下至少一种：Nluc、Gluc、Cluc、SEAP、Fluc、Rluc、GFP、mCherry、BFP、YFP。
可选择地，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成蛋白质二聚体或多肽二聚体。
进一步可选择地，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成亮氨酸拉链结构或抗原-抗体复合物。
进一步地，所述转录因子转录活化结构域和转录因子DNA结合结构域对应匹配所述报告基因的启动子。
可选择地，所述报告基因的启动子采用合成启动子，包括以下启动子的组合：UAS、pminCMV、Teto7、ZFHD1RE、PIR、ZFHD1、ZF21-16RE、ZF42-10R、ZF43-8RE、ZF54-8RE、pSV40。
进一步可选择地，所述报告基因的启动子采用以下任意一种：UAS-pminCMV、Teto7-pminCMV、ZFHD1RE-pminCMV、PIR-pminCMV、ZFHD1-pminCMV、ZF21-16RE-pminCMV、ZF42-10R-pminCMV、ZF43-8RE-pminCMV、ZF54-8RE-pminCMV、UAS-pSV40、Teto7-pSV40、ZFHD1RE-pSV40、PIR-pSV40、ZFHD1-pSV40、ZF21-16RE-pSV40、ZF42-10R-pSV40、ZF43-8RE-pSV40、ZF54-8RE-pSV40。
进一步地，所述报告基因的启动子的拷贝数为4～8。
进一步地，所述蛋白酶裂解位点与所述蛋白酶对应匹配，使得所述蛋白酶作为所述报告基因表达的激活因子；所述第三基因元件含有编码所述蛋白酶裂解位点的氨基酸序列的区域。
可选择地，所述蛋白酶采用以下任意一种：李子痘病毒蛋白酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶、南方豆花叶病毒蛋白酶、烟草脉动斑驳病毒蛋白酶。
可选择地，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子互不相同，或者，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子所对应的目的基因互不相同。
第二方面，前述的重组表达载体系统在构建报告细胞中的应用。
进一步地，利用至少一个表达载体构建所述重组表达载体系；将所述重组表达体系导入目标细胞中，形成所述报告细胞；监控所述报告细胞中的报告基因的表达产物。
第三方面，前述的重组表达载体系统在干细胞定向诱导分化中的应用。
可选择地，所述重组表达载体系统应用于干细胞定向诱导分化为肝细胞的监控。
进一步地，所述肝细胞的目标基因包括以下至少一种：ALB、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4。
可选择地，所述干细胞包括以下至少一种：间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞。
进一步可选择地，所述间充质干细胞包括以下至少一种：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、月经血间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。
与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
(1)本申请基于基因回路原理，利用重组表达载体系统构建了由两个输入与门串联构成的三输入与门，通过串联两个逻辑门控，实现一个与门的输出信号作为另一个与门的输入信号，只有三个输入信号同时存在时，才能够检测到报告基因的输出信号，有利于实现多目的基因的监控；
(2)本申请所限定的报告基因编码分泌型蛋白或荧光蛋白，能实现对报告基因的多次重复检测，提高监控的实时性，与检测报告基因的RT-PCR结果相比较，本申请的检测方法更简易高效；
(3)本申请应用于干细胞定向诱导分化的监控中，通过限定不同的目的基因及对应的目的基因的启动子，能够实现对不同定向分化方向的监控，监控方法通用性高、可扩展性强。
附图说明
图1为本申请的重组表达载体系统所执行的逻辑门控原理图及对应的真值表。
图2为本申请的重组表达载体系统的合成回路原理示意图。
图3为本申请的一个实施例的合成回路具体示意图。
图4为本申请的一个实施例的报告基因的检出结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
合成生物学是以生物信息学、DNA或RNA合成技术、遗传学和系统生物学为基础的交叉学科。合成生物学技术可以按照研究目的和应用目标，用人工合成有生命功能的生物分子元件、模块或器件搭建具有特定功能和逻辑关系的基因线路，用以加深对基因表达和调控的认识。
启动子克隆是一种研究基因转录调控的经典方法,被广泛应用于基因启动子转录活性的检测。真核生物在其转录水平的调控是真核生物调控基因表达的重要机制，其主要通过调控转录起始部位特殊的调控序列如启动子和作用于启动子区的转录因子实现。通过构建以目的基因启动子为启动序列的异源蛋白质表达载体,将重组质粒转染至细胞,上游的启动子可以调节下游异源蛋白的表达水平,从而反映目的基因启动子的启动转录活性。
蛋白酶(protease)可以对特异的蛋白酶裂解位点(cleavage site，CS)进行识别和切割，通过切割由对应裂解位点连接的的蛋白来调控蛋白的活性及降解，是一种常用的合成生物学工具。
降解决定子(Degron)是一种可以精确调控蛋白降解的蛋白，Degron通常位于蛋白的N端或C端，其上包含了一段特殊的氨基酸序列，可被蛋白酶特异性识别，进而通过泛素-蛋白酶体途径在蛋白水平精确可逆快速的调节特定蛋白的表达水平。
基因表达调控系统(regulatable gene expression system)由特定的转录因子和启动子组成，目前基于自然产生的元件进行改造的合成启动子及合成转录因子已广泛应用于基因回路设计。其中转录因子由DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)和转录活化结构域(activating domain，AD)构成，它可以与基因重组载体中特异的启动子序列相互作用，从而调控基因表达。因此，利用基因表达调控系统对目的基因进行调控和控制，使目的基因仅在特定条件下表达。
本申请提供了一种重组表达载体系统，所述重组表达载体系统构成合成回路元件组合和及基于该组合的报告基因系统。在一种可能的实施方式中，本申请提供了四种基因元件：(1)由目的基因启动子驱动的蛋白酶的第一基因元件；(2)由目的基因启动子驱动的转录因子DNA结合结构域-分子接头融合蛋白的第二基因元件；(3)由目的基因启动子驱动的分子接头-转录因子转录活化结构域(AD)-蛋白酶裂解位点(CS)-降解决定子(degron)融合蛋白的第三基因元件；(4)由合成启动子驱动的报告基因的基因元件。
除了基因元件，所述重组表达载体系统还包括目的基因的启动子和报告基因的启动子。
所述目的基因和对应的启动子应根据需要选定，例如需要确认肝细胞的成熟程度，可以选取与肝细胞功能性相关的基因作为目的基因，包括但不限于以下至少一个：ALB、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4，每个目的基因的启动子有对应性，可以是相同的目的基因对应不同的启动子，也可以是不同的目的基因分别对应不同的启动子，也可以是不同的目的基因对应相同的启动子。所述报告基因可以选取稳定表达且产物容易检出的基因，例如是分泌型蛋白、分泌性酶或荧光蛋白，包括但不限于以下至少一种：Nluc、Gluc、Cluc、SEAP、Fluc、Rluc、GFP、mCherry、BFP、YFP，上述这些报告基因的产物可以通过检测产物浓度来综合反映功能细胞的成熟程度。
本申请的实施例中，所述报告基因的启动子采用合成启动子，使得所述目的基因的启动子分别驱动第一基因元件、第二基因元件和第三基因元件表达之后的表达产物通过一系列的构象变换或组合构成与所述合成启动子结合的转录活化效应物，驱动所述报告基因表达，实现了多输入单输出的串联与门的调控效果。所述报告基因的启动子可以根据选定的转录因子DBD和转录因子AD来进行人工合成，可选择的转录因子DBD包括但不仅限于以下任意一个：Gal4、TetR、PIP、ZFHD1、ZF21-16、ZF42-10、ZF43-8、ZF54-8，可选择的转录因子AD包括但不限于以下任意一个VP64、VP16、p65AD、Rta。由此，可选择的报告基因的启动子包括但不限于以下任意一个：UAS-pminCMV、Teto7-pminCMV、ZFHD1RE-pminCMV、PIR-pminCMV、ZFHD1-pminCMV、ZF21-16RE-pminCMV、ZF42-10R-pminCMV、ZF43-8RE-pminCMV、ZF54-8RE-pminCMV、UAS-pSV40、Teto7-pSV40、ZFHD1RE-pSV40、PIR-pSV40、ZFHD1-pSV40、ZF21-16RE-pSV40、ZF42-10R-pSV40、ZF43-8RE-pSV40、ZF54-8RE-pSV40。进一步地，为实现报告基因的产物被更容易检出，该报告基因对应的启动子要适当增加拷贝数，可以将拷贝数增加至4～8个。经过实验验证，可选择的报告基因的启动子及对应的拷贝数包括但不限于以下任意一个：5×UAS-pminCMV、7×Teto7-pminCMV、4×ZFHD1RE-pminCMV、8×PIR-pminCMV、4×ZFHD1-pminCMV、8×ZF21-16RE-pminCMV、8×ZF42-10R-pminCMV、8×ZF43-8RE-pminCMV、8×ZF54-8RE-pminCMV、5×UAS-pSV40、7×Teto7-pSV40、4×ZFHD1RE-pSV40、8×PIR-pSV40、4×ZFHD1-pSV40、8×ZF21-16RE-pSV40、8×ZF42-10R-pSV40、8×ZF43-8RE-pSV40、8×ZF54-8RE-pSV40。
参考图1，本申请的实施例构建了由两个输入与门串联构成的三输入与门。通过串联两个逻辑门控，一个逻辑门控的输出将被作为另一逻辑门控的输入。只有在三个输入信号均存在(即三个目的基因均高表达)时，才能够探测到输出信号。
参考图2，本申请的重组表达载体体系的合成回路原理表达了该重组表达载体系统的转录及翻译后调控的过程：当三个目的基因高表达时，目的基因的启动子1驱动蛋白酶表达(驱动第一基因元件)，目的基因的启动子2驱动第二分子接头-AD-CS-degron表达(驱动第三基因元件)，目的基因的启动子3驱动DBD-第一分子接头表达(驱动第二基因元件)。第一基因元件的表达产物蛋白酶切割所述第三基因元件的表达产物的蛋白酶裂解位点，第三基因元件的表达产物分割为含有degron标记的部分和含有第二分子接头-AD的部分，含有degron标记的部分通过泛素-蛋白酶体途径降解，含有第二分子接头-AD的部分因三维结构的改变使得能与第二基因元件的表达产物识别结合，最终DBD识别对应的DNA响应元件RE，AD发挥转录活化效应，驱动报告基因表达并被检出。所述第一基因元件和第三基因元件作为第一级与门，所述第二基因元件作为与第一级与门串联的第二级与门，第一基因元件的产物即蛋白酶在该合成回路中作为报告基因表达的激活因子。
所述第一分子接头与第二分子接头能够对应匹配，具体的实现方式可以是第一分子接头与第二分子接头结合后构成互补配对的蛋白质二聚体或多肽二聚体，例如是同构二聚体形式的亮氨酸拉链结构，或者是异构二聚体形式的抗原-抗体复合物，如GCN4:scFv-GCN4，这些聚合结构都具有较强的对应性，通过提高亲和性能避免错配的情况发生，能实现基因表达的精准调控。
所述蛋白酶采用包括但不仅限于李子痘病毒蛋白酶PPVp、烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEVp)、南方豆花叶病毒蛋白酶(SMVp)、烟草脉动斑驳病毒蛋白酶(TVMVp)，对应地，所述蛋白酶裂解位点(CS)采用包括但不仅限于李子痘病毒蛋白酶裂解位点(ppvS)、烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解位点(tevS)、南方豆花叶病毒蛋白酶裂解位点(smvS)、烟草脉动斑驳病毒蛋白酶裂解位点(tvmvS)。
本申请的实施例基于上述原理和实现方式，具有以下优点：条件稳定，所采用的均为通用成熟的技术，可扩展性强；操作方便，构建智能报告细胞耗时短，相比于RT-PCR通量大耗时长，该智能报告系统检测速度快、灵敏度高、操作便捷、结果确切；重复性好，对于报告基因为分泌型酶或荧光蛋白的表达载体，对智能报告细胞的输出信号可多次重复检测实时监控；成本低廉，构建智能报告细胞同一般质粒转染一样，是较为经济的技术路线。
以下以干细胞诱导分化相关的实施例对本申请进行更详细的叙述。
实施例一
如图3所示，本实施例构建的用于定向诱导干细胞分化的智能报告细胞，包括以下步骤：
S1：制备重组表达载体系统
基因元件构建：由目的基因启动子驱动的转录因子DNA结合结构域-分子接头融合蛋白的基因元件包括顺次排列的以下元件：基因启动子、核定位信号肽序列、GAL4DNA结合域序列、亮氨酸拉链序列；由目的基因启动子驱动的分子接头-转录因子转录活化结构域AD-蛋白酶裂解位点CS-降解决定子degron融合蛋白的基因元件包括顺次排列的以下元件：基因启动子、降解决定子序列、烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解位点序列、VP64序列、亮氨酸拉链序列；由目的基因启动子驱动的蛋白酶的基因元件包括顺次排列的一下元件：基因启动子、烟草蚀刻病毒蛋白酶；由合成启动子驱动的报告基因的基因元件包括顺次排列的以下元件：拷贝数为5的上游激活序列UAS、最小化CMV启动子、NanoLuc序列。以上所述相邻编码蛋白序列之间均由接头序列linker连接。将上述四种基因元件插入同一或不同载体中。
本实施例基于合成生物学通过多个合成回路元件组合在转录及翻译后水平构建含基因回路的智能报告细胞。启动子克隆是一种研究基因转录调控的经典方法,通过构建以目的基因启动子为启动序列的异源蛋白质表达载体,上游启动子可以调节下游异源蛋白的表达水平,从而反映目的基因启动子的启动转录活性。烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEVp)是从植物病毒中发现的一类蛋白酶，可以对特异的序列进行识别和切割，是一种常用的合成生物学工具，其切割位点为烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解位点(tevS)。降解决定子(Degron)是一种可以精确调控蛋白降解的蛋白，其氨基酸序列可被蛋白酶特异性识别，通过泛素-蛋白酶体途径在蛋白水平精确可逆快速的调节特定蛋白的表达水平。亮氨酸拉链结构常出现于真核生物DNA结合蛋白的C端，为每7个氨基酸中的第7个氨基酸的七元重复单元结构,通过彼此交错深处的亮氨酸残基相互结合构成二聚体。基于亮氨酸拉链二聚化的结构特性，通过将亮氨酸拉链与目的蛋白相连形成融合蛋白，两条拉链间会产生一定吸引力，使得与亮氨酸拉链融合的目的蛋白在空间上相互靠近，从而可以发挥出完整的功能和活性。酵母GAL4基因表达系统是目前了解最透彻的真核细胞转录调节系统之一。GAL4不存在于哺乳动物细胞内，并且只有结合半乳糖代谢酶系GLA基因启动子的UAS才能使启动子下游基因转录，具有良好的特异性与可诱导性。这一系统在控制目的基因在培养的哺乳动物细胞中有序表达方面得到广泛应用。
本实施例拟整合多种合成回路元件构建了一个由两个2输入与门串联组成的3输入与门，只有在三个输入信号均存在(即三个目的基因均高表达)时，才能够探测到输出信号，形成具有报告功能的系统。
S2：转染及筛选
在需进行定向诱导分化干预时，将所述表达载体转染至干细胞中以构建智能报告细胞。
其中，所述干细胞可以选自胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、月经血间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。这些细胞来源均可接受本实施例所述的方法构建，并用于科研和临床需求。
实施例二
使用脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)定向诱导分化为肝样细胞(Hepatocyte like cell,HLC)测试所述智能报告系统检测方法。
S1：构建智能报告细胞
利用实施例一中所述智能报告细胞构建方法处理脐带间充质干细胞(MSC)。
S2：诱导分化
采用细胞/生长因子诱导法，将脐带间充质干细胞(MSC)诱导分化为肝样细胞(HLC)。
S3：报告系统检测
根据实施例一所构建的具体基因元件，其中报告基因为Nanoluc。取细胞上清离心去除细胞碎片，吸取上清与检测试剂混匀。待充分反应后，用荧光素酶测定仪检测样品的发光值以检测Nluc的酶活性。结果如图4A，*p＜0.05；***p＜0.001。
S4：报告系统有效性验证
根据实施例一所构建的具体基因元件，其中目的基因为ALB、CYP2E1、CYP2C9。提取S3中所吸取上清检测Nluc酶活性的细胞RNA，检测ALB、CYP2E1、CYP2C9基因mRNA水平。
结果如图4B，***p＜0.001。提示当三个目的基因mRNA水平上调，即均高表达时，Nluc酶活性明显上调，该智能报告系统可以很好的提示并响应。
合成生物学在干细胞智能化方面具有明显优势，本发明运用合成回路元件建立的智能报告细胞体系，部分解决了获得规模化一致性的目的细胞的问题，为规模化定向诱导干细胞分化为功能细胞提供新的方法和应用，为进一步研究在定向诱导分化中所参与的重要生物学事件的分子机制验证及获得规模化一致性良好的目的细胞诱导分化条件摸索提供有力工具。
综上所述，本申请的重组表达载体系统，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域-第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头-转录因子转录活化结构域-蛋白酶裂解位点-降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达的转录活化效应物。本申请应用于干细胞定向诱导分化的监控中，通过限定不同的目的基因及对应的目的基因的启动子，能够实现对不同定向分化方向的监控，监控方法通用性高、可扩展性强。
上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种干细胞定向诱导分化为肝细胞的监控方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建重组表达载体体系，所述重组表达载体体系包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域-第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头-转录因子转录活化结构域-蛋白酶裂解位点-降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因表达元件；所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成亮氨酸拉链结构或抗原-抗体复合物；所述蛋白酶裂解位点与所述蛋白酶对应匹配，使得所述蛋白酶作为所述报告基因表达的激活因子；所述第三基因元件含有编码所述蛋白酶裂解位点的氨基酸序列的区域；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达元件的转录活化效应物；所述报告基因包括以下至少一种：Nluc、Gluc、Cluc、SEAP、Fluc、Rluc、GFP、mCherry、BFP、YFP；所述转录因子转录活化结构域和转录因子DNA结合结构域对应匹配所述报告基因的启动子；所述目的基因包括以下至少一种：ALB、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4；
将所述重组表达载体体系导入所述干细胞中，形成报告细胞；
监控所述报告细胞中的报告基因的表达蛋白的浓度，用于反映肝细胞的成熟程度；
所述干细胞包括以下至少一种：间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞；所述间充质干细胞包括以下至少一种：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、月经血间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体采用真核表达载体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告基因表达元件中的启动子采用合成启动子，包括以下启动子的组合：UAS、pminCMV、Teto7、ZFHD1RE、PIR、ZFHD1、ZF21-16RE、ZF42-10RE、ZF43-8RE、ZF54-8RE、pSV40。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因的启动子采用以下任意一种：UAS-pminCMV、Teto7-pminCMV、ZFHD1RE-pminCMV、PIR-pminCMV、ZFHD1-pminCMV、ZF21-16RE-pminCMV、ZF42-10RE-pminCMV、ZF43-8RE-pminCMV、ZF54-8RE-pminCMV、UAS-pSV40、Teto7-pSV40、ZFHD1RE-pSV40、PIR-pSV40、ZFHD1-pSV40、ZF21-16RE-pSV40、ZF42-10RE-pSV40、ZF43-8RE-pSV40、ZF54-8RE-pSV40。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述报告基因的启动子的拷贝数为4~8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶采用以下任意一种：李子痘病毒蛋白酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶、南方豆花叶病毒蛋白酶、烟草脉动斑驳病毒蛋白酶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子互不相同，或者，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子所对应的目的基因互不相同。
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