KR20210133955A - 합성 분자 피드백 회로 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20210133955A
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signaling pathway
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하나 엘-사마드
앤드류 엔쥐
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

분자 피드백 회로뿐만 아니라 이러한 분자 피드백 회로를 인코딩하는 핵산 및 개체 분자 피드백 회로로 유전적으로 변형된 세포가 제공된다. 분자 피드백 회로를 사용하여 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하는 방법 및 분자 피드백 회로를 인코딩하는 핵산을 함유하는 세포를 투여함으로써 병태에 대해 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 분자 피드백 회로의 양태는 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 경로의 신호전달 단백질을 포함한다. 이러한 회로는 신호전달 경로의 출력에 반응하고 발현될 때 비활성화 도메인을 촉발하여 신호전달 분자를 비활성화시키는 스위치 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다.

Description

합성 분자 피드백 회로 및 이의 사용 방법
본 발명은 국방부 고등연구 계획국(Defense Advanced Research Projects Agency)에서 수여한 보조금 번호 제HR0011-16-2-0045호에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
본 출원은 2019년 1월 7일에 출원된 미국 가출원 일련번호 제62/789,402호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
통상적으로, 원하는 세포 활동 제어는 세포 시스템에 대한 반복적인 사용자-제공 입력(user-provided inputs)에 의해 제어되었다. 예를 들어, 일부 의학적 치료의 맥락에서, 장기간에 걸쳐 개체에서 원하는 수준의 세포 출력(output)은 치료 과정에 걸쳐 제제 투여, 평가, 재투여 및 재평가의 반복 주기에 의해 달성된다. 유사하게, 생물생산 응용분야(bioproduction application) 및 대사 공학(metabolic engineering)에서 생산 세포가 원하는 산물의 수율을 산출하도록 유도하기 위해, 성장 배지는 예를 들어 성장 인자를 보충하고/보충하거나 독성 부산물을 제거함으로써 반복적으로 증대된다.
원하는 작업을 수행하는 조작된 세포의 능력 및 이러한 조작된 세포를 생산하는 방법이 최근 수십 년 동안 크게 발전했다. 예를 들어, 합성 생물학 및 시스템 대사 공학 기술의 최근 발전은 환경 친화적인 방식(eco-friendly manner)으로 재생 가능한 바이오매스 자원으로부터 산업적으로 관련된 벌크 및 정밀 화학 물질(fine chemicals)을 생산하기 위한 미생물 세포 공장의 잠재력을 제공한다. 또한 다양한 사용자-정의 표적을 겨냥할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법과 같은 설계 세포 요법(designer cell therapies)은 임상에서 큰 가능성을 보여왔으며 널리 채택되고 지속적인 규제 승인을 얻고 있다.
추가 사용자-입력 없이, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위해 사용되는 바와 같은 이러한 조작된 세포의 출력은 일단 개체에게 투여되거나 생물반응기(bioreactor)에서 움직이면 일정하다. 조작된 세포 출력을 제어하기 위한 조정은 외부 입력(예를 들어, 작은 분자 형태 또는 기타 자극 또는 사용자-수행 작업)을 사용하여 이루어진다.
분자 피드백 회로(molecular feedback circuits) 및 이러한 분자 피드백 회로를 인코딩하는 핵산 및 대상 분자 피드백 회로로 유전적으로 변형된 세포가 제공된다. 분자 피드백 회로를 사용하여 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 제어하는 방법 및 분자 피드백 회로를 코딩하는 핵산을 함유하는 세포를 투여함으로써 상태에 대해 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 본 기재의 상기 분자 피드백 회로의 양태는 잠재적인 비활성화 도메인(latent deactivation domain)을 포함하는 신호전달 경로의 신호전달 단백질을 포함한다. 이러한 회로는 신호전달 경로의 출력에 반응하고, 발현될 때 상기 비활성화 도메인을 촉발하여 신호전달 분자를 비활성화시키는 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제어 서열을 포함할 수 있다.
임의의 실시양태에서, 상기 신호 전달 단백질은 케이지된 데그론(caged degron)을 포함하지 않는다. 다시 말해서, 임의의 실시양태에서, 상기 신호전달 단백질은 다음을 포함하지 않는다: (a) 데그론(degron), (b) 5개 알파 헬릭스를 포함하는 라커 도메인(locker domain), 및 (c) 하기와 같은 알파 헬릭스를 포함하는 래치 도메인(latch domain): (i) 키 폴리펩티드의 부존재 하에, 상기 데그론을 케이지하고 락커 도메인과 6개 헬릭스 번들을 형성하고 상기 신호전달 단백질의 분해를 방지하고; (ii) 키 폴리펩티드 존재 하에, 상기 데그론은 케이지되지 않고 상기 신호전달 단백질은 분해되며, 상기 키 폴리펩티드는 상기 래치 도메인보다 더 높은 친화도로 상기 라커 도메인에 결합하는 알파 헬릭스를 포함할 수 있다. 이러한 케이지된 데그론 분자는 가출원 일련번호 제62/789,418호(2019년 1월 7일 출원), 제62/850,336호(2019년 5월 20일 출원) 및 제62/789,351호(2019년 1월 7일 출원)는 본원에 참조로 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “합성(synthetic)", "키메라(chimeric)" 및 "조작된(engineered)"은 자연적으로 발생하지 않는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 인공적으로 유래된 폴리펩티드를 의미한다. 합성 폴리펩티드 및/또는 핵산은 예를 들어, 단일 아미노산, 단일 뉴클레오티드 등을 포함하는 기본 서브유닛으로부터 새로 조립될 수 있거나, 예를 들어, 재조합 방식을 통해 자연적으로 또는 인공적으로 유래된 폴리뉴클레오티드 또는 기존의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 키메라 및 조작된 폴리펩티드 또는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드는 두 개 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 또는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드 도메인의 조합, 결합 또는 융합에 의해 구성될 것이다. 키메라 및 조작된 폴리펩티드 또는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드는 결합된 두 개 이상의 폴리펩티드 또는 핵산 “부분(part)"을 포함하며, 결합된 부분은 상이한 단백질(또는 상이한 단백질을 인코딩하는 핵산)로부터 유래되며 결합된 부분은 동일한 단백질(또는 단백질을 인코딩하는 핵산)의 상이한 영역을 포함하나 상기 부분은 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “재조합(recombinant)"은 그 기원 또는 조작으로 인해 자연과 관련된 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 관련되지 않는 핵산 분자 예를 들어, 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성(semisynthetic), 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 설명한다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 상기 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 의미한다. 숙주 세포 또는 바이러스와 관련하여 사용되는 상기 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주 세포 또는 바이러스를 의미한다. 재조합은 또한 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)이 이종 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)의 도입에 의해 변형된 물질을 언급하기 위해 본원에서 사용된다.
상기 용어 “작동가능하게 연결된(operably linked)”은 그렇게 설명된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 그의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 인접할 수 있지만 반드시 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 경우에 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 상기 프로모터에 인접할 수 있다. 일부 경우에, 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는 하나 이상의 개재 서열(intervening sequences)에 의해 분리될 수 있다. 또한, 일부 경우에, 예를 들어 2개 이상의 코딩 서열이 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된 경우를 포함하지만 이에 제한되지 않는 2개 초과의 서열이 작동가능하게 연결될 수 있다.
“생물학적 샘플(biological sample)”은 개인 또는 개인의 집단으로부터 얻은 다양한 샘플 유형을 포함하며, 예를 들어, 세포 또는 생물학적 분자의 분리, 진단 분석 등을 포함하는 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 상기 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포와 같은 고체 조직 샘플 및 이의 자손을 포함한다. 상기 정의는 조달 후, 개별 샘플의 혼합 또는 풀링, 시약 처리, 가용화 또는 세포, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 등과 같은 특정 구성요소의 농축과 같은 임의의 방식으로 조작된 샘플도 포함된다. 상기 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 임상 샘플을 포함하며, 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 샘플도 포함한다. 상기 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 소변, 타액, 뇌척수액, 간질액, 안구액, 활액, 혈장 및 혈청과 같은 혈액 분획 등을 포함한다. 상기 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 또한 고체 조직 샘플, 조직 배양 샘플 및 세포 샘플을 포함한다. 따라서, 생물학적 샘플은 세포 샘플 또는 무세포 샘플일 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 따라서, 이 용어는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머(polymer)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는, 용어 “폴리펩티드(polyepetide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 유전적으로 코딩되고 비-유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 또는 유도체화된 아미노산, 변형된 펩티드 백본(backbone)을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형성을 의미한다. 상기 용어는 N-말단 메티오틴 잔기(N-terminal methionine residues)가 있거나 없는 이종 아미노산 서열과 융합한 단백질, 이종 및 상동 리더 서열(heterologous and homologous leader sequences)과의 융합; 면학적으로 태그된 단백질; 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
"벡터(vector)" 또는 "발현 벡터(expression vector)"는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 레플리콘(replicon)으로, 다른 DNA 세그먼트, 즉, "삽입(insert)"이 부착되어 세포에서 부착된 세그먼트의 복제를 야기할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "도메인(domain)" 및 "모티프(motif)"는 하나 이상의 특정 기능을 갖는 구조화된 도메인 및 구조화되지는 않았지만 하나 이상의 특정 기능을 보유하는 폴리펩티드의 구조화되지 않은 세그먼트를 모두 의미한다. 예를 들어, 구조화된 도메인은 폴리펩티드의 특정 기능에 관여하는 3차원 구조를 포함하는 폴딩된 폴리펩티드에서 연속적 또는 불연속적인 복수의 아미노산, 또는 이의 부분을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 경우에, 도메인은 폴딩되지 않은 또는 무질서한 폴리펩티드의 특정 기능을 유지하는 복수의 2개 이상의 아미노산, 또는 이의 부분을 포함하는 폴리펩티드의 구조화되지 않은 세그먼트를 포함할 수 있다. 또한 이 정의에 포함되는 도메인은 무질서하거나 구조화되지 않을 수 있지만 표적 또는 결합 파트너와 연관될 때 구조화되거나 정렬되는 도메인이다. 본질적으로 비구조화된 도메인 및 본질적으로 비구조화된 단백질의 비-제한적인 예는 예를 들어, Dyson & Wright. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:197-208에 설명되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "친화성(affinity)"은 두 제제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 말하며 해리 상수(Kd)로 표현된다. 친화성은 관련되지 않은 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 적어도 1배 이상, 적어도 2배 이상 적어도 3배 이상, 적어도 4배 이상, 적어도 5배 이상, 적어도 6배 이상, 적어도 7배 이상, 적어도 8배 이상, 적어도 9배 이상, 적어도 10배 이상, 적어도 20배 이상, 적어도 30배 이상, 적어도 40배 이상, 적어도 50배 이상, 적어도 60배 이상, 적어도 70배 이상 적어도 80배 이상, 적어도 90배 이상, 적어도 100배 이상, 또는 적어도 1000배 이상 클 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화성은 예를 들어 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰(pM) 또는 약 100 nM 내지 약 펨토몰(fM) 또는 그 이상일 수 있다.
상기 용어 "결합(binding)"은 예를 들어, 염 다리(salt birdge) 및 물 다리(water bridge)와 같은 상호작용을 포함하는 공유, 정전기, 소수성 및 이온 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 2개 분자 사이의 직접적인 관련을 의미한다. 비-특이적 결합은 약 10-7M 미만의 친화성을 갖는 결합, 예를 들어 10-6M, 10-5M, 10-4M 등의 친화성을 갖는 결합을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “치료(treatment)", "치료하는(treating)" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병에 대한 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질병에 기인하는 부작용의 관점에서 치료적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료(treatment)"는 포유동물, 예를 들어 인간의 질명의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체에서 발생하는 질병을 예방하는 단계; (b) 질병을 억제하는 단계, 즉, 질병의 발달을 저지하는 단계; 및 (c) 질병을 완화시키는 단계, 즉, 질병의 퇴행을 야기하는 단계를 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 상기 용어 “개인(individual)", "개체(subject)", "숙주(host)" 및 "환자(patient)"는 설치류(예를 들어, 랫, 마우스), 토끼류(예를 들어, 토끼), 비-인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"치료학적 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "유효량(efficacious amount)"는 상기 질병을 치료하기 위해 표유동물 또는 다른 개체에게 투여될 때, 질병에 대한 치료를 수행하기에 충분한 제제의 양 또는 두 개 제제의 조합된 양을 의미한다. 상기 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 상기 제제, 상기 질병 및 치료될 개체의 나이, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)" 및 "CAR"이라는 용어는 면역 세포의 활성화를 촉발하거나 억제할 수 있는 인공 다중-모듈 분자(artificial multi-module molecules)를 의미하며, 이는 일반적으로 세포외 도메인(예를 들어, 리간드/항원 결합 도메인), 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 이에 배타적이지 않다. 상기 CAR이라는 용어는 CAR 분자에 구체적으로 제한되지 않고 CAR 변이체도 포함한다. CAR 변이체는 CAR의 세포외 부분(예를 들어, 리간드 결합 부분) 및 세포내 부분(예를 들어, 세포내 신호전달 부분)이 2개의 개별 분자에 존재하는 분할 CAR을 포함한다. CAR 변이체는 또한 조건부로 활성화 가능한 CAR인 ON-스위치 CAR을 포함하며, 예를 들어 분할 CAR의 두 부분의 조건부 이종-이량체(hetero-dimerization)가 약리학적으로 제어되는 분할 CAR을 포함한다(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2014/127261 A1 및 미국 특허 출원 번호 2015/0368342 A1에 기술된 바와 같이, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). CAR 변이체는 또한 1차 CAR의 활성을 증폭시키거나 억제할 수 있는 2차 CAR 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 CAR을 포함한다. CAR 변이체는 또한 예를 들어 이중특이성 CAR 시스템의 성분으로 사용될 수 있는 억제 키메라 항원 수용체(inhibitory chimeric antigen receptors, iCAR)를 포함하며, 여기서 2차 CAR 결합 도메인의 결합은 1차 CAR 활성화의 억제를 야기한다. CAR 분자 및 이의 유도체(즉, CAR 변이체)는 예를 들어, PCT 공개번호 US2014/016527; Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304에 기재되어 있고, 이의 기재 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 유용한 CAR은 또한 Novartis(Basel, Switzerland)에 의해 상용화된 렌티바이러스 로딩된 CTL019(Tisagenlecleucel-T) CAR-T 세포에 의해 발현되는 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR을 포함한다. 상기 용어 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)" 및 "CAR"은 또한 SUPRA CAR 및 PNA CAR을 포함한다(예를 들어, Cho et al Cell 2018 173: 1426-1438 and Rodgers et al, Proc. Acad. Sci. 2016 113: E459-468 참조).
상기 용어 “세포 수용체(T cell receptor)" 및 "TCR"은 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 T 세포 또는 T 림프구의 표면에서 발견되는 분자를 의미하며, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드로서 항원의 단편을 인식하는 역할을 한다. TCR 복합체는 일반적으로 CD3 사슬 분자와의 복합체의 일부로 발현되는 고도로 가변적인 알파(α) 및 베타(β) 사슬로 이루어진 이황화물-연결된 막-고정 이종이량체 단백질(disulfide-linked membrane-anchored heterodimeric protein)이다. 많은 천연 TCR이 이종이량체 αβ 또는 γδ 형태로 존재한다. 이종이량체 αβ 형태의 완전한 내인성 TCR 복합체는 8개의 사슬, 즉, 알파 사슬(본원에서 TCRα 또는 TCR 알파로 지칭됨), 베타 사슬(본원에서 TCRβ 또는 TCR 베타로 지칭됨), 델타 사슬, 감마 사슬, 2개의 엡실론 사슬 및 2개의 제타 사슬을 포함한다. 일부 경우에, TCR은 일반적으로 TCRα 및 TCRβ 사슬만을 참조하여 언급되지만, 상기 조립된 TCR 복합체는 내인성 델타, 감마, 엡실론 및/똔느 제타 사슬과 관련될 수 있으므로 숙련된 기술자는 쉽게 이해할 것이며, 세포막에 존재하는 TCR에 대한 언급은 적절하게 완전히 또는 부분적으로 조립된 TCR 복합체에 대한 언급을 포함할 수 있다.
재조합 또는 조작된 개별 TCR 사슬 및 TCR 복합체가 개발되었다. 치료 맥락에서 TCR의 사용에 대한 언급은 개별적인 재조합 TCR 사슬을 의미할 수 있다. 이와 같이, 조작된 TCR은 개별 변형된 TCRα 또는 변형된 TCRβ 사슬 뿐만 아니라 연결 폴리펩티드에 방식으로 단일 폴리펩티드에 연결된 변형되고/비변형된 TCRα 및 TCRβ 사슬을 포함하는 단일 사슬 TCR은 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "합성 노치 수용체(synthetic Notch receptor)", "synNotch" 및 "synNotch 수용체"(receptor)는 적어도 다음을 포함하는 재조합 키메라 결합-유발 전사 스위치(recombinant chimeric binding-triggered transcriptional switches)를 의미한다: 세포외 결합 도메인, 적어도 하나 이상의 단백질 분해 절단 사이트를 포함하는 Notch 수용체의 일부, 및 신호전달 기능을 제공하는 세포내 도메인. SynNotch 폴리펩티드, 이의 성분 및 이를 사용하는 방법은 미국 특허 번호 9,834,608 및 9,670,281, 뿐만 아니라 oda et al., Science (2018) 361(6398):156-16; Roybal & Lim, Annu Rev Immunol. (2017) 35:229-253; Lim & June Cell. (2017) 168(4):724-740; Roybal et al. Cell. (2016) 167(2):419-432.e16; Roybal et al. Cell. (2016) 164(4):770-9; and Morsut et al. Cell. (2016) 164(4):780-91에 기재되어 있으며, 이의 기재 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한과 다른 명시된 또는 언급된 범위의 중간 값은 본 발명에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위해 참조로 여기에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "회로(circuit)"에 대한 언급은 복수의 이러한 회로를 포함하고 "핵산(the nucleic acid)"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 핵산 및 그의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 상기 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의해야 한다. 이와 같이, 이 설명은 청구 요소의 인용 또는 "부정적(negative)" 제한의 사용과 관련하여 "단독(solely)", "오직(only)" 등의 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.
명확성을 위해 별도의 실시양태와 관련하여 설명된 본 발명의 특정 특징은 단일 실시양태에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 속하는 실시양태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 기재된다. 또한, 다양한 실시양태 및 그 요소의 모든 하위 조합도 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 이러한 모든 하위 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 기재되어 있는 것처럼 본원에서 기재된다.
본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 공개를 위해서만 제공된다. 본 문서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공개보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로 별도로 확인해야 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
분자 피드백 회로 및 이러한 분자 피드백 회로를 인코딩하는 핵산 및 본 분자 피드백 회로로 유전적으로 변형된 세포가 제공된다. 분자 피드백 회로를 사용하여 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하는 방법 및 분자 피드백 회로를 코딩하는 핵산을 함유하는 세포를 투여함으로써 병태에 대해 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 분자 피드백 회로의 양태는 잠재성 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 경로의 신호전달 단백질을 포함한다. 이러한 회로는 상기 신호전달 경로의 출력에 반응하고, 발현될 때 비활성화 도메인을 촉발하여 상기 신호전달 분자를 비활성화시키는 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다.
분자 회로(Molecular Circuits)
본 발명의 분자 회로는 일부 경우에 전체 또는 부분적으로 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 회로는 일부 경우에 발현 벡터 및/또는 발현 카세트에 존재 및/또는 구성될 수 있다. 본 발명 회로의 개체 핵산은 일부 경우에, 예를 들어 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이러한 회로는 일부 경우에 면역 세포, 줄기 세포 등과 같은 세포에 존재할 수 있거나, 예를 들어 바이러스 벡터의 사용을 비롯한 다양한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 세포는 일부 경우에 개체 회로를 포함 및/또는 인코딩하도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 여기서 이러한 변형은 원하는 대로 효과적으로 영구적(예: 통합)이거나 일시적일 수 있다.
상기 구성요소가 모듈식인 본 개시내용의 회로는 잠재성 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "신호전달 단백질(signaling protein)"은 일반적으로 하기에 보다 상세히 기재된 천연 및 합성 신호전달 경로를 포함하는 신호전달 경로의 단백질을 의미한다. 임의의 편리한 신호전달 경로의 임의의 편리하고 적절한 신호전달 단백질이 사용될 수 있다. 일반적으로, 신호전달 단백질은 신호전달 단백질과 관련된 신호전달 경로의 입력에 의해 활성화될 수 있는 단백질을 포함한다. 신호 전달 경로는 신호 전달 단백질의 기능에 의존하거나 적어도 영향을 받는 출력을 생성할 수 있다. 그러한 출력은 입력에 대한 신호 단백질의 반응의 직접적 또는 간접적 결과일 수 있다. 유용한 신호전달 단백질은 입력-수신 구성원(input-receiving members), 중간 구성원(intermediate members) 및 출력-생성 구성원(output-producing members)을 포함하는 신호전달 경로의 임의의 편리하고 적절한 포인트의 구성원을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "입력-수용 구성원(input-receiving members)"은 일반적으로 경로를 따라 신호전달을 개시하기 위해 입력을 수용하는 신호전달 경로의 초기 구성요소를 의미한다. 입력-수용 구성원의 실시예에는 예를 들어, 세포외 수용체(예를 들어, G 단백질-결합 수용체(G protein-coupled receptors), 단백질 키나제(protein kinases), 인테그린(integrins), 톨-유사 수용체(toll-like receptors), 리간드 개폐 이온 채널(ligand-gated ion channels) 등) 및 세포내 수용체(예를 들어, 핵 수용체(nuclear receptors), 세포질 수용체(cytoplasmic receptors) 등)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 입력-수용 구성원은 신호 전달 경로의 리간드 입력과 같은 신호 경로의 입력에 직접 결합하는 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 입력-수용 구성원일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 입력-수용 구성원이 아닐 수 있고, 예를 들어, 중간 구성원 또는 출력-생성 구성원(output-producing member)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "중간 구성원(intermediate member)"은 일반적으로, 신호전달에 필요하거나 적어도 관련되어 있지만 초기 입력을 직접적으로 수용하지 않거나 신호전달 경로의 최종 출력을 직접 생성하거나 유발하지 않는 신호전달 경로의 구성요소를 의미한다. 신호전달 경로의 중간 구성원의 실시예는, 예를 들어 효소, 결합 파트너, 단백질 복합체 서브유닛, 스캐폴드 단백질, 수송 단백질, 공동-활성화제, 공동-억제제 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 중간 구성원일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 중간 구성원이 아닐 수 있고, 예를 들어, 입력-수용 구성원 또는 출력-생성 구성원일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "출력-생성 구성원(output-producing member)"는 일반적으로 신호 전달 경로의 출력을 직접 생성하거나 그렇지 않으면 신호 전달 경로의 출력이 발생하도록 하는 신호 전달 경로의 구성요소를 의미한다. 신호전달 경로의 출력-생성 구성원의 실시예는, 예를 들어 전사 인자, 효소 등과 같은 DNA 결합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 출력-생성 구성원일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질은 출력-생성 구성원이 아닐 수 있고, 예를 들어, 입력-수용 구성원 또는 중간 구성원일 수 있다.
신호전달 경로의 개략적인 실시예가 도 1에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 상기 신호전달 경로는 경로의 입력-수신 부재(101)를 활성화하는 입력(100)을 포함한다. 입력-수용 구성원(101)의 활성화는 경로의 제1 중간 구성원(102)을 긍정적으로 조절하고, 이는 경로의 제2 중간 구성원(103)을 긍정적으로 조절한다. 도시된 경로에서, 제2 중간 구성원(103)은 제3 중간 구성원(104)에 의해 부정적으로 조절된다. 제3 중간 구성원(104)에 의한 억제가 없는 경우, 제2 중간 구성원(103)은 상기 경로의 출력-생성 구성원(105)을 긍정적으로 조절한다. 따라서, 제2 중간 구성원(103)에 의한 활성화의 존재 하에, 출력-생성 구성원(105)은 활성이고 신호전달 경로의 출력을 인코딩하는 서열(106)에 작동가능하게 연결된 조절 영역(107)에 결합한다.
유용한 신호전달 단백질은, 신호전달 단백질이 신호전달 경로의 음성 조절인자 또는 신호전달 경로의 양성 조절인자인 경우를 포함하여, 신호전달 단백질과 관련된 하나 이상의 신호전달 경로의 조절인자일 수 있다. 따라서, 본 발명의 분자 피드백 회로는 양성 피드백 회로 및 음성 피드백 회로를 포함한다.
예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 사용된 신호전달 단백질은 활성화될 때 신호전달 경로의 출력을 구동할 수 있다. 이와 같이, 잠재적 비활성화 도메인을 촉발하여 신호전달 단백질을 비활성화하는 것은 신호전달 경로의 출력을 음성으로 조절하여 음성 피드백을 초래할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에 사용된 신호전달 단백질은 활성화될 때 신호전달 경로의 출력을 억제할 수 있다. 이와 같이, 잠재적인 비활성화 도메인을 유발하여 신호전달 단백질을 비활성화하는 것은 신호전달 경로의 출력을 긍정적으로 조절하여 양성 피드백을 초래할 수 있다.
도 2는 경로를 양성으로 조절하는 제1 중간 신호전달 구성원(102)이 잠재적인 비활성화 도메인(200)을 포함하도록 변형된 도 1에 제시된 신호전달 경로를 도시한다. 따라서, 상기 잠재적인 비활성화 도메인(200)이 잠재적인 상태에 남아 있을 때, 신호전달 경로를 통한 신호전달은 입력부(100)에서 입력-수용 구성원(101)을 통해 상기 경로의 다운스트림 구성요소를 양성으로 조절하는 제1 중간 신호전달 구성원(102)으로 진행하고, 제3 중간 구성원(그림 없음)에 의한 억제가 없을 때, 출력-생성 구성원(105)은 서열(106)에 의해 인코딩된 생성물의 발현으로 묘사되는 신호 전달 경로의 출력을 구동한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 발현된 스위치 폴리펩티드(300)는 잠재적인 비활성화 도메인(200)을 활성화하여 제1 중간 구성원(102)을 비활성화시키고, 따라서 제1 중간 구성원(102)에서 제2 중간 구성원(103) 및 경로의 후속 지점으로의 양성 신호전달의 결여를 야기한다. 따라서, 상기 서열(106)로부터의 출력은 생성되지 않거나 감소된다.
도 4에 도시된 다른 실시예에서, 잠복 비활성화 도메인(400)은 억제성 제3 중간 부재(104)에 부착된다. 따라서, 상기 잠재적인 비활성화 도메인(400)이 잠재적인 상태로 남아 있을 때, 제3 중간 구성원(104)의 존재는 제2 중간 구성원을 음성으로 조절함으로써 출력 서열(106)에 의해 인코딩된 생성물의 발현 및 생산을 억제한다. 상응하게, 상기 잠재적인 비활성화 도메인(400)이 발현된 스위치 폴리펩티드(401)에 의해 활성화될 때, 제3 중간 구성원(104)은 비활성화되고, 이에 의해 제3 중간 구성원(104)에 의한 음성 조절을 방지하고 출력의 생성, 즉 서열(106)에 의해 인코딩된 생성물의 발현의 적어도 증가를 촉진하기 위해 상기 경로(100)를 양성으로 조절한다.
스위치 폴리펩티드와 통합되는 경우, 그 발현이 신호전달 경로의 출력에 의해 구동되고, 잠재적인 비활성화 도메인을 경로의 신호전달 단백질에 커플링하면 원하는 대로 양성 또는 음성 피드백을 제공할 수 있다. 예를 들어,상기 잠재적인 비활성화 도메인을 양성 신호전달 조절자에 커플링하면 상기 경로에 대한 음성 피드백이 생성되는 반면, 잠재적인 비활성화 도메인을 음성 조절자에 커플링하면 상기 경로에 대한 양성 피드백이 생성된다. 일부 경우에, 음성 경로 피드백을 사용하여 응답을 약화시킬 수 있는 반면, 일부 경우에는 양성 경로 피드백을 사용하여 응답을 증폭하거나 초감도를 생성할 수 있다. 쉽게 명백해지는 바와 같이, 본 발명의 피드백 회로는 고도로 모듈화되어 있으므로, 본원에 기재된 회로는 원하는 대로 쉽게 변형될 수 있고/있거나, 예를 들어, 프로모터를 통해 측정 가능한 출력을 갖는 신호 전달 경로를 포함하는 본질적으로 임의의 편리하고 적절한 신호 전달 경로에 적용될 수 있다.
피드백 제어는 장애 제거를 통해 물리적 프로세스의 강력하고 안정적인 성능을 가능하게 한다. 피드백 제어의 구현은 일반적으로 (1) 프로세스의 출력을 측정하거나 "감지(sense)"하는 기능, (2) 원하는 출력 또는 "설정점(setpoint)"에 대한 출력 측정의 비교를 기반으로 수정 신호를 생성하는 컨트롤러 및 (3) 제어할 프로세스에 수정 신호를 입력하거나 "작동(actuate)"하는 방법이 포함될 수 있다. 생물학적 시스템의 피드백 제어를 생성하기 위해 발현된 스위치 폴리펩티드에 의해 촉발되는 잠재적인 비활성화 도메인 기반-단백질 스위치를 이용하는 설계된 회로가 본원에서 제공된다. 구체적으로, 상기에서 설명한 것과 유사한 3개의 모듈 (1) 관심 프로세스의 출력에 의해 활성화되는 감지 프로모터(sensing promoter), (2) (3) 신호 전달 단백질의 분해를 활성화하는 감지 프로모터에 의해 생성되는 스위치 펩티드 (즉, 전사 인자, 키나제 등)는 잠재성 비활성화 도메인에 융합된다. 이러한 각 모듈은 원하는 대로, 상기 프로세스의 원하는 피드백 제어를 달성하기 위해 간단한 조작을 통해 독립적으로 조정할 수 있다.
본 개시내용의 회로에 사용될 수 있는 신호전달 단백질은 신호전달 경로의 내인성 구성요소 뿐만 아니라 신호전달 경로의 이종 또는 합성 구성요소인 신호전달 단백질을 포함한다. 신호전달 경로의 이러한 내인성, 이종성 및/또는 합성 구성요소는 본 개시내용의 회로에서 사용하기 위해 하기에 더 상세히 설명되는 잠재성 비활성화 도메인을 포함하도록 변형될 수 있다. "신호전달 경로의 내인성 구성요소(endogenous component of the signaling pathway)"는 일반적으로 세포에서 자연적으로 발생하는 신호전달 경로의 성분을 의미한다.
"신호전달 경로의 이종 구성요소(heterologous component of the signaling pathway)"는 일반적으로 신호전달 경로에서 기능하지만 상기 개체 회로에서 사용되는 것과 다른 세포 또는 신호전달 경로로부터 유도되는 성분을 의미한다. 이종 구성 요소는 개체 회로의 신호 전달 경로와 분리된 신호전달 경로에서 파생될 수 있다. 이종 구성요소는 개체 회로에서 변조된 신호 전달 경로의 세포 및/또는 유기체와 상이한 유형의 세포 및/또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 제1 유기체(예를 들어, 마우스)로부터의 신호전달 경로의 성분은 제2 유기체(예를 들어, 인간)의 상응하는 신호전달 경로에서 사용될 수 있다.
"신호전달 경로의 합성 구성요소(synthetic component of the signaling pathway)"는 일반적으로 신호전달 경로에서 기능하지만 비-천연적으로 유도되는 구성요소를 의미한다. 비-천연 유래 구성요소는 예를 들어 유사체, 모방체, 융합체, 돌연변이체, 절단된 버전, 단편 등을 포함하는 재조합 성분을 포함할 수 있다. 신호전달 경로의 합성 구성 요소 의 비-제한적인 실시예는 합성 수용체, 합성 효소, 합성 공동-활성화제, 합성 공동-억제제, 합성 결합 파트너, 합성 스캐폴드 단백질, 합성 전사 인자 등을 포함한다.
본 발명의 회로는 하나 이상의 조절 서열을 사용할 수 있고, 상기 제어는 신호전달 단백질이 연관된 신호전달 경로의 구성요소에 의존할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 발명의 회로는 신호전달 경로의 출력에 반응하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 개체 회로의 하나 이상의 구성요소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 조절 서열은 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 경우에, 회로는 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 개체 회로의 신호전달 단백질을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 다양할 수 있고 내인성 및 이종성 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 천연 프로모터, 천연 인핸서, 이종 프로모터, 이종 인핸서, 합성 조절 서열, 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 신호전달 단백질을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 원하는 대로 구성되거나 유도될 수 있다. 일부 경우에, 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 신호전달 단백질의 천연 프로모터이다.
일부 경우에, 조절 서열은 예를 들어, 전사 인자가 신호전달 경로에서 기능하는 내인성, 이종성 또는 합성 전사 인자인 경우를 포함하여, 출력의 전사 인자에 대한 하나 이상의 결합 부위(예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 2개 내지 10개, 3개 내지 10개, 4개 내지 10개, 5개 내지 10개, 2개 내지 6개, 3개 내지 6개, 4개 내지 6개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 회로의 조절 서열은 신호전달 경로의 출력에 의해 제어되거나 그렇지 않으면 이에 반응할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 상기 개체 회로가 영향을 미치도록 구성된 신호전달 경로의 출력은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 통해 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 본 발명의 회로의 구성요소를 인코딩하는 서열의 조절을 신호전달 경로의 출력에 연결함으로써, 본 발명의 회로는 상기 출력에 반응하는 피드백을 제공할 수 있다.
본 발명의 회로에서 사용하는 유용한 신호전달 경로 출력은 다양할 수 있고, 조절 서열을 통한 발현에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치도록 구성될 수 있는 임의의 출력을 본질적으로 포함할 수 있다. 유용한 신호전달 경로 출력의 비-제한적인 실시예는 예를 들어, 전사 인자의 활성(예: 활성화, 억제 등), 전사 인자의 발현, 전사 인자의 전위, 효소의 활성(예: 활성화, 억제 등), 효소의 발현, 효소의 발현, 신호전달 분자의 생산, 신호전달 분자의 분비, 세포 활성(예를 들어, 면역 활성화, 면역 억제, 증식 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 천연 세포 프로그램의 활성화) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
신호전달 경로는 하나 이상의 입력에 의해 변조(예를 들어, 활성화, 억제 등)될 수 있다. 신호전달 경로의 입력은 다양할 수 있으며 신호전달 경로의 내인성(예: 천연) 입력 및 이종(예: 조작 또는 합성) 신호 경로 입력을 포함할 수 있다. 신호 전달 경로 및 신호 전달 경로 출력이 천연 또는 합성일 수 있으므로, 신호 경로 입력은 유사하게 천연 또는 합성일 수 있다.
천연 신호전달 경로는 많은 경우에 경로의 천연 또는 천연 수용체에 의해 제어될 수 있다. 천연 신호전달 경로의 비-제한적인 실시예는 AKT 신호전달 경로, Akt/PKB 신호전달 경로, AMPK 신호전달 경로, 세포자멸사 신호전달 경로(apoptosis signaling pathway), BMP 신호전달 경로, cAMP-의존성 경로, 에스트로겐 신호전달 경로, 헷지호그 신호전달 경로(hedgehog signaling pathway), 하마 신호전달 경로(hippo signaling pathway), 면역 활성화 경로, 면역 억제 경로, 면역 세포 분화 경로, 인슐린 신호 전달 경로, JAK-STAT 신호전달 경로, MAPK/ERK 신호전달 경로, mTOR 신호전달 경로, NF-κB 신호전달 경로, 결절 신호전달 경로(nodal signaling pathway), 노치 신호전달 경로(notch signaling pathway), p53 신호전달 경로, PI3K 신호전달 경로, TGF 베타 신호전달 경로, TLR 신호전달 경로, TNF 신호전달 경로, VEGF 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
합성 신호전달 경로의 비-제한적인 실시예에는 예를 들어 CAR, 조작된 TCR, synNotch 등과 같은(이에 국한되지 않음) 합성 또는 조작된 수용체에 의해 제어되는 경로가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 신호 전달 경로는 하기에 더 자세히 설명되어 있다.
본 발명의 회로를 사용하여 합성 synNotch 신호전달 경로 및 합성 CAR 신호전달 경로를 조절하는 도식화된 예가 각각 도 5 및 도 6에 도시되어 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 항원 결합 도메인(501), 단백질 분해로 절단 가능한 Notch 도메인(502), 및 세포내 신호전달 도메인을 갖는 synNotch 수용체(500)는 합성 전사 인자(synTF) 부분(503) 및 잠재성 비활성화 도메인(504)을 포함하며, 항원 입력(505)에 의해 촉발되어 세포내 신호전달 도메인을 방출한다. 항원 결합 후 synNotch의 세포내 신호전달 도메인의 방출은 synTF에 의해 제어되는 원하는 출력(506)의 발현을 유도한다. 도시된 실시양태에서, 상기 synTF 출력은 또한 스위치 폴리펩티드(508)의 발현(507)을 제어한다. 따라서, synNotch의 방출된 세포내 신호전달 도메인이 스위치 폴리펩티드의 발현을 유도할 때, 상기 스위치 폴리펩티드(508)는 잠재적인 비활성화 도메인(504)을 활성화하여 synNotch 수용체의 synTF-함유 세포내 신호전달 도메인을 비활성화시킨다. 따라서 합성 synNotch 신호 경로를 통해 음성 피드백을 제공하여 제어된 사용자 지정 출력이 생성된다.
도 6에 도시된 바와 같이, CAR(600)은 항원 결합 도메인(602)에 결합하는 항원 입력(601)에 의해 촉발되어 내부 신호전달 캐스케이드, 예를 들어 CAR(600)의 CD3z 도메인(603)을 통한 면역 자극 신호전달을 통해 면역 세포 활성화를 유도한다. 상기 CAR(600)은 또한 부착된 잠재적인 비활성화 도메인(604)을 포함하고 세포는 내부 신호전달 캐스케이드의 구성요소에 반응하는 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 서열(605)에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 따라서, 내부 신호전달 캐스케이드의 활성화는 면역 세포 활성화 및/또는 CAR에 의해 제어되는 원하는 면역 인자의 발현과 같은 원하는 출력(606)의 발현을 유도한다. 그러나, 사진의 실시형태에서, 상기 CAR 출력은 또한 스위치 폴리펩티드(607)의 발현을 제어한다. 따라서, 상기 신호전달 캐스케이드가 스위치 폴리펩티드(607)의 발현을 유도할 때, 스위치 폴리펩티드(607)는 CAR을 비활성화시키는 잠재성 비활성화 도메인(604)을 활성화시킨다. 따라서, 합성 CAR 신호전달 경로를 통해 음성 피드백을 제공함으로써 T-세포 활성화가 제어된다.
쉽게 명백해지는 바와 같이, 합성 신호전달 경로를 사용하는 이러한 예는 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
잠재적인 비활성화 도메인 및 스위치 폴리펩티드
상기 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 회로에 사용되는 신호전달 단백질은 잠재적인 비활성화 도메인을 포함할 수 있다. 본 회로의 개체 신호전달 단백질에 포함된 잠재적인 비활성화 도메인은 다양할 수 있고 원하는 대로 신호전달 단백질에 부착되거나 통합될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 비활성화 도메인이 링커를 통해 부착되는 경우를 포함하지만 이에 제한되지 않는 개체 신호전달 단백질에 잠재적인 비활성화 도메인을 부착하거나 통합하는 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다.
스위치 폴리펩티드가 없는 경우, 잠재적인 비활성화 도메인은 잠재적인 상태로 유지되며, 이는 비활성화 도메인이 연관된 신호 전달 단백질을 비활성화하지 않는다는 것을 의미한다. 상기 스위치 폴리펩티드의 존재 하에, 잠재적인 비활성화 도메인이 활성화되고, 이어서 이것이 연관된 신호 단백질을 비활성화시킨다. 비활성화 전략은 다양할 수 있으며, 예를 들어 유도성 분해, 유도성 국소화, 단백질 분할 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 스위치 폴리펩티드는 상응하게 다양할 수 있고, 예를 들어, 잠재적인 비활성화 도메인의 분해를 유도하는 폴리펩티드, 잠재적인 비활성화 도메인의 국소화를 유도하는 폴리펩티드, 잠재적인 비활성화 도메인의 분할을 유도하는 폴리펩티드 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 요약된 바와 같이, 잠재적인 비활성화 도메인은 유도성 분해 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "유도성 분해 도메인(inducible degradation domain)"은 스위치 폴리펩티드의 발현 시에 유도성 분해 도메인이 부착되거나 결합되는 신호전달 단백질과 같은 폴리펩티드의 분해를 조절(예: 강화, 증가 등)할 수 있는 도메인을 의미한다. 유도성 분해 도메인은 일반적으로 상응하는 스위치 폴리펩티드가 발현되지 않을 때 개체 신호전달 단백질의 분해를 조절(예를 들어, 강화, 증가 등)하지 않을 것이다. 따라서, 상기 분해 도메인은 일반적으로 그것이 부착되거나 결합되는 폴리펩티드의 분해를 유도하기 위해 스위치 폴리펩티드의 발현에 의해 활성화될 때까지 잠재적일 것이다. 상기 분해 도메인이 부착되거나 결합되는 신호 단백질과 같은 폴리펩티드의 분해는 폴리펩티드를 비활성화시킨다.
유도성 분해 도메인을 포함하는 잠재적인 비활성화 도메인의 구성은 해당 스위치 폴리펩티드와 마찬가지로 다양할 것이다. 일부 경우에, 분해 도메인은 degron을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유도성 분해 도메인은 상기 분해 도메인에 부착된 폴리펩티드(예를 들어, 신호전달 단백질)의 분해를 방지하는 보호 도메인을 포함할 수 있다. 보호 도메인에 의해 보호되는 분해 도메인은 스위치 폴리펩티드에 의해 탈보호될 수 있어, 상기 분해 도메인이 활성이 되어 부착된 또는 다른 방식으로 연관된 폴리펩티드의 분해를 촉발할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 신호전달 단백질에 부착된 분해 도메인은 스위치 폴리펩티드에 포함된 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 단백질 분해 절단 부위를 포함하는 보호 도메인에 의해 보호될 수 있다. 스위치 폴리펩티드가 없는 경우, 상기 프로테아제는 존재하지 않으며 보호 도메인은 분해 도메인이 신호 전달 단백질의 분해를 촉발하는 것을 방지한다. 스위치 폴리펩티드의 존재 하에, 상기 프로테아제는 단백질 분해 절단 부위를 절단하여 분해 도메인을 탈보호하고 신호전달 단백질의 분해를 촉발한다.
일부 실시양태에서, 스위치 폴리펩티드는 신호전달 단백질에 부착된 유도성 비활성화 도메인 상에 존재하는 N- 또는 C-말단 서열을 절단할 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제(tobacco etch virus (TEV) protease)와 같은 프로테아제를 포함할 수 있다. 상기 프로테아제에 의한 절단은 신호전달 단백질의 분해를 촉발하는 N- 또는 C-말단 degron을 드러낸다. 따라서, TEV 프로테아제-함유 스위치 폴리펩티드가 없을 때 상기 degron은 숨겨진 상태로 남아 있고 신호 전달 단백질의 분해를 유도하지 않는다. 일부 경우에, 프로테아제-유도성 분해 도메인 시스템에서 사용될 수 있는 구성요소 및 구성은 Gao et al., Science. 2018; 361(6408):1252-1258에 기내된 바와 같이 CHOMP (circuits of hacked orthogonal modular proteases) 시스템에서 사용되는 것을 포함할 수 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 일부 경우에, 다른 데그론 및/또는 다른 인코딩된 프로테아제가 명시적으로 기재된 것들을 대체할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유도된 분해는 표적 신호전달 단백질에 분해 서열의 결찰에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 두 펩티드가 모두 존재할 때 서로 결합하는 두 펩티드를 사용하여 분해 서열을 표적 신호전달 분자에 유도성 방식으로 결찰할 수 있다. 서로에 대한 펩티드의 결합은 일부 경우에 공유적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 태그-결합 도메인에 결합하는 태그 펩티드는 표적 신호전달 단백질에 혼입될 수 있고, 스위치 단백질은 구성적 degron과 같은 부착된 분해 서열을 갖는 태그-결합 도메인을 포함하도록 구성될 수 있다. 이러한 스위치 단백질이 발현되면, 태그와 태그-결합 도메인이 서로 결합하여 표적 시그널링 단백질에 분해 서열을 부착시켜 신호전달 단백질의 분해를 유도한다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 일부 경우에, 태그 및 태그-결합 도메인은 교환될 수 있으며, 즉, 태그 펩티드에 결합하는 태그-결합 도메인은 표적 신호전달 단백질에 통합될 수 있고 스위치 단백질은 다음과 같이 구성될 수 있고 분해 서열이 부착된 태그 펩티드를 포함한다.
이들 및 유사한 실시양태에서 사용될 수 있는 서로 결합하는 펩티드의 유용한 예는 SpyCatcher 및 SpyTag를 포함한다. 상기 용어 "SpyTag" 및 "SpyCatcher"("Spy"는 박테리아 Streptococcus pyogenes를 나타냄)는 일반적인 단백질-단백질 상호작용보다 더 큰 효능으로 두 개의 폴리펩티드를 결합할 수 있는 편리한 단백질 결합 도구를 나타낸다. 상기 SpyTag/SpyCatcher 시스템은 비가역적인 펩티드 결찰을 생성하므로 단백질을 결합, 라벨링 또는 고정화하는 데 사용할 수 있다. SpyTag는 유전적으로 인코딩된 파트너 SpyCatcher와 결합할 때 자발적인 아미드 결합을 형성하는 유전적으로 코딩된 펩티드이다. SpyTag는 광범위한 조건에서 SpyCatcher와 반응하며 반응 후 생성물은 매우 안정적이다. SpyCatcher 및 SpyTag는 Zakeri et al.(Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(12):E690-7) 및 PCT Pub. WO/2017/112784에 기재되어 있고, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 개시내용의 회로에서 분해 신호를 표적 신호전달 단백질에 유도적으로 결찰시키거나, 그렇지 않으면 연관시키도록 적응될 수 있는 단백질 커플링 전략의 유용한 예는 또한 PROTAC을 포함한다. 단백질 분해-표적 키메라(PROTAC)는 표적 단백질에 결합하는 첫 번째 도메인과 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)와 결합할 수 있는 두 번째 도메인을 포함하는 두 개-헤드를 가진 거대분자이다. 본원에 기재된 회로 및 방법에 사용하기 위해 조정될 수 있는 표적된 분해를 위해 PROTAC를 사용하는 방법은 예를 들어, aina & Crews, J Biol Chem. (2010) 285(15):11057-60; Raina & Crews, Curr Opin Chem Biol. (2017) 39:46-53; Coleman & Crews, Annual Review of Cancer Biology (2018) 2:41-58; Bondeson et al., Cell Chemical Biology (2018) 25(1):78-87; Neklesa et al., Pharmacology & Therapeutics. (2017) 174:138-144에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 유비퀴바디(Ubiquibodies) 및 펩티드 PROTAC는 예를 들어, Ludwicki et al, ACS Central Science 2019 5: 852-866; Portnoff et al, J. Biol. Chem. 2014 289: 7844-7855; Fan et al Nature Neuroscience 2014 17: 471 480; 및 Hines et al Proc. Natl. Acad. Sci. 2013 110: 8942-8947에 기재되어 있다.
쉽게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 회로에서 표적 신호전달 단백질에 분해 신호를 유도적으로 결찰하기 위한 전략 및 구성요소는 본원에 구체적으로 기재된 전략 및 구성요소에 제한되지 않을 수 있고, 일부 경우에 상기 기재된 회로에서 사용하기 위한 다른 단백질 커플링 시스템에 적응될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 회로에 사용되는 유도된 분해 전략은 표적 신호전달 단백질에 포함된 데그론(degron)의 인산화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키나제에 의해 인산화될 수 있는 데그론은 표적 신호전달 단백질 내로 통합될 수 있고 스위치 폴리펩티드는 키나제를 포함할 수 있다. 따라서, 스위치 폴리펩티드의 발현 시, 상기 키나제는 표적 신호전달 단백질의 분해를 유발하는 데그론을 인산화시킨다. 상응하게, 상기 스위치 폴리펩티드가 발현되지 않을 때, 키나제가 존재하지 않고, 데그론이 인산화되지 않고, 표적 신호 단백질이 분해되지 않는다.
본 발명의 회로에서 사용하기 위해 조정될 수 있는 인산화 기반 유도 분해 전략의 유용한 예는 예를 들어, Gordley et al. PNAS(2016) 113(47): 13528-13533에 의해 기재된 것과 같은; 모듈러-포스포-데그론(modular-phospho-degron) 전략을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 예를 들어, 모듈형 포스포-데그론은 Fus3 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)에 의해 인산화된 Tec1 전사 인자의 확장된 영역을 포함할 수 있으며, 효모 Cdc4 E3 유비퀴틴 리가제 복합체에 유도적으로 결합하고, 추가 폴리리신 영역을 포함할 수 있으며, 유비퀴틴화를 촉진한다. 상기 포스포-데그론(phospho-degron)은 MAPK 활성화 시 부착된 폴리펩티드의 빠른 분해를 초래하는 돌연변이 최적화된 Cdc 결합 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 신호전달 단백질은 모듈러 포스포-데그론을 포함하도록 구성될 수 있고 스위치 폴리펩티드는 MAPK를 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 스위치 폴리펩티드의 발현 시, 포스포-데그론은 MAPK에 의해 인산화되고 후속적으로 유비퀴틴화되어 표적 신호 단백질의 분해를 초래한다. 스위치 폴리펩티드가 없을 때, 포스포-데그론은 인산화되지 않고 표적 신호 단백질은 분해되지 않는다.
쉽게 이해되는 바와 같이, 본 개시내용의 회로에서 표적 신호전달 단백질의 인산화-의존성 유도성 분해를 위한 전략 및 구성요소는 본원에 구체적으로 기재된 전략 및 구성요소에 제한되지 않을 수 있고, 일부 경우에 설명된 회로에서 사용하기 위해 다른 인산화-의존성 시스템을 적용한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 회로에 사용된 유도 분해 전략은 직교 프로테아솜 시스템(orthogonal proteasome system)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스위치 폴리펩티드는 스위치 폴리펩티드가 발현되는 세포 유형(즉, 이종 프로테아좀)에 이종성인 프로테아좀을 포함하도록 구성될 수 있고 표적화된 신호전달 단백질은 이종 프로테아솜(heterologous proteasome)에 특이적인 분해 태그를 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 상기 프로테아좀과 분해 태그는 직교 쌍을 구성하여 태그된 신호 전달 단백질이 이종 프로테아좀에 의해서만 분해되도록 할 수 있다(즉, 상기 태그는 숙주-유래(내인성) 단백질 분해 기구에 의해 표적 신호전달 단백질의 분해를 유도하지 않음).
다양한 직교 프로테아좀/태그 쌍이, 예를 들어 회로를 포함하도록 변형된 세포에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포에서 직교 프로테아좀/태그 쌍은 원핵 프로테아좀 및 원핵 프로테아좀에 의한 분해를 신호하는 원핵 분해 태그를 포함할 수 있다. 원핵생물 세포에서 직교 프로테아좀/태그 쌍은 진핵생물 프로테아좀 및 진핵생물 프로테아좀에 의한 분해를 신호하는 진핵생물 분해 태그를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 직교 프로테아좀/태그 쌍은 예를 들어 쌍을 직교하게 만들기 위한 프로테아좀 및/또는 태그의 돌연변이에 의해 합성적으로 유도될 수 있다. 일부 경우에, 종간-교차 프로테아좀/태그 쌍은 직교 프로테아좀 시스템, 예를 들어, 프로테아좀 및 제2 종(예를 들어, 제2 박테리아 종, 제2 진핵생물 종 등)에서 사용되는 제1종 (예를 들어, 제1 박테리아 종, 제1 진핵생물 종 등)으로부터 유래된 분해 태그에 사용될 수 있다.
본 발명의 회로에 사용하기 위해 적합화될 수 있는 직교 프로테아좀 시스템의 유용한 실시예는 예를 들어, ClpXP 프로테아좀 및 ssrA 태그 시스템, mfLon 프로테아좀 및 pdt 태그 시스템 등과 같은 박테리아(예를 들어, E. coli, M. florum 등)로부터 유래된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 회로에 사용하기 위해 조정될 수 있는 유용한 시스템 및 구성요소는 예를 들어 Cameron & Collins, Nat Biotechnol. 2014; 32(12): 1276-1281 and Grilly et al. Molecular Systems Biology. 2007; 3:127;에 기재된 것이 포함되어 있으나, 이제 제한되지 않으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 따라서, 일부 경우에, 스위치 폴리펩티드는 직교 프로테아좀/태그 쌍의 프로테아좀을 포함할 수 있고 표적화된 신호전달 단백질은 직교 프로테아좀/태그 쌍의 분해 태그를 포함할 수 있다. 직교 프로테아좀/태그 쌍을 사용하는 회로는 프로테아좀 및/또는 태그가 세포에 이종성(즉, 내인성이 아님)인 세포에 도입될 수 있다.
쉽게 이해되는 바와 같이, 본 개시내용의 회로에서 표적 신호전달 단백질의 직교 프로테아좀 기반 유도성 분해를 위한 전략 및 구성요소는 본원에 구체적으로 기재된 전략 및 구성요소에 제한되지 않을 수 있고, 일부 경우에, 설명된 회로에서 사용하기 위해 다른 직교 프로테아좀 시스템을 조정한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 회로에 사용된 유도 분해 전략은 프로테아좀으로의 유도 국소화 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 스위치 폴리펩티드는 발현될 때 신호전달 단백질을 프로테아좀으로 국소화하거나 국소화하도록 유도될 수 있는 도메인을 포함할 수 있으며, 이로써 신호전달 단백질의 분해를 유도할 수 있다. 신호전달 단백질의 프로테아좀으로의 유도된 국소화는 어떤 경우에는 유비퀴틴과 무관할 수 있다. 다시 말해서, 신호전달 단백질의 프로테아좀으로의 유도된 국소화는 유비퀴틴화 단계를 우회할 수 있다.
예로서, 스위치 폴리펩티드는 프로테아좀에 융합된 이량체화 쌍의 제1 구성원을 포함하도록 구성되고 표적 신호전달 단백질은 이량체화 쌍의 제2 구성원을 포함하도록 변형된다. 이량체화 쌍의 제1 및 제2 구성원은 서로 직접 결합할 수 있거나(즉, 직접 이량체화할 수 있음) 이량체화 매개체(즉, 이량체화기(dimerizer))를 통해 이량체화할 수 있다. 서로 복합체를 형성할 수 있는 임의의 2개의 편리한 폴리펩티드 도메인은 제1 및 제2 이량체화 도메인으로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 이량체화 쌍의 제1 및 제2 구성원이 서로 직접 결합하는 경우, 프로테아좀에 융합된 이량체화 쌍의 제1 구성원을 포함하는 스위치 폴리펩티드의 발현은 직접 결합에 의해 프로테아좀에 대한 표적 신호 단백질의 국소화를 유도하여 이량체화 쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 결합하여 신호 전달 단백질의 분해를 초래한다. 상기 스위치 폴리펩티드가 발현되지 않을 때, 표적 신호 단백질은 프로테아좀에 국한되지 않는다.
이량체화 쌍의 제1 및 제2 구성원이 이량체화 매개체에 의해 이량체화되는 경우, 표적화된 신호전달 단백질(이량체화 쌍의 두 번째 구성원 포함)은 프로테아솜에 융합된 이량체화 쌍의 제1 구성원을 포함하는 스위치 폴리펩티드 및 이량체화 매개체 둘 다의 존재 하에 프로테아솜에 국소화될 수 있다. 따라서, 이량체화의 화학적 유도인자(CID)가 프로테아좀-융합 스위치 폴리펩티드 및 표적화된 신호전달 단백질의 이량체화를 유도하기 위해 사용되는 경우, CID의 존재 또는 부재는 회로가 피드백을 생성할 수 있는지 여부를 각각 제어할 수 있다. 서로 직접 결합하는 이량체화 도메인이 사용되는 경우, 피드백 생성은 이량체화 유도 분자의 존재와 무관할 수 있다.
유도된 분해의 프로테아좀 전략으로 유도된 국소화의 비제한적 예로서, Fpr1(친유성 마크로라이드 라파마이신과 높은 친화력으로 결합하는 것으로 밝혀진 펩타이드)은 프로테아좀 서브유닛에 융합(예: C-말단 융합)되고 Tor1(Fpr1 결합 라파마이신에 결합)의 리간드-결합 도메인은 표적 신호전달 단백질에 융합된다. 라파마이신의 존재하에서 Fpr1-태그된 프로테아좀 서브유닛의 발현 시, Tor1-태그된 신호전달 단백질은 프로테아좀에 국한되어 신호전달 단백질의 국소화에 의한 분해를 초래한다. 일부 경우에, Fpr1 및 Tor1은 서로 직접 결합하는 이량체화 도메인으로 대체되어 이량체화 매개체(예: 라파마이신)의 필요성을 무효화할 수 있다. 일부 경우에, 직접 이량체화 쌍의 이량체화 도메인이 치환되어 이량체화 매개체의 필요성을 무효화할 수 있다. 유도된 프로테아좀 국소화 전략과 Fpr1 및 Tor1 도메인의 실시예, 본 개시의 회로에서 사용하기 위해 적응될 수 있는 것은 예를 들어 Janse et al. J Biol Chem. 2004; 279(20):21415-20에 기재되어 있으며; 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
유용한 이량체화 도메인의 비-제한적인 실시예는, iDimerize 유도성 동종이량체(예: DmrB) 및 이종이량체 시스템(예: DmrA 및 DmrC) 및 iDimerize 역이량체화 시스템(예: DmrD)의 단백질 도메인(Takara Bio Inc.)을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (Clackson et al. (1998) Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(18): 10437-10442; Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. (1996) Three-part inventions: intracellular signaling and induced proximity. Trends Biochem. Sci. 21(11): 418-422; Jin et al. (2000) In vivo selection using a cell-growth switch. Nat. Genet. 26(1): 64-66; Castellano et al. (1999) Inducible recruitment of Cdc42 or WASP to a cell-surface receptor triggers actin polymerization and filopodium formation. Curr. Biol. 9(7): 351-360; Crabtree et al. (1997) Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptor tyrosine kinase ZAP70. Embo. J. 16(18): 5618-5628; Muthuswamy et al. (1999) Controlled dimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signaling by homo- and heterodimers. Mol. Cell. Biol. 19(10): 6845-6857 참조). 통상의 기술자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 다양한 다른 이량체화 도메인이 사용될 수 있다.
쉽게 이해되는 바와 같이, 본 개시내용의 회로에서 표적 신호전달 단백질의 유도된 프로테아좀-국소화 기반 유도성 분해를 위한 전략 및 구성요소는 본원에 구체적으로 기재된 전략 및 구성요소에 제한되지 않을 수 있으며, 일부에서 예를 들어, 설명된 회로에서 사용하기 위해 다른 유도된 프로테아좀 국소화 시스템을 조정한다.
다양한 degron이 본원에 설명된 유도성 분해 전략에 사용될 수 있다. Degron은 degron이 부착되거나 다른 방식으로 결합(예를 들어, 이식)되는 단백질의 분해를 신호 및/또는 표적으로 하는(또는 그렇지 않으면 분해 속도를 증가시키는) 단백질의 부분을 포함한다. 데그론의 비-제한적인 실시예는 짧은 아미노산 서열, 구조적 모티프, 노출된 아미노산 등을 포함한다. 데그론은 원핵생물 또는 진핵생물 유래일 수 있으며 자연 발생 또는 비-자연 발생(즉, 재조합) 형태로 사용될 수 있다. Degron은 분해를 위해 단백질을 표적으로 하기 위해 번역 후 변형될 수 있으며, 이러한 번역 후 수정에는 예를 들어, 유비퀴틴화(ubiquitination), 단백질 분해 절단(proteolytic cleavage), 인산화(phosphorylation), 메틸화(methylation), ADP-리보실화(ADP-ribosylation), 앰필화(ampylation), 지질화(lipidation), 알킬화(alkylation), 니트로실화(nitrosylation), 숙시닐화(succinylation), 수모일화(sumoylation), 네딜화(neddylation), 이스길화(isgylation) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
유용한 데그론은 유비퀴틴 의존성 데그론과 유비퀴틴 비의존성 데그론을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 단백질은 예를 들어, 설치류 ODC, 예를 들어 c-말단 마우스 ODC(cODC)와 같은 포유동물 ODC를 포함하나 이에 제한되지 않는 오르니틴 데카르복실라제(ornithine decarboxylase, ODC) 데그론의 부착에 의한 유비퀴틴-독립적 프로테아좀 분해를 위해 표적화될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에 유용한 데그론은 Takeuchi et al., Biochem. J (2008) 410:401-407 및/또는 Matsuzawa et al., PNAS (2005) 102(42):14982-7;에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 일부 경우에, 단백질은 데그론의 번역 후 변형(예를 들어, 단백질 분해 절단, 인산화, 메틸화, ADP-리보실화, 암필화, 지질화, 알킬화, 니트로실화, 숙시닐화, 수모일화, 네딜화, 이스길화 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 의해 유비퀴틴-독립적인 프로테아좀 분해의 표적이 될 수 있으며, 이러한 변형이 직접 또는 간접적으로 상기 단백질의 부분적 또는 완전한 언폴딩(unfolding) 또는 단백질의 분해를 초래하는 기타 메커니즘으로 이어진다.
일부 경우에, 본원에 설명된 회로에 사용된 데그론은 유비퀴틴과 무관한 열화 신호를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 신호는 변할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 유비퀴틴-독립적 분해 신호는 예를 들어 시스테인-알라닌(즉, CA) 디펩티드 모티프와 같은 디펩티드 모티프(dipeptide motif)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유비퀴틴-독립적인 분해 신호는 디펩티드 모티프만을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유비퀴틴-독립적 분해 신호는 예를 들어, 이에 제한되지 않으며, LXMSCAQE 모티프(여기서 X는 임의의 아미노산일수 있음) 또는 LXMSCAQES 모티프(여기서 X는 어떤 아미노산일 수 있음)와 같은 디펩티드 모티프 외에 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, LXMSCAQE 모티프 또는 LXMSCAQES 모티프는 X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 경우를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 데그론의 열화 신호는 다음 중에서 선택된 시퀀스를 포함할 수 있다: 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LPMSCAQES, 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LAMSCAQES, 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LVMSCAQES, 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LSMSCAQES, 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LEMSCAQES, 마지막 S가 존재 또는 부존재인 LKMSCAQES. 일부 경우에, 데그론의 열화 신호는 MSCAQE 서열 또는 MSCAQES 서열을 포함할 수 있다.
유비퀴틴-의존성 데그론은 예를 들어 PEST(프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T)) 서열 함유 데그론 뿐만 아니라 Melvin et al. (PLoS One. (2013) 29;8(10):e78082)에 기재된 데그론을 포함하나 이에 제한된 것은 아니며; Bonger로 확인된 데그론 및 TAZ, HIF-1α, iNOS, SRC3, Cyclin D1, IFNAR1, p53 및 β-Catenin에서 유래된 것으로 기술된 것을 포함하여 그 개시내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
유용한 데그론은 또한 E3 유비퀴틴 리가제 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 데그론은 종종 E3 유비퀴틴 리가아제에 의해 인식되는 기질 부위로 정의되며 짧은 펩티드 모티프 및 특정 구조 요소를 포함하는 다양한 이러한 데그론이 특성화되었다. E3 리가제/데그론 및 상응하는 모티프 패턴의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: APC/C (DBOX), 기본 모티프(primary motif) .R..L..[LIVM].; APC/C (KEN), 기본 모티프 .KEN.; APC/C (ABBA), 기본 모티프 [FIVL].[ILMVP][FHY].[DE].0,3[DEST]; APCC_TPR_1, 기본 모티프 .[ILM]R$; CBL (PTK), 기본 모티프 [DN].Y[ST]..P; CBL (MET), 기본 모티프 DYR; COP1, 기본 모티프 [DE][DE].2,3VP[DE]; CRL4_CDT2_1, 기본 모티프 [NQ]0,1..[ILMV][ST][DEN][FY][FY].2,3[KR]2,3[^DE]; CRL4_CDT2_2, 기본 모티프 [NQ]0,1..[ILMV]T[DEN][HMFY][FMY].2,3[KR]2,3[^DE]; Kelch_KEAP1_1, 기본 모티프 [DNS].[DES][TNS]GE; Kelch_KEAP1_2, 기본 모티프 QD.DLGV; Kelch_actinfilin, 기본 모티프 [AP]P[MV][IM]V; Kelch_KLHL3, 기본 모티프 E.EE.E[AV]DQH; MDM2_SWIB, 기본 모티프 F[^P]3W[^P]2,3[VIL]; Nend_Nbox_1, 기본 모티프 ^M0,1[FYLIW][^P]; Nend_UBRbox_1, 기본 모티프 ^M0,1[RK][^P].; Nend_UBRbox_2, 기본 모티프 ^M0,1([ED]).; Nend_UBRbox_3, 기본 모티프 ^M0,1([NQ]).; Nend_UBRbox_4, 기본 모티프 ^M0,1(C).; ODPH_VHL_1, 기본 모티프 [IL]A(P).6,8[FLIVM].[FLIVM]; SCF_COI1_1, 기본 모티프 ..[RK][RK].SL..F[FLM].[RK]R[HRK].[RK].; SCF_FBW7_1, 기본 모티프 [LIVMP].0,2(T)P..([ST]); SCF_FBW7_2, 기본 모티프 [LIVMP].0,2(T)P..E; SCF_SKP2-CKS1_1, 기본 모티프 ..[DE].(T)P.K; SCF_TIR1_1, 기본 모티프 .[VLIA][VLI]GWPP[VLI]...R.; SCF-TRCP1, 기본 모티프 D(S)G.2,3([ST]); SIAH, 기본 모티프 .P.A.V.P[^P]; SPOP, 기본 모티프 [AVP].[ST][ST][ST]; 여기서 '.'는 모든 아미노산 유형을 지정하고, '[X]'는 해당 위치에서 허용되는 아미노산 유형을 지정하고, 패턴의 시작 부분에 있는 '^X'는 서열이 아미노산 유형 X로 시작하는 것을 지정하고, '[^X]'는 위치가 X 유형 이외의 아미노산을 가질 수 있음을 의미하며 숫자는 다음 'Xx,y'로 지정되며, 여기서 x와 y는 해당 위치에 필요한 'X' 아미노산 유형의 최소 및 최대 수를 지정한다. '$' 기호는 단백질 사슬의 C-말단을 의미한다. E3 유비퀴틴 리가제 도메인을 포함하는 데그론은 Guharoy et al., Nature Communications (2016) 7:10239에 기재되어 있으며; 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 일부 경우에, 유용한 데그론은 ER-연관 분해(ERAD)에 대한 신호를 포함하는 데그론이 포함될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Maurer et al., Genes Genomes & Genetics (2016) 6:1854-1866에 기재되어 있고, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 일부 경우에, 유용한 데그론은 또한 특정 E3 유비퀴틴 리가제를 이용하는 옥신 유도성 데그론(AID)과 같은(이에 제한되지 않음) 약물 유도성 데그론을 포함할 수 있다(예를 들어, Nishimura et al., Nature Methods (2009) 6(12):917-922에 기술된 바와 같으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다).
쉽게 이해되는 바와 같이, E3 유비퀴틴 리가제 도메인을 포함하는 데그론은 다양할 것이며 본 개시내용의 회로는 본원에 구체적으로 기재된 E3 유비퀴틴 데그론의 사용으로 제한되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 회로에서 유도성 분해는 케이지되지 않은 경우, 케이지되지 않은 유비퀴틴을 함유하는 폴리펩티드를 프로테아좀으로 국소화하는 유비퀴틴의 직접적인 케이징을 사용할 수 있다. 예를 들어, 데그론은 상기 데그론의 구성요소 사이의 상대적인 간격을 수정하여 조정할 수 있다(예를 들어, Inobe et al., Nature Chemical Biology, 7(3), 161-167 참조; 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨). 따라서 이러한 수정을 통해, 데그론은 작동하지 않거나 최소한 최소한으로 작동할 수 있다. 그런 다음 변형된 데그론의 분해 기능은 유비퀴틴을 잠재적인 비활성화 도메인 함유 신호 단백질에 직접 국소화하거나 결찰(예: 이량체화를 통해)하여 복원할 수 있다. 유비퀴틴 단백질을 변형된 데그론에 결찰/국소화하는 임의의 편리한 방법이 이러한 실시양태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 이량체 쌍은 잠재적인 비활성화 도메인에 존재하는 쌍의 한 구성원 및 유비퀴틴 단백질에 부착된 다른 구성원과 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 류신 지퍼 쌍은 잠재적인 비활성화 도메인에 존재하는 쌍의 한 구성원 및 유비퀴틴 단백질에 부착된 다른 구성원과 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, SpyCatcher/SpyTag 쌍은 잠재적인 비활성화 도메인에 존재하는 쌍의 한 구성원 및 유비퀴틴 단백질에 부착된 다른 구성원과 함께 사용될 수 있다. 이러한 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명의 회로에 사용하도록 구성된 유도성 열화 전략에 사용될 수 있는 데그론의 다른 유용한 실시예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 예를 들어, N-말단 데그론(예를 들어, Tasaki & Kwon, Trends in Biochemical Sciences (2007) 32(11):520-528에 기재된 것과 같으나, 이에 제한되지 않으며, 이의 발명은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨); 구조화되지 않은 영역(예를 들어, Chung et al., Nat Chem Biol. 2015; 11(9): 713-720에 기재된 것과 같으나, 이에 제한되지 않으며, 이의 발명은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨); 리간드 유도 분해(LID) 및 불안정화 도메인(DD) 도메인(예를 들어, Bonger et al., Nat Chem Biol. 2012; 7(8): 531-537; Grimley et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008) 18: 759-761; and Chu et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008) 18: 5941-5944; Iwamoto et al., Chemistry & Biology (2010) 17: 981-988에 기재된 것과 같으나, 이에 제한되지 않으며, 이의 발명은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨); 예를 들어, ssrA 및 mf-Lon과 같은 원핵생물 프로테아좀 인식 서열(Cameron et al., (2014) Nature biotechnology 32(12): 1276-1281에 기재된 것과 같으며, 이의 발명은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 등.
개체 회로의 피드백 제어를 입증하는 회로에서 사용하도록 구성된 유도성 분해 시스템의 실시예는 발현된 키 폴리펩티드에 의해 케이지되지 않은 케이지형 데그론을 포함하는 degronLOCKR 시스템이다. 상기 degronLOCKR 시스템 및 degronLOCKR를 사용하는 회로는 동시 계류 중인 임시 출원 일련번호에 설명되어 있다: 62/789,418(2019년 1월 7일 출원), 62/850,336(2019년 5월 20일 출원) 및 62/789,351(2019년 1월 7일 출원), 뿐만 아니라 미국 가특허 출원 번호: 62/700,681(2018년 7월 19일 출원) 62/785,537(2018년 12월 27일 출원) 및 62/788,398(2019년 1월 4일 출원); 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 일부 경우에, 본 발명의 회로 및/또는 방법은 케이지된 데그론 시스템 및/또는 케이지된 데그론 시스템의 구성요소 및/또는 DegronLOCKR 시스템 및/또는 DegronLOCKR 시스템의 구성요소의 사용을 배제한다. 따라서, 일부 경우에, 본 발명의 잠재적인 비활성화 도메인은 케이지된 데그론이 아니다. 일부 경우에, 본 발명의 잠재적인 비활성화 도메인은 DegronLOCKR이 아니다. 일부 경우에, 본 발명의 잠재적인 비활성화 도메인은 LOCKR 도메인을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 본 발명의 잠재성 불활성화 도메인은 degronLOCKR 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
위에 요약된 바와 같이, 어떤 경우에는 비활성화를 위한 유용한 전략이 유도성 현지화를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 회로의 잠재적인 비활성화 도메인은 신호전달 단백질을 불활성화시키는 위치에 신호전달 단백질을 유도가능하게 국소화하는 도메인을 포함할 수 있다. 달리 말하면, 스위치 폴리펩티드의 존재 하에, 잠재적인 비활성화 도메인이 활성화되어 비활성화 도메인이 부착된 신호전달 단백질을 신호전달 단백질이 불활성인 세포의 일부에 제한시킬 수 있다. 유도성 국소화-기반 비활성화를 위한 다양한 다른 전략이 여기에 설명된 회로에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 스위치 폴리펩티드는 격리 도메인에 연결된 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하도록 구성될 수 있고 표적화된 신호전달 단백질은 결합 쌍의 제2 구성원을 포함할 수 있다. 따라서, 스위치 폴리펩티드의 발현 및 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원의 결합 시, 표적화된 신호전달 단백질은 격리되고 비활성화될 수 있다. 스위치 폴리펩티드가 없는 경우, 표적 신호 단백질은 격리되지 않고 따라서 활성 상태를 유지한다(즉, 비활성화되지 않음).
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "격리 도메인(sequestration domain)"은 일반적으로 폴리펩티드에 부착되고 이용가능할 때(즉, 케이지 되지 않거나 달리 접근할 수 없는 경우) 주요 기능을 수행할 수 없는 폴리펩티드가 세포 내 위치에 위치하는 폴리펩티드의 국소화를 초래하는 임의의 단백질 도메인을 의미할 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드가 전사 인자이고 이의 주요 기능이 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 유도하는 경우, 격리 도메인은 폴리펩티드가 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 유도하는 기능을 수행하는 것을 방지하기 위해 핵으로부터 떨어진 세포의 위치에 폴리펩티드를 국소화하는 기능을 할 수 있다. 그러나, 상기 전사 인자 기능을 갖는 폴리펩티드는 스위치 폴리펩티드의 부재 하에, 폴리펩티드가 세포의 핵에 국소화되어 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 유도할 수 있도록 구성될 수 있다.
유도성 국소화에 사용되는 전략은 표적화된 폴리펩티드의 작용 기전에 의존할 수 있고 유용한 전략은 핵으로부터 전사 인자의 격리에 제한되지 않을 것이다. 따라서, 다양한 격리 도메인이 여기에 설명된 유도성 위치 기반 비활성화 전략에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 사용된 격리 도메인은 예를 들어 원형질막, 미토콘드리아, 퍼옥시솜, 액포, 액틴 세포골격 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포의 다양한 위치에 부착된 폴리펩티드를 국소화할 수 있다. 따라서, 격리 도메인은 존재하고 접근 가능한 경우 부착된 폴리펩티드를 세포 내의 특정 위치로 국소화하는 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그의 유용한 실시예에는 예를 들어 원형질막-표적화 태그, 미토콘드리아 막-표적화 태그, 퍼옥시솜-표적화 태그, 액포-표적화 태그, 액틴-세포골격-표적화 태그 등이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 회로의 일부 실시양태에서, 표적화된 신호전달 단백질은 결합 쌍의 제1 구성원을 포함할 수 있고 스위치 폴리펩티드는 예를 들어, 상기 격리 도메인이 원형질막-표적화 태그, 미토콘드리아 막-표적화 태그, 퍼옥시솜-표적화 태그, 액포-표적화 태그, 액틴-세포골격-표적화 태그 등을 포함하는 경우 일부 경우를 포함하나 이에 제한되지 않는 격리 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다른 유용한 표적화 태그는 예를 들어 핵 위치 파악 태그, 핵 수출 태그 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 회로에 사용되는 유용한 유도성 국소화 전략은 국소화 태그에 융합된 제1 류신 지퍼 도메인 및 신호전달 경로의 표적화된 신호전달 단백질에 융합된 제2 류신 지퍼를 포함하는 스위치 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적화된 신호전달 단백질은 신호전달 경로의 전사 인자 구성원일 수 있지만 이에 제한되지는 않으며 국소화 태그는 핵 이외의 세포 위치, 예를 들어 원형질막(이에 국한되지 않음)에 국소화할 수 있다. 따라서, 전사 인자 표적 신호전달 단백질의 비활성화는 스위치 폴리펩티드의 존재에 의해 제어될 수 있다. 스위치 폴리펩티드의 존재 하에 제1 류신 지퍼는 제2 류신 지퍼에 결합하고 전사 인자 표적 신호전달 단백질은 핵으로부터 멀리(예를 들어, 외부로) 격리되어 신호전달 단백질을 비활성화시킨다. 스위치 폴리펩티드가 없으면 신호 전달 단백질이 격리되지 않고 비활성화가 유도되지 않는다. 따라서 상기 신호전달 단백질은 신호전달 기능을 수행할 수 있다. 이러한 유도 격리 전략은 일부 경우에 본원의 다른 곳에서 "앵커 어웨이(anchor away)"를 의미할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 회로에 사용된 앵커 어웨이 전략에 사용될 수 있는 유용한 류신 지퍼 결합 쌍 및 격리 도메인은 예를 들어 Chen et al. ACS Synth. Biol., 2015, 4(11):1205-1216에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 잠재적인 이종이량체화 도메인의 예는 다음 간행물에 설명되어 있다. 이러한 도메인은 degron을 모집하거나, 단백질을 국소화하거나(anchor away), 우성 음성으로 사용할 수 있다. 예를 들어, Thompson et al, ACS Synthetic Biology 2012 1: 118-129 and Chen et al Nature 2019 565: 106-111 참조.
유도성 국소화 전략에 사용될 수 있는 유용한 결합 쌍은 류신 지퍼 도메인으로 제한되지 않으며 이의 유용한 도메인은 다양할 수 있다. 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 서로 직접 결합할 수 있거나(즉, 직접 결합할 수 있음) 결합 매개자를 통해 결합할 수 있다. 서로 복합체를 형성할 수 있는 임의의 2개의 편리한 폴리펩티드 도메인은 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원으로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 일부 경우에, 본원의 다른 곳에서 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 폴리펩티드 이량체화 도메인은 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원으로서 사용될 수 있으며, 이량체화 쌍의 제1 및 제2 구성원이 서로 직접 결합(즉, 직접 이량체화할 수 있음)하거나 이량체화 매개체(즉, 이량체)를 통해 이량체화되는 경우를 포함한다.
결합 쌍, 및 이의 제1 및 제2 구성원의 유용한 실시예는 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2014/127261 및 WO2017/120546에 기재된 특이적 결합 쌍 및 이량체화 쌍을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 이의 기재내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 경우에, 본 발명의 회로에 사용된 유도성 국소화를 위한 전략은 케이지된 격리 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "케이지된 격리 도메인(caged sequestration domain)"은 일반적으로 국소화 태그 및 국소화 태그가 폴리펩티드의 국소화를 촉발하는 것을 방지하는 케이지 도메인, 및 현지화 태그의 정상적인 기능에 따라, 임의의 부착된 단백질을 포함하는 다중 도메인 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 원형질막-표적화 태그를 포함하는 케이지된 격리 도메인을 포함하는 상기 태그가 케이지된 상태로 유지되지만 상기 태그가 케이지되지 않은 경우 폴리펩티드 및 부착된 단백질을 원형질막에 국소화시킬 수 있는 경우에, 폴리펩티드는 원형질막에 국소화되지 않을 수 있다.
또 다른 실시예에서, 핵 국소화 태그를 포함하는 케이지된 격리 도메인을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 핵 국소화 서열(NLS)과 같으나 이에 제한되지 않음)는 태그가 케이지된 채로 있을 때 핵에 국소화되지 않을 수 있지만 태그가 케이지되지 않은 경우 폴리펩티드 및 임의의 부착된 단백질을 핵에 국소화할 수 있다. 일부 경우에, 유도된 국소화를 위한 이 전략은 신호전달 단백질 표적이 세포의 핵 외부, 예를 들어 세포질 및/또는 원형질막에서 신호전달 경로에서 기능하는 용도를 찾을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 임의의 편리한 핵 국소화 서열이 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 핵 수출 태그를 포함하는 케이지된 격리 도메인을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 핵 수출 서열(NES)와 같으나 이에 제한되지 않음)는 태그가 케이지된 채로 있을 때 핵에 제한될 수 있지만 태그가 케이지되지 않은 경우 폴리펩티드 및 임의의 부착된 단백질을 핵 외부로 국소화할 수 있습니다. 일부 경우에, 유도된 국소화를 위한 이 전략은 신호 단백질 표적이 세포의 핵에서 기능하는 용도를 찾을 수 있다. 그러한 실시양태에서, 임의의 편리한 핵 수출 시퀀스가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵 수출 태그를 포함하는 케이지된 격리 도메인은 예를 들어 케이지된 격리 도메인이 nesLOCKR 폴리펩티드를 포함하지 않는 경우를 포함하나 이에 제한되지 않는 LOCKR 도메인을 제외할 수 있다.
국소화 태그의 케이징/언케이징을 위한 임의의 유용한 전략이 관련 실시예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 스위치 폴리펩티드에 포함된 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 단백질 분해 절단 부위를 포함하는 도메인에 의한 국소화 태그의 보호를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 국소화 태그는 신호전달 단백질에 부착될 수 있고 국소화 태그는 스위치 폴리펩티드에 포함된 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 단백질 분해 절단 부위를 포함하는 보호 도메인에 의해 케이지될 수 있다. 스위치 폴리펩티드가 없는 경우, 상기 프로테아제는 존재하지 않으며 보호 도메인은 국소화 태그가 신호전달 단백질의 국소화를 촉발하는 것을 방지한다. 스위치 폴리펩티드의 존재 하에, 상기 프로테아제는 단백질 분해 절단 부위를 절단하고, 국소화 태그를 언케이징(uncaging)하거나 달리 보호해제하고, 국소화 태그에 따른 신호전달 단백질의 국소화를 촉발한다.
일부 실시양태에서, LOCKR-기반 케이지가 본 발명의 회로의 유도성 국소화 전략에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 신호전달 단백질은 LOCKR에 의해 케이지될 수 있고 주요 폴리펩티드를 포함하는 스위치 폴리펩티드에 의해 케이지되지 않을 수 있는 국소화 태그(예를 들어, NLS 또는 NES와 같으나 이에 제한되지 않음)를 포함하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, LOCKR-기반 케이지는 본 발명의 회로의 유도성 국소화 전략에 적용되지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 신호전달 단백질은 국소화 태그(예를 들어, NLS 또는 NES와 같으나 이에 제한되지 않음)를 포함하도록 구성될 수 있으며, LOCKR 도메인에 의해 케이지되지 않고 잠재적인 비활성화 도메인 함유 단백질은 LOCKER 도메인, 예를 들어 nesLOCKR 또는 nlsLOCKER를 포함하지 않을 수 있다. LOCKR 도메인 및 LOCKR 시스템을 사용하는 회로는 2019년 1월 7일에 제출된 변호사 문서 번호 UCSF-578PRV 및 MBHB 18-1783-PRO로 식별되는 동시 계류 중인 임시 출원에 설명되어 있으며, 미국 가특허 출원 번호: 62/700,681(2018년 7월 19일 출원), 62/785,537(2018년 12월 27일 출원) 및 62/788,398(2019년 1월 4일 출원); 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 회로의 신호전달 단백질의 유도된 비활성화를 위한 유용한 전략은 단백질 분할을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질 분할(protein splitting)"은 일반적으로 폴리펩티드를 분할하여 폴리펩티드를 기능적이지 않게 하거나 폴리펩티드의 적어도 하나 이상의 기능을 무효화하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 가역적으로 분할되어 폴리펩티드의 분할된 부분이 폴리펩티드를 기능적으로 만들거나 분할에 의해 폐지된 폴리펩티드의 적어도 하나 이상의 기능을 회복하도록 재결합될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 분할 부분이 폴리펩티드를 기능적으로 만들거나 분할에 의해 폐지된 폴리펩티드의 기능을 복원하기 위해 재결합되지 않을 수 있도록 비가역적으로 분할될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호전달 단백질의 폴리펩티드는 분할되고(신호 단백질의 적어도 하나의 기능을 제거) 상기 분할 폴리펩티드의 각 절반은 결합 쌍 구성원의 결합 시에 분할 신호전달 단백질이 재구성될 수 있도록 결합 쌍의 구성원에 융합된다. 예를 들어, 신호 전달 단백질은 제1 절반 및 제2 절반으로 분할될 수 있으며, 분할된 신호전달 단백질의 제1 절반은 결합 쌍의 제1 구성원에 융합될 수 있고, 제2 절반은 결합 쌍의 제2 구성원에 사용될 수 있다. 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원이 서로 결합되면, 신호전달 단백질은 폐지된 신호전달 단백질의 적어도 하나의 기능을 회복하여 재구성된다.
본 발명의 회로에서, 스위치 폴리펩티드는 분할 폴리펩티드를 재구성하는데 사용되는 결합 쌍 구성원 중 하나 또는 둘 모두를 능가하는 결합 쌍 구성원을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 상기 스위치 폴리펩티드의 존재 하에, 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원의 결합은 스위치 폴리펩티드에 의해 중단될 수 있고, 이에 의해 신호전달 단백질의 재구성을 방지하고 신호전달 단백질의 비활성화를 초래할 수 있다.
그러한 경우에, 상기 스위치 폴리펩티드의 결합 도메인은 본원에서 "우성 음성(dominant negative)" 도메인을 의미할 수 있다. 우성 음성 도메인은 본 발명의 회로의 신호전달 단백질에 부착되거나 달리 통합되는 잠재적인 비활성화 도메인의 도메인 간의 결합을 경쟁적으로 능가할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 잠재적인 비활성화 도메인은 신호전달 단백질의 도메인과 비공유적으로 결합하는 경쟁적 결합 도메인을 포함한다고 말할 수 있다. 이러한 "경쟁적 결합 도메인(competitive binding domain)"은 스위치 폴리펩티드의 결합 도메인의 존재 하에 치환될 수 있고, 따라서 신호전달 단백질의 비활성화를 초래할 수 있다. 스위치 폴리펩티드가 없는 경우, 상기 경쟁적 결합 도메인은 분할 신호전달 단백질의 결합 파트너에 결합하여 신호전달 단백질을 재구성하고 신호전달 경로에서 기능을 수행할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 전사 인자 또는 키나제와 같은 신호전달 단백질은 단백질의 분할된 부분이 서로 연관되어 있지 않을 때 신호 전달 단백질은 기능을 수행하지 않을 때, 즉, 표적의 전사를 유도하지 않으며 표적의 인산화를 촉매하지 않는 것과 같이, 분할될 수 있다. 상기 신호전달 단백질이 제1 류신 지퍼를 제2 류신 지퍼에 결합할 때 재구성될 수 있도록, 분할 신호전달 단백질의 제1 절반은 제1 류신 지퍼에 융합될 수 있고 분할 신호전달 단백질의 제2 절반은 제2 류신 지퍼에 융합될 수 있다. 우성 음성 류신 지퍼, 즉 제1 및 제2 류신 지퍼 사이의 상호작용보다 더 높은 친화도로 제1 또는 제2 류신 지퍼에 결합하는 제3 류신 지퍼는 스위치 폴리펩티드에 통합된다. 따라서, 상기 스위치 폴리펩티드는 분할 신호전달 단백질의 절반을 능가하여 비-기능적, 예를 들어, 전사 인자 기능을 수행할 수 없거나 키나제 기능을 수행할 수 없습니다. 류신 지퍼의 유용한 실시예와 2개의 더 낮은 친화도 류신 지퍼의 결합을 능가하는 우성 음성 류신 지퍼의 사용은 예를 들어, Buchler & Cross. Molecular Systems Biology (2009) 5:272에 기재된 이종 포유동물 bZIP(CEBPα) 전이활성화제 및 고친화성 3HF 우성-음성 억제제(그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 유용한 단백질 분할 전략은 분할 신호전달 단백질의 부분을 이량체화하여 신호전달 단백질을 재구성하는 이량체화 도메인 사이에 배치된 프로테아제 절단 부위의 절단을 포함한다. 예를 들어, 신호전달 단백질은 이량체화 쌍의 제1 구성원을 갖는 제1 부분 및 이량체화 쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 부분으로 분할될 수 있다. 이량체화 쌍의 구성원 중 하나 또는 둘 모두는 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 구성될 수 있다. 따라서, 상기 프로테아제를 포함하는 스위치 폴리펩티드의 발현 시, 프로테아제 절단 부위(들)가 절단되어 재구성된 신호전달 단백질을 분할함으로써 이를 불활성화시킨다.
일부 경우에, 상기 이량체화 쌍은 분할 신호전달 단백질을 이량체화하는 안티평행 류신 지퍼(antiparallel leucine zippers)와 같은 류신 지퍼를 포함한다. 따라서, 상기 신호전달 단백질은 안티평행 류신 지퍼 쌍의 제1 류신 지퍼를 갖는 제1 부분 및 쌍의 제2 류신 지퍼를 포함하는 제2 부분으로 분할된다. 상기 쌍의 류신 지퍼 중 하나 또는 둘 모두는 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 구성될 수 있다. 따라서, 상기 프로테아제를 포함하는 스위치 폴리펩티드의 발현 시, 프로테아제 절단 부위(들)가 절단되어 재구성된 신호전달 단백질을 분할함으로써 이를 불활성화시킨다.
사용될 수 있는 프로테아제 전략의 유용한 실시예는 예를 들어, 스위치 폴리펩티드가 분할 신호전달 단백질의 이량체화 도메인에 존재하는 프로테아제 절단 부위를 절단할 TEV 프로테아제를 포함할 수 있는 경우를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 TEV 프로테아제에 의한 절단은 분할 신호전달 단백질을 재구성하는 이량체화 도메인의 능력을 파괴하여 재구성된 분할 신호전달 단백질을 비활성화 및 재분할한다. 따라서, TEV 프로테아제-함유 스위치 폴리펩티드의 부재 하에 프로테아제 절단 사이트(들)는 절단되지 않은 채로 남아 있고 분할 신호전달 단백질은 재구성되고 활성 상태로 유지된다. 일부 경우에, 신호전달 단백질을 단백질 분해적으로(proteolytically) 절단하여 비활성화된 분할 신호전달 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있는 구성요소 및 구성은 Gao et al., Science. 2018; 361(6408):1252-1258에 기재된 바와 같이(그 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함됨), CHOMP(해킹된 직교 모듈식 프로테아제의 회로(circuits of hacked orthogonal modular proteases)) 시스템에서 사용되는 것을 포함할 수 있다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 일부 경우에, 다른 암호화된 프로테아제, 상응하는 프로테아제 절단 부위, 및/또는 이량체화 도메인이 명시적으로 기재된 것들을 대체할 수 있다.
또한 쉽게 이해되는 바와 같이, 단백질 분할을 사용하는 신호전달 단백질의 유도된 비활성화의 다양한 구성이 본 발명의 회로에서 사용될 수 있다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 회로는 스위치 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이의 발현은 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 작동가능하게 연결된 조절 서열에 의해 제어될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "스위치 폴리펩티드(switch polypeptide)"는 일반적으로 상응하는 잠재적인 비활성화 도메인의 존재 하에 발현될 때 잠재적인 활성화 도메인을 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 잠재적인 비활성화 도메인의 활성화는 이에 의해 비활성화 도메인이 연결되거나 그렇지 않으면 통합되는 폴리펩티드 및 예를 들어 부착된 신호전달 단백질과 같은 임의의 다른 부착된 단백질의 비활성화를 촉발한다. 스위치 폴리펩티드의 구성은 예를 들어 스위치가 활성화하도록 설계된 잠재적인 성분에 따라 달라질 것이다.
특정 잠재적인 비활성화 도메인과 함께 기능하도록 구성된 스위치 폴리펩티드는 일부 경우에 직교 시스템으로 구성될 수 있다. "직교 시스템(orthogonal system)"은 일반적으로 특정 스위치 폴리펩티드가 특정 잠재 비활성화 도메인과 함께 기능한다는 것을 의미하며, 그러나 상기 스위치 폴리펩티드는 반드시 다른 잠재적인 비활성화 도메인과 함께 기능하지 않고/않거나 잠재적인 비활성화 도메인은 다른 스위치 폴리펩티드와 반드시 기능하지 않는다. 따라서, 스위치 폴리펩티드 및 잠재적인 비활성화 도메인의 2개 이상의 상이한 직교 시스템은 간섭 없이 동일한 유기체 또는 세포에서 함께, 예를 들어 동시에 기능할 수 있다. 달리 말하면, 제1 직교 시스템의 제1 스위치 폴리펩티드는 제1 시스템의 제1 잠재적인 비활성화 도메인을 활성화하는 기능을 할 수 있는 반면, 상기 스위치 폴리펩티드는 제2 직교 시스템의 임의의 성분(예를 들어, 제2 스위치 폴리펩티드, 제2 잠재적인 비활성화 도메인 등)의 기능을 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 경우에 예를 들어, 각각이 상이한 신호전달 경로를 조절하는 2개 이상의 분자 피드백 회로, 동일한 신호전달 경로의 상이한 성분을 각각 조절하는 2개 이상의 분자 피드백 회로 등을 포함하는 두 개 이상의 분자 피드백 회로의 병렬 작동을 허용하기 위해 직교 시스템이 사용될 수 있다.
각각의 스위치 폴리펩티드 및 잠재적인 비활성화 도메인은 반드시 직교 쌍으로 구성될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 스위치 폴리펩티드가 동일한 잠재적인 비활성화 도메인을 활성화하는 기능을 할 수 있다. 상응하게, 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 잠재적인 비활성화 도메인이 동일한 스위치 폴리펩티드에 의해 활성화되도록 구성될 수 있다.
링커(Linkers)
본 발명의 회로에 사용된 폴리펩티드는 펩티드 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 개체 폴리펩티드의 2개의 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 상응하게, 본 발명의 회로의 성분을 인코딩하는 핵산 서열은 펩티드 링커를 인코딩하는 서열에 의해 연결될 수 있다.
펩티드 링커는 약 3개 아미노산(aa) 내지 약 200 aa으로 다양할 수 있으며, 예를 들어, 3 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 15 aa, 10 aa 내지 25 aa, 25 aa 내지 50 aa, 50 aa 내지 75 aa, 75 aa 내지 100 aa, 100 aa 내지 125 aa, 125 aa 내지 150 aa, 150 aa 내지 175 aa, 또는 175 aa 내지 200 aa를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 펩티드 링커는 3 aa 내지 30 aa, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 aa의 길이를 가질 수 있다. 펩티드 링커는 5 aa 내지 50 aa, 예를 들어, 5 aa 내지 40 aa, 5 aa 내지 35 aa, 5 aa 내지 30 aa, 5 aa 내지 25 aa, 5 aa 내지 20 aa, 5 aa 내지 15 aa 또는 5 aa 내지 10 aa의 길이를 가질 수 있다.
적절한 링커는 용이하게 선택될 수 있고 다수의 적절한 길이 중 임의의 것일 수 있으며, 1 아미노산 (예를 들어, Gly) 내지 20 아미노산, 2 아미노산 내지 15 아미노산, 4 아미노산 내지 10 아미노산, 5 아미노산 내지 9 아미노산, 6 아미노산 내지 8 아미노산, 또는 7 아미노산 내지 8 아미노산을 포함하는 3 아미노산 내지 12 아미노산, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 아미노산일 수 있다.
예시적인 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 1) 및 (GGGS)n(서열번호 2)을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 기타 가용성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체를 사용할 수 있으며; Gly와 Ser은 모두 상대적으로 구조화되지 않았으므로 구성 요소 사이의 중립적인 연결 고리 역할을 할 수 있다. 글리신 중합체를 사용할 수 있으며; 글리신은 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) 참조). 예시적인 링커는 GGSG (서열번호 3), GGSGG (서열번호 4), GSGSG (서열번호 5), GSGGG (서열번호 6), GGGSG (서열번호 7), GSSSG (서열번호 8), 등으로 이루어진 아미노산을 포함하나 이에 제한적이지 않다.
신호전달 경로(Signaling Pathways)
상기 요약된 바와 같이, 천연 및 합성 신호전달 경로를 포함하는 다양한 신호전달 경로는 본원에 기재된 분자 회로를 사용하여 변조될 수 있다. 적절한 신호 경로에는 하나 이상의 출력을 생성하기 위해 하나 이상의 입력에 의해 조절(예: 활성화, 억제 등)되는 경로가 포함된다. 신호전달 경로의 입력 및 출력은 다양할 수 있으며 신호전달 경로의 내인성(예: 천연) 입력 또는 출력 및 이종(예: 조작된 또는 합성) 신호 경로 입력 및 출력을 포함할 수 있다.
일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 입력은 예를 들어 상기 경로의 출력이 세포내 또는 세포간일 수 있는 경우를 포함하는 세포내 신호를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 출력은 예를 들어 상기 경로의 입력이 세포내 또는 세포간일 수 있는 경우를 포함하는 세포내 신호를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 입력은 예를 들어 상기 경로의 출력이 세포내 또는 세포간일 수 있는 경우를 포함하는 세포간 신호를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 출력은 예를 들어 상기 경로의 입력이 세포내 또는 세포간일 수 있는 경우를 포함하는 세포간 신호를 포함할 수 있다.
일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 입력 및 출력 모두는 세포내 신호를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 회로와 관련된 신호전달 경로의 입력 및 출력 모두는 세포간 신호를 포함할 수 있다.
본 발명의 회로를 사용하여 조절될 수 있는 고유 신호전달 경로의 적절한 비-제한적 실시예는 AKT 신호전달 경로, Akt/PKB 신호전달 경로, AMPK 신호전달 경로, 세포사멸 신호전달 경로, BMP 신호전달 경로, cAMP-의존성 경로, 에스트로겐 신호전달 경로, 헤지호그 신호전달 경로, 하마 신호전달 경로, 면역 활성화 경로, 면역 억제 경로, 면역 세포 분화 경로, 인슐린 신호 전달 경로, JAK-STAT 신호전달 경로, MAPK/ERK 신호전달 경로, mTOR 신호전달 경로, NF-κB 신호전달 경로, nodal 신호전달 경로, notch 신호전달 경로, p53 신호전달 경로, PI3K 신호전달 경로, TGF beta 신호전달 경로, TLR 신호전달 경로, TNF 신호전달 경로, VEGF 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
경로의 적절한 비-제한적 실시예로서, 이의 성분은 본원에 기재된 바와 같은 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하도록 변형될 수 있으며, Gene Ontology Phylogenetic Annotation Project의 일부로 설명된 PANTHER(Protein Analysis THrough Evolutionary Relationships) 경로도 포함되며, 이에 대한 설명(해당 경로의 구성 요소에 대한 설명 포함)은 www(dot)pantherdb(dot)org에서 온라인으로 볼 수 있다. 비-제한적인 실시예에는 2-아라키도노일글리세롤 생합성(2-arachidonoylglycerol biosynthesis), 5HT1 유형 수용체 매개된 신호전달 경로(5HT1 type receptor mediated signaling pathway), 5HT2 유형 수용체 매개된 신호전달 경로(5HT2 type receptor mediated signaling pathway), 5HT3 유형 수용체 매개된 신호전달 경로(5HT3 type receptor mediated signaling pathway), 5HT4 유형 수용체 매개된 신호전달 경로(5HT4 type receptor mediated signaling pathway), 5-히드록시트립타민 생합성(5-Hydroxytryptamine biosynthesis), 5-히드록시트립타민 분해(5-Hydroxytryptamine degredation), 아세테이트 활용(Acetate utilization), 액티빈 베타 신호전달 경로(Activin beta signaling pathway), 아데닌 및 하이포잔틴 회수 경로(Adenine and hypoxanthine salvage pathway), 아드레날린 및 노르아드레날린 생합성(Adrenaline and noradrenaline biosynthesis), 알라닌 생합성(Alanine biosynthesis), 알란토인 분해(Allantoin degradation), ALP23B 신호전달 경로(ALP23B signaling pathway), 알파 아드레날린성 수용체 신호전달 경로(Alpha adrenergic receptor signaling pathway), 알츠하이머 질환-아밀로이드 분비효소 경로(Alzheimer disease-amyloid secretase pathway), 알츠하이머 질환-프레세닐린 경로(Alzheimer disease-presenilin pathway), 아미노부티레이트 분해(Aminobutyrate degradation), 아난다미드 생합성(Anandamide biosynthesis), 아난다미드 분해(Anandamide degradation), 안드로겐/에스트로겐/프로게스테론 생합성(Androgen/estrogene/progesterone biosynthesis), 혈관신생 경로(Angiogenesis pathway), G 단백질(G proteins) 및 베타-아레스틴(beta-arrestin)을 통한 안지오텐신 II-자극된 신호전달 경로(Angiotensin II-stimulated signaling), 세포사멸 신호전달 경로(Apoptosis signaling pathway), 아르기닌 생합성(Arginine biosynthesis), 아스코르베이트 분해(Ascorbate degradation), 아스파라긴 및 아스퍼레이트 생합성(Asparagine and aspartate biosynthesis), ATP 합성(ATP synthesis), 네트린(netrin)에의해 매개되는 축삭 유도(Axon guidance), 세마포린(semaphorins)에 의해 매개되는 축삭 유도, Slit/Robo에 의해 매개되는 축삭 유도, B 세포 활성화 경로(B cell activation pathway), 베타1 아드레날린성 수용체 신호전달 경로(Beta1 adrenergic receptor signaling pathway), Beta2 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, Beta3 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, 비오틸 생합성(Biotin biosynthesis), 혈액 응고(Blood coagulation), BMP/activin 신호전달 경로, 부프로피온 분해(Bupropion degradation), 카드헤린 신호전달 경로(Cadherin signaling pathway), 코엔자임 A 연결된 카르니틴 대사(Coenzyme A linked carnitine metabolism), 카르니틴 대사(Carnitine metabolism), CCKR 신호전달, 세포 주기(Cell cycle), 콜레스테롤 생합성(Cholesterol biosynthesis), 코리스메이트 생합성(Chorismate biosynthesis), 일주기 시계 시스템(Circadian clock system), 코발라민 생합성(Cobalamin biosynthesis), 코엔자임 A 생합성(Coenzyme A biosynthesis), 코르티코르토핀 방출 인자 수용체 신호전달 경로(Cortocotropin releasing factor receptor signaling pathway), 시스테인 생합성(Cysteine biosynthesis), Rho GTPase에 의한 세포골격 조절(Cytoskeletal regulation), 데 노보 퓨린 생합성(De novo purine biosynthesis), 데 노보 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 생합성(De novo pyrimidine deoxyribonucleotide biosynthesis), 데 노보 피리미딘 리보뉴클레오티드 생합성(De novo pyrimidine ribonucleotides biosythesis), DNA 복제(DNA replication), 도파민 수용체 매개된 신호전달 경로(Dopamine receptor mediated signaling pathway), DPP-SCW 신호전달 경로, DPP 신호전달 경로, EGF 수용체 신호전달 경로, 내인성 칸나비노이드 신호전달(Endogenous cannabinoid signaling), 엔도테린 신호전달 경로(Endothelin signaling pathway), 엔케팔린 방출(Enkephalin release), FAS 신호전달 경로, FGF 신호전달 경로, 플라빈 생합성(Flavin biosynthesis), 테트라하이드로폴레이트 생합성(Tetrahydrofolate biosynthesis), 포르밀테트라하이드로포르메이트 생합성(Formyltetrahydroformate biosynthesis), 프룩토오스 갈락토오스 대사(Fructose galactose metabolism), GABA-B 수용체 II 신호전달, 감마-아미노부티르 산 합성(Gamma-aminobutyric acid synthesis), GBB 신호전달 경로, RNA 중합효소 I에 의한 일반 전사(General transcription by RNA polymerase I), 일반 전사 조절, 글루타민 글루타메이트 전환(Glutamine glutamate conversion), 해당과정(Glycolysis), 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 경로(Gonadotropin-releasing hormone receptor pathway), 헤지호그 신호전달 경로(Hedgehog signaling pathway), 헴 생합성(Heme biosynthesis), 헤테로트리메릭 G-단백질 신호전달 경로-Gi 알파 및 Gs 알파 매개된 경로(Heterotrimeric G-protein signaling pathway-Gi alpha and Gs alpha mediated pathway), 헤테로트리메릭 G-단백질 신호전달 경로-Gq 알파 및 Go 알파 매개된 경로, 헤테로메트릭 G-단백질 신호전달 경로-막대 외부 세그먼트 광변환(Heterotrimeric G-protein signaling pathway-rod outer segment phototransduction), 히스타민 H1 수용체 매개된 신호전달 경로(Histamine H1 receptor mediated signaling pathway), 히스타민 H2 수용체 매개된 신호전달 경로, 히스타민 합성(Histamine synthesis), 히스티딘 생합성(Histidine biosynthesis), 헌팅턴 질환 경로(Huntington disease pathway), HIF 활성화를 위한 저산소증 반응(Hypoxia response via HIF activation), 케모카인(chemokine) 및 사이토카인(cytokine) 신호전달 경로에 의해 매개되는 염증, 인슐린(Insulin)/IGF 경로-미토겐 활성화 단백질 키나아제(IGF pathway-mitogen activated protein kinase kinase)/MAP 키나아제 캐스케이드(MAP kinase cascade), 인슐린/IGF 경로 단백질 키나아제 B 신호전달 캐스케이드, 인테그린 신호전달 경로(Integrin signalling pathway), 인터페론-감마 신호전달 경로(Interferon-gamma signaling pathway), 인터루킨 신호전달 경로(Interleukin signaling pathway), 이온성 글루타메이트 수용체 경로(Ionotropic glutamate receptor pathway), 이소류신 생합성(Isoleucine biosynthesis), JAK/STAT 신호전달 경로, 류신 생합성(Leucine biosynthesis), 리포에이트 생합성(Lipoate_biosynthesis), 리신 생합성(Lysine biosynthesis), 만노오스 대사(Mannose metabolism), 대사성 글루타메이트 수용체 그룹 III 경로(Metabotropic glutamate receptor group III pathway), 대사성 글루타메이트 수용체 그룹 II 경로, 대사성 글루타메이트 수용체 그룹 I 경로, 메티오닌 생합성(Methionine biosynthesis), 메틸시트레이트 주기(Methylcitrate cycle), 메틸말로닐 경로(Methylmalonyl pathway), mRNA 스플라이싱(mRNA splicing), 무스카린성 아세틸콜린 수용체 1 및 3 신호전달 경로(Muscarinic acetylcholine receptor 1 and 3 signaling pathway), 무스카린성 아세틸콜린 수용체 2 및 4 신호전달 경로, MYO 신호전달 경로, N-아세틸글루코사민 대사(N-acetylglucosamine metabolism), 니코틴 분해(Nicotine degradation), 니코틴 약력학 경로(Nicotine pharmacodynamics pathway), 니코틴성 아세틸콜린 수용체 신호전달 경로(Nicotinic acetylcholine receptor signaling pathway), 노치 신호전달 경로(Notch signaling pathway), O-항원 생합성(O-antigen biosynthesis), 오피오이드 프로디노핀 경로(Opioid prodynorphin pathway), 오피오이드 프로엔케팔린 경로(Opioid proenkephalin pathway), 오피오이드 프로로이오멜라노코르틴 경로(Opioid proopiomelanocortin pathway), 오르니틴 분해(Ornithine degradation), 산화 스트레스 반응(Oxidative stress response), 옥시토신 수용체 매개된 신호전달 경로(Oxytocin receptor mediated signaling pathway), p38 MAPK 경로, p53 경로, 글루코오스 결핍(glucose deprivation)에 의한 p53 경로, P53 경로 피드백 루프 1(P53 pathway feedback loops 1), p53 경로 피드백 루프 2, 판토테네이트 생합성(Pantothenate biosynthesis), 파킨슨 질환(Parkinson disease), PDGF 신호전달 경로, 펜토오스 포스페이트 경로(Pentose phosphate pathway), 펩티도글리칸 생합성(Peptidoglycan biosynthesis), 페닐아세테이트 분해(Phenylacetate degradation), 페닐알라닌 생합성(Phenylalanine biosynthesis), 페닐에틸아민 분해(Phenylethylamine degradation), 페닐프로피오네이트 분해(Phenylpropionate degradation), PI3 키나아제 경로, 플라스미노겐 활성화 캐스케이드(Plasminogen activating cascade), 피리독살-5-포스페이트 생합성(Pyridoxal-5-phosphate biosynthesis), 프롤린 생합성(Proline biosynthesis), PRPP 생합성, 퓨린 대사(Purine metabolism), 피리독살 포스페이트 샐비지 경로(Pyridoxal phosphate salvage pathway), 피리미딘 대사(Pyrimidine Metabolism), 피루베이트 대사(Pyruvate metabolism), Ras 경로, S-아데노실메티오닌 생합성(S-adenosylmethionine biosynthesis), 샐비지 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드(Salvage pyrimidine deoxyribonucleotides), 샐비지 피리미딘 리보뉴클레오티드(Salvage pyrimidine ribonucleotides), SCW 신호전달 경로, 세린 글리신 생합성(Serine glycine biosynthesis), 숙시네이트(Succinate)에서 프로피리오네이트(proprionate)로 변환, 설페이트 동화(Sulfate assimilation), 시냅스 소포 밀매(Synaptic vesicle trafficking), TCA 주기, T 세포 활성 경로(T cell activation pathway), TGF-베타 신호전달 경로(TGF-beta signaling pathway), 티아민 생합성(Thiamin biosynthesis), 티아민 대사(Thiamin metabolism), 트레오닌 생합성(Threonine biosynthesis), 티로트로핀-방출 호르몬 수용체 신호전달 경로(Thyrotropin-releasing hormone receptor signaling pathway), 톨 경로(Toll pathway), 톨 수용체 신호전달 경로(Toll receptor signaling pathway), bZIP 전사 인자(bZIP transcription factor)에 의한 전사 조절(Transcription regulation), 트리아실글리세롤 대사(Triacylglycerol metabolism), 트립토판 생합성(Tryptophan biosynthesis), 티로신 생합성(Tyrosine biosynthesis), 유비퀴틴 프로테아좀 경로(Ubiquitin proteasome pathway), 발린 생합성(Valine biosynthesis), 바소프레신 합성(Vasopressin synthesis), VEGF 신호전달 경로, 비타민 B6 생합성(Vitamin B6 biosynthesis), 비타민 B6 대사(Vitamin B6 metabolism), 비타민 D 대사 및 경로(Vitamin D metabolism and pathway), Wnt 신호전달 경로, 크산틴(Xanthine) 및 구아닌(guanine) 샐비지 경로 등이 포함된다.
신호전달 경로의 추가 비-제한적 실시예 및 이의 설명은 다음을 포함한다: AKT 신호전달 경로 (AKT는 세포 사멸(apoptosis) 억제와 같은 다양한 생물학적 반응을 매개하는 데 관여하는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)이다.), Angiopoietin-TIE2 신호전달 (The 안지오포이에틴(angiopoietins) TIE2/TEK RTK (수용체 티로신 키나아제(Receptor Tyrosine Kinase))에 결합하는 새로운 성장 인자 리간드 계열이다.), MHC에 의한 항원 처리 및 제시(항원 처리 및 제시는 T 세포가 인식할 수 있도록 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 단백질의 결합을 초래하는 과정이다), 죽음 수용체를 통한 세포 사멸(Apoptosis) (특정 세포에는 세포외 사멸 신호의 존재를 감지하고 세포의 고유한 세포사멸 기구를 빠르게 점화시키는 사멸 수용체(DR)라고 하는 고유한 센서가 있음), APRIL 경로(면역 반응에서, APRIL은 B 세포 및 T 세포 증식을 위한 공동 자극제로 작용하고 클래스 스위치를 지원함), B-세포 개발 경로 (B-세포 수용체(BCR) 복합체는 일반적으로 2개의 Ig 중쇄, 2개의 Ig 경쇄 및 신호전달 서브유닛으로 구성된 항원 결합 서브유닛으로 구성됨), BMP 경로 (뼈 형태 형성 단백질(Bone morphogenetic proteins, BMP)은 변형 성장 인자-베타(TGF-베타) 슈퍼패밀리의 큰 서브클래스이다), 암 면역 편집(Cancer Immunoediting) (면역 체계는 종양 성장을 억제하려고 시도하지만 때로는 종양 세포가 이 면역 압력을 벗어나거나 약화시킬 수 있다), 대식세포에서 CCR5 경로 (C-C 모티프 케모카인 수용체 유형 5(C-C motif chemokine receptor type 5, CCR5)는 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 슈퍼패밀리의 케모카인 수용체 서브클래스의 구성원이다), CD4 및 CD8 T-세포 리니지(Lineage) (각각의 성숙한 T-세포는 일반적으로 T-세포 수용체(T-cell receptor, TCR)와 일치하는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)-결합 특성을 갖는 공동 수용체 분자(CD4 또는 CD8)의 발현을 유지한다), 세포 사멸 경로(Cellular Apoptosis Pathway) (세포 사멸(Apoptosis)는 세포가 프로그램 된 세포 사멸을 지시하는 자연적으로 발생하는 과정이다.), CTL-매개된 세포사멸(CTL-Mediated Apoptosis) (킬러 T 세포(killer T-cells)라고도 알려진 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)는 외래 에피토프를 표시하는 체세포를 제거하도록 설계된 세포 매개 면역 중에 생성된다.), CTLA4 신호전달 경로 (공동-자극 CTLA4 경로(co-stimulatory CTLA4 pathway)는 T 세포 활성화를 약화시키거나 하향 조절하며 CTLA4는 외래 에피토프를 표시하는 체세포를 제거하도록 설계되었다.), 사이토카인 네트워크(Cytokine Network) (사이토카인은 생물학적 반응에 따라 면역세포에 미치는 영향에 따라 염증성 사이토카인 또는 항염증성 사이토카인으로 분류된다.), ErbB 계열 경로(Family Pathway) (막관통 수용체 티로신 키나아제(transmembrane receptor tyrosine kinases, RTK)의 ErbB 계열은 장기의 성장과 발달 동안 중요한 역할을한다), Fas 신호전달 (FAS(APO1 또는 CD95라고도 함)는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원을 포함하는 사멸 영역이다.), FGF 경로 (혈관신생의 가장 잘 특성화된 조절제 중 하나는 헤파린-결합 섬유아세포 성장 인자(heparin-binding fibroblast growth factor (FGF))이다.), 과립구 유착(Granulocyte Adhesion) 및 당뇨병(Diapedesis) (과립구의 유착 및 발혈은 대부분 비-림프성 내피(non-lymphoid endothelium)와 관련하여 분석되었습니다.), 그랜자임 경로(Granzyme Pathway) (Granzyme A(GzmA)는 세포 사멸(apoptosis)의 형태학적 특징을 가진 카스파아제-비의존성 세포 죽음 경로(caspase-independent cell death pathway)를 활성화한다), GSK3 신호전달 (GSK3는 모든 진핵생물에서 발견되는 편재적으로 발현되고 고도로 보존된 세린/트레오닌 단백질 키나제(serine/threonine protein kinase)이다), 다능성 줄기 세포(Multipotent Stem Cells)에서 조혈(Hematopoiesis) (조혈모세포는 자가재생능력의 정도에 따라 장기, 단기, 다능성 전구세포로 분류된다.), 만능 줄기 세포(Pluripotent Stem Cells)에서 조혈 (만능 줄기 세포는 인간에게서 발견되는 거의 모든 가능한 조직 유형을 형성할 수 있다.), 활성화 및 정지 T-세포(Activated and Quiescent T-Cells)에서 IL-2 유전자 발현 (IL-2는 T -세포, B-세포, NK 세포 및 기타 면역 세포의 성장, 증식 및 분화를 자극하는 사이토카인이다.), IL-6 경로 (IL-6은 면역 체계와 다양한 기관의 많은 생리학적 현상에 영향을 미치는 다면발현성 사이토카인이다.), IL-10 경로 (IL-10은 중요한 면역 조절 기능을 갖고 많은 면역 세포 유형에 영향을 미치는 다발성 사이토카인이다), IL-22 경로 (IL-22는 사이토카인의 IL-10 계열의 구성원이며 면역 체계에 여러 효과를 발휘한다), 인터페론 경로(Interferon Pathway) (인터페론은 바이러스 감염에 대한 세포 저항을 유도하는 능력으로 가장 잘 알려진 다면발현성 사이토카인이다), JAK/STAT 경로 (JAK/STAT 경로는 세포 증식 및 조혈을 포함하는 진화적으로 보존된 역할을 하는 신호 캐스케이드이다), MAPK 계열 경로 (미토겐-활성화된 단백질 키나아제(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)는 효모와 인간과 같이 다양한 유기체에 보존되어 있는 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 큰 패밀리에 속한다.), 포유류 ESC 다능성의 Nanog (NANOG는 만능 줄기 세포에서 전사되는 전사 인자이며 세포 분화 시 하향 조절된다.), p53-매개된 세포 사멸 경로(p53-Mediated Apoptosis Pathway) (종양 단백질 p53은 유전 독성 또는 세포 스트레스에 대한 반응으로 세포 사멸, 성장 정지 또는 노화와 관련된 다양한 유전자의 발현을 조절하는 핵 전사 인자다.), 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis)의 병인 (류마티스 관절염(RA)은 주로 손과 발의 작은 관절에 영향을 미치는 만성 대칭 다관절 관절 질환이다.), B 림프구에서 PI3K 신호전달 (포스포이노시티드 3-키나아제(phosphoinositide 3-kinases, PI3K)는 세포 성장, 분화, 생존, 증식, 이동 및 대사를 포함한 수많은 생물학적 과정을 조절한다), RANK 경로 (RANKL과 그 수용체 RANK는 뼈 재형성의 핵심 조절자이며 파골세포의 발달과 활성화에 필수적이다.), 파골세포(Osteoclasts)에서의 RANK 신호전달 (RANKL은 파골세포 전구체 세포의 분화를 유도하고 성숙한 파골세포의 흡수 기능과 생존을 자극한다), TGF-Beta 경로 (변형 성장 인자(transforming growth factor, TGF)-베타 계열의 구성원은 대부분의 조직의 발달, 항상성 및 복구에 중요한 역할을 한다), THC 분화 경로 (1형(TH1) 및 2형(TH2)의 T-헬퍼 세포(T-helper cells)는 T-헬퍼 세포에서 파생되며 선천 및 후천 면역계의 세포에 도움을 제공한다.), TNF 신호전달 경로 (종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor, TNF)는 지질 대사, 응고, 인슐린 저항성 및 내피 기능에 영향을 미치는 다기능 전염증성 사이토카인입니다.), TNF 슈퍼패밀리 경로 (종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리는 TNF 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원인 29개의 수용체를 통해 신호를 보내는 19개의 구성원으로 구성된다.), 백혈구의 경내피 이동(Transendothelial Migration of Leukocytes) (내피를 가로지르는 혈장 단백질과 용질의 수송은 두 가지 다른 경로를 포함한다: 경세포 및 세포주위 접합), 간 NK 세포(Hepatic NK Cells)의 종양 제거 효과(Tumoricidal Effects) (간은 종양의 형성과 전이의 주요 부위이다), TWEAK 경로 (TWEAK는 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리에 속하는 세포 표면 관련 단백질이며 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다), 리간드 및 수용체 상호작용의 VEGF 계열(혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 단순 시스템에서 복잡한 시스템으로 진화한 고도로 보존된 유전 경로이다) 등.
상기 요약된 바와 같이, 본원에 기재된 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 신호전달 경로의 구성요소는 신호전달 경로 구성원의 비활성화가 스위치 폴리펩티드의 발현에 의해 제어될 수 있도록 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하도록 변형될 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 경로 구성요소는 예를 들어, 상기 나열된 경로의 상응하는 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 입력-수용 구성원, 중간 구성원, 및 출력-생성 구성원을 포함한다.
유사하게, 본질적으로 임의의 합성 경로는 본원에 기재된 바와 같은 분자 회로를 사용하여 변조될 수 있다. 본 발명의 회로를 사용하여 조절될 수 있는 합성 신호전달 경로의 적절한 비-제한적 실시예는 합성 또는 예를 들어 CAR, 조작된 TCR, synNotch 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 조작된 수용체에 의해 제어되는 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 예시에서, 본 발명의 회로를 사용하여 조절된 경로는 예를 들어 면역 활성화 경로 또는 면역 억제 경로와 같은 면역 조절 경로를 포함할 수 있다. 이러한 면역 조절 경로는 천연 또는 합성일 수 있고 상기 회로가 사용되는 세포에 내인성일 수 있거나 회로가 사용되는 세포에 이종성일 수 있다.
본 발명의 회로를 사용하여 조절될 수 있는 합성 신호전달 경로의 적절한 비-제한적 실시예는 또한 생합성 및/또는 생물생산 경로를 포함한다. 생합성 및/또는 생물생산 경로는 천연 또는 합성일 수 있고 상기 경로가 내인성 또는 이종성인 세포 및/또는 유기체에서 사용될 수 있다.
본 발명의 회로를 사용하여 조절될 수 있는 생합성 경로의 비-제한적인 실시예는 호르몬 생산 경로(예를 들어, 인슐린 생산 경로, 에스트로겐/프로게스테론 생산 경로, 안드로겐 생산 경로, 성장 호르몬 생산 경로 등), 오피오이드 생산 경로(opioid production pathways), 이소부탄올 생산 경로(isobutanol production pathways,), 비-리보솜 폴리케타이드 합성효소(NRPS) 생산 경로(non-ribosomal polyketide synthetase (NRPS) production pathways), 항생제 생산 경로(antibiotic production pathways), 화학요법 생산 경로(chemotherapeutic production pathways), 아르테미신산 생산 경로(artemisinic acid production pathways), 테르페노이드 생산 경로(terpenoid production pathways), 폴리케타이드 생산 경로(polyketide production pathways) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
합성 생합성 경로의 비-제한적 실시예에는, 예를 들어, 합성 호르몬 생산 경로, 합성 오피오이드 생산 경로, 합성 항생제 생산 경로, 합성 화학요법 생산 경로, 합성 아르테미신산 생산 경로, 합성 테르페노이드 생산 경로, 합성 폴리케타이드 생산 경로 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산(Nucleic Acids)
상기 요약된 바와 같이, 본 발명은 또한 분자 피드백 회로를 코딩하는 핵산을 제공한다. 상기 개체 핵산은 예를 들어, 스위치 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열, 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하는 신호전달 단백질을 인코딩하는 서열 등을 포함할 수 있다. 이러한 핵산은 하나 이상의 서열이 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 스위치 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열이 신호전달 경로의 출력에 반응하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 구성될 수 있다. 본원에 구체적으로 기재된 회로를 포함하나 이에 제한되지 않는 잠재적인 비활성화 도메인을 사용하여 본질적으로 임의의 회로를 코딩하는 핵산이 제공된다. 벡터, 예를 들어, 발현 카세트, 재조합 발현 벡터, 바이러스 벡터 등과 같은 핵산을 함유하는 다양한 구성 뿐만 아니라 상기 개체 회로를 인코딩하는 단리된 핵산이 포함된다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 기재된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명의 회로의 구성요소의 전부 또는 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 일부 실시양태에서, 예를 들어 재조합 발현 벡터를 포함하는 DNA일 것이다. 본 발명의 회로의 구성요소의 전부 또는 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 일부 실시양태에서 RNA, 예를 들어 시험관내 합성 RNA일 것이다.
상기 요약된 바와 같이, 일부 예시에서, 상기 개체 회로는 전사 제어 요소(예: 프로모터, 인핸서 등)와 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결된 인코딩 핵산(예를 들어, 스위치 폴리펩티드 또는 잠재적인 비활성화 도메인-연결 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산)을 사용할 수 있다. 일부 경우에는, 상기 전사 조절 요소가 유도될 수 있다. 일부 경우에는, 상기 전사 조절 요소가 구성적이다. 일부 경우에는, 상기 프로모터가 진핵 세포에서 기능한다. 일부 경우에는, 상기 프로모터가 원핵 세포에서 기능한다. 일부 경우에는, 상기 프로모터가 세포 유형-특이적 프로모터이다. 일부 경우에는, 상기 프로모터가 조직-특이적 프로모터이다.
이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적절한 전사 및 번역 제어 요소 중 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어 Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544 참조).
프로모터는 구성적으로 활성 프로모터(즉, 구성적으로 활성/"ON" 상태에 있는 프로모터)일 수 있고, 이는 유도성 프로모터(즉, 상태가 활성/"ON" 또는 비활성/“”인 프로모터는 외부 자극, 예를 들어 특정 온도, 화합물 또는 단백질의 존재에 의해 제어된다)일 수 있고, 이는 공간적으로 제한된 프로모터(즉, 전사 제어 요소, 인핸서 등)(예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)일 수 있으며, 이는 일시적으로 제한된 프로모터(즉, 프로모터는 배아 발달의 특정 단계 동안 또는 생물학적 과정의 특정 단계, 예를 들어 세포 주기, 포유동물의 모낭 주기, 포유동물의 일주기 등 동안 "ON" 상태 또는 "OFF" 상태에 있다)일 수 있다.
적절한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현을 위해, 적절한 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 진핵 세포에서의 발현을 위해 적절한 프로모터는 예를 들어, 효모 프로모터(예를 들어, 효모 교배 경로 유전자(yeast mating pathway genes)의 프로모터, 효모 갈락토스-유도성 프로모터(east galactose-inducible promoters) 등), 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소;거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터(cytomegalovirus immediate early promoter); 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터(herpes simplex virus thymidine kinase promoter); 초기 및 후기 SV40 프로모터(early and late SV40 promoters); 레트로바이러스의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터(mouse metallothionein-I promoter); 및 다양한 당업계에 공지된 조직 특이적 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 예시에서, 다양한 강도의 전사 제어 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 강도의 프로모터, 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터, 예를 들어, 약한 프로모터, 중간 프로모터 및 강한 프로모터, 예를 들어 구성적 프로모터 pREV1, pRNR2, pRET2 등과 같으나 이에 제한되지 않는 것이 사용될 수 있다. 일부 예시에서, 상기 프로모터의 강도는 프로모터 내의 결합 사이트(예를 들어, DBD 결합 사이트)의 수를 각각 감소 또는 증가시킴으로써 조절, 예를 들어 더 약하게 만들거나 더 강하게 만들 수 있다. 따라서, 개체 프로모터에 존재하는 결합 사이트의 수는 다양할 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 1 내지 6 또는 그 이상의 범위일 수 있다.
일부 예시에서, 본원에 기재된 핵산의 전사 제어 요소는 시스-활성 조절 서열(cis-acting rgulatory seguence)을 포함할 수 있다. 임의의 적절한 시스-활성 조절 서열이 본원에 기재된 핵산에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 예시에서, 시스-활성 조절 서열은 업스트림 활성화 서열 또는 업스트림 활성화 서열(UAS)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본원에 기재된 핵산의 UAS는 Gal4 반응성 UAS일 수 있다. 일부 예시에서, 유용한 전사 제어 요소는 면역-관련 전사 제어 요소, 예를 들어 활성화된 T-세포의 핵 인자(NFAT) 프로모터 등을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다.
일부 예시에서, 본 발명의 회로의 전사 제어는 합성 전사 인자에 반응하는 하나 이상의 조절 요소의 사용을 포함할 수 있다. 합성 전사 인자, 및 이에 반응하는 조절 요소는 다양할 수 있으며, 예를 들어 에스트라디올 리간드 결합 도메인(estradiol ligand binding domain, LBD) 기반 합성 전사 인자, 프로게스테론 LBD 기반 합성 전사 인자(progesterone LBD based synthetic transcription factors), 아연-핑거 기반 합성 전사 인자(zinc-finger based synthetic transcription factors), 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 합성 전사 인자는 키메라에 의한 것일 수 있고 다양한 도메인, 예를 들어 DNA 결합 도메인(DBD), 활성화 도메인, 아연-핑거 도메인(들) 등을 포함할 수 있다. 유용한 도메인, 예를 들어, LBD, DBD, 활성화 도메인 등은 다양할 것이고 예를 들어, Gal4p DBD, Zif268 전사 인자 DBD, 바이러스 활성화 도메인(예를 들어, VP16, VP64 등), Msn2p 활성화 도메인 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 유용한 합성 전사 인자의 비-제한적 실시예는 GEM(Gal4 DNA 결합 도메인-에스트라디올 호르몬 결합 도메인-Msn2 활성화 도메인), Z3PM(Z3 징크 핑거-프로게스테론 호르몬 결합 도메인-Msn2 활성화 도메인), 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상응하게, 유용한 조절 요소는 다양할 것이고, 예를 들어 pZ 프로모터, pZ3 프로모터, pGAL1 프로모터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 합성 전사 인자에 반응성인 프로모터를 포함할 수 있다. 적절한 프로모터 및 합성 전사 인자의 실시예는, 예를 들어 본원에 기재된 것들, Aranda-Diaz et al. ACS Synth Biol. (2017) 6(3): 545-554에 기재된 것(그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 통합된다)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
적절한 프로모터는 일부 예시에서, 적절한 가역적 프로모터(reversible promoters)를 포함할 수 있다. 가역적 프로모터는 예를 들어, 진핵생물 및 원핵생물과 같은 많은 유기체로부터 단리 및 유래될 수 있다. 제2 유기체, 예를 들어, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역적 프로모터의 변형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터, 및 이러한 가역적 프로모터에 기초하지만 또한 추가의 대조군 단백질을 포함하는 시스템은 알코올 조절 프로모터(alcohol regulated promoters) (예: 알코올 탈수소효소 I(alcA) 유전자 프로모터, 알코올 전사 활성화제 단백질(AlcR)에 반응하는 프로모터 등), 테트라사이클린 조절 프로모터(tetracycline regulated promoters) (예: TetActivators, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터(steroid regulated promoters) (예를 들어, 랫 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템(rat glucocorticoid receptor promoter systems), 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템(human estrogen receptor promoter systems), 레티노이드 프로모터 시스템(retinoid promoter systems), 갑상선 프로모터 시스템(thyroid promoter systems), 엑디손 프로모터 시스템(ecdysone promoter systems), 미페프리스톤 프로모터 시스템(mifepristone promoter systems) 등), 금속 조절 프로모터(metal regulated promoters) (예: 메탈로티오네인 프로모터 시스템(metallothionein promoter systems) 등), 병인-관련 조절 프로모터(pathogenesis-related regulated promoters)　(예: 살리실산 조절 프로모터(salicylic acid regulated promoters, 에틸렌 조절 프로모터(ethylene regulated promoters), 벤조티아디아졸 조절 프로모터(benzothiadiazole regulated promoters 등), 온도 조절된 프로모터(temperature regulated promoters) (예를 들어, 열충격 유도성 프로모터(heat shock inducible promoters) (예를 들어, HSP-70, HSP-90, 대두 열충격 프로모터(soybean heat shock promoter) 등), 빛 조절 프로모터(ight regulated promoters), 합성 유도성 프로모터(synthetic inducible promoters) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
사용하기에 적절한 유도성 프로모터는 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 실시예는, 알코올-조절 프로모터, 테트라사이클린-조절 프로모터 예를 들어, 안하이드로테트라사이클린(aTc) 반응성 프로모터(anhydrotetracycline (aTc)-responsive promoters) 및 테트라사이클린 억제 단백질(tetR), 테트라사이클린 작동자 서열(tetO) 및 테트라사이클린 전사활성화제 융합 단백질(tTA)을 포함하는 기타 테트라사이클린 반응성 프로모터 시스템(tetracycline-responsive promoter systems)), 스테로이드-조절 촉진제(예를 들어, 랫 글루코코르티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑디손 수용체(moth ecdysone receptors)에 기초한 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 슈퍼패밀리로부터의 프로모터), 금속-조절 촉진제 (예를 들어, 효모, 마우스 및 인간의 메탈로티오네인(metallothionein)(금속 이온에 결합 및 격리하는 단백질) 유전자에서 유래된 프로모터), 병인-조절 프로모터 (예를 들어, 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아디아졸(BTH)에 의해 유도됨), 온도/열-유도성 프로모터 (예: 열 충격 프로모터) 및 빛-조절 프로모터 (예를 들어, 식물 세포의 빛 반응성 프로모터) 와 같은 화학적/생화학적으로-조절된 프로모터 및 물리적으로-조절된 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지 않습니다.
일부 예시에서, 유용한 프로모터는 면역 세포 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 회로의 구성요소가 면역 세포에서 발현되는 실시양태에서, 면역 세포 프로모터가 사용될 수 있다. 적절한 면역 세포 프로모터는, 예를 들어 CD8 세포-특이적 프로모터(CD8 cell-specific promoters), CD4 세포-특이적 프로모터(CD4 cell-specific promoters), 호중구-특이적 프로모터(neutrophil-specific promoters), 및 NK-특이적 프로모터(NK-specific promoters를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터가 사용될 수 있다(예를 들어, Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101:3416 참조). 다른 실시예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포-특이적 발현은 Ncr1(p46) 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다(예를 들어, Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565. 참조).
일부 예시에서, 본 발명의 핵산의 면역 세포 특이적 프로모터는 B29 유전자 프로모터, CD14 유전자 프로모터, CD43 유전자 프로모터, CD45 유전자 프로모터, CD68 유전자 프로모터, IFN-β 유전자 프로모터, WASP 유전자 프로모터, T-세포 수용체 β-사슬 유전자 프로모터, V9γ(TRGV9) 유전자 프로모터, V2δ(TRDV2) 유전자 프로모터 등의 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 회로 또는 그의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 발현 벡터이거나 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합 발현 벡터는 바이러스 구축물, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 구축물, 재조합 아데노바이러스 구축물, 재조합 렌티바이러스 구축물, 재조합 레트로바이러스 구축물 등이다. 일부 경우에, 본 발명의 회로, 또는 그의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 본 발명의 회로, 또는 그의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 AAV 벡터이다.
적절한 발현 벡터는 바이러스 벡터(예: 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 기반 바이러스 벡터; 폴리오바이러스(poliovirus); 아데노바이러스(adenovirus)(예를 들어, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., Hum Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (예를 들어, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617 참조); SV40; 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus); 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) (예를 들어, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999 참조); 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 설치류 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스(spleen necrosis virus), 및 레트로바이러스, 예를 들어 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 렌티바이러스(lentivirus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 골수증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus) 및 유선 종양 바이러스(mammary tumor virus)와 같은 레트로바이로스로부터 유래된 벡터); 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에는, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터이다. 피기백(piggyback) 및 잠자는 숲속의 미녀 벡터(sleeping beauty vectors)와 같은 트랜스포존-매개 벡터(transposon-mediated vectors)도 적절하다.
일부 예시에서, 본 발명의 핵산은 2개 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 서열을 가질 수 있고, 여기서 2개 이상의 폴리펩티드의 발현은 상기 개인 폴리펩티드의 개별 발현을 용이하게 하는 개별 코딩 영역 사이의 서열 요소의 존재에 의해 가능해진다. 이러한 서열 요소는 본원에서 바이시스트론-촉진 서열(bicistronic-facilitating sequences)로 지칭될 수 있으며, 여기서 2개의 코딩 영역 사이의 바이시스트론-촉진 서열의 존재는 단일 핵산 서열에 존재하는 각각의 코딩 영역으로부터 별개의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 일부 예시에서, 핵산은 코딩 영역 사이에 바이시스트론-촉진 서열을 갖는 단일 핵산에 존재하는 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 코딩 영역을 함유할 수 있다. 단일 핵산 서열로부터 다중 개인 폴리펩티드의 개별적인 발현을 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있고, 유사하게, 바이시스트론 발현의 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.
일부 예시에서, 바이시스트론-촉진 서열은 절단 가능한 연결 폴리펩티드에 의해 일시적으로 연결된 단일 핵산 서열로부터 2개의 폴리펩티드 발현을 허용할 수 있다. 이러한 예시에서, 바이시스트론-촉진 서열은 하나 이상의 인코딩된 펩티드 절단 부위를 포함할 수 있다. 적절한 펩티드 절단 사이트는 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptides)의 절단 사이트 뿐만 아니라 별도의 효소에 의해 절단되는 사이트를 포함한다. 일부 예시에서, 바이시스트론-촉진 서열의 펩티드 절단 사이트는 푸린 절단 사이트(furin cleavage site)를 포함할 수 있다(즉, 상기 바이시스트론-촉진 서열은 푸린 절단 사이트를 인코딩할 수 있다).
일부 예시에서, 상기 바이시스트론-촉진 서열은 자가-절단 펩티드 서열을 인코딩할 수 있다. 유용한 자가-절단 펩티드 서열은 예를 들어, T2A 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 펩티드 2A 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 예시에서, 바이시스트로닉-촉진 서열은 하나 이상의 스페이서 인코딩 서열(spacer encoding sequences)을 포함할 수 있다. 스페이서 인코딩 서열은 일반적으로 일부 예시에서 펩티드 태그를 의미하는 아미노산 스페이서를 인코딩한다. 유용한 스페이서 인코딩 서열은, 예를 들어 V5 펩티드 태그를 인코딩하는 서열을 포함하는 V5 펩티드 인코딩 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단일 핵산 서열로부터의 다중 코딩 서열의 다중- 또는 이중시스트론 발현은 푸린 절단, T2A 및 V5 펩티드 태그 서열을 사용하는 방법을 사용할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 일부 예시에서, 내부 리보솜 진입 사이트(internal ribosome entry site, IRES) 기반 시스템이 사용될 수 있다. Yang et al. (2008) Gene Therapy. 15(21):1411-1423; Martin et al. (2006) BMC Biotechnology. 6:4(그 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 바이시스트론 발현 방법을 사용할 수 있다.
세포(Cells)
상기 요약된 바와 같이, 본 발명은 또한 분자 피드백 회로를 인코딩하는 핵산을 함유하는 세포를 제공한다. 하나 이상의 분자 피드백 회로 및/또는 이의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하도록 변형된 세포는 본원에서 유전적으로 변형된 것을 의미할 수 있으며, 여기서 이러한 변형은 원하는 대로 안정하거나 일시적일 수 있다. 유용한 세포는 예를 들어 박테리아 세포, 식물 세포, 동물 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 비인간 영장류 세포, 인간 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 원핵 및 진핵 세포를 포함할 수 있다.
적절한 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 뿐만 아니라 부분적으로 및 완전히 분화된 세포가 포함된다. 적절한 세포는 뉴런, 간 세포; 신장 세포; 면역 세포; 심장 세포; 골격근 세포; 평활근 세포; 폐 세포; 등을 포함한다.
적절한 세포는 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포, 유도 만능 줄기(induced pluripotent stem, iPS) 세포); 생식 세포(예를 들어, 난모세포(oocyte), 정자, 난자, 정조세포(spermatogonia) 등); 체세포, 예를 들어 섬유아세포, 희돌기아교세포(oligodendrocyte), 신경교 세포(glial cell), 조혈 세포(hematopoietic cell), 뉴런, 근육 세포, 뼈 세포, 간세포, 췌장 세포 등을 포함한다.
적절한 세포는 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cells), 태아 심근세포(fetal cardiomyocytes), 근섬유아세포(myofibroblasts), 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells), 자가번역 확장 심근세포(autotransplated expanded cardiomyocytes), 지방세포(adipocytes), 전능 세포(totipotent cells), 만능 세포(pluripotent cells), 혈액 줄기 세포(blood stem cells), 근아세포(myoblasts), 성체 줄기 세포(adult stem cells), 골수 세포(bone marrow cells), 중간엽 세포(mesenchymal cells), 배아 줄기 세포(embryonic stem cells), 실질세포(parenchymal cells), 상피세포(epithelial cells), 내피세포(endothelial cells), 중피세포(mesothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 조골세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 외인성 세포(exogenous cells), 내인성 세포(endogenous cells), 줄기 세포(stem cells), 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cells), 골수 유래 전구 세포(bone-marrow derived progenitor cells), 심근 세포(myocardial cells), 골격 세포(skeletal cells), 태아 세포(fetal cells), 미분화 세포(undifferentiated cells), 다능 전구 세포(multi-potent progenitor cells), 단능 전구 세포(unipotent progenitor cells), 단핵구(monocytes), 심장 근모세포(cardiac myoblasts), 골격 근모세포(skeletal myoblasts), 대식세포(macrophages), 모세관 내피 세포(capillary endothelial cells), 이종 세포(xenogenic cells), 동종 세포(allogenic cells), 및 출생 후 줄기 세포(post-natal stem cells)를 포함한다.
일부 경우에, 상기 세포는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 상기 세포가 유도 만능 줄기 세포다. 일부 경우에, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포다. 일부 경우에, 상기 세포가 조혈 줄기 세포다. 일부 경우에, 상기 세포가 성체 줄기 세포다.
적절한 세포는 기관지폐포 줄기 세포(bronchioalveolar stem cells, BASCs), 돌출 상피 줄기 세포(bulge epithelial stem cells, bESCs), 각막 상피 줄기 세포(corneal epithelial stem cells, CESCs), 심장 줄기 세포(cardiac stem cells, CSCs), 상피 신경 능선 줄기 세포(epidermal neural crest stem cells, eNCSCs), 배아 줄기 세포(embryonic stem cells, ESCs), 내피 전구 세포(endothelial progenitor cells, EPCs), 간 난원형 세포(hepatic oval cells, HOCs), 조혈 줄기 세포(hematopoetic stem cells, HSCs), 케라티노사이트 줄기 세포(keratinocyte stem cells, KSCs), 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells, MSCs), 신경 줄기 세포(neuronal stem cells, NSCs), 췌장 줄기 세포(pancreatic stem cells, PSCs), 망막 줄기 세포(retinal stem cells, RSCs), 및 피부-유래 전구체(skin-derived precursors, SKPs)를 포함한다.
일부 예시에서, 세포는 면역 세포이다. 적절한 포유동물 면역 세포는 1차 세포 및 불멸화된 세포주를 포함한다. 적절한 포유동물 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫) 세포주 등을 포함한다. 일부 예시에서, 상기 세포는 불멸화된 세포주가 아니라, 대신 개인으로부터 수득한 세포(예를 들어, 1차 세포)이다. 예를 들어, 일부 경우에, 상기 세포는 개인으로부터 수득된 면역 세포, 면역 세포 전구체 또는 면역 줄기 세포이다. 실시예로서, 상기 세포는 개인으로부터 얻은 림프구 세포, 예를 들어 림프구 또는 이의 전구세포이다. 또 다른 실시예로서, 상기 세포는 개인으로부터 수득한 세포독성 세포 또는 이의 전구세포이다. 또 다른 실시예로서, 상기 세포는 개인으로부터 수득한 줄기 세포 또는 전구 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "면역 세포(immune cells)"는 일반적으로 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래된 백혈구(백혈구)를 포함한다. "면역 세포(immune cells)"는 예를 들어 림프구 세포, 즉 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포) 및 골수-유래 세포(호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil), 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cells)를 포함한다. "T 세포(T cell)"는 T-헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T-세포(CD8+ 세포), T-조절 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다. "세포독성 세포(cytotoxic cell)"는 CD8+ T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 호중구를 포함하며, 이들 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다. "B 세포(B cell)"는 예를 들어 Pre B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙한 B 세포, 기억 B 세포 및 형질모세포(plasmablasts)와 같은 CD19를 발현하는 세포를 포함하는 B 세포 계통의 성숙 및 미성숙 세포를 포함한다. 면역 세포는 또한 Pro B 세포와 같은 B 세포 전구체 및 형질 세포와 같은 B 세포 계통 유도체를 포함한다.
본 발명의 회로를 인코딩하는 세포는 임의의 편리한 방법에 의해 생성될 수 있다. 개체 회로의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산은 상기 개체 핵산이 일시적으로만 존재하거나, 염색체외에서 유지되거나, 숙주 게놈 내로 통합되는 경우를 포함하여, 상기 개체 면역 세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 상기 개체 핵산의 도입 및/또는 상기 개체 면역 세포의 유전적 변형은 생체 내(in vivo), 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다.
일부 경우에, 상기 개체 핵산의 도입 및/또는 유전자 변형은 생체 외에서 수행된다. 예를 들어, 면역 세포, 줄기 세포 등은 개인으로부터 수득되며; 개인으로부터 수득한 세포는 본 발명의 회로의 구성요소를 발현하도록 변형된다. 따라서, 상기 변형된 세포는 도입된 핵산 상에 존재하는 하나 이상의 분자 피드백 회로에 의해 정의된 바와 같이, 선택된 하나 이상의 신호전달 경로에 대한 제어 피드백으로 변형될 수 있다. 일부 경우에, 상기 변형된 세포가 생체 외에서 조절된다. 다른 경우에, 상기 세포는 (예를 들어, 세포를 수득한 개인) 도입되고/되거나 개인에 이미 존재하고; 상기 세포는 예를 들어, 핵산 또는 벡터를 개체에게 생체 내 투여함으로써 생체 내에서 조절된다.
일부 예시에서, 본 발명의 피드백 회로를 사용하는 세포는 개체의 세포 요법에 유용한 치료 세포일 수 있다. 예를 들어, 면역 세포를 사용하는 세포 요법과 같은 응용 분야에서 상기 면역 세포는 인체에 관심있는 치료 페이로드(therapeutic payload)를 전달하도록 운영된다. 이러한 조작된 세포의 출력이 너무 높으면, 독성 효과(예를 들어, CAR T 세포 요법에서 관찰되는 사이토카인 방출 증후군(CRS))가 발생할 수 있지만, 반면에 너무 낮은 출력은 요법이 비효율적이다. 치료 세포는 잘-제어된 실험실 조건 하에서 원하는 수준의 출력(즉, 설정값)을 달성하도록 미세 조정될 수 있다. 그러나 조작된 치료 세포가 기능하는 동적 환경은 상기 출력이 시간이 지나도 일정하게 유지되도록 보장하기 어렵다. 피드백 제어를 구현하기 위해 본원에 설명된 분자 회로를 사용하여, 조작된 세포는, 예를 들어 출력을 드리프트하게 하는 교란을 포함하여 환경에 직면한 교란에 대해 자동으로 교정할 수 있는 능력을 갖는다. 하나의 양태에서, 자가-조절 조작된 세포는 생체 내 시나리오에서 더 강력하므로 합성 생물학의 기존 세포 치료 적용을 개선한다.
일부 예시에서, CAR T 세포 또는 합성 수용체(예를 들어, SynNotch) 활성화 T 세포와 같은 세포 치료제는 안전 메커니즘으로서 피드백 제어로부터 크게 이익을 얻는다. CAR T 세포의 피드백 컨트롤러는 T 세포 활성화 수준을 조절하고 면역 세포의 과도한 자극으로 인한 CRS와 같은 독성 효과를 예방할 수 있다. 유사하게, SynNotch T 세포에서, 예를 들어 피드백 제어는 존재하거나 도입된 조작된 세포에 대한 임의의 방해에 관계없이 관심 페이로드의 정확한 농도의 전달을 가능하게 할 수 있다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 치료 세포에서 피드백 제어의 사용은 이러한 접근법에 제한되지 않고 다른 접근법도 포함한다.
본 발명의 회로가 사용될 수 있는 유용한 세포는 치료 세포로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 예시에서 생물 생산에 사용되는 세포가 사용될 수 있습니다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물생산(bioproduction)"은 일반적으로 다양한 응용분야, 예를 들어 산업, 상업, 생물의학, 연구 등의 적용을 위해 원하는 성분이 세포에 의해 생산되는 과정을 의미한다. 생물 생산 공정에서 생산되는 생물학적 제품은 다양할 수 있으며 이러한 제품은 생산에 사용되는 세포 및/또는 유기체에 내인성 또는 이종성일 수 있다. 일부 예시에서, 관심 있는 생물학적 제품에는 재조합 치료 단백질, 바이러스(예를 들어, 유전자 치료용 재조합 바이러스), 백신, 항체, 단백질 및 펩티드(예를 들어, 효소, 성장 인자 등), 다당류, 핵산(DNA 및 RNA 포함), 세포 및 영양 제품이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 회로 및/또는 방법은 생물반응기에서 세포(예를 들어, 포유류, 효모, 박테리아 및/또는 곤충 세포)를 사용하여 생물학적 제품의 생산, 형질전환 동물(예를 들어, 염소 또는 닭)의 사용을 포함하는 방법, 형질전환 식물(예를 들어, 담배, 종자 또는 이끼)의 사용을 포함하는 방법, 및 당업자에게 공지된 다른 방법과 같은 당업계에 공지된 여러 상이한 생산 기술과 함께 사용될 수 있다.
사용되는 경우, 생물생산에 적절한 세포는 예를 들어 COS 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YB2/0 세포 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 유용한 세포는 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물 기원(예를 들어, 포유동물, 효모, 식물 등을 포함)일 수 있고, 일부 예시에서 확립된 세포 배양주일 수 있다. 적합한 세포는 일부 예시에서, 또한 HeLa 세포 (예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예를 들어, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, mouse L 세포 (ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함한다.
일부 예시에서, 유용한 생물생산 세포는 효모 세포를 포함할 수 있다. 적절한 효모 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라마에(Pichia koclamae), 피치아 멤브레나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오푼티아(Pichia opuntiae), 피치아 서모톨러랜스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피치아 피즈페리(Pichia pijperi), 피치아 스티프티스(Pichia stiptis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이페로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸(Candida albicans), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리지애(Aspergillus oryzae), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미늄(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 예시에서, 유용한 생물생산 세포는 원핵 세포를 포함할 수 있다. 적절한 원핵생물 세포는 대장균(Escherichia coli), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 살모넬라 종(Salmonella sp.), 시겔라 종(Shigella sp.) 등의 임의의 다양한 실험실 균주를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; U.S. Patent No. 6,447,784; and Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302 참조. 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 실시예는 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 및 에스. 티피무리움(S. typhimurium)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적절한 시겔라 균주는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 소네이(Shigella sonnei) 및 시겔라 디스엔테리애(Shigella disenteriae)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 실험실 균주는 비-병원성이다. 다른 적절한 박테리아의 비-제한적인 실시예는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸디타(Pseudomonas pudita), 슈도모나스 에이루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 대장균(Escherichia coli)이다.
일부 예시에서, 유용한 피드백 제어는 대사 공학에 사용되는 세포이며, 여기서 대사 경로에서 효소의 균형은 산물의 최적 역가를 얻기 위해 필수적이다. 대사 경로의 중간체 또는 심지어 최종 생성물이 숙주 세포에 대해 적어도 어느 정도의 독성을 갖는 것은 일반적이다. 따라서 효소 비율의 최적화는 효과적인 세포 성장을 유지하면서 생산되는 생성물의 양을 최대화하는 데 유리하다. 추가로, 산업 발효를 사용하는 반응기의 큰 크기로 인해, 발효 전반에 걸쳐 세포는 매우 가변적인 환경을 경험할 수 있고 다양한 수준에서 다양한 스트레스 요인을 받을 수 있다. 이러한 장애는 효소의 활성을 이동시켜, 경로 활성의 "재-균형(re-balancing)"을 필요로 할 수 있다. 본 발명의 분자 회로를 사용하는 피드백 컨트롤러는 교란의 영향을 완화하고, 효소 비율을 동적으로 재균형시켜 역가를 최대화한다.
방법(Method)
상기 요약된 바와 같이, 본 발명은 또한 잠재적인 비활성화-기반 분자 피드백 회로를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 예를 들어 세포가 잠재적인 비활성화-기반 분자 피드백 회로로 유전적으로 변형된 세포의 신호전달 경로를 조절하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 전술한 회로 및 이의 구성요소 중 임의의 것이 본원에서 설명된 방법에 사용될 수 있다.
다양한 비활성화 전략이 본 개시내용의 방법에 사용되는 회로의 신호전달 단백질을 비활성화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 예시에서, 신호전달 단백질의 비활성화는 예를 들어 사용된 비활성화 도메인이 신호전달 단백질의 분해를 초래하는 경우를 포함하여 분해-기반 전략을 사용할 수 있다. 일부 예시에서, 상기 비활성화 도메인은 분해 도메인이거나 이를 포함할 수 있다.
일부 예시에서, 신호전달 단백질의 비활성화는 예를 들어, 잠재적인 비활성화 도메인이 프로테아제이거나 이를 포함하는 스위치 폴리펩타이드에 의해 매개되는 단백질분해 절단 이벤트에 의해 활성화되는 경우를 포함하여 프로테아제 기반 전략을 사용할 수 있다. 일부 예시에서, 신호전달 단백질은 예를 들어 신호전달 단백질이 프로테아제에 의해 분할되는 경우를 포함하나, 이에 제한되지 않는 발현된 프로테아제에 의해 비활성화될 수 있다.
일부 예시에서, 신호전달 단백질의 비활성화는, 예를 들어 비활성화 도메인에 의한 신호전달 단백질의 비활성화가 스위치 폴리펩타이드에 의해 매개되는 상기 신호전달 단백질의 재-국소화를 포함하는 국소화-기반 전략을 사용할 수 있다. 일부 예시에서, 비활성화 도메인에 의한 신호전달 단백질의 비활성화는 신호전달 단백질의 격리를 포함한다. 일부 예시에서, 상기 신호전달 단백질의 재-국소화는 국소화 신호를 신호전달 단백질과 연관시키는 결합 이벤트를 수반할 수 있다. 예를 들어, 일부 예시에서, 비활성화 도메인은 결합 쌍의 제1 구성원을 포함할 수 있고 스위치 도메인은 격리 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함할 수 있다.
일부 예시에서, 신호전달 단백질의 비활성화는, 예를 들어 스위치 폴리펩타이드가 우성 음성 도메인을 포함하는 경우를 포함하여, 신호전달 단백질의 우성 음성 억제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 개체 방법은 결합 쌍의 두 구성원의 결합에 의해 재구성된 분할 신호전달 단백질(split signaling protein)을 포함할 수 있으며, 여기서 스위치 폴리펩티드는 우성 음성 도메인을 포함하거나 이에 연결된 결합 쌍의 구성원을 포함한다. 이러한 방법에서, 상기 스위치 폴리펩티드의 결합은 분할 신호전달 단백질의 절반의 재-결합을 방해하여, 상기 분할 신호전달 단백질을 비활성화시킬 수 있다. 따라서, 일부 예시에서, 상기 신호전달 단백질의 우성 음성 억제는 신호전달 단백질에 연결되거나 그렇지 않으면 신호전달 단백질에 통합되는 결합 쌍의 구성원에 대한 비-공유 결합 도메인의 경쟁적 결합을 포함할 수 있지만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 설명한 바와 같이, 일부 예시에서, 본 발명의 다양한 방법에서 사용될 수 있는 결합 쌍의 유용한 구성원은 류신-지퍼 결합 쌍(leucine-zipper binding pair)의 구성원을 포함할 수 있으며, 즉, 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 류신-지퍼의 제1 및 제2 부분을 포함할 수 있다 .
세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하기 위해 사용되는 방법은 다양한 목적을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 예시에서, 본 발명의 회로는 관심 신호전달 경로의 피드백 제어를 제공하는 방법에 채용될 수 있다. 일부 예시에서, 피드백 제어는 음성 피드백 제어를 포함할 수 있으며, 이는 다른 양태 중에서, 예를 들어 특정 경로 출력이 생성 및/또는 임계값 수준 이상에서 생성될 때 경로가 활성 상태로 남아 있는 것을 방지할 수 있다. 일부 예시에서, 피드백 제어는 다른 양태 중에서, 예를 들어 특정 경로 출력의 증폭을 제공할 수 있는 양성 피드백 제어를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 피드백 제어는 예를 들어, 상기 경로의 신호전달 출력이 예를 들어 환경 요인 및 입력과 같은 변수로부터 절연되는 경우를 포함하여 신호전달 경로의 보다 안정적인 출력을 제공할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법의 세포는 다양할 수 있고 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 회로의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로 유전적으로 변형된 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 외(ex vivo) 세포를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 세포는 개체로부터 얻은 1차 세포이다. 일부 예시에서, 세포는 세포 배양물로부터 수득한다.
따라서, 본 발명의 방법은, 이러한 세포가 비변형되거나 본 발명의 회로를 포함하도록 이미 유전적으로 변형된 경우를 포함하여, 상기 방법에 사용된 세포를 수득하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 방법은 유전자 변형을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 방법은 유전자 변형 전 및/또는 후에 세포를 수집하는 경우를 포함하여 세포를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 세포를 수집하는 방법은 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 배양물로부터 세포를 수집하는 단계, 관심 있는 세포를 포함하는 개체로부터 세포 샘플을 수집하는 단계 등이 포함될 수 있다.
일부 예시에서, 본 발명의 방법은 신호전달 경로의 신호전달을 조정(예를 들어, 증가 및/또는 감소)하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 조정은 상기 경로의 신호전달 단백질의 비활성화를 야기하기 위해 잠재적인 비활성화 도메인을 활성화하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 회로는 양성 및 음성 피드백을 포함하는 피드백을 포함할 수 있다. 본 방법의 피드백은 상기 신호전달 경로의 출력에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다. 따라서, 일단 상기 회로가 개시되고 및/또는 상기 회로를 포함하는 세포가 전달되면, 상기 회로에 따른 신호전달 경로의 조정은 추가 조작을 필요로 하지 않을 수 있으며, 즉, 상기 회로에 의한 신호전달 경로의 피드백 조절은 필수적으로 자동일 수 있다.
따라서, 본 발명의 분자 피드백 회로를 함유하는 세포를 사용하는 방법에서, 일부 예시에서, 상기 세포는 개체에게 투여될 수 있고 상기 회로의 추가 조작이 수행될 필요가 없다. 예를 들어, 개체가 본 발명의 분자 피드백 회로를 함유하는 세포로 치료되는 경우, 상기 치료는 이러한 투여가 상기 개체를 치료하기 위한 유일한 주입인 경우를 포함하여, 개체에게 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
이러한 방법에서, 투여될 수 있는 세포는 예를 들어 면역 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법에서, 상기 회로는 일부 예시에서, 상기 면역 세포의 천연 또는 합성 신호전달 경로, 예를 들어 면역 활성화 경로 또는 면역 억제 경로(이에 제한되지 않음)의 신호전달을 조절하도록 구성될 수 있다. 천연 또는 합성 수단에 의해 조절되는 적절한 면역 활성화 경로의 비-제한적 실시예는 사이토카인 신호전달 경로, B 세포 수용체 신호전달 경로, T 세포 수용체 신호전달 경로 등을 포함한다. 천연 또는 합성 수단에 의해 조절되는 적절한 면역 억제 경로의 비-제한적 실시예는 억제성 면역 체크포인트 경로(inhibitory immune checkpoint pathways) 등을 포함한다.
본 발명의 방법은 치료제를 발현하는 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 세포는 본 발명의 분자 피드백 회로를 포함할 수 있고 면역 세포일 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 일부 예시에서,방법은 내인성 또는 이종성으로 치료제를 생성하는 비-면역 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 치료제의 생성은 분자 피드백 회로에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 제어된다. 일부 예시에서, 방법은 내인성으로 또는 이종성으로 치료제를 생성하는 면역 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 치료제의 생성은 분자 피드백 회로에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 제어된다. 적절한 인코딩된 치료제의 비-제한적 실시예는 예를 들어, 호르몬 또는 호르몬 생산 경로의 구성요소, 예를 들어 인슐린 또는 인슐린 생산 경로의 구성요소, 에스트로겐/프로게스테론 또는 에스트로겐/프로게스테론의 구성요소, 테스토스테론 또는 안드로겐 생산 경로의 구성요소, 성장 호르몬 또는 성장 호르몬 생산 경로의 구성요소 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 방법은 일부 예시에서, 예를 들어 상태가 대사 또는 호르몬 결핍인 경우를 포함하여, 상기 상태에 대해 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 예시에서, 상기 분자 피드백 회로는 분자 피드백 회로의 출력이 대사 또는 호르몬의 생성 및/또는 분비를 전체적으로 또는 부분적으로 제어하도록 구성될 수 있다.
일부 예시에서, 본 방법은 세포를 회로를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 접촉은 핵산(들)을 세포 내로 도입하기에 충분하다. 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 편리한 방법은 바이러스 형질감염(viral transfection), 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection), 충격(bombardment), 화학적 형질전환(chemical transformation), 형질도입성 담체(예를 들어, 형질도입성 담체 단백질)의 용도 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에서 사용될 수 있다. 핵산은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 유지되거나 배양된 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 또한 예를 들어, 개체 외부의 세포를 분리, 배양 또는 유지할 필요 없이 상기 세포 내로 핵산을 전달하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)의 사용을 통해 생체 내(in vivo) 살아있는 개체의 세포 내로 도입될 수 있다.
상기 회로 인코딩 구성요소를 전달하는 임의의 편리한 방법은 개체 방법에서 사용할 수 있다. 일부 예시에서, 상기 개체 회로는 개체에 회로를 발현하는 세포를 투여함으로써 전달될 수 있다. 일부 예시에서, 상기 개체 회로는 상기 회로를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 개체에게 투여함으로써 전달될 수 있다. 상기 회로를 인코딩하는 핵산을 개체에게 투여하는 단계는 상기 핵산이 아직 발현되거나 발현되지 않을 수 있는 핵산을 함유하는 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 상기 회로를 인코딩하는 핵산을 개체에게 투여하는 단계는 상기 핵산을 세포에 전달하도록 설계된 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 개체 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 치료제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 도입하는 것을 포함할 수 있으며, 그 발현은 분자 피드백 회로에 의해 적어도 부분적으로 제어된다. 상기 치료제는 암 치료를 위한 치료제일 수 있다. 상기 도입된 세포는 예를 들어 골수 세포(myeloid cells) 또는 림프 세포(lymphoid cell)를 포함하는 면역 세포일 수 있다.
치료될 수 있는 암의 비-제한적 실시예는 다음을 포함한다: 급성 림프구성 백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL), 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia, AML), 부신피질암(Adrenocortical Carcinoma), AIDS-관련 암(AIDS-Related Cancers) (예를 들어, 카포시 육종(Kaposi Sarcoma), 림프종(Lymphoma), 등), 항문암(Anal Cancer), 어펜딕스 암(Appendix Cancer), 성상세포종(Astrocytomas), 비정형 기형/횡문형 종양(Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor), 기저 세포 암종(Basal Cell Carcinoma), 담관암(Bile Duct Cancer)(간외(Extrahepatic)), 방광암(Bladder Cancer), 골암(Bone Cancer) (예를 들어, 유잉 육종(Ewing Sarcoma), 골육종(Osteosarcoma) 및 악성 섬유성 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma), 등), 뇌간 신경교종(Brain Stem Glioma), 뇌종양(Brain Tumors) (예를 들어, 성상세포종(Astrocytomas), 중추신경계 배아종양(Central Nervous System Embryonal Tumors), 중추신경계 생식세포종양(Central Nervous System Germ Cell Tumors), 두 개인두종(Craniopharyngioma), 뇌실막종(Ependymoma), 등), 유방암(Breast Cancer) (예를 들어, 여성유방암(female breast cancer), 남성유방암(male breast cancer), 소아유방암(childhood breast cancer), 등), 기관지 종양(Bronchial Tumors), 버킷 림프종(Burkitt Lymphoma), 카르시노이드 종양(Carcinoid Tumor) (예를 들어, 소아(Childhood), 위장(Gastrointestinal), 등), 원발성 미상 암(Carcinoma of Unknown Primary), 심장(심장) 종양(Cardiac (Heart) Tumors), 중추신경계(Central Nervous System) (예를 들어, 비정형 기형/횡문형 종양(Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor), 배아 종양(Embryonal Tumors), 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor), 림프종(Lymphoma), 등), 자궁경부암(Cervical Cancer), 소아암(Childhood Cancers), 척색종(Chordoma), 만성 림프구성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL), 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia, CML), 만성 골수 증식성 종양(Chronic Myeloproliferative Neoplasms), 결장암(Colon Cancer), 결장직장암(Colorectal Cancer), 두 개인두종(Craniopharyngioma), 피부 T-세포 림프종(Cutaneous T-Cell Lymphoma), 관(Duct) (예를 들어, 담관(Bile Duct), 관외(Extrahepatic), 등), 상피 내관암종(Ductal Carcinoma In Situ, DCIS), 배아종양(Embryonal Tumors), 자궁내막암(Endometrial Cancer), 뇌실막종(Ependymoma), 식도암(Esophageal Cancer), 감각신경모세포종(Esthesioneuroblastoma), 유잉 육종(Ewing Sarcoma), 두 개 외 생식세포 종양(Extracranial Germ Cell Tumor), 생식선외 생식세포종양(Extragonadal Germ Cell Tumor), 간외 담관암(Extrahepatic Bile Duct Cancer), 안암(Eye Cancer) (예를 들어, 안내 흑색종(Intraocular Melanoma), 망막모세포종(Retinoblastoma), 등), 뼈의 섬유성 조직구종(Fibrous Histiocytoma) (예를 들어, 악성(Malignant), 골육종(Osteosarcoma), 등), 담낭암(Gallbladder Cancer), 위(위) 암(Gastric (Stomach) Cancer), 위장 유암종(Gastrointestinal Carcinoid Tumor), 위장 기질 종양(Gastrointestinal Stromal Tumors, GIST), 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor) (예를 들어, 두 개외(Extracranial), 성선외(Extragonadal), 난소(Ovarian), 고환(Testicular), 등), 임신성 융모성 질환(Gestational Trophoblastic Disease), 신경교종(Glioma), 모발 상피세포 백혈병(Hairy Cell Leukemia), 두경부암(Head and Neck Cancer), 심장암(Heart Cancer), 간세포(간) 암(Hepatocellular (Liver) Cancer), 조직구증(Histiocytosis) (예를 들어, 랑게르한스 세포(Langerhans Cell), 등), 호지킨 림프종(Hodgkin Lymphoma), 인두암(Hypopharyngeal Cancer), 안구내 흑색종(Intraocular Melanoma), 섬세포 종양(Islet Cell Tumors) (예를 들어, 췌장 신경내분비 종양(Pancreatic Neuroendocrine Tumors), 등), 카포시 육종(Kaposi Sarcoma), 신장암(Kidney Cancer) (예를 들어, 신장세포(Renal Cell), 윌름스 종양(Wilms Tumor), 소아 신장 종양(Childhood Kidney Tumors), 등), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans Cell Histiocytosis), 후두암(Laryngeal Cancer), 백혈병(Leukemia) (예를 들어, 급성 림프모구성(Acute Lymphoblastic (ALL)), 급성 골수성(Acute Myeloid (AML)), 만성 림프구성(Chronic Lymphocytic (CLL)), 만성 골수성(Chronic Myelogenous (CML)), 털 세포(Hairy Cell), 등), 입술 및 구강암(Lip and Oral Cavity Cancer), 간암(Liver Cancer) (원발성(Primary)), 소엽상피내암종(Lobular Carcinoma In Situ (LCIS)), 폐암(Lung Cancer) (예를 들어, 비-소세포성(Non-Small Cell), 소세포성(Small Cell), 등), 림프종(Lymphoma) (예를 들어, AIDS-관련, 버킷(Burkitt), 피부 T-세포(Cutaneous T-Cell), 호지킨(Hodgkin), 비-호지킨(Non-Hodgkin), 1차 중추 신경계(Primary Central Nervous System (CNS)), 등), 거대글로불린혈증(Macroglobulinemia) (예를 들어, 발덴스트롬(Waldenstrom), 등), 남성 유방암(Male Breast Cancer), 뼈 및 골육종(Osteosarcoma)의 악성 섬유 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma), 흑색종(Melanoma), 메르켈 세포 암종(Merkel Cell Carcinoma), 중피종(Mesothelioma), 잠복 원발성(Occult Primary)을 동반한 전이성 편평 경부암(Metastatic Squamous Neck Cancer), NUT 유전자를 포함하는 정중선 암종(Midline Tract Carcinoma), 구강암(Mouth Cancer), 다발성 내분비 종양 증후군(Multiple Endocrine Neoplasia Syndromes), 다발성 골수종/형질 세포 신생물(Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasm), 식육종(Mycosis Fungoides), 골수이형성 증후군(Myelodysplastic Syndromes), 골수이형성/골수증식성 신생물(Myelodysplastic/Myeloproliferative Neoplasms), 골수성 백혈병(Myelogenous Leukemia) (예를 들어, 만성(CML), 등), 골수성 백혈병(Myeloid Leukemia) (예를 들어, 급성(AML), 등), 골수증식성 신생물(Myeloproliferative Neoplasms) (예를 들어, 만성, 등), 비강 및 부비동암(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer), 비인두암(Nasopharyngeal Cancer), 신경모세포종(Neuroblastoma), 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin Lymphoma), 비-소세포성 폐암(Non-Small Cell Lung Cancer), 구강암(Oral Cancer), 구강암(Oral Cavity Cancer) (예를 들어, 입술(Lip), 등), 구강인두암(Oropharyngeal Cancer), 골육종(Osteosarcoma) 및 뼈의 악성 섬유성 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma), 난소암(Ovarian Cancer) (예를 들어, 상피(Epithelial), 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor), 저 악성 잠재적인 종양(Low Malignant Potential Tumor), 등), 췌장암(Pancreatic Cancer), 췌장 신경내분비 종양(Pancreatic Neuroendocrine Tumors) (섬세포 종양(Islet Cell Tumors)), 유두종(Papillomatosis), 부신경절종(Paraganglioma), 부비동 및 비강암(Paranasal Sinus and Nasal Cavity Cancer), 부갑상선암(Parathyroid Cancer), 음경암(Penile Cancer), 인두암(Pharyngeal Cancer), 갈색세포종(Pheochromocytoma), 뇌하수체 종양(Pituitary Tumor), 흉막폐모세포종(Pleuropulmonary Blastoma), 원발성 중추신경계 림프종(Primary Central Nervous System (CNS) Lymphoma), 전립선암(Prostate Cancer), 직장암(Rectal Cancer), 신장 세포(신장) 암(Renal Cell (Kidney) Cancer), 신장 골반(Renal Pelvis) 및 요관(Ureter), 이행 세포 암(Transitional Cell Cancer), 망막모세포종(Retinoblastoma), 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma), 침샘암(Salivary Gland Cancer), 육종(Sarcoma) (예를 들어, 유잉(Ewing), 카포시(Kaposi), 골육종(Osteosarcoma), 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma), 연조직(Soft Tissue), 자궁(Uterine), 등), 세자리 증후군(S
Figure pct00001
Syndrome), 피부 암(Skin Cancer) (예를 들어, 소아(Childhood), 흑색종(Melanoma), 메르켈 세포 암종(Merkel Cell Carcinoma), 비흑색종(Nonmelanoma), 등), 소세포폐암(Small Cell Lung Cancer), 소장암(Small Intestine Cancer), 연조직육종(Soft Tissue Sarcoma), 편평세포암종(Squamous Cell Carcinoma), 편평경부암(Squamous Neck Cancer) (예를 들어, 오컬트 원발성(Occult Primary)인, 전이성(Metastatic), 등), 위암(Stomach (Gastric) Cancer), T-세포 림프종(T-Cell Lymphoma), 고환암(Testicular Cancer), 인후암(Throat Cancer), 흉선종(Thymoma) 및 흉선암종(Thymic Carcinoma), 갑상선암(Thyroid Cancer), 신우(Renal Pelvis) 및 요관(Ureter)의 이행세포암(Transitional Cell Cancer), 요관 및 신우암, 요도암(Urethral Cancer), 자궁암(Uterine Cancer) (예를 들어, 자궁내막(Endometrial), 등), 자궁 육종(Uterine Sarcoma), 질암(Vaginal Cancer), 외음부암(Vulvar Cancer), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstr
Figure pct00002
Macroglobulinemia), 빌름스 종양(Wilms Tumor), 등.
일부 예시에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 자가면역 질환인 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 기능장애에 대한 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 예시에서, 본 발명의 분자 피드백 회로는 자가면역 질환을 갖는 개체의 면역 활성화 수준을 조절하여, 자가면역 질환에 대한 개체를 치료하기 위한 상기 개체의 자가면역 반응을 제어하도록 구성될 수 있다. 일부 예시에서, 자가면역 질환을 갖는 개체는 분자 피드백 회로의 출력이 면역 억제인 본 발명의 분자 피드백 회로를 포함하도록 구성된 세포가 투여될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 방법에 사용되는 핵산, 회로 및 세포를 제조하는 방법을 추가로 포함한다. 상기 개체 핵산 및 회로, 및 이들의 구성요소를 제조함에 있어서, 핵산 조작, 변형 및 증폭(예를 들어, 집합적으로 "클로닝(cloning)"으로 지칭됨)의 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다. 상기 기재된 회로를 인코딩하는 핵산을 함유하는 개체 세포를 제조하는 것에 있어서, 형질감염(transfection), 형질도입(transduction), 배양(culture) 등의 편리한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 회로의 구성요소들의 전부 또는 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 개체 회로 또는 이의 구성요소가 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 사이에서 분할되는 경우, 2개 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 별개의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 선택 가능한 마커, 복제 기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 기타 특징을 포함할 수 있다. 적절한 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다.
다수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있으며; 다수는 본 발명의 재조합 구조물을 생성하기 위해 상업적으로 이용가능하다. 다음 벡터는 실시예의 방식으로 제공된다. 박테리아: pBs, 파지스크립트(phagescript), PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 진핵생물: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 갖는다. 상기 발현 숙주에서 작동하는 선택가능한 마커가 존재할 수 있다.
적절한 발현 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스 기반 바이러스 벡터; 폴리오바이러스(poliovirus); 아데노바이러스(adenovirus) (예를 들어, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (예를 들어, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617 참조); SV40; 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus); 인체 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) (예를 들어, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999 참조); 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) (e.g., 설치류 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스(spleen necrosis virus), 및 Rous 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), Harvey 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus), 및 유선 종양 바이러스(mammary tumor virus)와 같은 레트로바이러스 유래 벡터); 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명의 회로 또는 그의 구성요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 일부 실시양태에서 DNA 또는 RNA, 예를 들어 시험관 내 합성된 DNA, 재조합 DNA, 시험관 내 합성된 RNA 또는 재조합 RNA 등일 것이다. DNA/RNA의 시험관내 합성 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 임의의 공지된 방법을 사용하여 원하는 서열을 포함하는 DNA/RNA를 합성할 수 있다. DNA/RNA를 숙주 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. DNA/RNA를 숙주 세포에 도입하는 것은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, NK 세포(NK cell), 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte) 등)는 본 발명의 회로의 전부 또는 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA/RNA로 시험관 내 또는 생체 외에서 형질도입, 형질감염 또는 전기천공될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 투여 전에 세포를 배양하는 것, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 세포를 배양하는 것(예를 들어, 하나 이상의 항원의 존재 또는 부재) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 발명의 회로를 인코딩하도록 유전적으로 변형된 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 편리한 세포 배양 방법을 사용할 수 있지만 이러한 방법은 예를 들어, 배양되는 세포의 유형, 세포의 의도된 용도(예를 들어, 세포가 연구 또는 치료 목적으로 배양되는지 여부) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 예시에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 세포 배양 시딩, 세포 배양 공급, 세포 배양 통과, 세포 배양 분할, 세포 배양 분석, 약물로 세포 배양 처리, 세포 배양 수확 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 일반적인 세포 배양 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 일부 예시에서 개체 방법에 사용되는 세포를 수용 및/또는 수집하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 개체로부터 세포를 수집한다. 개체로부터 세포를 수집하는 것은 개체로부터 조직 샘플을 얻고 조직 샘플에서 세포를 농축, 분리 및/또는 증식시키는 것을 포함할 수 있다.세포의 분리 및/또는 농축은 배양(예를 들어, 부착 배양, 현탁 배양 등), 세포 분류(예를 들어, FACS, 미세유체학(microfluidics) 등) 등을 포함하는 임의의 편리한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 세포는 예를 들어, 혈액(예를 들어, 말초혈, 제대혈 등 포함), 골수, 생검, 피부 샘플, 입안 면봉 검사(cheek swab) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 편리한 세포 조직 샘플에서 수집할 수 있다. 일부 예시에서, 세포는 예를 들어 혈액 은행, 조직 은행 등을 포함하는 공급원으로부터 수용된다. 수용된 세포는 이전에 분리되었을 수 있거나 조직 샘플의 일부로 수용될 수 있으므로 분리/농축은 세포를 수용한 후 사용하기 전에 수행될 수 있다. 특정 예시에서, 수용된 세포는 예를 들어 배양된 세포주의 세포를 포함하는 비-1차 세포일 수 있다. 본 발명에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 세포는 본원에 추가로 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 비-제한적 양태의 실시예
상기에 설명된 본 주제의 실시예의 실시양태를 포함하는 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 실시양태와 조합하여 유익할 수 있다. 전술한 설명을 제한하지 않고, 1-[xxx]로 번호가 매겨진 본 발명의 특정한 비-제한적인 양태가 하기에 제공된다. 본 발명을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 개별적으로 번호가 매겨진 양태들 각각은 개별적으로 번호가 매겨진 양태들 중 임의의 선행 또는 하기와 조합되거나 사용될 수 있다. 이는 이러한 모든 양태의 조합에 대한 지원을 제공하기 위한 것이며 하기에 명시적으로 제공된 양태의 조합으로 제한되지 않는다:
1. 분자 피드백 회로(molecular feedback circuit)로서, 상기 회로는
신호전달 경로의 입력에 의해 활성화될 때 신호전달 경로의 출력을 유도하는 신호전달 단백질(상기 신호전달 단백질은 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하지만 케이지된 데그론(caged degron)은 포함하지 않음); 및
상기 출력에 반응하고, 발현될 때 비활성화 도메인을 유발하여 신호 분자를 비활성화시키는 스위치 폴리펩티드(switch polypeptide)를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 조절 서열을 포함한다.
2. 제1 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 입력, 출력, 또는 둘 모두는 세포내 신호를 포함한다.
3. 제1 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 입력, 출력 또는 둘 모두는 세포 간 신호를 포함한다.
4. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 분해 도메인(degradation domain)이다.
5. 제4 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 분해 도메인은 데그론(degron)을 포함한다.
6. 제4 양태 또는 제5 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 신호 단백질의 분해를 예방하고 상기 스위치 폴리펩티드에 의해 탈보호되는 보호 도메인을 포함한다.
7. 제6 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 스위치 폴리펩티드는 프로테아제(protease)를 포함한다.
8. 제1 양태 내지 제3 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 결합 쌍(binding pair)의 제1 구성원을 포함한다.
9. 제8 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 스위치 폴리펩티드는 격리 도메인(sequestration domain)에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함한다.
10. 제9 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 격리 도메인은 원형질막-표적화 태그(plasma membrane-targeting tag), 미토콘드리아 막-표적화 태그(mitochondrial membrane-targeting tag), 퍼옥시솜-표적화 태그(peroxisome-targeting tag), 액포-표적화 태그(vacuole-targeting tag), 또는 액틴-세포골격-표적화 태그(actin-cytoskeleton-targeting tag)를 포함한다.
11. 제8 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 스위치 도메인은 우성 음성 도메인을 포함하는 결합 쌍의 제2 구성원을 포함한다.
12. 제11 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 잠재적 불활성화 도메인이 상기 결합 쌍의 제1 구성원에 비-공유적으로 결합하는 경쟁적 결합 도메인(competitive binding domain)을 포함한다.
13. 제8 양태 내지 제12 양태들 중 어느 한 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 결합 쌍의 제1 및 제2 구성은 류신-지퍼(leucine-zipper)의 제1 및 제2 부분을 포함한다.
14. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 신호전달 경로의 양성 조절자(positive regulator)이다.
15. 제1 양태 내지 제14 양태들 중 어느 한 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 상기 신호전달 경로의 음성 조절자(negative regulator)이다.
16. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 단백질이 신호전달 경로의 중간 구성원 또는 전사 인자이다.
17. 제16 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 전사 인자는 합성 전사 인자이다.
18. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 조절자 서열(regulatory sequence)은 출력의 전사 인자에 대한 결합 사이트를 포함한다.
19. 제18 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 조절자 서열은 전사 인자에 대한 복수의 결합 사이트를 포함한다.
20. 제19 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 복수의 결합 부위가 2 내지 10개의 결합 사이트이다.
21. 제16 양태 내지 제20 양태들 중 어느 한 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 출력은 상기 전사 인자의 발현이다.
22. 제1 양태 내지 제15 양태들 중 어느 한 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 수용체이고 상기 입력은 상기 수용체에 대한 리간드(ligand)이다.
23. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 경로는 AKT 신호전달 경로(AKT signaling pathway), Akt/PKB 신호전달 경로(Akt/PKB signaling pathway), AMPK 신호전달 경로(AMPK signaling pathway), 아팝토시스 신호전달 경로(apoptosis signaling pathway), BMP 신호전달 경로(BMP signaling pathway), cAMP-의존성 경로(cAMP-dependent pathway), 에스트로겐 신호전달 경로(estrogen signaling pathway), 헤지호그 신호전달 경로(hedgehog signaling pathway), 히포 신호전달 경로(hippo signaling pathway), 면역 활성 경로(immune activation pathway), 면역 억제 경로(immune suppression pathway), 면역 세포 분화 경로(immune cell differentiation pathway), 인술린 신호 형질도입 경로(insulin signal transduction pathway), JAK-STAT 신호전달 경로(JAK-STAT signaling pathway), MAPK/ERK 신호전달 경로(MAPK/ERK signaling pathway), mTOR 신호전달 경로(mTOR signaling pathway), NF-κB 신호전달 경로(NF-κB signaling pathway), 노달 신호전달 경로(nodal signaling pathway), 노치 신호전달 경로(notch signaling pathway), p53 신호전달 경로(p53 signaling pathway), PI3K 신호전달 경로(PI3K signaling pathway), TGF 베타 신호전달 경로(TGF beta signaling pathway), TLR 신호전달 경로(TLR signaling pathway), TNF 신호전달 경로(TNF signaling pathway), VEGF 신호전달 경로(VEGF signaling pathway), 및 Wnt 신호전달 경로(Wnt signaling pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
24. 전술한 양태들 중 어느 하나에 따른 회로에 있어서, 상기 회로는 상기 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 포함한다.
25. 제24 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 상기 신호전달 단백질의 천연 프로모터(native promoter)이다.
26. 제1 양태 내지 제22 양태들 중 어느 한 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 신호전달 경로는 합성 신호전달 경로이다.
27. 제26 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 수용체는 합성 수용체이다.
28. 제27 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 합성 수용체는 synNotch 수용체이다.
29. 제27 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 합성 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(engineered T cell receptor, TCR)이다.
30. 제29 양태에 따른 회로에 있어서, 상기 출력은 면역 활성 또는 면역 억제이다.
31. 전술한 양태들 중 어느 한 양태에 따른 분자 피드백 회로를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자.
32. 제31 양태에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하도록 유전적으로 변형된 세포.
33. 제32 양태에 따른 세포에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포이다.
34. 제33 양태에 따른 진핵 세포의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 상태(condition)에 대한 개체를 치료하는 방법.
35. 제34 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 상태는 암이고 상기 분자 피드백 회로의 출력이 면역 활성화이다.
36. 제34 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 상태는 자가면역 질환이고 상기 분자 피드백 회로의 출력이 면역 억제이다.
37. 제34 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 상태는 대사성 또는 호르몬의 결핍이고, 상기 분자 피드백 회로의 출력이 대사성 또는 호르몬의 생성 및/또는 분비이다.
38. 분자 피드백 회로를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하는 방법으로서,
상기 분자 피드백 회로는 신호전달 경로의 신호전달 단백질(상기 신호전달 단백질은 잠재적인 비활성화 도매인을 포함하지만 케이지된 데그론은 포함하지 않음)을 인코딩하는 핵산 서열; 및
발현될 때 잠재적인 비활성화 도메인을 활성화시키는 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 신호전달 경로의 출력에 반응하는 조절 서열을 포함하고,
상기 활성화된 비활성화 도메인은 상기 신호전달 단백질은 비활성화함으로서 상기 신호전달 경로의 신호전달을 조정한다.
39. 제37 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 조정하는 단계는 음성 피드백을 포함한다.
40. 제38 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 조정하는 단계는 양성 피드백을 포함한다.
41. 제38 양태 내지 제40 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 상기 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 분해를 포함한다.
42. 제41 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 분해 도메인이다.
43. 제41 양태 또는 제42 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 스위치 폴리펩티드에 의해 매개되는 단백질 분해 절단 사건(proteolytic cleavage event)에 의해 활성화 된다.
44. 제38 양태 내지 제40 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 상기 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 격리를 포함한다.
45. 제44 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고 상기 스위치 도메인은 격리 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함한다.
46. 제38 양태 내지 제40 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 우성 음성 억제(dominant negative suppression)를 포함한다.
47. 제46 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 스위치 도메인은 우성 음성 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함한다.
48. 제46 양태 또는 제47 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 결합 쌍의 제1 구성원에 비공유적으로 결합된 경쟁적 결합 도메인을 포함한다.
49. 제45 양태 내지 제48 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 류신-지퍼의 제1 및 제2 부분을 포함한다.
50. 제38 양태 내지 제49 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 세포는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 세포이다.
51. 제38 양태 내지 제50 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 신호전달 경로는 상기 세포의 천연 신호전달 경로이다.
52. 제51 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 천연 신호전달 경로는 천연 생합성 경로(native biosynthesis pathway)이다.
53. 제52 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 천연 생합성 경로는 호르몬 생산 경로이다.
54. 제53 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 호르몬 생산 경로는 인슐린 생산 경로(insulin production pathway), 에스트로겐/프로게스테론 생산 경로(estrogen/progesterone production pathway), 안드로겐 생산 경로(androgen production pathway), 및 성장 호르몬 생산 경로(growth hormone production pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
55. 제44 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 세포는 면역세포이며 상기 천연 신호전달 경로는 면역 활성 경로 또는 면역 억제 경로이다.
56. 제48 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 면역 활성 경로는 사이토카인 신호전달 경로(cytokine signaling pathway), B 세포 수용체 신호전달 경로(B cell receptor signaling pathway), 및 T 세포 수용체 신호전달 경로(T cell receptor signaling pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
57. 제48 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 면역 억제 경로는 저해성 면역 체크포인트 경로(inhibitory immune checkpoint pathway)이다.
58. 제38 양태 내지 제50 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 신호전달 경로는 합성 신호전달 경로이다.
59. 제58 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 synNotch 수용체이고 상기 출력은 상기 synNotch 수용체의 세포내 도메인의 방출이다.
60. 제58 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이고 상기 신호전달 경로는 합성 면역 활성 경로 또는 합성 면역 억제 경로이다.
61. 제60 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 면역 세포는 골수 세포(myeloid cell) 또는 림프 세포(lymphoid cell)이다.
62. 제61 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 면역 세포는 T 림프구(T lymphocyte), B 림프구(B lymphocyte) 및 자연 살해 세포(Natural Killer cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 림프 세포이다.
63. 제60 양태 내지 제62 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 합성 면역 수용체이다.
64. 제63 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 합성 면역 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다.
65. 제58 양태 내지 제64 양태들 중 어느 한 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 출력은 면역 활성 또는 면역 억제이다.
66. 제58 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 합성 신호전달 경로는 합성 생합성 경로이다.
67. 제66 양태에 따른 방법에 있어서, 상기 합성 생합성 경로는 호르몬 생산 경로(hormone production pathway), 아편유사제 생산 경로(opioid production pathway), 항생제 생산 경로(antibiotic production pathway), 화학 요법 생산 경로(chemotherapeutic production pathway), 아르테미신 산 생산 경로(artemisinic acid production pathway), 테르페노이드 생산 경로(terpenoid production pathway), 및 폴리케타이드 생산 경로(polyketide production pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
도 1은 본원에 기재된 바와 같은 신호전달 경로를 개략적으로 도시한다.
도 2는 본원에 기재된 바와 같이 도 1의 신호전달 경로의 양성 조절 구성원에 부착된 잠재적인 비활성화 도메인을 갖는 신호전달 경로를 개략적으로 도시한다.
도 3은 본원에 기재된 바와 같이, 도 2의 개략적으로 도시된 신호전달 경로에서 잠재적인 비활성화 도메인의 활성화를 도시한다.
도 4는 본원에 기재된 바와 같이, 도 1의 신호전달 경로의 음성 제어 멤버에 부착된 잠재적인 비활성화 도메인을 갖는 신호전달 경로를 개략적으로 도시한다.
도 5는 본원에 기재된 바와 같이, 합성 노치 수용체(synthetic Notch receptor)를 이용하는 분자 피드백 회로 전략을 개략적으로 도시한다.
도 6은 본원에 기재된 바와 같이, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 이용하는 분자 피드백 회로 전략을 개략적으로 도시한다.
도 7은 본 기재에서 설명된 피드백 회로의 실시예에서 피드백을 제어하기 위한 다양한 전략을 개략적으로 도시한다.
도 8은 본원에 설명된 회로에서 피드백을 제어하기 위한 격리-기반 전략(sequestration-based strategy)의 실시예를 개략적으로 도시한다.
도 9는 본원에 설명된 회로에서 피드백을 제어하기 위한 격리-기반 전략의 실시예에 대한 대안적인 묘사를 제공한다.
도 10은 본 발명의 전략-기반 피드백 회로의 실시예를 사용하는 피드백 제어를 나타낸다.
도 11은 류신 지퍼 전사 인자(leucine zipper transcription factor) 및 류신 지퍼 전사 인자의 우성 음성 억제제(dominant negative inhibitor)를 개략적으로 도시한다.
도 12는 본원에 기재된 회로에서 피드백을 제어하기 위한 경쟁-기반 전략(competition-based strategy)의 실시예를 개략적으로 도시한다.
도 13은 본원 기재의 경쟁-기반 피드백 회로의 실시예를 사용하는 피드백 제어를 나타낸다.
도 14는 데그론 LOCKR-기반 피드백 회로(degronLOCKR-based feedback circuit) 또는 생물학적 경로 제어의 개략도를 제공한다.
도 15는 데그론 LOCKR(degronLOCKR)로 테스트된 메이팅 경로 제어기(mating pathway regulator)의 패널을 제공한다.
도 16은 데그론 LOCKR 모듈은 상기 메이팅 경로의 합성 피드백 제어를 성공적으로 구현하는 것을 나타낸다.
도 17은 합성 회로의 제어를 통해 정량화된 데그론 LOCKR 피드백 모듈의 작동 특성을 제공한다.
도 18은 양성 또는 음성 교란(disturbances에 대한 반응으로 정상 상태 솔루션(steady state solutions)을 제공한다.
도 19는 고정 용량의 E2에 대한 Pg의 함수로서 회로 동작(circuit behavior)을 도시한다.
도 20은 고정 용량의 Pg에 대한 E2의 함수로서 회로 동작(circuit behavior)을 도시한다.
도 21은 구성적으로 다른 양의 키를 발현할 때 회로 동작을 나타낸다.
도 22는 상기 데그론 LOCKR(DegronLOCKR) 합성 피드백 전략이 예측 가능하게 조정 가능한 것을 보여준다.
도 23은 프로모터 강도(promoter strength) 또는 키 길이 변화가 피드백 이득을 조절하는 것을 보여준다.
도 24는 튜닝 피드백 강도(tuning feedback strength)가 회로 출력의 동적 동작을 변경하는 것을 보여준다.
도 25는 메이팅 경로에서 합성 피드백의 조합 조정(combinatorial tuning)을 도시한다.
도 26은 네스LOCKR(nesLOCKR)을 사용하는 단백질 국소화의 제어를 도시한다.
도 27은 Key가 발현될 때 네스LOCKR의 세포질 응집(cytosolic aggregation)을 도시한다.
도 28은 tagBFP의 형광 히스토그램(왼쪽 패널) 및 mCherry의 형광 히스토그램(오른쪽 패널)을 나타낸다.
도 29는 약물의 존재 및 부존재 하에서 두 회로에 대한 출력 및 키 형광(하부 패널)을 비교하는 피드백 없음 및 피드백 회로도(상부 패널) 및 대표적인 히스토그램을 도시한다.
도 30은 상이한 피드백 변형에 대한 출력(왼쪽 패널) 및 피드백 없는 회로 및 mCMV-Key가 있는 피드백 회로(오른쪽 패널)에 대한 정규화된 출력의 비교를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되는 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니며, 하기의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이다. 사용된 숫자(예를 들어, 양(amounts), 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했으나, 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부(parts)는 중량부(parts by weight)이고, 분자량(molecular weight)은 중량 평균 분자량(weight average molecular weight)이고, 온도는 섭씨 온도 이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 약어가 사용될 수 있다: 예를 들어, bp, 염기쌍(base pair(s)); kb, 킬로베이스(kilobase(s)); pl, 피코리터(picoliter(s)); s 또는 sec, 초(second(s)); min, 분(minute(s)); h 또는 hr, 시간(hour(s)); aa, 아미노산(amino acid(s)); kb, 킬로베이스(kilobase(s)); bp, 염기쌍(base pair(s)); nt, 뉴클레오티드(nucleotide(s)); i.m., 근육 내(intramuscular(ly)); i.p., 복강 내(intraperitoneal(ly)); s.c., 피하(subcutaneous(ly)); 등.
실시예 1: 신호 경로 구성 요소의 잠재적 비활성화를 사용하는 전략적인 피드백 회로
신호 경로 구성 요소의 잠재적 비활성화를 사용하는 피드백 회로를 구축하기 위해 다양한 전략이 사용되었다. 이러한 실시예에서 "생물학적 네트워크(biological network)"라고 하는 신호 전달 경로의 도식화된 실시예가 도 7의 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 신호전달 경로의 구성요소인 신호전달 단백질 "A", "B" 및 "Z"는 입력을 변환하여 전사 "출력(output)"을 야기한다. 사용된 전략의 실시예로는 degronLOCKR 피드백(도 7, 두 번째 패널), 격리 피드백(sequestration feedback)(도 7, 세 번째 패널) 및 경쟁 피드백(competition feedback)(도 7, 네 번째 패널)을 사용한 유도 분해를 포함한다. 일부 예시에서, LOCKR-기반 시스템(예: degronLOCKR, nesLOCKR 및 nlsLOCKR)을 사용하는 실시예는 하기에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 회로에 사용된 잠재적 비활성화의 일반적인 전략에 대한 개념 증명 설명(proof-of-concept demonstrations)을 제공한다. 그러나, 이러한 실시예에서 LOCKR-기반 시스템의 사용은 단지 예시적 및/또는 비교용일 뿐이며, 본 개시의 관점에서 LOCKR 독립 시스템(즉, 일반적으로 LOCKR을 사용하지 않는 시스템 또는 degronLOCKR, nesLOCKR 또는 nlsLOCKR을 구체적으로 사용하지 않는 시스템)을 쉽게 대체할 수 있다.
degronLOCKR 피드백 실시예에서, 상기 회로는 케이지된 데그론이 신호 단백질 "B"에 부착되도록 구성된다. 상기 회로는 키 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 갖는 핵산을 포함하도록 추가로 구성된다. 도시된 바와 같이, 상기 사용된 조절 서열은 신호 전달 경로의 중간 성분에 반응한다. 따라서, 상기 신호전달 경로가 상기 신호를 변환하고, 상기 신호전달 경로의 중간 성분이 발현되거나 그렇지 않으면 활성화될 때 상기 키 폴리펩티드가 발현된다. 상기 키 폴리펩티드의 발현은 케이지된 데그론을 언케이징하여, 신호 전달 경로 성분 "B"의 분해 및 경로 신호 전달에 대한 음성 피드백을 야기한다. degronLOCKR 피드백의 추가 실시예는 실시예 4에 제공된다.
격리 피드백 예에서, 상기 회로는 "프레이(prey)"를 의미하는 결합 쌍의 제1 멤버가 신호 전달 단백질 "B"에 부착되도록 구성된다. 상기 회로는 상기 원형질막(PM)에 국한되는 단백질 모티프에 부착된 "베이트(bait)"로서, 도 7에 언급된 결합 쌍의 제2 멤버를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 갖는 핵산을 포함하도록 추가로 구성된다. 도시된 바와 같이, 상기 사용된 조절 서열은 신호 전달 경로의 중간 성분에 반응한다. 따라서, 신호전달 경로가 신호를 변환하고 신호전달 경로의 중간 성분이 발현되거나 그렇지 않으면 활성화될 때, "베이트-PM(bait-PM)" 폴리펩티드가 발현된다. 상기 발현된 베이트-PM 폴리펩티드는 신호전달 경로 성분 "B"에 부착된 프레이 도메인에 결합한다. 따라서, 신호전달 경로 성분 "B"는 성분 "B"가 신호전달 경로 내에서 기능하는 세포내 위치로부터 멀리 원형질막으로 격리된다. 따라서 성분 "B"의 격리는 경로 신호 전달에 대한 음성 피드백을 유래한다. 격리 피드백의 실시예는 하기에서 더 자세히 설명하는 "앵커 어웨이(anchor away)" 회로를 포함한다.
경쟁 피드백 실시예에서, 상기 회로는 시그널링 경로의 성분 "B"가 분할되고 분할 부분이 각각의 분할 부분에 통합된 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domains)으로 인해 재결합되도록 구성된다. 따라서, 재구성된 분할 단백질은 비분할 성분 "B" 대응물(counterpart)과 유사한 신호전달 경로에서 신호전달을 전달할 수 있다. 상기 회로는 우성 음성 류신 지퍼 도메인을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 갖는 핵산을 포함하도록 추가로 구성된다. 상기 우성 음성 류신 지퍼 도메인은 성분 "B" 류신 지퍼 도메인이 결합하는 친화성보다 더 높은 친화도로 성분 "B" 류신 지퍼 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 결합한다. 따라서 존재하는 경우, 상기 우성 음성 류신 지퍼 도메인은 성분 "B"의 분할 부분의 재결합을 능가한다. 따라서, 상기 우성 음성 류신 지퍼 도메인이 발현될 때 신호전달 경로 성분 "B"가 비활성화되어 경로 신호전달에 대한 음성 피드백을 야기한다. 경쟁 피드백의 실시예는 하기의 실시예 3에 설명된 회로를 포함한다.
실시예 2: 앵커 어웨이(Anchor away): 격리-기반 피드백 회로(sequestration-based feedback circuit)
"앵커 어웨이(anchor away)"라고 명명된 격리-기반 피드백 회로는 도 8에 개략적으로 도시된 바와 같이 구성되었다. 구체적으로, 합성 전사 인자("SynTF") GEM은 류신 지퍼("프레이(prey)")의 절반에 융합되었고 pGAL1 프로모터로부터 전사를 활성화하기 위해 E2에 의해 유도되었다. GEM은 Z3PM 및 RFP의 생산을 센서로 활성화한다. Z3PM은 Pg에 의해 유도되어 pZ3 프로모터로부터 전사를 활성화한다. Z3PM은 YFP의 생산 및 원형질막 표적화 도메인("bait-PM")에 융합된 류신 지퍼의 나머지 절반을 활성화한다. 피드백은 GEM을 원형질막에 국한시키고 전사를 활성화하는 것을 방지한다. 상기 회로의 "앵커(anchor)", “컨트롤러(Controller)", "프로세스(process)" 및 "제어된 출력(controlled output)" 부분을 나타내는 앵커 어웨이 회로의 대체 묘사가 도 9에 제공된다.
상기 앵커 어웨이 피드백 회로는 회로 출력을 측정하기 위해 YFP를 사용하여 상응하는 "피드백 없음(no feedback)" 제어 회로와 함께 구성 및 테스트되었다. 도 10에서, 프로게스테론의 함수로서 정상-상태 YFP 출력은 앵커 어웨이 피드백에 대해 나타나고 피드백이 없는 행동은 맨 위 행(row)에 표시되었다. 증가하는 프로모터 강도(위에서 아래로)는 상기 억제제(즉, 베이트)를 활성화하는 Z3 결합 부위의 증가에 해당한다. 이러한 데이터는 더 강한 프로모터가 더 큰 피드백 효과를 야기하여 더 낮은 최대 출력과 표시된 피드백 곡선의 기울기의 변화를 야기한다는 것을 보여준다.
실시예 3: 경쟁-기반 피드백(Competition-based feedback)
CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파(CEBPα)는 GCAAT 프로모터를 이량체화하고 활성화하는 류신 지퍼 전사 인자(leucine zipper transcription factor)이다. "DN"은 높은 친화력으로 CEBPα 단량체에 결합하는 우성 음성으로 상기 전사 인자가 DNA에 결합하는 것을 방지하고 전사를 활성화한다 (도 11; 또한 Buchler & Cross. Molecular Systems Biology (2009) 5:272 참조; 이의 개시 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함됨).
상기 앵커 어웨이 피드백 회로는 격리-기반 피드백을 도 12에 개략적으로 도시된 경쟁-기반 피드백을 위한 구성요소로 대체하도록 재설계되었다. GEM(및 E2)은 CEBPα 생성을 통해 회로의 설정값을 결정한다. CEBPα는 Z3PM의 전사를 활성화한다. Z3PM은 Pg에 의해 유도되어 pZ3 프로모터로부터 전사를 활성화한다. Z3PM은 YFP와 CEBPα TF 이량체(dimer)를 분리하는 류신 지퍼(DN)의 나머지 절반의 생산을 활성화한다. 따라서 피드백은 CEBPα를 비활성화하고 출력이 증가함에 따라 Z3PM의 생산을 감소시킨다.
도 12에 도시된 폐쇄-루프 피드백 회로(closed-loop feedback circuit)는 회로 출력을 측정하기 위해 YFP를 사용하여 상응하는 개방-루프 피드백 회로(open-loop feedback circuit)를 구성하고 비교하였다. 도 13에서, 프로게스테론의 함수로서 정상-상태 YFP 출력은 피드백이 있는 경우(왼쪽) 및 피드백이 없는 경우(오른쪽)로 표시된다. 나타낸 바와 같이, E2의 양이 증가하면 상기 회로의 출력이 증가한다. 피드백은 회로의 최대 출력을 감소시켰고 또한 Pg에 대한 의존성의 기울기를 감소시켰다. 종합하면, 상기 데이터는 DN을 사용하는 폐쇄-루프 피드백 회로가 피드백이 없는 상응하는 회로(개방 루프)와 비교하여 Pg 투여량 반응의 기울기를 변경한다는 것을 보여준다. 이 실시예는 경쟁-기반 피드백 회로에서 류신 지퍼 전사 인자에 대한 음성 피드백을 구현하기 위해 지배적인 음성 생산이 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 새로운 단백질 스위치(de novo protein switch)를 사용한 모듈식 및 조정 가능한 생물학적 피드백 제어
이 실시예에서, 모듈식 연결성과 예측 가능한 조정성을 갖춘 호스트-애그노스틱 부품(host-agnostic parts)을 통해 설계된 새로운 단백질 스위치 degronLOCKR을 사용하여, 효모 S. cerevisiae의 내인성 경로 및 합성 회로에 대한 피드백 제어를 구현한다.
degronLOCKR 장치는 LOCKR(Latching Orthogonal Cage Key pRoteins) 기술을 기반으로 하며, 디자이너 degSwitch와 키 단백질로 구성되어 있다. 상기 degSwitch는 불안정한 여섯-헬릭스(래치)에 포함된 cODC degron이 있는 여섯-헬릭스 번들(six-helix bundl)로, 다섯-헬릭스 스캐폴드(five-helix scaffold)(케이지)와의 상호 작용을 통해 차단된다. 유전적으로 인코딩된 펩타이드인 키(key)는 상기 케이지와 결합하기 위해 래치(latch)를 압도할 수 있다. 이것은 cODC 데그론을 나타내므로, 상기 degSwitch와 임의의 융합된 화물(cargo)을 프로테아좀에 대한 분해를 목표로한다. degronLOCKR은 단백질 분해가 전사 후 조절을 위한 보편적인 방법이기 때문에 합성 생물학을 위한 강력한 장치이다. degronLOCKR은 전사 인자의 안정성을 조절하여 유전자 발현을 제어할 수 있음이 밝혀졌다. 여기서, 이 기능은 키를 네트워크 출력의 함수로 표현함으로써 degronLOCKR을 사용하여 생물학적 네트워크에서 모듈식 피드백 제어를 구현하는 데 활용된다(도 14, 패널 a). 상기 degronLOCKR 피드백 전략은 피드백 제어를 구현하기 위한 다른 접근 방식에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 상기 degronLOCKR의 모듈식 특성으로 인해 degSwitch가 관심 있는 임의의 단백질에 직접 융합되어 표적 효과를 생성할 수 있다. 상기 degSwitch로 내인성 유전자를 변형하면 신호 전달 단백질의 기본 전사 및 번역 조절도 보존된다. 마지막으로, degronLOCKR은 완전히 새로 설계된 단백질이므로 예측 가능한 변형을 통해 특성을 조정할 수 있다.
내인성 효모 경로에서 degronLOCKR 합성 음성 피드백
개념(concept)의 정성적 증거로서, degronLOCKR은 많은 내인성 피드백 루프를 갖는 복잡한 신호 전달 경로인, 효모 MAPK 메이팅 경로(도 14, 패널 b)에서 합성 음성 피드백을 구현하는 데 사용되었다. ΔFAR1 ΔBAR1 배경 균주(background strain)에서 여러 양성 경로 분자의 내인성 유전자좌위에 degSwitch를 추가하여 경로 출력을 조절하는 degronLOCKR의 능력을 테스트했으며, 상기 키는 유도성 시스템을 사용하여 표현되었다(Aranda-Diaz et al. ACS Synth. Biol. 6, 545-554 (2017)) (도 14, 패널 c). 상기 키는 세포의 특정 구획에서 각 분자의 분해를 촉발하는 핵 국소화 서열을 사용하여 세포질 또는 핵을 표적으로 하였다(도 15). 이 국소화된 유도성 저하가 세포에서 특정 위치의 작용을 가능하게 하는 degronLOCKR의 고유한 특성입니다. 상기 메이팅 경로는 α-인자(100nM)의 포화 용량으로 자극되었고 pAGA1-YFP-cODC (McCullagh et al. Nat. Cell Biol. 12, 954-962 (2010)) 전사 리포터를 사용하여 경로 활성을 모니터링하였다(cODC degron(Hoyt et al. J. Biol. Chem. 278, 12135-12143 (2003))은 수명이 긴 형광 리포터를 불안정하게 하여 역학을 관찰할 수 있다). STE20(MAPKKKK), STE11(MAPKKK) 및 FUS3(MAPK)을 분해하면 중간 정도의 효과가 있는 반면, STE12(TF)를 분해하면 짝짓기 경로의 출력이 완전히 제거된다(도 14, 패널 c, 하단). 이러한 데이터는 degronLOCKR이 내인성 경로를 조절하는 효과적인 도구임을 나타낸다.
상기 메이팅 경로의 합성 음성 피드백 제어는 다음으로 내인성 STE12가 degSwitch에 융합된 균주에서 메이팅 경로 반응성 프로모터(pFIG1)로부터 key-CFP-NLS를 발현함으로써 구현되었다(도 16, 패널 a). 이 피드백의 효과는 STE12가 여전히 degSwitch에 융합되어 있지만 키는 구성적 프로모터에 의해 구동되는 피드백이 없는 균주와 비교하였다. pAGA1-YFP-cODC 역학은 자동화된 유세포 분석을 사용하여 높은(25nM), 중간(6.25nM) 및 낮은(3.13nM) 용량의 α-인자(도 16, 패널 b)로 자극한 후 추적하였다. 비교를 위해 피드백이 없는 균주(pREV1-key-CFP-NLS)를 동시에 측정하였다. 알파-인자의 각 용량으로 자극한 후, 합성 피드백의 출력 및 피드백 없는 균주는 처음에 서로 밀접하게 따랐습니다. 약 2시간 후, 상기 합성 피드백 출력은 감소하기 시작했고 상기 피드백 없음 출력은 α-인자의 다른 용량에 상응하는 다른 정상 상태로 증가하였다. degronLOCKR 합성 피드백이 있는 균주는 α-인자의 더 많은 용량에 대해 더 큰 과도상태 오버슈트(transient overshoots)를 표시했지만, 결국 입력 크기에 관계없이 동일한 정상-상태 출력으로 수렴되었다. 이러한 데이터는 합성 피드백이 이 입력 영역에서 메이팅 경로의 α-인자에 대한 정상 상태 출력을 둔감하게 한다는 것을 시사한다. 이 효과는 관찰된 과도 상태가 다르기 때문에 신호 포화로 인한 것이 아니다. 상기 피드백 균주는 최대 출력 크기의 감쇠(attenuation)와 용량 반응의 선형 영역에서 감소된 기울기를 나타낸다(도 16, 패널 c). 구성적 프로모터 강도의 범위를 가진 피드백이 없는 균주와 합성 피드백 균주를 비교하면(Lee et al. ACS Synth. Biol. 4, 975-986 (2015)) (pREV1, pRNR2, pRET2) 피드백에 의해 생성된 동작이 상기 키 구성적 양을 다르게 표현하여 달성할 수 없음을 나타낸다. 종합하면, 상기 역학 적응 행동과 용량 반응은 합성 음성 피드백의 효과와 복잡한 내인성 신호 경로의 신속한 재설계를 위한 도구로서 degronLOCKR의 유용성을 명확하게 보여준다.
합성 전사 캐스케이드에서 degronLOCKR 피드백
degronLOCKR 피드백 모듈의 정량적 기능 및 작동 범위는 다음으로 두 개의 유도 가능한 합성 전사 인자(Aranda-Diaz et al.)로 구성된 간단한 합성 전사 캐스케이드(simple synthetic transcriptional cascade)를 사용하여 매핑되었다(도 17, 패널 a). 첫 번째로, GEM(Gal4 DNA 결합 도메인-에스트라디올 호르몬 결합 도메인-Msn2 활성화 도메인)은 에스트라디올(E2)에 의해 유도되고 pGAL1을 활성화하여 Z3PM(Z3 징크 핑거-프로게스테론 호르몬 결합 도메인-Msn2 활성화 도메인)을 생성한다. Z3PM은 차례로, 프로게스테론(Pg)에 의해 유도되고 pZ3-YFP-cODC의 전사를 활성화한다. 피드백을 구현하기 위해, 메이팅 경로를 제어하는 데 성공한 동일한 모듈식 전략이 사용되었다: GEM을 degSwitch에 융합하고 pZ3을 사용하여 key-CFP-NLS(합성 피드백)를 발현한다. 생성된 키의 양과 그에 따른 GEM의 분해율은 Z3PM 활동의 함수이기 때문에, 피드백을 통해 GEM의 농도는 Z3PM의 출력에 따라 달라진다. 상기 회로는 각각 출력을 증가 또는 감소시키기 위해 Z3PM에 융합된 Pg 또는 청색광 유도성 degron(psd)의 유도(Renicke et al. Chem. Biol. 20, 619-626 (2013)) 에 의해 교란될 수 있다. Z3PM의 농도를 조절하여 이러한 교란에 대한 피드백 버퍼. 이러한 유형의 교란 제거 실험은 기술 시스템에서 피드백의 필수 테스트이다.
상기 회로의 간단한 계산 모델은 Pg의 증가가 피드백 없이 출력의 단조로운 증가를 초래한다고 예측(키가 구성적으로 표현됨)하는 반면, 피드백은 Pg의 동일한 증가에 대해 피드백이 없는 회로보다 방해 전 값에 더 가까운 값을 갖는 정상-상태에 따른 출력의 일시적인 증가를 제공한다(도 17, 패널 b, 왼쪽). 피드백은 Z3PM의 생산 속도를 감소시켜 Pg 교란에 대한 출력의 의존성을 약화시키고, 따라서 농도 감소와 함께 Pg 증가 후 Z3PM 활성 증가를 보상한다(도 17, 패널 b, 오른쪽; 도 18).
이러한 예측은 먼저 7.5nM E2 및 0.78nM Pg로 세포를 유도하고 이들의 출력이 정상-상태에 도달할 때까지 성장하여 실험적으로 검증되었다(도 17, 패널 c). 그 때, 상기 세포는 Pg의 높은(6.25nM), 중간(3.13nM) 또는 낮은(1.56nM) 단계-입력으로 혼란되었고 pZ3-YFP-cODC의 역학은 자동화된 유세포 분석 및 광유전학적으로 활성화된 연속 배양 플랫폼을 사용하여 측정되었다. 대조군으로서, E2 및 Pg의 사전-방해 농도에서 피드백 균주와 유사한 YFP 정상-상태 출력을 갖는 피드백이 없는 균주(pRNR2 발현하는 키)에 대해 동일한 일련의 유도가 수행되었다. 피드백이 없으면, 상기 Pg의 단계-입력은 Z3PM 활동을 증가시켰고, 출력이 교란에 상응하는 새로운 정상-상태에 도달할 때까지 YFP 표현을 증가시킨다. 대조적으로, 상기 합성 피드백 회로는 Z3PM 활동이 증가함에 따라 키 발현을 증가시켜 GEM 저하를 야기하여 Z3PM 생산을 감소시켰다. 이 버퍼링 효과(buffering effect)는 상기 합성 피드백 회로 출력이 감소하기 시작하는 반면 피드백 없음 회로 출력은 계속 상승하는 교란 후 2시간부터 볼 수 있다. 이 적응 행동은 상기 메이팅 경로를 위해 구성된 합성 음성 피드백 루프와 질적으로 유사하다. 잘 정의된 입력과 방해 때문에, 적응은 사전-방해 출력에 의해 정규화된 사후- 및 사전-방해 출력 사이의 절대 차이의 역수를 취하여 계산된 정밀 메트릭(precision metric)을 사용하여 정량화될 수 있다(Ma et al. Cell 138, 760-773 (2009)) (도 17, 패널 e). 상기 피드백 회로는 Pg 양성 방해에 대한 피드백이 없는 회로보다 훨씬 더 높은 정밀도를 생성하여 피드백 제어의 이점을 보여준다.
상기 세포가 음성 교란을 받는 경우에도 유사한 실험이 수행되었다. 세포를 30nM E2 및 1.57nM Pg에서 정상-상태로 성장시킨 다음 청색광으로 유도하여 Z3PM의 분해를 활성화시켰다(도 17, 패널 d). 제어(control)로, 방해 전 합성 피드백 회로의 정상-상태 발현과 일치하도록 pRPL18B에서 구성적으로 발현된 키를 사용하여 제어로 피드백 없음 회로를 구축하였다. Z3PM 저하의 결과로서 합성 피드백 및 피드백 없음 회로 모두에서 YFP 표현이 즉시 감소한 후, 피드백 없음 회로는 새로운 더 낮은 정상-상태로 안착되었습니다. 그러나 피드백 회로는 슬라이트 오버슈트(slight overshoot)를 겪은 후 상기 피드백 없음 회로보다 사전-방해 값에 더 가까운 정상-상태로 복구되었다. 상기 음성 방해에 대한 합성 피드백 회로의 적응 정도는 양성 방해만큼 극적이지 않습니다(도 17, 패널 f). 모델 시뮬레이션은 음성 교란이 회로 출력을 피드백이 있는 회로와 없는 회로 사이의 상대적인 차이가 더 작을 것인 더 낮은 발현 수준으로 푸시한다는 것을 보여준다. 따라서, 피드백이 여전히 음성 교란에 대해 적극적으로 버퍼링하더라도 효과를 관찰하기가 더 어려울 것이다. 이는 생물학적 분자 또는 전자 구성요소로 구축된 임의의 피드백 회로가 생산적인 모듈식 사용을 가능하게 하기 위해 철저한 프로토타이핑(prototyping)을 통해 탐색해야 하는 속성을 가지고 있다는 사실을 강조한다.
degronLOCK 피드백 모듈의 속성을 추가로 설명하기 위해, E2 및 Pg 농도의 전체 범위로 피드백 및 피드백 없음 회로를 유도하고 유세포 분석을 사용하여 정상 상태에서 pZ3-YFP-cODC 출력을 측정하였다(도 19 및 도 20). 이러한 실험에서, pGAL1-RFP는 GEM의 활동 및 이에 따른 피드백 작용에 대한 보다 근접한 정보를 얻기 위해 측정되었다. E2의 고정된 농도(7.5nM E2)에서, Pg를 증가시키면 포화에 도달할 때까지 피드백 없음 회로의 YFP 출력이 증가한다(도 21, 도 17, 패널 e). 상기 키가 이 균주의 구성적 프로모터에서 발현되기 때문에, RFP 형광은 Pg에 둔감하다. 대조적으로, RFP 형광은 합성 피드백 회로에서 Pg의 함수로 감소하는데, 이는 degronLOCKR에 의해 유도된 GEM의 분해의 결과다. 이 효과는 이 농도를 넘어서는 일정한 RFP 발현에서 나타난 바와 같이, 결국 6.25nM Pg 이상으로 포화된다. 이러한 두 작동 영역 간의 차이는 YFP 출력에서 명확하게 관찰할 수 있으며, 활성 피드백 영역에서 Pg에 대한 감도가 감소하고 피드백이 포화될 때 극적으로 증가한다. 이러한 결과는 상기 키와 degSwitch 사이의 복합물 형성이 포화될 때 피드백이 포화되는 것을 보여주는 모델에 의해 질적으로 요약된다(도 16 및 도 17).
다음으로 상기 조정 가능성 degronLOCKR 피드백 제어가 조사되었다. 설계된 피드백 컨트롤러의 유용한 양태는 애플리케이션에 맞게 이득을 조정할 수 있다는 것이다. 피드백 이득을 조정하는 두 가지 방법이 평가되었다: 피드백 프로모터의 강도 변경과 상기 키 및 케이지의 결합 친화도 변경(도 22, 패널 a). 컴퓨터 모델(computational model)은 피드백 이득을 조정하는 두 가지 방법이 질적으로 유사하므로 상호 교환 가능해야 한다고 예측한다(도 22, 패널 b). 이를 테스트하기 위해, 각각 4개 및 3개의 Z3 결합 부위(BS)를 갖는 pZ3 프로모터의 중간 및 약한 변이체가 생성되었다. 피드백 프로모터 강도를 약화시키는 효과를 테스트하기 위해, 상이한 회로 변이체의 E2의 고정된 농도에서 Pg 용량 반응을 수행하였다(도 22, 패널 b). 상기 프로모터를 약화시키면 Pg에 대한 정상-상태 출력의 의존도가 변경되는 것으로 관찰되었다. 바인딩 사이트의 수가 감소함에 따라, 상기 피드백 회로에 대한 출력 용량 반응은 피드백이 없는 회로로 수렴되었다(도 23). 다음으로 상기 키의 길이를 감소시킴으로써 상기 케이지에 대한 키의 친화도를 감소시켰다. 전체-길이 키는 4개(중간) 또는 12개(짧은) 잔기에 의해 절단되었고 각각 키 변이체(key variant)는 전체-강도 pZ3 프로모터(6x Z3 BS)를 사용하여 피드백 회로에서 테스트되었다(도 22, 패널 c, 도 23). 상기 피드백 프로모터의 강도를 감소시키는 것과 유사하게, 키 길이의 감소는 Pg에 대한 정상-상태 출력의 의존도를 변화시켰다(도 22, 패널 d). 다른 전략 중 하나를 통해 상기 피드백 이득의 강도를 감소시키는 것도 과도 현상을 크게 만들고 적응을 감소시켰다(도 24). 키 길이를 통한 피드백 이득 조정은 새로운 단백질(de novo proteins)의 고유한 강도를 보여주는 프로모터 엔지니어링의 매력적인 대안이다.
이러한 조정 전략의 일반화 가능성을 보여주기 위해, 상기 메이팅 경로를 수정하고 피드백 프로모터의 강도와 키 길이를 모두 변경하여 합성 피드백 루프의 조합 조정을 수행하였다(도 22, 패널 d). pAGA1은 pFIG1보다 훨씬 더 강력한 프로모터이기 때문에, 상기 키를 발현하기 위해 pAGA1을 사용하면 알파-인자로 유도된 후 발현 펄스(pulse)가 생성된다(도 22, 패널 e). 상기 펄스의 크기와 그에 따른 정상-상태 출력은 모두 키 길이를 감소시킴으로써 증가하여 상기 시스템의 피드백 양이 감소하였다. 유사하게, 피드백을 구동하기 위해 더 약한 프로모터 pFIG1을 사용하는 동안 키 길이를 감소시키면 더 큰 과도 상태 및 더 높은 정상-상태 출력을 얻을 수 있다. 상이한 프로모터 및 키 길이에 대한 α-인자의 함수로서 정상-상태 출력을 측정(도 22, 패널 f, 도 25)하면 프로모터 강도 또는 키 길이를 감소시켜 상기 경로의 정상-상태 출력과 용량 반응의 기울기가 증가하여 피드피드백 이득이 감소하는 것을 나타낸다. 종합하면, 이러한 데이터는 degronLOCKR 피드백 전략의 특성에 대한 손쉬운 조정 가능성을 보여준다.
방법
DNA 회로의 구성(Construction of DNA circuits)
Lee et al.(2015)에 따라 효모 균주 구성을 위한 플라스미드를 조립하기 위해 계층적 골든 게이트 어셈블리(Hierarchical golden gate assembly)를 사용하였다. 개별 부분의 BsaI, BsmBI 및 NotI 절단 부위는 다운스트림 어셈블리 및 선형화를 용이하게 하기 위해 제거되었다. 부분(Parts)은 PCR을 통해 생성되거나 IDT에서 gBlock으로 구매하였다. 그런 다음 이러한 부분을 카세트 플라스미드에서 전사 단위(프로모터-유전자-종결자)로 조립하였다. 그런 다음 이러한 카세트를 함께 조립하여 효모 게놈에 삽입하기 위한 다중-유전자 플라스미드를 형성하였다.
효모 균주 및 성장 배지(Yeast strains and growth media)
모든 실험에 사용된 기본 S. cerevisiae 균주는 BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)이었다. 모든 효모 배양물은 YPD 배지(10g/L 박토 효모 추출물(Bacto Yeast Extract), 20g/L 박토 펩톤, 20g/L 덱스트로스)에서 성장시켰다. 영양요구성 마커(auxotrophic marker)(URA3, LEU2 및/또는 HIS3)의 선택은 합성 완전 배지(6.7g/L 아미노산이 없는 박토 효모 질소 염기, 2g/L 완전 보충 아미노산 혼합물, 20g/L 덱스트로스)에서 수행되었다.
FAR1 및 BAR1의 녹아웃(Knockouts of FAR1 and BAR1)
Lee et al.에 요약된 CRISPR/Cas9 방법을 사용하여 녹아웃된 FAR1 및 BAR1을 사용한 메이팅 경로 실험을 통해 BY4741(yAHN797)의 수정된 버전은 생성되었다. FAR1은 각 유전자의 ORF를 표적화하기 위해 Benchling 생물학 설계 도구를 사용하여 설계된 2개의 sgRNA에 의해 처음 표적화되었다. 이러한 sgRNA는 2개의 핵 국소화 서열 및 URA3 영양요구성 마커를 갖는 Cas9를 함유하는 CEN6/ARS4 플라스미드에서 발현되었다. 상기 ORF의 50bp 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 상동성을 갖는 복구 DNA(repair DNA)는 올리고(oligo)를 어닐링하여 생성하였다. 표준 리튬 아세테이트 절차(standard lithium acetate procedure)를 사용하여 sgRNA/Cas9 및 복구 DNA를 함유하는 플라스미드로 효모를 형질전환시켰다. sgRNA의 효능은 복구 DNA가 제공되지 않은 형질전환체에 대해 복구 DNA가 제공된 형질전환체의 콜로니 수를 비교함으로써 평가되었다. 콜로니를 콜로니 PCR로 스크리닝하여 녹아웃을 확인하고, 성공적인 클론을 YPD의 밤새 배양에서 성장시켰다. 그 다음 5 ul의 밤새 배양물을 5-플루오로오로트산(5-FOA)을 함유하는 합성 완전 배지에 플레이팅하여 CEN6/ARS4 플라스미드 상의 URA3 영양요구성 마커를 역선택(counterselect)하였다. 그런 다음 상기 녹아웃 프로세스를 반복하여 BAR1을 녹아웃시켰다.
효모 게놈에 degSwitch의 통합(Integration of degSwitch into yeast genome)
5xGS 링커 및 URA3 영양요구성 마커가 있는 degSwitch로 이루어진 선형 DNA는 중첩 확장 PCR(overlap extension PCR)을 사용하여 생성되었다. 그 다음 이 선형 DNA를 PCR 템플릿으로 사용하여 MAT 경로 조절자 GPA1, MSG5, SST2, STE5, STE7, STE11 및 STE50의 3' 말단을 표적으로 하는 상동성을 추가하였다. 그 다음 각각의 선형 DNA 단편을 사용하여 개별 리튬 아세테이트 효모 형질전환(Individual lithium acetate yeast transformations)을 수행하여 각각의 7개 유전자 degSwitch 다운스트림을 모 균주 yAHN797에 삽입하고 우라실이 없는 합성 완전 배지에 선택적으로 플레이팅하였다. 콜로니 PCR(colony PCR)을 사용하여 삽입을 확인하였다.
효모 세포 배양 및 유도(Yeast cell culture and induction)
적절한 영양요구성 마커가 있는 SDC 플레이트, 또는 영양요구성 마커가 없는 경우 YPD 플레이트 상의 글리세롤 스톡(glycerol stock)에서 효모 균주를 스트리킹하였다. 이러한 플레이트로부터의 개별 콜로니를 사용하여 YPD에 배양물을 접종하여 12-24시간에 걸쳐 포화 상태로 성장시켰다.
알파 인자 유도(Alpha-factor induction)
포화 배양물을 신선한 YPD에서 1:500으로 희석하고 450ul를 2mL 96웰 저장 블록(storage block)(Corning)의 개별 웰에 분취하여 Multitron shaker(Infors HT)에서 30℃ 및 900RPM에서 3시간 동안 증식시켰다. 알파-인자 메이팅 페로몬(Alpha-factor mating pheromone)은 50uM 스톡 용액(Zymo Research)에서 YPD로 적절하게 희석하여 10배 농도로 준비하였다. 3시간 성장시킨 후, 50ul의 알파-인자 용액을 96웰 블록에 첨가하고 상기 블록을 4시간 성장 동안 shaker로 되돌렸다.
에스트라디올(Estradiol) 및 프로게스테론(Progesterone) 유도
포화 배양물을 신선한 YPD에서 1:500으로 희석하고 400ul를 Multitron shaker(Infors HT)에서 30℃ 및 900RPM에서 3시간 성장 동안 2mL 96웰 저장 블록(Corning)의 개별 웰에 분취하였다. 에스트라디올(Sigma-Aldrich) 및 프로게스테론(Fisher Scientific)은 3.6mM(에스트라디올) 및 3.2mM(프로게스테론) 스톡 용액에서 YPD로 적절한 희석액을 만들어 10배 농도로 제조하였다. 3시간 성장 후, 50ul의 에스트라디올 및 프로게스테론 유도제를 적절한 조합으로 96웰 블록에 첨가하고 상기 블록을 10시간 성장 동안 shaker로 되돌렸다.
효모 배양(Yeast culture)
포화 배양물은 10mL 또는 15mL YPD로 메이팅 경로 배양물에 대해 1:200 또는 1:100으로 희석되었다. 배양물을 shaker에서 30℃의 유리관에서 2시간 동안 성장시켰다. 그 다음 배양물을 0.01 OD600으로 희석하고 30mL YPD의 총 부피로 개별 팔콘 튜브(Falcon tubes)에 분취하였다. 30℃의 맞춤형 생물반응기에서 또 다른 1시간 성장을 수행하였고, 자기 제어 교반 막대(magnetically-controlled stir bars)로 교반하였다. 모든 배양물은 0.5X 페니실린 스트렙토마이신에서 YPD에서 성장시켰다.
하드웨어(Hardware)
시간 경과에 따른 측정값을 수집하기 위해, 자동화된 유세포 분석 및 연속 배양을 위한 플랫폼을 구축하였다. 기존의 자동화된 실험 플랫폼은 다양한 농도 및 장기 배양에서 소분자 유도를 수행하도록 조정되었다. 효모 배양물은 8개의 온도-제어되고, 자기적으로 교반되는 챔버에 보관된 광학적으로 투명한 원뿔형 튜브(Falcon) 50mL에서 성장되었다. 액체 처리는 BD High-Throughput Sampler의 2개의 주사기 펌프(Cavro XCalibur Pump, TECAN)를 사용하여 수행되었다. 이 설정을 통해 개별 배양에서 BD LSRII 유세포 분석기로 샘플링하여 측정할 수 있다. 지속적으로 배양하기 위해 정해진 양의 배양물을 먼저 폐기물로 옮기고 다른 비율의 호르몬 배지와 신선한 배지를 다시 추가하였다. HTS에 대한 명령은 LABVIEW 2013을 사용하여 제어되었다.
샘플링 기간은 각각의 호르몬 농도에서 샘플, 희석 부피 추출(extract dilution volume), 희석 부피 보충(replenish dilution volume)의 3가지 주요 단계로 구성되었다. 장기간의 실험 동안 이벤트 속도를 거의 일정하게 유지하기 위해 샘플링 기간이 선택되었다. 90분의 배가 시간을 가정하여, 4mL의 배양액을 추출한 다음 25분마다 신선한 배지와 호르몬으로 교체하였다(희석률 0.16mLmin-1). 상기 메이팅 경로에 대해 수행된 더 짧은 실험은 연속 배양으로 수행되지 않았으므로, 매 10분마다 더 높은 샘플링 빈도를 허용한다.
에스트라디올 및 프로게스테론 유도(1회 유도)
[E2] 및 [Pg] 농도가 실험 내내 동일하게 유지되는 조건을 연구하기 위해 한 번의 유도만 필요했다. (1) 인듀서, (2) 1X [E2] 및 1X [Pg] 농도의 리필 스톡, 및 (3) 호르몬이 없는 리필 스톡의 세 가지 스톡이 생성되었다. 유도 시점 동안 (1) 및 (3)의 상이한 비율에 의해 배양물을 각각의 농도로 유도하였다. (2) 및 (3)의 조정된 비율에 의해 배양물을 각각의 농도로 유지하였다.
에스트라디올 및 프로게스테론 유도(2회 유도)
[E2]는 같지만 [Pg]가 다른 교란 거부 반응(disturbance rejection)을 연구하기 위해 배양을 두 번 유도했다. 첫 번째 유도는 모든 배양물이 동일한 사전-방해 농도(pre-disturbance concentration)에서 정상 상태로 성장할 수 있도록 했다. 배양물이 정상 상태(t=0hrs)에 도달한 후, 더 많은 Pg로 배양물을 유도하거나 동일한 농도로 유지하고 다시 정상 상태로 성장시켰다. 4개의 스톡이 생성되었다: (1) 사전-교란 농도를 달성하기 위한 유도제, (2) 다른 교란 [Pg]을 달성하기 위한 유도제, (3) 원하는 농도를 유지하기 위해 1X [E2]/[Pg]에서 리필 스톡(refill stock), 및 (4) Pg 없으나 1X [E2]에서 리필 스톡. 배양은 (1)과 함께 t=-10hr에서 유도되었다. 모든 배양물은 (3)과 (4) 사이의 1:8 희석액으로 보충하여 10시간 동안 동일한 사전-방해 농도로 유지되었다. t=0에서, 배양은 (2)와 (4)의 다른 비율로 유도되었다. 농도는 (3)과 (4)의 비율을 조정하여 유지하였으며, 희석 없이 가장 높은 교란 [Pg]를 달성하고 1:8 희석에서 가장 낮은 [Pg]를 유지하도록 하였다.
알파 인자 유도(Alpha factor induction)
메이팅 경로에 대한 degronLOCKR 매개된 피드백의 동적 반응을 연구하기 위해, 배양물을 t0에서 입력(알파-인자)으로 유도하였다. 상이한 볼륨의 YPD 1X 25nM 알파-인자 스톡과 알파-인자가 없는 YPD를 결합하여 다른 농도가 달성되었다.
광 유도(Light induction)
각 생물반응기에는 USB 제어 가능한 LED 드라이버(Mightex)에 연결된 개별 청색 LED가 장착되어 있다. 광 유도 시점에서 시작하여, 배양물은 포화 광량(saturating light dose)(25mA의 강도 진폭으로 45초 켜짐/15초 꺼짐)에 노출되었다. 이 광 체계는 발현이 정상-상태에 도달할 때까지 유지되었다.
유세포 분석(Flow cytometry)
형광 단백질 리포터 발현의 분석은 고-처리량 샘플러가 장착된 BD LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences)로 수행되었다. 세포의 허용 가능한 밀도를 얻기 위해 기기를 통과하기 전에 배양물을 TE로 희석하였다. YFP(Venus) 형광은 FITC 채널을 사용하여 측정하고, RFP(mKate2)는 PE-Texas Red 채널(정상 측정용) 또는 mCherry 채널(동적 측정용)을 사용하여 측정하고, CFP는 DAPI 채널을 사용하여 측정하였다. 정상-상태 측정의 경우, 샘플당 5,000-10,000개의 이벤트가 수집되었다. 동적 측정의 경우, 샘플당 2,000-10,000개의 이벤트가 수집되었다. 형광 값은 적절한 채널에 대한 높이(H) 측정으로 계산되었고, 측면 스캐터(side scatter)(SSC-H)으로 나누어 세포 크기를 정규화하였다.
도 14. degronLOCKR는 생물학적 경로를 제어하기 위한 모듈식 도구이다. a) degSwitch를 이펙터 분자에 융합하고 네트워크 출력에서 키 발현을 구동하여 내인성 또는 합성 생물학적 네트워크에서 합성 피드백 제어를 구현하기 위한 모듈식 도구로서의 degronLOCKR의 개략도. b) 복잡한 내인성 피드백을 나타내지 않는 효모 메이팅 경로의 단순화된 개략도. α-인자를 추가하여 경로를 활성화하고 pAGA1-YFP-cODC 리포터를 사용하여 신호 활성을 측정한다. c) degronLOCKR은 메이팅 경로 활성을 제어하기 위해 양성 신호 분자의 분해를 유도하였다. 표시된 신호 분자의 내인성 카피(copy)를 degSwitch에 융합하고 키를 프로게스테론 유도성 시스템을 사용하여 발현하였다. α-인자 포화 용량으로 세포를 유도하고 키 유무에 따른 경로 활성을 비교하였다. pAGA1-YFP-cODC는 4시간의 성장 후 유세포 분석기에서 측정되었습니다. 데이터는 3개 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 16. degronLOCKR 모듈은 메이팅 경로의 합성 피드백 제어를 성공적으로 구현한다. a) STE12의 내인성 카피가 degSwitch에 융합되고 경로 리포터 pFIG1(합성 피드백) 또는 구성적 프로모터(피드백 없음)가 키-CFP-NLS를 발현하는데 사용되는 합성 음성 피드백의 계략도. 모든 출력 측정은 pAGA1-YFP-coODC용이다. b) pAGA1-YFP-coODC 역학의 측정. 합성 피드백 및 피드백 없음(pREV1) 균주는 시간 t=0hr에서 고(25nM), 중(6.25nM) 또는 저(3.13nM) 용량의 α-인자로 유도되었고, 유세포 분석 측정(포인트)은 10분 마다 수행되었다. 선은 3개의 데이터 포인트에 대한 이동 평균을 나타낸다. c) 합성 피드백(pFIG1) 및 4개의 피드백 없음(키 없음, pREV1, pRNR2, pRET2) 균주의 α-인자 용량 반응. pAGA1-YFP-cODC 형광은 α-인자 유도 4시간 후 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다. 실선은 데이터에 맞는 언덕 함수(hill function)이다. (b)의 실험에서 얻은 α-인자의 고, 중, 저용량을 그래프에 나타내었다.
도 17. 합성 회로의 제어를 통해 정량화된 degronLOCKR 피드백 모듈의 작동 특성. a) 합성 피드백 회로의 개략도. GEM-degSwitch는 구성적으로 발현되고 에스트라디올(E2)에 의해 활성화되어 pGAL1-Z3PM-psd의 발현을 유도한다. Z3PM은 프로게스테론(Pg)에 의해 활성화되어 pZ3에서 발현을 유도한다. 청색광은 Z3PM-psd의 분해를 유도하는 데 사용할 수 있다. pZ3-YFP-cODC는 회로의 측정된 출력이며, pZ3-key-CFP-NLS는 GEM-degSwitch의 분해를 활성화하여 회로에서 피드백(합성 피드백)을 구동한다. 피드백이 없는 회로에서 구성적 프로모터는 키-CFP-NLS를 표현하는 데 사용된다. b) 피드백 및 피드백 없음 회로의 모델 시뮬레이션(보충 정보 참조). 시뮬레이션된 역학(왼쪽)과 Pg 교란에 따른 출력의 정상-상태 변화(오른쪽)는 피드백 버퍼가 GEM을 저하시키고 Z3PM 농도를 감소시켜 Pg 농도를 증가시키는 것을 방지한다는 것을 나타낸다. c) 합성 피드백에 대해 자동화된 유세포 분석을 사용하고 양성 교란에 따른 피드백 없음 균주(pRNR2-key-CFP-NLS)는 pZ3-Venus-coODC의 동적 측정. 세포를 0.78nM Pg 및 7.5nM E2에서 정상-상태 발현으로 성장시켰다. 시간 0시에 세포를 동일한 Pg 농도로 유지하거나 1.56nM(저), 3.13nM(중) 또는 6.25nM(고) Pg의 새로운 최종 농도로 유도하였다. 역학은 또 다른 8시간 동안 측정되었다. 실선은 3개의 데이터 포인트에 대한 이동 평균을 나타낸다. d) 합성 피드백에 대해 자동화된 유세포 분석을 사용하고 음성 교란에 따른 피드백 없음 균주(pRPL18B-key-CFP-NLS 구동 키)는 pZ3-Venus-cODC의 동적 측정. 세포를 1.57nM Pg 및 30nM E2에서 정상-상태 발현으로 성장시킨 다음 시간 0시에 청색광을 가하여 psd를 활성화시켰다. 역학을 교란 후 8시간 동안 측정하였다. 성장 및 샘플링 조건은 c)와 같다. e) 합성 피드백의 정밀도 대 각각의 교란에 대한 피드백 없음 회로. f) 7.5nM E2의 고정 농도에서 Pg의 함수로서 피드백(pRNR2-key-CFP-NLS)이 있거나 없는 정상-상태 회로 거동(자극 후 10시간)의 비교. RFP 형광은 Z3PM 농도에 대한 프록시이고 YFP 형광은 회로의 출력이다. c)에서 양성 교란에 사용된 Pg 용량이 표시된다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 22. DegronLOCKR 합성 피드백 전략은 예측 가능하게 조정할 수 있다. a) (상단) 합성 피드백 회로에서 피드백 게인을 조정하기 위한 다양한 방법 탐색. (하단) 키 생산 속도 또는 키/케이지 친화도를 감소시키기 위한 Pg 교란의 함수로서 회로 출력 및 Z3PM의 모델 시뮬레이션(보충 정보 참조). b & c) 조정(tuning)의 실험적 검증. b) (상단) 고정 길이의 키를 사용하여 pZ3의 Z3 결합 사이트 수를 변경하여 피드백 게인을 조정한다. (하단) 강한(pZ3-6x), 중간(pZ3-4x) 및 약한(pZ3-3x) 피드백 균주 대 피드백 없음(pREV1-key-CFP-NLS) 균주에 대한 Pg의 함수로서의 RFP 및 YFP 형광. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다. c) (상단) pZ3-6x에 고정된 피드백 프로모터의 강도로 키의 길이를 변경하여 피드백 게인을 조정한다. (하단) 긴(55aa), 중간(51aa) 및 짧은(43aa) 키 피드백 균주 대 피드백 없음(pREV1-NLS-key-CFP) 균주에 대한 Pg의 함수로서의 RFP 및 YFP 형광. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다. d) 메이팅 경로에서 합성 음성 피드백 루프에 대한 피드백 게인을 조정하기 위해 프로모터 강도 및 키 길이를 변경한다. pAGA1은 pFIG1보다 메이팅 경로의 더 강력한 리포터이다. e) (상단) 다양한 피드백에 대한 pAGA1-YFP-coODC의 동적 측정 및 25nM α-인자로 자극 후 피드백 변형 없음. 포인트는 유세포 분석 측정을 나타내고 선은 3개의 데이터 포인트에 대해 취한 이동 평균을 나타낸다. (하단) 피드백 균주 대 피드백 없음(pREV1-NLS-key-CFP) 균주의 α-인자 용량 반응. YFP 형광은 α-인자 유도 4시간 후 유세포 분석기를 사용하여 측정되었다. 점은 3개의 생물학적 복제의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 실선은 데이터에 맞는 언덕 함수이다. 동적 실험에 사용된 α-인자의 용량(상단)은 그래프에 표시되어 있다.
도 15: degronLOCKR로 테스트한 짝짓기 경로 조절기 패널. degSwitch는 각 레귤레이터의 내인성 카피의 C-말단에 융합되었다. SV40 NLS가 있거나 없는 키는 Pg 유도성 시스템을 사용하여 표현되었다. STE20, STE11 및 PTP3은 세포질 키(Key-CFP)를 사용하여 분해되었고 STE12, DIG1 및 DIG2는 핵 키(Key-CFP-NLS)를 사용하여 분해되었다. MSG5 및 FUS3은 세포질(cyto) 또는 핵(nuc) 키를 사용하여 분해되었다. 세포를 1nM(낮음) 또는 100nM(높음) α-인자와 50nM 또는 0nM Pg로 유도하고 4시간 동안 성장시킨 후 유세포 분석기를 사용하여 YFP 형광을 측정하였다. 데이터는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 18: 양성 또는 음성 교란에 대한 정상-상태 솔루션. a) 프로게스테론(Pg) 또는 b) ZPM 분해율(γZ)과 같은 안정된 값은 Hill-like 모델(Hill-like model)에 따라 변경된다. 연속선은 피드백 시스템(FB)에 해당하는 반면, 점선은 피드백이 제거된 실시예를 보여준다(즉, 식 12 대신 fK = μK*; FB 없음). 회색 상자는 피드백이 "활성(active)"으로 간주되는 영역을 구분하며, 이것은 교란의 상대적 변화 (a) ΔP/P 또는 b) ΔγZ/γZ)에 대한 총 GEM의 상대적 변화(Δ(G+C)/(G+C))로 정의되며 0.15보다 높다. 주목할만한 것은 피드백이 없을 때, Δ(G+C)는 키 또는 GEM의 합성 또는 저하 속도를 직접적으로 제외하고 모든 교란에 대해 0이다.
도 19: 고정 용량의 E2에 대한 Pg의 함수로서의 회로 거동. E2의 모든 농도에서 Pg의 함수로서 피드백(pRNR2-key-CFP-NLS)이 있거나 없는 정상-상태 회로 동작(자극 후 10시간)의 비교. YFP 형광은 회로의 출력이고, RFP 형광은 Z3PM 농도에 대한 프록시이며, BFP 형광은 생성된 키의 양이다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 20: 고정 용량의 Pg에 대한 E2의 함수로서의 회로 거동. Pg의 모든 농도에서 E2의 함수로서 피드백(pRNR2-key-CFP-NLS)이 있거나 없는 정상 상태 회로 동작(자극 후 10시간)의 비교. YFP 형광은 회로의 출력이고, RFP 형광은 Z3PM 농도에 대한 프록시이며, BFP 형광은 생성된 키의 양이다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 21: 서로 다른 양의 키를 구성적으로 발현할 때의 회로 동작. 7.5nM E2의 고정 농도에서 Pg의 함수로서 피드백 및 피드백이 없는 다양한 수준의 키 발현(pREV1, pRNR2, pRET2, pRPL18B)이 있는 정상-상태 회로 동작(자극 후 10시간)의 비교. YFP 형광은 회로의 출력이고, RFP 형광은 Z3PM 농도에 대한 프록시이며, BFP 형광은 생성된 키의 양이다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 23: 프로모터 강도 또는 키 길이를 변경하면 피드백 게인이 조절된다. 7.5nM E2의 고정 농도에서 Pg의 함수로서 다양한 수준의 피드백 게인에 대한 정상-상태 회로 동작(자극 후 10시간)의 비교(왼쪽, 피드백 프로모터 강도 변경을 통한 조정, 오른쪽, 키 길이 변경을 통한 조정). 왼쪽, 피드백 프로모터 강도 변경을 통한 조정(x는 Z3 운영자 사이트의 수를 나타낸다); 오른쪽, 키 길이 변경을 통한 조정(m은 키의 C-말단에서 제거된 잔기의 수를 나타낸다). YFP 형광은 회로의 출력이고, RFP 형광은 Z3PM 농도에 대한 프록시이며, BFP 형광은 생성된 키의 양이다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다.
도 24: 피드백 강도를 조정하면 회로 출력의 동적 동작이 변경된다. 시간 = 0hrs에서 3.13nM Pg 및 7.5nM E2로 유도한 후 다양한 게인과 피드백 없음 균주(pREV1-key-CFP-NLS) 및 합성 피드백 균주에 대해 자동화된 유세포 분석을 사용한 pZ3-Venus-cODC의 동적 측정. 실선은 3개의 데이터 포인트에 대한 이동 평균을 나타낸다.
도 25: 메이팅 경로에서 합성 피드백의 조합 조정. (상단) 25nM α-인자로 자극 후 다양한 피드백 및 피드백 없음(pREV1, pRNR2, pRET2, pRPL18B) 균주에 대한 pAGA1-YFP-coODC의 동적 측정. 포인트는 유세포 분석 측정을 나타내고 선은 3개의 데이터 포인트에 대해 취한 이동 평균을 나타낸다. (하단) 피드백 균주 대 피드백 없음(pREV1, pRNR2, pRET2, pRPL18B) 균주의 α-인자 용량 반응. YFP 형광은 α-인자 유도 4시간 후 유세포 분석기를 사용하여 측정되었다. 포인트는 3개의 생물학적 복제의 평균 ±sd를 나타낸다. 실선은 데이터에 맞는 언덕 함수이다.
실시예 5: 유도성 핵 추출(Inducible nuclear export)
이 실시예에서, 핵 추출 신호를 사용한 유도성 국소화(inducible localization)는 피드백 회로 설계를 위한 기능적 전략으로 입증되었다.
핵 내외의 전사 인자 및 키나아제의 동적 이동은 세포 기능에서 필수적인 역할을 한다. 핵 국소화에 대한 유도성 제어를 얻기 위해 핵 추출 시퀀스(nuclear export sequence, NES)가 Switcha에 케이지되어 생체 내에서 LOCKR의 기능이 더욱 확장되었다. NES 시퀀스(G
Figure pct00003
T. et al. Nat. Struct. Mol. Biol. (2010) 17:1367-1376)는 cODC에 사용된 것과 동일한 전략으로 케이지되었고 생성된 nesSwitcha는 강력한 핵 국소화 서열(Kosugi, S. et al. J. Biol. Chem. (2009) 284:478-485)으로 YFP에 융합되었다. RFP-히스톤 융합(HTA2)은 동일한 세포에서 구성적으로 발현되어 핵 마커로 작용하였다(도 26, 패널 a). nesLOCKRa의 스위칭 기능을 테스트하기 위해, YFP 국솨화를 키 발현이 있는 경우와 없는 경우를 비교하였다. YFP는 keya-BFP의 부재 하에 핵에서 RFP와 공동 국소화되는 것으로 밝혀졌다(도 26, 패널 b, 왼쪽). NLS-YFP-nesSwitcha가 keya-BFP와 공동발현되었을 때, YFP 형광은 더 많은 세포질로 나타났으며, 이는 핵 추출 신호의 언케이징을 나타낸다(도 26, 패널 b, 오른쪽). 세포질에서 관찰된 YFP 반점은 NLS 및 keya-BFP 없이 YFP-nesSwitcha의 동시발현이 유사한 패턴을 초래하기 때문에 응집으로 인한 것 같다(도 27, 패널 a, 패널 b). NES의 언케이징은 keya-BFP 상의 NLS의 존재와 무관하다(도 27, 패널 c, 패널 d). 이론에 얽매이지 않고, 핵 외부에서 nesLOCKR를 유지하기 위한 메커니즘은 핵으로부터의 핵 추출과 세포질에서 키에 의해 새로 번역된 NLS-YFP-nesSwitcha 또는 잔류 NLS-YFP-nesSwitcha의 포획의 조합일 수 있다. keya-BFP의 발현은 항상 YFP-nesSwitcha와의 공동-국소화를 초래한다(도 27).
다음으로, nesLOCKR을 사용하여 SynTF의 국소화를 제어하였다. SynTF는 전사를 활성화하기 위해 핵에 국소화되어야 하기 때문에 nesLOCKR의 활성화는 pSynTF 프로모터의 출력 감소로 이어질 것이라고 가정하였다. 이중 유도 시스템(도 26, 패널 c)을 사용하여, pSynTF-YFP 리포터와 동일한 세포에서 서로 다른 농도의 SynTF-RFP-nesSwitcha 및 keya-BFP가 발현되었고, 정상 상태 형광은 유세포 분석기를 사용하여 측정되었다(도 26, 패널 d). 31.25 nM E2에서 키의 유도는 YFP 신호의 33% 감소를 일으켰으며, 이는 nesLOCKR의 성공적인 활성화 및 핵으로부터 SynTF의 배제를 나타낸다(도 26, 패널 e). 이러한 결과는 본원에 설명된 회로에서 피드백 제어를 위해 위치 기반 전략을 사용하는 능력을 추가로 보여준다.
도 26. nesLOCKR를 사용하여 단백질 국소화 제어. a) NLS-YFP-nesSwitcha의 핵심 유도 핵 추출의 개략도. 상기 핵은 히스톤 HTA2-RFP로 표시된다. b) Keya-BFP가 발현되지 않을 때, 핵 HTA2-RFP 형광과 NLS-YFP-nesSwitcha의 공동-국소화를 보여주는 형광 현미경 검사법(왼쪽), Keya-BFP가 발현될 때 핵 외부에서 관찰된 보다 확산된 NLS-YFP-nesSwitcha 형광 신호와 비교한다(오른쪽). c) 합성 전사 인자(SynTF)에 대한 nesLOCKRa의 효과를 결정하기 위한 이중 유도 분석의 개략도. Pg는 Keya-BFP의 발현을 유도하고, E2는 SynTF-RFP-nesSwitcha 융합의 발현을 유도한다. 상기 pSynTF 프로모터는 SynTF에 의해 활성화되고 YFP를 발현한다. d) 유세포 분석에 의해 측정된 E2(0-125 nM) 및 Pg(0-500 nM)의 함수로서의 YFP 및 RFP 형광의 히트맵(Heatmap). e) Pg 유도의 함수로서 31.25 nM E2에서 YFP, SynTF-RFP-nesSwitcha 및 Keya-BFP의 형광을 비교하는 선 플롯(Line plot)(도 26의 검은색 직사각형, 패널 b). 형광 값은 최대 YFP, RFP 또는 BFP 형광으로 정규화되었다. 오차 막대는 3개의 생물학적 복제물의 표준편차를 나타낸다.
도 27. 키(Key)가 표현될 때 nesLOCKR의 세포질 응집. a) 핵 마커 HTA2-RFP가 있는 세포질 YFP-nesSwitcha 및 Key-BFP의 개략도. b) YFP 형광은 YFP-nesSwitcha가 NLS 없이 발현될 때 예상되는 세포질 분포를 보여주지만(왼쪽) YFP 형광의 반점이 YFP-nesSwitcha와 Key-BFP가 모두 세포질에서 발현될 때 관찰되며, 이는 nesSwitcha의 응집 때문이라고 가정한다. Key-BFP 형광은 YFP-nesSwitcha 형광(오른쪽)에 공동-국소화된다. c) 핵 마커 HTA2-RFP가 있는 Key-BFP-NLS가 있는 NLS-YFP-nesSwitcha의 개략도. d) YFP-nesSwitcha는 강한(SV40) NLS(왼쪽)로 표현될 때 핵에 국소화된다. Key-BFP가 적당히 강한 NLS로 표현될 때, Key-BFP가 NLS 없이 발현될 때와 동일한 YFP 국소화 패턴이 관찰되며(도 26, 패널 b), NES의 언케이징이 Key-BFP 국소화와 무관함을 나타낸다. Key-BFP-NLS 형광은 NLS-YFP-nesSwitcha 형광(오른쪽)에 공동 국소화된다.
실시예 4: 인간 1차 T 세포에서 degronLOCKR 기능
인간 1차 T 세포에서 기능하는 degronLOCKR의 능력은 mCherry 형광 단백질을 유도적으로 분해함으로써 입증되었다.Lentiviral 전달 구조는 t8 토홀드(toehold)와 래치에 내장된 cODC degron이 있는 비대칭 짧은 스캐폴드 degronSwitch에 융합된 mCherry를 포함하여 구성되었다. 상기 mCherry-degronSwitch 융합은 pPGK 구성적 프로모터를 사용하여 발현되었다. 2차 렌티바이러스 구성에서 tagBFP에 대한 Key의 융합은 4개의 다른 구성적 프로모터(pPGK, pSFFV, pCMV(G), pCMV(D))를 사용하여 발현되었다.
실험은 인간 1차 CD4+ T 세포에서 수행되었다. 전술한 렌티바이러스의 상이한 조합으로 세포를 형질도입하였다. 하나의 예에서, 세포는 mCherry-degronSwitch로만 형질도입되었다. 다른 세포에서는 Key-tagBFP를 발현하는 바이러스 외에 mCherry-degronSwitch 바이러스를 모두 받았다. 렌티바이러스 형질도입 후, 유세포분석을 사용하여 형광을 측정하였다. 분포는 도 28에 나와 있다. 우리는 mCherry 형광이 세포가 임의의 양의 키 생성을 함유하는 바이러스와 공동-형질도입되었을 때 거의 완전히 폐지되었음을 관찰하였다(키 생성은 tagBFP 형광을 사용하여 정량화되었다). 이 데이터는 키가 degronSwitch를 트리거하고 mCherry의 성능 저하를 활성화할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: Jurkat T 세포에서 degronLOCKR-매개된 피드백 기능
유도성 인간화 합성 전사 인자 ZF3-p65-Ert2(ZPE)는 degronLOCKR에 의해 매개되는 피드백이 인간 T 세포에서 기능할 수 있는지 여부를 테스트하기 위한 모델 프로세스로 사용되었다(Mo Khalil, Boston U의 유도성 TF 선물). 상기 회로의 출력은 pZF3 프로모터에 의해 생성된 mCherry 형광 리포터이고, degronSwitch에 융합된 ZPE는 pSFFV 구성 프로모터에 의해 구동된다. 두 가지 버전의 회로가 구성되었는데, 하나는 피드백이 없는 버전이고 다른 하나는 키를 통한 피드백이 있는 버전이다. 피드백이 있는 회로에는 별도의 pZF3 프로모터에 의해 구동되는 키가 있으며 mEGFP에 융합된다. 이 피드백 회로의 여러 변이체는 서로 다른 pZF3 프로모터 변이체와 키 길이를 혼합하고 일치시켜 테스트하였다. 이러한 실험은 렌티바이러스를 사용하여 구축물을 Jurkat T 세포에 안정적으로 통합함으로써 수행되었다. 회로를 수신한 세포는 mCherry 양성(pZF3(4x)mCMV 프로모터가 누출됨) 및 피드백 버전의 경우 BFP 양성으로 게이트 아웃되었다.
이 실험은 ZPE 전사 인자를 핵 내로 전위시켜 활성화하는 타목시펜(4OHT) 범위로 세포를 유도함으로써 수행되었다. 세포는 유세포 분석을 사용하여 유도 후 5일째에 측정되었다. 피드백이 있는 회로의 회로 출력 및 키 생성에 대한 샘플 분포를 도 29에 나타내었다.
4OHT 농도의 전체 범위에 대한 피드백 없음 및 피드백 회로의 용량 반응을 비교하였다. 피드백으로부터 버퍼링은 이전에 효모에서 관찰된 효과와 유사하게 프로모터 또는 키 길이를 변경하여 조정할 수 있는 것으로 나타난다. 전체 길이 키를 구동하는 mCMV 프로모터의 피드백 오프를 관찰할 때, 피드백의 존재가 최대 정상-상태 출력을 감소시키고 용량-반응의 기울기도 감소시키는 것을 볼 수 있다(도 30). 이러한 특성은 피드백의 전형적인 특징이며 피드백 회로가 회로에 영향을 미치고 있음을 나타낸다. 미래에, mCherry는 관심 있는 페이로드(payload)로 대체될 수 있다. 우리의 피드백 회로는 방해 제거를 수행하고 T 세포 활성화(즉, CAR 생성) 또는 치료 페이로드 전달의 역학을 조정할 수 있다.
본 발명이 그 특정 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞추기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 여기에 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
<110> The Regents of the University of California <120> SYNTHETIC MOLECULAR FEEDBACK CIRCUITS AND METHODS OF USING THE <130> IP21-0017 <150> US 62/789,402 <151> 2019-01-07 <150> PCT/US 2020/012353 <151> 2020-01-06 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 1 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 2 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 3 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 5 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 6 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 7 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 8 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5

Claims (65)

  1. 분자 피드백 회로(molecular feedback circuit)로서, 상기 회로는
    신호전달 경로의 입력에 의해 활성화될 때 신호전달 경로의 출력을 유도하는 신호전달 단백질(상기 신호전달 단백질은 잠재적인 비활성화 도메인을 포함하지만 케이지된 데그론(caged degron)은 포함하지 않음); 및
    상기 출력에 반응하고, 발현될 때 비활성화 도메인을 유발하여 신호 분자를 비활성화시키는 스위치 폴리펩티드(switch polypeptide)를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 조절 서열을 포함하는, 분자 피드백 회로.
  2. 제1항에 있어서, 상기 입력, 출력, 또는 둘 모두는 세포내 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  3. 제1항에 있어서, 상기 입력, 출력 또는 둘 모두는 세포 간 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 분해 도메인(degradation domain)인 것을 특징으로 하는 회로.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분해 도메인은 데그론(degron)을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 신호 단백질의 분해를 예방하고 상기 스위치 폴리펩티드에 의해 탈보호되는 보호 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스위치 폴리펩티드는 프로테아제(protease)를 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 결합 쌍(binding pair)의 제1 구성원을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  9. 제8항에 있어서, 상기 스위치 폴리펩티드는 격리 도메인(sequestration domain)에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  10. 제9항에 있어서, 상기 격리 도메인은 원형질막-표적화 태그(plasma membrane-targeting tag), 미토콘드리아 막-표적화 태그(mitochondrial membrane-targeting tag), 퍼옥시솜-표적화 태그(peroxisome-targeting tag), 액포-표적화 태그(vacuole-targeting tag), 또는 액틴-세포골격-표적화 태그(actin-cytoskeleton-targeting tag)를 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  11. 제8항에 있어서, 상기 스위치 도메인은 우성 음성 도메인을 포함하는 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  12. 제11항에 있어서, 상기 잠재적 불활성화 도메인이 상기 결합 쌍의 제1 구성원에 비-공유적으로 결합하는 경쟁적 결합 도메인(competitive binding domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 쌍의 제1 및 제2 구성은 류신-지퍼(leucine-zipper)의 제1 및 제2 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  14. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 신호전달 경로의 양성 조절자(positive regulator)인 것을 특징으로 하는 회로.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 상기 신호전달 경로의 음성 조절자(negative regulator)인 것을 특징으로 하는 회로.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질이 신호전달 경로의 중간 구성원 또는 전사 인자인 것을 특징으로 하는 회로.
  17. 제16항에 있어서, 상기 전사 인자는 합성 전사 인자인 것을 특징으로 하는 회로.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자 서열(regulatory sequence)은 출력의 전사 인자에 대한 결합 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출력은 상기 전사 인자의 발현인 것을 특징으로 하는 회로.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 수용체이고 상기 출력은 상기 수용체에 대한 리간드(ligand)인 것을 특징으로 하는 회로.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 AKT 신호전달 경로(AKT signaling pathway), Akt/PKB 신호전달 경로(Akt/PKB signaling pathway), AMPK 신호전달 경로(AMPK signaling pathway), 아팝토시스 신호전달 경로(apoptosis signaling pathway), BMP 신호전달 경로(BMP signaling pathway), cAMP-의존성 경로(cAMP-dependent pathway), 에스트로겐 신호전달 경로(estrogen signaling pathway), 헤지호그 신호전달 경로(hedgehog signaling pathway), 히포 신호전달 경로(hippo signaling pathway), 면역 활성 경로(immune activation pathway), 면역 억제 경로(immune suppression pathway), 면역 세포 분화 경로(immune cell differentiation pathway), 인술린 신호 형질도입 경로(insulin signal transduction pathway), JAK-STAT 신호전달 경로(JAK-STAT signaling pathway), MAPK/ERK 신호전달 경로(MAPK/ERK signaling pathway), mTOR 신호전달 경로(mTOR signaling pathway), NF-κB 신호전달 경로(NF-κB signaling pathway), 노달 신호전달 경로(nodal signaling pathway), 노치 신호전달 경로(notch signaling pathway), p53 신호전달 경로(p53 signaling pathway), PI3K 신호전달 경로(PI3K signaling pathway), TGF 베타 신호전달 경로(TGF beta signaling pathway), TLR 신호전달 경로(TLR signaling pathway), TNF 신호전달 경로(TNF signaling pathway), VEGF 신호전달 경로(VEGF signaling pathway), 및 Wnt 신호전달 경로(Wnt signaling pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 회로.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회로는 상기 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 회로.
  23. 제22항에 있어서, 상기 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 상기 신호전달 단백질의 천연 프로모터(native promoter)인 것을 특징으로 하는 회로.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 합성 신호전달 경로인 것을 특징으로 하는 회로.
  25. 제24항에 있어서, 상기 수용체는 합성 수용체인 것을 특징으로 하는 회로.
  26. 제25항에 있어서, 상기 합성 수용체는 synNotch 수용체인 것을 특징으로 하는 회로.
  27. 제25항에 있어서, 상기 합성 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(engineered T cell receptor, TCR)인 것을 특징으로 하는 회로.
  28. 제27항에 있어서, 상기 출력은 면역 활성 또는 면역 억제인 것을 특징으로 하는 회로.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 분자 피드백 회로를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자.
  30. 제19항에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하도록 유전적으로 변형된 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  32. 제31항에 따른 진핵 세포의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 상태(condition)에 대한 개체를 치료하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 상태는 암이고 상기 분자 피드백 회로의 출력이 면역 활성화인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 상태는 자가면역 질환이고 상기 분자 피드백 회로의 출력이 면역 억제인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 상태는 대사성 또는 호르몬의 결핍이고, 상기 분자 피드백 회로의 출력이 대사성 또는 호르몬의 생성 및/또는 분비인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 분자 피드백 회로를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하는 방법으로서,
    상기 분자 피드백 회로는 신호전달 경로의 신호전달 단백질(상기 신호전달 단백질은 잠재적인 비활성화 도매인을 포함하지만 케이지된 데그론은 포함하지 않음)을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    발현될 때 잠재적인 비활성화 도메인을 활성화시키는 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 신호전달 경로의 출력에 반응하는 조절 서열을 포함하고,
    상기 활성화된 비활성화 도메인은 상기 신호전달 단백질은 비활성화함으로서 상기 신호전달 경로의 신호전달을 조정하는, 세포의 신호전달 경로의 신호전달을 조절하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 조정하는 단계는 음성 피드백을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 조정하는 단계는 양성 피드백을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 상기 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 분해를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 분해 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 스위치 폴리펩티드에 의해 매개되는 단백질 분해 절단 사건(proteolytic cleavage event)에 의해 활성화 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 상기 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 격리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 비활성화 도메인은 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고 상기 스위치 도메인은 격리 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비활성화 도메인에 의한 신호전달 단백질의 비활성화는 상기 신호전달 단백질의 우성 음성 억제(dominant negative suppression)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 스위치 도메인은 우성 음성 도메인에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 잠재적 비활성화 도메인은 상기 결합 쌍의 제1 구성원에 비공유적으로 결합된 경쟁적 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원은 류신-지퍼의 제1 및 제2 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제36항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 상기 세포의 천연 신호전달 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 천연 신호전달 경로는 천연 생합성 경로(native biosynthesis pathway)인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 천연 생합성 경로는 호르몬 생산 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 호르몬 생산 경로는 인슐린 생산 경로(insulin production pathway), 에스트로겐/프로게스테론 생산 경로(estrogen/progesterone production pathway), 안드로겐 생산 경로(androgen production pathway), 및 성장 호르몬 생산 경로(growth hormone production pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제42항에 있어서, 상기 세포는 면역세포이며 상기 천연 신호전달 경로는 면역 활성 경로 또는 면역 억제 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제46항에 있어서, 상기 면역 활성 경로는 사이토카인 신호전달 경로(cytokine signaling pathway), B 세포 수용체 신호전달 경로(B cell receptor signaling pathway), 및 T 세포 수용체 신호전달 경로(T cell receptor signaling pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제46항에 있어서, 상기 면역 억제 경로는 저해성 면역 체크포인트 경로(inhibitory immune checkpoint pathway)인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 합성 신호전달 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 synNotch 수용체이고 상기 출력은 상기 synNotch 수용체의 세포내 도메인의 방출인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이고 상기 신호전달 경로는 합성 면역 활성 경로 또는 합성 면역 억제 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 면역 세포는 골수 세포(myeloid cell) 또는 림프 세포(lymphoid cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 림프구(T lymphocyte), B 림프구(B lymphocyte) 및 자연 살해 세포(Natural Killer cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 림프 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 합성 면역 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 합성 면역 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출력은 면역 활성 또는 면역 억제인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 합성 신호전달 경로는 합성 생합성 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 합성 생합성 경로는 호르몬 생산 경로(hormone production pathway), 아편유사제 생산 경로(opioid production pathway), 항생제 생산 경로(antibiotic production pathway), 화학 요법 생산 경로(chemotherapeutic production pathway), 아르테미신 산 생산 경로(artemisinic acid production pathway), 테르페노이드 생산 경로(terpenoid production pathway), 및 폴리케타이드 생산 경로(polyketide production pathway)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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