JP2015513406A - 改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこれを用いた標的タンパク質の製造方法 - Google Patents

改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこれを用いた標的タンパク質の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、改変グルタミン合成酵素(Glutamine synthetase、GS)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよびこれを用いた標的タンパク質の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、グルタミン合成酵素(GS)阻害剤に対する感受性が増加するように改変GS、前記改変GSをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、および前記形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、改変グルタミン合成酵素(Glutamine synthetase、GS)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよびこれを用いた標的タンパク質の製造方法に関する。より具体的には、本発明は、グルタミン合成酵素阻害剤に対する感受性が増加するように改変グルタミン合成酵素(GS)、前記改変GSをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、および前記形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法に関する
組換えタンパク質は、原核および真核細胞を含むさまざまな種類の宿主細胞において発現可能である。しかし、抗体とFc融合タンパク質のように、糖タンパク質(glycoprotein)は安全性と効果に影響を与える炭水化物部分に結合したポリペプチドからなり、したがって、翻訳後修飾(post-translational modification)の過程の間、普通、グリコシル化(glycosylation)が可能な動物細胞において発現される。組換えタンパク質性医薬品の生産の際、ヒト(天然型)糖タンパク質の糖鎖の違いは、タンパク質性医薬品の免疫原性(immunogenicity)と関連がある。したがって、ヒト型糖タンパク質と同様であるかまたは類似した糖鎖を持つ糖タンパク質を生産することが重要となる。
これまで、組換えタンパク質性医薬品の発現および生産において通常用いられてきた動物細胞としては、ハイブリドーマ(hybridoma)、マウス骨髄腫(mouse myeloma)、CHO細胞などがある。これらの動物細胞におけるタンパク質の発現は、ヒトタンパク質と類似したタンパク質の生産には適しているが、その発現レベルが顕著に低く、大量生産が困難であるという欠点がある。特に、治療用抗体は、kgの単位量を生産しなければならないため、動物細胞の培養は治療用抗体の大量生産には適していない。従って、宿主細胞で標的遺伝子を高発現させるためには、標的DNAが動物細胞にランダムに導入される際に、標的遺伝子をゲノムの転写率の高い活性領域に組み込む必要がある。導入された前記外来遺伝子は、宿主細胞のゲノムと共に複製される。しかし、転写率の高い活性領域に遺伝子を組み込むための相同性組換え技術(homologous recombination technology)は、まだ一般化されていない。
ランダムに組み込まれたDNAの発現率を高めるもう一つの方法は、組み込まれた遺伝子を増幅させる方法であるが、この方法は遺伝子増幅システムで操作されたベクターへの遺伝子のクローニングのステップを必要とする。一般的な遺伝子増幅システムはDHFRシステム(非特許文献１)であり、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dihydrofolate reductase、DHFR)の阻害剤であるメトトレキサート(methotrexate、MTX)を用いて、標的遺伝子とDHFRを共増幅することによってタンパク質の発現レベルを増強するシステムである。DHFRはヌクレオチドの生合成に関与する酵素であり、DHFR活性の抑制は細胞の維持に必要不可欠なDNA合成を効果的に妨げ、これにより細胞死に至らせる。したがって、ゲノムに外来性のDHFR遺伝子が挿入されたクローンのみがこのような状況で生存することができる。さらに、MTX濃度が高まり、強力なプロモーターを用いると、数百から数千コピーのDHFR遺伝子をも増幅させることができる。即ち、細胞培養にDHFRの阻害剤であるMTXを付加すればするほど、細胞は生き残るためにDHFRと導入された標的遺伝子の発現を増幅させる。従って、複数のDNAのコピーが混合(incorporation)されるので、さまざまな分子変異体(molecular variants)の生成をもたらす。
また、CHO細胞株を用いたDHFRシステムは、様々なのタンパク質性医薬品の発現システムとして報告され、商品化されているので、使用におけるその安全性と効用性が検証されている。しかし、DHFRシステムは、通常レベル以上の高発現量を示す単一細胞株を分離するためには、数ヶ月を要するという欠点がある。さらに、細胞がMTXに対して抵抗し、MTX濃度を高めても標的遺伝子が増幅されない場合もある。それだけでなく、DHFRシステムに用いられるCHO-DUKX細胞に復帰突然変異体(revertant)が容易に生じうる。従って、DHFRシステム以外のタンパク質生産のための高レベルの遺伝子発現システムの開発が強く求められてきた。
GSシステムは、Celltech社が最初に開発した高レベルの遺伝子発現システム(特許文献１)であり、前記DHFRに基づいた遺伝子発現システムの限界、目的とする単一細胞株を分離するための時間的効率の低さと、標的タンパク質の生産性の低さを克服した。前記GSシステムは、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを生成する唯一の合成経路に関与する酵素であるGS(glutamine synthetase)を用いたものであり、グルタミンの欠乏した条件下で動物細胞が適宜成長できないという事実に基づいたものである。このようなGSシステムは、DHFRシステムに比べて一個の細胞あたり少ないDNAコピー数を必要とし、スクリーニングの初期段階で高い発現率を有する単一細胞を選択するようになる。 従って、タンパク質性医薬品の発現システムとしてGSシステムを採用する機関の数が増加している。GSシステムに最も多く用いられている細胞株としては、NS0細胞株とCHO細胞株がある。両細胞株のうち、マウス骨髄腫細胞であるNS0細胞株は十分な量のGSを発現することができないため、グルタミンの欠乏した条件下において、ゲノムに標的遺伝子が挿入された細胞を容易に選択することができる。このようなNS0細胞株とは異なり、CHO細胞株は十分な量のGSを発現するため、グルタミンの欠乏した培地においても生存が可能である。しかし、CHO細胞をMSX(methionine sulphoximine)のような高濃度のGS特異的阻害剤で処理すると、前記細胞は内在性のGS活性のみでは細胞が生存できないため、GS遺伝子と標的タンパク質遺伝子を含むベクターが導入された細胞だけが生存可能となる。上述のようなメカニズムにより、標的タンパク質に対する遺伝子が挿入された細胞のみを分離することができるようになり、さらに、標的タンパク質を高収率で生産できる。つまり、細胞にGS特異的阻害剤が添加されるほど、細胞は生き残るためにGS遺伝子と共に導入された標的遺伝子だけでなく外来性のGS遺伝子をも増幅させるので、細胞に標的タンパク質の量を増加させることができる。しかし、このようなGSシステムも、標的タンパク質に対する遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされた細胞をGS特異的阻害剤で処理して標的タンパク質を生産したとしても、生産量においては限界があった。また、細胞を長期間培養した場合、標的タンパク質の生産量が減少した。このような限界により、GSと共にに導入された標的遺伝子をさらに高いレベルまで増幅させることができ、GS阻害剤により敏感に反応できる改変GSタンパク質の開発が求められてきた。
米国特許第5122464号
Takeshi omasa, gene amplification and its application in cell and tissue engineering, J.Bios. and Bioe(2002),Vol. 94, No. 6, 600-605
GS阻害剤に対する感受性が野生型GSタンパク質に比べ 顕著に増大した改変GSタンパク質を開発するために努力を重ね、本発明者らは、野生型GSに比べて１個のアミノ酸が置換され、GS阻害剤に対する感受性が著しく増大したタンパク質を開発した。そこで、本発明者らは、前記改変GSおよび標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを動物細胞にトランスフェクトした後、GS阻害剤の存在下において標的タンパク質が生産されることを確認し、さらに、前記改変GSがGS阻害剤に対して高い感受性を示し、野生型GSタンパク質を含むベクターシステムに比べて顕著に高いレベルの標的タンパク質の生産を示すだけでなく、長期間の培養後にも標的タンパク質の生産レベルが減少しないことを確認することにより、本発明を完成した。
発明を解決するための手段
本発明の目的は、配列番号4のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素において、299番目のアミノ酸であるグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換された、改変グルタミン合成酵素(GS)を提供することである。
また、本発明の目的は、前記改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記のポリヌクレオチドおよび標的タンパク質をコードする遺伝子を含む標的タンパク質の発現のためのベクターを提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記ベクターを含む形質転換体を提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記形質転換体を培養するステップを含む、標的タンパク質の製造方法及び前記方法により製造された標的タンパク質を提供することである。
本発明の改変GS遺伝子を含む発現ベクターは、CHO細胞を宿主細胞として使用し、前記細胞にGS阻害剤を処理した条件下でも、改変GS遺伝子を含む発現ベクターが導入された宿主細胞の選別を可能にする。したがって、本発明の発現ベクターは、標的タンパク質の効果的な生産に広く活用することができる。
本発明のpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GSまたはpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMを製作するクローニング方法を示した模式図である。 本発明の代表的な標的タンパク質であるNFR-Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GSまたはpcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMの開裂地図である。 本発明の代表的な標的タンパク質であるTNFR-Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GSまたはpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PMを製造するクローニング方法を示した模式図である。 本発明の代表的な標的タンパク質のTNFR-Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GSまたはpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc- SV40-GS PMの開裂地図である。 ３種のTNFR-Fc発現ベクター(IRES-GS PM、IRES-GSまたはSV40-GS)のうちの一つでトランスフェクトされたCHO K-1細胞においてTNFR-Fcの発現レベルを示したグラフである。 ３種のTNFR-Fc発現ベクター(IRES-GS PM、IRES-GSまたはSV40-GS)のうちの一つでCHO K-1細胞株にトランスフェクトされた後、経時的に、MSX処理によるTNFR-Fcタンパク質の発現レベルの変化を示したグラフである。 ２次一過性トランスフェクション(transient transfection)によって確認したTNFR-Fcの発現レベルの変化を示たグラフであり、培養の初期段階ではSV40-GSベクターでトランスフェクトされたグループでの発現レベルが高いが、MSXを処理して長期間培養、IRES-GS PMベクターでトランスフェクトされたグループで最も高い発現レベルが観察された。 IRES-GS PMベクターまたはSV4O-GS PMベクターでそれぞれトランスフェクトされた安定した２つのグループのCHO-S細胞株におけるTNFR-Fcの発現レベルを示したグラフである。
一つの様態として、本発明は、配列番号4のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素において、299番目のアミノ酸であるグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換された、改変グルタミン合成酵素(GS)を提供する。
本発明において使用される用語「グルタミン合成酵素(glutamine synthetase、GS)」とは、哺乳類の臓器および微生物に見られる酵素であり、ATPが存在する時、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンの合成を触媒する酵素を意味する。前記酵素を活性化させるためには２価の金属イオンが必要であり、その酵素活性はグリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン、グルコサミン-6リン酸、シチジン三リン酸などによって酵素の活性が阻害される。本発明の目的上、前記グルタミン合成酵素は、標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターがトランスフェクトされた細胞を選択したり、GS阻害剤を処理することによって標的タンパク質の発現を増加させるために使用できる酵素を意味するが、これらに限定されない。
前記グルタミン合成酵素の情報は、NCBI GenBank(ジェンバンク)などの一般のデータベースから得ることができる。その例として、GenBankから得られたハムスター由来のグルタミン合成酵素につての情報は、受託番号がX03495.1であることがわかるが、これに限定されない。前記代表的な野生型グルタミン合成酵素のヌクレオチド配列は配列番号3で表わされ、そのアミノ酸配列は配列番号4で表される。
本発明において使用される用語「改変グルタミン合成酵素」とは、グルタミン合成酵素の299番目のアミノ酸であるグリシン(Gly、G)が、改変グルタミン合成酵素(GS)に、配列番号4のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素において、299番目のアミノ酸であるグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換された酵素を意味する。
前記改変グルタミン合成酵素は、前記改変グルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含む標的タンパク質発現用ベクターに、細胞のトランスフェクションによりGSを内因的に生産できるかどうかを選別するマーカーとして用いられたり、好ましくは、「プロモーター標的タンパク質をコードするIRES-遺伝子改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド」または「プロモーター改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド-IRES-標的タンパク質をコードする遺伝子」など形で標的タンパク質をコードする遺伝子とポリシストロン性転写(polycistronic translation)により、グルタミン合成酵素阻害剤を処理することによって、標的タンパク質の発現を増加させうるタンパク質を意味するが、これに限定されるのもではない。
本発明の発明者らは、配列番号4のグルタミン合成酵素の299番目のグリシンに対するコドンのグアノシン(G)がシチジン(C)に置換される場合、GS阻害剤に対する感受性が野生型GSに比べて著しく増加することを初めて立証した。本発明の改変GSは、GS阻害剤に対して感受性が顕著に増加しているので、標的タンパク質の発現システムに効果的に使用することができる。
また、前記改変グルタミン合成酵素は、配列番号4のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素において、前記299番目のグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換されたアミノ酸配列を含み、また、野生型GSに比べてGS阻害剤に対する感受性が増加するものであれば、本発明の改変グルタミン合成酵素は前述の改変GSのアミノ酸配列と70％以上、好ましくは、80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明において使用される用語「GS阻害剤」とは、前記GSの活性を抑制することができる外部因子を意味する。前記阻害剤の例として、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン、グルコサミン-6-リン酸、シチジン三リン酸および MSX(methionine sulphoximine)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的面において、GS阻害剤はMSXが好ましいが、これらに限定されない。
本発明において使用される用語「感受性」とは、一般には、外部の刺激に反応する特性を意味する。酵素に関しては、酵素活性を調節する外部因子に対する反応において酵素活性が増強または減少するという特性を意味する。本発明の目的上、前記感受性はGS阻害剤に対する反応においてGSの活性が抑制されることを意味するが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施例では、ハムスターの細胞のRNAからグルタミン合成酵素をPCRを行ってクローニングを通じて、改変グルタミン合成酵素をコードする遺伝子の取得を試みた。その結果、配列番号4の野生型グルタミン合成酵素の299番目のグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換された改変グルタミン合成酵素が得られたことが確認され、これをGS PMと命名した(実施例3)。また、前記改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドをIRESに連結させてIRES-GS PMを製造し、これを標的タンパク質をコードする遺伝子と結合させて、標的タンパク質遺伝子-IRES-GS PMが相互に作動可能に結合された発現カセットを含むベクターを製造した(実施例4)。また、本発明の前記改変グルタミン合成酵素を含むベクターを用いて標的タンパク質を発現させた結果、野生型グルタミン合成酵素を用いた場合よりも標的タンパク質の生産レベルが顕著に高かった(実施例6および7)。
他の態様として、本発明は、前記改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明において、前記改変グルタミン合成酵素は、野生型GSの299番のアミノ酸であるグリシンがアルギニンに置換されたことを特徴とする。したがって、前記改変グルタミン合成酵素の299番目のアミノ酸をコードするDNAのコドンは、CGT、CGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGからなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない
さらに、前記本発明の改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、標的タンパク質の発現を増強させるためのものであってもよい。
本発明の改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードする遺伝子と共にポリシストロン性翻訳によって翻訳される形態でベクター内に存在することができる。前記ベクターで宿主細胞にトランスフェクトされた後、GS阻害剤で細胞を処理すると、導入されたベクターから発現される改変グルタミン合成酵素の活性が抑制されるので、グルタミンの合成量が減少する。しかし、細胞が生存するためには、グルタミンが必要であるため、GS阻害剤の抑制の下でこれらの細胞はグルタミン合成酵素をさらに生産しようとする。この時、改変GSをコードするポリヌクレオチドと共に導入された標的タンパク質をコードする遺伝子も共に増幅されるので、それにより標的タンパク質の発現メカニズムを増強させることができる。
他の態様として、本発明は、前記改変GSをコードするポリヌクレオチドと、標的タンパク質をコードする遺伝子を含む標的タンパク質を発現させるためのベクターを提供する。
前記改変GSをコードするポリヌクレオチドについては、前述の通りである。
本発明において使用される用語「標的タンパク質」とは、宿主細胞において生産しようとする目的タンパク質を意味する。本発明の目的上、前記改変グルタミン合成酵素によってその発現が増幅されるタンパク質を意味するが、これに限定されるものではない。前記標的タンパク質は、本発明のベクターを用いて発現可能なタンパク質であれば、その種類は特に制限されない。本発明の一実施例では、本発明の改変グルタミン合成酵素をによって発現しうる代表的な標的タンパク質として、TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc融合タンパク質を使用した
本発明において使用される用語「 TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc融合タンパク質」とは、TNFRタンパク質の全部または一部が免疫グロブリンのFc領域と酵素作用によって連結されて製造された結果物、またはゲノムの操作によって前記２つのポリペプチドを１つのポリペプチドとして発現させて製造された結果物を意味する。前記TNFR-Fc融合タンパク質は、TNFRタンパク質と免疫グロブリンのFc領域が相互に直接連結するか、またはペプチドリンカーを介して連結されてもよいが、これに限定されない。前記TNFR-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号5のポリヌクレオチドであってもよいが、これに限定されない。
本発明において使用される用語「発現ベクター」とは、宿主細胞に導入されるとき、挿入された遺伝子のみが発現されるように挿入された遺伝子に操作可能に接続され、重要な調節要素を含むDNA構築物を意味する。前記発現ベクターは、標準的な組換えDNA技術を用いて製造および精製することができる。前記発現ベクターの種類は、原核細胞および真核細胞の各種宿主細胞から標的遺伝子を発現して生産するものであれば、特に限定されない。強力なプロモーター活性と強力な発現力を保持しながら、天然のタンパク質と類似した形態の外来タンパク質を大量に生産することができる発現ベクターが好ましい。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、標的タンパク質をコードする遺伝子、停止コドン、およびターミネーターを含むことが好ましい。さらに、シグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、標的遺伝子の5'側および3'側非翻訳領域、選択可能マーカー領域、または必要に応じて複製可能単位などを適宜含むことができる。さらに、前記発現ベクターの種類は、１個の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むモノシストロン性ベクター(mono-cistronic vector)、２個の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロン性ベクター(bi-cistronic vector)、3つ以上の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリシストロン性ベクター(poly-cistronic vector)であってもよい。 本発明の目的上、前記発現ベクターとしては、SV40プロモーターを含むモノシストロンベクターまたはIRES配列を含むバイシストロンベクターが好ましく、より好ましくはプロモーター、標的タンパク質をコードする遺伝子、IRES、および改変GS遺伝子を順次に含む発現ベクター、またはプロモーター、改変GS遺伝子、IRES、および標的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施態様によると、CHO DG44からGS PMをコードするポリヌクレオチドを得て、前記得られたポリヌクレオチドをpGEMTベクターに結合してpGEMT-GS PMベクターを得た。続いて、前記pGEMT-GS PMベクターを切断されたTOPO-IRES-DHFRベクターに挿入し、pCR2.1-TOPO-IRES-GS PMベクターを得て、前記ベクターからIRES-GS PMフラグメントを得た。前記得られたIRES-GS PMフラグメントを切断されたpcDNA-Kozak-TNFR-Fc-IRES-DHFRベクターに挿入してKozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMベクター(「IRES-GS PMベクター」)を作製した(図1)。
本発明の他の一実施態様によれば、前記GS PMをコードする前記ポリヌクレオチドを切断したpcDNA3.1-TNFR-Fc-SV40-DHFRベクターに挿入してpcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PMベクターを得た。次に、前記pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PMベクターを切断し、切断された部位にpcDNA3.1-Kozak-TNFR-FC-IRES-DHFRベクターから抽出されたTNFR-FCフラグメントを挿入して、 pcDNA-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PMベクター(「SV40-GS PMベクター」)を作製した(図3)。
さらに、他の一態様として、本発明は、前記ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明において使用される用語「形質転換体」とは、前記発現ベクターに含まれている組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させるように発現ベクターに形質転換された細胞を意味する。組換え哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、好ましくは動物細胞または動物由来の細胞であってもよく、最も好ましくはNS0細胞またはCHO細胞であってもよいが、これに限定されない。本発明の目的上、前記形質転換体は、前記発現ベクターがNS0細胞株またはCHO細胞株に導入されて製造された形質転換体が好ましいが、これに限定されない。
さらに、他の一態様として、本発明は、前記形質転換体を培養するステップを含む、標的タンパク質の製造方法を提供する。
前記形質転換体および標的タンパク質については、前述の通りである。
前記方法は、具体的には、(a)前記形質転換体を培養するスッテプと、(b)GS阻害剤を培地に添加するステップを含む。また、本発明は(c)標的タンパク質を培地から回収するスッテプをさらに含むことができる。
好ましくは、 前記GS阻害剤が培地に添加される場合、野生型GSを用いた発現システムに比べGS阻害剤に対する感受性が増強した本発明の改変GSタンパク質を用いた発現システムは、野生型GSを用いた発現システムに比べ標的タンパク質の発現を増加させることができる。
さらに、他の一態様として、本発明は、前述の方法で製造された標的タンパク質を提供する。
前記方法および標的タンパク質については、前述の通りである。
発明を実施するための具体的な内容
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を単に例示的に説明するものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1：TNFR-Fc融合タンパク質をコードする遺伝子の合成
本発明の組換えタンパク質発現ベクターシステムを用いて生産された組換えタンパク質の発現レベルを確認するために、TNFR-Fc融合タンパク質を代表的標的タンパク質として使用した。
前記融合タンパク質をコードする遺伝子(配列番号5)を、以下のレベルに適合するようGeneArt社によって合成した：(1)TNFRのシグナル配列を含むようにする。(2)TNFRアミノ酸の1番から235番目のアミノ酸まで発現できるようにする。(3)CHO細胞にトランスフェクトできるようにCHO細胞にコドン最適化されなければならない。(4)Invitrogen社のpcDNA3.1ベクターに挿入することを考慮して、 5 '末端には制限酵素NheI切断部位を、3'末端には制限酵素NotI切断部位を挿入する。
前記合成された融合タンパク質をコードする遺伝子の最終的なヌクレオチド配列はVectorNTIプログラムを用いて分析した。
実施例2：TNFR-Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターの作製 本発明では、改変GSタンパク質を用いた組換えタンパク質発現システムに対する対照群として、一般的な組換えタンパク質発現システムであるDHFRシステムを用いた。そのために下記の説明のとおり、ハムスターのジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子をクローニングした。
ハムスターのDHFR遺伝子を得るために、ハムスターのDHFR遺伝子の突然変異体のを持つpSVA3ベクター(ATCC77273)を購入して前記DHFR遺伝子を鋳型として用い、点突然変異(point mutation)を行って、野生型DHFR遺伝子を得た。さらに、IRES配列は、該当するDNA配列を含むClontech社のベクター(Cat＃6029-1、PT3267-5)からPCR反応を介して得た。
前記で得られたDHFR遺伝子とIRES(Internal ribosome entry site)配列をpCR2.1ベクターにクローニングして、pCR2.1-IRES-DHFR発現ベクターを作製した。
実施例1で得られたTNFR-Fcが挿入されたそれぞれのpcDNA3.1-TNFR-Fcベクターと得られた前記pCR2.1-IRES-DHFRベクターをそれぞれ制限酵素SalIおよびXbaIで切断した後、これを結紮して、TNFR-Fcが挿入されたpcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-DHFR発現ベクターを得た。
また、それをカナマイシン耐性遺伝子を含有したベクターにクローニングするためにClontech社のpAC-GFPベクター(＃632483)からカナマイシン耐性遺伝子を得て、Kan/ Neo遺伝子を導入した。前記ベクターは、TNFR-Fc遺伝子の転写開始部位にKozak配列および抗生物質選択マーカーとしてKan/ Neo遺伝子を持つベクターであり、これをCHO細胞を用いた組換えタンパク質の発現レベルを比較するために、4種類の発現ベクターシステムのクローニングの基本骨格として用いた。
実施例3：改変GS遺伝子の製造
野生型GSに比べGS阻害剤に対する感受性が増大され、標的タンパク質の発現システムに適用可能な改変GS遺伝子を得るために下記のような過程を行った。
改変GS遺伝子を得るために、ハムスター細胞株CHO DG44(Invitrogen社、12609-012)を培養した後、TRIZOL試薬(Invitrogen社)を用いて全RNAを分離した。次に、取得した全RNAを用いてRT-PCRを行い、cDNAを得た。前記得られたcDNAを鋳型とし、次に、GS PM遺伝子を得るためのプライマー対(GS SalI-FプライマーおよびGS XbaI-Rプライマー)を用いてPCRを行い、PCR産物を得た (94℃で5分間の変性；94℃で30秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長を25サイクル反復；および72℃で7分間伸長)。
GS SalI-F(フォーワードプライマー)：5'-gtcgacatggccacctcagcaagttccc-3'
(配列番号6)
GS XbaI-R(リバースプライマー)：5'-tctagattagtttttgtattggaaaggg-3'
(配列番号7)
前記得られたPCR産物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、該当するバンドを切断し、キアゲンクリーニングキット(＃28204)を用いて洗浄した。その後、前記結果物を遺伝子クローニングベクターであるpGEMTベクター(Promega社、USA)に挿入した。前記PCR産物が挿入されたpGEMTベクターをTOP10細胞に導入し、合計10個のコロニーを得た。その後、ヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を分析した。
前記のような手順を数回行って、野生型ハムスターGS(NCBI GenBank Accession Number：X03495.1)のアミノ酸配列と比較して、299番目の１個のアミノ酸が異なる、改変GS遺伝子を得た。配列解析の結果、これらの違いは、前記野生型GS遺伝子配列(配列番号3)において、895番目のヌクレオチドであるG(グアノシン)がC(シチジン)に変化したものであることが分かった。即ち、改変GSは、299番目のアミノ酸であるグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に変更されたアミノ酸の特徴を有する。本発明では、前記得られた改変GSを「GS-PM」と命名した。
さらに、野生型ハムスターGSタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るために、GS-PMのヌクレオチド配列において、895番目をCからGに置換した。具体的には、１個のアミノ酸を置換するために点突然変異によってクローニングを行った。 さらに具体的には、本発明のGS PMから１個のアミノの異なる野生型GSを得るために、GS PM DNAを鋳型とし、点突然変異部位(CGT→GGT)を含むように合成されたプライマー対(KpnI F-プライマーおよびXbaI R-プライマー)を用いてPCRを行った(94℃で5分間の変性;94℃で30秒間の変性、54℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を30サイクル反復、および72℃で7分間の伸長)。その結果CGT配列がGGTに変更されたGS PCRフラグメントを得た 。
KpnI F-primer(フォーワードプライマー)：
5'-caccggtaccacattcgagcctacgatcccaaggggggcctggacaatgcccgtggtctg-3'
(配列番号8)
XbaI R-primer(リバースプライマー)： 5'-tctagattagtttttgtattggaaggg-3'
(配列番号9)
また、PCR産物のヌクレオチド配列を分析した。その結果、CGTからGGTへの点突然変異が観察された。該当するPCR産物はKpnIおよびXbaIで切断した後、KpnIおよびXbaIで処理したpGEMT-GS PMベクターに結紮して、pGEMT-GSベクターを得た。
実施例4：哺乳類細胞でタンパク質を発現するためのGSベクターのクローニング
実施例3で得られた前記pGEMT-GS PMベクターに含まれている前記GS PM遺伝子は、そのN末端とC末端にそれぞれSalIとXbaI制限酵素部位を有するようにクローニングした。したがって、IRES-GS PMを得るためにSalIおよびXbaIにpGEMT-GS PMを制限酵素処理して得られたフラグメントを、SalIおよびXbaI制限酵素で予め切断しておいたTOPO-IRES-DHFRベクターに挿入してpCR2.1-TOPO -IRES-GS PMを得た。
次に、TNFR-Fc遺伝子とIRES-GS PM遺伝子を結合させるために、XhoIとXbaIで切断したTNFR-Fc-IRES-DHFR遺伝子とIRES-GS PMフラグメントを結紮(ligation)させて、Kozak-TNFR -Fc-IRES-GS PMベクター(「IRES-GS PMベクター」)を作製した(図1)。図1は、本発明のpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMをクローニングする方法を表す模式図である。
また、Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMベクターとTOPO-GSベクターを用いて、Kozak-TNFR-Fc-IRES-GSベクター(「IRES-GSベクター」)を作製した(図2)。
図2は本発明のTNFR-Fcをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GSベクターまたはpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PMを示す開裂地図である。
一方、GSシステムのうちLonza社のGSシステムと同様のSV40プロモーターGSシステムを作製するために、クローニングされたpcDNA3.1-TNFR-Fc-SV40-DHFRベクターを用いた。pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-DHFRにGS遺伝子を挿入するための適切な制限酵素部位が存在しないため、GS遺伝子両端に新たな制限酵素切断部位をまず挿入した。
具体的には、GS遺伝子のN末端にはBsaBIを含み、GS遺伝子のC末端にはBstBIを含むプライマー対(GS-BsaBI-FプライマーおよびGS-BstBI-Rプライマー)を合成し、PCRを行った。さらに、GS遺伝子の両末端にBsaBIとBstBI部位を挿入し、BsaBIとBstBIを処理することによってpcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-DHFRからDHFRを除去した。続いて、BsaBI/ BstBIで切断されたGS遺伝子を挿入して、pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PMベクターを作製した。
GS-BsaBI-F(フォーワードプライマー)：
5'-gatgaggatcatggccacctcagcaag-3'(配列番号10)
GS-BstBI-R(リバースプライマー)：
5'-ttcgaattagtttttgtattggaaggg-3'(配列番号11)
しかし、pcDNA3.1-TNFR-Fc-SV40-GS PMベクターは前記pcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-GS PMベクターとは異なり、TNFR-Fc遺伝子の前半部にKozak配列を持たない。したがって、前記ベクターにKozak配列を挿入する２次クローニングのステップが行われた。Kozak配列には予め作製されたpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-DHFRベクターのKozak配列を用いた。pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PMベクターのTNFR-Fcの代わりにKozak-TNFR-FCを挿入してpcDNA3.1-Kozak-TNFR-FC-SV40-GS PMを製造した。
クローニングに用いられる制限酵素はTNFR-FcのN末端にあるNdeIおよびNheI、TNFR-FcのC末端にあるBstXI、SgrAIおよびNotIを含むことができる。それらのうち利用可能な制限酵素を選択してpcDNA-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PMベクター(「SV40-GS PMベクター」)を作製した(図3)。図3は、本発明のTNFR-Fcをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GSまたはpcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PMのクローニング方法を示した模式図である。
前記作製されたSV40-GS PMベクターは、細胞株を選択するための抗生物質耐性遺伝子であるアンピシリン耐性遺伝子を含んでいるので、前記遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えるための３次クローニングのステップを行った。アンピシリンは患者によく使用されている抗生物質の一つであるため、抗生物質耐性遺伝子は安全性の面において使用頻度が低い抗生物質に置き換えられた。
使用頻度の低いカナマイシン耐性遺伝子に置き換えるためのクローニングを行うために、Clontech社のpAC-GFPベクター(＃632483)からカナマイシン耐性遺伝子を得て、SV40-GS PMベクターに導入した。さらに、前記SV40-GS PMベクターを用いてpcDNA-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GSベクター(「SV40-GSベクター」)を作製した(図4)。図4は、本発明のTNFR-Fcをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GSまたはpcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PMを示した開裂地図である。
最後に、哺乳類細胞において標的タンパク質を発現させるためのタンパク質発現ベクターシステムとして、IRES-GS PM、IRES-GS、SV40-GS PMおよびSV40-GSの異なった4種類の発現ベクターを作製した。
実施例5：形質転換体の作製
GSとDHFR遺伝子発現システムの間に、TNFR-Fc融合タンパク質の生産性を比較するために、実施例4で作製したそれぞれの発現ベクターをCHO K-1細胞に導入することによって、それぞれの形質転換体を作製した。
詳しくは、FBSを10％含むDMEM/F12培地でCHO K-1細胞を培養し、3ないし4 x105細胞数/ウェルで6ウェルプレートに接種して一晩培養した。細胞が80〜90％の集密度(confluence)に達した時、前記発現ベクターをそれぞれ導入した。
このため、実施例4で作製した各発現ベクター4μgとOpti-MEM250μlを互いに混合し、それとは別にLipofectamine2000(Invitrogen社)10μlとOpti-MEM250μlを互いに混合した。次に、前記混合物を室温で5分間放置した。続いて、前記各混合物を互いに混合して、室温で20分間放置した。
その後、前記6ウェルプレートの培地を2mlのOpti-MEM I mediaに交換して、前記の最終的な混合物500μlを前記6ウェルプレートの各ウェルに加えた後、37℃で4〜6時間培養した。前記培地を元の培養培地(FBSを10％含むDMEM/F12培地)に交換し、さらに一晩培養した。続いて、前記6ウェルプレートの培養培地をGS選択培地に交換し、それぞれの発現ベクターが導入された細胞の成長速度に合わせて継代培養した。この時、GS選択培地は、10％FBS、1X GS supplement、GS阻害剤であるMSXを含むグルタミン・フリーDMEM(glutamine-free DMEM)またはグルタミン・フリーIMDM(glutamine-free IMDM)であった。前記1x GS supplementは、アデノシン(500x、15mM)、シチジン (1000x、30mM)、ウリジン(1000x、30mM)、グアノシン(1000x、3mM)、チミジン(1000x、10mM)、アスパラギン(1000x、500mM)およびグルタミン酸(1000x、500mM)を含むことによって製造したもの、または商業的に入手可能な50x GS supplement(SAFC)を希釈して使用した。
実施例6：TNFR-Fcの発現レベルの測定
実施例5で継代培養された各形質転換体の培養液をELISAに適用して、前記形質転換体から発現された各タンパク質の発現レベルを測定した。
詳しくは、96ウェルプレートを抗ヒトIgG Fc抗体(Pierce社、31125)でコーティングし、1％BSAでブロッキングした。次に、前記継代培養された各形質転換体の培養液を各ウェルに加えて反応させた。続いて、ビオチン抱合型抗ヒトTNFR抗体(R&Dシステム)を検出用抗体として各ウェルに加えて反応させた。各ウェルにHRP抱合型ストレプトアビジンを処理して再び反応させた。最後に、各ウェルにTMBを処理して発色させ、各タンパク質の発現レベルを調べた。
まず、CHO K-1において3種のTNFR-Fc GSベクター(IRES-GS PM、IRES-GS、SV40-GS)間の発現レベルを比較し、IRES-DHFRシステムおよびタンパク質の発現レベルをGSベクター間においても比較した(図5)。図5は、3種のTNFR-Fcの遺伝子の発現ベクター(IRES-GS PM、IRES-GS、SV40-GS)でトランスフェクトされたCHO K-1細胞においてTNFR-Fcの発現レベルを示すグラフである。
その結果、図5に示すように、CHO K-1細胞は、発現ベクターによるトランスフェクション後64時間が経過しても、GSベクター3種のTNFR-FCタンパク質の発現レベルや細胞生存率には変化が見られなかった。むしろIRES-DHFRシステムよりも3種のGSシステムが発現レベルの面で優れていた。さらに、発現ベクターによるトランスフェクション後5日が経過しても、前記3種の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞は、成長を維持しながら、TNFR-Fcタンパク質を持続的に発現した
次に、25μMのMSXを含むグルタミンフリー選択培地を用いて、3種のTNFR-Fcの遺伝子発現ベクター(IRES-GS PM、IRES-GS、SV40-GS)でトランスフェクトされた細胞を培養する時、同様の結果が得られるか否かを実験した(図6)。図6は、3種のTNFR-Fc遺伝子の発現ベクター(IRES-GS PM、IRES-GS、SV40-GS)でトランスフェクトされたCHO K-1細胞株の初期MSX処理によるTNFR-Fcタンパク質の発現レベルの経時的変化を示したグラフである。
その結果、図6に示すように、細胞の培養時間が経過するほど、本発明のIRES-GS PMベクターが導入された細胞株が、他のベクターでトランスフェクトされた細胞株に比べて総TNFR-Fcタンパク質の発現レベルおよび同一細胞数当たりの発現レベルの面において、優れた結果を示した。発現ベクターによるトランスフェクション直後には、SV40-GSベクターでトランスフェクトされた細胞株が最も高いレベルを示した。しかし、MSX添加後には、本発明のIRES-GS PMベクターでトランスフェクトされた細胞株が、最も高いレベルを示した。
一方、前記図5の全体的な結果を分析すると、両方ともに同じIRESを含むにもかかわらず、IRES-GSとIRES-GS PM間の発現レベルに大きな差があることが確認された。二つの遺伝子間に１個のアミノ酸の違いのみを示すため、実験初期においてはそれらの活性に大きな差がないことが予想がされた。実際に選択培地での培養が継続するにしたがいGSとGS PM間に差が見られた。
従って、GSとGS PM間の１個のアミノ酸の違いが発現レベルに大きな影響を与えるかを明確に調べるために、V40-GS PMベクターを用いて、全4種のベクター(IRES-GS、IRES-GS PM、SV40-GS 、SV40-GS PM)でトランスフェクトされた細胞株間のTNFR-Fcタンパク質の発現レベルを比較した(図7)。図7は、2次一過性トランスフェクト後のTNFR-Fcの発現レベル(上のグラフ)およびTNFR-Fcの発現レベルの経時的変化(下のグラフ)を示すグラフである。
その結果、図7の上のグラフのに示されるように、トランスフェクション後6日間、MSXを加えずに培養した細胞は、大部分、NFR-Fcの発現レベルは6000から9000ng/106cellsを示し、野生型であるIRES- GSおよびSV40-GSベクターでトランスフェクトされた細胞においてTNFR-Fcの発現レベルが相対的に増加した。しかし、図7の下のグラフに示されるように、トランスフェクション後3日が経過した後に細胞に25μMのMSXを処理し、トランスフェクション後20日経過した後には200μMのMSXを処理し、7日間さらに培養した場合には、25μMのMSXを加えた直後には1000ng/106cells以下のTNFR-Fcの発現レベルを示したが、時間の経過に伴い発現レベルが増加した。200μMのMSXを加えた後は、本発明のIRES-GS PMベクターでトランスフェクトされた細胞のみがTNFR-Fcの発現レベルの増加を示した。
前述の結果は、本発明の改変GSタンパク質が野生型GSタンパク質に比べてGS阻害剤に対する感受性を増過させ、前記改変GSタンパク質をコードするポリヌクレオチドと標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターは、標的タンパク質の生産に効果的であることを示唆している。
実施例7：安定してトランスフェクトされたCHO-S細胞におけるTNFR-Fcタンパク質の発現レベルの比較
実施例6の結果は、4種のGS発現ベクターのうちGSを含む発現ベクター(IRES-GS PMおよびSV40-GS PM発現ベクター)でトランスフェクトされた細胞株が、同一細胞数当たりのパク質発現がより高いレベルであることを示した。よって、安定したCHO-S細胞株における前記IRES-GS PMおよびSV40-GS PM発現ベクター間の発現レベルを比較した。組換えタンパク質を大量生産するために、CHO K-1の代わりに浮遊増殖に適したCHO-S細胞を採用し、安定した細胞株樹立のために使用した。
まず、IRES-GS PMまたはSV40-GS PM発現ベクターでトランスフェクトされたTNFR-Fc発現生産細胞株を樹立した。樹立した各TNFR-Fc発現細胞株を25μMまたは250μMのMSXを含む培地で培養し、それらから発現されるTNFR-Fcタンパク質の発現レベルを比較した(図8)。図8は、安定した細胞株においてIRES-GS PMベクターとSV4O-GS PMベクターを比較したグラフである。これに関連し、PCDはpg/ cell/ dayを意味し、下記の式により算出した。
PCD=発現レベル(ng / mL)/((AB)* Culture day/ LN(A/ B))/1000
A：Harvest cell conc.(x 106cells/ mL)
B：Seed cell conc.(x 106cells/ mL)
その結果、図8に示されるように、MSXの濃度に関係なく、IRES-GS PM発現ベクターでトランスフェクトされた細胞株のほうがSV40-GS PM発現ベクターでトランスフェクトされた細胞株に比べてTNFR-FCタンパク質のより高い発現レベルを示した。また、MSX250μMでの最大PCDは〜8 PCDであり、既存のIRES-DHFRシステムを用いて、限界希釈(limiting dilution)した単一の細胞株のPCDよりも高かった。8 PCDの細胞群から単一細胞株を選択する場合、8 PCDよりも高発現の細胞株が得られるであろう。
前記のような結果は、本発明の改変GS遺伝子を含むベクターを用いた発現システム、特に本発明の改変GS遺伝子を含むポリシストロニック(polycistronic)ベクターは、標的遺伝子を高効率で生産できることを立証する。
本発明を前述の好ましく、代替可能な実施態様を参照して具体的に説明したが、当該技術分野において通常の技術者は以下の請求の範囲に定義された本発明の思想と範囲を逸脱することなく、本発明を実施する上でここに記載された発明の実施態様に対するさまざまな代案を用いることができると理解されなければならない。以下の請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、したがって、これらの請求項の範囲内での方法および装置が含まれるものと解釈される。本発明のこのような説明は、ここに説明された構成要素がすべて新規で非自明な組み合わせを含むものとして理解されるべきであり、請求の範囲は、それらの構成要素の任意の新規で自明でない組合せの本適用または後続適用において提示すことができる。

Claims (16)

  1. 配列番号4のアミノ酸からなるグルタミン合成酵素において、299番目のグリシン(Gly、G)がアルギニン(Arg、R)に置換された、改変グルタミン合成酵素(GS)。
  2. グルタミン合成酵素阻害剤に対する感受性が配列番号4のアミノ酸配列からなるグルタミン合成酵素に比べ増加した、請求項１に記載の改変グルタミン合成酵素。
  3. 前記グルタミン合成酵素阻害剤が、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン、グルコサミン-6-リン酸(glucosamine-6-phosphate)、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate)、MSX(methionine sulphoximine)、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の改変グルタミン合成酵素。
  4. 請求項１に記載の改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
  5. 前記改変グルタミン合成酵素の299番目のアミノ酸をコードするDNAのコドンが、CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGからなる群から選択されるものである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 請求項４に記載のポリヌクレオチドおよび標的タンパク質をコードする遺伝子を含む、標的タンパク質発現用ベクター。
  7. 前記ポリヌクレオチドが、標的タンパク質の発現を増加させるためのものである、請求項６に記載のベクター。
  8. 前記標的タンパク質の発現増加が、グルタミン合成酵素阻害剤に対するGSの感受性を増強させることによって行われる 、請求項７に記載のベクター。
  9. 前記標的タンパク質が、TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc融合タンパク質である、請求項６に記載のベクター。
  10. 前記ベクターが、IRES(Internal ribosome entry site)をさらに含む、請求項６に記載のベクター。
  11. 前記ベクターが、5'側から3'側に標的タンパク質をコードする遺伝子、IRES(Internal ribosome entry site)、および改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、請求項１０に記載のベクター。
  12. 請求項６〜11のいずれか一項に記載のベクターを含む形質転換体。
  13. NS0細胞またはCHO細胞を形質転換体用宿主細胞とする、請求項１２に記載の形質転換体。
  14. 請求項１２に記載の形質転換体を培養するスッテプを含む、標的タンパク質の製造方法。
  15. グルタミン合成酵素阻害剤を培地に添加するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１４に記載の方法で製造された標的タンパク質。
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