CN113544273A - 合成的分子反馈回路及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了分子反馈回路以及编码这样的分子反馈回路的核酸和用主题分子反馈回路遗传修饰的细胞。还提供了使用分子反馈回路调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法和通过施用含有编码分子反馈回路的核酸的细胞来治疗受试者的病况的方法。本公开内容的分子反馈回路的方面包括信号传导途径的信号传导蛋白，其包含潜在失活结构域。这样的回路可以包含调节序列，所述调节序列响应信号传导途径的输出并且与编码开关多肽的核酸可操作地连接，所述开关多肽在表达时触发失活结构域以使信号传导分子失活。

Description

合成的分子反馈回路及其使用方法
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国防高级研究计划局授予的基金号HR0011-16-2-0045下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
交叉引用
本申请要求于2019年1月7日提交的美国临时申请系列号62/789,402的权益，该申请通过引用并入本文。
发明背景
常规地，细胞活动的所需的调节已经通过对细胞系统的重复的、用户提供的输入来控制。例如，在一些医学治疗的背景下，通过在治疗过程中给药药剂、评估、重新给药和重新评估的重复循环而在延长的时间段内实现受试者中细胞输出的所需水平。类似地，在生物生产应用和代谢工程化中，为了诱导生产细胞输出所需的产品产率，生长培养基被反复增加，例如，通过补充生长因子和/或去除有毒副产物。
近几十年来，工程化的细胞执行所需任务的能力以及产生这样的工程化的细胞的方法取得了巨大进步。例如，合成生物学和系统代谢工程化技术的最新进展提供了微生物细胞工厂用于以生态友好的方式从可再生生物质资源产生工业相关的大批量和精细化学品的潜力。此外，设计细胞疗法(例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法，其可针对各种用户定义的靶标)在临床上显示出巨大的前景，并正在获得广泛采用和持续的监管批准。
在没有进一步的用户输入的情况下，这样的工程化细胞的输出(例如，用于如上所述的各种目的)一旦施用至受试者或在生物反应器中调动时是恒定的。用于调节工程化细胞输出的调整使用外部输入(例如小分子形式)或其他刺激或用户执行的动作来进行。
发明内容
提供了分子反馈回路以及编码这样的分子反馈回路的核酸和用主题分子反馈回路遗传修饰的细胞。还提供了使用分子反馈回路调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法和通过施用含有编码分子反馈回路的核酸的细胞来治疗受试者的病况的方法。本公开内容的分子反馈回路的方面包括信号传导途径的信号传导蛋白，其包含潜在失活结构域。这样的回路可以包含调节序列，所述调节序列响应信号传导途径的输出并且与编码开关多肽的核酸可操作地连接，所述开关多肽在表达时触发失活结构域以使信号传导分子失活。
在任何实施方案中，信号传导蛋白不包含经笼罩的降解决定子(caged degron)。换言之，在任何实施方案中，信号传导蛋白不包含：(a)降解决定子，(b)包含五个α螺旋的锁结构域，和(c)包含α螺旋的闩锁结构域，其：(i)在不存在钥匙多肽的情况下，与锁结构域形成六螺旋束以笼罩降解决定子并防止信号传导蛋白的降解和(ii)在钥匙多肽存在的情况下，降解决定子被解笼罩并且信号传导蛋白被降解，其中钥匙多肽可以包含以比闩锁结构域更高的亲和力结合锁结构域的α螺旋。在临时申请系列号62/789,418(于2019年1月7日提交)、62/850,336(于2019年5月20日提交)和62/789,351(于2019年1月7日提交)中描述了这样的经笼罩的降解决定子分子，这些申请通过引用并入本文。
附图简要说明
图1示意性地描绘了如本文所述的信号传导途径。
图2示意性地描绘了如本文所述的具有附接至图1的信号传导途径的正调节成员的潜在失活结构域的信号传导途径。
图3描绘了如本文所述的图2的示意性描绘的信号传导途径中潜在失活结构域的活化。
图4示意性地描绘了如本文所述的具有附接至图1的信号传导途径的负调节成员的潜在失活结构域的信号传导途径。
图5示意性地描绘了如本文所述的采用合成Notch受体的分子反馈回路策略。
图6示意性地描绘了如本文所述的采用嵌合抗原受体(CAR)的分子反馈回路策略。
图7示意性地描绘了用于在本公开内容中描述的反馈回路的实例中控制反馈的各种策略。
图8示意性地描绘了用于控制本文描述的回路中的反馈的基于隔离的策略的实例。
图9提供了用于控制本文描述的回路中的反馈的基于隔离的策略的实例的替代描述。
图10展示了使用本公开内容的基于隔离的反馈回路的实例的反馈控制。
图11示意性地描绘了亮氨酸拉链转录因子和亮氨酸拉链转录因子的显性阴性抑制剂。
图12示意性地描绘了用于控制本文描述的回路中的反馈的基于竞争的策略的实例。
图13展示了使用本公开内容的基于竞争的反馈回路的实例的反馈控制。
图14提供了基于degronLOCKR的反馈回路或控制生物途径的示意性描述。
图15提供了使用degronLOCKR测试的一组交配途径调节剂。
图16表明degronLOCKR模块成功实现了交配途径的合成反馈控制。
图17提供了通过合成回路的控制量化的degronLOCKR反馈模块的操作特性。
图18提供了响应正面或负面干扰的稳态解决方案。
图19描绘了对于固定剂量的E2的作为Pg的函数的回路行为。
图20描绘了对于固定剂量的Pg的作为E2的函数的回路行为。
图21描绘了当组成性地表达不同数量的钥匙(key)时的回路行为。
图22表明DegronLOCKR合成反馈策略是可预测地可调谐的。
图23表明改变启动子强度或钥匙长度调节反馈增益。
图24表明调谐反馈强度改变回路输出的动态行为。
图25描绘了交配途径中合成反馈的组合调谐。
图26描述了使用nesLOCKR控制蛋白质定位。
图27描绘了当表达钥匙时nesLOCKR的胞质聚集。
图28显示了tagBFP的荧光直方图(左图)和mCherry的荧光直方图(右图)。
图29显示了无反馈和反馈回路图(上图)以及比较在存在和不存在药物的情况下两个回路的输出和钥匙荧光的代表性直方图(下图)。
图30显示了不同反馈变体的输出(左图)和没有反馈的回路和具有mCMV-钥匙的反馈回路的标准化输出(右图)的比较。
定义
如本文所用，术语“合成的”、“嵌合的”和“工程化的”一般是指非天然存在的人工衍生的多肽或多肽编码核酸。合成的多肽和/或核酸可以从基本子单元(包括例如单个氨基酸、单个核苷酸等)从头组装，或者可以衍生自预先存在的多肽或多核苷酸，无论是天然或人工衍生的，例如通过重组方法。嵌合和工程化多肽或多肽编码核酸通常将通过两个或更多个不同多肽或多肽编码核酸或多肽结构域或多肽结构域编码核酸的组合、连接或融合来构建。嵌合和工程化多肽或多肽编码核酸包括其中连接的两个或更多个多肽或核酸“部分”衍生自不同的蛋白质(或编码不同蛋白质的核酸)，以及其中连接的部分包含相同蛋白质(或编码蛋白质的核酸)的不同区域，但各部分以非天然存在的方式连接。
如本文所用，术语“重组”描述核酸分子，例如基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，其不与在自然界中与其缔合的全部或部分多核苷酸序列缔合。关于蛋白质或多肽使用的术语重组是指通过从重组多核苷酸表达产生的多肽。关于宿主细胞或病毒使用的术语重组是指其中已引入重组多核苷酸的宿主细胞或病毒。关于材料(例如细胞、核酸、蛋白质或载体)，重组在本文中还用于指材料已通过引入异源材料(例如细胞、核酸、蛋白质或载体)修饰。
术语“可操作地连接”是指这样的并列，其中如此描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响其转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。可操作地连接的核酸序列可以但不一定是相邻的。例如，在一些情况下，与启动子可操作地连接的编码序列可以与启动子相邻。在一些情况下，与启动子可操作地连接的编码序列可以被一个或多个间插序列(包含编码和非编码序列)隔开。此外，在一些情况下，可以可操作地连接多于两个序列，包括但不限于，例如，其中两个或更多个编码序列可操作地连接至单个启动子。
“生物样品”包括从个体或个体群体获得的多种样品类型并且可以以各种方式使用，包括例如细胞或生物分子的分离、诊断测定等。该定义包括血液和生物来源的其他液体样品，固体组织样品，例如活检标本或组织培养物或从中衍生的细胞及其后代。该定义还包括在采购后以任何方式处理过的样品，例如通过混合或汇集个体样品，用试剂处理，溶解，或富集某些组分，例如细胞、多核苷酸、多肽等。该术语“生物样品”包括临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊液、间质液、眼液、滑液、血液级分例如血浆和血清等。术语“生物样品”还包括实体组织样品、组织培养样品和细胞样品。因此，生物样品可以是细胞样品或无细胞样品。
在本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包含遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学的修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列(具有或不具有N末端甲硫氨酸残基)的融合体；免疫标记的蛋白；等等。
“载体”或“表达载体”是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，其可以与另一个DNA区段即“插入物”附接，以引起附接的区段在细胞中的复制。
术语“结构域”和“基序”在本文中可互换使用，是指具有一种或多种特定功能的结构化结构域和多肽的非结构化区段，其尽管是非结构化的，但保留一种或多种特定功能。例如，结构化结构域可包括但不限于折叠多肽中连续或不连续的多个氨基酸或其部分，其包含促成多肽的特定功能的三维结构。在其他情况下，结构域可包含多肽的非结构化区段，该区段包含多个的两个或更多个氨基酸或其部分，其维持未折叠或无序的多肽的特定功能。该定义还包括可能是无序或非结构化的但在与靶标或结合配偶体缔合后变为结构化或有序的结构域。固有非结构化结构域和固有非结构化蛋白质的结构域的非限制性实例描述于例如Dyson&Wright.Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:197-208中。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数并表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比针对不相关氨基酸序列的抗体的亲和力大至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更多。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或者更多。
术语“结合”是指由于例如共价键、静电键、疏水键和离子键和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)导致的两个分子之间的直接缔合。非特异性结合是指以小于约10-7M的亲和力结合，例如以10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力结合。
如本文所用，术语“治疗”、“医治”等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。该作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响方面可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(例如人类)中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠类(例如大鼠、小鼠)、兔类动物(例如兔)、非人类灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”是指一种药剂的量或两种药剂的组合量，当施用至哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时，其足以实现对疾病的这样的治疗。“治疗有效量”将取决于药剂、疾病及其严重程度和要治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
在本文中可互换使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指能够触发或抑制免疫细胞活化的人工多模块分子，其通常但不排他地包含细胞外结构域(例如，配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。术语CAR不特别地限于CAR分子，而是还包括CAR变体。CAR变体包括分裂的CAR，其中CAR的细胞外部分(例如，配体结合部分)和细胞内部分(例如，细胞内信号传导部分)存在于两个单独的分子上。CAR变体还包括ON-开关CAR，其是条件性可活化CAR，例如包括分裂的CAR，其中分裂的CAR的两个部分的条件性异二聚化是药理学控制的(例如，如PCT公开号WO2014/127261A1和美国专利申请号2015/0368342A1中所述，其公开内容通过引用整体并入本文)。CAR变体还包括双特异性CAR，它包含可以放大或抑制初级CAR的活性的次级CAR结合结构域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其可以例如用作双特异性CAR系统的组分，其中次级CAR结合结构域的结合导致初级CAR活化的抑制。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)描述于例如PCT申请号US2014/016527；Fedorov等人Sci Transl Med(2013)；5(215):215ra172；Glienke等人FrontPharmacol(2015)6:21；Kakarla&Gottschalk 52Cancer J(2014)20(2):151-5；Riddell等人Cancer J(2014)20(2):141-4；Pegram等人Cancer J(2014)20(2):127-33；Cheadle等人Immunol Rev(2014)257(1):91-106；Barrett等人Annu Rev Med(2014)65:333-47；Sadelain等人Cancer Discov(2013)3(4):388-98；Cartellieri等人,J BiomedBiotechnol(2010)956304；其公开内容通过引用整体并入本文。有用的CAR还包括由慢病毒加载的CTL019(Tisagenlecleucel-T)CAR-T细胞(由Novartis(Basel,Switzerland)商品化)表达的抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR。术语“嵌合抗原受体”和“CAR”还包括SUPRA CAR和PNECAR(参见，例如，Cho等人Cell 2018 173:1426-1438和Rodgers等人,Proc.Acad.Sci.2016113:E459-468)。
术语“T细胞受体”和“TCR”可互换使用，并一般指在T细胞或T淋巴细胞表面上发现的分子，其负责将抗原的片段识别为与主要组织相容性复合(MHC)分子结合的肽。TCR复合物是通常由表达为与CD3链分子的复合物的一部分的高度可变的α(alpha)和β(beta)链组成的二硫键连接的膜锚定异二聚体蛋白。许多天然TCR以异二聚体αβ或γδ形式存在。异二聚体αβ形式中的完整内源性TCR复合物包含八条链，即α链(本文中称为TCRα或TCRα)、β链(本文中称为TCRβ或TCRβ)、δ链、γ链、两条ε链和两条ζ链。在一些情况下，TCR通常仅指TCRα和TCRβ链，然而，由于组装的TCR复合物可能与内源性δ、γ、ε和/或ζ链缔合，因此普通技术人员将容易理解提及存在于细胞膜中的TCR可酌情包括提及完全或部分组装的TCR复合物。
已经开发了重组的或工程化的个体TCR链和TCR复合物。提及在治疗环境中使用TCR可能是指单独的重组TCR链。因此，工程化的TCR可以包括单独的修饰的TCRα或修饰的TCRβ链以及包含通过连接多肽连接成单个多肽的修饰和/或未修饰的TCRα和TCRβ链的单链TCR。
在本文中可互换使用的术语“合成的Notch受体”、“synNotch”和“synNotch受体”是指重组嵌合结合触发的转录开关，其至少包含：胞外结合结构域、包含至少一个蛋白水解裂解位点的Notch受体的一部分和提供信号传导功能的细胞内结构域。SynNotch多肽、其组分和使用它们的方法描述于美国专利号9,834,608和9,670,281以及Toda等人,Science(2018)361(6398):156-16；Roybal&Lim,Annu Rev Immunol.(2017)35:229-253；Lim&JuneCell.(2017)168(4):724-740；Roybal等人Cell.(2016)167(2):419-432.e16；Roybal等人Cell.(2016)164(4):770-9；和Morsut等人Cell.(2016)164(4):780-91中；其公开内容通过引用整体并入本文。
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，这里使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一)和该所述范围中的任何其他所述的或中间的值包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围内，并且也包含在本发明内，受所述范围内的任何具体排除的限值的限制。在所述范围包含一个或两个限值的情况下，不包含这些包含的限值之一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与引用这些出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个回路”包括多个这样的回路并且提及“所述核酸”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种核酸及其等价物，等等。进一步注意，权利要求可以被起草以排除任何可选元素。因此，本声明旨在用作与权利要求要素的叙述相关联的诸如“仅”、“只有”等专有术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明具体地包含并且在本文中公开，就像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案的所有子组合及其要素也被本发明具体地包含并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合在本文中被单独地和明确地公开一样。
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详细描述
提供了分子反馈回路以及编码这样的分子反馈回路的核酸和用主题分子反馈回路遗传修饰的细胞。还提供了使用分子反馈回路调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法和通过施用含有编码分子反馈回路的核酸的细胞来治疗受试者的病况的方法。本公开内容的分子反馈回路的方面包括信号传导途径的信号传导蛋白，其包含潜在失活结构域。这样的回路可以包含调节序列，所述调节序列响应信号传导途径的输出并且与编码开关多肽的核酸可操作地连接，所述开关多肽在表达时触发失活结构域以使信号传导分子失活。
分子回路
在一些情况下，本公开内容的分子回路可以全部或部分地由核酸序列编码。在一些情况下，这样的回路可以存在和/或配置在表达载体和/或表达盒中。在一些情况下，本发明的回路的主题核酸可以包含在载体(包括例如病毒和非病毒载体)内。在一些情况下，这样的回路可以存在于细胞(例如免疫细胞、干细胞等)中，或者可以通过各种方式引入细胞中，包括例如通过使用病毒载体。在一些情况下，细胞可以被遗传修饰以包含和/或编码主题回路，其中这样的修饰可以根据需要是有效地永久的(例如，整合的)或瞬时的。
本公开内容的回路(其组分是模块化的)可以包含含有潜在失活结构域的信号传导蛋白。如本文所用，术语“信号传导蛋白”通常是指下文更详细描述的信号传导途径(包括天然和合成信号传导途径)的蛋白质。可以使用任何方便的信号传导途径的任何方便和合适的信号传导蛋白。通常，信号传导蛋白包括可以通过与信号传导蛋白相关的信号传导途径的输入活化的蛋白质。信号传导途径可以产生依赖于信号传导蛋白的功能或至少受信号传导蛋白的功能影响的输出。这样的输出可能是信号传导蛋白对输入的反应的直接或间接结果。有用的信号传导蛋白包括来自信号传导途径中的任何方便和适当的点的成员，包括输入接收成员、中间成员和输出产生成员。
如本文所用，“输入接收成员”通常是指信号传导途径的初始组分，其接收输入以启动沿该途径的信号传导。输入接收成员的实例包括但不限于例如细胞外受体(例如G蛋白偶联受体、蛋白激酶、整联蛋白、toll样受体、配体门控离子通道等)和细胞内受体(例如，核受体、细胞质受体等)。在一些情况下，输入接收成员可以是直接结合信号传导途径的输入例如信号传导途径的配体输入的蛋白质。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以是输入接收成员。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以不是输入接收成员，例如，它可以是中间成员或输出产生成员。
如本文所用，“中间成员”通常是指信号转导所需或至少参与信号转导但不直接接收初始输入或直接产生或导致信号传导途径的最终输出。信号传导途径的中间成员的实例包括但不限于例如酶、结合配偶体、蛋白质复合物亚基、支架蛋白、转运蛋白、共活化剂、共阻遏物等。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以是中间成员。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以不是中间成员，例如，它可以是输入接收成员或输出产生成员。
如本文所用，“输出产生成员”通常是指直接产生信号传导途径的输出或以其他方式引起信号传导途径的输出发生的信号传导途径的组分。信号传导途径的输出产生成员的实例包括但不限于例如DNA结合蛋白，例如转录因子、酶等。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以是输出产生成员。在一些情况下，在本公开内容的回路中的包含潜在失活结构域的信号传导蛋白可以不是输出产生成员，例如，它可以是输入接收成员或中间成员。
图1中描绘了信号传导途径的示意性实例。如所示的，信号传导途径包含活化途径的输入接收成员101的输入100。输入接收成员101的活化正调节途径的第一中间成员102，其正调节途径的第二中间成员103。在所描绘的途径中，第二中间成员103被第三中间成员104负调节。在没有第三中间成员104的抑制的情况下，第二中间成员103正调节途径的输出产生成员105。因此，在存在通过第二中间成员103的活化的情况下，输出产生成员105是有活性的并且结合可操作地连接至编码信号传导途径的输出的序列106的调控区107。
有用的信号传导蛋白可以是与信号传导蛋白相关的信号传导途径的一种或多种调节剂，包括其中信号传导蛋白可以是信号传导途径的负调节剂或信号传导途径的正调节剂。因此，本公开内容的分子反馈回路包括正反馈回路和负反馈回路。
例如，在一些情况下，在本公开内容的回路中采用的信号传导蛋白可以在被活化时驱动信号传导途径的输出。因此，触发潜在失活结构域以使信号传导蛋白失活可能负调节信号传导途径的输出，从而导致负反馈。在一些情况下，本公开内容的回路中采用的信号传导蛋白在被活化时可以抑制信号传导途径的输出。因此，触发潜在失活结构域以使信号传导蛋白失活可以正调节信号传导途径的输出，从而导致正反馈。
图2描绘了图1中呈现的信号传导途径，其中正调节途径的第一中间信号传导成员102已被修饰以包含潜在失活结构域200。因此，当潜在失活结构域200保持在潜伏状态时，通过信号传导途径的信号传导从输入100出发，通过输入接收成员101，到达第一中间信号传导成员102，它正调节途径的下游组分，使得在没有通过第三中间成员(未图示)的抑制的情况下，输出产生元件105驱动信号传导途径的输出，描述为由序列106编码的产物的表达。
如图3所示，表达的开关多肽300活化潜在失活结构域200，导致第一中间成员102失活，因此缺乏从第一中间成员102到第二中间成员103的正向信号传导和途径的后续点。因此，不产生或减少了来自序列106的输出。
在另一个实例中，如图4所示，潜在失活结构域400附接至抑制性第三中间成员104。因此，当潜在失活结构域400保持在潜伏状态时，第三中间成员104的存在负调节第二中间成员，从而抑制由输出序列106编码的产物的表达和产生。相应地，当潜在失活结构域400被表达的开关多肽401活化时，第三中间成员104失活，从而防止第三中间成员104的负调节并正调节途径100以促进输出的产生，即至少增加由序列106编码的产物的表达。
当与开关多肽整合时，其表达由信号传导途径的输出驱动，将潜在失活结构域偶联到途径的信号传导蛋白可根据需要提供正反馈或负反馈。例如，将潜在失活结构域与正信号传导调节剂偶联在该途径上产生负反馈，而将潜在失活结构域与负调节剂偶联在该途径上产生正反馈。在一些情况下，负途径反馈可用于抑制反应，而在一些情况下，正途径反馈可用于放大反应或产生超灵敏度。将明显的是，本公开内容的反馈回路是高度模块化的，因此，本文描述的回路可以根据需要容易地修改和/或应用于基本上任何方便和适当的信号传导途径，包括例如具有经由启动子的可测量输出的信号传导途径。
反馈控制通过干扰抑制实现物理过程的稳健、稳定的性能。反馈控制的实现通常可包括：(1)测量或“传感”过程的输出的能力，(2)基于输出测量针对所需输出或“设定点”的比较生成校正信号的控制器，以及(3)向要控制的过程输入或“驱动”校正信号的方法。本文提供了设计的回路，其利用基于潜在失活结构域的蛋白质开关(由表达的开关多肽触发)，以产生生物系统的反馈控制。具体来说，与上述模块类似的三个模块：(1)由感兴趣的过程的输出活化的传感启动子，(2)由活化(3)与潜在失活结构域融合的信号传导蛋白(即，转录因子、激酶等)的降解的传感启动子产生的开关肽。这些模块中的每一个都可以根据需要通过简单的操作独立地调整以实现过程的所需反馈控制。
可用于本公开内容的回路中的信号传导蛋白包含作为信号传导途径的内源组分以及信号传导途径的异源或合成组分的信号传导蛋白。信号传导途径的这样的内源性、异源性和/或合成组分可以被修饰以包含潜在失活结构域以用于本公开内容的回路中，如下文更详细描述的。“信号传导途径的内源性组分”通常是指在细胞中天然存在的信号传导途径的组分。
“信号传导途径的异源组分”通常是指在信号传导途径中起作用但源自不同于其在主题回路中所用于的细胞或信号传导途径的组分。异源组分可以源自与主题回路的信号传导途径分开的信号传导途径。异源组分可以源自与主题回路中调节的信号传导途径的细胞和/或生物体不同类型的细胞和/或不同生物体。例如，在一些情况下，来自第一生物体(例如，小鼠)的信号传导途径的组分可用于第二生物体(例如，人)的相应信号传导途径中。
“信号传导途径的合成组分”通常是指在信号传导途径中起作用但非天然衍生的组分。非天然衍生的组分可包含重组组分，包括例如类似物、模拟物、融合物、突变体、截短形式、片段等。信号传导途径的合成组分的非限制性实例包括合成受体、合成酶、合成共活化剂、合成共阻遏物、合成结合配偶体、合成支架蛋白、合成转录因子等。
本公开内容的回路可采用一种或多种调节序列，其的控制可取决于与信号传导蛋白相关的信号传导途径的组分。例如，在一些情况下，本公开内容的回路可以包含响应信号传导途径的输出的调节序列。调节序列可以与编码主题回路的一种或多种组分的一种或多种核酸序列可操作地连接。例如，调节序列可以与编码开关多肽的核酸序列可操作地连接。
在一些情况下，回路可以包含与编码信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列。与编码主题回路的信号传导蛋白的序列可操作地连接的调节序列可以变化并且可以包含内源和异源调节序列，包括但不限于例如天然启动子、天然增强子、异源启动子、异源增强子、合成调节序列等。与编码信号传导蛋白的序列可操作地连接的调节序列可以根据需要是组成性的或诱导性的。在一些情况下，与编码信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列是信号传导蛋白的天然启动子。
在一些情况下，调节序列可包含一个或多个结合位点(例如，1个或多个、2个或更多个、2至10个、3至10个、4至10个、5至10个、2至6、3至6个、4至6个、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)用于输出的转录因子，包括例如，其中转录因子是在信号传导途径中起作用的内源的、异源的或合成的转录因子。
本公开内容的回路的调节序列可由信号传导途径的输出控制或以其他方式响应于信号传导途径的输出。例如，在一些情况下，主题回路被配置用于影响的信号传导途径的输出可以通过与编码序列可操作地连接的调节序列诱导编码序列的表达。通过将编码本公开内容的回路的组分的序列的调节连接到信号传导途径的输出，本公开内容的回路可以提供响应于输出的反馈。
在本公开内容的回路中采用的有用的信号传导途径输出可以变化并且可以基本上包括可以被配置用于通过调节序列直接或间接影响表达的任何输出。有用的信号传导途径输出的非限制性实例包括但不限于例如转录因子的活性(例如活化、抑制等)、转录因子的表达、转录因子的易位、酶的活性(例如活化、抑制等)、酶的表达、信号传导分子的产生、信号传导分子的分泌、细胞活化(包括例如天然细胞程序的活化，例如但不限于例如免疫活化、免疫抑制、增殖等)等。
信号传导途径可以通过一种或多种输入来调节(例如，活化、抑制等)。信号传导途径的输入可以变化并且可以包含信号传导途径的内源性(例如，天然的)输入和异源性(例如工程化的或合成的)信号传导途径的输入。由于信号传导途径和信号传导途径输出可以是天然的或合成的，信号传导途径输入同样可以是天然的或合成的。
在许多情况下，天然信号传导途径可以由该途径的天然或自然受体控制。天然信号传导途径的非限制性实例包括但不限于例如AKT信号传导途径、Akt/PKB信号传导途径、AMPK信号传导途径、凋亡信号传导途径、BMP信号传导途径、cAMP依赖性途径、雌激素信号传导途径、hedgehog信号传导途径、hippo信号传导途径、免疫活化途径、免疫抑制途径、免疫细胞分化途径、胰岛素信号转导途径、JAK-STAT信号传导途径、MAPK/ERK信号传导途径、mTOR信号传导途径、NF-κB信号传导途径、节点信号传导途径、notch信号传导途径、p53信号传导途径、PI3K信号传导途径、TGFβ信号传导途径、TLR信号传导途径、TNF信号传导途径、VEGF信号传导途径、Wnt信号传导途径等。
合成信号传导途径的非限制性实例包括但不限于由合成或工程化受体(例如但不限于例如CAR、工程化TCR、synNotch等)控制的那些信号传导途径。下文更详细地描述了这些信号传导途径。
使用本公开内容的回路调节合成synNotch信号传导途径和合成CAR信号传导途径的示意性实例分别在图5和图6中描述。如图5所示，具有抗原结合结构域501、可蛋白水解裂解的Notch结构域502和包含合成转录因子(synTF)部分503和潜在失活结构域504的细胞内信号传导结构域的synNotch受体500由抗原输入505触发以释放细胞内信号传导结构域。抗原结合后synNotch的细胞内信号传导结构域的释放诱导了由synTF控制的所需输出506的表达。在图示的实施方案中，synTF输出还控制开关多肽508的表达507。因此，当synNotch的释放的细胞内信号传导结构域诱导开关多肽的表达时，开关多肽508活化潜在失活结构域504以失活synNotch受体的包含synTF的细胞内信号传导结构域。因此，通过提供通过合成synNotch信号传导途径的负反馈，生成了受控的定制输出。
如图6所示，CAR 600由抗原输入601与抗原结合结构域602的结合触发以诱导内部信号传导级联，例如通过经由CAR 600的CD3z结构域603的免疫刺激性信号传导导致免疫细胞活化。CAR 600还包含附接的潜在失活结构域604，并且细胞包含调节序列，其可操作地连接至编码开关多肽的序列605，该开关多肽响应内部信号传导级联的组分。因此，内部信号传导级联的活化诱导所需输出606的表达，例如免疫细胞活化和/或由CAR控制的所需免疫因子的表达。然而，在图示的实施方案中，CAR输出还控制开关多肽607的表达。因此，当信号传导级联诱导开关多肽607的表达时，开关多肽607活化潜在失活结构域604，其使CAR失活。因此，通过提供通过合成CAR信号传导途径的负反馈，T细胞活化得到控制。
将明显的是，这些采用合成信号传导途径的实例并非旨在进行限制。
潜在失活结构域和开关多肽
如上所述，在本公开内容的回路中采用的信号传导蛋白可以包含潜在失活结构域。包含在本发明的回路的主题信号传导蛋白中的潜在失活结构域可以变化并且可以根据需要附接或以其他方式整合到信号传导蛋白中。可以使用将潜在失活结构域附接或整合到主题信号传导蛋白中的任何方便的方法，包括但不限于，例如，其中潜在失活结构域通过接头附接。
在不存在开关多肽的情况下，潜伏的失活结构域保持在潜伏状态，这意味着失活结构域不会使与其缔合的信号传导蛋白失活。在开关多肽存在的情况下，潜在失活结构域被活化并随后使与其缔合的信号传导蛋白失活。用于失活的策略将有所不同，并且可以包括但不限于例如诱导性降解、诱导性定位、蛋白质分裂等。开关多肽可以相应地变化并且可以包括但不限于例如诱导潜在失活结构域的降解的多肽、诱导潜在失活结构域的定位的多肽、诱导潜在失活结构域的分裂的多肽等。
如上所述，潜在失活结构域包含诱导性降解结构域。如本文所用，“诱导性降解结构域”通常是指在开关多肽的表达后能够调节(例如，增强、增加等)与诱导性降解结构域附接或变得与诱导性降解结构域缔合的多肽(例如信号传导蛋白)的降解的结构域。当相应的开关多肽不表达时，诱导性降解结构域通常将不调节(例如，增强、增加等)主题信号传导蛋白的降解。因此，降解结构域通常将是潜伏的，直到被开关多肽的表达活化以诱导与其附接或变得与其缔合的多肽的降解。与降解结构域附接或变得与降解结构域缔合的多肽(例如信号传导蛋白)的降解使多肽失活。
包含诱导性降解结构域的潜伏失活结构域的构型将变化，相应的开关多肽也将变化。在一些情况下，降解结构域可包含降解决定子。在一些情况下，诱导性降解结构域可以包含防止与降解结构域附接的多肽(例如，信号传导蛋白)的降解的保护结构域。受保护结构域保护的降解结构域可以被开关多肽脱保护，使得降解结构域变得有活性以触发附接的或以其他方式缔合的多肽的降解。
例如，在一些实施方案中，附接至信号传导蛋白的降解结构域可以被保护结构域保护，该保护结构域包含可被开关多肽中包含的蛋白酶裂解的蛋白水解裂解位点。在不存在开关多肽的情况下，蛋白酶不存在并且保护结构域防止降解结构域触发信号传导蛋白的降解。在开关多肽存在的情况下，蛋白酶裂解蛋白水解裂解位点，使降解结构域脱保护并引发信号传导蛋白的降解。
在一些实施方案中，开关多肽可包含蛋白酶，例如烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶，其将裂解存在于与信号传导蛋白附接的诱导性失活结构域上的N-或C-末端序列。通过蛋白酶的裂解暴露了N末端或C末端降解决定子，其随后触发信号传导蛋白的降解。因此，在不存在含有TEV蛋白酶的开关多肽的情况下，降解决定子保持隐藏状态并且不会诱导信号传导蛋白的降解。在一些情况下，可用于蛋白酶诱导性降解结构域系统的组分和配置可包含在Gao等人,Science.2018；361(6408):1252-1258(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的CHOMP(被攻击的正交模块蛋白酶的回路)系统。如将容易理解的，在一些情况下，其他降解决定子和/或其他编码的蛋白酶可以替代明确描述的那些。
在一些实施方案中，诱导的降解可以通过将降解序列连接到靶信号传导蛋白来实现。例如，在一些情况下，当两种肽都存在时彼此结合的两种肽可用于以诱导性方式将降解序列连接到靶信号传导分子。在一些情况下，肽彼此的结合可以是共价的。在一些实施方案中，结合标签结合结构域的标签肽可以被掺入靶信号传导蛋白中，并且开关蛋白可以被配置为包含具有附接的降解序列(例如组成性降解决定子)的标签结合结构域。在表达这样的开关蛋白时，标签和标签结合结构域彼此结合，从而将降解序列附接至靶信号传导蛋白并诱导信号传导蛋白的降解。很容易理解，在一些情况下，标签和标签结合结构域可以互换，即结合标签肽的标签结合结构域可以掺入靶信号传导蛋白中，并且开关蛋白可以被配置为包含具有附接的降解序列的标签肽。
可用于这些和类似实施方案中的彼此结合的肽的有用实例包含SpyCatcher和SpyTag。术语“SpyTag”和“SpyCatcher”(“Spy”指的是化脓性链球菌)是指一种方便的蛋白质偶联工具，它可以比普通蛋白质-蛋白质相互作用更有效地连接两个多肽。SpyTag/SpyCatcher系统可用于结合、标记或固定蛋白质，因为它产生不可逆的肽连接。SpyTag是一种基因编码的肽，其在与其基因编码的配偶体SpyCatcher结合后形成自发的酰胺键。SpyTag与SpyCatcher在广泛范围的条件下反应，并且反应后的产物极其稳定。SpyCatcher和SpyTag描述于Zakeri等人,(Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(12):E690-7)和PCT公开号WO/2017/112784中；其公开内容通过引用整体并入本文。
可适用于在本公开内容的回路中将降解信号诱导性地连接或以其他方式缔合到靶信号传导蛋白的蛋白质偶联策略的有用实例还包括PROTAC。蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)是双头大分子，其包含结合靶蛋白的第一个结构域和能够与E3泛素连接酶结合的第二个结构域。采用PROTAC进行可适用于本文所述的回路和方法的靶向降解的方法包括但不限于例如描述于以下中的那些：Raina&Crews,J Biol Chem.(2010)285(15):11057-60；Raina&Crews,Curr Opin Chem Biol.(2017)39:46-53；Coleman&Crews,Annual Review ofCancer Biology(2018)2:41-58；Bondeson等人,Cell Chemical Biology(2018)25(1):78-87；Neklesa等人,Pharmacology&Therapeutics.(2017)174:138-144；其公开内容通过引用整体并入本文。泛素体和肽PROTAC描述于例如Ludwicki等人,ACS Central Science 20195:852-866；Portnoff等人,J.Biol.Chem.2014 289:7844-7855；Fan等人,NatureNeuroscience 2014 17:471 480；和Hines等人,Proc.Natl.Acad.Sci.2013 110:8942-8947。
如将容易理解的，用于将降解信号诱导地连接到本公开内容的回路中的靶信号传导蛋白的策略和组分可能不限于本文具体描述的那些策略和组分，并且在一些情况下可以适应用于所描述的回路的其他蛋白质偶联系统。
在一些实施方案中，在本公开内容的回路中采用的诱导降解策略可以包括包含在靶信号传导蛋白中的降解决定子的磷酸化。例如，可以被激酶磷酸化的降解决定子可以被掺入到靶信号传导蛋白中并且开关多肽可以包含激酶。因此，在开关多肽表达时，激酶磷酸化降解决定子，引发靶信号传导蛋白的降解。相应地，当开关多肽不表达时，激酶不存在，降解决定子不磷酸化，并且靶信号传导蛋白不降解。
可适用于本公开内容的回路的基于磷酸化的诱导降解策略的有用实例包括但不限于例如模块化-磷酸-降解决定子策略，例如由Gordley等人,PNAS(2016)113(47):13528–13533描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。例如，模块化磷酸-降解决定子可能包含Tec1转录因子的延伸区域，该区域被Fus3丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化，诱导性结合酵母Cdc4 E3泛素连接酶复合物，并包含促进泛素化的额外的多聚赖氨酸区域。磷酸-降解决定子可包含突变优化的Cdc结合区，其在MAPK活化后导致附接的多肽的快速降解。因此，靶信号传导蛋白可以被配置为包含模块化磷酸-降解决定子并且开关多肽可以被配置为包含MAPK。因此，在开关多肽表达后，磷酸-降解决定子被MAPK磷酸化，随后泛素化，导致靶信号传导蛋白降解。当开关多肽不存在时，磷酸-降解决定子不被磷酸化，并且靶信号传导蛋白不被降解。
如将容易理解的，用于本公开内容的回路中的靶信号传导蛋白的磷酸化依赖性诱导性降解的策略和组分可能不限于本文具体描述的那些策略和组分，并且在一些情况下可以适应用于所描述的回路的其他磷酸化依赖系统。
在一些实施方案中，在本公开内容的回路中采用的诱导降解策略可以包含正交蛋白酶体系统。例如，开关多肽可以被配置为包含与表达开关多肽的细胞类型异源的蛋白酶体(即异源蛋白酶体)，并且靶向的信号传导蛋白可以被配置为包含特异性针对该异源蛋白酶体的降解标签。因此，蛋白酶体和降解标签可以构成正交对，使得带标签的信号传导蛋白仅被异源蛋白酶体降解(即，标签不诱导通过任何宿主衍生的(内源性)蛋白质降解机制的靶向信号传导蛋白的降解)。
可以使用各种正交蛋白酶体/标签对，例如，取决于被修饰以包含回路的细胞。例如，在真核细胞中，正交蛋白酶体/标签对可以包含原核蛋白酶体和原核降解标签，该原核降解标签发出通过原核蛋白酶体降解的信号。在原核细胞中，正交蛋白酶体/标签对可以包含真核蛋白酶体和真核降解标签，该真核降解标签发出通过真核蛋白酶体降解的信号。在一些情况下，正交蛋白酶体/标签对可以合成地衍生，例如通过蛋白酶体和/或标签的突变以使该对正交。在一些情况下，跨物种蛋白酶体/标签对可用于正交蛋白酶体系统，例如源自第一物种(例如第一细菌物种、第一真核生物物种等)的蛋白酶体和降解标签用于第二物种(例如，第二细菌物种、第二真核生物物种等)。
可适用于本公开内容的回路的正交蛋白酶体系统的有用的实例包括但不限于例如源自细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、M.florum等)的那些，例如但不限于例如ClpXP蛋白酶体和ssrA标签系统、mfLon蛋白酶体和pdt标签系统等。可适用于本公开内容的回路的有用的系统和组分包括但不限于例如在Cameron&Collins,Nat Biotechnol.2014；32(12):1276–1281和Grilly等人,Molecular Systems Biology.2007；3:127中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。因此，在一些情况下，开关多肽可以包含正交蛋白酶体/标签对的蛋白酶体，并且靶向的信号传导蛋白可以包含正交蛋白酶体/标签对的降解标签。可以将采用正交蛋白酶体/标签对的回路引入细胞中，其中蛋白酶体和/或标签对于细胞是异源的(即，非内源性的)。
如将容易理解的，用于本公开内容的回路中的靶信号传导蛋白的基于正交蛋白酶体的诱导性降解的策略和组分可能不限于本文具体描述的那些策略和组分，并且在一些情况下可以适应用于所描述的回路的其他正交蛋白酶体系统。
在一些实施方案中，在本公开内容的回路中采用的诱导降解策略可以包含诱导定位到蛋白酶体的系统。例如，在一些实施方案中，开关多肽可以包含这样的结构域，该结构域在表达时使信号传导蛋白定位或可以被诱导以使信号传导蛋白定位到蛋白酶体，从而诱导信号传导蛋白的降解。在一些情况下，信号传导蛋白到蛋白酶体的诱导定位可能是泛素非依赖性的。换句话说，将信号传导蛋白诱导定位到蛋白酶体可能绕过泛素化步骤。
作为一个实例，开关多肽被配置为包含与蛋白酶体融合的二聚化对的第一个成员，并且靶信号传导蛋白被修饰为包含二聚化对的第二个成员。二聚化对的第一个和第二个成员可以直接相互结合(即，可以直接二聚化)或可以通过二聚化介体(即，二聚化剂)二聚化。可以选择能够彼此形成复合物的任何两个方便的多肽结构域用作第一和第二二聚化结构域。例如，在二聚化对的第一个和第二个成员直接相互结合的情况下，包含与蛋白酶体融合的二聚化对的第一个成员的开关多肽的表达通过二聚化对的第一个和第二个成员之间的直接结合诱导靶信号传导蛋白定位到蛋白酶体，从而导致信号传导蛋白的降解。当开关多肽不表达时，靶信号传导蛋白不定位到蛋白酶体。
在二聚化对的第一个和第二个成员通过二聚化介体二聚化的情况下，靶向的信号传导蛋白(包含二聚化对的第二个成员)可以在存在包含与蛋白酶体融合的二聚化对的第一个成员的开关多肽和二聚化介体的情况下定位到蛋白酶体。因此，当使用二聚化的化学诱导剂(CID)来诱导蛋白酶体融合的开关多肽和靶向的信号传导蛋白的二聚化时，CID的存在或不存在可以分别控制回路是否能够或不能够产生反馈。在采用直接相互结合的二聚化结构域时，反馈的产生可能与任何二聚化诱导分子的存在无关。
作为诱导的降解的诱导定位到蛋白酶体策略的非限制性实例，Fprl(已显示与亲脂性大环内酯雷帕霉素以高亲和力结合的肽)融合(例如，C-末端融合)至蛋白酶体亚基以及Tor1的配体结合结构域(其结合Fpr1结合的雷帕霉素)融合至靶信号传导蛋白。在雷帕霉素的存在下表达Fpr1标记的蛋白酶体亚基后，Tor1标记的信号传导蛋白定位于蛋白酶体，导致信号传导蛋白的定位诱导的降解。在一些情况下，Fpr1和Tor1可以替代直接相互结合的二聚化结构域，从而消除二聚化介体(例如，雷帕霉素)的必要性。在一些情况下，直接二聚化对的二聚化结构域可以被取代，从而不需要二聚化介体。可适用于本公开内容的回路的诱导蛋白酶体定位策略以及Fpr1和Tor1结构域的实例包括但不限于例如Janse等人,JBiol Chem.2004；279(20):21415-20中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。
有用的二聚化结构域的非限制性实例包括但不限于iDimerize诱导性同源二聚体(例如DmrB)和异源二聚体系统(例如DmrA和DmrC)和iDimerize反向二聚化系统(例如，DmrD)(Takara Bio Inc.)的蛋白质结构域(还参见Clackson等人,(1998)Redesigning anFKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(18):10437–10442；Crabtree,G.R.&Schreiber,S.L.(1996)Three-part inventions:intracellular signaling and induced proximity.TrendsBiochem.Sci.21(11):418–422；Jin等人,(2000)In vivo selection using a cell-growth switch.Nat.Genet.26(1):64–66；Castellano等人,(1999)Induciblerecruitment of Cdc42or WASP to a cell-surface receptor triggers actinpolymerization and filopodium formation.Curr.Biol.9(7):351–360；Crabtree等人,(1997)Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptortyrosine kinase ZAP70.Embo.J.16(18):5618–5628；Muthuswamy等人,(1999)Controlleddimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signalingby homo-and heterodimers.Mol.Cell.Biol.19(10):6845–6857)。普通技术人员将容易理解，可以采用各种其他二聚化结构域。
如将容易理解的，用于在本公开内容的回路中靶信号传导蛋白的基于诱导的蛋白酶体定位的诱导性降解的策略和组分可能不限于本文具体描述的那些策略和组分，并且在一些情况下可以适应用于所描述的回路的其他诱导的蛋白酶体定位系统。
在本文所述的诱导性降解策略中可以使用各种降解决定子。降解决定子包含发出信号和/或靶向用于降解(或以其他方式增加降解速率)与该降解决定子附接或以其他方式缔合(例如，接枝到其上)的蛋白质的蛋白质部分。降解决定子的非限制性实例包括短氨基酸序列、结构基序、暴露的氨基酸等。降解决定子可以是原核生物或真核生物衍生的，并且可以以天然存在或非天然存在(即重组)的形式使用。降解决定子可以被翻译后修饰以靶向用于降解的蛋白质，其中这样的翻译后修饰包括但不限于例如泛素化、蛋白水解裂解、磷酸化、甲基化、ADP-核糖基化、氨酰化、脂化、烷基化、亚硝基化、琥珀酰化、sumoylation、neddylation、isgylation等。
有用的降解决定子包括泛素依赖性降解决定子和泛素非依赖性降解决定子。例如，在一些情况下，蛋白质可以通过附接鸟氨酸脱羧酶(ODC)降解决定子(包括但不限于例如哺乳动物ODC，例如啮齿动物ODC，包括但不限于例如c-末端小鼠ODC(cODC))被靶向用于泛素非依赖性蛋白酶体降解。在一些情况下，有用的降解决定子包括Takeuchi等人,Biochem.J(2008)410:401–407和/或Matsuzawa等人,PNAS(2005)102(42):14982-7中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，蛋白质可以通过降解决定子的翻译后修饰(包括但不限于，例如，蛋白水解裂解、磷酸化、甲基化、ADP-核糖基化、氨酰化、脂化、烷基化、亚硝基化、琥珀酰化、sumoylation、neddylation、isgylation等)被靶向用于泛素非依赖性蛋白酶体降解，其中这样的修饰直接或间接导致蛋白质的部分或完全解折叠或导致蛋白质降解的其他机制。
在一些情况下，本文描述的回路中采用的降解决定子可以包含泛素非依赖性降解信号，其中这样的信号可以变化。例如，在一些情况下，泛素非依赖性降解信号可以包含二肽基序，例如半胱氨酸-丙氨酸(即，CA)二肽基序。在一些情况下，泛素非依赖性降解信号可能仅包含二肽基序。在一些情况下，泛素非依赖性降解信号除二肽基序外还可包含氨基酸残基，例如但不限于例如LXMSCAQE基序，其中X可以是任何氨基酸或LXMSCAQES基序，其中X可以是任何氨基酸。在一些情况下，LXMSCAQE基序或LXMSCAQES基序可以包含其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
因此，在一些情况下，降解决定子的降解信号可以包含选自以下的序列：LPMSCAQES，其中最后的S存在或不存在，LAMSCAQES，其中最后的S存在或不存在，LVMSCAQES，其中最后的S存在或不存在，LSMSCAQES，其中最后的S存在或不存在，LEMSCAQES，其中最后的S存在或不存在，以及LKMSCAQES，其中最后的S存在或不存在。在一些情况下，降解决定子的降解信号可以包含MSCAQE序列或MSCAQES序列。
泛素依赖性降解决定子包括但不限于，例如，含有PEST(脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T))序列的降解决定子，以及Melvin等人(PLoS One.(2013)29；8(10):e78082)中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文，包括鉴定为Bonger的降解决定子和描述为衍生自TAZ、HIF-1α、iNOS、SRC3、细胞周期蛋白D1、IFNAR1、p53和β-连环蛋白的那些。
有用的降解决定子还可以包含E3泛素连接酶结构域。这样的降解决定子通常被定义为被E3泛素连接酶识别的底物位点，并且已经表征了多种这样的降解决定子，包括短肽基序和特定结构元件。E3连接酶/降解决定子和相应基序模式的非限制性实例包括：APC/C(DBOX)，主要基序.R..L..[LIVM].；APC/C(KEN)，主要基序.KEN.；APC/C(ABBA),主要基序[FIVL].[ILMVP][FHY].[DE].{0,3}[DEST]；APCC_TPR_1，主要基序.[ILM]R$；CBL(PTK)，主要基序[DN].Y[ST]..P；CBL(MET)，主要基序DYR；COP1，主要基序[DE][DE].{2,3}VP[DE]；CRL4_CDT2_1，主要基序[NQ]{0,1}..[ILMV][ST][DEN][FY][FY].{2,3}[KR]{2,3}[^DE]；CRL4_CDT2_2，主要基序[NQ]{0,1}..[ILMV]T[DEN][HMFY][FMY].{2,3}[KR]{2,3}[^DE]；Kelch_KEAP1_1，主要基序[DNS].[DES][TNS]GE；Kelch_KEAP1_2，主要基序QD.DLGV；Kelch_actinfilin，主要基序[AP]P[MV][IM]V；Kelch_KLHL3，主要基序E.EE.E[AV]DQH；MDM2_SWIB，主要基序F[^P]{3}W[^P]{2,3}[VIL]；Nend_Nbox_1，主要基序^M{0,1}[FYLIW][^P]；Nend_UBRbox_1，主要基序^M{0,1}[RK][^P].；Nend_UBRbox_2，主要基序^M{0,1}([ED]).；Nend_UBRbox_3，主要基序^M{0,1}([NQ]).；Nend_UBRbox_4，主要基序^M{0,1}(C).；ODPH_VHL_1，主要基序[IL]A(P).{6,8}[FLIVM].[FLIVM]；SCF_COI1_1，主要基序..[RK][RK].SL..F[FLM].[RK]R[HRK].[RK].；SCF_FBW7_1，主要基序[LIVMP].{0,2}(T)P..([ST])；SCF_FBW7_2，主要基序[LIVMP].{0,2}(T)P..E；SCF_SKP2-CKS1_1，主要基序..[DE].(T)P.K；SCF_TIR1_1，主要基序.[VLIA][VLI]GWPP[VLI]...R.；SCF-TRCP1，主要基序D(S)G.{2,3}([ST])；SIAH，主要基序.P.A.V.P[^P]；SPOP，主要基序[AVP].[ST][ST][ST]；其中“.”指定任何氨基酸类型，“[X]”指定该位置处允许的一种或多种氨基酸类型，模式开头的“^X”指定序列以氨基酸类型X开始，“[^X]”表示该位置可以具有X型以外的任何氨基酸，编号指定为以下“X{x,y}”，其中x和y指定在该位置所需的“X”氨基酸类型的最小和最大数量。“$”符号表示蛋白质链的C末端。Guharoy等人,Nature Communications(2016)7:10239中描述了包含E3泛素连接酶结构域的降解决定子；其公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，有用的降解决定子可包括包含用于ER相关降解(ERAD)的信号的那些降解决定子，包括但不限于例如Maurer等人,Genes Genomes&Genetics(2016)6:1854-1866中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，有用的降解决定子还可以包含药物诱导的降解决定子，例如但不限于例如利用特定E3泛素连接酶的生长素诱导的降解决定子(AID)(例如，如Nishimura等人,Nature Methods(2009)6(12):917-922中所述；其公开内容通过引用整体并入本文)。
如将容易理解的，包含E3泛素连接酶结构域的降解决定子将变化并且本公开内容的回路可能不限于使用本文具体描述的那些E3泛素降解决定子。
在一些情况下，本公开内容的回路中的诱导性降解可采用泛素的直接笼罩，当未笼罩时，其将含有未笼罩的泛素的多肽定位于蛋白酶体。例如，可以通过修改降解决定子的组分之间的相对间距来调整降解决定子(参见例如Inobe等人,Nature Chemical Biology,7(3),161–167；其公开内容通过引用整体并入本文)。因此，通过这样的修改，可以使降解决定子无功能或至少具有最低限度的功能。然后可以通过将泛素直接定位或连接(例如，通过二聚化)到含有潜在失活结构域的信号传导蛋白来恢复修饰的降解决定子的降解功能。在这样的实施方案中可以使用将泛素蛋白连接/定位到修饰的降解决定子的任何方便的方法。例如，在一些情况下，可以使用具有配对的存在于潜在失活结构域中的一个成员和与泛素蛋白附接的另一个成员的二聚体对。在一些情况下，可以使用具有配对的存在于潜在失活结构域中的一个成员和与泛素蛋白附接的另一个成员的亮氨酸拉链对。在一些情况下，可以使用具有配对的存在于潜在失活结构域中的一个成员和与泛素蛋白附接的另一个成员的SpyCatcher/SpyTag对。这样的实例仅用于举例说明目的，并且不是旨在进行限制。
可用于适用于本公开内容的回路的诱导性降解策略中的其他有用的降解决定子实例包括但不限于例如N末端降解决定子(例如但不限于例如在Tasaki&Kwon,Trends inBiochemical Sciences(2007)32(11):520-528中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文)；非结构化区域(例如但不限于，例如Chung等人,Nat Chem Biol.2015；11(9):713–720中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文)；配体诱导的降解(LID)和去稳定结构域(DD)结构域(例如但不限于例如Bonger等人,Nat Chem Biol.2012；7(8):531–537；Grimley等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.(2008)18:759-761；和Chu等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.(2008)18:5941-5944；Iwamoto等人,Chemistry&Biology(2010)17:981-988中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文)；原核蛋白酶体识别序列，例如ssrA和mf-Lon(例如Cameron等人,(2014)Nature biotechnology 32(12):1276-1281中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文)；等等。
适用于展示主题回路的反馈控制的回路的诱导性降解系统的实例是degronLOCKR系统，其包含被表达的钥匙多肽解笼罩的经笼罩的降解决定子。degronLOCKR系统和使用degronLOCKR的回路在共同申请中的临时申请系列号62/789,418(2019年1月7日提交)、62/850,336(2019年5月20日提交)和62/789,351(2019年1月7日提交)以及美国临时专利申请号62/700,681(2018年7月19日提交)、62/785,537(2018年12月27日提交)和62/788,398(2019年1月4日提交)中进行了描述；其公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，本公开内容的回路和/或方法排除经笼罩的降解决定子系统和/或经笼罩的降解决定子系统的组分和/或DegronLOCKR系统和/或DegronLOCKR系统的组分的使用。因此，在一些情况下，本公开内容的潜在失活结构域不是经笼罩的降解决定子。在一些情况下，本公开内容的潜在失活结构域不是DegronLOCKR。在一些情况下，本公开内容的潜在失活结构域不包含LOCKR结构域。在一些情况下，本公开内容的潜在失活结构域不包含degronLOCKR多肽。
如上所述，在一些情况下，有用的失活策略可包括诱导性定位。因此，本公开内容的回路的潜在失活结构域可以包含将信号传导蛋白诱导性地定位到使信号传导蛋白失活的位置的结构域。换句话说，在开关多肽存在的情况下，潜在失活结构域可以变得有活性，使得失活结构域将附接的信号传导蛋白定位到其中信号传导蛋白失活的细胞部分。可在本文描述的回路中采用用于基于诱导性定位的失活的各种不同策略。
例如，在一些实施方案中，开关多肽可以被配置为包含结合对的与隔离结构域连接的第一成员，并且靶向的信号传导蛋白可以包含结合对的第二成员。因此，在开关多肽的表达和结合对的第一和第二成员的结合后，靶向的信号传导蛋白可以被隔离和失活。在不存在开关多肽的情况下，靶向的信号传导蛋白不被隔离并因此保持活性(即未被失活)。
如本文所用，术语“隔离结构域”通常是指当附接至多肽并且可用(即，未被笼罩或以其他方式不可接近)时导致多肽定位到细胞中的其中多肽不能执行其主要功能的位置的任何蛋白质结构域。例如，在多肽是转录因子并且其主要功能是驱动一种或多种靶基因的表达的情况下，隔离结构域可以用于将多肽定位于细胞的远离细胞核的位置以防止多肽执行其驱动一种或多种靶基因的表达的功能。然而，可以配置具有转录因子功能的多肽以使得在不存在开关多肽的情况下，该多肽能够定位于细胞的细胞核以驱动一种或多种其靶基因的表达。
用于诱导性定位的策略可能取决于靶向的多肽的作用机制，并且有用的策略将不限于将转录因子与细胞核隔离。因此，可在本文所述的基于诱导性定位的失活策略中采用各种隔离结构域。例如，在一些情况下，采用的隔离结构域可以将附接的多肽定位到细胞的不同位置，包括但不限于例如质膜、线粒体、过氧化物酶体、液泡、肌动蛋白细胞骨架等。因此，隔离结构域可包含标签，当存在且可接近时，其诱导附接的多肽定位到细胞内的特定位置。这样的标签的有用实例可包括但不限于例如质膜靶向标签、线粒体膜靶向标签、过氧化物酶体靶向标签、液泡靶向标签、肌动蛋白-细胞骨架靶向标签等。
在本文描述的回路的一些实施方案中，靶向信号传导蛋白可以包含结合对的第一成员并且开关多肽可以包含结合对的与隔离结构域连接的第二成员，包括但不限于例如其中隔离结构域包含质膜靶向标签、线粒体膜靶向标签、过氧化物酶体靶向标签、液泡靶向标签、肌动蛋白-细胞骨架靶向标签等。在一些情况下，其他有用的靶向标签可以包括但不限于例如核定位标签、核输出标签等。
在一些实施方案中，在本公开内容的回路中采用的有用的诱导性定位策略可以包含开关多肽，该开关多肽包含与定位标签融合的第一亮氨酸拉链结构域和与信号传导途径的靶向的信号传导蛋白融合的第二亮氨酸拉链结构域。例如，靶向的信号传导蛋白可以是但不限于信号传导途径的转录因子成员并且定位标签可以定位于细胞核以外的细胞位置，例如但不限于例如质膜。因此，转录因子靶信号传导蛋白的失活可以通过开关多肽的存在来控制。在存在开关多肽的情况下，第一个亮氨酸拉链结合第二个亮氨酸拉链，并且转录因子靶信号传导蛋白与细胞核隔离(例如，在细胞核外)，从而使信号传导蛋白失活。在不存在开关多肽的情况下，信号传导蛋白不被隔离并且不诱导失活。因此，信号传导蛋白可以执行其信号传导功能。在一些情况下，诱导的隔离的这样的策略可以在本文的其他地方被称为“锚定离开(anchor away)”。
在一些情况下，可以在本公开内容的回路中采用的锚定离开策略中采用的有用的亮氨酸拉链结合对和隔离结构域可以包括但不限于例如Chen等人,ACS Synth.Biol.,2015,4(11):1205–1216中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文。潜在的异二聚化结构域的实例在以下出版物中有所描述。这些结构域可用于招募降解决定子、定位蛋白质(锚定离开)或作为显性阴性物。参见，例如，Thompson等人,ACS Synthetic Biology2012 1:118-129和Chen等人,Nature 2019 565:106-111。
可用于诱导性定位策略的有用结合对不限于亮氨酸拉链结构域并且其有用的结构域可以变化。结合对的第一和第二成员可以直接相互结合(即，可以直接结合)或可以通过结合介体结合。可以选择能够彼此形成复合物的任何两个方便的多肽结构域用作结合对的第一和第二成员。在一些情况下，多肽二聚化结构域(包括但不限于本文别处描述的那些)可以用作结合对的第一和第二成员，包括其中二聚化对的第一和第二成员直接相互结合(即，可以直接二聚化)或通过二聚化介体(即二聚化剂)二聚化。
结合对及其第一和第二成员的有用实例还可包括但不限于例如PCT公开号WO2014/127261和WO2017/120546中描述的特异性结合对和二聚化对，其公开内容通过引用整体并入本文。
在一些情况下，在本公开内容的回路中采用的用于诱导性定位的策略可以包含经笼罩的隔离结构域。如本文所用，“经笼罩的隔离结构域”通常是指包含定位标签和防止定位标签根据定位标签的正常功能触发多肽和任何附接的蛋白质的定位的笼结构域的多结构域多肽。例如，当标签保持经笼罩时，包含含有质膜靶向标签的经笼罩的隔离结构域的多肽可能不会定位到质膜，但在标签未被笼罩时可将多肽和任何附接的蛋白质定位于质膜。
在另一个实例中，当标签保持经笼罩时，包含含有核定位标签(例如但不限于例如核定位序列(NLS))的经笼罩的隔离结构域的多肽可能不定位于核，但当标签未被笼罩时，可以将多肽和任何附接的蛋白质定位到核。在一些情况下，这样的诱导性定位策略可以用于其中靶向的信号传导蛋白在细胞的核外(例如，在细胞质和/或质膜中)的信号传导途径中起作用的情况。在这样的实施方案中，可以采用任何方便的核定位序列。
在另一个实例中，当标签保持经笼罩时，包含含有核输出标签(例如但不限于例如核输出序列(NES))的经笼罩的隔离结构域的多肽可以定位于核，但当标签未被笼罩时，可以将多肽和任何附接的蛋白质定位到核外。在一些情况下，这样的诱导性定位策略可以用于其中靶向的信号传导蛋白在细胞的核中起作用的情况。在这样的实施方案中，可以采用任何方便的核输出序列。在一些情况下，包含核输出标签的经笼罩的隔离结构域可排除LOCKR结构域，包括但不限于例如其中经笼罩的隔离结构域不包含nesLOCKR多肽。
在相关实施方案中可以采用用于定位标签的笼罩/解笼罩的任何有用策略。包括但不限于，例如，通过包含可被开关多肽中包含的蛋白酶裂解的蛋白水解裂解位点的结构域保护定位标签。例如，定位标签可以附接至信号传导蛋白并且定位标签可以被保护结构域笼罩，该保护结构域包含蛋白水解裂解位点，所述蛋白水解裂解位点可以被开关多肽中包含的蛋白酶裂解。在不存在开关多肽的情况下，蛋白酶不存在并且保护结构域阻止定位标签触发信号传导蛋白的定位。在开关多肽的存在下，蛋白酶裂解蛋白水解裂解位点，解笼罩或以其他方式脱保护定位标签并触发信号传导蛋白根据定位标签的定位。
在一些实施方案中，基于LOCKR的笼可以用于本公开内容的回路的诱导性定位策略中。例如，在一些情况下，信号传导蛋白可以被配置为包含定位标签(例如但不限于例如NLS或NES)，其可以被LOCKR笼罩并且被包含钥匙多肽的开关多肽解笼罩。在一些实施方案中，在本公开内容的回路的诱导性定位策略中可以不采用基于LOCKR的笼。例如，在一些情况下，信号传导蛋白可以被配置为包含不被LOCKR结构域笼罩的定位标签(例如但不限于，例如NLS或NES)，并且含有潜在失活结构域的蛋白质可以不包含LOCKER结构域，例如nesLOCKR或nlsLOCKER。LOCKR结构域和采用LOCKR系统的回路描述于由2019年1月7日提交的代理案卷号UCSF-578PRV和MBHB 18-1783-PRO以及美国临时专利申请号62/700,681(2018年7月19日提交)、62/785,537(2018年12月27日提交)和62/788,398(2019年1月4日提交)(其公开内容通过引用整体并入本文)确定的共同申请中的临时申请中。
如上所述，用于诱导本公开内容的回路的信号传导蛋白的失活的有用策略可以包括蛋白质分裂。如本文所用，“蛋白质分裂”通常是指分裂多肽以使多肽无功能或使多肽的至少一种功能失效。在一些情况下，多肽可以可逆地分裂，使得多肽的分裂部分可以重新连接以使得多肽有功能或恢复被分裂消除的多肽的至少一种功能。在一些情况下，多肽可以不可逆地分裂，使得多肽的分裂部分不能重新连接以使得多肽有功能或恢复被分裂消除的多肽的功能。
在一些实施方案中，信号传导蛋白的多肽被分裂(消除信号传导蛋白的至少一个功能)并且分裂多肽的每一半与结合对的成员融合，使得分裂信号传导蛋白可以在结合对成员的结合后重构。例如，信号传导蛋白可以分裂成前半部分和后半部分，并且前半部分可以与结合对的第一个成员融合，而分裂信号传导蛋白的后半部分可以用于结合对的第二个成员。在结合对的第一和第二成员彼此结合后，信号传导蛋白被重构，从而恢复信号传导蛋白的被消除的至少一个功能。
在本公开内容的回路中，开关多肽可以被配置成包含竞争胜过用于重构分裂多肽的结合对成员之一或两者的结合对成员。因此，在存在开关多肽的情况下，结合对的第一和第二成员的结合可能被开关多肽中断，从而阻止信号传导蛋白的重构并导致信号传导蛋白的失活。
在这样的情况下，开关多肽的结合结构域在本文中可以称为“显性阴性”结构域。显性阴性结构域可以竞争性地竞争胜过附接于或以其他方式掺入本公开内容的回路的信号传导蛋白的潜在失活结构域的结构域之间的结合。因此，在一些情况下，可以认为潜在失活结构域包含与信号传导蛋白的结构域非共价结合的竞争性结合结构域。这样的“竞争性结合结构域”可以在存在开关多肽的结合结构域的情况下被置换，从而导致信号传导蛋白的失活。在不存在开关多肽的情况下，竞争性结合结构域结合其在分裂信号传导蛋白中的结合配偶体，重构信号传导蛋白并使其能够在信号传导途径中发挥其功能。
在一些实施方案中，信号传导蛋白，例如转录因子或激酶，可以被分裂，使得当蛋白质的分裂部分彼此不缔合时，信号传导蛋白不执行其功能，即，它不诱导靶标的转录，不催化靶标的磷酸化等。分裂信号传导蛋白的前半部分可以融合到第一个亮氨酸拉链，而分裂信号传导蛋白的后半部分可以融合到第二个亮氨酸拉链，使得在第一个亮氨酸拉链与第二个亮氨酸拉链结合后，可以重构信号传导蛋白。显性阴性亮氨酸拉链(即以比第一和第二亮氨酸拉链之间的相互作用更高的亲和力结合第一或第二亮氨酸拉链的第三亮氨酸拉链)被掺入开关多肽。因此，开关多肽可能胜过分裂信号传导蛋白的一半，使其失去功能，例如不能执行转录因子功能、不能执行激酶功能等。亮氨酸拉链和使用显性阴性亮氨酸拉链胜过两个较低亲和力的亮氨酸拉链的结合的有用实例包括但不限于例如描述于Buchler&Cross.Molecular Systems Biology(2009)5:272(其公开内容通过引用整体并入本文)中的异源哺乳动物bZIP(CEBPα)反式激活因子和高亲和力3HF显性阴性抑制剂。
在一些实施方案中，有用的蛋白质分裂策略包括裂解位于二聚化结构域之间的蛋白酶裂解位点，所述二聚化结构域将分裂信号传导蛋白的部分二聚化以重构信号传导蛋白。例如，信号传导蛋白可以分裂成具有二聚化对的第一成员的第一部分和包含二聚化对的第二成员的第二部分。二聚化对的一个或两个成员可以被配置为含有被蛋白酶裂解的蛋白酶裂解位点。因此，在包含蛋白酶的开关多肽表达时，一个或多个蛋白酶裂解位点被裂解，使重构的信号传导蛋白分裂，从而使其失活。
在一些情况下，二聚化对包含亮氨酸拉链，例如反平行亮氨酸拉链，其使分裂信号传导蛋白二聚化。因此，信号传导蛋白被分成具有反平行亮氨酸拉链对的第一亮氨酸拉链的第一部分和包含该对的第二亮氨酸拉链的第二部分。该对的亮氨酸拉链中的一个或两个可以被配置为包含被蛋白酶裂解的蛋白酶裂解位点。因此，在包含蛋白酶的开关多肽表达时，一个或多个蛋白酶裂解位点被裂解，使重构的信号传导蛋白分裂，从而使其失活。
可以采用的蛋白酶策略的有用实例包括但不限于例如其中开关多肽可以包含将裂解存在于分裂信号传导蛋白的二聚化结构域中的蛋白酶裂解位点的TEV蛋白酶。TEV蛋白酶的裂解破坏了二聚化结构域重构分裂信号传导蛋白的能力，从而使重构的分裂信号传导蛋白失活和重新分裂。因此，在不存在含有TEV蛋白酶的开关多肽的情况下，一个或多个蛋白酶裂解位点保持未裂解并且分裂信号传导蛋白保持重构和活性。在一些情况下，可用于蛋白水解裂解信号传导蛋白以产生失活的分裂信号传导蛋白的组分和配置可包括在Gao等人,Science.2018；361(6408):1252-1258(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的CHOMP(被攻击的正交模块蛋白酶的回路)系统中使用的那些。很容易理解，在一些情况下，其他编码的蛋白酶、相应的蛋白酶裂解位点和/或二聚化结构域可以替代明确描述的那些。
还将容易理解，采用蛋白质分裂的信号传导蛋白的诱导失活的各种配置可用于本公开内容的回路中。
如上所述，本公开内容的回路可以包含开关多肽，其表达可以受调节序列控制，编码开关多肽的序列可操作地连接至该调节序列。如本文所用，术语“开关多肽”通常是指当在相应潜在失活结构域的存在下表达时活化潜在活化结构域的多肽。潜在失活结构域的活化从而触发失活结构域连接至或以其他方式掺入的多肽和任何其他附接的蛋白质例如附接的信号传导蛋白的失活。开关多肽的构型将变化，例如取决于开关被设计以活化的潜在组分。
在一些情况下，被配置为与特定潜在失活结构域一起起作用的开关多肽可以被配置为正交系统。“正交系统”通常是指特定开关多肽与特定潜在失活结构域一起起作用，但开关多肽不一定与其他潜在失活结构域一起起作用和/或潜在失活结构域不一定与其他开关多肽一起起作用。因此，开关多肽和潜在失活结构域的两个或更多个不同的正交系统可以在相同生物体或细胞中一起例如同时地起作用而不会相互干扰。换句话说，第一正交系统的第一开关多肽可用于活化第一系统的第一潜在失活结构域，而开关多肽基本上不干扰第二正交系统(例如第二开关多肽、第二潜在失活结构域等)的任何组分的功能。在一些情况下，可以采用正交系统以允许两个或更多个分子反馈回路(包括例如各自调节不同信号传导途径的两个或更多个分子反馈回路、各自调节同一信号传导途径的不同组分的两个或更多个分子反馈回路等)的并行操作。
每个开关多肽和潜在失活结构域不必被配置成正交对。例如，在一些情况下，两个或更多个不同的开关多肽可用于活化相同的潜在失活结构域。相应地，在一些情况下，两个或更多个不同的潜在失活结构域可以被配置为被相同的开关多肽活化。
接头
在本公开内容的回路中采用的多肽可以包含或可以不包含肽接头。例如，在一些情况下，主题多肽的两个结构域可以通过肽接头连接。相应地，编码本公开内容的回路的组分的核酸序列可以通过编码肽接头的序列连接。
肽接头的长度可以从约3个氨基酸(aa)或更少至约200个氨基酸或更多，包括但不限于例如3个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至15个氨基酸、10个氨基酸至25个氨基酸，25个氨基酸至50个氨基酸，50个氨基酸至75个氨基酸，75个氨基酸至100个氨基酸，100个氨基酸至125个氨基酸，125个氨基酸至150个氨基酸，150个氨基酸至175个氨基酸，或175个氨基酸至200个氨基酸。肽接头可具有3个氨基酸至30个氨基酸的长度，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。肽接头可以具有5个氨基酸至50个氨基酸的长度，例如5个氨基酸至40个氨基酸、5个氨基酸至35个氨基酸、5个氨基酸至30个氨基酸、5个氨基酸至25个氨基酸、5个氨基酸至20个氨基酸，5个氨基酸至15个氨基酸或5个氨基酸至10个氨基酸。
合适的接头可以容易地选择并且可以是许多合适长度中的任何一个，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
示例性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:1)和(GGGS)n(SEQ ID NO：2)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser都是相对非结构化的，并且因此可以用作组分之间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸接近显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基受到少得多的限制(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性接头可包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO：3)、GGSGG(SEQID NO：4)、GSGSG(SEQ ID NO：5)、GSGGG(SEQ ID NO：6)、GGGSG(SEQ ID NO：7)、GSSSG(SEQID NO：8)等。
信号传导途径
如上所述，可以使用本文描述的分子回路来调节各种信号传导途径，包括天然和合成信号传导途径。合适的信号传导途径包括被一种或多种输入调节(例如，活化、抑制等)以产生一种或多种输出的那些。信号传导途径的输入和输出可以变化，并且可以包含信号传导途径的内源性(例如，天然)输入或输出以及异源性(例如，工程化或合成的)信号传导途径输入和输出。
在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输入可以包含细胞内信号，包括例如当途径的输出可以是细胞内或细胞间的时。在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输出可以包含细胞内信号，包括例如当途径的输入可以是细胞内或细胞间的时。在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输入可以包含细胞间信号，包括例如当途径的输出可以是细胞内或细胞间的时。在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输出可以包含细胞间信号，包括例如当途径的输入可以是细胞内或细胞间的时。
在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输入和输出都可以包含细胞内信号。在一些情况下，与本公开内容的回路相关的信号传导途径的输入和输出都可以包含细胞间信号。
可以使用本公开内容的回路调节的天然信号传导途径的合适的非限制性实例包括但不限于例如AKT信号传导途径、Akt/PKB信号传导途径、AMPK信号传导途径、细胞凋亡信号传导途径、BMP信号传导途径、cAMP依赖途径、雌激素信号传导途径、hedgehog信号传导途径、hippo信号传导途径、免疫活化途径、免疫抑制途径、免疫细胞分化途径、胰岛素信号转导途径、JAK-STAT信号传导途径、MAPK/ERK信号传导途径、mTOR信号传导途径、NF-κB信号传导途径、节点信号传导途径、notch信号传导途径、p53信号传导途径、PI3K信号传导途径、TGFβ信号传导途径、TLR信号传导途径、TNF信号传导途径、VEGF信号传导途径、Wnt信号传导途径等。
途径的合适的非限制性实例(其组分可被修饰以包含如本文所述的潜在失活结构域)还包括被描述为基因本体论系统发育注释计划的一部分的那些PANTHER(通过进化关系的蛋白质分析)途径，其描述(包括这样的途径的组分的描述)可在www(dot)pantherdb(dot)org在线获得。非限制性实例包括2-花生四烯酰甘油生物合成、5HT1型受体介导的信号传导途径、5HT2型受体介导的信号传导途径、5HT3型受体介导的信号传导途径、5HT4型受体介导的信号传导途径、5-羟色胺生物合成、5-羟色胺降解、乙酸盐利用、活化素β信号传导途径、腺嘌呤和次黄嘌呤补救途径、肾上腺素和去甲肾上腺素生物合成、丙氨酸生物合成、尿囊素降解、ALP23B信号传导途径、α肾上腺素能受体信号传导途径、阿尔茨海默病-淀粉样蛋白分泌酶途径、阿尔茨海默病-早老素途径、氨基丁酸降解、大麻素生物合成、大麻素降解、雄激素/雌激素/孕酮生物合成、血管生成途径、通过G蛋白和β-抑制素的血管紧张素II刺激的信号传导、细胞凋亡信号传导途径、精氨酸生物合成、抗坏血酸降解、天冬酰胺和天冬氨酸生物合成、ATP合成、轴突生长诱向因子介导的轴突导向、信号素介导的轴突导向、Slit/Robo介导的轴突导向、B细胞活化途径、β1肾上腺素受体信号传导途径、β2肾上腺素受体信号传导途径、β3肾上腺素受体信号传导途径、生物素生物合成、血液凝固、BMP/活化素信号传导途径、安非他酮降解、钙粘蛋白信号传导途径、辅酶A相关的肉碱代谢、肉碱代谢、CCKR信号传导、细胞周期、胆固醇生物合成、分支酸生物合成、生物钟系统、钴胺素生物合成、辅酶A生物合成、促肾上腺皮质激素释放因子受体信号传导途径、半胱氨酸生物合成、通过Rho GTPase的细胞骨架调节、从头嘌呤生物合成、从头嘧啶脱氧核糖核苷酸生物合成、从头嘧啶核糖核苷酸生物合成、DNA复制、多巴胺受体介导的信号传导途径、DPP-SCW信号传导途径、DPP信号传导途径、EGF受体信号传导途径、内源性大麻素信号传导、内皮素信号传导途径、脑啡肽释放、FAS信号传导途径、FGF信号传导途径、黄素生物合成、四氢叶酸生物合成、甲酰四氢甲酸生物合成、果糖半乳糖代谢、GABA-B受体II信号传导、γ-氨基丁酸合成、GBB信号传导途径、通过RNA聚合酶I的一般转录、一般转录调节、谷氨酰胺谷氨酸转化、糖酵解、促性腺激素释放激素受体途径、Hedgehog信号传导途径、血红素生物合成、异三聚G蛋白信号传导途径-Giα和Gsα介导的途径、异三聚G蛋白信号传导途径-Gqα和Goα介导的途径、异三聚G蛋白信号传导途径-杆外段光转导、组胺H1受体介导的信号传导途径、组胺H2受体介导的信号传导途径、组胺合成、组氨酸生物合成、亨廷顿病途径、通过HIF活化的缺氧反应、趋化因子和细胞因子信号传导途径介导的炎症、胰岛素/IGF途径-丝裂原活化蛋白激酶激酶/MAP激酶级联、胰岛素/IGF途径-蛋白激酶B信号传导级联、整合素信号传导途径、干扰素-γ信号传导途径、白介素信号传导途径、离子型谷氨酸受体途径、异亮氨酸生物合成、JAK/STAT信号传导途径、亮氨酸生物合成、硫辛酸盐生物合成、赖氨酸生物合成、甘露糖代谢、代谢型谷氨酸受体组III途径、代谢型谷氨酸受体组II途径、代谢型谷氨酸受体组I途径、甲硫氨酸生物合成、柠檬酸甲酯循环、甲基丙二酰途径、mRNA剪接、毒蕈碱乙酰胆碱受体1和3信号传导途径、毒蕈碱乙酸酰胆碱受体2和4信号传导途径、MYO信号传导途径、N-乙酰氨基葡萄糖代谢、尼古丁降解、尼古丁药效学途径、烟碱乙酰胆碱受体信号传导途径、Notch信号传导途径、O-抗原生物合成、阿片类物质强啡肽原途径、阿片类物质脑啡肽原途径、阿片类物质前阿黑皮素途径、鸟氨酸降解、氧化应激反应、催产素受体介导的信号传导途径、p38MAPK途径、p53途径、葡萄糖剥夺的p53途径、P53途径反馈回路1、p53途径反馈回路2、泛酸生物合成、帕金森病、PDGF信号传导途径、磷酸戊糖途径、肽聚糖生物合成、苯乙酸酯降解、苯丙氨酸生物合成、苯乙胺降解、苯丙酸酯降解、PI3激酶途径、纤溶酶原活化级联、5-磷酸吡哆醛生物合成、脯氨酸生物合成、PRPP生物合成、嘌呤代谢、磷酸吡哆醛补救途径、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、Ras途径、S-腺苷甲硫氨酸生物合成、补救嘧啶脱氧核糖核苷酸、补救嘧啶核糖核苷酸、SCW信号传导途径、丝氨酸甘氨酸生物合成、琥珀酸转化为丙酸酯、硫酸盐同化作用、突触小泡运输、TCA循环、T细胞活化途径、TGF-β信号传导途径、硫胺生物合成、硫胺代谢、苏氨酸生物合成、促甲状腺激素释放激素受体信号传导途径、Toll途径、Toll受体信号传导途径、通过bZIP转录因子的转录调节、甘油三酯代谢、色氨酸生物合成、酪氨酸生物合成、泛素蛋白酶体途径、缬氨酸生物合成、加压素合成、VEGF信号传导途径、维生素B6生物合成、维生素B6代谢、维生素D代谢和途径、Wnt信号传导途径、黄嘌呤和鸟嘌呤补救途径等。
信号传导途径的其他非限制性实例及其描述包括以下：AKT信号传导途径(AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其参与介导各种生物反应，例如细胞凋亡的抑制)，血管生成素-TIE2信号传导(血管生成素是与TIE2/TEK RTK(受体酪氨酸激酶)结合的新的生长因子配体家族)，通过MHC的抗原加工和呈递(抗原加工和呈递是导致蛋白质与主要组织相容性复合体(MHC)分子缔合以用于T细胞识别的过程)，通过死亡受体的细胞凋亡(某些细胞具有独特的传感器，称为死亡受体(DR)，其检测细胞外死亡信号的存在并迅速点燃细胞的内在细胞凋亡机制)，APRIL途径(在免疫反应中，APRIL作为B细胞和T细胞增殖的共同刺激物并支持类别转换)，B细胞发育途径(B细胞受体(BCR)复合体通常由包含两条Ig重链，两条Ig轻链的抗原结合亚基和信号传导亚基组成)，BMP途径(骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个大的亚类)，癌症免疫编辑(免疫系统试图限制肿瘤生长，但有时肿瘤细胞可能会逃避或减弱这样的免疫压力)，巨噬细胞中的CCR5途径(CC基序趋化因子受体5型(CCR5)是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的趋化因子受体亚类的成员)，CD4和CD8 T细胞谱系(每个成熟的T细胞通常保留具有与其T细胞受体(TCR)相匹配的主要组织相容性复合体(MHC)结合特性的共同受体分子(CD4或CD8)的表达)，细胞凋亡途径(细胞凋亡是一种自然发生的过程，通过该过程，细胞被引导至程序性细胞死亡)，CTL介导的细胞凋亡(细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，也称为杀伤性T细胞，在旨在去除显示外来表位的体细胞的细胞介导的免疫过程中产生)，CTLA4信号传导途径(共刺激性CTLA4途径减弱或下调T细胞活化CTLA4旨在去除显示外来表位的体细胞)，细胞因子网络(细胞因子根据其生物学反应分为促炎或抗炎细胞因子，这取决于它们对免疫细胞的影响)，ErbB家族途径(跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)的ErbB家族在器官的生长和发育过程中起着重要作用)，Fas信号传导(FAS(也称为APO1或CD95)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的包含死亡结构域的成员)，FGF途径(血管生成的最充分表征的调节剂之一是肝素结合成纤维细胞生长因子(FGF))，粒细胞粘附和血球渗出(粒细胞的粘附和血球渗出主要在非淋巴样内皮的背景下进行分析)，颗粒酶途径(颗粒酶A(GzmA)活化不依赖于半胱天冬酶的具有细胞凋亡形态特征的细胞死亡途径)，GSK3信号传导(GSK3是一种普遍表达的，高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于所有真核生物中)，来自多潜能干细胞的血细胞生成(造血干细胞根据其自我更新能力的程度分类为长期，短期和多能祖细胞)，来自多能干细胞的血细胞生成(多能干细胞能够形成人类中发现的几乎所有可能的组织类型)，活化和静止T细胞中的IL-2基因表达(IL-2是一种细胞因子，其刺激T细胞，B细胞，NK细胞和其他免疫细胞的生长，增殖和分化)，IL-6途径(IL-6是一种多效性细胞因子，其影响免疫系统和各种器官的许多生理事件)，IL-10途径(IL-10是一种多效性细胞因子，其具有重要的免疫调节功能，并且其活性影响多种免疫细胞类型)，IL-22途径(IL-22是IL-10细胞因子家族的成员，并且对免疫系统有多种作用)，干扰素途径(干扰素是一种多效性细胞因子，其最为已知的是其诱导对病毒感染的细胞抗性的能力)，JAK/STAT途径(JAK/STAT途径是一种信号传导级联，其进化上保守的作用包括细胞增殖和造血)，MAPK家族途径(丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)属于在酵母和人类等多种生物体中都是保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的大家族)，哺乳动物ESC多能性中的Nanog(NANOG是一种在多能干细胞中转录的转录因子，并且在细胞分化时下调)，p53介导的细胞凋亡途径(肿瘤蛋白p53是一种核转录因子，其调节参与响应基因毒性或细胞应激的细胞凋亡，生长停滞或衰老的多种基因的表达)，类风湿性关节炎的发病机理(类风湿性关节炎(RA)是一种慢性对称性多关节病，其主要影响手和脚的小关节)，B淋巴细胞中的PI3K信号传导(磷酸肌醇3-激酶(PI3K)调节许多生物过程，包括细胞生长，分化，存活，增殖，迁移和代谢)，RANK途径(RANKL及其受体RANK是骨重塑的关键调节剂，并且是破骨细胞的发育和活化必不可少的)，破骨细胞中的RANK信号传导(RANKL诱导破骨细胞前体细胞的分化并刺激成熟破骨细胞的再吸收功能和存活)，TGF-β途径(转化生长因子(TGF)-β家族的成员在大多数组织的发育，稳态和修复中发挥重要作用)，THC分化途径(1型(TH1)和2型(TH2)T辅助细胞源自T辅助细胞，并为先天性和适应性免疫系统的细胞提供帮助)，TNF信号传导途径(肿瘤坏死因子(TNF)是一种多功能促炎细胞因子，具有对脂质代谢，凝血，胰岛素抵抗和内皮功能的作用)，TNF超家族途径(肿瘤坏死因子(TNF)超家族由19个成员组成，这些成员通过29个受体发出信号，这些受体是TNF受体(TNFR)超家族的成员)，白细胞的跨内皮迁移(运输血浆蛋白和溶质穿过内皮涉及两种不同的途径：跨细胞和细胞旁接合点)，肝NK细胞的杀肿瘤作用(肝脏是肿瘤的形成和转移的主要部位)，TWEAK途径(TWEAK是属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的细胞表面相关蛋白并具有多种生物活性)，VEGF配体家族和受体相互作用(血管内皮生长因子(VEGF)是一种已从简单系统进化到复杂系统的高度保守的遗传途径)，等等。
如上所述，信号传导途径(包括但不限于本文所述的途径)的组分可以被修饰以包含潜在失活结构域，使得信号传导途径成员的失活可以通过开关多肽的表达来控制。可以采用的合适的途径组分包括例如输入接收成员、中间成员和输出产生成员，包括但不限于例如上面列出的途径的相应成员。
类似地，基本上任何合成途径都可以使用如本文所述的分子回路来调节。可以使用本公开内容的回路调节的合成信号传导途径的合适的非限制性实例包括但不限于由合成或工程化受体(例如但不限于例如CAR、工程化TCR、synNotch等)控制的那些途径。
在一些情况下，使用本公开内容的回路调节的途径可以包括免疫调节途径，例如免疫活化途径或免疫抑制途径。这样的免疫调节途径可以是天然的或合成的，并且可以对于其中使用回路的细胞是内源的或对于其中使用回路的细胞是异源的。
可以使用本公开内容的回路调节的合成信号传导途径的合适的非限制性实例还包括生物合成和/或生物生产途径。生物合成和/或生物生产途径可以是天然的或合成的，并且可以用于其中途径是内源性或异源性的细胞和/或生物体中。
可以使用本公开内容的回路调节的生物合成途径的非限制性实例包括但不限于激素产生途径(例如，胰岛素产生途径、雌激素/孕酮产生途径、雄激素产生途径、生长激素产生途径等)、阿片类物质产生途径、异丁醇产生途径、非核糖体聚酮化合物合成酶(NRPS)产生途径、抗生素产生途径、化疗药物产生途径、青蒿酸产生途径、萜类化合物产生途径、聚酮化合物产生途径等。
合成生物合成途径的非限制性实例包括但不限于例如合成激素产生途径、合成阿片类物质产生途径、合成抗生素产生途径、合成化疗药物产生途径、合成青蒿酸产生途径、合成萜类化合物产生途径、合成聚酮化合物产生途径等。
核酸
如上所述，本公开内容还提供了编码分子反馈回路的核酸。主题核酸可以包括例如编码开关多肽的序列、编码包含潜在失活结构域的信号传导蛋白的序列等。这样的核酸可以被配置为使得一种或多种序列可操作地连接至调节序列。例如，可以配置核酸使得编码开关多肽的序列可操作地连接至响应信号传导途径的输出的调节序列。提供了编码使用潜在失活结构域的基本上任何回路的核酸，包括但不限于本文具体描述的那些回路。涵盖了编码主题回路的分离的核酸以及含有这样的核酸的各种配置，例如载体，例如表达盒、重组表达载体、病毒载体等。
本公开内容的重组表达载体包括包含一种或多种所述核酸的那些。在一些实施方案中，包含编码本公开内容的回路的全部或部分组分的核苷酸序列的核酸将是DNA，包括例如重组表达载体。在一些实施方案中，包含编码本公开内容的回路的全部或部分组分的核苷酸序列的核酸将是RNA，例如体外合成的RNA。
如上所述，在一些情况下，主题回路可以利用与调节序列(例如转录控制元件(例如，启动子；增强子等)可操作地连接的编码核酸(例如，编码开关多肽或潜在失活结构域连接的信号传导蛋白的核酸)。在一些情况下，转录控制元件是可诱导的。在一些情况下，转录控制元件是组成性的。在一些情况下，启动子在真核细胞中是有功能的。在一些情况下，启动子在原核细胞中是有功能的。在一些情况下，启动子是细胞类型特异性启动子。在一些情况下，启动子是组织特异性启动子。
取决于所使用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成性和诱导性启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如，Bitter等人,(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
启动子可以是组成性活性启动子(即，组成性处于活性/“ON”状态的启动子)，它可以是诱导性启动子(即，其状态(活性/“ON”或非活性/“OFF”)受外部刺激(例如特定温度、化合物或蛋白质的存在)控制的启动子)，它可以是空间限制性启动子(即转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)，并且它可以是时间限制性启动子(即，启动子在胚胎发育的特定阶段或在生物过程(例如细胞周期、哺乳动物中的毛囊周期、哺乳动物中的昼夜节律周期等)的特定阶段期间处于“ON”状态或“OFF”状态)。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于酵母启动子(例如，酵母交配途径基因的启动子、酵母半乳糖诱导性启动子等)、轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元素；巨细胞病毒即刻早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于来自逆转录病毒的长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。
在一些情况下，可以使用不同强度的转录控制元件。例如，可以使用不同强度(例如弱、中等和强启动子)的启动子，例如组成性或诱导性启动子，例如但不限于例如组成性启动子pREV1、pRNR2、pRET2等。在一些情况下，启动子的强度可以通过分别减少或增加启动子内的结合位点(例如，DBD结合位点)的数量来调节，例如，使其变弱或变强。因此，存在于主题启动子中的结合位点的数量可以变化并且可以在1至6个或更多个的范围内，包括但不限于例如1、2、3、4、5、6个等。
在一些情况下，本文所述核酸的转录控制元件可包含顺式作用调节序列。任何合适的顺式作用调节序列均可用于本文所述的核酸。例如，在一些情况下，顺式作用调节序列可以是或包含上游激活序列或上游活化序列(UAS)。在一些情况下，本文所述核酸的UAS可以是Gal4响应性UAS。在一些情况下，有用的转录控制元件可以包括免疫相关的转录控制元件，例如但不限于例如活化的T细胞的核因子(NFAT)启动子等。
在一些情况下，本公开内容的回路的转录控制可以包括使用一种或多种响应合成转录因子的调节元件。合成转录因子和响应其的调节元件将变化，并且可以包括但不限于例如基于雌二醇配体结合结构域(LBD)的合成转录因子、基于孕酮LBD的合成转录因子、基于锌指的合成转录因子等。合成转录因子可以是嵌合的并且可以包含各种结构域，例如DNA结合结构域(DBD)、活化结构域、锌指结构域等。有用的结构域(例如LBD、DBD、活化结构域等)将变化，并且可以包括但不限于例如Gal4p DBD、Zif268转录因子DBD、病毒活化结构域(例如VP16、VP64等)、Msn2p活化结构域等。有用的合成转录因子的非限制性实例包括但不限于例如GEM(Gal4 DNA结合结构域-雌二醇激素结合结构域-Msn2活化结构域)、Z3PM(Z3锌指-孕酮激素结合结构域-Msn2活化结构域)等。相应地，有用的调节元件将变化并且可以包括响应合成转录因子的启动子，包括但不限于例如pZ启动子、pZ3启动子、pGAL1启动子等。合适的启动子和合成转录因子的实例包括但不限于例如本文所述的那些，Aranda-Díaz等人,ACS Synth Biol.(2017)6(3):545–554(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述的那些，等等。
在一些情况下，合适的启动子可以包括合适的可逆启动子。可逆启动子可以从许多生物体例如真核生物和原核生物中分离和衍生。用于第二种生物的源自第一种生物的可逆启动子的修饰(例如第一种原核生物和第二种真核生物、第一种真核生物和第二种原核生物等)是本领域公知的。这样的可逆启动子和基于这样的可逆启动子但还包含额外控制蛋白的系统包括但不限于醇调节启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、响应醇反式活化蛋白(AlcR)的启动子)等)、四环素调节启动子(例如，启动子系统包含TetActivators、TetON、TetOFF等)、类固醇调节启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、发病机制相关调节启动子(例如水杨酸调节启动子、乙烯调节启动子、苯并噻二唑调节启动子等)、温度调节启动子(例如热休克诱导性启动子(例如HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等)、光调节启动子、合成诱导性启动子等等。
适用的诱导性启动子包括本文所述的或本领域普通技术人员已知的任何诱导性启动子。诱导性启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调节和物理调节的启动子，例如醇调节的启动子、四环素调节的启动子(例如脱水四环素(aTc)响应性启动子和其他四环素响应性启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白(tetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式活化因子融合蛋白(tTA))、类固醇调节启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子，以及来自类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调节的启动子(例如，源自来自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和隔离金属离子的蛋白质)基因的启动子)、发病机制调节的启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导)、温度/热诱导性启动子(例如热休克启动子)和光调节启动子(例如，来自植物细胞的光响应性启动子)。
在一些情况下，有用的启动子可以是免疫细胞启动子。例如，在回路的组分在免疫细胞中表达的实施方案中，可以使用免疫细胞启动子。合适的免疫细胞启动子包括但不限于例如CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、中性粒细胞特异性启动子和NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见，例如，Salmon等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739；和Marodon等人,(2003)Blood 101:3416。作为另一个实例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可以通过使用Ncr1(p46)启动子来实现；参见，例如，Eckelhart等人,(2011)Blood 117:1565。
在一些情况下，本公开内容的核酸的免疫细胞特异性启动子可以是B29基因启动子、CD14基因启动子、CD43基因启动子、CD45基因启动子、CD68基因启动子、IFN-β基因启动子、WASP基因启动子、T细胞受体β链基因启动子、V9γ(TRGV9)基因启动子、V2δ(TRDV2)基因启动子等等。
在一些情况下，包含编码本公开内容的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组表达载体或包含在重组表达载体中。在一些实施方案中，重组表达载体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒(AAV)构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。在一些情况下，包含编码本公开内容的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组慢病毒载体。在一些情况下，包含编码本公开内容的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组AAV载体。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下病毒的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,Hum Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591594,1996；Srivastava的WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒和源自逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)；等等。在一些情况下，载体是慢病毒载体。同样合适的是转座子介导的载体，例如背驮式(piggyback)和睡美人载体。
在一些情况下，本公开内容的核酸可以具有编码两种或更多种多肽的单一序列，其中两种或更多种多肽的表达通过个体编码区之间促进个体多肽的单独表达的序列元件的存在而成为可能。这样的序列元件在本文中可称为双顺反子促进序列，其中两个编码区之间双顺反子促进序列的存在使得来自存在于单个核酸序列中的每个编码区的单独多肽的表达成为可能。在一些情况下，核酸可包含存在于单个核酸中的编码两种多肽的两个编码区，其中在编码区之间具有双顺反子促进序列。可以使用用于从单个核酸序列单独表达多个个体多肽的任何合适的方法，并且类似地，可以使用双顺反子表达的任何合适的方法。
在一些情况下，双顺反子促进序列可以允许通过可裂解的连接多肽临时连接的两个多肽从单个核酸序列的表达。在这样的情况下，双顺反子促进序列可以包含一个或多个编码的肽裂解位点。合适的肽裂解位点包含自裂解肽的那些以及被单独的酶裂解的那些。在一些情况下，双顺反子促进序列的肽裂解位点可以包括弗林蛋白酶裂解位点(即，双顺反子促进序列可以编码弗林蛋白酶裂解位点)。
在一些情况下，双顺反子促进序列可以编码自裂解肽序列。有用的自裂解肽序列包括但不限于例如肽2A序列，包括但不限于例如T2A序列。
在一些情况下，双顺反子促进序列可以包含一个或多个间隔区编码序列。间隔区编码序列通常编码氨基酸间隔区，在一些情况下也称为肽标签。有用的间隔区编码序列包括但不限于例如V5肽编码序列，包括编码V5肽标签的那些序列。
来自单一核酸序列的多个编码序列的多或双顺反子表达可以利用但不限于采用弗林蛋白酶裂解、T2A和V5肽标签序列的那些方法。例如，在一些情况下，可以采用基于内部核糖体进入位点(IRES)的系统。可以采用双顺反子表达的任何合适的方法，包括但不限于，例如，Yang等人,(2008)Gene Therapy.15(21):1411-1423；Martin等人,(2006)BMCBiotechnology.6:4(其公开内容通过引用整体并入本文)描述的那些。
细胞
如上所述，本公开内容还提供了含有编码分子反馈回路的核酸的细胞。被修饰以包含编码一种或多种分子反馈回路和/或其一种或多种组分的一种或多种核酸的细胞在本文中可被称为已被遗传修饰，其中这样的修饰可根据需要是稳定的或瞬时的。有用的细胞可以包括原核和真核细胞，包括但不限于例如细菌细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、非人灵长类细胞、人细胞等。
合适的细胞包括干细胞、祖细胞以及部分和完全分化的细胞。合适的细胞包括神经元、肝细胞；肾细胞；免疫细胞；心脏细胞；骨骼肌细胞；平滑肌细胞；肺细胞；等等。
合适的细胞包括干细胞(例如胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞；生殖细胞(例如，卵母细胞、精子、卵原细胞、精原细胞等)；体细胞，例如成纤维细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、造血细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞等。
合适的细胞包括人胚胎干细胞、胚胎心肌细胞、肌成纤维细胞、间充质干细胞、自体移植的扩增心肌细胞、脂肪细胞、全能细胞、多能细胞、血液干细胞、成肌细胞、成体干细胞、骨髓细胞、间充质细胞、胚胎干细胞、实质细胞、上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、外源细胞、内源细胞、干细胞、造血干细胞、骨髓源性祖细胞、心肌细胞、骨骼细胞、胎儿细胞、未分化细胞、多能祖细胞、单能祖细胞、单核细胞、心脏成肌细胞、骨骼成肌细胞、巨噬细胞、毛细血管内皮细胞、异种细胞、同种异体细胞和出生后干细胞。
在一些情况下，细胞是干细胞。在一些情况下，细胞是诱导多能干细胞。在一些情况下，细胞是间充质干细胞。在一些情况下，细胞是造血干细胞。在一些情况下，细胞是成体干细胞。
合适的细胞包括细支气管肺泡干细胞(BASC)、膨胀上皮干细胞(bESC)、角膜上皮干细胞(CESC)、心脏干细胞(CSC)、表皮神经嵴干细胞(eNCSC)、胚胎干细胞(ESC)、内皮祖细胞(EPC)、肝卵圆细胞(HOC)、造血干细胞(HSC)、角化细胞干细胞(KSC)、间充质干细胞(MSC)、神经元干细胞(NSC)、胰腺干细胞(PSC)、视网膜干细胞(RSC)和皮肤源性前体细胞(SKP)。
在一些情况下，细胞是免疫细胞。合适的哺乳动物免疫细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等等。在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在一些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞、免疫细胞祖细胞或免疫干细胞。例如，细胞是从个体获得的淋巴样细胞，例如淋巴细胞或其祖细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的细胞毒性细胞或其祖细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的干细胞或祖细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括源自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)。“免疫细胞”包括例如淋巴样细胞，即淋巴细胞(T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞)和骨髓衍生细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。“T细胞”包含表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞和中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。“B细胞”包括B细胞谱系的成熟和未成熟细胞，包括例如表达CD19的细胞，例如Pre B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞和浆母细胞。免疫细胞还包括B细胞祖细胞，例如Pro B细胞和B细胞谱系衍生物，例如浆细胞。
编码本公开内容的回路的细胞可以通过任何方便的方法产生。可以将编码主题回路的一种或多种组分的核酸稳定或瞬时引入主题免疫细胞，包括其中主题核酸仅暂时存在、维持在染色体外或整合到宿主基因组中的情况。主题核酸的引入和/或主题免疫细胞的遗传修饰可以在体内、体外或离体进行。
在一些情况下，主题核酸和/或遗传修饰的引入是离体进行的。例如，免疫细胞、干细胞等是从个体获得的；并且从个体获得的细胞被修饰以表达本公开内容的回路的组分。修饰的细胞因此可以使用对一种或多种选择的信号传导途径的控制反馈进行修饰，如由存在于引入的核酸上的一种或多种分子反馈回路所定义。在一些情况下，修饰的细胞是离体调节的。在其他情况下，细胞被引入(例如，从其获得细胞的个体)和/或已经存在于个体中；并且细胞在体内调节，例如通过在体内向个体施用核酸或载体。
在一些情况下，采用本公开内容的反馈回路的细胞可以是在受试者的细胞治疗中有用的治疗细胞。例如，在诸如使用免疫细胞的细胞疗法的应用中，免疫细胞被工程化为在人体中递送感兴趣的治疗有效载荷。如果这些工程化细胞的输出太高，可能发生毒性作用(例如，在CAR T细胞疗法中观察到的细胞因子释放综合征(CRS))，但另一方面，输出太低，则治疗可能无效。在良好控制的实验室条件下，可以对治疗细胞进行微调以实现所需的输出水平(即设定点)。然而，工程化的治疗细胞在其中发挥作用的动态环境使得保证输出将随着时间的推移保持恒定变得困难。使用本文所述的分子回路来实施反馈控制，工程化细胞具有针对环境中遇到的干扰(包括例如导致输出漂移的干扰)自动校正的能力。一方面，自调节工程化细胞在体内情况下更加稳健，从而改进了合成生物学的现有细胞治疗应用。
在一些情况下，诸如CAR T细胞或合成受体(例如SynNotch)的细胞疗法使T细胞能够作为安全机制从反馈控制极大获益。CAR T细胞中的反馈控制器可以调节T细胞活化的水平，并防止由免疫细胞的过度刺激导致的毒性效应，例如CRS。类似地，在SynNotchT细胞中，例如，反馈控制可以实现感兴趣的有效载荷的精确浓度的递送，而不管存在或引入的对工程化细胞的任何干扰。很容易理解，在治疗细胞中使用反馈控制不限于这些方法，并且还包括其他方法。
在其中可以采用本公开内容的回路的有用细胞不限于治疗细胞。例如，在一些情况下，可以使用在生物生产中使用的细胞。如本文所用，“生物生产”通常是指通过细胞产生所需组分用于各种应用(例如用于工业、商业、生物医学、研究等应用)的过程。在生物生产过程中产生的生物产品可能变化，并且这样的产品对于在其生产中使用的细胞和/或生物体可以是内源的或异源的。在一些情况下，感兴趣的生物产品包括但不限于重组治疗性蛋白质、病毒(例如用于基因治疗的重组病毒)、疫苗、抗体、蛋白质和肽(例如酶、生长因子等)、多糖、核酸(包括DNA和RNA)、细胞和营养产品。本公开内容的回路和/或方法可以与本领域已知的几种不同产生技术(例如使用生物反应器中的细胞(例如哺乳动物、酵母、细菌和/或昆虫细胞)产生生物产品、涉及使用转基因动物(例如山羊或鸡)的方法、涉及使用转基因植物(例如烟草、种子或苔藓)的方法以及本领域技术人员已知的其他方法)结合使用。
在采用时，用于生物生产的合适细胞可以包括但不限于例如COS细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YB2/0细胞等。有用的细胞可以是原核(例如细菌)或真核来源(包括例如哺乳动物、酵母、植物等)，并且在一些情况下可以是已建立的细胞培养系。在一些情况下，合适的细胞还可以包括HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.CCL-2)，CHO细胞(例如ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)，293细胞(例如ATCC No.CRL-1573)，Vero细胞，NIH3T3细胞(例如ATCC No.CRL-1658)，Huh-7细胞，BHK细胞(例如ATCC No.CCL10)，PC12细胞(ATCC No.CRL1721)，COS细胞，COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)，RAT1细胞，小鼠L细胞(ATCCNo.CCLI.3)，人胚肾(HEK)细胞(ATCC No.CRL1573)，HLHepG2细胞等。
在一些情况下，有用的生物生产细胞可以包括酵母细胞。合适的酵母细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤氏酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、水杨毕赤酵母(Pichia salictaria)、葛根毕赤酵母(Pichiaguercuum)、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌属的种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母属的种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢属的种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等等。
在一些情况下，有用的生物生产细胞可以包括原核细胞。合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、乳杆菌属的种(Lactobacillus sp.)、沙门氏菌属的种(Salmonella sp.)、志贺菌属的种(Shigella sp.)等的多种实验室菌株中的任一种。参见，例如，Carrier等人,(1992)J.Immunol.148:1176-1181；美国专利号6,447,784；和Sizemore等人,(1995)Science 270:299-302。可以使用的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。合适的志贺菌属菌株包括但不限于弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)和痢疾志贺菌(Shigella disenteriae)。通常，实验室菌株是非致病性菌株。其他合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、梅瓦隆假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红球菌属的种(Rhodococcus sp.)等。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌。
在一些情况下，有用的反馈控制是用于代谢工程化的细胞，其中代谢途径中酶的平衡对于获得最佳的产物滴度是必不可少的。代谢途径的中间体或甚至终产物通常是具有至少一定程度的对宿主细胞的毒性。因此，酶的比例的优化有利于最大化产生的产物的量，同时保持有效的细胞生长。此外，由于工业发酵所采用的反应器的较大尺寸，整个发酵过程中的细胞可能经历高度可变的环境，并且可能经受不同水平的各种不同压力源。这些干扰可能导致酶的活性发生变化，从而需要途径活性的“重新平衡”。采用本公开内容的分子回路的反馈控制器减轻了干扰的影响，从而通过动态地重新平衡酶比例来最大化滴度。
方法
如上所述，本公开内容还提供了使用基于潜在失活的分子反馈回路的方法。这样的方法包括但不限于例如调节细胞的信号传导途径的方法，其中该细胞是或已经被使用基于潜在失活的分子反馈回路进行遗传修饰。可以在本文描述的方法中采用任何上述回路及其组分。
可以采用各种失活策略来使本公开内容的方法中采用的回路的信号传导蛋白失活。例如，在一些情况下，信号传导蛋白的失活可以采用基于降解的策略，包括例如当所采用的失活结构域导致信号传导蛋白的降解时。在一些情况下，失活结构域可以是或可以包含降解结构域。
在一些情况下，信号传导蛋白的失活可以采用基于蛋白酶的策略，包括例如，其中潜在失活结构域被蛋白水解裂解事件活化，该蛋白水解裂解事件由是或包含蛋白酶的开关多肽介导。在一些情况下，信号传导蛋白可以被表达的蛋白酶失活，包括但不限于例如其中信号传导蛋白被蛋白酶分裂。
在一些情况下，信号传导蛋白的失活可以采用基于定位的策略，包括例如当通过失活结构域对信号传导蛋白的失活包括由开关多肽介导的信号传导蛋白的重新定位时。在一些情况下，失活结构域对信号传导蛋白的失活包括信号传导蛋白的隔离。在一些情况下，信号传导蛋白的重新定位可能涉及将定位信号与信号传导蛋白缔合的结合事件。例如，在一些情况下，失活结构域可以包含结合对的第一成员并且开关结构域可以包含结合对的与隔离结构域连接的第二成员。
在一些情况下，信号传导蛋白的失活可以采用信号传导蛋白的显性阴性抑制，包括例如当开关多肽包含显性阴性结构域时。例如，主题方法可包括通过结合对的两个成员的结合重构的分裂信号传导蛋白，其中开关多肽包含结合对的成员，该成员包含或连接至显性阴性结构域。在这样的方法中，开关多肽的结合可破坏分裂信号传导蛋白的一半的重新缔合，从而使分裂信号传导蛋白失活。因此，在一些情况下，信号传导蛋白的显性阴性抑制可以包括但不一定限于非共价结合的结构域与结合对的成员的竞争性结合，该成员连接到或以其他方式掺入信号传导蛋白。
如上所述，在一些情况下，可以在本公开内容的各种方法中采用的结合对的有用成员可以包括亮氨酸-拉链结合对的成员，即结合对的第一和第二成员可以包括亮氨酸拉链的第一和第二部分。
用于调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法可用于多种目的。例如，在一些情况下，本公开内容的回路可以用于提供感兴趣的信号传导途径的反馈控制的方法中。在一些情况下，反馈控制可以包括负反馈控制，其可以在其他方面中例如当特定途径输出产生和/或在阈值水平或高于阈值水平产生时防止途径保持活跃。在一些情况下，反馈控制可以包括正反馈控制，其可以在其他方面中例如提供特定途径输出的放大。在一些情况下，反馈控制可以提供信号传导途径的更稳定的输出，包括例如在途径的信号传导输出与变量(诸如但不限于例如环境因素和输入)隔离时。
如上所述，本公开内容的方法的细胞可以变化并且可以包含用编码如本文所述的一种或多种回路的一种或多种组分的一种或多种核酸遗传修饰的体外和/或离体细胞。在一些情况下，细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些情况下，细胞是从细胞培养物中获得的。
因此，本公开内容的方法可以包括获得在该方法中使用的细胞，包括其中这样的细胞未被修饰或已经被遗传修饰以包含本公开内容的回路。在一些情况下，本公开内容的方法可以包括进行遗传修饰。在一些情况下，本公开内容的方法可以包括收集细胞，包括其中遗传修饰之前和/或之后收集细胞。收集细胞的方法可以变化并且可以包括例如从细胞培养物中收集细胞、从包含感兴趣细胞的受试者收集细胞样品等。
在一些情况下，本公开内容的方法可以包括调节(例如，增加和/或减少)信号传导途径的信号传导，其中这样的调节涉及活化潜在失活结构域以引起该途径的信号传导蛋白的失活。如本文所述，本公开内容的回路可包含反馈，包括正反馈和负反馈。本发明的方法的反馈可能至少部分取决于信号传导途径的输出。因此，一旦启动回路和/或递送包含该回路的细胞，根据该回路的信号传导途径的调节可能不需要进一步的操纵，即该回路对信号传导途径的反馈调节可以基本上是自动的。
因此，在采用包含本公开内容的分子反馈回路的细胞的方法中，在一些情况下，可以将细胞施用至受试者并且不需要进行回路的进一步操作。例如，当受试者用包含本公开内容的分子反馈回路的细胞进行治疗时，治疗可以包括将细胞施用至受试者，包括其中这样的施用是治疗受试者的唯一干预。
在这样的方法中，可施用的细胞可包括但不限于例如免疫细胞。在这样的方法中，在一些情况下，回路可以被配置为调节免疫细胞的天然或合成信号传导途径(例如但不限于例如免疫活化途径或免疫抑制途径)的信号传导。合适的免疫活化途径(无论是通过天然方式还是合成方式调节)的非限制性实例包括细胞因子信号传导途径、B细胞受体信号传导途径、T细胞受体信号传导途径等。合适的免疫抑制途径(无论是通过天然方式还是合成方式调节)的非限制性实例包括抑制性免疫检查点途径等。
本公开内容的方法可以包括向受试者施用表达治疗剂的细胞。这样的细胞可以包含本公开内容的分子反馈回路并且可以是或可以不是免疫细胞。例如，在一些情况下，方法可以包括向受试者施用内源性或异源性产生治疗剂的非免疫细胞，其中治疗剂的产生完全或部分地由分子反馈回路控制。在一些情况下，方法可包括向受试者施用内源性或异源性产生治疗剂的免疫细胞，其中治疗剂的产生完全或部分地由分子反馈回路控制。合适的编码的治疗剂的非限制性实例包括但不限于例如激素或激素产生途径的组分，例如胰岛素或胰岛素产生途径的组分、雌激素/孕酮或雌激素/孕酮产生途径的组分、睾酮或雄激素产生途径的组分、生长激素或生长激素产生途径的组分等。
在一些情况下，这样的方法可用于治疗受试者的病况，包括例如其中病况是代谢物或激素的缺乏。在这样的情况下，分子反馈回路可以被配置成使得分子反馈回路的输出全部或部分地控制代谢物或激素的产生和/或分泌。
在一些情况下，本发明的方法可包括将细胞与一种或多种编码回路的核酸接触，其中这样的接触足以将一种或多种核酸引入细胞中。将核酸引入细胞的任何方便的方法可用于本文中，包括但不限于病毒转染、电穿孔、脂质转染、轰击、化学转化、可转导载体(例如，可转导的载体蛋白)的使用等。核酸可被引入体外或离体维持或培养的细胞中。也可以将核酸体内引入活受试者的细胞中，例如通过使用一种或多种载体(例如病毒载体)，其将核酸递送到细胞中而无需在受试者外分离、培养或维持细胞。
递送回路编码组分的任何方便的方法可以用于主题方法中。在一些情况下，可以通过向受试者施用表达回路的细胞来递送主题回路。在一些情况下，可以通过向受试者施用包含编码回路的一个或多个核苷酸序列的核酸来递送主题回路。向受试者施用编码回路的核酸可以包括向受试者施用含有该核酸的细胞，其中该核酸可能已或可能尚未表达。在一些情况下，向受试者施用编码回路的核酸可以包括向受试者施用设计用于将核酸递送至细胞的载体。
主题方法可以包括将含有编码治疗剂(其表达至少部分由分子反馈回路控制)的核酸序列的细胞引入有此需要的受试者。治疗剂可以是用于治疗癌症的治疗剂。引入的细胞可以是免疫细胞，包括例如髓样细胞或淋巴样细胞。
可以治疗的癌症的非限制性实例包括例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症(例如，卡波西肉瘤、淋巴瘤等)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌(肝外)、膀胱癌、骨癌(例如尤文肉瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤等)、脑干胶质瘤、脑肿瘤(例如，星形细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤等)、乳腺癌(例如，女性乳腺癌、男性乳腺癌、儿童乳腺癌等)、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤(例如，儿童、胃肠道等)、原发灶不明癌、心脏(心)肿瘤、中枢神经系统(例如，非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤等)，宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管(例如，胆管、肝外等)、导管原位癌(DCIS)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤等)、骨纤维组织细胞瘤(例如，恶性、骨肉瘤等)、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如，颅外、性腺外、卵巢、睾丸等)、妊娠滋养层疾病、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝脏)癌、组织细胞增多病(例如朗格汉斯细胞等)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤(例如胰腺神经内分泌肿瘤等)、卡波西肉瘤、肾癌(例如肾细胞、肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤等)、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、喉癌、白血病(例如，急性淋巴细胞(ALL)、急性髓细胞(AML)、慢性淋巴细胞(CLL)、慢性骨髓性(CML)、毛细胞等)、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌(例如，非小细胞、小细胞等)、淋巴瘤(例如，AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(CNS)等)、巨球蛋白血症(例如
Figure BDA0003244821640000601
等)、男性乳腺癌、骨的恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿性的转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性赘生物、骨髓性白血病(例如慢性(CML)等)、骨髓性白血病(例如急性(AML)等)、骨髓增殖性赘生物(例如，慢性等)、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌(例如唇等)、口咽癌、骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如上皮性、生殖细胞肿瘤、低恶性潜能肿瘤等)、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，尤因、卡波西、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织、子宫等)、Sézary综合征、皮肤癌(例如，儿童、黑色素瘤、默克尔细胞癌、非黑色素瘤等)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌(例如，原发灶隐匿性、转移性等)、胃部(胃)癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌(例如子宫内膜癌等)，子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
Figure BDA0003244821640000602
巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤等。
在一些情况下，本公开内容的方法可用于治疗受试者的免疫功能障碍，包括但不限于例如其中病况是自身免疫病。例如，在一些情况下，本公开内容的分子反馈回路可以被配置为调节患有自身免疫病的受试者的免疫活化水平，从而控制受试者的自身免疫反应以治疗受试者的自身免疫病。在一些情况下，可以向患有自身免疫病的受试者施用被配置为包含本公开内容的分子反馈回路的细胞，其中分子反馈回路的输出是免疫抑制。
本公开内容还包含制备本文所述方法中采用的核酸、回路和细胞的方法。在制备主题核酸和回路及其组分时，可以采用核酸操作、修饰和扩增(例如，统称为“克隆”)的任何方便的方法。在制备含有编码所述回路的核酸的主题细胞时，可以采用转染、转导、培养等的方便的方法。
编码本公开内容的回路的全部或部分组分的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。当主题回路或其组分分开在两个或更多个单独的多肽之间时，可以将编码这两个或更多个多肽的核苷酸序列克隆到相同或单独的载体中。表达载体可以包含选择标记、复制起点和提供载体的复制和/或维持的其他特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多可商购获得用于产生主题重组构建体。以下载体是作为实例提供的。细菌：pBs,phagescript,PsiX174,pBluescript SK,pBs KS,pNH8a,pNH16a,pNH18a,pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A,pKK223-3,pKK233-3,pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物：pWLneo,pSV2cat,pOG44,PXR1,pSG(Stratagene)pSVK3,pBPV,pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中起作用的选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下病毒的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人,GeneTher 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H GeneTher 5:1088 1097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther10:641 648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava的WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒和源自逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)；等等。
如上所述，在一些实施方案中，包含编码本公开内容的回路或其组分的核苷酸序列的核酸在一些实施方案中将是DNA或RNA，例如体外合成的DNA、重组DNA、体外合成的RNA、重组RNA等。体外合成DNA/RNA的方法是本领域已知的；可以使用任何已知方法来合成包含所需序列的DNA/RNA。将DNA/RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。将DNA/RNA引入宿主细胞可以在体外或离体或体内进行。例如，宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)可以在体外或离体用包含编码全部或部分本公开内容的回路的核苷酸序列的DNA/RNA转导、转染或电穿孔。
本公开内容的方法可以进一步包括培养经遗传修饰以编码本公开内容的回路的细胞，包括但不限于例如在施用前培养细胞、在体外或离体培养细胞(例如，一种或多种抗原的存在或不存在)等。可以采用任何方便的细胞培养方法，而这样的方法将基于各种因素(包括但不限于，例如，正在培养的细胞的类型、细胞的预期用途(例如，培养细胞是为了研究还是治疗目的)等)而变化。在一些情况下，本公开内容的方法可以进一步包括细胞培养的常见过程，包括但不限于例如接种细胞培养物、饲喂细胞培养物、传代细胞培养物、分裂细胞培养物、分析细胞培养物、用药物处理细胞培养物、收获细胞培养物等。
在一些情况下，本公开内容的方法可以进一步包括接收和/或收集在主题方法中使用的细胞。在一些情况下，从受试者收集细胞。从受试者收集细胞可包括从受试者获得组织样品并从组织样品富集、分离和/或繁殖细胞。细胞的分离和/或富集可以使用任何方便的方法进行，包括例如通过培养(例如贴壁培养、悬浮培养等)分离/富集、细胞分选(例如，FACS、微流体等)等。细胞可以从任何方便的细胞组织样品收集，包括但不限于例如血液(包括例如外周血、脐带血等)、骨髓、活组织检查、皮肤样品、脸颊拭子等。在一些情况下，细胞是从来源包括例如血库、组织库等接收的。接收的细胞可能已经预先分离或可能作为组织样品的一部分接收，因此分离/富集可以在接收细胞后和在使用之前进行。在某些情况下，接收的细胞可以是非原代细胞，包括例如培养的细胞系的细胞。用于本文所述方法的合适细胞在本文中进一步详述。
公开内容的非限制性方面的实例
上述本发明主题的各方面，包括实施方案，可以单独地或与一个或多个其他方面或实施方案组合地是有益的。在不限制前述描述的情况下，以下提供编号为1-[xxx]的本公开内容的某些非限制性方面。本领域技术人员在阅读本公开内容后将明白，各个单独编号的方面中的每一个都可以与之前或之后单独编号的方面中的任一个一起使用或组合。这旨在为各方面的所有这样的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的各方面的组合：
1.一种分子反馈回路，所述回路包含：
当被信号传导途径的输入活化时驱动信号传导途径的输出的信号传导蛋白，其中所述信号传导蛋白包含潜在失活结构域；和
响应于输出并与编码开关多肽的核酸序列可操作地连接的调节序列，所述开关多肽在表达时触发失活结构域以使信号传导分子失活。
2.根据方面1的回路，其中所述输入、输出或两者包含细胞内信号。
3.根据方面1的回路，其中所述输入、输出或两者包含细胞间信号。
4.根据前述任一方面的回路，其中所述失活结构域是降解结构域。
5.根据方面4的回路，其中所述降解结构域包含降解决定子。
6.根据方面4或5的回路，其中所述潜在失活结构域包含防止所述信号传导蛋白降解并被所述开关多肽去保护的保护结构域。
7.根据方面6的回路，其中所述开关多肽包含蛋白酶。
8.根据方面1至3中任一项的回路，其中所述失活结构域包含结合对的第一成员。
9.根据方面8的回路，其中所述开关多肽包含所述结合对的与隔离结构域连接的第二成员。
10.根据方面9的回路，其中所述隔离结构域包含质膜靶向标签、线粒体膜靶向标签、过氧化物酶体靶向标签、液泡靶向标签或肌动蛋白-细胞骨架靶向标签。
11.根据方面8的回路，其中所述开关结构域包含所述结合对的包含显性阴性结构域的第二成员。
12.根据方面11的回路，其中所述潜在失活结构域包含与所述结合对的第一成员非共价结合的竞争性结合结构域。
13.根据方面8至12中任一项的回路，其中所述结合对的第一和第二成员包含亮氨酸拉链的第一和第二部分。
14.根据前述方面中任一项的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的正调节剂。
15.根据方面1至14中任一项的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的负调节剂。
16.根据前述方面中任一项的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的中间成员或转录因子。
17.根据方面16的回路，其中所述转录因子是合成转录因子。
18.根据前述方面中任一项的回路，其中所述调节序列包含输出的转录因子的结合位点。
19.根据方面18的回路，其中所述调节序列包含所述转录因子的多个结合位点。
20.根据方面19的回路，其中所述多个结合位点是2至10个结合位点。
21.根据方面16至20中任一项的回路，其中所述输出是所述转录因子的表达。
22.根据方面1至15中任一项的回路，其中所述信号传导蛋白是受体并且所述输入是所述受体的配体。
23.根据前述方面中任一项所述的回路，其中所述信号传导途径选自：AKT信号传导途径、Akt/PKB信号传导途径、AMPK信号传导途径、凋亡信号传导途径、BMP信号传导途径、cAMP依赖途径、雌激素信号传导途径、hedgehog信号传导途径、hippo信号传导途径、免疫活化途径、免疫抑制途径、免疫细胞分化途径、胰岛素信号转导途径、JAK-STAT信号传导途径、MAPK/ERK信号传导途径、mTOR信号传导途径、NF-κB信号传导途径、节点信号传导途径、notch信号传导途径、p53信号传导途径、PI3K信号传导途径、TGFβ信号传导途径、TLR信号传导途径、TNF信号传导途径、VEGF信号传导途径和Wnt信号传导途径。
24.根据前述方面中任一项的回路，其中所述回路还包含与编码所述信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列。
25.根据方面24的回路，其中与编码所述信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列是所述信号传导蛋白的天然启动子。
26.根据方面1至22中任一项的回路，其中所述信号传导途径是合成信号传导途径。
27.根据方面26的回路，其中所述受体是合成受体。
28.根据方面27的回路，其中所述合成受体是synNotch受体。
29.根据方面27的回路，其中所述合成受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
30.根据方面29的回路，其中所述输出是免疫活化或免疫抑制。
31.编码根据前述方面中任一项所述的分子反馈回路的一种或多种核酸分子。
32.一种经遗传修饰以包含根据方面31的一种或多种核酸分子的细胞。
33.根据方面32的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
34.一种治疗受试者的病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据方面33所述的真核细胞。
35.根据方面34的方法，其中所述病况是癌症并且所述分子反馈回路的输出是免疫活化。
36.根据方面34的方法，其中所述病况是自身免疫病并且所述分子反馈回路的输出是免疫抑制。
37.根据方面34的方法，其中所述病况是代谢物或激素的缺乏，并且所述分子反馈回路的输出是代谢物或激素的产生和/或分泌。
38.一种调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法，所述方法包括：
用分子反馈回路对细胞进行基因修饰，所述分子反馈回路包含：
编码所述信号传导途径的信号传导蛋白的核酸序列，所述信号传导蛋白包含潜在失活结构域；和
响应于所述信号传导途径的输出的调节序列，其与编码开关多肽的核酸序列可操作地连接，所述开关多肽在表达时活化所述潜在失活结构域，
其中活化的失活结构域使所述信号传导蛋白失活，从而调节所述信号传导途径的信号传导。
39.根据方面38的方法，其中所述调节包括负反馈。
40.根据方面38的方法，其中所述调节包括正反馈。
41.根据方面38至40中任一项的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的降解。
42.根据方面41的方法，其中所述失活结构域是降解结构域。
43.根据方面41或42的方法，其中所述潜在失活结构域被所述开关多肽介导的蛋白水解裂解事件活化。
44.根据方面38至40中任一项的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的隔离。
45.根据方面44的方法，其中所述失活结构域包含结合对的第一成员，并且所述开关结构域包含所述结合对的与隔离结构域连接的第二成员。
46.根据方面38至40中任一项的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的显性阴性抑制。
47.根据方面46的方法，其中所述开关结构域包含所述结合对的与显性阴性结构域连接的第二成员。
48.根据方面46或47的方法，其中所述潜在失活结构域包含与所述结合对的第一成员非共价结合的竞争性结合结构域。
49.根据方面45至48中任一项的方法，其中所述结合对的第一和第二成员包含亮氨酸拉链的第一和第二部分。
50.根据方面38至49中任一项的方法，其中所述细胞是体外或离体细胞。
51.根据方面38至50中任一项的方法，其中所述信号传导途径是细胞的天然信号传导途径。
52.根据方面51的方法，其中所述天然信号传导途径是天然生物合成途径。
53.根据方面52的方法，其中所述天然生物合成途径是激素产生途径。
54.根据方面53的方法，其中所述激素产生途径选自：胰岛素产生途径、雌激素/孕激素产生途径、雄激素产生途径和生长激素产生途径。
55.根据方面44的方法，其中所述细胞是免疫细胞并且所述天然信号传导途径是免疫活化途径或免疫抑制途径。
56.根据方面48的方法，其中所述免疫活化途径选自：细胞因子信号传导途径、B细胞受体信号传导途径和T细胞受体信号传导途径。
57.根据方面48的方法，其中所述免疫抑制途径是抑制性免疫检查点途径。
58.根据方面38至50中任一项的方法，其中所述信号传导途径是合成信号传导途径。
59.根据方面58的方法，其中所述信号传导蛋白是synNotch受体并且所述输出是synNotch受体的细胞内结构域的释放。
60.根据方面58的方法，其中所述细胞是免疫细胞并且所述信号传导途径是合成免疫活化途径或合成免疫抑制途径。
61.根据方面60的方法，其中所述免疫细胞是髓样细胞或淋巴样细胞。
62.根据方面61的方法，其中所述免疫细胞是选自以下的淋巴样细胞：T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞。
63.根据方面60至62中任一项的方法，其中所述信号传导蛋白是合成免疫受体。
64.根据方面63的方法，其中所述合成免疫受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
65.根据方面58至64中任一项的方法，其中所述输出是免疫活化或免疫抑制。
66.根据方面58的方法，其中所述合成信号传导途径是合成生物合成途径。
67.根据方面66所述的方法，其中所述合成生物合成途径选自：激素产生途径、阿片类物质产生途径、抗生素产生途径、化疗药物产生途径、青蒿酸产生途径、萜类化合物产生途径和聚酮化合物产生途径。
实施例
提出以下实施例是以向本领域普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开内容和描述，并不旨在限制本发明人认为的其发明的范围并且也不旨在代表以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为按重量计的份数，分子量为加权平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1：使用信号传导途径的组分的潜在失活的策略反馈回路
使用多种策略来构建反馈回路，该反馈回路采用信号传导途径的组分的潜在失活。在这些实施例中称为“生物网络”的信号传导途径的示意性实施例显示在图7的左侧图中。如所示的，信号传导途径的组分(信号传导蛋白“A”、“B”和“Z”)转导输入以产生转录“输出”。所采用的策略的实例包括使用degronLOCKR反馈(图7；第2组)、隔离反馈(图7；第3组)和竞争反馈(图7，第4组)的诱导的降解。在一些情况下，使用基于LOCKR的系统(例如，degronLOCKR、nesLOCKR和nlsLOCKR)的实例，如下所述，提供了本文所述回路中采用的潜在失活的一般策略的概念验证展示。然而，在这样的实例中，基于LOCKR的系统的使用仅是示例性和/或比较性的，并且鉴于本公开内容，可以容易地替代LOCKR非依赖性系统(即，通常不采用LOCKR的系统，或具体地例如degronLOCKR、nesLOCKR或nlsLOCKR)。
在degronLOCKR反馈实例中，回路被配置为使得经笼罩的降解决定子附接至信号传导蛋白“B”。该回路还被配置为包含具有与编码钥匙多肽的序列可操作地连接的调节序列的核酸。如图所示，所使用的调节序列响应信号传导途径的中间组分。因此，当信号传导途径转导信号并且信号传导途径的中间组分被表达或以其他方式被活化时，钥匙多肽被表达。钥匙多肽的表达解放经笼罩的降解决定子，导致信号传导途径组分“B”的降解和对途径信号传导的负反馈。实施例4中提供了degronLOCKR反馈的更多实例。
在隔离反馈实例中，回路被配置为使得结合对的第一成员(也称为“猎物”)附接至信号传导蛋白“B”。该回路还被配置为包含具有与编码附接至定位于质膜(PM)的蛋白质基序的结合对的第二成员的序列可操作地连接的调节序列的核酸，在图7中被称为“诱饵”。如图所示，所使用的调节序列响应信号传导途径的中间组分。因此，当信号传导途径转导信号并且信号传导途径的中间组分被表达或以其他方式被活化时，“诱饵-PM”多肽被表达。表达的诱饵-PM多肽与附接至信号传导途径组分“B”的猎物结构域结合。因此，信号传导途径组分“B”与质膜隔离，远离细胞内位置，其中组分“B”在信号传导途径内起作用。因此，组分“B”的隔离导致对途径信号传导的负反馈。隔离反馈的实例包括下面更详细描述的“锚定离开”回路。
在竞争反馈实例中，回路被配置为使得信号传导途径的组分“B”被分裂并且分裂部分由于掺入每个分裂部分中的亮氨酸拉链结构域而重新缔合。因此，重构的分裂蛋白能够类似于未分裂组分“B”对应物在信号传导途径中转导信号传导。该回路还被配置为包含具有与编码显性阴性亮氨酸拉链结构域的序列可操作地连接的调节序列的核酸。显性阴性亮氨酸拉链结构域以比组分“B”亮氨酸拉链结构域结合的亲和力更高的亲和力结合组分“B”亮氨酸拉链结构域中的一者或两者。因此，当存在时，显性阴性亮氨酸拉链结构域胜过组分“B”的分裂部分的重新缔合。因此，当显性阴性亮氨酸拉链结构域表达时，信号传导途径组分“B”失活，导致途径信号传导的负反馈。竞争反馈的实例包括下面实施例3中描述的回路。
实施例2：锚定离开：基于隔离的反馈回路
命名为“锚定离开”的基于隔离的反馈回路被配置为如图8中示意性描绘的。具体而言，合成转录因子(“SynTF”)GEM被融合到亮氨酸拉链的一半(“猎物”)，并被E2诱导以活化从pGAL1启动子的转录。GEM活化Z3PM和RFP的产生作为传感器。Z3PM由Pg诱导以活化从pZ3启动子的转录。Z3PM活化YFP和亮氨酸拉链的与质膜靶向结构域融合的另一半(“诱饵-PM”)的产生。反馈将GEM定位到质膜并防止其活化转录。锚定离开回路的替代描述，表示回路的“锚”、“控制器”、“过程”和“受控输出”部分，在图9中提供。
结合使用YFP以测量回路输出的相应“无反馈”控制回路来构建和测试锚定离开反馈回路。在图10中，对于锚定离开反馈显示了作为孕酮的函数的稳态YFP输出，并且没有反馈的行为显示在顶行。递增的启动子强度(从上到下)对应于活化抑制剂(即诱饵)的Z3结合位点的递增的数量。这些数据表明，更强的启动子导致更大的反馈效应，从而导致更低的最大输出以及所示反馈曲线的斜率的变化。
实施例3：基于竞争的反馈
CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα)是一种亮氨酸拉链转录因子，其二聚化并活化GCAAT启动子。“DN”是显性阴性，其以高亲和力结合CEBPα单体，阻止转录因子结合DNA并活化转录(图11；也参见Buchler&Cross.Molecular Systems Biology(2009)5:272；其公开内容通过引用整体并入本文)。
锚定离开反馈回路被重新工程化以用用于基于竞争的反馈的组分代替基于隔离的反馈，如图12中示意性描绘的。GEM(和E2)通过产生CEBPα来确定回路的设定点。CEBPα活化Z3PM的转录。Z3PM由Pg诱导以活化从pZ3启动子的转录。Z3PM活化YFP和将CEBPαTF二聚体分裂开的亮氨酸拉链(DN)的另一半的产生。因此，反馈使CEBPα失活并随着输出增加调低Z3PM的产生。
图12中描绘的闭环反馈回路被构建并与使用YFP以测量回路输出的相应开环反馈回路进行比较。在图13中，对于具有反馈(左)和没有反馈(右)显示了作为孕酮的函数的稳态YFP输出。如所示的，E2的增加的量增加回路的输出。反馈降低了回路的最大输出，并且还降低了对Pg的依赖性的斜率。总的来说，数据表明，与没有反馈的相应回路(开环)相比，使用DN的闭环反馈回路改变了Pg剂量反应的斜率。这个实施例表明显性阴性产生可用于在基于竞争的反馈回路中实现对亮氨酸拉链转录因子的负反馈。
实施例4：使用从头蛋白质开关的模块化和可调生物反馈控制
在此实施例中，采用通过具有模块化连接性和可预测可调性的宿主不可知部分设计的从头蛋白质开关degronLOCKR来实现对酿酒酵母中内源性途径和合成回路的反馈控制。
degronLOCKR装置基于LOCKR(Latching Orthogonal Cage Key pRoteins)技术，并且由设计者degSwitch和钥匙蛋白质组成。degSwitch是一个六螺旋束，其将cODC降解决定子嵌入不稳定的第六螺旋(闩锁)中，该螺旋通过与五螺旋支架(笼)的相互作用被封闭。钥匙(一种基因编码的肽)对于与笼子的结合可以胜过闩锁。这揭示了cODC降解决定子，从而将degSwitch和任何融合的货物靶向到蛋白酶体以用于降解。degronLOCKR是合成生物学的强大设备，因为蛋白质降解是翻译后调节的通用方法。已经表明degronLOCKR可以通过调节转录因子的稳定性来控制基因表达。在这里，该功能性被利用来通过将钥匙表达为网络的输出的函数来使用degronLOCKR对生物网络实施模块化反馈控制(图14，图a)。对于实现反馈控制，degronLOCKR反馈策略与其他的方法相比提供了几个优势。首先，degronLOCKR的模块化特性允许degSwitch直接融合到任何感兴趣的蛋白质以产生中靶效应。使用degSwitch修饰内源基因还保留信号传导蛋白的天然转录和翻译调节。最后，degronLOCKR是一种完全从头设计的蛋白质，因此允许可预测的修饰以调节其特性。
内源性酵母途径中的degronLOCKR合成负反馈
作为概念的定性证明，degronLOCKR用于在酵母MAPK交配途径(这是一种具有许多内源性反馈回路的复杂信号传导途径)中实施合成负反馈(图14，图b)。通过将degSwitch附加到ΔFAR1ΔBAR1背景菌株中几个阳性途径分子的内源性基因座来测试degronLOCKR调节途径输出的能力，并使用诱导系统表达该钥匙(Aranda-Díaz等人,ACS Synth.Biol.6,545–554(2017))(图14，图c)。使用核定位序列将钥匙靶向到细胞质或细胞核以触发细胞特定区室中每个分子的降解(图15)。这样的局部诱导降解是degronLOCKR的一个独特特征，其在细胞中实现位置特异性作用。交配途径用饱和剂量的α-因子(100nM)刺激，并使用pAGA1-YFP-cODC(McCullagh等人,Nat.Cell Biol.12,954–962(2010))转录报告因子(cODC降解决定子(Hoyt等人,J.Biol.Chem.278,12135–12143(2003))使长寿命荧光报告因子不稳定，从而允许观察到动力学)监测途径活性。降解STE20(MAPKKKK)、STE11(MAPKKK)和FUS3(MAPK)具有适度的作用，而降解STE12(TF)完全消除了交配途径的输出(图14，图c，底部)。这些数据表明degronLOCKR是调节内源性途径的有效工具。
交配途径的合成负反馈控制接下来通过在其中内源性STE12与degSwitch融合的菌株中表达来自交配途径响应启动子(pFIG1)的钥匙-CFP-NLS来实施(图16，图a)。将这样的反馈的效果与没有反馈的菌株(其中STE12仍与degSwitch融合，但钥匙是由组成性启动子驱动)进行比较。在用高(25nM)、中(6.25nM)和低(3.13nM)剂量的α-因子刺激后(图16，图b)，使用自动流式细胞术跟踪pAGA1-YFP-cODC动力学。为了进行比较，同时测量了没有反馈的菌株(pREV1-钥匙-CFP-NLS)。在用每个剂量的α-因子进行刺激后，合成反馈和无反馈菌株的输出最初彼此密切跟随。约两小时后，合成反馈输出开始减少，而无反馈输出增加到不同的稳态，对应于不同剂量的α-因子。对于较大剂量的α-因子，具有degronLOCKR合成反馈的菌株显示出较大的瞬态过冲，但无论输入大小如何，最终都会收敛于相同的稳态输出。这些数据表明，合成反馈使稳态输出对这样的输入机制中交配途径的α-因子不敏感。由于不同的观察到的瞬态，这样的效果可能不是由于信号传导的饱和引起的。
为了获得合成反馈和无反馈菌株的稳态行为的更全面的比较，测量各自的输出剂量反应作为α-因子的函数。反馈菌株显示最大输出幅度的衰减和剂量反应的线性区域中的斜率降低(图16，图c)。将合成反馈菌株与具有一系列组成性启动子强度的无反馈菌株(Lee等人,ACS Synth.Biol.4,975–986(2015))(pREV1,pRNR2,pRET2)进行比较，表明通过反馈产生的行为不能通过表达钥匙的不同组成性量来实现。总之，动态适应行为和剂量反应清楚地证明了合成负反馈的作用和degronLOCKR作为快速重新连接复杂内源性信号传导途径的工具的效用。
合成转录级联中的degronLOCKR反馈
degronLOCKR反馈模块的定量能力和操作范围接下来使用由两个诱导性合成转录因子组成的简单合成转录级联(Aranda-Díaz等人)来绘制(图17，图a)。第一个，GEM(Gal4DNA结合结构域-雌二醇激素结合结构域-Msn2活化结构域)，由雌二醇(E2)诱导并活化pGAL1以产生Z3PM(Z3锌指-孕酮激素结合结构域-Msn2活化结构域)。进而，Z3PM由孕酮(Pg)诱导并活化pZ3-YFP-cODC的转录。为了实施反馈，使用了成功控制交配途径的相同模块化策略：将GEM融合到degSwitch并使用pZ3来表达钥匙-CFP-NLS(合成反馈)。通过使用反馈，GEM的浓度取决于Z3PM的输出，因为产生的钥匙的数量以及因此GEM的降解率是Z3PM活性的函数。该回路可以通过添加Pg或诱导与Z3PM融合的蓝光诱导性降解决定子(psd)(Renicke等人,Chem.Biol.20,619–626(2013))以分别增加或减少输出来进行干扰。反馈通过调节Z3PM的浓度来缓冲这些干扰。这样的类型的干扰抑制实验是技术系统中反馈的必要测试。
回路的简单计算模型预测Pg的增加导致没有反馈(钥匙是组成性表达的)的输出的单调增加，而反馈给出输出的瞬时增加，随后适应稳态，其值对于Pg的相同的增加，比没有反馈的回路更接近干扰前的值(图17，图b，左)。反馈通过降低Z3PM的产生速率来减弱输出对Pg干扰的依赖性，因此补偿在伴随其浓度降低的Pg增加后Z3PM活性的增加(图17，图b，右；图18)。
这些预测通过首先用7.5nM E2和0.78nM Pg诱导细胞并且其生长直到它们的输出达到稳态来实验验证(图17，图c)。当时，细胞用高(6.25nM)、中(3.13nM)或低(1.56nM)步进输入的Pg干扰，并使用自动流式细胞术和光遗传学实现的连续培养平台测量pZ3-YFP-cODC的动力学。作为对照，在没有反馈的菌株(表达钥匙的pRNR2)上进行相同系列的诱导，该菌株具有与E2和Pg的干扰前浓度下的反馈菌株相似的YFP稳态输出。在没有反馈的情况下，Pg的步进输入导致Z3PM活性增加，从而导致YFP表达增加，直到输出达到与干扰相称的新稳态。相比之下，随着Z3PM活性的增加，合成反馈回路增加钥匙表达，导致GEM降解，从而导致Z3PM产生的减少。这样的缓冲效果在当合成反馈回路输出开始下降而无反馈回路输出继续攀升时的干扰后两小时开始可见。这样的适应行为在性质上类似于为交配途径构建的合成负反馈回路。由于定义明确的输入和干扰，可以使用精确度量来量化适应，该度量通过取由干扰前输出标准化的干扰后输出和干扰前输出之间的绝对差的倒数来计算(Ma等人,Cell138,760–773(2009))(图17，图e)。对于Pg正干扰，反馈回路比没有反馈的回路产生高得多的精度，展示了反馈控制的好处。
进行了类似的实验，其中细胞受到负干扰。细胞在30nM E2和1.57nM Pg下生长至稳态，然后用蓝光诱导以活化Z3PM的降解(图17，图d)。作为对照，构建了无反馈回路作为具有从pRPL18B组成性表达的钥匙的对照以匹配干扰前合成反馈回路的稳态表达。由于Z3PM降解在合成反馈和无反馈回路中YFP表达的立即下降后，无反馈回路稳定到新的较低稳态。然而，反馈回路经历了轻微的过冲，之后它恢复到比无反馈回路更接近干扰前的值的稳态。合成反馈回路中针对负干扰的适应量不如正干扰那么显著(图17，图f)。模型模拟表明，负干扰将回路输出推到一个较低的表达水平，其中有反馈和没有反馈的回路之间的相对差异将更小。因此，即使反馈仍在积极缓冲负干扰，效果也将更难以观察。这强调了一个事实，即任何反馈回路(无论是用生物分子还是电子元件构建的)都具有需要通过彻底的原型设计进行探索的特性，以便实现高效的模块化使用。
为了进一步描述degronLOCK反馈模块的特性，用全范围的E2和Pg浓度诱导反馈回路和无反馈回路，并使用流式细胞术测量在稳态下的pZ3-YFP-cODC输出(图19和图20)。在这些实验中，测量pGAL1-RFP以获得关于GEM活性和从而反馈作用的更接近的信息。在E2的固定浓度(7.5nM E2)下，增加Pg导致无反馈回路的YFP输出增加，直到达到饱和为止(图21，图17，图e)。因为钥匙是由该菌株中的组成性启动子表达的，所以RFP荧光对Pg不敏感。相比之下，由于GEM的degronLOCKR诱导的降解，RFP荧光作为合成反馈回路中Pg的函数而降低。这样的效应最终在6.25nM Pg以上饱和，如超过该浓度的恒定RFP表达所示的。这两个操作区域之间的差异在YFP输出中清晰可见，这表明在主动反馈区域对Pg的敏感性降低，而在反馈饱和时显著增加。这些结果由模型定性地重现，该模型显示了当钥匙和degSwitch之间的复合物形成饱和时反馈饱和(图16和图17)。
接下来研究可调性degronLOCKR反馈控制。设计的反馈控制器的一个有用方面是调整增益以适应应用的能力。评估了调整反馈增益的两种方法：改变反馈启动子的强度和改变钥匙和笼的结合亲和力(图22，图a)。计算模型预测用于调整反馈增益的两种方法在性质上是相似的，因此应该是可互换的(图22，图b)。为了测试这一点，分别创建了具有四个和三个Z3结合位点(BS)的pZ3启动子的中等和弱变体。为了测试减弱反馈启动子强度的效果，在不同回路变体的固定浓度的E2下进行Pg剂量反应(图22，图b)。据观察，弱化启动子确实改变了稳态输出对Pg的依赖性。随着结合位点的数量减少，反馈回路的输出剂量反应收敛到没有反馈的回路(图23)。接下来，通过减少钥匙的长度来降低钥匙对笼子的亲和力。全长钥匙截短4个(中等)或12个(短)残基，并且使用全强度pZ3启动子(6xZ3 BS)在反馈回路中测试每个钥匙变体(图22，图c，图23)。类似于减少反馈启动子的强度，钥匙长度的减少导致稳态输出对Pg的依赖性发生变化(图22，图d)。通过任一策略降低反馈增益的强度也导致更大的瞬态和降低的适应(图24)。通过钥匙长度调整反馈增益是启动子工程化的一个有吸引力的替代方案，展示了从头蛋白质的独特优势。
为了显示这些调整策略的普遍性，修改了交配途径并且通过改变反馈启动子的强度和钥匙的长度来执行合成反馈环的组合调整(图22，图d)。因为pAGA1是比pFIG1强得多的启动子，所以使用pAGA1表达钥匙在用α-因子诱导后产生表达脉冲(图22，图e)。脉冲的大小以及跟随它的稳态输出都通过减少钥匙长度而增加，这减少了系统中的反馈量。类似地，在使用较弱的启动子pFIG1驱动反馈的同时减少钥匙长度产生更大的瞬态和更高的稳态输出。对不同启动子和钥匙长度作为α-因子的函数的稳态输出的测量(图22，图f，图25)清楚地表明减少启动子强度或钥匙长度增加途径的稳态输出和剂量反应的斜率，表明降低的反馈增益。综上所述，这些数据证明了degronLOCKR反馈策略的特性的轻松可调性。
方法
DNA回路的构建
根据Lee等人(2015)，使用分级金门组装来组装用于酵母菌株构建的质粒。个体部件的BsaI、BsmBI和NotI切割位点被移除，以促进下游组装和线性化。部件通过PCR生成，或作为gBlock从IDT购买。然后将这些部件组装成盒式质粒上的转录单元(启动子-基因-终止子)。然后将这些盒组装在一起以形成多基因质粒用于插入酵母基因组。
酵母菌株和生长培养基
在所有实验中使用的基础酿酒酵母菌株是BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)。所有酵母培养物都在YPD培养基(10g/L Bacto酵母提取物、20g/L Bacto蛋白胨、20g/L右旋糖)中生长。营养缺陷型标记(URA3、LEU2和/或HIS3)的选择在合成完全培养基(6.7g/L不含氨基酸的Bacto-酵母氮碱、2g/L完全补充氨基酸混合物、20g/L右旋糖)上进行。
FAR1和BAR1的敲除
创建了BY4741(yAHN797)的修改形式用于交配途径实验，其中使用Lee等人概述的CRISPR/Cas9方法敲除FAR1和BAR1。FAR1首先被使用Benchling生物学设计工具设计的两个sgRNA靶向，以靶向每个基因的ORF。这些sgRNA在包含Cas9的CEN6/ARS4质粒上表达，该质粒具有两个核定位序列和一个URA3营养缺陷型标记。通过退火寡核苷酸产生与ORF的上游和下游50bp具有同源性的修复DNA。使用标准乙酸锂程序用含有sgRNA/Cas9和修复DNA的质粒转化酵母。通过比较给予修复DNA的转化体相对于未提供修复DNA的转化体的菌落数来评估sgRNA的功效。通过菌落PCR筛选菌落以验证敲除，成功的克隆在YPD的过夜培养物中生长。然后将5ul过夜培养物接种在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的合成完全培养基上，以反选择CEN6/ARS4质粒上的URA3营养缺陷型标记。然后重复敲除过程以敲除BAR1。
将degSwitch整合到酵母基因组中
使用重叠延伸PCR产生由具有5xGS接头和URA3营养缺陷型标记的degSwitch组成的线性DNA。然后将此线性DNA用作PCR模板，以添加80bp同源性，靶向MAT途径调节因子GPA1、MSG5、SST2、STE5、STE7、STE11和STE50的3’末端。然后使用每个线性DNA片段进行个体醋酸锂酵母转化以将该7个基因的每一个下游的degSwitch插入亲本菌株yAHN797，并选择性地接种到缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上。使用菌落PCR确认插入。
酵母细胞培养和诱导
酵母菌株从甘油原液在带有适当营养缺陷标记的SDC平板上划线，或如果不存在营养缺陷标记，则在YPD平板上划线。来自这些平板的个体菌落用于接种YPD中的培养物以在12-24小时内生长至饱和。
α-因子诱导
将饱和培养物在新鲜YPD中以1:500稀释，并将450ul等分到2mL96孔储存块(Corning)的各个孔中以用于在Multitron振荡器(Infors HT)中在30℃和900RPM下生长三小时。通过从50uM原液(Zymo Research)制备适当稀释液到YPD中，以10x浓度制备α-因子交配信息素。3小时生长后，将50ulα-因子溶液加入96孔块中，然后将块放回振荡器中生长4小时。
雌二醇和孕酮诱导
将饱和培养物在新鲜YPD中以1:500稀释，并将400ul等分到2mL96孔储存块(Corning)的各个孔中以用于在Multitron振荡器(Infors HT)中在30℃和900RPM下生长三小时。通过从3.6mM(雌二醇)和3.2mM(孕酮)原液制备适当稀释液到YPD中，以10x浓度制备雌二醇(Sigma-Aldrich)和孕酮(Fisher Scientific)。三小时生长后，将50ul的雌二醇和孕酮诱导剂以适当的组合加入96孔块中，然后将块放回振荡器中生长十小时。
酵母培养
将饱和培养物以1:200或1:100(用于交配途径培养物)稀释到10mL或15mL YPD中。培养物在玻璃管中于30℃在振荡器中生长2小时。然后将培养物稀释至0.01OD600并以30mLYPD的总体积等分到单独的Falcon管中。在定制的生物反应器中在30℃下进行另外一小时的生长，并用磁控搅拌棒搅拌。所有培养物均在0.5X青霉素链霉素下在YPD中生长。
硬件
为了收集时程测量，构建了用于自动流式细胞术和连续培养的平台。现有的自动化实验平台适用于在不同浓度下进行小分子诱导和进行长期培养。酵母培养物在50mL光学透明锥形管(Falcon)中生长，该管置于八个温控磁力搅拌室中。使用BD高通量采样器的两个注射泵(Cavro XCalibur Pump，TECAN)完成液体处理。此设置允许从个体培养物采样到BD LSRII流式细胞仪用于进行测量。为了实现连续培养，首先将指定体积的培养物移出丢弃，并重新添加不同比例的激素培养基和新鲜培养基。使用LABVIEW 2013控制对于HTS的命令。
采样周期由三个主要步骤组成：采样、提取稀释液体积和在各自的激素浓度下补充稀释液体积。在长时间的实验过程中，选择一个采样周期来保持事件率接近恒定。假设倍增时间为90分钟，因此提取4mL培养物，然后每25分钟用新鲜培养基和激素替换(稀释率为0.16mLmin-1)。在交配途径上进行的较短实验没有使用连续培养进行，从而允许每10分钟的更高的采样频率。
雌二醇和孕酮诱导(一次诱导)
为了研究其中[E2]和[Pg]浓度在整个实验中保持相同的条件，只需要一次诱导。创建了三种原液：(1)诱导剂，(2)1X[E2]和1X[Pg]浓度的再填充原液，以及(3)不含激素的再填充原液。在诱导时间点期间，通过(1)和(3)的不同比例将培养物诱导至各自的浓度。通过调整(2)和(3)的比例将培养物保持在它们各自的浓度。
雌二醇和孕酮诱导(二次诱导)
为了研究相同[E2]但不同[Pg]下的干扰排斥，将培养物诱导两次。第一次诱导允许所有培养物在相同的干扰前浓度下生长至稳定状态。在培养物达到稳定状态后(t＝0hrs)，培养物用更多的Pg诱导或保持在相同的浓度，并允许再次生长至稳定状态。创建了四种原液：(1)诱导剂以实现干扰前浓度，(2)诱导剂以实现不同的干扰[Pg]，(3)1X[E2]/[Pg]的再填充原液以维持所需浓度，以及(4)1X[E2]但没有Pg的再填充原液。在t＝-10hr时用(1)诱导培养物。通过用(3)和(4)之间的1:8稀释液补充，将所有培养物保持在相同的干扰前浓度下10小时。在t＝0时，用不同比例的(2)和(4)诱导培养物。通过调整(3)和(4)的比例来维持浓度，以便在不稀释的情况下实现最高干扰[Pg]，并使用1:8稀释液维持最低[Pg]。
α-因子诱导
为了研究degronLOCKR介导的反馈对交配途径的动态响应，在t0时用输入(α-因子)诱导培养物。通过组合不同体积的YPD 1X 25nMα-因子原液和不含α-因子的YPD，实现了不同的浓度。
光诱导
每个生物反应器都配备有单独的蓝色LED，其连接到USB可控的LED驱动器(Mightex)。从光诱导时间点开始，将培养物暴露于饱和光剂量(45秒开/15秒关，强度幅度为25mA)。维持这样的光照方案直到表达达到稳态。
流式细胞术
荧光蛋白报告因子表达的分析是用配备有高通量取样器的BD LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)进行的。培养物在运行通过仪器之前在TE中稀释以获得可接受的细胞密度。YFP(Venus)荧光使用FITC通道测量，RFP(mKate2)使用PE-Texas Red通道(用于稳态测量)或mCherry通道(用于动态测量)进行测量，并且CFP使用DAPI通道测量。对于稳态测量，每个样品收集了5,000-10,000个事件。对于动态测量，每次采样收集2,000-10,000个事件的样品。荧光值计算为适当通道的高度(H)测量值，并通过除以侧向散射(SSC-H)标准化至细胞大小。
图14.degronLOCKR是一种用于控制生物途径的模块化工具。a)degronLOCKR作为模块化工具以通过将degSwitch融合到效应分子并从网络输出驱动钥匙的表达实现对内源性或合成生物网络的合成反馈控制的示意图。b)未显示复杂的内源性反馈的酵母交配途径的简化示意图。通过添加α-因子活化途径，并使用pAGA1-YFP-cODC报告因子测量信号传导活性。c)正信号传导分子的degronLOCKR诱导的降解以控制交配途径活性。指示的信号传导分子的内源性拷贝与degSwitch融合，并且使用孕酮诱导性系统表达钥匙。用饱和剂量的α-因子诱导细胞，并比较有和没有钥匙的途径活性。生长四小时后，在流式细胞仪上测量pAGA1-YFP-cODC。数据代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图16.degronLOCKR模块成功实现了交配途径的合成反馈控制a)合成负反馈的示意图，其中STE12的内源性拷贝与degSwitch融合，并且途径报告因子pFIG1(合成反馈)或组成性启动子(无反馈)被用于表达钥匙-CFP-NLS。所有输出测量均针对pAGA1-YFP-cODC。b)pAGA1-YFP-cODC动力学的测量。合成反馈和无反馈(pREV1)菌株在时间t＝0hr时用高(25nM)、中(6.25nM)或低(3.13nM)剂量的α-因子诱导，并且每10分钟进行流式细胞术测量(点)。线代表在三个数据点上取的移动平均值。c)合成反馈(pFIG1)和四种无反馈(无钥匙、pREV1、pRNR2、pRET2)菌株的α-因子剂量反应。pAGA1-YFP-cODC荧光在α-因子诱导后四小时使用流式细胞术测量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。实线是拟合至数据的山丘函数。图上指示了来自(b)中实验的高、中和低剂量的α-因子。
图17.通过合成回路的控制量化的degronLOCKR反馈模块的操作特性。a)合成反馈回路的示意图。GEM-degSwitch是组成性表达的并被雌二醇(E2)活化以驱动pGAL1-Z3PM-psd的表达。Z3PM被孕酮(Pg)活化以驱动从pZ3的表达。蓝光可用于诱导Z3PM-psd的降解。pZ3-YFP-cODC是回路的测量的输出，并且pZ3-钥匙-CFP-NLS通过活化GEM-degSwitch的降解来驱动回路中的反馈(合成反馈)。在没有反馈的回路中，使用组成性启动子来表达钥匙-CFP-NLS。b)反馈和无反馈回路的模型模拟(见补充信息)。模拟的动力学(左)和Pg干扰后输出的稳态的变化(右)表明反馈缓冲通过降解GEM和降低Z3PM浓度增加Pg浓度。c)在正干扰后针对合成反馈和无反馈菌株(pRNR2-钥匙-CFP-NLS)使用自动流式细胞术对pZ3-Venus-cODC进行动态测量。细胞在0.78nM Pg和7.5nM E2中生长至稳态表达。在0小时时，将细胞保持在相同的Pg浓度，或被诱导至1.56nM(低)、3.13nM(中)或6.25nM(高)Pg的新的终浓度。对动力学测量另外八小时。实线代表在三个数据点上取的移动平均值。d)在负干扰后针对合成反馈和无反馈菌株(pRPL18B-钥匙-CFP-NLS驱动钥匙)使用自动流式细胞术对pZ3-Venus-cODC进行动态测量。细胞在1.57nM Pg和30nM E2中生长至稳态表达，然后在0小时时经受蓝光以活化psd。在干扰后对动力学测量8小时。生长和取样条件同c)。e)对每个干扰的合成反馈相对无反馈回路的精度。f)在7.5nM E2的固定浓度下，作为Pg的函数的有和没有反馈(pRNR2-钥匙-CFP-NLS)的稳态回路行为(刺激后10小时)的比较。RFP荧光是Z3PM浓度的代表，YFP荧光是回路的输出。指示了c)中用于正干扰的Pg剂量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图22.DegronLOCKR合成反馈策略是可预测地可调的。a)(顶部)探索不同的方法来调整合成反馈回路中的反馈增益。(底部)回路输出和Z3PM作为Pg干扰的函数用于降低钥匙产生率或钥匙/笼亲和力的模型模拟(见补充信息)。b&c)调整的实验验证。b)(顶部)通过使用固定长度的钥匙改变pZ3上Z3结合位点的数量来调整反馈增益。(底部)对于强(pZ3-6x)、中等(pZ3-4x)和弱(pZ3-3x)反馈菌株相对无反馈(pREV1-钥匙-CFP-NLS)菌株的作为Pg的函数的RFP和YFP荧光。
点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。c)(顶部)通过改变钥匙的长度来调整反馈增益，反馈启动子的强度固定在pZ3-6x。(底部)对于长(55个氨基酸)、中(51个氨基酸)和短(43个氨基酸)钥匙反馈菌株相对无反馈(pREV1-NLS-钥匙-CFP)菌株的作为Pg的函数的RFP和YFP荧光。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。d)改变启动子强度和钥匙长度以调整交配途径中对合成负反馈回路的反馈增益。pAGA1是交配途径的比pFIG1更强的报告因子。e)(顶部)在用25nMα-因子刺激后对于各种反馈和无反馈菌株的pAGA1-YFP-cODC的动态测量。点代表流式细胞术测量值，线代表在三个数据点上取的移动平均值。(底部)反馈菌株相对无反馈(pREV1-NLS-钥匙-CFP)菌株的α-因子剂量反应。在α-因子诱导后四小时，使用流式细胞术测量YFP荧光。点代表三个生物学重复的平均值，并且误差线代表标准误差。实线是拟合至数据的山丘函数。在图上指示动态实验中使用的α-因子的剂量(顶部)。
图15：使用degronLOCKR测试的一组交配途径调节剂。degSwitch融合到每个调节剂的内源性拷贝的C末端。使用Pg诱导系统表达有或没有SV40 NLS的钥匙。STE20、STE11和PTP3使用细胞质钥匙(钥匙-CFP)降解，并且STE12、DIG1和DIG2使用核钥匙(钥匙-CFP-NLS)降解。MSG5和FUS3使用细胞质(cyto)或核(nuc)钥匙进行降解。细胞用1nM(低)或100nM(高)α-因子和50nM或0nM Pg诱导并生长四小时，然后使用流式细胞仪测量YFP荧光。数据代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图18：响应正或负干扰的稳态解决方案。根据我们的Hill样模型的稳定值如a)孕酮(Pg)或b)ZPM降解率(γZ)变化。实线对应于反馈系统(FB)，而虚线显示了其中反馈已被移除的实例(即fK＝μK*而不是Eq.12；无FB)。灰色框界定了其中反馈被认为是“活跃”(其由相对于干扰的相对变化(a)ΔP/P或b)Δγz/γz)的总GEM的相对变化(Δ(G+C)/(G+C))高于0.15定义)的区域。值得注意的是，在没有反馈的情况下，除了直接干扰钥匙或GEM的合成或降解率之外，对于任何干扰Δ(G+C)都等于零。
图19：对于固定剂量的E2，作为Pg的函数的回路行为。在所有E2浓度下，作为Pg的函数的有和没有反馈(pRNR2-钥匙-CFP-NLS)的稳态回路行为(刺激后10小时)的比较。YFP荧光是回路的输出，RFP荧光是Z3PM浓度的代表，BFP荧光是产生的钥匙的数量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图20：对于固定剂量的Pg，作为E2的函数的回路行为。在所有Pg浓度下，作为E2的函数的有和没有反馈(pRNR2-钥匙-CFP-NLS)的稳态回路行为(刺激后10小时)的比较。YFP荧光是回路的输出，RFP荧光是Z3PM浓度的代表，BFP荧光是产生的钥匙的数量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图21：当组成性地表达不同数量的钥匙时的回路行为。在7.5nM E2的固定浓度下，有反馈的稳态回路行为(刺激后10小时)和无反馈的钥匙表达的各种水平(pREV1、pRNR2、pRET2、pRPL18B)作为Pg的函数的比较。YFP荧光是回路的输出，RFP荧光是Z3PM浓度的代表，BFP荧光是产生的钥匙的数量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图23：改变启动子强度或钥匙长度调节反馈增益。在7.5nM E2的固定浓度下，作为Pg的函数的各种水平的反馈增益(左，通过改变反馈启动子强度进行调整；右，通过改变钥匙长度进行调整)的稳态回路行为(刺激后10小时)的比较。左，通过改变反馈启动子强度进行调整(x是指Z3操纵子位点的数量)；右，通过改变钥匙长度进行调整(m是指从钥匙的C末端去除的残基的数量)。YFP荧光是回路的输出，RFP荧光是Z3PM浓度的代表，BFP荧光是产生的钥匙的数量。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。
图24：调整反馈强度改变回路输出的动态行为。在时间＝0小时时用3.13nM Pg和7.5nM E2诱导后，对于具有各种增益的合成反馈菌株和无反馈菌株(pREV1-钥匙-CFP-NLS)使用自动流式细胞术进行pZ3-Venus-cODC的动态测量。实线表示在三个数据点上取的移动平均值。
图25：交配途径中合成反馈的组合调整。(顶部)在用25nMα-因子刺激后，对于各种反馈和无反馈(pREV1、pRNR2、pRET2、pRPL18B)菌株的pAGA1-YFP-cODC的动态测量。点代表流式细胞术测量值，线代表在三个数据点上取的移动平均值。(底部)反馈菌株相对无反馈(pREV1、pRNR2、pRET2、pRPL18B)菌株的α-因子剂量反应。在α-因子诱导后四小时，使用流式细胞术测量YFP荧光。点代表三个生物学重复的平均值±s.d.。实线是拟合至数据的山丘函数。
实施例5：诱导性核输出
在这个实施例中，使用核输出信号的诱导性定位被证明是用于反馈回路设计的功能策略。
转录因子和激酶进出细胞核的动态穿梭在细胞功能中起重要作用。为了获得对核定位的诱导性控制，将核输出序列(NES)笼罩于Switcha中，进一步扩展了体内LOCKR的功能性。NES序列(Güttler,T.等人,Nat.Struct.Mol.Biol.(2010)17:1367–1376)使用用于cODC的相同策略进行笼罩，并且所得的nesSwitcha与具有强核定位序列的YFP融合(Kosugi,S.等人,J.Biol.Chem.(2009)284:478–485)。RFP-组蛋白融合(HTA2)在相同细胞中组成性表达以充当核标记(图26，图a)。为了测试nesLOCKRa的开关能力，在有和没有钥匙表达的情况下比较YFP定位。发现在不存在钥匙a-BFP的情况下，YFP与RFP共定位于细胞核中(图26，图b，左)。当NLS-YFP-nesSwitcha与钥匙a-BFP共表达时，YFP荧光更多出现在细胞质中，表明核输出信号的解笼罩(图26，图b，右)。在胞质溶胶中观察到的YFP斑点可能是由于聚集，因为没有NLS的YFP-nesSwitcha和钥匙a-BFP的共表达导致类似的模式(图27，图a，图b)。NES的解笼罩与钥匙a-BFP上NLS的存在无关(图27，图c，图d)。不受理论束缚，在细胞核外维持nesLOCKR的机制可以是从细胞核的核输出与通过胞质溶胶中的钥匙捕获新翻译的NLS-YFP-nesSwitcha或残留的NLS-YFP-nesSwitcha的组合。钥匙a-BFP的表达总是导致与YFP-nesSwitcha的共定位(图27)。
接下来，nesLOCKR用于控制SynTF的定位。假设nesLOCKR的活化会导致pSynTF启动子的输出的减少，因为SynTF需要定位到细胞核以活化转录。使用双诱导系统(图26，图c)，不同浓度的SynTF-RFP-nesSwitcha和钥匙a-BFP在与pSynTF-YFP报告因子相同的细胞中表达，并使用流式细胞术测量稳态荧光(图26，图d)。在31.25nM E2下钥匙的诱导导致YFP信号降低33％，表明nesLOCKR的成功活化和SynTF从细胞核的排出(图26，图e)。这些结果进一步证明了在本文描述的回路中使用基于定位的策略用于反馈控制的能力。
图26.使用nesLOCKR控制蛋白质定位。a)NLS-YFP-nesSwitcha的钥匙诱导的核输出的示意图。细胞核由组蛋白HTA2-RFP标记。b)荧光显微术显示(左)当没有表达钥匙a-BFP时NLS-YFP-nesSwitcha与核HTA2-RFP荧光的共定位，相比之下，(右)在表达钥匙a-BFP时在细胞核外观察到更弥散的NLS-YFP-nesSwitcha荧光信号。c)确定nesLOCKRa对合成转录因子(SynTF)的影响的双重诱导测定的示意图。Pg诱导钥匙a-BFP的表达，并且E2诱导SynTF-RFP-nesSwitcha融合体的表达。pSynTF启动子被SynTF活化并表达YFP。d)通过流式细胞术测量的YFP和RFP荧光作为E2(0-125nM)和Pg(0-500nM)的函数的热图。e)比较YFP、SynTF-RFP-nesSwitcha和钥匙a-BFP在31.25nM E2下的荧光(图26中的黑色矩形，图b)作为Pg诱导的函数的线图。荧光值被标准化至最大YFP、RFP或BFP荧光。误差棒代表三个生物学重复的s.d.。
图27：在表达钥匙时nesLOCKR的细胞质聚合。a)具有核标记HTA2-RFP的细胞质YFP-nesSwitcha和钥匙-BFP的示意图。b)当YFP-nesSwitcha在没有NLS的情况下表达时，YFP荧光显示了预期的细胞质分布(左)，但当YFP-nesSwitcha和钥匙-BFP在细胞质中表达时观察到YFP荧光的斑点，我们假设这是由于nesSwitcha的聚集。钥匙-BFP荧光与YFP-nesSwitcha荧光共定位(右)。c)具有带有核标记HTA2-RFP的钥匙-BFP-NLS的NLS-YFP-nesSwitcha的示意图。d)当用强(SV40)NLS表达时，YFP-nesSwitcha定位于细胞核(左)。当钥匙-BFP与具有中等强度的NLS表达时，观察到与在没有NLS的情况下表达钥匙-BFP时相同的YFP定位模式(图26，图b)，表明NES的解笼罩与钥匙-BFP定位无关。钥匙-BFP-NLS荧光与NLS-YFP-nesSwitcha荧光共定位(右)。
实施例4：人类原代T细胞中的degronLOCKR功能
degronLOCKR在人原代T细胞中起作用的能力通过诱导性降解mCherry荧光蛋白来证明。构建慢病毒转移构建体，其包含融合到不对称短支架degronSwitch(具有嵌入闩锁中的cODC降解决定子和t8立足点)的mCherry。使用pPGK组成性启动子表达mCherry-degronSwitch融合体。在第二个慢病毒构建体中，使用四种不同的组成性启动子(pPGK、pSFFV、pCMV(G)、pCMV(D))表达钥匙与tagBFP的融合。
在人原代CD4+T细胞中进行实验。用上述慢病毒的不同组合转导细胞。在一种情况下，仅用mCherry-degronSwitch转导细胞。在其他情况下，除了表达钥匙-tagBFP的病毒外，细胞还接受了mCherry-degronSwitch病毒。慢病毒转导后，使用流式细胞术测量荧光。分布如图28所示。我们观察到，当细胞用含有任意数量的钥匙产物(使用tagBFP荧光对钥匙生产进行量化)的病毒共转导时，mCherry荧光几乎完全消失。该数据表明钥匙能够触发degronSwitch并活化mCherry的降解。
实施例5：Jurkat T细胞中degronLOCKR介导的反馈功能
诱导性人源化合成转录因子ZF3-p65-Ert2(ZPE)用作模型过程以测试由degronLOCKR介导的反馈是否在人T细胞中起作用(Mo Khalil，Boston U的诱导性TF礼物)。回路的输出是由pZF3启动子产生的mCherry荧光报告因子，并且与degronSwitch融合的ZPE由pSFFV组成性启动子驱动。构建了两种形式的回路，一种没有反馈，另一种具有通过钥匙的反馈。具有反馈的回路具有由单独的pZF3启动子驱动的钥匙，并与mEGFP融合。通过混合和匹配不同的pZF3启动子变体和钥匙长度来测试该反馈回路的几个变体。这些实验是通过使用慢病毒将构建体稳定地整合到Jurkat T细胞中来进行的。接收回路的细胞被门控为mCherry阳性(pZF3(4x)mCMV启动子泄漏)，并且对于反馈显示，BFP阳性。
该实验是通过用一系列他莫昔芬(4OHT)诱导细胞进行的，他莫昔芬(4OHT)通过将ZPE转录因子易位到细胞核中来活化它。使用流式细胞术在诱导后5天测量细胞。图29显示了对于回路输出的样品分布和对于具有反馈的回路的钥匙产生。
比较了全范围4OHT浓度下无反馈和反馈回路的剂量反应。似乎可以通过改变启动子或钥匙长度来调整从反馈的缓冲，类似于以前在酵母中观察到的效果。当观察驱动全长钥匙的mCMV启动子的反馈关闭时，我们可以看到反馈的存在既降低了最大稳态输出，也降低了剂量反应的斜率(图30)。这些特征是反馈的经典标志，并且表明我们的反馈回路正在对回路产生影响。将来，mCherry可能被感兴趣的有效载荷取代。我们的反馈回路可以执行干扰抑制和调整T细胞活化的动力学(即CAR的产生)或治疗有效载荷的递送。
虽然已经参照本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等价物。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都意图在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 加利福尼亚大学董事会
<120> 合成的分子反馈回路及其使用方法
<130> UCSF-577WO
<150> 62/789,402
<151> 2019-01-07
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 1
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
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Claims (65)

1.分子反馈回路，所述回路包含：
当被信号传导途径的输入活化时驱动信号传导途径的输出的信号传导蛋白，其中所述信号传导蛋白包含潜在失活结构域但不包含经笼罩的降解决定子；和
响应于输出并与编码开关多肽的核酸序列可操作地连接的调节序列，所述开关多肽在表达时触发失活结构域以使信号传导分子失活。
2.根据权利要求1所述的回路，其中所述输入、输出或两者包含细胞内信号。
3.根据权利要求1所述的回路，其中所述输入、输出或两者包含细胞间信号。
4.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述失活结构域是降解结构域。
5.根据权利要求4所述的回路，其中所述降解结构域包含降解决定子。
6.根据权利要求4或5所述的回路，其中所述潜在失活结构域包含防止所述信号传导蛋白降解并被所述开关多肽去保护的保护结构域。
7.根据权利要求6所述的回路，其中所述开关多肽包含蛋白酶。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的回路，其中所述失活结构域包含结合对的第一成员。
9.根据权利要求8所述的回路，其中所述开关多肽包含所述结合对的与隔离结构域连接的第二成员。
10.根据权利要求9所述的回路，其中所述隔离结构域包含质膜靶向标签、线粒体膜靶向标签、过氧化物酶体靶向标签、液泡靶向标签或肌动蛋白-细胞骨架靶向标签。
11.根据权利要求8所述的回路，其中所述开关结构域包含所述结合对的包含显性阴性结构域的第二成员。
12.根据权利要求11所述的回路，其中所述潜在失活结构域包含与所述结合对的第一成员非共价结合的竞争性结合结构域。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的回路，其中所述结合对的第一和第二成员包含亮氨酸拉链的第一和第二部分。
14.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的正调节剂。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的负调节剂。
16.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述信号传导蛋白是所述信号传导途径的中间成员或转录因子。
17.根据权利要求16所述的回路，其中所述转录因子是合成转录因子。
18.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述调节序列包含输出的转录因子的结合位点。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的回路，其中所述输出是所述转录因子的表达。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的回路，其中所述信号传导蛋白是受体并且所述输入是所述受体的配体。
21.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述信号传导途径选自：AKT信号传导途径、Akt/PKB信号传导途径、AMPK信号传导途径、凋亡信号传导途径、BMP信号传导途径、cAMP依赖途径、雌激素信号传导途径、hedgehog信号传导途径、hippo信号传导途径、免疫活化途径、免疫抑制途径、免疫细胞分化途径、胰岛素信号转导途径、JAK-STAT信号传导途径、MAPK/ERK信号传导途径、mTOR信号传导途径、NF-κB信号传导途径、节点信号传导途径、notch信号传导途径、p53信号传导途径、PI3K信号传导途径、TGFβ信号传导途径、TLR信号传导途径、TNF信号传导途径、VEGF信号传导途径和Wnt信号传导途径。
22.根据前述权利要求中任一项所述的回路，其中所述回路还包含与编码所述信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列。
23.根据权利要求22所述的回路，其中与编码所述信号传导蛋白的核酸序列可操作地连接的调节序列是所述信号传导蛋白的天然启动子。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的回路，其中所述信号传导途径是合成信号传导途径。
25.根据权利要求24所述的回路，其中所述受体是合成受体。
26.根据权利要求25所述的回路，其中所述合成受体是synNotch受体。
27.根据权利要求25所述的回路，其中所述合成受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
28.根据权利要求27所述的回路，其中所述输出是免疫活化或免疫抑制。
29.编码根据前述权利要求中任一项所述的分子反馈回路的一种或多种核酸分子。
30.一种经遗传修饰以包含根据权利要求19所述的一种或多种核酸分子的细胞。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
32.一种治疗受试者的病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求31所述的真核细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述病况是癌症并且所述分子反馈回路的输出是免疫活化。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述病况是自身免疫病并且所述分子反馈回路的输出是免疫抑制。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述病况是代谢物或激素的缺乏，并且所述分子反馈回路的输出是代谢物或激素的产生和/或分泌。
36.一种调节细胞的信号传导途径的信号传导的方法，所述方法包括：
用分子反馈回路对细胞进行基因修饰，所述分子反馈回路包含：
编码所述信号传导途径的信号传导蛋白的核酸序列，所述信号传导蛋白包含潜在失活结构域但不包含经笼罩的降解决定子；和
响应于所述信号传导途径的输出的调节序列，其与编码开关多肽的核酸序列可操作地连接，所述开关多肽在表达时活化所述潜在失活结构域，
其中活化的失活结构域使所述信号传导蛋白失活，从而调节所述信号传导途径的信号传导。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述调节包括负反馈。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述调节包括正反馈。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的降解。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述失活结构域是降解结构域。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述潜在失活结构域被所述开关多肽介导的蛋白水解裂解事件活化。
42.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的隔离。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述失活结构域包含结合对的第一成员，并且所述开关结构域包含所述结合对的与隔离结构域连接的第二成员。
44.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述失活结构域对所述信号传导蛋白的失活包括所述信号传导蛋白的显性阴性抑制。
45.根据权利要求44的方法，其中所述开关结构域包含所述结合对的与显性阴性结构域连接的第二成员。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述潜在失活结构域包含与所述结合对的第一成员非共价结合的竞争性结合结构域。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述结合对的第一和第二成员包含亮氨酸拉链的第一和第二部分。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的方法，其中所述细胞是体外或离体细胞。
49.根据权利要求36至48中任一项所述的方法，其中所述信号传导途径是细胞的天然信号传导途径。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述天然信号传导途径是天然生物合成途径。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述天然生物合成途径是激素产生途径。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述激素产生途径选自：胰岛素产生途径、雌激素/孕激素产生途径、雄激素产生途径和生长激素产生途径。
53.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞并且所述天然信号传导途径是免疫活化途径或免疫抑制途径。
54.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫活化途径选自：细胞因子信号传导途径、B细胞受体信号传导途径和T细胞受体信号传导途径。
55.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫抑制途径是抑制性免疫检查点途径。
56.根据权利要求36至48中任一项所述的方法，其中所述信号传导途径是合成信号传导途径。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述信号传导蛋白是synNotch受体并且所述输出是synNotch受体的细胞内结构域的释放。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞并且所述信号传导途径是合成免疫活化途径或合成免疫抑制途径。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述免疫细胞是髓样细胞或淋巴样细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫细胞是选自以下的淋巴样细胞：T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述信号传导蛋白是合成免疫受体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述合成免疫受体是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的方法，其中所述输出是免疫活化或免疫抑制。
64.根据权利要求56的方法，其中所述合成信号传导途径是合成生物合成途径。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述合成生物合成途径选自：激素产生途径、阿片类物质产生途径、抗生素产生途径、化疗药物产生途径、青蒿酸产生途径、萜类化合物产生途径和聚酮化合物产生途径。
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