CN112662676B - 一种dna编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(1)设计靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列，并推导所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的基因序列；(2)构建含有所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列的重组表达载体；(3)将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得的重组宿主细胞长效表达靶向水解蛋白的多肽或者蛋白。本发明中，利用重组表达载体实现长期下调目标蛋白表达的效果，该技术仅需制备重组表达载体，而无需体外制备蛋白水解靶向嵌合体，能够降低成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法。
背景技术
现有技术中下调细胞内目标蛋白表达的方法主要有两种：一种是后转录修饰或后翻译修饰的方式，例如利用小干扰RNA(siRNA)和蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)抑制目标蛋白的过表达；另一种是通过基因编辑工具、例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)的方法敲除目标蛋白的基因序列。
在第一种方法中，siRNA和PROTAC稳定性低，只能实现对目标蛋白短暂的下调效果。如CN111704648A公开了以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物及制备方法与应用，以VHL配体或CRBN配体作为E3连接酶配体部分，通过不同长度烷基侧链连接氧桥双环庚烯类磺酸酯或磺酰胺雌激素受体配体，得到PROTAC分子，所述PROTAC分子能够下调乳腺细胞中ER的表达，但无法长效发挥作用，且转染细胞难度较高。何念哲设计了靶向Bcl-2家族的PROTAC，获得了首批能够靶向PPIs靶点的、能够靶向Bcl-2或Mcl-1蛋白的选择性PROTAC，但仍存在无法长效发挥作用的问题(何念哲.靶向Bcl-2家族的蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)的设计，合成及生物学活性评价[D].2019.)。
在第二种方法中，ZFN和TALEN制作繁琐、价格昂贵，CRISPR要求需要编辑的目的基因存在前间隔序列邻近基序(PAM)，且存在脱靶问题。如CN107130000A公开了一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，所述系统包括特异性靶向KRAS基因的sgRNA和特异性靶向EGFR基因的sgRNA，可同时高效敲除在肺癌中高度表达的两个癌症驱动因子KRAS及EGFR，该系统操作简单，但存在脱靶的问题，存在敲除细胞关键基因的风险。
综合上述，如何实现安全、长效下调目标蛋白表达的效果，同时降低成本，成为目标蛋白研究领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白(DNA-Encoding Targeted Proteolysis，DE-TAP)的方法，所述方法能在细胞中持续表达靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白，实现长效下调目标蛋白表达的效果。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列，并推导所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的基因序列；
(2)构建含有所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列的重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得的重组宿主细胞长效表达靶向水解蛋白的多肽或者蛋白。
所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白包括靶向目标蛋白的配体、连接体和招募E3泛素连接酶的配体，所述靶向目标蛋白的配体包括靶向目标蛋白的多肽、特异性抗体、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体中的任意一种，所述连接体包括连接所述靶向目标蛋白的配体和所述招募E3泛素连接酶的配体的多肽。
本发明的靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白中，靶向目标蛋白的配体能够选择性地和目标蛋白结合，招募E3泛素连接酶的配体能够和E3泛素连接酶结合，靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白通过将E3泛素连接酶招募到目标蛋白附近，使E3泛素连接酶对目标蛋白泛素化并进入泛素化降解途径，从而实现下调目标蛋白表达的目的；所述靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白采用多肽连接体连接所述靶向目标蛋白的配体和所述招募E3泛素连接酶的配体，实现了利用基因工程手段长效下调目标蛋白表达的效果。
优选地，所述E3泛素连接酶配体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1：ALAPYIP。
优选地，所述连接体包括甘氨酸和丝氨酸。
优选地，所述连接体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2：GSGS。
优选地，所述靶向目标蛋白的配体包括表皮生长因子受体(EGFR)靶向配体、雌激素受体(ER)靶向配体、信号传导与转录激活因子3(STAT3)靶向配体或Ras蛋白靶向配体中的任意一种。
优选地，所述表皮生长因子受体靶向配体包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3：
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR。
优选地，所述雌激素受体靶向配体包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4：HKILHRLLQ。
优选地，所述信号传导与转录激活因子3靶向配体包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5：HGFQWPGSWTWENGKWTWKGAYQFLKGGG。
优选地，所述Ras蛋白靶向配体包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6：HYPWFKARLYPL。
优选地，步骤(1)所述设计靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列包括：通过结构生物学和蛋白质组学，挖掘与目标蛋白具有亲和力的多肽、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体并获取相应的氨基酸序列，并设计连接体和招募E3泛素连接酶的配体的氨基酸序列，获得靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列。
优选地，所述靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示氨基酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO:7：
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSGSALAPYIP。
SEQ ID NO:8：HKILHRLLQGSGSALAPYIP。
SEQ ID NO:9：
HGFQWPGSWTWENGKWTWKGAYQFLKGGGGSGSALAPYIP。
SEQ ID NO:10：HYPWFKARLYPLGSGSALAPYIP。
优选地，步骤(1)所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示核酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO:11：
ATGAATTCCGATAGCGAATGCCCACTGTCACACGACGGTTACTGCCTCCACGATGGCGTGTGCATGTACATCGAGGCTCTGGACAAGTATGCTTGTAATTGCGTGGTGGGGTACATCGGAGAGCGCTGCCAGTATCGGGATTTGAAATGGTGGGAGCTGAGGGGGAGCGGCAGCGCCCTGGCCCCGTACATCCCTTGA。
SEQ ID NO:12：
ATGCATAAAATTCTCCATAGACTTTTGCAGGGTTCTGGATCTGCACTCGCCCCTTATATCCCTTAG。
SEQ ID NO:13：
ATGCATGGTTTTCAGTGGCCTGGGTCTTGGACTTGGGAAAACGGAAAATGGACATGGAAGGGAGCATATCAATTCCTGAAGGGAGGTGGCGGATCTGGCAGTGCATTGGCTCCATACATCCCCTGA。
SEQ ID NO:14：
ATGCATTATCCATGGTTTAAGGCCCGACTGTACCCTTTGGGAAGTGGCTCCGCCTTGGCCCCATACATCCCCTAG。
优选地，步骤(2)所述重组表达载体为含有靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列的病毒载体或质粒载体。
本发明中，根据靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列推导其编码基因，将所述编码基因构连接入表达载体，构建能够表达所述靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白的重组表达载体，所述重组表达载体被导入细胞后能够持续表达靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白，实现了长效下调目标蛋白表达的效果。
优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.1和pVAX1。
优选地，步骤(3)所述重组宿主细胞的基因组中整合有所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列。
本发明中，将能够表达靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白的重组表达载体导入细胞，所述重组表达载体能够在细胞中持续表达靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白，实现长效下调目标蛋白表达的效果，该技术仅需制备重组表达载体，而无需体外制备蛋白水解靶向嵌合体，能够降低成本。
优选地，步骤(3)所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
作为优选的技术方案，所述DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法包括以下步骤：
(1)通过结构生物学和蛋白质组学，挖掘与目标蛋白具有亲和力的多肽、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体并获取相应的氨基酸序列，并设计连接体和招募E3泛素连接酶的配体的氨基酸序列，获得靶向水解蛋白的多肽或蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:7～10，根据所述氨基酸序列获取靶向水解蛋白的多肽或蛋白的核酸序列SEQ ID NO:11～14；
(2)构建含有所述靶向水解蛋白的多肽或蛋白的核酸序列的重组病毒或重组质粒；
(3)将所述重组病毒或重组质粒导入宿主细胞，获得的重组宿主细胞长效表达靶向水解蛋白的多肽或蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明的靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白中，利用靶向目标蛋白的配体和招募E3泛素连接酶的配体相互配合，实现靶向性下调目标蛋白表达的目的，同时构建能够表达所述靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白的重组表达载体，所述重组表达载体被导入细胞后能够持续表达靶向水解目标蛋白的多肽或者蛋白，实现了利用基因工程手段长效下调目标蛋白表达的效果；
(2)本发明中，利用重组表达载体实现下调目标蛋白表达的效果，该技术仅需制备重组表达载体，而无需体外制备蛋白水解靶向嵌合体，能够降低成本；
(3)本发明分别构建了靶向水解EGFR、ER、STAT3和Ras的多肽或者蛋白的重组表达载体，所述重组表达载体均能有效下调细胞中相应目标蛋白的表达，在培养2天后和14天后，对EGFR蛋白靶向水解的多肽或者蛋白的重组表达载体和ER蛋白靶向水解的多肽或者蛋白的重组表达载体的下调效果进行检测，二者均能使细胞中相应目标蛋白的含量维持在较低水平，表明能够长效下调目标蛋白的表达。
附图说明
图1为EGFR DE-TAP质粒的图谱；
图2为经EGFR DE-TAP和Gefitinib-based PROTAC 3处理的Hep3B细胞的EGFR的表达量(培养2天后)，Con表示空白对照组EGFR的表达量；
图3为经EGFR DE-TAP和Gefitinib-based PROTAC 3处理的Hep3B细胞的EGFR的表达量(培养14天后)，Con表示空白对照组EGFR的表达量；
图4为ER DE-TAP质粒的图谱；
图5为经ER DE-TAP和PROTAC ERαDegrader-1处理的MCF-7细胞的ER的表达量(培养2天后)，Con表示空白对照组ER的表达量；
图6为经ER DE-TAP和PROTAC ERαDegrader-1处理的MCF-7细胞的ER的表达量(培养14天后)，Con表示空白对照组ER的表达量；
图7为STAT3 DE-TAP质粒的图谱；
图8为Panc1细胞的STAT3表达量(培养2天后)，+表示转染STAT3 DE-TAP的细胞的STAT3表达量，-表示未转染STAT3 DE-TAP的细胞的STAT3表达量；
图9为Ras DE-TAP质粒的图谱；
图10为Hela细胞的Ras表达量(培养2天后)，+表示转染Ras DE-TAP的细胞的Ras表达量，-表示未转染Ras DE-TAP的细胞的Ras表达量。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明以四种与癌症密切相关的蛋白作为例证，包括表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)、信号传导与转录激活因子3(Signal Transducer And Activator Of Transcription 3，STAT3)和Ras蛋白(Rat Sarcoma，Ras)，以说明本发明DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法的普适性。
实施例1
本实施例进行下调EGFR实验，具体过程包括如下步骤：
(1)以pcDNA3.1为原始质粒构建能够表达靶向水解EGFR蛋白的蛋白的重组质粒，选取pcDNA3.1两个酶切位点HindIII(911)和BamHI(929)进行双酶切，插入SEQ ID NO:11的双链DNA序列，得到EGFR DE-TAP质粒，其图谱如图1所示；
(2)于37℃、5％CO2条件下，采用含有10％胎牛血清和1％青霉素的MEM培养基培养人肝癌细胞系(Hep3B细胞系)；
(3)将Hep3B细胞用胰酶消化并重悬于0.5mL电转导缓冲液中，加入终浓度为10μg/mL的EGFR DE-TAP质粒，使用宽度为4mm的电转杯进行电转导(250V，5ms)，随后将电转杯置于37℃恒温培养箱中放置10min，转移细胞悬浮液至含有10％胎牛血清和1％青霉素的MEM培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养；
(4)另外取未经电转导的Hep3B细胞在37℃恒温培养箱中培养，并在培养基中添加终浓度为10μg/mL的商用小分子PROTAC(Gefitinib-based PROTAC 3)；
(5)在培养2天后和14天后，分别取步骤(3)和步骤(4)培养的Hep3B细胞，制备细胞裂解液，按照标准western blotting操作步骤分析细胞裂解液中EGFR蛋白含量，以未经电转导和Gefitinib-based PROTAC 3培养处理的Hep3B细胞为空白对照，以β-actin为内参，结果如图2和图3所示。
如图2所示，培养2天后，含有EGFR DE-TAP的Hep3B细胞和Gefitinib-basedPROTAC 3培养处理的Hep3B细胞中的EGFR含量均下降，表明EGFR DE-TAP和Gefitinib-based PROTAC 3均能有效下调EGFR表达。
如图3所示，培养14天后，含有EGFR DE-TAP的Hep3B细胞中的EGFR含量仍较低，而经Gefitinib-based PROTAC 3培养处理的Hep3B细胞中的EGFR含量已回升至原始水平，表明EGFR DE-TAP仍能继续有效下调EGFR表达，而Gefitinib-based PROTAC 3不能持续下调EGFR表达，由此说明EGFR DE-TAP能够长期下调EGFR表达。
上述实例表明本发明通过构建能够表达靶向水解目标蛋白的蛋白的重组表达载体，并将所述重组表达载体导入细胞，能够实现长期下调目标蛋白表达的效果。
实施例2
本实施例进行下调ER表达实验，具体过程包括如下步骤：
(1)以pcDNA3.1为原始质粒构建能够表达靶向水解ER蛋白的多肽的重组质粒，选取pcDNA3.1两个酶切位点HindIII(911)和BamHI(929)进行双酶切，插入SEQ ID NO:12的双链DNA序列，得到ER DE-TAP质粒，其图谱如图4所示；
(2)于37℃、5％CO2条件下，采用含有10％胎牛血清和1％青霉素的D MEM培养基培养人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞系)；
(3)将MCF-7细胞用胰酶消化并重悬于0.5mL电转导缓冲液中，加入终浓度为10μg/mL的ER DE-TAP质粒，使用宽度为4mm的电转杯进行电转导(250V，5ms)，随后将电转杯置于37℃恒温培养箱中放置10min，转移细胞悬浮液至含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养；
(4)另外取未经电转导的MCF-7细胞在37℃恒温培养箱中培养，并在培养基中添加终浓度为10μg/mL的商用小分子PROTAC(PROTAC ERαDegrader-1)；
(5)在培养2天后和14天后，分别取步骤(3)和步骤(4)培养的MCF-7细胞，制备细胞裂解液，按照标准western blotting操作步骤分析细胞裂解液中ER蛋白含量，以未经电转导和PROTAC ERαDegrader-1培养处理的MCF-7细胞为空白对照，以β-actin为内参，结果如图5和图6所示。
如图5所示，培养2天后，含有ER DE-TAP的MCF-7细胞和PROTAC ERαDegrader-1培养处理的MCF-7细胞中的ER含量均下降，表明ER DE-TAP和PROTAC ERαDegrader-1均能有效下调ER表达。
如图6所示，培养14天后，含有ER DE-TAP的MCF-7细胞中的ER含量仍较低，而经PROTAC ERαDegrader-1培养处理的MCF-7细胞中的ER含量已回升至原始水平，表明ER DE-TAP仍能继续有效下调ER表达，而PROTAC ERαDegrader-1不能持续下调ER表达，由此说明ERDE-TAP能够长期下调ER表达。
上述实例表明本发明通过构建能够表达靶向水解目标蛋白的多肽的重组表达载体，并将所述重组表达载体导入细胞，能够实现长效下调目标蛋白表达的效果。
实施例3
本实施例进行下调STAT3表达实验，具体过程包括如下步骤：
(1)以pcDNA3.1为原始质粒构建能够表达靶向水解STAT3蛋白的多肽的重组质粒，选取pcDNA3.1两个酶切位点HindIII(911)和BamHI(929)进行双酶切，插入SEQ ID NO:13的双链DNA序列，得到STAT3 DE-TAP质粒，其图谱如图7所示；
(2)于37℃、5％CO2条件下，采用含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM培养基培养胰腺癌细胞系(Panc1细胞系)；
(3)将Panc1细胞用胰酶消化并重悬于0.5mL电转导缓冲液中，加入终浓度为10μg/mL的STAT3 DE-TAP质粒，使用宽度为4mm的电转杯进行电转导(250V，5ms)，随后将电转杯置于37℃恒温培养箱中放置10min，转移细胞悬浮液至含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养；
(4)在培养2天后，取步骤(3)培养的Panc1细胞，制备细胞裂解液，按照标准western blotting操作步骤分析细胞裂解液中STAT3蛋白含量，以β-actin为内参，结果如图8所示。
如图8所示，培养2天后，含有STAT3 DE-TAP的Panc1细胞中的STAT3含量下降，表明STAT3 DE-TAP能有效下调STAT3表达。
实施例4
本实施例进行下调Ras表达实验，具体过程包括如下步骤：
(1)以pcDNA3.1为原始质粒构建能够表达靶向水解Ras蛋白的多肽的重组质粒，选取pcDNA3.1两个酶切位点HindIII(911)和BamHI(929)进行双酶切，插入SEQ ID NO:14的双链DNA序列，得到Ras DE-TAP质粒，其图谱如图9所示；
(2)于37℃、5％CO2条件下，采用含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM培养基培养人宫颈癌细胞系(Hela细胞系)；
(3)将Hela细胞用胰酶消化并重悬于0.5mL电转导缓冲液中，加入终浓度为10μg/mL的Ras DE-TAP质粒，使用宽度为4mm的电转杯进行电转导(250V，5ms)，随后将电转杯置于37℃恒温培养箱中放置10min，转移细胞悬浮液至含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养；
(4)在培养2天后，取步骤(3)培养的Hela细胞，制备细胞裂解液，按照标准westernblotting操作步骤分析细胞裂解液中Ras蛋白含量，以β-actin为内参，结果如图10所示。
如图10所示，培养2天后，含有Ras DE-TAP的Hela细胞中的Ras含量下降，表明RasDE-TAP能有效下调Ras表达。
综上所述，本发明利用靶向目标蛋白的配体和E3泛素连接酶配体相互配合，实现靶向性下调目标蛋白表达的目的，同时构建能够表达所述靶向降解目标蛋白的蛋白或多肽的重组表达载体，所述重组表达载体被导入细胞后能够持续表达靶向降解目标蛋白的蛋白或多肽，实现了长期下调目标蛋白表达的效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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<213> 人工合成
<400> 3
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln
1 5
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
His Gly Phe Gln Trp Pro Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp
1 5 10 15
Thr Trp Lys Gly Ala Tyr Gln Phe Leu Lys Gly Gly Gly
20 25
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
His Tyr Pro Trp Phe Lys Ala Arg Leu Tyr Pro Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser Gly Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
50 55 60
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Gly Ser Gly Ser Ala Leu Ala
1 5 10 15
Pro Tyr Ile Pro
20
<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
His Gly Phe Gln Trp Pro Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp
1 5 10 15
Thr Trp Lys Gly Ala Tyr Gln Phe Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
35 40
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
His Tyr Pro Trp Phe Lys Ala Arg Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
20
<210> 11
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
atgaattccg atagcgaatg cccactgtca cacgacggtt actgcctcca cgatggcgtg 60
tgcatgtaca tcgaggctct ggacaagtat gcttgtaatt gcgtggtggg gtacatcgga 120
gagcgctgcc agtatcggga tttgaaatgg tgggagctga gggggagcgg cagcgccctg 180
gccccgtaca tcccttga 198
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atgcataaaa ttctccatag acttttgcag ggttctggat ctgcactcgc cccttatatc 60
ccttag 66
<210> 13
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
atgcatggtt ttcagtggcc tgggtcttgg acttgggaaa acggaaaatg gacatggaag 60
ggagcatatc aattcctgaa gggaggtggc ggatctggca gtgcattggc tccatacatc 120
ccctga 126
<210> 14
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
atgcattatc catggtttaa ggcccgactg taccctttgg gaagtggctc cgccttggcc 60
ccatacatcc cctag 75
Claims (12)
1.一种DNA编码靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）设计靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列，并推导所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的基因序列；
（2）构建含有所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列的重组表达载体；
（3）将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得的重组宿主细胞长效表达靶向水解蛋白的多肽或者蛋白；
所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白包括靶向目标蛋白的配体、连接体和招募E3泛素连接酶的配体；
所述靶向目标蛋白的配体包括靶向目标蛋白的多肽、特异性抗体、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体中的任意一种；
所述连接体包括连接所述靶向目标蛋白的配体和所述招募E3泛素连接酶的配体的多肽；
所述招募E3泛素连接酶的配体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
步骤（2）中所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列为如SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示核酸序列中的任意一种；
步骤（3）中所述宿主细胞为人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺癌细胞或人宫颈癌细胞中任意一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向目标蛋白的配体包括表皮生长因子受体靶向配体、雌激素受体靶向配体、信号传导与转录激活因子3靶向配体或Ras蛋白靶向配体中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表皮生长因子受体靶向配体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述雌激素受体靶向配体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述信号传导与转录激活因子3靶向配体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Ras蛋白靶向配体的氨基酸序列如SEQID NO: 6所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述设计靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列包括：通过结构生物学和蛋白质组学，挖掘与目标蛋白具有亲和力的多肽、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体并获取相应的氨基酸序列，并设计连接体和招募E3泛素连接酶的配体的氨基酸序列，获得靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述重组表达载体为含有靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列的质粒载体。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述重组宿主细胞的基因组中整合有所述靶向水解蛋白的多肽或者蛋白的核酸序列。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述导入的方法包括电转导、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）通过结构生物学和蛋白质组学，挖掘与目标蛋白具有亲和力的多肽、特异性抗体的Fab片段、DARPin或纳米体并获取相应的氨基酸序列，并设计连接体和招募E3泛素连接酶的配体的氨基酸序列，获得靶向水解蛋白的多肽或蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO: 7~10，根据所述氨基酸序列获取靶向水解蛋白的多肽或蛋白的核酸序列SEQ ID NO: 11~14；
（2）构建含有所述靶向水解蛋白的多肽或蛋白的核酸序列的重组质粒；
（3）将所述重组质粒导入宿主细胞，获得的重组宿主细胞长效表达靶向水解蛋白的多肽或蛋白。
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