KR101577839B1 - 이종 단백질의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

천연형 단백질 또는 재조합 단백질을 고생산량으로 제조할 수 있는 방법을 제공한다.
알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현하고, 또한 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 세포를 배양하여, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.

Description

이종 단백질의 제조 방법 {METHOD OF PRODUCING HETEROGENEOUS PROTEIN}
본 발명은 이종(異種) 단백질의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 알라닌아미노트랜스페라아제를 강(强)발현하는 세포를 사용하여 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술을 이용하여, 의약으로서 유용한 단백질을 생산할 때 동물 세포를 사용하면, 원핵 세포가 수행할 수 없는 복잡한 번역 후 수식이나 폴딩이 가능해지므로, 동물 세포는 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포로서 다용되어 왔다.
최근, 항체나 생리 활성 단백질 등의 다양한 바이오 의약품이 배출되고 있는데, 재조합 단백질을 효율적으로 동물 세포에게 생산케 하는 기술은 바이오 의약품의 저비용화로 연결되어 환자에게 안정적인 공급을 약속하는 것이다.
따라서, 보다 생산 효율이 높은 단백질의 제조 방법이 요망되고 있다.
알라닌은 단백질 구성 아미노산 중 하나로, 비필수 아미노산이다. 생체 내에서는, 피루브산에 글루탐산의 아미노기가 전이됨으로써 생합성된다. 또, 역반응으로 분해된다.
알라닌의 분해 효소로서는, 알라닌아미노트랜스페라아제 (EC 2.6.1.2.)(비특허문헌 1) 가 알려져 있는데, 이 효소는 알라닌의 아미노기를 2-옥소글루타르산으로 전이시켜 글루탐산을 생성시킨다. 알라닌아미노트랜스페라아제는 글루타민-피루브산트랜스아미나아제라고도 불리고, GPT 로 약칭된다 (비특허문헌 2). GPT 는 GOP (아스파르트산아미노트랜스페라아제) 와 함께, 간장 중에 함유되는 효소로서, 간장의 세포가 파괴되면 혈액 중에 방출되기 때문에, GPT 와 GOT 가 이상(異常) 고가를 나타내는 경우에는 간장에 어떠한 장해가 있다고 진단된다.
이와 같이, 알라닌아미노트랜스페라아제는 간기능의 마커로서 이용되고 있는데, 알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현한 CHO 세포 등의 숙주 세포가 어떤 거동을 나타내는지에 대해서는 알려지지 않았다.
Sanjay B. J., et. al., Hepatology (2004) 39(5), 1297-1302 Melanie M. S., et. al., Genomics (1997) 40, 247-252
본 발명은 천연형 단백질 또는 재조합 단백질을 높은 생산량으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 알라닌아미노트랜스페라아제 (이하, 「ALT」라고 기재하는 경우도 있다) 를 강발현하는 세포를 사용함으로써 원하는 폴리펩티드의 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 또한, ALT 와 타우린 트랜스포터를 공(共)발현시키는 세포를 사용함으로써, 원하는 폴리펩티드의 생산량을 더욱 증가시킬 수 있었다. 세포 배양에서, 알라닌은 시간 경과적으로 다량 생성되므로, 세포 내에 축적된 알라닌은 배지 중에 분비된다. ALT 강발현에 의해, 알라닌으로부터 피루브산이나 글루탐산을 생합성시키는 반응을 촉진할 수 있으면, TCA 회로에서의 대사나, 당신생(糖新生)에 의한 글루코오스 생성에 이용되어, 세포의 배양 거동이 개선되고, 원하는 폴리펩티드의 고생산이 기대된다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현하고, 또한 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 세포를 배양시켜, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
(2) 알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현하는 세포가 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 를 도입한 세포인 (1) 기재된 제조 방법.
(3) 알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현하는 세포가 추가로 타우린 트랜스포터를 강발현하는 (1) 또는 (2) 기재된 제조 방법.
(4) 타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포가 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 를 도입한 세포인 (3) 기재된 제조 방법.
(5) 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 (2) 또는 (4) 기재된 제조 방법.
(6) 원하는 폴리펩티드가 항체인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(7) 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 가 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 하나인 (2) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(a) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(b) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(c) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열과 70 % 이상의 동일성을 갖고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(d) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA
(e) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(8) (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 폴리펩티드를 함유하는 의약품을 제조하는 방법.
(9) 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 가 도입되어 있는 세포.
(10) 추가로 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 가 도입되어 있는 (9) 기재된 세포.
(11) 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 와 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 가 도입되어 있는 세포.
(12) 알라닌아미노트랜스페라아제를 강발현하고, 또한 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 세포를
Figure 112010007923815-pct00001
-케토글루탈산을 함유하는 배지에서 배양시켜, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
본 발명에 의해, 원하는 폴리펩티드의 생산량을 증가시킬 수 있게 되었다.
본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본 특허출원, 일본 특허출원 2007-205158 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은 인간 ALT1 (496 아미노산) 을 발현시킨 Puromycin 선발용 플라스미드이다.
도 2 는 인간 ALT1 (496 아미노산) 을 발현시킨 Hygromycin 선발용 플라스미드이다.
도 3 은 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 유가(流加) 배양 17 일째의 항(抗)글리피칸-3 항체 생성량 플롯이다. pPur-ALT1 도입 세포 (n = 4) 의 항글리피칸-3 항체 생성량은 pPur 도입 세포 (n = 3) 에 대해 우위였다 (P < 0.01).
도 4 는 ALT1 발현주인 A72 및 컨트롤주 P41 의 1 ℓ Jar 유가 배양에서의 항체 생성량을 나타내는 그래프이다. 배양 19 일째의 A72 의 항글리피칸-3 항체 생성량은 2.9 g/ℓ 이고 P41 보다 높았다.
도 5 는 ALT1 발현주인 A72 및 컨트롤주 P41 의 생존률을 나타내는 그래프이다. 배양 후기에서의 A72 의 생존률은 P41 보다 높았다.
도 6 은 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 유가 배양 4 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량 플롯이다. pHyg-TauT/pPur-ALT1 공도입 세포 (n = 6) 의 항글리피칸-3 항체 생성량은 pHyg-TauT/pPur 공(共)도입 세포 (n = 8) 에 대해 우위였다 (P < 0.01).
도 7 은 TauT/ALT1 공발현주인 TA41 의 1 ℓ Jar 유가 배양의 항체 생성량을 나타내는 그래프이다. 배양 21 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량은 5.3 g/ℓ 였다.
도 8 은 클로닝된 CHO 세포 유래 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자의 염기 배열 및 아미노산 배열을 나타낸다.
도 9 는 신규로 클로닝한 CHO 세포 유래 타우린 트랜스포터막 토폴로지이다.
도 10 은 Hamster TauT (622 아미노산) 를 발현시킨 플라스미드이다.
도 11 은 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 배치 배양 7 일째의 생세포 밀도 플롯이다. pHyg/TauT 도입 세포의 생세포 밀도는 pHyg 도입 세포에 대해 우위였다.
도 12 는 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 배치 배양 7 일째의 락트산 생성량 플롯이다. pHyg/TauT 도입 세포는 저락트산 생성이고, pHyg 도입 세포에 대해 우위였다.
도 13 은 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 배치 배양 7 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량 플롯이다. pHyg/TauT 도입 세포의 7 주 중 4 주는 pHyg 도입 세포의 최고값 이상의 항체 생성량을 갖고 있었다.
도 14 는 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 유가 배양 7 일째의 항글리피칸 3 항체 생성량 플롯이다. pHyg/TauT 도입 세포의 항글리피칸-3 항체는 pHyg 도입 세포에 대해 우위였다.
도 15 는 증식력이 높은 pHyg/TauT 도입 세포인 T10 의 1 ℓ 자(jar)에 의한 유가 배양에서의 생존률을 나타내는 그래프이다. T10 의 생존률은 배양 32 일째에도 80 % 이상이었다.
도 16 은 정치(靜置) 배양에서의 확대 과정에서 증식력이 높은 pHyg/TauT 도입 세포인 T10 의 1 ℓ 자에 의한 유가 배양에서의 항체 생성량을 나타내는 그래프이다. 배양 35 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량은 2.9 g/ℓ 였다.
도 17 은 TauT 도입 T10 세포가 세포막 상에 TauT 분자를 발현시키고 있는 것을 나타내는 플로우 사이트 메트리의 분석 결과이다.
도 18 은 1 ℓ 자 유가 배양 중의 세포 내 암모니아 함량 (농도비) 을 나타내는 그래프이다. 친주에 대해, pHyg/TauT 도입주의 암모니아 억제는 현저하였다.
도 19 는 배지 중의 타우린 농도에 의존하여 타우린이 세포 내에 주입되어 있는 것을 나타내는 그래프이다. 타우린의 주입량은 pHyg/TauT 도입주와 친주에서 차는 확인되지 않았다.
도 20 은 배지 중의 글루타민 소비를 나타내는 그래프이다. pHyg/TauT 도입주는 친주에 대해, 배지 중의 타우린 농도에 의존하지 않아 세포당 글루타민 소비량이 현저하게 높았다.
도 21 은 pHyg/TauT 도입주의 항글리피칸-3 항체 생성량이 배양 개시시의 배지 중의 타우린 농도에 의존하지 않고, 동일한 정도인 것을 나타내는 그래프이다.
도 22 는 TauT/ALT 공발현주 TA41 의 쉐이커 fed-batch 배양 14 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량을 나타낸다.
Figure 112010007923815-pct00002
-케토글루탈산 첨가에 의해 항체 생성량이 증가되었다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 ALT 를 강발현하고, 또한 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 세포를 배양시켜, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 세포는 원하는 폴리펩티드를 생성할 수 있는 천연 세포이어도 되고, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 형질 전환 세포이어도 되는데, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 형질 전환 세포가 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 원하는 폴리펩티드는 특별히 한정되지 않고, 항체 (예를 들어, 항 IL-6 리셉터 항체, 항 IL-6 항체, 항글리피칸-3 항체, 항 CD3 항체, 항 CD20 항체, 항 GPIIb/IIIa 항체, 항 TNF 항체, 항 CD25 항체, 항 EGFR 항체, 항 Her2/neu 항체, 항 RSV 항체, 항 CD33 항체, 항 CD52 항체, 항 IgE 항체, 항 CD11a 항체, 항 VEGF 항체, 항 VLA4 항체 등) 나 생리 활성 단백질 (과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴, 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 인터류킨, t-PA, 우로키나제, 혈청 알부민, 혈액 응고 인자, PTH 등) 등 어떠한 폴리펩티드이어도 되는데, 특히 항체가 바람직하다. 항체는, 천연 항체, Fab, scFv, sc(Fv)2 등의 저분자화 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등의 어떠한 항체이어도 된다.
ALT 를 강발현하는 세포를 사용함으로써 세포에 의한 폴리펩티드의 생성량을 증가시킬 수 있다.
ALT 는 본래, 알라닌의 아미노기를 2-옥소글루타르산으로 전이시키고, 글루탐산을 생성시키는 효소로서 알려져 있다. 본 발명자들은 CHO 세포 등의 숙주 세포 내에서 강발현함으로써 알라닌으로부터 피루브산이나 글루탐산을 생합성시키는 반응을 촉진할 수 있으면, TCA 회로에서의 대사나, 당신생에 의한 글루코오스 생성에 이용되어, 세포의 배양 거동이 개선되고, 원하는 폴리펩티드의 타카오산이 기대된다고 생각하였다.
ALT 를 강발현하는 세포는 천연 세포와 비교하여 ALT 의 발현량이 증가되어 있는 세포이면 특별히 한정되지 않는다. 천연 세포는 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어 CHO 세포 등 재조합 단백질을 제조할 때 숙주로서 사용되고 있는 세포를 들 수 있다.
ALT 를 강발현하는 세포로서는, 예를 들어, ALT 유전자가 인위적으로 도입된 세포를 들 수 있다. ALT 유전자가 인위적으로 도입된 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있고, 예를 들어, ALT 유전자를 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 세포에 형질 전환시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 유전자 활성화 기술 (예를 들어, 국제 공개 제WO94/12650호 팜플렛 참조) 에 의해 내인성(內因性) ALT 유전자가 활성화되고, 그 결과, ALT 가 강발현된 세포도 ALT 유전자가 인위적으로 도입된 세포에 포함된다.
세포에 강발현하는 ALT 유전자로서는 어떠한 생물에서 유래하는 ALT 이어도 되며 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 인간, 마우스, 래트, 개, 아프리카 발톱 개구리, 초파리, 선충, 일본쌀, 원자 홍조, 빵 효모, 사상균 Ashbya gossypii, 진균 Candida albicans, 분열 효모, 진균 Aspergillus nidulans, 진균 Aspergillus fumigatus, 청주 누룩곰팡이 Aspergillus oryzae, 진균 Cryptococcus neoformans, 세포성 점균 Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, 세포 내 기생성 원충 Leishmania major, 적리 아메바 Entamoeba histolytica 또는 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 등의 ALT 가 공지되어 있었고, 이것들을 이용할 수 있는데, 인간, 설치류 혹은 숙주 세포와 동일한 종 유래의 ALT 인 것이 바람직하고, 예를 들어, ALT 를 강발현하는 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 인 경우에는, 인간 혹은 햄스터 유래의 ALT 인 것이 바람직하다. 인간, 마우스, 효모 등의 ALT 는 Variant (ALT1 과 ALT2) 가 존재한다. ALT2 는 ALT1 에 대해 아미노산 레벨로 80 % 이상의 상동성이 있다. 후술하는 실시예에서는 ALT1 을 강제 발현시켰다.
ALT 유전자로서는, 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 것의 DNA 를 들 수 있다.
(a) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(b) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수 (예를 들어, 몇 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(c) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열과 70 % 이상의 동일성을 갖고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(d) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA
(e) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
ALT 를 강발현하는 세포는 동물 세포, 식물 세포, 효모 등의 진핵 세포 ; 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 등 어떤 세포이어도 되고, CHO 세포, COS 세포 등의 동물 세포가 바람직하고, 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또, 원하는 폴리펩티드를 제조하기 위해서는, CHO dhfr-세포 등 원하는 유전자를 도입하는 데 적합한 세포인 것이 바람직하다.
ALT 를 강발현하는 세포는 원하는 폴리펩티드를 제조하기 위해, 추가로 타우린 트랜스포터를 강발현하고 있는 것이 바람직하다. 당해 세포에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입하고, 그 세포를 배지 내에서 배양시킴으로써, 보다 대량으로 원하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
ALT 유전자가 인위적으로 도입된 세포를 사용하여 원하는 폴리펩티드를 제조하는 경우, ALT 유전자와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입 순서는 특별히 제한되지 않아, ALT 유전자를 도입한 후에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입해도 되고, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입한 후에 ALT 유전자를 도입해도 된다. 또, ALT 유전자와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 동시에 도입해도 된다.
ALT 유전자 및 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입은 단일한 벡터에 의해 동시에 도입해도 되고, 복수의 벡터를 사용하여 각각 도입해도 된다.
ALT 외에 타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포를 사용함으로써, 세포 내 암모니아 농도를 억제시킬 수 있다.
타우린 트랜스포터는 타우린, β-알라닌이나 각종 아미노산을 세포 내에 주입할 수 있는, 침투압 조절 기능을 갖는 막단백질이다.
타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포는 천연 세포와 비교하여 타우린 트랜스포터의 발현량이 증가되어 있는 세포이면 특별히 한정되지 않는다. 천연 세포는 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어 CHO 세포 등 재조합 단백질을 제조할 때 숙주로서 사용되고 있는 세포를 들 수 있다.
타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포로서는, 예를 들어, 타우린 트랜스포터 유전자가 인위적으로 도입된 세포를 들 수 있다. 타우린 트랜스포터 유전자가 인위적으로 도입된 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있고, 예를 들어, 타우린 트랜스포터 유전자를 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 세포에 형질 전환시킴으로써 제조할 수 있다.
세포에 강발현하는 타우린 트랜스포터 유전자로서는, 어떤 생물 유래의 타우린 트랜스포터이어도 되며 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터 등 설치류 등의 생물 유래의 타우린 트랜스포터를 들 수 있고, 인간, 설치류 혹은 숙주 세포와 동일한 종 유래의 타우린 트랜스포터인 것이 바람직하고, 예를 들어, 타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 인 경우에는, 인간 혹은 햄스터 유래의 타우린 트랜스포터인 것이 바람직하다.
타우린 트랜스포터 유전자로서는, 타우린 트랜스포터를 코드하는 이하의 (a1) ∼ (e1) 중 어느 하나의 DNA 를 들 수도 있다.
(a1) 배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(b1) 배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수 (예를 들어, 수 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(c1) 배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열과 70 % 이상의 동일성을 갖고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
(d1) 배열 번호 61, 63, 65 또는 67 의 염기 배열을 갖는 DNA
(e1) 배열 번호 61, 63, 65 또는 67 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
원하는 폴리펩티드를 제조하려면, 타우린 트랜스포터와 ALT 유전자를 강발현하는 세포에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입하여, 그 세포를 배지 중에서 배양시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 유전자 활성화 기술 (예를 들어, 국제공개 제WO94/12650호 팜플렛 참조) 에 의해, 그 세포의 내인성의 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 활성화됨으로써, 원하는 폴리펩티드를 생성하는 세포를 사용하여, 원하는 폴리펩티드를 제조할 수도 있다.
타우린 트랜스포터 유전자와 ALT 유전자가 인위적으로 도입된 세포를 사용하여 원하는 폴리펩티드를 제조하는 경우, 타우린 트랜스포터 유전자와 ALT 유전자와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입 순서는 특별히 제한되지 않아, 타우린 트랜스포터 유전자와 ALT 유전자를 도입한 후에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입해도 되고, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입한 후에 타우린 트랜스포터 유전자와 ALT 유전자를 도입해도 된다. 또, 타우린 트랜스포터 유전자와 ALT 유전자와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 동시에 도입해도 된다.
타우린 트랜스포터 유전자, ALT 유전자 및 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입은 단일한 벡터에 의해 동시에 도입해도 되고, 복수의 벡터를 사용하여 각각 도입해도 된다.
ALT 를 강발현하는 세포 (타우린 트랜스포터를 강발현해도 된다) 의 배양에는, 통상적인 세포 (바람직하게는, 동물 세포) 배양에서 사용되고 있는 배지를 사용할 수 있다. 이들에는 통상적으로, 아미노산, 비타민류, 지질 인자, 에너지원, 침투압 조절제, 철원, pH 완충제를 함유한다. 이들 성분의 함량은 통상적으로 아미노산은 0.05 - 1500 ㎎/ℓ, 비타민류는 0.001 - 10 ㎎/ℓ, 지질 인자는 0 - 200 ㎎/ℓ, 에너지원은 1 - 20 g/ℓ, 침투압 조절제는 0.1 - 10000 ㎎/ℓ, 철원은 0.1 - 500 ㎎/ℓ, pH 완충제는 1 - 10000 ㎎/ℓ, 미량 금속 원소는 0.00001 - 200 ㎎/ℓ, 계면 활성제는 0 - 5000 ㎎/ℓ, 증식 보조 인자는 0.05 - 10000 ㎍/ℓ 및 뉴클레오시드는 0.001 - 50 ㎎/ℓ 의 범위가 적당한데, 이들에 한정되지 않고, 배양하는 세포의 종류, 원하는 폴리펩티드의 종류 등에 의해 적절히 결정할 수 있다.
상기 성분 외에, 예를 들어, 미량 금속 원소, 계면 활성제, 증식 보조 인자, 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다.
구체적으로는, 예를 들어, L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이로류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-오르니틴, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 등, 바람직하게는 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스틴, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이로류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 등의 아미노산류 ; i-이노시톨, 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴아미드, 니코틴산, p-아미노벤조산, 판토텐산칼슘, 염산피리독살, 염산피리독신, 리보플라빈, 염산티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등, 바람직하게는 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴산아미드, 판토텐산칼슘, 염산피리독살, 리보플라빈, 염산티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등의 비타민류 ; 염화콜린, 타르타르산콜린, 리놀산, 올레산, 콜레스테롤 등, 바람직하게는 염화콜린 등의 지질 인자 ; 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸룩토오스 등, 바람직하게는 글루코오스 등의 에너지원 ; 염화나트륨, 염화칼륨, 질산칼륨 등, 바람직하게는 염화나트륨 등의 침투압 조절제 ; EDTA 철, 시트르산 철, 염화 제 1 철, 염화 제 2 철, 황산 제 1 철, 황산 제 2 철, 질산 제 2 철 등, 바람직하게는 염화 제 2 철, EDTA 철, 시트르산 철 등의 철원류 ; 탄산수소나트륨, 염화칼슘, 인산 2 수소나트륨, HEPES, MOPS 등, 바람직하게는 탄산수소나트륨 등의 pH 완충제를 함유하는 배지를 예시할 수 있다.
상기 성분 외에, 예를 들어, 황산구리, 황산망간, 황산아연, 황산마그네슘, 염화니켈, 염화주석, 염화마그네슘, 아(亞)규산나트륨 등, 바람직하게는 황산구리, 황산아연, 황산마그네슘 등의 미량 금속 원소 ; Tween80, 플루로닉 F68 등의 계면 활성제 ; 및 재조합형 인슐린, 재조합형 IGF-1, 재조합형 EGF, 재조합형 FGF, 재조합형 PDGF, 재조합형 TGF-
Figure 112010007923815-pct00003
, 염산에탄올아민, 아(亞)셀렌산나트륨, 레티노인산, 염산프토렉신 등, 바람직하게는 아셀렌산나트륨, 염산에탄올아민, 재조합형 IGF-1, 염산프토렉신 등의 증식 보조 인자 ; 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘 등의 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다. 또한 상기 배지의 적합예에서는, 스트렙토마이신, 페니실린 G 칼륨 및 겐타마이신 등의 항생 물질이나, 페놀레드 등의 pH 지시약을 포함하고 있어도 된다.
또, 배지에는, ALT 의 기질이 되는
Figure 112010007923815-pct00004
-케토글루탈산을 첨가해도 된다.
Figure 112010007923815-pct00005
-케토글루탈산의 첨가에 의해, 원하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 의 생성량이 증가될 수 있다. 이 때의
Figure 112010007923815-pct00006
-케토글루탈산의 첨가량은 통상적으로 0.01 ∼ 1000 mM 의 범위이면 되고, 0.1 ∼ 100 m 가 바람직하고, 또한 1 ∼ 10 mM 가 바람직하다.
배지의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이한데, 일반적으로는 pH 6.8 ∼ 7.6, 대부분의 경우 pH 7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.
배지는 시판되는 동물 세포 배양용 배지, 예를 들어, D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), D-MEM/F-12 1 : 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO-S-SFM II (Invitrogen 사), CHO-SF (Sigma-Aldrich 사), EX-CELL 301 (JRH biosciences 사), IS CHO-V (Irvine Scientific 사), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich 사) 등의 배지를 사용할 수도 있다.
또한, 배지는 무혈청 배지, 예를 들어, CD-CHO (Invitrogen 사) 이어도 된다.
ALT 를 강발현하는 세포 (타우린 트랜스포터를 강발현해도 된다) 가 CHO 세포인 경우, CHO 세포의 배양은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 기상의 CO2 농도가 0 - 40 %, 바람직하게는 2 - 10 % 의 분위기 하, 30 - 39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 정도로 배양할 수 있다.
또한 배양 세포에서 항체 등의 원하는 폴리펩티드를 생성하는 경우, 배양 후기에는 세포가 상당히 고밀도 상태 (대략 1 x 107 cells/㎖) 가 되고, 락트산 등 노폐물의 영향이 매우 높아진다. ALT 를 강발현하는 세포에 의해 원하는 폴리펩티드를 제조하면, 배양 후기에도 높은 생존률을 유지하여, 원하는 폴리펩티드의 생성량 향상에 대해서도 기대할 수 있다.
ALT 를 강발현하는 세포를 사용하여 원하는 폴리펩티드를 생성시키기 위해 적당한 배양 기간은 통상적으로 1 일 ∼ 3 개월이고, 바람직하게는 1 일 ∼ 2 개월, 더욱 바람직하게는 1 일 ∼ 1 개월이다.
또, 동물 세포 배양용 각종 배양 장치로서는, 예를 들어 발효조형 탱크 배양 장치, 에어리프트형 배양 장치, 컬쳐 플라스크형 배양 장치, 스피너 플라스크형 배양 장치, 마이크로 캐리어형 배양 장치, 유동층형 배양 장치, 호로파이버형 배양 장치, 롤러 보틀형 배양 장치, 충전조형 배양 장치 등을 사용하여 배양할 수 있다.
배양은 배치 배양 (batch culture), 유가 배양 (fed-batch culture), 연속 배양 (continuous culture) 등 중 어느 방법을 이용해도 되는데, 유가 배양 또는 연속 배양이 바람직하고, 유가 배양이 보다 바람직하다.
또한, ALT 를 강발현하는 세포 (타우린 트랜스포터를 강발현해도 된다) 를 강발현하는 세포를 배양할 때에, 세포에 대한 타우린의 주입을 촉진시키기 위해 배지 중에 타우린을 첨가해도 된다. 배지에 첨가하는 타우린의 농도는 특별히 한정되지 않는데, 통상적으로 0 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ, 바람직하게는 0 g/ℓ ∼ 20 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 0 g/ℓ ∼ 10 g/ℓ 이다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 폴리펩티드가 의약으로서 이용할 수 있는 생물학적 활성을 갖는 경우에는, 이 폴리펩티드를 의약적으로 허용되는 담체 또는 첨가제와 혼합하여 제제화시킴으로써 의약품을 제조할 수 있다.
의약적으로 허용되는 담체 및 첨가제의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 카세인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
실제 첨가물은 본 발명 치료제의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절하게 조합하여 선택되는데, 물론 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 폴리펩티드를 용제, 예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등에 용해시키고, 이것에 흡착 방지제, 예를 들어 Tween80, Tween20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 혹은, 사용 전에 용해 재구성하는 제형으로 하기 위해 동결 건조시킨 것이어도 되고, 동결 건조를 위한 부형제로서는, 예를 들어, 만니톨, 포도당 등의 당 알코올이나 당류를 사용할 수 있다.
폴리펩티드의 유효 투여량은 폴리펩티드의 종류, 치료나 예방의 대상으로 하는 질환의 종류, 환자의 연령, 질환의 중독도(重篤度) 등에 의해 적절히 선택된다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항글리피칸 항체인 경우, 항글리피칸 항체의 유효 투여량은 1 회에 체중 1 kg 당 0.001 mg 내지 1000 mg 의 범위에서 선택된다. 혹은, 환자당 0.01 ∼ 100000 mg/body 의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다.
폴리펩티드의 투여 방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 것도 가능한데, 바람직하게는 비경구 투여이고, 구체적으로는 주사 (예를 들어, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의한 전신 또는 국소 투여), 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다.
본 발명에서, ALT 를 코드하는 유전자로서 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용하면 된다. 그 밖에도, 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용해도 된다.
배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간, 마우스, 래트, 개, 아프리카 발톱 개구리, 초파리, 선충, 일본쌀, 원자 홍조, 빵 효모, 사상균 Ashbya gossypii, 진균 Candida albicans, 분열 효모, 진균 Aspergillus nidulans, 진균 Aspergillus fumigatus, 청주 누룩곰팡이 Aspergillus oryzae, 진균 Cryptococcus neoformans, 세포성 점균 Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, 세포 내 기생성 원충 Leishmania major, 적리 아메바 Entamoeba histolytica 또는 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi ALT (이하,「인간 등의 ALT」라고 기재하는 경우도 있다) 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드이다. 이와 같은 폴리펩티드에는, 예를 들어, 인간 등의 ALT 의 변이체 등이 함유된다. 후술하는 실시예에서는, 공개되어 있는 인간 ALT1 유전자가 코드하고 있는 아미노산 496 개 중, 4 아미노산 (R53S, Q72R, F286S, M332K) 이 치환되어 있는 변이체가 사용되었다.
어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자이면, 부위 특이적 변이 유발법 (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 이용하여, 인간 등의 ALT 아미노산에 적절히 변이를 도입함으로써 인간 등의 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제할 수 있다. 또, 아미노산의 변이는 자연계에서도 생길 수 있다.
인간 등의 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드로서는, 구체적으로는 인간 등의 ALT 의 아미노산 배열 (예를 들어, 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60) 중의 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 1 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 결실된 것, 인간 등의 ALT 아미노산 배열에 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 1 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 부가된 것, 인간 등의 ALT 의 아미노산 배열 중의 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 1 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 등을 들 수 있다.
변이되는 아미노산 잔기는 특별히 한정되지 않는데, 아미노산 측사슬의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들어 아미노산 측사슬의 성질로서는, 소수성 아미노산 (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산 (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측사슬을 갖는 아미노산 (G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (S, T, Y), 황원자 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (D, N, E, Q), 염기 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (R, K, H), 방향족 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (H, F, Y, W) 을 들 수 있다 (괄호 내는 모두 아미노산의 1 문자 표기를 나타낸다).
또한, 어느 아미노산 배열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다 (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984)81, 5662-5666, Zoller, M.J. & Smith, M.Nucleic Acids Research (1982)10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982)79, 6409-6413).
인간 등의 ALT 에 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 폴리펩티드로서는, 예를 들어, 인간 등의 ALT 를 함유하는 융합 폴리펩티드를 들 수 있다. 융합 폴리펩티드는 인간 등의 ALT 와 다른 폴리펩티드가 융합된 것이다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법은 인간 등의 ALT 를 코드하는 유전자와 다른 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현 벡터에 도입시켜 숙주로 발현시키면 되고, 당업자에게 공지된 수법을 사용할 수 있다. 인간 등의 ALT 와의 융합에 사용되는 다른 폴리펩티드로서는, 특별히 한정되지 않는다.
인간 등의 ALT 와의 융합에 사용되는 다른 펩티드로서는, 예를 들어, FLAG (Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988)6, 1204-1210), 6 개의 His (히스티딘) 잔기로 이루어지는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소 (HA), 인간 c-myc 의 단편(斷片), VSV-GP 의 단편, p18HIV 의 단편, T7-tag, HSV-tag , E-tag , SV40T 항원의 단편, lck tag,
Figure 112010007923815-pct00007
-tubulin 의 단편, B-tag , Protein C 의 단편, GST (글루타티온-S-트랜스페라아제), HA (인플루엔자 응집소), 면역 글로불린 정상 영역, β-갈락토시다아제, MBP (말토오스 결합 폴리펩티드) 등을 들 수 있다.
시판되어 있는 이들 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 인간 등의 ALT 를 코드하는 유전자와 융합시키고, 이로써 조제된 융합 유전자를 발현시킴으로써 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.
또, 어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로서는, 하이브리다이제이션 기술 (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) 을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자이면, 인간 등의 ALT 를 코드하는 DNA 배열 (예를 들어, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 DNA 배열) 혹은 그 일부를 기본으로, 이것과 상동성이 높은 DNA 를 단리시키고, 그 DNA 로부터 인간 등의 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 단리시키는 것도 통상적으로 실시할 수 있는 것이다.
인간 등의 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 단리시키 위한 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건은 예를 들어 저(低)스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 저스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 42 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 를 들 수 있고, 바람직하게는 50 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 이다. 또한 보다 바람직하게는 고(高)스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 고스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 65 ℃, 2×SSC 및 0.1 % SDS 를 들 수 있다. 이들 조건에서, 온도를 낮출수록 높은 상동성을 갖는 DNA 뿐만 아니라, 낮은 상동성만 가지고 있는 DNA 까지도 포괄적으로 얻을 수 있다. 반대로, 온도를 높일수록, 높은 상동성을 갖는 DNA 만이 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 온도 이외에도 염 농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자이면 이들 요소를 적절히 선택하는 것으로 동일한 스트린젠시를 실현할 수 있다.
이들 하이브리다이제이션 기술에 의해 단리되는 DNA 가 코드하는 폴리펩티드는 인간 등의 ALT 와 아미노산 배열에서 70 % 이상의 동일성을 갖는 것이면 되는데, 통상적으로 인간 등의 ALT 와 아미노산 배열에서 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 통상적으로 97 % 이상의 동일성, 바람직하게는 98 % 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 동일성을 나타낸다. 폴리펩티드의 동일성을 결정하려면, 문헌 (Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)80, 726-730) 에 기재된 알고리즘에 따르면 된다.
폴리펩티드는 후술하는 그것을 생성하는 세포나 숙주 혹은 정제 방법에 의해, 아미노산 배열, 분자량, 등전점 또는 당사슬의 유무나 형태 등이 상이할 수도 있다. 그러나, 얻어진 폴리펩티드가 인간 등의 ALT 와 동등한 기능을 갖고 있는 한, 그것을 코드하는 DNA 를 본 발명에서 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 원핵 세포, 예를 들어 대장균으로 발현시켰을 경우, 본래의 폴리펩티드의 아미노산 배열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 또, 진핵 세포, 예를 들어 포유 동물 세포로 발현시켰을 경우, N 말단의 시그널 배열은 제거된다. 이와 같은 폴리펩티드를 코드하는 DNA 도 본 발명에서 이용할 수 있다.
폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 재조합 폴리펩티드로서 또 천연 폴리펩티드로서 조제할 수 있다. 재조합 폴리펩티드이면, 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를, 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 이것을 적당한 숙주 세포에 도입하여 얻은 형질 전환체를 회수하고, 추출물을 얻은 후, 이온 교환, 역상, 겔 여과 등의 크로마토그래피, 혹은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 칼럼에 고정시킨 어피니티 크로마토그래피에 넣음으로써, 또는, 추가로 이들 칼럼을 복수 조합함으로써 정제시켜 조제할 수 있다.
또, 폴리펩티드를 글루타티온 S 트랜스페라아제 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서, 혹은 히스티딘을 복수 부가시킨 재조합 폴리펩티드로서 숙주 세포 (예를 들어, 동물 세포나 대장균 등) 내에서 발현시킨 경우에는, 발현시킨 재조합 폴리펩티드는 글루타티온 칼럼 혹은 니켈 칼럼을 사용하여 정제시킬 수 있다.
융합 폴리펩티드의 정제 후, 필요에 따라 융합 폴리펩티드 중 목적으로 하는 폴리펩티드 이외의 영역을, 트롬빈 또는 팩터 Xa 등에 의해 절단하여 제거할 수도 있다.
천연 폴리펩티드이면, 당업자에게 주지된 방법, 예를 들어, 인간 ALT 와 동등한 기능을 갖고 있는 폴리펩티드를 발현시키고 있는 조직이나 세포의 추출물에 대해, 인간 ALT 에 결합하는 항체가 결합된 어피니티 칼럼을 작용시켜 정제시킴으로써 단리할 수 있다. 항체는 폴리크로날 항체이어도 되고 모노크로날 항체이어도 된다.
본 발명에서, ALT 를 코드하는 DNA 로서 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 를 사용해도 된다. 그 밖에도, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 ALT 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용해도 된다.
ALT 를 코드하는 DNA 는 상기 서술한 원하는 폴리펩티드의 in vivo 나 in vitro 에서의 생산에 이용되는 것 외에, ALT 를 강발현하는 세포의 제조에 사용할 수 있다. ALT 를 코드하는 DNA 는 ALT 를 코드할 수 있는 것이면, 어떠한 형태이어도 된다. 즉, mRNA 로부터 합성된 cDNA 인지, 게놈 DNA 인지, 화학 합성 DNA 인지 등에 상관없다. 또, ALT 를 코드하는 DNA 를 코드할 수 있는 한, 유전 암호의 축중(縮重)에 기초하는 임의의 염기 배열을 갖는 DNA 가 함유된다.
ALT 를 코드하는 DNA 는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들어, ALT 를 발현시키고 있는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, ALT 의 DNA 의 배열 (예를 들어, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59) 의 일부를 프로브로 하고 하이브리다이제이션을 실시함으로써 조제할 수 있다. cDNA 라이브러리는 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 에 기재된 방법에 의해 조제해도 되고, 시판되는 유전자 라이브러리를 사용해도 된다. 또, ALT 를 발현시키고 있는 세포로부터 RNA 를 조제하고, ALT 의 DNA 의 배열 (예를 들어, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59) 에 기초하여 올리고 DNA 를 합성하고, 이것을 프라이머로서 사용하여 PCR 반응을 실시하고, ALT 를 코드하는 cDNA 를 증폭시킴으로써 조제할 수도 있다.
또, 얻어진 cDNA 의 염기 배열을 결정함으로써, 그것이 코드하는 번역 영역을 결정할 수 있어, ALT 의 아미노산 배열을 얻을 수 있다. 또, 얻어진 cDNA 를 프로브로서 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 게놈 DNA 를 단리할 수 있다.
구체적으로는, 다음과 같이 하면 된다. 먼저, ALT 를 발현시키는 세포, 조직 등에서 mRNA 를 단리시킨다. mRNA 의 단리는, 공지된 방법, 예를 들어, 구아니딘 초원심법 (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979)18, 5294-5299), AGPC 법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159) 등에 의해 전체 RNA 를 조제하고, mRNA Purification Kit (Pharmacia) 등을 사용하여 전체 RNA 로부터 mRNA 를 정제시킨다. 또, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) 를 사용함으로써 mRNA 를 직접 조제할 수도 있다.
얻어진 mRNA 로부터 역전사 효소를 사용하여 cDNA 를 합성한다. cDNA 의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (생화학 공업) 등을 사용하여 실시할 수도 있다. 또, 프라이머 등을 사용하여 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 제) 및 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction ; PCR) 을 사용한 5'-RACE 법 (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989)17, 2919-2932) 에 따라, cDNA 의 합성 및 증폭을 실시할 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 조제하여 벡터 DNA 와 연결한다. 또한, 이것으로 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택하고 원하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA 의 염기 배열은 공지된 방법, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드체인터미네이션법에 의해 확인할 수 있다.
또, ALT 를 코드하는 DNA 에서는, 발현에 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하고, 보다 발현 효율이 높은 염기 배열을 설계할 수 있다 (Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981)9, r43-74). 또, ALT 를 코드하는 DNA 는 시판되는 키트나 공지된 방법에 의해 개변시킬 수 있다. 개변으로서는, 예를 들어, 제한 효소에 의한 소화, 합성 올리고 뉴클레오티드나 적당한 DNA 프래그먼트의 삽입, 링커의 부가, 개시 코돈 (ATG) 및/또는 종지 코돈 (TAA, TGA, 또는 TAG) 의 삽입 등을 들 수 있다.
ALT 를 코드하는 DNA 는 또한, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 이고, 또한 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 함유한다.
스트린젠트한 조건으로서는, 당업자이면 적절히 선택할 수 있는데, 예를 들어 저스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 저스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 42 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 를 들 수 있고, 바람직하게는 50 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 이다. 또한 보다 바람직하게는 고스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 고스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 65 ℃, 2×SSC 및 0.1 % SDS 를 들 수 있다. 이들 조건에서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA 를 얻을 수 있다. 상기의 하이브리다이즈하는 DNA 는 바람직하게는 천연 유래의 DNA, 예를 들어 cDNA 또는 염색체 DNA 이어도 된다.
이들 하이브리다이제이션 기술에 의해 단리되는 DNA 는 통상적으로 인간 등의 ALT 를 코드하는 DNA 와 염기 배열에서 높은 동일성을 갖는다. ALT 를 코드하는 DNA 에는, 인간 등의 ALT 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하고, 인간 등의 ALT 를 코드하는 DNA 와 높은 동일성을 갖는 DNA 도 포함된다. 높은 동일성이란, 통상적으로 96 % 이상의 동일성, 바람직하게는 98 % 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 동일성을 나타낸다. 염기 배열의 동일성은 Karlin and Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877, 1993) 에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘에 기초하여, BLASTN 나 BLASTX 로 불리는 프로그램이 개발되어 있다 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 403-410, 1990). BLAST 에 기초하여 BLASTN 에 의해 염기 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score = 100, wordlength = 12 로 한다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지된 것이다 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov.). ALT 를 코드하는 DNA 는 벡터에 삽입되면 된다.
벡터로서는, 예를 들어, 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 벡터를 대장균 (예를 들어, JM109, DH5
Figure 112010007923815-pct00008
, HB101, XL1Blue) 등으로 대량으로 증폭시켜 대량 조제하기 위해, 대장균으로 증폭되기 위한 「ori」를 갖고, 추가로 형질 전환된 대장균의 선발 유전자 (예를 들어, 어떠한 약제 (암피실린이나 테트라시클린, 카나마이신, 클로람페니콜) 에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자) 를 갖는 것이 바람직하다. 벡터의 예로서는, M13 계 벡터, pUC 계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또, cDNA 의 서브 클로닝, 절단을 목적으로 했을 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들어, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 생산하는 목적으로 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들어, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 벡터가 대장균으로 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5
Figure 112010007923815-pct00009
, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 했을 경우에는, 대장균으로 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터 (Ward 등, Nature (1989)341, 544-546 ; FASEB J.(1992)6, 2422-2427), araB 프로모터 (Better 등, Science (1988)240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1 (Pharmacia 사 제조), 「QIAexpress system」(Qiagen 사 제조), pEGFP, 또는 pET (이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리메라제를 발현시키고 있는 BL21 이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또, 벡터에는, 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 배열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 배열로서는, 대장균의 페리프라즘에 생성시키는 경우, pelB 시그널 배열 (Lei, S.P. et al J. Bacteriol. (1987)169, 4379) 을 사용하면 된다. 숙주 세포로의 벡터의 도입은 예를 들어 염화칼슘법, 일렉트로포레이션법을 이용하여 실시할 수 있다.
대장균을 숙주로 하는 경우 이외에도, 예를 들어, 원하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 벡터로서는, 포유 동물 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3 (Invitrogen 사 제조) 나, pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충 세포 유래의 발현 벡터 (예를 들어 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL 사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터 (예를 들어 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레토로 바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pZIpneo), 효모 유래의 발현 벡터 (예를 들어, 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen 사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pPL608, pKTH50) 등을 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물 세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터 (Mulligan 등, Nature (1979)277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1
Figure 112010007923815-pct00010
프로모터 (Mizushima 등, Nucleic Acids Res.(1990)18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 바람직하고, 세포에 대한 형질 전환을 선발하기 위한 유전자 (예를 들어, 약제 (네오마이신, G418 등) 에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자) 를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포 내에서의 유전자의 카피수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터 (예를 들어, pCHOI 등) 를 도입하고, 메토트렉사이트 (MTX) 에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현시키는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40 의 복제 기점을 갖는 벡터 (pcD 등) 로 형질 전환시키는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 파피로마 바이러스 (BPV) 등 유래의 것을 사용할 수 있다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드트랜스페라아제 (APH) 유전자, 티미딘키나제 (TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실트랜스페라아제 (Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 (dhfr) 유전자 등을 함유할 수 있다.
ALT 를 코드하는 DNA (벡터에 삽입되어 있어도 된다) 가 도입되는 숙주 세포로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 대장균이나 여러 가지 동물 세포 등을 사용할 수 있다. ALT 를 코드하는 DNA 가 도입된 숙주 세포에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입하면, 이 숙주 세포는 ALT 를 강발현할 수 있고, 원하는 폴리펩티드의 생산을 증가시킬 수 있다. ALT 를 코드하는 DNA 가 도입된 숙주 세포에는, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA (벡터에 삽입되어 있어도 된다) 가 추가로 도입되어도 된다. ALT 를 코드하는 DNA 가 도입된 숙주 세포에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 와 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 를 도입함으로써, 원하는 폴리펩티드의 생성량을 향상시킬 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생성계는 in vitro 및 in vivo 의 생성계가 있다. in vitro 의 생성계로서는, 진핵 세포를 사용하는 생성계나 원핵 세포를 사용하는 생성계를 들 수 있다.
본 발명에서, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 로서, 배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용하면 된다. 그 밖에도, 배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수 (예를 들어, 수 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용해도 된다.
배열 번호 62, 64, 66 또는 68 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수 (예를 들어, 수 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는/및 삽입된 아미노산 배열을 갖고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드는, 햄스터, 래트, 마우스 및 인간 타우린 트랜스포터 (이하, 「햄스터 등의 타우린 트랜스포터」라고 기재하는 경우도 있다) 와 기능적으로 동등한 폴리펩티드이다. 이와 같은 폴리펩티드에는, 예를 들어, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터의 변이체 등이 포함된다.
어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자이면, 부위 특이적 변이 유발법 (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하고, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터의 아미노산에 적절히 변이를 도입함으로써 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제할 수 있다. 또, 아미노산의 변이는 자연계에서도 발생될 수 있다.
햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드로서는, 구체적으로는 햄스터 등의 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열 중의 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 2 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 2 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 결실된 것, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터 아미노산 배열에 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 2 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 2 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 부가된 것, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터 아미노산 배열 중의 1 또는 2 개 이상, 바람직하게는 2 개 이상 30 개 이하, 보다 바람직하게는 2 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 등을 들 수 있다.
변이되는 아미노산 잔기는 특별히 한정되지 않는데, 아미노산 측사슬의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산에 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들어 아미노산 측사슬의 성질로는, 소수성 아미노산 (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산 (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측사슬을 갖는 아미노산 (G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (S, T, Y), 황원자 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (D, N, E, Q), 염기 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (R, K, H), 방향족 함유 측사슬을 갖는 아미노산 (H, F, Y, W) 을 들 수 있다 (괄호 내에는 모두 아미노산의 1 문자 표기를 나타낸다).
햄스터 등의 타우린 트랜스포터에 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 폴리펩티드로는, 예를 들어, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 함유하는 융합 폴리펩티드를 들 수 있다. 융합 폴리펩티드는 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 다른 폴리펩티드가 융합된 것으로, 본 발명에 포함된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법은 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자와 다른 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 프레임이 일치하도록 연결하고 이것을 발현 벡터에 도입하여 숙주로 발현시키면 되고, 당업자에게 공지된 수법을 사용할 수 있다. 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와의 융합에 사용되는 다른 폴리펩티드로서는, 특별히 한정되지 않는다.
햄스터 등의 타우린 트랜스포터와의 융합에 사용되는 다른 펩티드로는, 예를 들어, FLAG (Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988)6, 1204-1210), 6 개의 His (히스티딘) 잔기로 이루어지는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소 (HA), 인간 c-myc 의 단편, VSV-GP 의 단편, p18HIV 의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag,
Figure 112010007923815-pct00011
-tubulin 의 단편, B-tag, Protein C 의 단편, GST (글루타티온-S-트랜스페라아제), HA (인플루엔자 응집소), 면역 글로불린 정상 영역, β-갈락토시다아제, MBP (말토오스 결합 폴리펩티드) 등을 들 수 있다.
시판되는 이들 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자와 융합시키고, 이로써 조제된 융합 유전자를 발현시킴으로써 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.
또, 어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로는, 하이브리다이제이션 기술 (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) 을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자이면, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 배열 혹은 그 일부를 기본으로, 이것과 상동성이 높은 DNA 를 단리시키고, 그 DNA 로부터 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 단리시키는 것도 통상적으로 실시할 수 있는 것이다.
햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 단리시키기 위한 하이브리다이제이션의 조건으로는, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건은 예를 들어 저스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 저스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 42 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 를 들 수 있고, 바람직하게는 50 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 이다. 또한 보다 바람직하게는, 고스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 고스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 65 ℃, 2×SSC 및 0.1 % SDS 를 들 수 있다. 이들 조건에서, 온도를 낮출수록 높은 상동성을 갖는 DNA 뿐만 아니라, 낮은 상동성만 갖는 DNA 까지도 포괄적으로 얻을 수 있다. 반대로, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA 만이 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 온도 이외에도 염 농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자이면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현할 수 있다.
이들 하이브리다이제이션 기술에 의해 단리되는 DNA 가 코드하는 폴리펩티드는 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 아미노산 배열에서 70 % 이상의 동일성을 갖는 것이면 되고, 통상적으로 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 아미노산 배열에서 높은 상동성을 갖는다. 상기 폴리펩티드에는, 본 발명의 햄스터 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등하고, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터 아미노산 배열과 높은 상동성을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 높은 상동성이란, 통상적으로 97 % 이상의 동일성, 바람직하게는 98 % 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 동일성을 나타낸다. 폴리펩티드의 동일성을 결정하려면, 문헌 (Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)80, 726-730) 에 기재된 알고리즘에 따르면 된다.
폴리펩티드는 후술하는 그것을 생성하는 세포나 숙주 혹은 정제 방법에 의해, 아미노산 배열, 분자량, 등전점 또는 당사슬의 유무나 형태 등이 상이할 수도 있다. 그러나, 얻어진 폴리펩티드가 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 동등한 기능을 갖고 있는 한, 그것을 코드하는 DNA 를 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 원핵 세포, 예를 들어 대장균으로 발현시켰을 경우, 본래의 폴리펩티드의 아미노산 배열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 또, 진핵 세포, 예를 들어 포유 동물 세포로 발현시켰을 경우, N 말단의 시그널 배열은 제거된다. 이와 같은 폴리펩티드를 코드하는 DNA 도 본 발명에서 사용할 수 있다.
폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 재조합 폴리펩티드로서 또 천연의 폴리펩티드로서 조제할 수 있다. 재조합 폴리펩티드이면, 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 이것을 적당한 숙주 세포에 도입하여 얻은 형질 전환체를 회수하여 추출물을 얻은 후, 이온 교환, 역상, 겔 여과 등의 크로마토그래피, 혹은 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 칼럼에 고정시킨 어피니티 크로마토그래피에 넣음으로써, 또는, 추가로 이들 칼럼을 복수 조합함으로써 정제시켜 조제할 수 있다.
또, 폴리펩티드를 글루타티온 S 트랜스페라아제 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 혹은 히스티딘을 복수 부가시킨 재조합 폴리펩티드로서 숙주 세포 (예를 들어, 동물 세포나 대장균 등) 내에서 발현시킨 경우에는, 발현시킨 재조합 폴리펩티드는 글루타티온 칼럼 혹은 니켈 칼럼을 사용하여 정제시킬 수 있다.
융합 폴리펩티드의 정제 후, 필요에 따라 융합 폴리펩티드 중 목적으로 하는 폴리펩티드 이외의 영역을 트롬빈 또는 팩터 Xa 등에 의해 절단하여 제거할 수도 있다.
천연 폴리펩티드이면, 당업자에게 주지된 방법, 예를 들어, 폴리펩티드를 발현시키고 있는 조직이나 세포의 추출물에 대해, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터에 결합하는 항체가 결합된 어피니티 칼럼을 작용시켜 정제시킴으로써 단리시킬 수 있다. 항체는 폴리크로날 항체이어도 되고 모노클로날 항체이어도 된다.
본 발명에서, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 로서, 배열 번호 61, 63, 65 또는 67 의 염기 배열을 갖는 DNA 를 사용해도 된다. 그 밖에도, 배열 번호 61, 63, 65 또는 67 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 타우린 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 사용해도 된다.
타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 상기 서술한 원하는 폴리펩티드의 in vivo 나 in vitro 에서의 생산에 이용되는 것 외에, 타우린 트랜스포터를 강발현하는 세포의 제조에 사용할 수 있다. 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 타우린 트랜스포터를 코드할 수 있는 것이면 어떠한 형태이어도 된다. 즉, mRNA 로부터 합성된 cDNA 인지, 게놈 DNA 인지, 화학 합성 DNA 인지 등에 상관없다. 또, 타우린 트랜스포터를 코드할 수 있는 한, 유전 암호의 축중에 기초하는 임의의 염기 배열을 갖는 DNA 가 함유된다.
타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들어, 타우린 트랜스포터를 발현시키고 있는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 의 배열 (예를 들어, 배열 번호 61, 63, 65 또는 67) 의 일부를 프로브로 하고 하이브리다이제이션을 실시함으로써 조제할 수 있다. cDNA 라이브러리는 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 에 기재된 방법에 의해 조제해도 되고, 시판되는 유전자 라이브러리를 사용해도 된다. 또, 타우린 트랜스포터를 발현시키고 있는 세포로부터 RNA 를 조제하고, 타우린 트랜스포터의 DNA 의 배열 (예를 들어, 배열 번호 61, 63, 65 또는 67) 에 기초하여 올리고 DNA 를 합성하고, 이것을 프라이머로서 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 타우린 트랜스포터를 코드하는 cDNA 를 증폭시킴으로써 조제할 수도 있다.
또, 얻어진 cDNA 의 염기 배열을 결정함으로써, 그것이 코드하는 번역 영역을 결정할 수 있고, 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열을 얻을 수 있다. 또, 얻어진 cDNA 를 프로브로서 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 게놈 DNA 를 단리시킬 수 있다.
구체적으로는, 다음과 같이 하면 된다. 먼저, 타우린 트랜스포터를 발현시키는 세포, 조직 등에서 mRNA 를 단리시킨다. mRNA 의 단리는 공지된 방법, 예를 들어, 구아니딘 초원심법 (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979)18, 5294-5299), AGPC 법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal.Biochem.(1987)162, 156-159) 등에 의해 전체 RNA 를 조제하고, mRNA Purification Kit (Pharmacia) 등을 사용하여 전체 RNA 로부터 mRNA 를 정제시킨다. 또, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) 를 사용함으로써 mRNA 를 직접 조제할 수도 있다.
얻어진 mRNA 로부터 역전사 효소를 사용하여 cDNA 를 합성한다. cDNA 의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (생화학 공업) 등을 사용하여 실시할 수도 있다. 또, 프라이머 등을 사용하여, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 제) 및 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction ; PCR) 을 사용한 5'-RACE 법 (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989)17, 2919-2932) 에 따라, cDNA 의 합성 및 증폭을 실시할 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 조제하고, 벡터 DNA 와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택해 원하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA 의 염기 배열은 공지된 방법, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드체인터미네이션법에 의해 확인할 수 있다.
또, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 에서는, 발현에 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하고, 보다 발현 효율이 높은 염기 배열을 설계할 수 있다 (Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981)9, r43-74). 또, 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 시판되는 키트나 공지된 방법에 의해 개변할 수 있다. 개변으로는, 예를 들어, 제한 효소에 의한 소화, 합성 올리고 뉴클레오티드나 적당한 DNA 프래그먼트의 삽입, 링커의 부가, 개시 코돈 (ATG) 및/또는 종지 코돈 (TAA, TGA, 또는 TAG) 의 삽입 등을 들 수 있다.
타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 또한, 배열 번호 61, 63, 65 또는 67 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 이고, 또한 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 함유한다.
스트린젠트한 조건으로는, 당업자이면 적절히 선택할 수 있는데, 예를 들어 저스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 저스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 42 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 를 들 수 있고, 바람직하게는 50 ℃, 2×SSC, 0.1 % SDS 이다. 또한 보다 바람직하게는 고스트린젠트한 조건을 들 수 있다. 고스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 65 ℃, 2×SSC 및 0.1 % SDS 를 들 수 있다. 이들 조건에서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA 를 얻을 수 있다. 상기의 하이브리다이즈하는 DNA 는 바람직하게는 천연 유래의 DNA, 예를 들어 cDNA 또는 염색체 DNA 이어도 된다.
이들 하이브리다이제이션 기술에 의해 단리되는 DNA 는 통상적으로 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 와 염기 배열에서 높은 동일성을 갖는다. 이들의 DNA 에는, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하고, 햄스터 등의 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 와 높은 동일성을 갖는 DNA 도 함유된다. 높은 동일성이란, 통상적으로 96 % 이상의 동일성, 바람직하게는 98 % 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 동일성을 나타낸다. 염기 배열의 동일성은 Karlin and Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877, 1993) 에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘에 기초하여, BLASTN 이나 BLASTX 로 불리는 프로그램이 개발되어 있다 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 403-410, 1990). BLAST 에 기초하여 BLASTN 에 의해 염기 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score = 100, wordlength = 12 로 한다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지이다 (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov.).
타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 는 벡터에 삽입되면 된다.
벡터로서는, 예를 들어, 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 벡터를 대장균 (예를 들어, JM109, DH5
Figure 112010007923815-pct00012
, HB101, XL1Blue) 등으로 대량으로 증폭시켜 대량 조제하기 위해, 대장균으로 증폭되기 위한 「ori」를 갖고, 추가로 형질 전환된 대장균의 선발 유전자 (예를 들어, 어떠한 약제 (암피실린이나 테트라시클린, 카나마이신, 클로람페니콜) 에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자) 를 갖는 것이 바람직하다. 벡터의 예로는, M13 계 벡터, pUC 계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또, cDNA 의 서브 클로닝, 절단을 목적으로 했을 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들어, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 생산하는 목적에서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로는, 예를 들어, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 벡터가 대장균으로 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5
Figure 112010007923815-pct00013
, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 했을 경우에는, 대장균으로 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터 (Ward 등, Nature (1989)341, 544-546 ; FASEB J.(1992)6, 2422-2427), araB 프로모터 (Better 등, Science (1988)240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 벡터로는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1 (Pharmacia 사 제조), 「QIAexpress system」(Qiagen 사 제조), pEGFP, 또는 pET (이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현시키고 있는 BL21 이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또, 벡터에는, 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 배열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 배열로는, 대장균의 페리프라즘에 생성시키는 경우, pelB 시그널 배열 (Lei, S.P. et al J. Bacteriol. (1987)169, 4379) 을 사용하면 된다. 숙주 세포로의 벡터의 도입은 예를 들어 염화칼슘법, 일렉트로포레이션법을 이용하여 실시할 수 있다.
대장균을 숙주로 하는 경우 이외에도, 예를 들어, 원하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 벡터로는, 포유 동물 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3 (Invitrogen 사 제조) 나, pEGF-BOS (Nucleic Acids.Res.1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충 세포 유래의 발현 벡터 (예를 들어 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL 사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터 (예를 들어 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레토로 바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pZIpneo), 효모 유래의 발현 벡터 (예를 들어, 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen 사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pPL608, pKTH50) 등을 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물 세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터 (Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1
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프로모터 (Mizushima 등, Nucleic Acids Res.(1990)18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 바람직하고, 세포로의 형질 전환을 선발하기 위한 유전자 (예를 들어, 약제 (네오마이신, G418 등) 에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자) 를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포 내에서의 유전자의 카피수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손시킨 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터 (예를 들어, pCHOI 등) 를 도입하고, 메토트렉사이트 (MTX) 에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현시키는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40 의 복제 기점을 갖는 벡터 (pcD 등) 로 형질 전환시키는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로는, 또한, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 파피로마 바이러스 (BPV) 등 유래의 것을 사용할 수도 있다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드트랜스페라아제 (APH) 유전자, 티미딘키나아제 (TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실트랜스페라아제 (Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원 효소 (dhfr) 유전자 등을 함유할 수 있다.
본 발명은 ALT 를 코드하는 DNA 와 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 가 도입되어 있는 세포 (어느 DNA 도 벡터에 삽입되어 있어도 된다) 도 제공한다.
진핵 세포를 사용하는 경우, 예를 들어, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포를 숙주에 사용할 수 있다. 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, CHO (J.Exp.Med.(1995)108, 945), COS, 3T3, 골수종, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, 양서류 세포, 예를 들어 아프리카 발톱 개구리 난모 세포 (Valle, et al., Nature (1981)291, 358-340), 혹은 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 , Sf21, Tn5 가 알려져 있다. CHO 세포로는, 특히, DHFR 유전자를 결손시킨 CHO 세포인 dhfr-CHO (Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1980)77, 4216-4220) 나 CHO K-1 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1968)60, 1275) 를 바람직하게 사용할 수 있다. 동물 세포에서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 숙주 세포에 DNA (벡터에 삽입되어 있어도 된다) 를 도입하는 것은 예를 들어 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 카티오닉 리보솜 DOTAP (베이린가만하임사 제조) 를 사용한 방법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시할 수 있다.
식물 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 폴리펩티드 생산계로서 알려져 있고, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균 세포로는, 효모, 예를 들어, 사카로미세스 (Saccharomyces) 속, 예를 들어, 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들어, 아스페르질루스 (Aspergillus) 속, 예를 들어, 아스페르질루스 니거 (Aspergillus niger) 가 알려져 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 사용하는 생성계가 있다. 세균 세포로는, 대장균 (E. coli), 예를 들어, JM109, DH5
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, HB101 등을 들 수 있고, 그 밖에 고초균이 알려져 있다.
이들 세포를 목적으로 하는 유전자에 의해 형질 전환시키고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양시킴으로써 목적으로 하는 유전자가 코드하는 폴리펩티드 가 얻어진다. 배양은 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포의 배양액으로서 예를 들어, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM 을 사용할 수 있다. 그 때, 소 태아 혈청 (FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있고, 무혈청 배양시켜도 된다. 배양시의 pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 30 ∼ 40 ℃ 에서 약 15 ∼ 200 시간 실시하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기, 교반을 추가한다.
한편, in vivo 에서 폴리펩티드를 생성시키는 계로는, 예를 들어, 동물을 사용하는 생성계나 식물을 사용하는 생성계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생성시켜 회수한다. 본 발명에서의 「숙주」란, 이들의 동물, 식물을 포함한다.
동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생성계가 있다. 포유류 동물로는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다 (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 포유류 동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다.
예를 들어, 목적으로 하는 유전자를, 염소 β 카세인과 같은 유즙 중에서 고유하게 생성되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 함유하는 유전자 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷의 염소에게 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그 자손이 생성하는 유즙으로부터, 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생성되는 폴리펩티드를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다 (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994)12, 699-702).
또, 곤충으로는, 예를 들어 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적으로 하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입한 바큘로 바이러스를 누에에게 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다 (Susumu, M. et al., Nature (1985)315, 592-594).
또한, 식물을 사용하는 경우, 예를 들어 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들어 pMON 530 에 삽입하고, 이 벡터를 아그로 박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들어, 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 에 감염시켜 본 담배의 잎으로부터 원하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다 (Julian K.-C.Ma et. al., Eur. J. Immunol. (1994)24, 131-138).
이로써 얻어진 폴리펩티드는 숙주 세포 내 또는 세포 외 (배지 등) 로부터 단리되어, 실질적으로 순수하고 균일한 폴리펩티드로서 정제시킬 수 있다. 폴리펩티드의 분리, 정제는 통상적인 폴리펩티드의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되지 않는다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 등전점 전기 영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 폴리펩티드를 분리, 정제시킬 수 있다.
크로마토그래피로는, 예를 들어 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명은 이들의 정제 방법을 이용하여 고도로 정제된 폴리펩티드도 포함한다.
또한, 폴리펩티드를 정제 전 또는 정제 후에 적당한 폴리펩티드 수식 효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 첨가하고 부분적으로 펩티드를 제거할 수도 있다. 폴리펩티드 수식 효소로서는, 예를 들어, 트립신, 키모트립신, 리실엔드펩티다아제, 프로테인키나제, 글루코시다아제 등이 사용된다.
또한, 본 발명에서, 「DNA 를 도입한 세포」란, 유전자 재조합 기술에 의해 외래성 DNA 가 삽입된 세포 외에 유전자 활성화 기술 (예를 들어, 국제 공개 제WO94/12650호 팜플렛 참조) 에 의해 내인성 DNA 가 활성화되고, 그 결과, 당해 DNA 에 대응하는 단백질의 발현 혹은 당해 DNA 의 전사가 개시 혹은 증가된 세포도 포함하는 개념이다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] 인간 간세포 알라닌아미노트랜스페라아제 (Alanine aminotransferase) 유전자 클로닝
시판되는 Human Liver QUICK-Clone cDNA (Clontech 사) 를 주형으로 하여, 인간 간 유래 Alanine aminotransferase (ALT1) 유전자를 PCR 법에 의해 얻었다. 클로닝된 유전자는 염기 배열을 결정하고, 공개되어 있는 인간 ALT1 과의 상동성으로부터 ALT1 을 코드하고 있는 것을 확인하였다. 얻어진 ALT1 유전자는 1488 염기 중, 5 지점 (c157a, a215g, c765t, t857c, t995a) 에서 변이가 확인되고, 코드하는 아미노산은 496 개 중, 4 아미노산 (R53S, Q72R, F286S, M332K) 이 상이했는데, 인간 간 유래 ALT1 PCR 클론으로서 세포 개변에 사용하였다.
[실시예 2] 인간 알라닌아미노트랜스페라아제 도입에 의한 항체 생성량 증가
실시예 1 의 클로닝에 의해 취득한 인간 ALT1 (이하 ALT1) 유전자에 Kozak 배열을 첨가하고, CMV 프로모터 발현 플라스미드 pPur-ALT1 (도 1), pHyg-ALT1 (도 2) 을 구축하였다. pPur-ALT1 혹은 ALT1 유전자를 함유하지 않는 pPur 발현 플라스미드를, 친주인 항글리피칸-3 항체 생성 CHO 세포 (국제 공개 제WO 2006/006693호 팜플렛을 참조) 에 일렉트로포레이션법으로 도입하고, Puromycin (6 ㎍/㎖) 존재하에서 정치 배양에서 고증식인 세포주 (pPur-ALT1 : 7 주, pPur : 3 주) 를 선발하였다. 확대 후, pPur-ALT1 세포주로부터 Total RNA 를 조제하고, TaqMan 법에 의해 인간 ALT1 을 고발현시키고 있는 6 주를 선발하고, 추가로 진탕 배양하에서 컨트롤인 pPur 도입 세포 (3 주) 와 동일한 정도로 증식하는 4 주를 인간 ALT1 도입 세포로 하여 항체 생성량을 비교하였다. 초발 밀도 2 x 105 cells/㎖ 의 50 ㎖ 쉐이커 플라스크에 의한 유가 배양에서, 쉐이커 배양 후기 17 일째의 pPur-ALT1 도입 세포 (4 주) 의 항글리피칸-3 항체 생성량은 pPur 도입 세포 (3 주) 에 대해 우위였다 (t 검정 P<0.01, 도 3). 쉐이커 유가 배양 검토에서, 각각 가장 항체 고생성이었던 pPur-ALT1 발현주 A72 및 Pur 발현주 P41 을 초발 10 x 105 cells/㎖ 로 1 ℓ 자 유가 배양을 실시하면, A72 의 항체 생성량은 배양 19 일째에 2.9 g/ℓ 이고, P41 의 항체 생성량 (2.2 g/ℓ) 이상으로 고생성이었다 (도 4). 배양 14 일째 이후에 P41 의 생성량 증가가 확인되지 않으므로, A72 의 항체 고생성은 생존률 유지 효과에 의한 것으로 생각할 수 있었다 (도 5). 또, Hygromycin (200 ㎍/㎖) 존재하에서 상기와 동일한 수법으로 약제 선발된 pHyg/ALT 도입 세포 (3 주) 를 친주와 함께, 초발 밀도 1 x 105 cells/㎖ 로 15 ㎖ 튜브에 의한 유가 배양을 실시하면, 튜브 배양 후기 10 일째의 pHyg-ALT 도입 세포의 항글리피칸-3 항체 생성량은 471 ㎎/ℓ, 544 ㎎/ℓ, 588 ㎎/ℓ 로, 모두 친주 (400 ㎎/ℓ) 이상이었다 (data not shown).
다음으로, pHyg-TauT 도입 세포 T10 (후술하는 참고예 2 를 참조) 을 친주로 하고, pPur-ALT1 혹은 pPur 을 공도입하여, 고증식이고 또한 인간 ALT1 을 고발현시키고 있는 TauT/ALT1 공발현 세포 (6 주), 및 고증식인 TauT/pPur 공발현 세포 (8 주) 를 선발하고, 초발 밀도 10 x 105 cells/㎖ 로 50 ㎖ 쉐이커 플라스크에 의한 유가 배양을 실시하였다. ALT 발현 세포인 TauT/ALT1 공발현주의 쉐이커 배양 4 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량은 TauT/pPur 세포에 대해 우위였다 (t 검정 P<0.01, 도 6).
쉐이커 유가 배양 검토에서 가장 항체 고생성이고, 또한, ALT1 mRNA 를 가장 발현시키고 있었던 TauT/ALT1 공발현주 TA41 (881 ㎎/ℓ/4 days) 을 초발 10 x 105 cells/㎖ 로 1 ℓ 자 유가 배양을 실시하면, 그 항체 생성량은 배양 7 일째에 1.3 g/ℓ, 배양 10 일째에 3.0 g/ℓ, 배양 12 일째에 3.5 g/ℓ, 배양 17 일째에 4.6 g/ℓ, 배양 21 일째에 5.3 g/ℓ 로 높고 (도 7), TauT/pPur 공발현주 중에서 가장 생성량이 많았던 컨트롤주 TP08 (656 ㎎/ℓ/4 days) 에 대해서도 명백하게 높았다 (배양 10 일째에 2.4 g/ℓ).
TauT/ALT1 공발현주인 TA41 의 50 ㎖ 쉐이커 플라스크 유가 배양 14 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량은 알라닌과 함께 ALT 의 기질이 되는
Figure 112010007923815-pct00016
-케토글루탈산을 첨가하면 증가되었다 (도 22). 배양 14 일째의 항글리피칸-3 항체 생성량은 2.5 mM
Figure 112010007923815-pct00017
-케토글루탈산 존재하에서 1452 ㎎/ℓ,
Figure 112010007923815-pct00018
-케토글루탈산 비존재하에서 1239 ㎎/ℓ 였다.
이상의 결과는 ALT1 을 인위적으로 발현시킴으로써 배양 후기에 항체를 고생성하는 세포가 얻어지는 것을 시사하고 있다.
본 발명은 모든 항체 생성 세포에 응용할 수 있다.
[참고예 1] CHO 세포 유래 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자 클로닝
CHO DXB11 세포에 항 IL-6 리셉터 항체 유전자를 도입한 항 IL-6 리셉터 항체 생성 세포 (일본 공개특허공보 평8-99902호) 로부터 total RNA 추출을 실시한 후, 폴리 A 에 의존하는 cDNA 를 합성하였다. SalI, XhoI, EcoRI 의 3 종류의 제한 효소로 단편화시킨 cDNA 를 주형시킴으로써, Hamster 타우린 트랜스포터 (TauT) 유전자를 PCR 에 의해 얻었다. PCR 프라이머는 이미 알려진 Rat/Mouse TauT 사이에서 유전자 배열이 보존되어 있는 5', 3' 를 함유하는 것을 설계하여 사용하였다. 클로닝된 유전자는 염기 배열을 결정하고, 이미 알려진 생물종의 TauT 와의 상동성으로부터 Hamster TauT 를 코드하고 있는 것을 확인하였다 (도 8). Hamster TauT 아미노산 배열은 Mouse (96 % Identity), Rat (96 % Identity), Human (93 % Identity) TauT 에 대해 높은 상동성을 갖고 있고, 12 의 막관통 영역을 갖는 트랜스포터인 것이 예상되었다 (도 9).
[참고예 2] 햄스터 타우린 트랜스포터 도입에 의한 생세포 밀도 증가, 유산 생성량 억제, 및 항체 생성량 증가
참고예 1 의 클로닝에 의해 취득한 Hamster TauT (이하 TauT) 유전자에 Kozak 배열을 첨가하여 CMV 프로모터 발현 플라스미드 pHyg/TauT (도 10) 를 구축하였다. pHyg/TauT 혹은 TauT 유전자를 제거한 컨트롤 플라스미드 pHyg 를, 친주인 항글리피칸-3 항체 생성 CHO 세포 (국제 공개 제WO 2006/006693호 팜플렛을 참조) 에 일렉트로포레이션법으로 도입하였다. 발현 플라스미드 도입 세포를 Hygromycin (400 ㎍/㎖) 존재하에서 선발한 후, 안정적으로 증식하는 세포주 전부를 확대하였다 (pHyg/TauT : 8 주, pHyg : 7 주). TauT mRNA 를 조제 후 TaqMan 법에 의해, 친주에 대해 우위 발현을 확인할 수 있는 7 주를 pHyg/TauT 도입 세포로 하였다. 도입 세포 (7 주) 의 mRNA 평균 발현량은 컨트롤 (7 주) 의 약 40 배였다. 합계 14 주의 세포는 2 x 105 cells/㎖ 의 초발 밀도로 50 ㎖ 쉐이커 플라스크에 의한 배치 (batch) 배양 및 유가 (fed-batch) 배양을 실시하고, 배양 후기 7 일째의 생세포 밀도, 락트산 생성량, 항글리피칸-3 항체 생성량을 비교하였다. 배치 배양에서는 세포 증식에 수반되어 배양액 중에 락트산 등의 성장 저해 물질이 축적되어 증식이 억제되는데, pHyg/TauT 도입 세포의 생세포 밀도 (도 11) 및 락트산 생성량 (도 12) 은 pHyg 도입 세포에 대해 우위였다 (t 검정 P<0.05). 항글리피칸-3 항체 생성량에 관해서는, pHyg/TauT 도입 세포의 7 주 중 4 주가 pHyg 도입 세포의 최고값 이상이었다 (도 13). 또한 pHyg/TauT 도입 세포의 항글리피칸-3 항체 생성량의 우위성 (t 검정 P<0.01, 도 14) 이 유가 배양에 의해 명백해졌기 때문에, 상기 4 주 중에서 가장 증식력이 높았던 pHyg/TauT 도입 세포 (T10) 와 친주의 1 ℓ 자에 의한 유가 배양을 실시한 결과, T10 는 배양 32 일째에도 생존률이 80 % 이상으로 유지되어 있고 (도 15), 유산 생성이 억제되어 있었다. 그 결과, 항글리피칸-3 항체 생성량은 배양 35 일째에 2.9 g/ℓ (도 16) 를 달성하였다. TauT 도입 T10 세포가 세포막 상에 TauT 분자를 발현시키고 있는 것은 플로우 사이트 메트리 분석 (도 17) 으로 확인하였다. 이상의 결과는 Hamster TauT 를 인위적으로 발현시킴으로써 항체 생성 세포의 포텐셜이 상승되어, 항체 고생성주가 얻어지는 것을 시사하고 있다.
[참고예 3] 햄스터 타우린 트랜스포터 도입주의 암모니아 생성량 억제, 타우린의 주입, 글루타민 소비량 증가, 및 타우린 부(否)의존적인 항체 생성량
친주 및 pHyg/TauT 도입주를, 초발 2 x 105 cells/㎖ 로 1 ℓ 자에 유가 배양시키고, 적시에 배양조로부터 450 x 105 세포를 함유하는 배양액을 채취하였다. 원심에 의해, 배양 상청을 분리 채취한 후, 세포 펠릿에 프로테아제 저해제 (Complete Mini, Roche Diagnostics 사, Protease inhibitor cocktail tablets) 를 함유한 1 ㎖ 의 냉각 멸균수를 첨가하고, 빙상에서 초음파 세포 파쇄기 (MISONIX ASTRASON MODEL XL2020) 를 사용하여 5 초 펄스 조작 후, 5 초 휴지(休止)를 1 세트로 하고, 합계 12 세트 처리를 반복하여 세포를 완전히 파쇄시켰다. 처리 후의 용액은 전체량을 원심식 여과 유닛에 어플라이함으로써, 분자량 5000 이하의 여과액을 조제하여 세포 내 아미노산 측정용 시료로 하였다. 각 시료는 또한, 닌히드린 시액-L8500 세트 (와코 순약 공업) 및, 히타치 제조 전자동 아미노산 분석 장치 (L-8500) 의 개량형을 사용하여 570 nm 의 흡광도를 검출, 비교하고, 시료 중의 각종 아미노산 농도를 구하였다. 배양액 중의 각종 아미노산 및 암모니아 등의 농도는 직접 측정한 값이므로, μM 오더의 농도를 비교하고, 한편, 세포 내 농도는 세포 펠릿에 냉각 멸균수 1 ㎖ 를 첨가한 후 초음파 세포를 파쇄함으로써, 각종 아미노산 및 암모니아 등의 측정값을 세포당 값으로 환산하고, 그 환산값을 비교하였다. 도 18 의 암모니아 농도비는 1 ℓ 자에 유가 배양 개시시의 450 x 105 개당 친주의 암모니아 검출값을 1 로 규정하고, 배양 개시시에 6 일째, 12 일째, 18 일째의 검출값과 비교하여 비를 구하였다. 또, 도 19, 도 20 의 타우린과 글루탐산도 상기 아미노산 분석에 의해 측정하였다.
그 결과, pHyg/TauT 도입주는 배양 후기에서 세포 내 암모니아가 저농도로 유지되어 있고, 항체 고생성에 기여하고 있는 것으로 생각할 수 있었다 (도 18).
세포 내의 타우린 농도비는 상기, 암모니아와 거의 동일한 방법으로 구하였다 (도 19). 차이점은 50 ㎖ 쉐이커 배치 배양 4 일째의 200 x 105 개당 친주의 암모니아 검출값을 1 로 규정하고 있는 것이다.
그 결과, pHyg/TauT 도입주는 타우린 첨가량에 의존하여 타우린을 주입하고, 그 주입량은 친주와 동등하였다. 그러나, 도 20 에 나타내는 바와 같이, pHyg/TauT 도입주의 글루타민 소비량은 친주에 대해 현저하고, 초발 타우린 농도에 의존하지 않았다. 글루타민이 하이브리도머의 세포 증식이나 생존률, 및 항체 생성능을 개선시키고, 항체 생성량을 상승시키는 기능을 하는 것은 보고되어 있다 (Enzyme and Microbial Technology 17 : 47-55, 1995). 따라서, pHyg/TauT 도입주의 항체 생성 증강 효과는, 타우린 트랜스포터를 개입시킨 타우린 이외의 다른 아미노산 (글루타민 등) 의 주입에 의한 가능성도 생각할 수 있다. 또한, 글루타민 농도는 도 19 에서의 배양 4 일째의 배양액을 아미노산 분석한 측정값을 1 x 105 세포당으로 환산한 값이다.
실제, 항글리피칸-3 항체 생성량은 50 ㎖ 쉐이커 유가 배양 개시시의 초발 타우린 농도 (0 ∼ 500 mM (62.575 g/ℓ)) 에 의존하지 않았다 (도 21). 또, 친주에 대해서도 초발 타우린 농도에 의한 항체 생성량의 영향에 우위한 차는 확인되지 않았다.
이상의 결과는 배양 개시시의 배지 중에 타우린을 함유하지 않아도 TauT 강발현주가 높은 항체 생성능을 갖는 것을 시사하고, 타우린 이외의 아미노산 등의 주입에 대해서도 촉진될 가능성도 생각할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
산업상 이용 가능성
본 발명은 폴리펩티드의 생산에 사용할 수 있다.
배열표 프리 텍스트
<배열 번호 1>
배열 번호 1 은 인간 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Homo sapiens (human) : 2875) 을 나타낸다.
<배열 번호 2>
배열 번호 2 는 인간 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Homo sapiens (human) : 2875) 을 나타낸다.
<배열 번호 3>
배열 번호 3 은 인간 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 를 코드하는 유전자 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Homo sapiens (human) : 84706) 의 염기 배열을 나타낸다.
<배열 번호 4>
배열 번호 4 는 인간 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Homo sapiens (human) : 84706) 을 나타낸다.
<배열 번호 5>
배열 번호 5 는 마우스 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse) : 76282) 의 염기 배열을 나타낸다.
<배열 번호 6>
배열 번호 6 은 마우스 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse) : 76282) 을 나타낸다.
<배열 번호 7>
배열 번호 7 은 마우스 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse) : 108682) 을 나타낸다.
<배열 번호 8>
배열 번호 8 은 마우스 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse) : 108682) 을 나타낸다.
<배열 번호 9>
배열 번호 9 는 래트 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat) : 81670) 을 나타낸다.
<배열 번호 10>
배열 번호 10 은 래트 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat) : 81670) 을 나타낸다.
<배열 번호 11>
배열 번호 11 은 개 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog) : 609510) 을 나타낸다.
<배열 번호 12>
배열 번호 12 는 개 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog) : 609510) 을 나타낸다.
<배열 번호 13>
배열 번호 13 은 아프리카 발톱 개구리 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog) : 444533) 을 나타낸다.
<배열 번호 14>
배열 번호 14 는 아프리카 발톱 개구리 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog) : 444533) 을 나타낸다.
<배열 번호 15>
배열 번호 15 는 초파리 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly) : Dmel_CG1640) 을 나타낸다.
<배열 번호 16>
배열 번호 16 은 초파리 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly) : Dmel_CG1640) 을 나타낸다.
<배열 번호 17>
배열 번호 17 은 선충 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode) : C32F10.8) 을 나타낸다.
<배열 번호 18>
배열 번호 18 은 선충 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode) : C32F10.8) 을 나타낸다.
<배열 번호 19>
배열 번호 19 는 일본쌀 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice) : 4342210) 을 나타낸다.
<배열 번호 20>
배열 번호 20 은 일본쌀 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice) : 4342210) 을 나타낸다.
<배열 번호 21>
배열 번호 21 은 일본쌀 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice) : 4348524) 을 나타낸다.
<배열 번호 22>
배열 번호 22 는 일본쌀 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice) : 4348524) 을 나타낸다.
<배열 번호 23>
배열 번호 23 은 원시 홍조 시아니디오시존 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae : CMM066C) 을 나타낸다.
<배열 번호 24>
배열 번호 24 는 원시 홍조 시아니디오시존 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae : CMM066C) 을 나타낸다.
<배열 번호 25>
배열 번호 25 는 빵 효모 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae : YLR089C) 을 나타낸다.
<배열 번호 26>
배열 번호 26 은 빵 효모 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT1) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae : YLR089C) 을 나타낸다.
<배열 번호 27>
배열 번호 27 은 빵 효모 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Saccharomycescerevisiae : YDR111C) 을 나타낸다.
<배열 번호 28>
배열 번호 28 은 빵 효모 알라닌아미노트랜스페라아제 변이체 (ALT2) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae : YDR111C) 을 나타낸다.
<배열 번호 29>
배열 번호 29 는 사상균 Ashbya gossypii 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii) : AGOS_AGR085W) 을 나타낸다.
<배열 번호 30>
배열 번호 30 은 사상균 Ashbya gossypii 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii) : AGOS_AGR085W) 을 나타낸다.
<배열 번호 31>
배열 번호 31 은 진균 Candida albicans 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Candida albicans : CaO19_346) 을 나타낸다.
<배열 번호 32>
배열 번호 32 는 진균 Candida albicans 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Candida albicans : CaO19_346) 을 나타낸다.
<배열 번호 33>
배열 번호 33 은 분열 효모 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe : SPBC582.08) 을 나타낸다.
<배열 번호 34>
배열 번호 34 는 분열 효모 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe : SPBC582.08) 을 나타낸다.
<배열 번호 35>
배열 번호 35 는 진균 Aspergillus nidulans 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans : AN1923.2) 을 나타낸다.
<배열 번호 36>
배열 번호 36 은 진균 Aspergillus nidulans 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans : AN1923.2) 을 나타낸다.
<배열 번호 37>
배열 번호 37 은 진균 Aspergillus fumigatus 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus : AFUA_6 G07770) 을 나타낸다.
<배열 번호 38>
배열 번호 38 은 진균 Aspergillus fumigatus 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus : AFUA_6 G07770) 을 나타낸다.
<배열 번호 39>
배열 번호 39 는 청주 누룩곰팡이 Aspergillus oryzae 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae : AO090003000164) 을 나타낸다.
<배열 번호 40>
배열 번호 40 은 청주 누룩곰팡이 Aspergillus oryzae 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae : AO090003000164) 을 나타낸다.
<배열 번호 41>
배열 번호 41 은 진균 Cryptococcus neoformans 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21 : CNG01490) 을 나타낸다.
<배열 번호 42>
배열 번호 42 는 진균 Cryptococcus neoformans 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21 : CNG01490) 을 나타낸다.
<배열 번호 43>
배열 번호 43 은 세포성 점균 Dictyostelium discoideum 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum : DDB_0232139) 을 나타낸다.
<배열 번호 44>
배열 번호 44 는 세포성 점균 Dictyostelium discoideum 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum : DDB_0232139) 을 나타낸다.
<배열 번호 45>
배열 번호 45 는 Trypanosoma brucei 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei : Tb927.1.3950) 을 나타낸다.
<배열 번호 46>
배열 번호 46 은 Trypanosoma brucei 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei : Tb927.1.3950) 을 나타낸다.
<배열 번호 47>
배열 번호 47 은 세포 내 기생성 원충 Leishmania major 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Leishmania major : LmjF12.0630) 을 나타낸다.
<배열 번호 48>
배열 번호 48 은 세포 내 기생성 원충 Leishmania major 알라닌아미노트랜스페라아제의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Leishmania major : LmjF12.0630) 을 나타낸다.
<배열 번호 49>
배열 번호 49 는 적리 아메바 Entamoeba histolytica 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica : 233.t00009) 을 나타낸다.
<배열 번호 50>
배열 번호 50 은 적리 아메바 Entamoeba histolytica 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica : 233.t00009) 을 나타낸다.
<배열 번호 51>
배열 번호 51 은 적리 아메바 Entamoeba histolytica 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica : 24.t00016) 을 나타낸다.
<배열 번호 52>
배열 번호 52 는 적리 아메바 Entamoeba histolytica 알라닌아미노트랜스페라아제 (2 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica : 24.t00016) 을 나타낸다.
<배열 번호 53>
배열 번호 53 은 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 506529.420) 을 나타낸다.
<배열 번호 54>
배열 번호 54 는 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 506529.420) 을 나타낸다.
<배열 번호 55>
배열 번호 55 는 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 506529.430) 을 나타낸다.
<배열 번호 56>
배열 번호 56 은 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 506529.430) 을 나타낸다.
<배열 번호 57>
배열 번호 57 은 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 510889.120) 을 나타낸다.
<배열 번호 58>
배열 번호 58 은 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 510889.120) 을 나타낸다.
<배열 번호 59>
배열 번호 59 는 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 를 코드하는 유전자의 염기 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 510889.140) 을 나타낸다.
<배열 번호 60>
배열 번호 60 은 세포 내 기생성 원충 Trypanosoma cruzi 알라닌아미노트랜스페라아제 (4 종 중 1 개) 의 아미노산 배열 (KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 510889.140)(KEGG / ENZYME : 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi : 510889.140) 을 나타낸다.
<배열 번호 61>
배열 번호 61 은 햄스터 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자의 염기 배열을 나타낸다.
<배열 번호 62>
배열 번호 62 는 햄스터 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열을 나타낸다.
<배열 번호 63>
배열 번호 63 은 래트 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자의 염기 배열 (GenBank NM_017206) 을 나타낸다.
<배열 번호 64>
배열 번호 64 는 래트 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열 (GenBank NM_017206) 을 나타낸다.
<배열 번호 65>
배열 번호 65 는 마우스 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자의 염기 배열 (GenBank NM_009320) 을 나타낸다.
<배열 번호 66>
배열 번호 66 은 마우스 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열 (GenBank NM_009320) 을 나타낸다.
<배열 번호 67>
배열 번호 67 은 인간 타우린 트랜스포터를 코드하는 유전자의 염기 배열 (GenBank NM_003043) 을 나타낸다.
<배열 번호 68>
배열 번호 68 은 인간 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열 (GenBank NM_003043) 을 나타낸다.
<110> CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> A method of preparing a heteroprotein <130> FP-111PCT <150> JP P2007-205158 <151> 2007-08-07 <160> 68 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcctcga gcacaggtga ccggagccag gcggtgaggc atggactgag ggcgaaggtg 60 ctgacgctgg acggcatgaa cccgcgtgtg cggagagtgg agtacgcagt gcgtggcccc 120 atagtgcagc gagccttgga gctggagcag gagctgcgcc agggtgtgaa gaagcctttc 180 accgaggtca tccgtgccaa catcggggac gcacaggcta tggggcagag gcccatcacc 240 ttcctgcgcc aggtcttggc cctctgtgtt aaccctgatc ttctgagcag ccccaacttc 300 cctgacgatg ccaagaaaag ggcggagcgc atcttgcagg cgtgtggggg ccacagtctg 360 ggggcctaca gcgtcagctc cggcatccag ctgatccggg aggacgtggc gcggtacatt 420 gagaggcgtg acggaggcat ccctgcggac cccaacaacg tcttcctgtc cacaggggcc 480 agcgatgcca tcgtgacggt gctgaagctg ctggtggccg gcgagggcca cacacgcacg 540 ggtgtgctca tccccatccc ccagtaccca ctctactcgg ccacgctggc agagctgggc 600 gcagtgcagg tggattacta cctggacgag gagcgtgcct gggcgctgga cgtggccgag 660 cttcaccgtg cactgggcca ggcgcgtgac cactgccgcc ctcgtgcgct ctgtgtcatc 720 aaccctggca accccaccgg gcaggtgcag acccgcgagt gcatcgaggc cgtgatccgc 780 ttcgccttcg aagagcggct ctttctgctg gcggacgagg tgtaccagga caacgtgtac 840 gccgcgggtt cgcagttcca ctcattcaag aaggtgctca tggagatggg gccgccctac 900 gccgggcagc aggagcttgc ctccttccac tccacctcca agggctacat gggcgagtgc 960 gggttccgcg gcggctatgt ggaggtggtg aacatggacg ctgcagtgca gcagcagatg 1020 ctgaagctga tgagtgtgcg gctgtgcccg ccggtgccag gacaggccct gctggacctg 1080 gtggtcagcc cgcccgcgcc caccgacccc tcctttgcgc agttccaggc tgagaagcag 1140 gcagtgctgg cagagctggc ggccaaggcc aagctcaccg agcaggtctt caatgaggct 1200 cctggcatca gctgcaaccc agtgcagggc gccatgtact ccttcccgcg cgtgcagctg 1260 cccccgcggg cggtggagcg cgctcaggag ctgggcctgg cccccgatat gttcttctgc 1320 ctgcgcctcc tggaggagac cggcatctgc gtggtgccag ggagcggctt tgggcagcgg 1380 gaaggcacct accacttccg gatgaccatt ctgcccccct tggagaaact gcggctgctg 1440 ctggagaagc tgagcaggtt ccatgccaag ttcaccctcg agtactcctg a 1491 <210> 2 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Ser Thr Gly Asp Arg Ser Gln Ala Val Arg His Gly Leu 1 5 10 15 Arg Ala Lys Val Leu Thr Leu Asp Gly Met Asn Pro Arg Val Arg Arg 20 25 30 Val Glu Tyr Ala Val Arg Gly Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu 35 40 45 Glu Gln Glu Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile 50 55 60 Arg Ala Asn Ile Gly Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Arg Pro Ile Thr 65 70 75 80 Phe Leu Arg Gln Val Leu Ala Leu Cys Val Asn Pro Asp Leu Leu Ser 85 90 95 Ser Pro Asn Phe Pro Asp Asp Ala Lys Lys Arg Ala Glu Arg Ile Leu 100 105 110 Gln Ala Cys Gly Gly His Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Val Ser Ser Gly 115 120 125 Ile Gln Leu Ile Arg Glu Asp Val Ala Arg Tyr Ile Glu Arg Arg Asp 130 135 140 Gly Gly Ile Pro Ala Asp Pro Asn Asn Val Phe Leu Ser Thr Gly Ala 145 150 155 160 Ser Asp Ala Ile Val Thr Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Gly Glu Gly 165 170 175 His Thr Arg Thr Gly Val Leu Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr 180 185 190 Ser Ala Thr Leu Ala Glu Leu Gly Ala Val Gln Val Asp Tyr Tyr Leu 195 200 205 Asp Glu Glu Arg Ala Trp Ala Leu Asp Val Ala Glu Leu His Arg Ala 210 215 220 Leu Gly Gln Ala Arg Asp His Cys Arg Pro Arg Ala Leu Cys Val Ile 225 230 235 240 Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Gln Thr Arg Glu Cys Ile Glu 245 250 255 Ala Val Ile Arg Phe Ala Phe Glu Glu Arg Leu Phe Leu Leu Ala Asp 260 265 270 Glu Val Tyr Gln Asp Asn Val Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe His Ser 275 280 285 Phe Lys Lys Val Leu Met Glu Met Gly Pro Pro Tyr Ala Gly Gln Gln 290 295 300 Glu Leu Ala Ser Phe His Ser Thr Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys 305 310 315 320 Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Val Glu Val Val Asn Met Asp Ala Ala Val 325 330 335 Gln Gln Gln Met Leu Lys Leu Met Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val 340 345 350 Pro Gly Gln Ala Leu Leu Asp Leu Val Val Ser Pro Pro Ala Pro Thr 355 360 365 Asp Pro Ser Phe Ala Gln Phe Gln Ala Glu Lys Gln Ala Val Leu Ala 370 375 380 Glu Leu Ala Ala Lys Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Phe Asn Glu Ala 385 390 395 400 Pro Gly Ile Ser Cys Asn Pro Val Gln Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro 405 410 415 Arg Val Gln Leu Pro Pro Arg Ala Val Glu Arg Ala Gln Glu Leu Gly 420 425 430 Leu Ala Pro Asp Met Phe Phe Cys Leu Arg Leu Leu Glu Glu Thr Gly 435 440 445 Ile Cys Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr 450 455 460 His Phe Arg Met Thr Ile Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Arg Leu Leu 465 470 475 480 Leu Glu Lys Leu Ser Arg Phe His Ala Lys Phe Thr Leu Glu Tyr Ser 485 490 495 <210> 3 <211> 1572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcagcggg cggcggcgct ggtccggcgg ggctgtggtc cccggacccc cagctcctgg 60 ggccgcagcc agagcagcgc ggccgccgag gcctcggcgg tgctcaaggt gcggcccgag 120 cgcagccggc gcgagcgcat cctcacgctg gagtccatga acccgcaggt gaaggcggtg 180 gagtacgccg tgcggggacc catcgtgctc aaggccggcg agatcgagct cgagctgcag 240 cggggtatca aaaagccatt cacagaggtc atccgagcca acatcgggga cgcccaggct 300 atggggcagc agccaatcac cttcctccgg caggtgatgg cactatgcac ctacccaaac 360 ctgctggaca gccccagctt cccagaagat gctaagaaac gtgcccggcg gatcctgcag 420 gcttgtggcg ggaacagcct ggggtcctac agtgctagcc agggtgtcaa ctgcatccgt 480 gaagatgtgg ctgcctacat caccaggagg gatggcggtg tgcctgcgga ccccgacaac 540 atctacctga ccacgggagc tagtgacggc atttctacga tcctgaagat cctcgtctcc 600 gggggcggca agtcacggac aggtgtgatg atccccatcc cacaatatcc cctctattca 660 gctgtcatct ctgagctcga cgccatccag gtgaattact acctggacga ggagaactgc 720 tgggcgctga atgtgaatga gctccggcgg gcggtgcagg aggccaaaga ccactgtgat 780 cctaaggtgc tctgcataat caaccctggg aaccccacag gccaggtaca aagcagaaag 840 tgcatagaag atgtgatcca ctttgcctgg gaagagaagc tctttctcct ggctgatgag 900 gtgtaccagg acaacgtgta ctctccagat tgcagattcc actccttcaa gaaggtgctg 960 tacgagatgg ggcccgagta ctccagcaac gtggagctcg cctccttcca ctccacctcc 1020 aagggctaca tgggcgagtg tggttacaga ggaggctaca tggaggtgat caacctgcac 1080 cctgagatca agggccagct ggtgaagctg ctgtcggtgc gcctgtgccc cccagtgtct 1140 gggcaggccg ccatggacat tgtcgtgaac cccccggtgg caggagagga gtcctttgag 1200 caattcagcc gagagaagga gtcggtcctg ggtaatctgg ccaaaaaagc aaagctgacg 1260 gaagacctgt ttaaccaagt cccaggaatt cactgcaacc ccttgcaggg ggccatgtac 1320 gccttccctc ggatcttcat tcctgccaaa gctgtggagg ctgctcaggc ccatcaaatg 1380 gctccagaca tgttctactg catgaagctc ctggaggaga ctggcatctg tgtcgtgccc 1440 ggcagtggct ttgggcagag ggaaggcact taccacttca ggatgactat cctccctcca 1500 gtggagaagc tgaaaacggt gctgcagaag gtgaaagact tccacatcaa cttcctggag 1560 aagtacgcgt ga 1572 <210> 4 <211> 523 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Arg Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg Gly Cys Gly Pro Arg Thr 1 5 10 15 Pro Ser Ser Trp Gly Arg Ser Gln Ser Ser Ala Ala Ala Glu Ala Ser 20 25 30 Ala Val Leu Lys Val Arg Pro Glu Arg Ser Arg Arg Glu Arg Ile Leu 35 40 45 Thr Leu Glu Ser Met Asn Pro Gln Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Val 50 55 60 Arg Gly Pro Ile Val Leu Lys Ala Gly Glu Ile Glu Leu Glu Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ile Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg Ala Asn Ile Gly 85 90 95 Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Gln Pro Ile Thr Phe Leu Arg Gln Val 100 105 110 Met Ala Leu Cys Thr Tyr Pro Asn Leu Leu Asp Ser Pro Ser Phe Pro 115 120 125 Glu Asp Ala Lys Lys Arg Ala Arg Arg Ile Leu Gln 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Tyr Arg Gly Gly 340 345 350 Tyr Met Glu Val Ile Asn Leu His Pro Glu Ile Lys Gly Gln Leu Val 355 360 365 Lys Leu Leu Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val Ser Gly Gln Ala Ala 370 375 380 Met Asp Ile Val Val Asn Pro Pro Val Ala Gly Glu Glu Ser Phe Glu 385 390 395 400 Gln Phe Ser Arg Glu Lys Glu Ser Val Leu Gly Asn Leu Ala Lys Lys 405 410 415 Ala Lys Leu Thr Glu Asp Leu Phe Asn Gln Val Pro Gly Ile His Cys 420 425 430 Asn Pro Leu Gln Gly Ala Met Tyr Ala Phe Pro Arg Ile Phe Ile Pro 435 440 445 Ala Lys Ala Val Glu Ala Ala Gln Ala His Gln Met Ala Pro Asp Met 450 455 460 Phe Tyr Cys Met Lys Leu Leu Glu Glu Thr Gly Ile Cys Val Val Pro 465 470 475 480 Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr His Phe Arg Met Thr 485 490 495 Ile Leu Pro Pro Val Glu Lys Leu Lys Thr Val Leu Gln Lys Val Lys 500 505 510 Asp Phe His Ile Asn Phe Leu Glu Lys Tyr Ala 515 520 <210> 5 <211> 1491 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atggcctcac aaaggaatga ccggatccag gcttcaagga atggactgaa ggggaaggtg 60 ctaactctgg ataccatgaa 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tcagtctcta agggctacat gggcgagtgc 960 gggtttcgtg gtggctatgt ggaagtggta aacatggatg ccgaggtgca gaaacagatg 1020 gcgaaactga tgagcgtgcg gttgtgtcca ccagtgccgg gccaggcttt gatgggcatg 1080 gtggtcagtc cgccaacccc ctcggagccg tccttcaagc agtttcaagc agagaggcag 1140 gaggtgctgg ctgaactggc agccaaggct aaactcacgg agcaggtctt caacgaggcc 1200 cccgggatcc gctgcaaccc ggtgcagggc gctatgtatt ccttccctca aattcagctg 1260 cctttgaaag cagtgcagcg tgcgcaggac ctgggcctgg cccctgacat gttcttctgt 1320 ctgtgcctcc tggaagagac tggcatctgc gttgtgcctg ggagtggctt tgggcagcag 1380 gagggcacct atcatttccg gatgaccatt ctgcccccca tggagaaact gcgggtgctg 1440 ctggagaaac tgaggcactt ccatgctaaa ttcactcatg agtactcctg a 1491 <210> 6 <211> 496 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ala Ser Gln Arg Asn Asp Arg Ile Gln Ala Ser Arg Asn Gly Leu 1 5 10 15 Lys Gly Lys Val Leu Thr Leu Asp Thr Met Asn Pro Cys Val Arg Arg 20 25 30 Val Glu Tyr Ala Val Arg Gly Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu 35 40 45 Glu Gln Glu Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu 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8 <211> 522 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Gln Arg Ala Ala Val Leu Val Arg Arg Gly Ser Cys Pro Arg Ala 1 5 10 15 Ser Gly Pro Trp Gly Arg Ser His Ser Ser Ala Ala Ala Glu Ala Ser 20 25 30 Ala Ala Leu Lys Val Arg Pro Glu Arg Ser Pro Arg Asp Arg Ile Leu 35 40 45 Thr Leu Glu Ser Met Asn Pro Gln Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Val 50 55 60 Arg Gly Pro Ile Val Leu Lys Ala Gly Glu Ile Glu Met Glu Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ile Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg Ala Asn Ile Gly 85 90 95 Asp Ala His Ala Met Gly Gln Gln Pro Ile Thr Phe Leu Arg Gln Val 100 105 110 Met Ala Leu Cys Thr Tyr Pro Asn Leu Leu Asn Ser Pro Ser Phe Pro 115 120 125 Glu Asp Ala Lys Lys Arg Ala Arg Arg Ile Leu Gln Ala Cys Gly Gly 130 135 140 Asn Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Ala Ser Gln Gly Val Asn Cys Ile Arg 145 150 155 160 Glu Asp Val Ala Ala Phe Ile Thr Arg Arg Asp Gly Val Pro Ala Asp 165 170 175 Pro Asp Asn Ile Tyr Leu Thr Thr Gly Ala Ser Asp Gly Ile Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Lys Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Lys Ser 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<210> 13 <211> 1623 <212> DNA <213> Xenopus laevis <400> 13 atgagtattc tcagggggtc tctgaggggg gtgctggccc ccaatgcttc tgttgtgttt 60 aggagcagat tgccccccca gctcacttct gccctcctgt gccccctcag gtcgctgtcg 120 ggaacgccgc tggctgaacc ggacgggaaa gttactcgca agatgtctga gaacgggaca 180 tgcaaccgga tcctgactct ggactccatg aatccctgta tccagaaagt ggaatacgca 240 gtgaggggcc ccatcgtcat cagggctgtg gagctggaga aagaactgca gcagggggta 300 aagaagccat tcacagaagt gatcaaagcc aatattggag atgcccatgc aatgggtcag 360 aaacccgtta ctttcctgcg ccaggtgagt gccatctgtc tgtaccccga gctcatgaat 420 gacaacaagt tcccggagga cgtgaagcag aaggcagcga ggatcctgca ggcgtgtggc 480 gggcacagca ttggggccta cagcgccagc caagggattg aagtgatccg acaagatgtg 540 gccaagtaca ttgagagaag ggatgggggt atcctgtccg accccaacaa catctacctc 600 tccacggggg ccagtgactc tattgtgaca atgctgaagt tgctggtgtc tgggcaaggg 660 aaatcccgaa ctggggtgat gatcccgatc cctcaatacc cgctgtattc tgcggccctg 720 gcagagttgg atgccgtgca ggttaattat tatctggatg aggagaactg ctgggccctg 780 gacatcaacg agctgcggag agcactagcg gaggcccgaa aacattgtga ccccaaagta 840 ctgtgcatta ttaacccagg aaaccctaca gggcaggtgc agagccgcaa gtgcattgag 900 gacgtgatcc gttttgctgc tgaagagaat cttttcctga tggcggatga ggtctaccaa 960 gataatgtct atgccaaggg ctgtgccttt cactccttca aaaaggttct ctttgagatg 1020 ggacccaagt attcagaaac gctggaactg gcttctttcc actccacatc caagggatac 1080 atgggagagt gcgggttcag agggggttac atggaagtga tcaatatgga tcctgctgtc 1140 aagcaacaac taaccaagtt ggtgtctgtg cgtctgtgcc ccccagtgcc ggggcaagta 1200 ttacttgatg tgattgtgaa cccaccaaag cctggggagc cctcctacaa acagttcatt 1260 tctgagaaac aggctgtgct caataacctg gctgagaaag ctcgtctcac tgaggaaatc 1320 ctaaaccaag cgcctgggat ccgctgtaac ccagtccagg gagccatgta ctcgtttcca 1380 aggatccaca tcccagagaa ggccattaaa cttgcacagg ctgagggaca ggccccagac 1440 atgttcttct gtatgaagct gctggaagag actggcattt gtgtggtacc tggaagtgga 1500 tttggacaac gtgagggcac tcaccatttc aggatgacca tcctccctcc caccgataag 1560 ctgaagagcc tgttagagcg gctgaaggat ttccaccaga aatttatgga tgagtattcc 1620 tag 1623 <210> 14 <211> 540 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 14 Met Ser Ile Leu Arg Gly Ser Leu Arg Gly Val Leu Ala Pro Asn Ala 1 5 10 15 Ser Val Val Phe Arg Ser Arg Leu Pro Pro Gln Leu Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Leu Cys Pro Leu Arg Ser Leu Ser Gly Thr Pro Leu Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Gly Lys Val Thr Arg Lys Met Ser Glu Asn Gly Thr Cys Asn Arg Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Asp Ser Met Asn Pro Cys Ile Gln Lys Val Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Val Arg Gly Pro Ile Val Ile Arg Ala Val Glu Leu Glu Lys Glu Leu 85 90 95 Gln Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Lys Ala Asn Ile 100 105 110 Gly Asp Ala His Ala Met Gly Gln Lys Pro Val Thr Phe Leu Arg Gln 115 120 125 Val Ser Ala Ile Cys Leu Tyr Pro Glu Leu Met Asn Asp Asn Lys Phe 130 135 140 Pro Glu Asp Val Lys Gln Lys Ala Ala Arg Ile Leu Gln Ala Cys Gly 145 150 155 160 Gly His Ser Ile Gly Ala Tyr Ser Ala Ser Gln Gly Ile Glu Val Ile 165 170 175 Arg Gln Asp Val Ala Lys Tyr Ile Glu Arg Arg Asp Gly Gly Ile Leu 180 185 190 Ser Asp Pro Asn Asn Ile Tyr Leu Ser Thr Gly Ala Ser Asp 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tcgaaagcgc tcacactgga taacataaat 300 cccaacttta ttgccatgga atatgccgtt cgcggtcctc tggtgattcg tgctggggaa 360 atcgagaagg aactggaaaa gggtgtcaag aagccattcg accaggtgat ccgtgccaac 420 atcggtgatt gccatgcgat gggccagcag cccttgacct tcctgcgaca gctgttggcg 480 ctgaccttcg agacacgtct gctggattca cccgattatc ccgaggacgt caagaagcgc 540 gcctgtgcca ttttgaacgg ctgccagggt caatcggtgg gctcgtacac cgactccgcc 600 ggtctggagg tggtgcgtcg ccaggttgct cagtacatcg agaaaaggga tggcggcatc 660 gcctccaatt ggcaggacat ctatctaacc ggcggtgcct ctcccggcat caagagcatt 720 ctctccatga tcaacgccga ggtgggatgc aaggcgcctg gtgtcatggt gcccattccg 780 cagtacccac tgtactcggc caccatctcc gaatacggca tgaccaaggt ggattactat 840 ctggaggagg agaccggttg gagcctggac aggaaggagc tgcaacggtc ctacgatgag 900 gcgaagaagg tctgcaatcc gcgtgccctg gtcgtgatca atccgggcaa tcccaccgga 960 caggtactga cccgcgagaa catcgaggag atcattaagt tcgcacacga taacaaggtg 1020 ctggtgctgg ccgatgaggt gtaccaggac aatgtctacg acaagaactc caagttctgg 1080 tcgttcaaga aggtggccta cgaaatgggc gacccctatc gtaatctgga aatggtcagt 1140 ttcctgtcca cctcgaaggg ctatctgggc gagtgcggca ttcgcggcgg ttacatggag 1200 gttctcaatc ttgatcccaa ggtcaaggcc atgctgacca agtcgataac ggcggcgctt 1260 tgcagcacca ccgctggcca ggtggccgtg agtgccctgg tcaatccacc gcagcccgga 1320 gagccatcat acgatctgta caagaaggag cgcgatggca ttctggccgc tctaaaagaa 1380 cgggccgagc tcgtccacaa ggcactgaac agcttcgaag gctacaaggt taaccccgta 1440 cagggcgcca tgtacgtctt tccacagatc gagatcccgc ccaaggcgat cgaggcggcc 1500 aaggccaagg gcatggcccc cgatgttttc tacgcatttg agctgctcga gacgagcggc 1560 atttgcattg ttcctggcag tggatttggt cagaagcccg gcacgtggca tttccgaagc 1620 acgatcctcc cgcaaacgga caagctgaag ctgatgatgg agaagttccg tgtgttccac 1680 gccgagttca tgaagaagta caagtag 1707 <210> 16 <211> 568 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 16 Met Ser Arg Met Leu Ile Lys Pro Ala Ala Ala Thr Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gln Gln His Gln Arg Gln Gln Gln Gln Tyr Val Ile Arg Arg Trp 20 25 30 Lys Ser Phe Leu His Asn Asn Ser Asn Asn Ala Asn Arg Arg Ala Ala 35 40 45 Lys Ser Thr 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gcatacagtc agagtacggg agtggaaatt 420 gtacgaaaac acgtggcaga gtatattaag agacgtgatg gaggaattcc atgcaattca 480 gaagatgtct gcttgtctgg aggagcttct gaatcaatcc gaaatgttct caaacttttt 540 atcaatcata acaacgcaaa gaaagtcgga gtcatgattc caattccaca atatccactc 600 tattctgcca ctatcgaaga attcggactt ggacaagttg gatactattt gagtgaatcg 660 tctaattggt ccatggatga agctgaactt gaaagatctt tcaatgatca ctgcaaagaa 720 tacgatattc gagttttgtg tatcatcaat ccaggaaatc ctaccggaca agcactttct 780 cgtgaaaata ttgagactat catcaagttt gcacaaaaga agaacctgtt ccttatggct 840 gatgaggttt atcaagacaa cgtctacgct caaggatcgc aattccattc attcaagaag 900 gttcttgtgg agatgggaga gccatacaat aaaatggaat tggcttcttt ccattcggta 960 tccaaaggat acatgggaga atgcggaatg cgtggaggat atgttgaatt cttgaatctc 1020 gacccagaag tgtatgtcct tttcaaaaaa atgatctctg ccaaattgtg ctccacagta 1080 ctcggacaag ccgtcattga tgccgttgtg aatccaccaa aggaaggaga tgcatcgtat 1140 gctctgtgga aacaagaaaa ggatgcagta cttgcttctc ttaaggaacg tgctacactc 1200 gtcgagaagg catacagtag cattgatgga atcagctgta atccagttca aggagccatg 1260 tacgctttcc cgcaaatcac gattccacag agagctgttg aaaaagctca gtctttgaac 1320 caacaacctg atttcttcta tgctatgcaa cttcttgaga ccaccggaat ctgtatcgtg 1380 ccaggaagtg gatttggaca aaaagacgga acttatcatt tcagaacgac aattcttcca 1440 cagccagaac tcttcaaaga catgctctcc cggttcactg atttccacca aaaattcctt 1500 gccgaataca agtag 1515 <210> 18 <211> 504 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 18 Met Arg Thr Val Gln Ala Ile Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Phe Phe 1 5 10 15 Gly Thr Ser Thr Arg Ile Met Ala Ser Gly Lys Thr Leu Asn Thr Ser 20 25 30 Asn Ile Asn Pro Asn Val Ile Lys Met Glu Tyr Ala Val Arg Gly Pro 35 40 45 Ile Val Ile Arg Ala Val Glu Leu Glu Lys Glu Leu Ala Thr Gly Ala 50 55 60 Gln Lys Pro Phe Pro Asn Val Ile Lys Ala Asn Ile Gly Asp Ala His 65 70 75 80 Ala Met Gly Gln Lys Pro Ile Thr Phe Ile Arg Gln Leu Leu Ala Cys 85 90 95 Ile Val Asn Pro Glu Ile Met Lys Thr Asp Lys Ser Ile Pro Ser Asp 100 105 110 Val Ile Glu His Ala Asn Ala Phe Leu Gly Ser Cys Gly Gly Lys Ser 115 120 125 Ala 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<213> Oryza sativa japonica <400> 21 atggctgctc ccagcgtcgc cgtcgacaac ctcaacccca aggttttgaa ttgtgagtat 60 gcagtgcgtg gagagattgt gatccatgct cagcgcctgc agcaacagct acagactcaa 120 ccagggtctc ttccttttga tgagatccta tactgcaaca ttgggaatcc ccagtctctt 180 ggtcagaagc cagttacatt cttcagggag gttattgctc tttgtgatca tccatgcttg 240 ttggaaaagg aggaaaccaa atcattgttc agtgctgatg ccatttctcg agcaacaaca 300 attcttgcct cgattcctgg aagagcaact ggagcataca gccacagcca gggcatcaaa 360 gggctgcgtg atgcaattgc tgctggaatt gcatcacgtg acggataccc tgcaaatgca 420 gacgacattt tccttactga cggagcaagc cctggagttc acatgatgat gcagttactg 480 ataaggaacg agaaagatgg cattctctgc ccaattcctc aatatccttt gtactcagcc 540 tccattgctc ttcatggtgg agctcttgtc ccgtattatc ttaatgaatc aacaggctgg 600 ggtttggaga tctctgacct taagaagcaa ctcgaagatt ctcggttgaa aggcattgat 660 gttagggctt tggtagttat caatccagga aatccaactg ggcaggttct tgctgaggaa 720 aaccaacggg acatagtgaa gttctgcaaa aatgagggac ttgttcttct ggctgatgag 780 gtgtaccaag agaacatcta tgttgacaac aagaaattta actctttcaa gaagatagcg 840 agatccatgg gatacaacga ggatgatctc cctttagtat catttcaatc tgtttctaag 900 ggatattatg gtgaatgtgg caaaagagga ggctacatgg agattactgg cttcagtgct 960 ccagttagag agcagatcta caaagtggcg tcagtgaact tatgttccaa tatcactggc 1020 cagatccttg ccagcctcgt catgaatcca ccaaaggctg gagatgcatc atatgcttca 1080 tacaaggcag agaaagatgg aatcctccaa tcattagctc gccgtgcaaa ggcattggag 1140 aatgctttca acagtcttga gggaattaca tgcaacaaaa ctgaaggagc aatgtacctc 1200 ttccctcagc ttagtctgcc acaaaaggca attgacgctg ctaaagctgc taacaaagca 1260 cctgatgctt tctatgccct tcgtctcctc gaggcaaccg gaattgttgt tgtccctgga 1320 tctggatttg gccaagttcc tggcacatgg cacatcagat gcacaatcct gccacaggag 1380 gagaagatcc ccgcgatcat ctcccgcttc aaggcattcc atgagggctt catggcagcg 1440 taccgcgact ga 1452 <210> 22 <211> 483 <212> PRT <213> Oryza sativa japonica <400> 22 Met Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Asp Asn Leu Asn Pro Lys Val Leu 1 5 10 15 Asn Cys Glu Tyr Ala Val Arg Gly Glu Ile Val Ile His Ala Gln Arg 20 25 30 Leu Gln Gln Gln Leu Gln Thr Gln Pro Gly Ser 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aattttctgt agagggccag aaacgggtgt cttgattcca 840 attcctcaat atccattata taccgctact ctagctttga acaattctca agctttacca 900 tactatttag atgagaattc aggttggtca actaatccag aagaaattga aactgtcgtc 960 aaagaggcta tacagaacga aatcaaacct acagttctag tggttatcaa tccaggtaat 1020 cctacaggag ctgtcctatc acctgagtct atagctcaga tttttgaagt cgcagccaag 1080 tacggtacag tagtgatagc tgacgaagtt tatcaagaaa atatcttccc gggcaccaag 1140 ttccattcta tgaagaaaat tttgagacat ttacagaggg aacatccagg taaattcgat 1200 aatgttcagc tagcttcttt gcattcgact tctaagggtg tttctggtga atgtggtcaa 1260 aggggtggct acatggaact cactggattc agccatgaga tgagacaagt tatcttgaaa 1320 ctagcctcga tttcattgtg tcccgttgtc acaggtcaag ctttggttga tttgatggtt 1380 cgtccaccag tggaagggga ggaatcattc gagtcggacc aagcagaacg taactccatc 1440 catgaaaagt taattacaag agcaatgaca ctgtatgaga catttaactc tttagaaggc 1500 attgaatgtc aaaagcctca aggtgccatg tatttattcc ctaagataga cttacctttc 1560 aaggcagttc aagaagctcg ccacttagag ttaactccgg atgaatttta ttgtaagaag 1620 ttgttagaat ctactggcat 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tactcggcgt cgcagggtgt gaaaggctac 480 cggcgcacgg ttgcgcagtt tattgagcgg cgcgatggga tcccagcgaa tccagacaac 540 gtgtacctga ccgcgggtgc gtcctctgct gtgtcttgtc tgctgtcgac attctgcaag 600 ggaccggaga caggcgtgtt gatcccaatc cctcagtacc cgctgtacac tgctacgatc 660 acacagaata acgcggttgc gctgccgtac tacctaaatg aggctgatgg gtggtctacg 720 aatccagatg agatggaacg tgtcatcctc gattctaaga agaggaacat cgcgcccaaa 780 tgtctggttg tgattaaccc tgggaatccc actggttccg tactgtctgt aaaggatatg 840 gaggctattc taacacttgc tgcgaagtat gggattgtcg ttattgcgga cgaggtatac 900 caggataatg tgtttggcga tgccaagttc cactctatgc gtaaggtgct gaaaaacctt 960 caactcagag agccaacgct ctacaagaat gtccagttag cctctcttca ctcgatctcg 1020 aaggggctct ccggcgaatg tggccagcgt ggtggctaca tggaattgat cggtttccgt 1080 gaggagctca ggaaggtttt cgttaagttg gcttctatat ctctttgtcc agtggttacc 1140 ggacaagctc tagtcgacct tatggttggg cctcccagcc aaggggatcc atcctatgag 1200 caatataccc aggaaacaag gagtatctat cacgaattgg aggaacggtc gcaactgctg 1260 tggaaaacgt tctgttcctt ggagggtata gaatgcaata tgccacaagg tgctctatat 1320 ctattcccta agttgcatct tccacagaaa gctattgaag cggcgcaaaa gctgggtata 1380 ccagcggatg agctctactg tagcgaatta cttgatgaaa caggcatctg cactgtccct 1440 ggaactggtt tcggccaaat cccgggcaca tatcacgtta gaactacgtt tttgccacct 1500 ggtactaagt ggatcgaaag ttggaaggac ttccacaaga aattttatga caagtatagg 1560 gactaa 1566 <210> 30 <211> 521 <212> PRT <213> Ashbya gossypii <400> 30 Met Ala Ile Gly Met Leu Arg Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ala Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Gln Gly Arg Val Leu Arg Thr Arg Arg Leu Ser Ser Val Lys 20 25 30 Asp Gly Ser Arg Phe Val Pro Ala Glu Pro Met Thr Leu Ala Asp Val 35 40 45 Asn Glu Asn Val Val Lys Ala Lys Tyr Ala Val Arg Gly Lys Ile Pro 50 55 60 Thr Arg Ala Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu His Pro Gly Ser 65 70 75 80 Leu Pro Phe Ser Lys Ile Ile Gln Ala Asn Ile Gly Asn Pro Gln Gln 85 90 95 Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Tyr Arg Gln Val Ile Ser Leu Met 100 105 110 Gln Asn Pro Gln Leu Leu Glu Met Pro Ala Glu Trp Leu Gln Gln Ala 115 120 125 Phe Lys Ala Asp Val Val 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aattccttaa ggtttttagc aacctttaaa cctgcggatc cattgactac tcatgatatc 120 aacccacaaa cggtcgaggc aaaatacgct gtacgtggga aaatcccaat tattgccgat 180 gaattgaatg aattgattca aaagcaacca cagctgcatg gattaccatt tagcaaaatc 240 attaatgcca acattggtaa cccacagcaa ttggaacaac gtccattgac atggtatcgt 300 caagtattgt ctcttttaca atacccggat ttattgaaaa atggagaccc tgaaaccgtt 360 aaatcacttt atcctgaaga tgtgattgag cgagcacaat caattttgaa acacattgga 420 tcaatagggg catactctca ttctcagggt gccagttatt tccgacaatc tattgctgaa 480 tttataacta accgtgatgg tggttatgta tcccacgcca acaacatttt tttaacttcc 540 ggggcatcaa ctgcagtgtc gtatttatta caaattttgt ctgtcaatga aaactccggg 600 ttcttaattc cgatcccaca gtatcctttg tatactgcca ctattgcctt gaataatgcc 660 aagccaattg gttattatct cgatgagtcg aaccattggt caaccaatcc tcaagagatt 720 agagaattga tcgaaaccaa tcaactgcaa ggtattaaca tcaaggcatt ggtggtgatt 780 aacccgggga acccaacggg ggcaatttta tcatcacaag atataattga attgatagat 840 attgctgctg aatatggaat tgtattaatt gccgatgagg tttatcaaga aaatattttc 900 aaagggaaat ttgtttcatt caagaagatt ttgtcggaat taattgagca agaccctcaa 960 acttataaac atgttcaatt agcatcatta cactcgacat cgaaaggtgt tagtggagaa 1020 tgtggacaac gtggtggata tatggaatta gttgggttca aaccggaagt taaagatgtg 1080 gttttcaaat tggcatcgat taatttatgt tctgttgtct ctggtcaagc attaatggag 1140 ttaatgatta atcctcctca agaaggtgat cctagttacc ccttgtacaa aagcgaaacc 1200 gaatcaatcc ataacgattt ggaatcaaga gcagaatcac tctatcaagc ttttttacaa 1260 atggaagata tcaaatgtaa taaaccaatg ggggccatgt atattttccc cactttagat 1320 tttgatccag cccgatacca taagttatat tcgagagcta agaattccaa tttacaaatt 1380 gatgatattt attgtatcga gttattagaa ggtacaggta tttgttgtgt tcctggtaat 1440 ggatttggtc agaaaccaga tacttatcat ttaagaacaa catttttacc accaggtaaa 1500 gaatggattg ataaatggat aaatttccat aaatcattta ttaaaaaata taaagatgaa 1560 tag 1563 <210> 32 <211> 520 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 32 Met Leu Arg Val Asn Ser Arg Leu Leu Thr Thr Arg Lys Ser Gln Phe 1 5 10 15 Met Phe Thr Ser Asn Ser Leu Arg Phe Leu Ala Thr Phe Lys Pro Ala 20 25 30 Asp Pro Leu 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gcgttcaggt 1380 atatgtgttg ttcctggaag tggatttggg caaccagaag gtgattatca tattcgaatc 1440 acgtttttgg ctaaaggaac tgaatacatt gaacgatttg tcaaagctca taatgaaata 1500 atggacctct atgaataa 1518 <210> 34 <211> 505 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 34 Met Phe Thr Asp Tyr Pro Asn Asp Ile Asn Cys Glu Ser Pro Arg Met 1 5 10 15 Ser Asp Leu Asp Gly Phe Cys Gln Asn Ala Phe Ser Asp Leu Asn Ser 20 25 30 Leu Asn Gln Gln Val Phe Lys Ala Asn Tyr Ala Val Arg Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Ile Leu Ala Asp Glu Ile Gln Asp Asp Leu Leu Glu Asn Pro Ser 50 55 60 Ser Tyr Pro Phe Ser Glu Ile Val Tyr Ala Asn Ile Gly Asn Pro Gln 65 70 75 80 Gln Met Gly Gln Ser Pro Ile Thr Phe Val Arg Gln Val Leu Ser Leu 85 90 95 Cys Gln Tyr Pro Thr Leu Leu Asp His Ala Glu Glu Lys Trp Phe Gln 100 105 110 Asn Leu Phe Pro Thr Asp Val Val Gln Arg Ser Lys Met Leu Leu Lys 115 120 125 Glu Ser Gly Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Ala Ser Gln Gly Ile Pro Leu 130 135 140 Val Arg Arg His Val Ala Asp Phe Ile Arg Ala Arg Asp Gly Phe Asp 145 150 155 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240 cccatcactt tcttccgtca agtcctcagt cttatggaaa accctctact gttaagcaac 300 aaagatgccc ttcgtacgtc tttcggctat caggatgatg ttatcgagcg ggccgagaag 360 cttctggccg aagtccagag tgttggtgca tacagtcaca gccaaggtgc tcccctgatt 420 cgcgagagtg tggccaagtt cattgaagaa cgtgatggct tccccgccga ccctcagtcg 480 ctttacctta ctggtggtgc ctcttccggt gtaaacacca ttctgaacgt catttgtaat 540 gggccaaatg ctggtgtcct agttccgatt ccccagtatc ctctgtacac agccacttta 600 tccctcttga atgctcagtg tgttccttac cacttagaag agcagaaggc ttggggtacc 660 gacatcggta caatcaagaa gtcattggaa caggccaagg ctgcaggcac tgacgttcgc 720 gccattgttg ttatcaaccc tggcaacccg acgggcgctt ctttgagtcc agctgatatc 780 aagagcgtcc ttgacatcgc cgcggaagag aagctcgtcg taattgcgga cgaggtatac 840 cagacaaatg tgtttatcgg agaattcaca tcgttcaaaa agaggctccg ggagctgcag 900 caagaagtac ctggtaaata cgacaatgtc gagcttgttt cccttcacag tacttccaag 960 ggtatggttg gtgaatgtgg ccatcgcgga ggttacttcg aactggttgg atttgatccc 1020 ttggttgctg cccaggtcta caagttcatc agcatcatgc tctgccctcc tgtcatcggg 1080 caatgtttgg ttgaactgat ggtgaaccct ccaaaggagg gcgagcccag ccatgagttg 1140 tatcagaagg agtacaacgg catccgggaa ggactgcgcc agcgcgcctt tgccctctat 1200 gaagcttttc aacggatgga gggtgtcgag tgccaagagc ctcagggtgc catgtacctt 1260 ttccctacta tctcactgcc tcccaaggct attgaagccg ctgccgctga gaaccgcgcc 1320 gcagacgaat tctactgcct ccgtctcctt gacgccactg gtgtttgcgt cgtccctggc 1380 tccggcttcg gtcagaagga gaacacgctc cacttccgca ctactttcct cgcaccaggc 1440 acggactggg tggagcgtat cgtgaagttc cattccgagt tcatggccaa atacaaatag 1500 1500 <210> 36 <211> 499 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 36 Met Thr Thr Arg Thr Thr Val Pro Asn Ala Ser Gln Arg Ala Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Val Arg Cys Leu Thr Leu Asp Asn Ile Asn Ser Asn Val 20 25 30 Lys Ala Ala Lys Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Ala Val Lys Ala Glu 35 40 45 Glu Tyr Arg Val Arg Leu Ala Gln Gly Asp Lys Thr Leu Pro Phe Asp 50 55 60 Ser Val Ile Phe Ala Asn Ile Gly Asn Pro Gln Gln Leu Asp Gln Lys 65 70 75 80 Pro Ile Thr Phe Phe Arg Gln Val Leu Ser Leu Met Glu Asn Pro Leu 85 90 95 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atgatcacag aacccaccat gaccgtgcca tataccacca agcggaccgc ttctgatctc 60 ggccctcgtc gtctccgtgc cgataatatc aatcccaacg tcaaggcggc caagtatgct 120 gtccgtggtg agcttgccgt caaggcggag gaataccgtg tgagattggc caagggagac 180 aagtctttgc cctttgacag tgtcattttc gccaatattg gcaaccccca gcagctggat 240 caaaaaccca tcaccttctt ccgtcaagta ctcagtcttc tcgagaacac cgcattgctt 300 gaaaaaccgg aggtcctgcg gtcgtctttc ggctacaacc aggacgtcat tgaccgggct 360 aagaagcttc ttgcggacat tcagagcgtc ggtgcctaca gtcacagcca gggagcacca 420 gtaattcggg agagcgtggc caaattcatc gaggagcgtg atggcttccc cgccaacccg 480 caagacctgt acctctgcgc tggtgcgtcg tccggtgtta gcacgctgct gaatgtcatc 540 tgcaacggtc ccaccgccgg tgtccttgtg ccgattcccc aatatcctct gtacaccgcc 600 accctgtccc ttctcaatgc acagtgcgtc ccataccatt tagaggagga caaggcctgg 660 ggtaccgacg tggaggccat ccggcaatct ctggtgcgcg ccaaggccga gggcactgag 720 gttcgtgcta tcgtcgtcat caaccccggt aacccgacgg gtgcctcgct cagccccgag 780 gacatcaaga gcgtgcttga catcgccgcc gaggagaagc tggtcgtcat cgccgacgag 840 gtgtaccaga ccaacgtctt 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agcatttcaa caaaatggaa 1260 ggtgtttctt gcaacaatgc ggaaggagcc atgtacttgt tcccgaggat taatatccct 1320 cccaaagctg tagaggcggc gaagaagttg ggtaaggaac cggatgtgat gtatgctttg 1380 gatcttcttg atgcgaccgg tatctgtgcg gtggcaggca gcggttttgg ccaagaaccg 1440 gggacgttcc atttgcgagt gactgccctg tgtcccgata ctgctgaatt tatcggtcga 1500 ttccaaaagt tcaacaagga atttatggaa aagtatgcct aa 1542 <210> 42 <211> 480 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans <400> 42 Met Pro Arg Leu Ser Asn Val Tyr Cys Pro Lys Ser Leu Leu Gln Arg 1 5 10 15 Gln Thr Ile Gln Ile Arg Ser Phe Ser Gln Thr Met Ser Pro Phe Lys 20 25 30 Pro Ala Leu Thr Leu Asp Thr Ile Asn Pro Ala Val Gln Ala Val His 35 40 45 Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Ala Asp Lys Tyr Val Gln 50 55 60 Val Leu Ala Asp Ile Thr His Lys Pro Leu Pro Phe Glu Lys Ile Val 65 70 75 80 Thr Ala Asn Ile Gly Asn Pro Gln Gln Gln Gly Leu Asp Gln Val Pro 85 90 95 Leu Thr Tyr Trp Arg Gln Ile Ile Ser Leu Leu Glu Tyr Pro Asp Leu 100 105 110 Met Gln Lys His Glu Gln Leu Ala Lys Gln Ile Tyr Pro 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caaaatgtaa gaaatgcaca atatgcagta cgtggtgaat tagttattcg tgcagaagca 240 atttcacatc aattacaaaa acaaaaaaca gaaggcacaa aaacattacc atttgaagag 300 attgtctatt gtaatattgg taatccacaa caattgaaac aaaaaccatt aacttatttc 360 cgtcaagttg tatcattagt tgaatgtcca gatttattag ataatccata cgttgaaaag 420 atatatccag ccgatgttat ctcacgtgct aaagagatat taggatcaat taataataca 480 acaggtgcct attccaatag tcaaggtatt ggtttagttt taagatcagt tgcagatttc 540 atagagagac gtgatggaca taaatctgat ccatccgaaa ttttccttac agatggtgca 600 tcagttggtg tacaacgtat tttgaaactt ttaattaaag atcgttcaga cggtatctta 660 attccaattc cacaatatcc actctacagt gccaccattg aattatataa tggcagtcaa 720 ttagggtacc tattaaatga agagaaaggt tggtcactcg agatctccca attggagcat 780 tcctacaatg atgcagtttc aaagggtatt aatccacgtg cactcgttat catcaatcca 840 ggtaatccaa ctggtcaatg tttagataga gcaaatatgg aagagattgt caagttttgt 900 ttagaaaaga atgtagtatt attggctgat gaagtctatc aagagaatgt ttatgtcaaa 960 gagagtaaac cattcatctc attcaaaaag gttgtcaaag atatgggtgg tgattatgca 1020 gatttagaga tggtttcatt ccattcagtt agtaaaggtt tcgttggtga atgtggtaaa 1080 cgtggtggtt atatggaatt aaatggtgtc actcaagatg ttaaagctga aatttataaa 1140 ctcgcatcaa ttggtttatg tccaaatgtt attggtcaat tggttgttga tttaatggtt 1200 cgtccaccag ttgctggtga acaatcacat gatctctacc ttaaagaaag agataatatc 1260 tatgaatctt taaaaaaacg tgcaaatctc ttaacaaatg ctttaaataa tcttgaaggt 1320 gtaacttgta atccatcaga aggtgcaatg tatgctttcc cacaaattcg tcttccagct 1380 aaagctgtag aatatgcaaa ttcaattggt aaagcaccag atgcttacta ttgtattcaa 1440 ttactcgaag ccactggtat ctgtgttgta ccaggtagtg gtttcggtca aaaagatggt 1500 acttggcatt ttagaactac cttcttacct tctgaagaag caattgaagg tgtttgtaag 1560 agaatcgctg atttccatca atcatttatg aataaatata aataa 1605 <210> 44 <211> 534 <212> PRT <213> Dictyostelium discoideum <400> 44 Met Phe Lys Arg Ser Leu Lys Val Leu Leu Ser Asn Pro Pro Ile Asn 1 5 10 15 Arg Val Lys Pro Ser Ser Thr Ile Ile Gln Pro Leu Ser Asn Thr Thr 20 25 30 Thr Thr Thr Ile Ile Asn Asn Asn Asn Ile Thr Asn Phe Glu Lys Met 35 40 45 Thr His Lys Lys Ser Met Thr 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aacgtactgg cgcctacacg gactccgcag gctatgcctt tgtacgtgac 600 atcgtcgcgc agtatgtgaa tgagcgtgac gcctatgtaa aaccgcttca ggaggcatcg 660 tcgattgtgc ttacagacgg cgcaagcact ggtgtgcgca taatcttaca gacgcttgtg 720 ggcgatgaga aggacgctgt gatgattccc atcccgcagt atccgctgta cacggcacag 780 attgcattgt tgggaggtac ccccgcgatg tattaccttc gtgagagcga aggctgggcg 840 ctgaacgttg gagagctcga ggcagtatac aaagactgtg tggcgaacgg aaacgcgacg 900 ccccgcgtgc tcgtcgtgat taaccctggt aaccctacag gtggcgtgtt ggagcgcact 960 gtgatggagg aggttgccaa gttctgttgc gatcacggtg ttgtgctcat ggccgatgag 1020 gtttaccagg aaaatatcta caccgcgacc aagcggtttg agagttttcg gaagattgtg 1080 ctcgaacttc caccaccata caacaccgac accgtgcttg tttccttgca ctccgtgtcg 1140 aagggtatta tcggtgagtg tggtcgccgt ggtgggtact tcacactcac aaacgctccg 1200 cctgagttag tggagcaggt gatgaaattg tgctctatta acctctgcag caacgtcaac 1260 ggtcagctta tgacggcact gatgtgctcc ccgccgaaac ctggcgatgc gagcttcgac 1320 cactacacgg cagagtacag tggcattttt gaaagcctta agcgccgtgc tgacctgctt 1380 gcaaaggaac tgaacaacat ccgtggtttc aagtcccaat ctgttgaggg cgccatgtac 1440 gctttcccca ctattgagct ccctcccaag tacgtgaagc acaacgatga gatgaactca 1500 aaggagggcc gacagcttgc gccggacgcg cgttgggcac tggagcttct cgagagcacc 1560 ggtattgttg tggtgccggg ttctggcttt gggcagcagc ctgggacact gcacttccgc 1620 acgacgatcc tcccacccga agcgcatatg gagcgtgtgg tgaaggctct gcgccagttc 1680 caggagggca tttgggccaa gtatgcataa 1710 <210> 46 <211> 569 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 46 Met Asp Ile Tyr Leu Phe Ser Val Trp Phe Ile Gln Asn Glu Glu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Asp Phe Leu Asn Ile Ser Lys Lys Asn Lys Ala Lys Ser Ser 20 25 30 Val Gln His Ile Gly Gly Leu Ala Arg Lys Gln Asn Pro Glu Pro Thr 35 40 45 Lys Ser Ile Phe Val Ser Arg Tyr Gly Ala Arg Ser Leu Lys Thr Ser 50 55 60 Thr Met Lys Gly Asn Gln Glu Phe Phe Gln Lys Gly Gly Ala His Val 65 70 75 80 Ser Lys Gly Val His Ile Asn Pro Arg Val Lys Lys Ala Gln Tyr Ala 85 90 95 Val Arg Gly Leu Val Pro Met Arg Ala Asp Glu Ile Arg Glu Glu Ile 100 105 110 Arg Ser Gly Thr Gly Lys Ser Lys Phe Ser Phe Asn 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actggtgctt actcaccatc taaaggtctt 360 gcttatgtta gacaaacaat tgcacgtttc ttagaagaaa gagataatgt tccaatgtcc 420 ccagaagata tttatttaac tgatggtgct tctattgcta ttaagattgt tatgcaatta 480 atgctttcac atccacttca tggtattatg attccaaatc cacaatatcc attatatggt 540 gcttgtattc aacaattagg aggaaaaaca tgtcattata atttaaacga agataattat 600 tggttaccag acattaatga tattaaggaa caatatgaaa aatatcagaa tgaaggaatt 660 aaaattaagg cattagttgt tattaatcca ggaaatccat gtggagaagt tttaccagtt 720 gacactataa aagaaattat tagattctgt aacgaaaaga agatttgttt aatggctgat 780 gaagtatatc aagaaaatat ttggactgat gttccattca actcatttag aaaaattctt 840 gctacaatgg aaccagaaat tgcacatgga cttgaattaa tttctttcca ttctatttca 900 aaaggattct atggagaatg tggtaagaga ggaggaatgt ttgcatgtac caatattcca 960 gaatttgctc gtttaatgat gtataaaatt atttctacta ctttatgttc taatgttgta 1020 ggacaagttg taatgtctat aatttgtaat cttccaaaag aaggagaccc atcctatcca 1080 ttatttaaac aagaaagaga tgaaatcctt ggctctttaa aacgtaaagc agaatattta 1140 tgtgatattt tcaataagtg tgaaggtatg tcttgtaata gagctgctgg agctatgtat 1200 cttttcccaa gaattacatt accagaaaaa ttcataaaag aatgtcatga aagacatgaa 1260 gatccaaatg aaacatattg tattgaaatg ttaaaaaaga ctggaattgc tgttgtaaaa 1320 gggtctggat ttggtcagaa aaagggtaca tatcatttta gaattgcttt gttaccacca 1380 gaaaatgaaa ttgaagaagt tggaaaaaga attcaagtat tccataattc ttttattcaa 1440 caatacaagt aa 1452 <210> 52 <211> 483 <212> PRT <213> Entamoeba histolytica <400> 52 Met Arg Ser Phe Ala Ser Glu Asn Ile Ser Pro Asp Val Val Ala Phe 1 5 10 15 Gln Phe Ala Val Arg Gly Lys Ile Ala Ile Val Ser Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Asn Ala Ile Lys Lys Ala Lys Ala Glu Gly Lys Pro Asn Pro Tyr Pro 35 40 45 Phe Glu Lys Val Val Lys Cys Asn Ser Gly Asn Pro Gln Leu Leu Asn 50 55 60 Gln Lys Pro Leu Thr Phe Val Arg Glu Ile Thr Ser Met Val Glu Tyr 65 70 75 80 Pro Pro Leu Thr Glu His Pro Glu Leu Phe His Ala Asp Ala Val Ala 85 90 95 Arg Ala Lys Glu Ile Ile Lys Ala Thr Gly Cys Asn Gly Thr Thr Gly 100 105 110 Ala Tyr Ser Pro Ser Lys Gly Leu Ala Tyr Val Arg Gln Thr Ile Ala 115 120 125 Arg Phe 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caggtgatgt cgctgattga cgcgccgttc 240 ctgctggaga acgagaaggt tacgtcgcag ttcccggcgg atgcggtggc gcgtgcgagg 300 gagtatcttc gccacatcgg cgatcgcacg ggcgcctaca cggactctgc gggctacgcc 360 tttgtccgtg acatcgtggc gcggcaaatc aatgaacgcg accacgagat aaagccgctg 420 gtggacgcat cctctatttt tctgacggac ggcgcgagct cgggcgtgcg tcttttgctg 480 caggttctcg tgggtgacgc gagtgatgcg gtgatggttc ccattccgca gtacccgctg 540 tacacggcgc agcttacgct tcttggcggc acgcccgcga tgtactacct gtgtgagaag 600 gataactggg cactgaacgt ggaggagctg gcgtcggtgt acgacgagtg cgtggcgaag 660 aataatgcga ccccgcgcgt gctcgttgtg atcaaccctg ggaacccgac tggcggcgtg 720 ctggatcgcg acgtgatgga ggccgtggcg aaattctgct gcgaccgcgg cattgtgctg 780 atggcggacg aggtgtacca ggagaacgtg tacgcggcgg gaaagcgttt cttgagcttc 840 cgggaagtgg tgcttgggct gccggcgccg tacaacacgg acacggtgct ggcctcgctg 900 cactcgacgt cgaagggcat cattggtgag tgcgggcgcc gcggcgggta cttctgcctc 960 acaaacttcc ccgcgccggt tcgggagcag gtgttaaaga tgtgctccat ggttccgtgc 1020 agcagcgtga atgggcagtt gatgacggca ctgatgtgct cgccaccgcg gcccggtgac 1080 gcgagctatg agtcatactg ggcggagtac aatgggatct ttgcgagtct aaagaagcgc 1140 gccctgctgc ttgcgaagga gctgagcacg attcgcggtt tttcttgcca gccggtggaa 1200 ggggcgatgt acgcgtttcc gacgattgag ctgccggaga agtactttca gcacaatgag 1260 gagctgaacg cgaaggaggg gcgaaagctt gggcccgaca cgcgatgggc gttggagctt 1320 ctggagagca gcggggttgt tgttgtggcc ggctctgggt ttggtcagca gcccaacacg 1380 ctgcacttcc gcacgacgat cctgccgccg gagcagcaga tggaacggat ggtgaaggcg 1440 atgcgcacat tccaggaggg catttgggca aagtacgggt aa 1482 <210> 54 <211> 493 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 54 Met Ser Gly Ser Arg Lys Glu Ile Arg Ile Asn Pro Arg Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Glu Tyr Ala Val Arg Gly Met Leu Pro Met Arg Ala Asp Glu Ile 20 25 30 Arg Ala Ala Leu Ala Thr Pro Glu Gly Lys Ala Lys Tyr Pro Phe Ser 35 40 45 Ser Ile Val Tyr Cys Asn Ile Gly Asn Pro Gln Ala Leu Glu Gln Lys 50 55 60 Pro Leu Thr Phe Phe Arg Gln Val Met Ser Leu Ile Asp Ala Pro Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Asn Glu Lys Val Thr Ser Gln Phe Pro Ala Asp Ala Val 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tggattcagg gccattcgca tcaacccccg tgtggtggcg 60 gcagagtatg cggtgcgtgg gatgctccca atgcgtgcgg acgagatcag ggcggccctg 120 gcgacaccgg aggggaaggc caagtatccc ttccccagca ttgtgtactg caacattggg 180 aacccgcagg cactggaaca gaagccgctg acgttcttcc ggcaggtgat gtcgctgatt 240 gacgcgccgt tcctgctgga aaacgagaag gttacgtcgc agtacccggc ggatgcggtg 300 gcgcgtgcga gggagtatct tcgccacatc ggcgatcgca cgggcgccta cacggactct 360 gcgggctacg cctttgtccg tgacatcgtg gcgcggcaaa tcaatgaacg cgaccacgag 420 ataaagccgc tggtggacgc atcctctatt tttctgacgg acggcgcgag ctcgggcgtg 480 cgtcttttgc tgcaggttct cgtgggtgac gcgagtgatg cggtgatggt tcccattccg 540 cagtacccgc tgtacacggc gcagcttacg cttcttggcg gcacgcccgc gatgtactac 600 ctgtgtgaga aggataactg ggcactgaac gtggaggagc tggcgtcggt gtacgacgag 660 tgcgtggcga agaataatgc gactccgcgc gtgctcgttg tgatcaaccc tgggaacccg 720 actggcggcg tgctggatcg cgacgtgatg gaggctgtgg cgaaattctg ctgcgaccgc 780 ggcattgtgc tgatggcgga cgaggtgtac caggagaacg tgtacgcggc gggaaagcgt 840 ttcttgagct tccgggaagt ggtgcttggg ctgccggcgc 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<213> Trypanosoma cruzi <400> 58 Met Ser Gly Ser Arg Lys Glu Ile Arg Ile Asn Pro Arg Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Glu Tyr Ala Val Arg Gly Met Leu Pro Met Arg Ala Asp Glu Ile 20 25 30 Arg Ala Ala Leu Ala Thr Pro Glu Gly Lys Ala Lys Tyr Pro Phe Ser 35 40 45 Ser Ile Val Tyr Cys Asn Ile Gly Asn Pro Gln Ala Leu Glu Gln Lys 50 55 60 Pro Leu Thr Phe Phe Arg Gln Val Met Ser Leu Ile Asp Ala Pro Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Asn Glu Lys Val Thr Ser Gln Phe Pro Ala Asp Ala Val 85 90 95 Ala Arg Ala Arg Glu Tyr Leu Arg His Ile Gly Asp Arg Thr Gly Ala 100 105 110 Tyr Thr Asp Ser Ala Gly Tyr Ala Phe Val Arg Asp Ile Val Ala Arg 115 120 125 Gln Ile Asn Glu Arg Asp His Glu Ile Lys Pro Leu Val Asp Ala Ser 130 135 140 Ser Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Ser Gly Val Arg Leu Leu Leu 145 150 155 160 Gln Val Leu Val Gly Asp Ala Ser Asp Ala Val Met Val Pro Ile Pro 165 170 175 Gln Tyr Pro Leu Tyr Thr Ala Gln Leu Thr Leu Leu Gly Gly Thr Pro 180 185 190 Ala Met Tyr Tyr Leu Cys Glu Lys Asp Asn Trp Ala Leu Asn Val Glu 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ttctggagag cagcggggtt gttgttgtgc ccggctctgg gtttggtcag 1380 cggcccaaca cgctgcactt ccgcacgacg atcctgccgc cggagcagca gatggaacgg 1440 atggtgaagg cgatgcgcac attccaggag ggcatttggg caaagtacgg gtaa 1494 <210> 60 <211> 497 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 60 Met Leu Arg Lys Thr Leu Phe Gly Phe Arg Ala Ile Arg Ile Asn Pro 1 5 10 15 Arg Val Val Ala Ala Glu Tyr Ala Val Arg Gly Met Leu Pro Met Arg 20 25 30 Ala Asp Glu Ile Arg Ala Ala Leu Ala Thr Pro Glu Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Tyr Pro Phe Ser Ser Ile Val Tyr Cys Asn Ile Gly Asn Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Glu Gln Lys Pro Leu Thr Phe Phe Arg Gln Val Met Ser Leu Ile 65 70 75 80 Asp Ala Pro Phe Leu Leu Glu Asn Glu Lys Val Thr Ser Gln Phe Pro 85 90 95 Ala Asp Ala Val Ala Arg Ala Arg Glu Tyr Leu Arg His Ile Gly Asp 100 105 110 Arg Thr Gly Ala Tyr Thr Asp Ser Ala Gly Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 115 120 125 Ile Val Ala Arg Gln Ile Asn Glu Arg Asp His Glu Ile Lys Pro Leu 130 135 140 Val Asp Ala Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Ser Gly Val 145 150 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atccaaaagc tgtgactatg 1140 atgccgctgc ccaccttttg gtccattctg ttttttatta tgctcctctt gcttggactg 1200 gacagccagt ttgttgaagt cgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccgtcc 1260 ttcctaagga agggttatcg tcgggaagtc ttcatcgcca tcctgtgtag catcagctac 1320 ctgctggggc tgtcgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcaact ctttgactac 1380 tatgcagcta gtggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc 1440 tggatatatg gtggtgataa cttatatgac ggtattgagg acatgattgg ctatcggcct 1500 gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ttctctgtgc tggatgtttc 1560 atcttctctc ttgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtctacgt gtatcctgat 1620 tgggcaattg ggctgggctg gggcctggcc ctatcctcca tggtgtgtat ccccttggtc 1680 attgccatcc tcctctgccg gacggaggga ccgttccgcg tgagaatcca atacctgata 1740 acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgagg gggccacacc cttccactcc 1800 cgcacaagcc tcgtcatgaa cggcgcactc atgaaaccca gtcacgtcat tgtggagacc 1860 atgatgtga 1869 <210> 62 <211> 622 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 62 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys 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ggtattgagg acatgattgg ctatcggcct 1500 gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ctctttgtgt tggatgtttc 1560 gtcttctcgc ttgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtgtaccg gtacccggat 1620 tgggcaattg ggctgggctg gggcctggcc ctttcctcca tgctgtgtat ccccttggtc 1680 attgtcatcc tcctctgccg gacggaggga ccgctccgcg tgagaatcaa atacctgata 1740 acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgaag gggccacacc ctttcactcc 1800 cgagtaaccc tcatgaacgg cgcactcatg aaacccagtc acgtcattgt ggagaccatg 1860 atgtga 1866 <210> 66 <211> 621 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 66 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 1 5 10 15 Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Asp Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60 Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 Leu Glu Val Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys 100 105 110 Trp Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Ile 115 120 125 Val Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp 130 135 140 Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe His Ser Phe Gln Lys Asp Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160 His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro Gln Cys Met Glu Asp Thr Leu 165 170 175 Arg Arg Asn Glu Ser His Trp Val Ser Leu Ser Thr Ala Asn Phe Thr 180 185 190 Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Gly Ile Asp Asn Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240 Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Glu 260 265 270 Gly Ile Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Ser Arg Leu Gly Asp Pro 275 280 285 Gln Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala Ile 290 295 300 Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335 Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala Ile Phe Ser Ile Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350 Gln Glu Gln Gly Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365 Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380 Thr Phe Trp Ser Ile Leu Phe Phe Ile Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Asp Ser Gln Phe Val Glu Val Glu Gly Gln Ile Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415 Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu Ile Phe Ile 420 425 430 Ala Ile Leu Cys Ser Ile Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Thr Met Val Thr 435 440 445 Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gln Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460 Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val Ile Ala 465 470 475 480 Trp Ile Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Asp Met Ile 485 490 495 Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val Ile Thr 500 505 510 Pro Ala Leu Cys Val Gly Cys Phe Val Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525 Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Arg Tyr Pro Asp Trp Ala Ile Gly 530 535 540 Leu Gly Trp Gly Leu Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys Ile Pro Leu Val 545 550 555 560 Ile Val Ile Leu Leu Cys Arg Thr Glu Gly Pro Leu Arg Val Arg Ile 565 570 575 Lys Tyr Leu Ile Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590 Glu Gly Ala Thr Pro Phe His Ser Arg Val Thr Leu Met Asn Gly Ala 595 600 605 Leu Met Lys Pro Ser His Val Ile Val Glu Thr Met Met 610 615 620 <210> 67 <211> 1863 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 atggccacca aggagaagct gcagtgtctg aaagatttcc acaaggacat cctgaagccc 60 tcaccaggga agagcccagg cacgcggcct gaggacgagg ctgagggaaa acctccgcag 120 agggagaagt ggtctagcaa gatcgacttt gtgctctctg tggctggcgg cttcgtgggc 180 ttgggcaacg tctggcgctt cccgtacctc tgctacaaga atggtggagg tgcgtttctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagc ggcctgcctg tgtttttctt ggagatcatc 300 ataggccagt acacctctga agggggcatc acctgctggg aaaagatctg ccccttgttc 360 tctggtatcg gctatgcctc cgttgtaatt gtgtccctcc tgaatgtcta ctacatcgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctgttc cagtccttcc agaaggagct gccctgggca 480 cactgcaacc acagctggaa cacacctcac tgcatggagg acaccatgcg caagaacaag 540 agtgtctgga tcaccatcag ctccaccaac ttcacctccc ctgtcatcga gttctgggag 600 cgcaacgtgc tgagcttgtc ccctggaatc gaccacccag gctctctgaa atgggacctc 660 gctctctgcc ttcttttagt ctggctagtg tgtttcttct gcatctggaa gggcgtcagg 720 tccactggga aggtcgtcta cttcacagcc acttttccat tcgccatgct cctggtgctg 780 ctggtccgag ggctgacgct gccgggcgcg ggcgcaggca tcaagttcta tctgtatcct 840 gacatcaccc gccttgagga cccacaggtg tggattgacg ctgggactca gatattcttc 900 tcttatgcca tctgcctggg ggctatgacc tcgctgggga gctacaacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcaa ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 gatgtggctg agtcaggtcc tggcctggcc ttcattgcct acccaaaagc tgtgacaatg 1140 atgccgctgc ccacattttg gtccattctt ttttttatta tgcttctctt gcttggactg 1200 gatagccagt ttgttgaagt tgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccatcc 1260 ttcctaagga agggttatcg tcgggaaatc ttcatcgcct tcgtgtgtag catcagctac 1320 ctgctggggc tgacgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcagct ctttgactac 1380 tatgcagcta gcggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc 1440 tggatatatg gaggtgataa cctttatgat ggtattgagg acatgattgg ctatcggccc 1500 gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtg atcactccag ttctctgtgt tggatgtttc 1560 atcttctcgc tcgtcaagta cgtacccctg acctacaaca aaacatacgt gtaccccaac 1620 tgggccattg ggctgggctg gagcctggcc ctttcctcca tgctctgcgt tcccttggtc 1680 atcgtcatcc gcctctgcca gactgagggg ccgttccttg tgagagtcaa gtacctgctg 1740 accccaaggg aacccaaccg ctgggctgtg gagcgcgagg gagccacacc ttacaactct 1800 cgcaccgtca tgaacggcgc tctcgtgaaa ccgacccaca tcattgtgga gaccatgatg 1860 tga 1863 <210> 68 <211> 620 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 1 5 10 15 Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60 Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 Leu Glu Ile Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys 100 105 110 Trp Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Val 115 120 125 Val Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp 130 135 140 Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gln Ser Phe Gln Lys Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160 His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Met 165 170 175 Arg Lys Asn Lys Ser Val Trp Ile Thr Ile Ser Ser Thr Asn Phe Thr 180 185 190 Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205 Gly Ile Asp His Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240 Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Ala 260 265 270 Gly Ile Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Thr Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285 Gln Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala Ile 290 295 300 Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335 Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala Ile Phe Ser Ile Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350 Gln Glu Gln Gly Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365 Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380 Thr Phe Trp Ser Ile Leu Phe Phe Ile Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Asp Ser Gln Phe Val Glu Val Glu Gly Gln Ile Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415 Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu Ile Phe Ile 420 425 430 Ala Phe Val Cys Ser Ile Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Thr Met Val Thr 435 440 445 Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gln Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460 Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val Ile Ala 465 470 475 480 Trp Ile Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Asp Met Ile 485 490 495 Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val Ile Thr 500 505 510 Pro Val Leu Cys Val Gly Cys Phe Ile Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525 Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Thr Tyr Val Tyr Pro Asn Trp Ala Ile Gly 530 535 540 Leu Gly Trp Ser Leu Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys Val Pro Leu Val 545 550 555 560 Ile Val Ile Arg Leu Cys Gln Thr Glu Gly Pro Phe Leu Val Arg Val 565 570 575 Lys Tyr Leu Leu Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590 Glu Gly Ala Thr Pro Tyr Asn Ser Arg Thr Val Met Asn Gly Ala Leu 595 600 605 Val Lys Pro Thr His Ile Ile Val Glu Thr Met Met 610 615 620

Claims (12)

  1. 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 및 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포를 배양시켜, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포가 추가로 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포인 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    원하는 폴리펩티드가 항체인 제조 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 가 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 하나인 제조 방법.
    (a) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
    (b) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열에서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및 삽입으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 변이된 아미노산 배열을 갖고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
    (c) 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60 의 아미노산 배열과 97 % 이상의 동일성을 갖고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
    (d) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA
    (e) 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 의 염기 배열을 갖는 DNA 에 상보적인 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 알라닌아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA
  8. 삭제
  9. 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    추가로 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포.
  11. 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 와 타우린 트랜스포터를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포.
  12. 알라닌아미노트랜스페라아제를 코드하는 DNA 및 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터에 의해 형질 전환된 세포를,
    Figure 112015060367721-pct00019
    -케토글루탈산을 함유하는 배지에서 배양시켜, 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
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