BRPI0815036B1 - Métodos para produção de um polipeptídeo e para preparação de um produto farmacêutico - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HETEROGÊNEAS. A presente invenção refere-se a um método capaz de produzir uma proteína natural ou recombinante em alto rendimento. A presente invenção se refere a um método de produção de um polipeptídeo compreendendo cultura de uma célula a qual expressa fortemente aminotransferase de alanina e tem um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permite que a célula produza o polipeptídeo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método de produção de uma proteína heterogênea, mais especificamente um método de produção de um polipeptídeo usando uma célula a qual expressa fortemente aminotransferase de alanina.

TÉCNICA ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Quando proteínas úteis como produtos farmacêuticos são produzidas com a técnica de DNA recombinante, o uso de células animais permite modificação pós-translacional complicada e duplicação, as quais células procariotas não podem realizar. Portanto, células animais são frequentemente usadas como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes.

[003] Recentemente, um grande número de produtos biofarmacêuticos, tais como anticorpos e proteínas fisiologicamente ativas, foi desenvolvido. Técnicas que permitem a produção eficiente de proteínas recombinantes por células animais levam à redução dos custos dos produtos biofarmacêuticos e prometem seu fornecimento estável aos pacientes.

[004] Sob essas circunstâncias, um método de produção de proteína com maior eficiência de produção é desejado.

[005] A alanina é um dos aminoácidos proteinogênicos e é um aminoácido não-essencial. Em um corpo vivo, ela é biossintetizada através de transferência de um grupo amino de glutamato para piruvato e é degradada através de uma reação inversa.

[006] Como uma enzima de degradação de alanina, aminotransferase de alanina (EC 2.6.1.2.) (Documento de Não-Patente 1) é conhecida. Essa e nzima transfere um grupo amino da alanina para 2-oxoglutamato a fim de sintetizar glutamato. A aminotransferase de alanina é também denominada transaminase glutâmica-pirúvica, a qual é abreviada como GPT (Documento de Não-Patente 2). GPT e GOP (aminotransferase de aspartato) são enzimas encontradas no fígado. Uma vez que GPT e GOP são liberadas no sangue quando células hepáticas são destruídas, o fígado é diagnosticado como tendo algum tipo de distúrbio quando níveis anormalmente altos de GPT e GOT são observados.

[007] Conforme mostrado acima, aminotransferase de alanina é usada como um marcador de função hepática. Contudo, não se sabe como células hospedeiras, tais como células CHO, se comportam se aminotransferase de alanina é fortemente expressa nas mesmas. Documento de Não-Patente 1 Sanjay B. J. e outros, Hepatology (2004) 39(5), 1297-1302 Documento de Não-Patente 2 Melanie M. S. e outros, Genomics (1997) 40, 247-252

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA PARA SOLUÇÃO PELA INVENÇÃO

[008] É um objetivo da presente invenção proporcionar um método o qual é capaz de produzir uma proteína natural ou recombinante em alto rendimento.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

[009] Como um resultado de pesquisas extensivas e intensivas para a solução do problema acima, os presentes inventores descobriram que é possível aumentar o rendimento de um polipeptídeo desejado usando uma célula que expressa fortemente aminotransferase de alanina (aqui depois algumas vezes referida como "ALT"). Assim, a presente invenção foi obtida. Além disso, o polipeptídeo desejado poderia ser produzido em uma quantidade ainda maior usando células capazes de coexpressar ALT e um transportador de taurina. Uma vez que a alanina é produzida em grande quantidade com o tempo em cultura de células, a alanina acumulada em células é secretada no meio. Se a reação de biossíntese de piruvato e glutamato a partir de alanina pode ser promovida através de forte expressão de ALT, os produtos são utilizados no metabolismo durante um ciclo de TCA e produção de glicose através de glicogênese. Isso aprimorará o comportamento de cultura de célula e, assim, produção em alto rendimento do polipeptídeo desejado é prevista.

[0010] A presente invenção pode ser sumarizada como segue. (1) Um método de produção de um polipeptídeo compreendendo cultura de uma célula a qual expressa fortemente aminotransferase de alanina e tem um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permitindo que a célula produza o referido polipeptídeo. (2) O método de (1) acima, em que a célula a qual expressa fortemente aminotransferase de alanina é uma célula na qual um DNA que codifica a aminotransferase de alanina foi transferido. (3) O método de produção de (1) ou (2) acima, em que as células que expressam fortemente aminotransferase de alanina ainda expressam um transportador de taurina fortemente. (4) O método de produção de (3) acima, em que as células que expressam fortemente um transportador de taurina são células nas quais DNA que codifica um transportador de taurina foi transferido. (5) O método de (2) ou (4) acima, em que a célula é células de ovário de hamster Chinês. (6) O método de qualquer um de (1) a (5) acima, em que o polipeptídeo desejado é um anticorpo. (7) O método de qualquer um de (2) a (6) acima, em que o DNA que codifica aminotransferase de alanina é qualquer um de (a) a (e) a seguir: (a) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60; (b) um DNA que codifica um polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina; (c) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo 70% ou mais de homologia de sequência com a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina; (d) um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59; (e) um DNA o qual se hibridiza a um DNA complementar a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59 sob condições estringentes e ainda codifica um polipeptídeo tendo atividade de aminotransferase de alanina. (8) Um método de preparo de um produto farmacêutico contendo um polipeptídeo preparado através do método de qualquer um de (1) a (7) acima. (9) Uma célula a qual tem um DNA transferido que codifica aminotransferase de alanina e um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado. (10) A célula de acordo com (9) acima a qual ainda tem um DNA transferido que codifica um transportador de taurina. (11) Uma célula a qual tem um DNA transferido que codifica aminotransferase de alanina e um DNA transferido que codifica um transportador de taurina. (12)Um método de produção de um polipeptídeo compreendendo cultura, em um meio contendo a-cetoglutarato, de uma célula a qual expressa fortemente aminotransferase de alanina e tem um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permite que a célula produza o referido polipeptídeo.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0011] De acordo com a presente invenção, se tornou possível aumentar o rendimento de um polipeptídeo desejado.

[0012] A presente especificação abrange os conteúdos descritos na especificação e/ou nos desenhos do Pedido de Patente Japonesa N° 2007-205158, baseado no qual o presente pedido de patente reivindica prioridade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] A figura 1 mostra um plasmídeo para seleção com Puromicina, o qual foi usado para expressão de ALT1 humana (496 aminoácidos).

[0014] A figura 2 mostra um plasmídeo para seleção por Higromicina, o qual foi usado para expressão de ALT1 humana (496 aminoácidos).

[0015] A figura 3 mostra plotagens de rendimento do anticorpo antiglipican-3 no dia 17 de uma cultura alimentada em batelada em frasco de agitação de 50 ml. O recipiente de anticorpo em células pPur-ALT1-transferidas (n = 4) foi superior àquele em células pPur- transferidas (n = 3) (P < 0,01).

[0016] A figura 4 é um gráfico mostrando os rendimentos de anticorpo de A72, o qual é uma cepa expressando ALT1 e P41 como uma cepa de controle, em cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. O rendimento do anticorpo antiglipican-3 A72 foi de 2,9 g/L no dia 19 da cultura, o qual era maior do que aquele do P41.

[0017] A figura 5 é um gráfico mostrando as proporções de sobrevivência de A72, o qual é uma cepa expressando ALT1, e P41 como uma cepa de controle. A proporção de sobrevivência de A72 no último estágio da cultura era maior do que aquela de P41.

[0018] A figura 6 mostra plotagens de rendimento do anticorpo antiglipican-3 no dia 4 de cultura alimentada em batelada em frasco de agitação de 50 ml. O rendimento de anticorpo em células pHyg- TauT/pPur-ALT1-cotransferidas (n = 6) foi superior àquele de células pHyg-TauT/pPur-cotransferidas (n = 8) (P < 0,01).

[0019] A figura 7 é um gráfico mostrando o rendimento de anticorpo de TA41, o qual é uma cepa coexpressando TauT/ALT1, em cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. O rendimento do anticorpo antiglipican-3 foi de 5,3 g/L no dia 21 de cultura.

[0020] A figura 8 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene transportador de taurina em células CHO derivada de hamster recentemente clonado e a sequência de aminoácido deduzida do mesmo.

[0021] A figura 9 é uma topologia de membrana do transportador de taurina de um TauT derivado de células CHO recentemente clonado.

[0022] A figura 10 mostra um plasmídeo o qual foi usado para expressão de TauT de hamster (622 aminoácidos).

[0023] A figura 11 mostra plotagens de densidade de células viáveis no dia 7 de cultura em batelada em frasco de agitação de 50 ml. A densidade de células viáveis em células pHyg/TauT-transferidas foi superior àquela em células pHyg-transferidas.

[0024] A figura 12 mostra plotagens de rendimento de lactato no dia 7 de cultura em batelada em frasco de agitação de 50 ml. Células pHyg/TauT-transferidas produzem menos lactato e são superiores a células pHyg-transferidas.

[0025] A figura 13 mostra plotagens de rendimento de anticorpo antiglipican-3 no dia 7 de cultura em batelada em frasco de agitação de 50 ml. Quatro das 7 cepas de células pHyg/TauT-transferidas mostraram rendimentos de anticorpo maiores do que o maior rendimento em células pHyg-transferidas.

[0026] A figura 14 mostra plotagens do rendimento de anticorpo antiglipican-3 no dia 7 de cultura alimentada em batelada em frasco de agitação de 50 ml. O rendimento de anticorpo em células pHyg/TauT- transferidas foi superior àquele de células pHyg-transferidas.

[0027] A figura 15 é um gráfico mostrando a proporção de sobrevivência de uma célula pHyg/TauT-transferida T10 (a qual mostrou alta capacidade de crescimento) em cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. A proporção de sobrevivência de T10 foi de 80% ou mais, mesmo no dia 32 de cultura.

[0028] A figura 16 é um gráfico mostrando o rendimento de anticorpo de uma célula pHyg/TauT-transferida T10 (a qual mostrou alta capacidade de crescimento durante o processo de expansão em cultura estática) em cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. O rendimento de anticorpo antiglipican-3 de T10 foi de 2,9 g/L no dia 35 de cultura.

[0029] A figura 17 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo indicando que a célula TauT-transferida T10 expressa moléculas TauT sobre sua membrana celular.

[0030] A figura 18 é um gráfico mostrando os teores de amônia intracelular (proporções de concentração) em cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. A inibição de amônia em cepas pHyg/TauT- transferidas era acentuada comparado com a cepa precursora.

[0031] A figura 19 é um gráfico mostrando que taurina é captada em células, dependendo da concentração de taurina no meio. Nenhuma diferença foi observada na captação de taurina entre cepas pHyg/TauT-transferidas e a cepa precursora.

[0032] A figura 20 é um gráfico mostrando o consumo de glutamina no meio. Comparado com a cepa precursora, cepas pHyg/TauT-transferidas mostram um consumo de glutamina/célula acentuadamente alto, dependendo da concentração de taurina no meio.

[0033] A figura 21 é um gráfico mostrando que os rendimentos de anticorpo antiglipican-3 de cepas pHyg/TauT-transferidas são quase iguais, sem depender da concentração inicial de taurina no meio.

[0034] A figura 22 é um gráfico mostrando o rendimento de anticorpo antiglipican-3 de TA41, uma cepa coexpressando TauT/ALT, no dia 14 de cultura alimentada em batelada em um agitador. O rendimento de anticorpo foi aumentado através da adição de a- cetoglutarato.

MELHOR MODO PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0035] Aqui abaixo, modalidades da presente invenção serão descritas em maiores detalhes.

[0036] A presente invenção proporciona um método de produção de um polipeptídeo compreendendo cultura de uma célula a qual expressa fortemente ALT e tem um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permite que a célula produza o polipeptídeo.

[0037] No método da presente invenção, a célula pode ser uma célula natural capaz de produzir o polipeptídeo desejado ou uma célula transformada na qual DNA que codifica o polipeptídeo tenha sido transferido. De preferência, uma célula transformada na qual um DNA que codifica o polipeptídeo desejado tenha sido transferido é usada.

[0038] No método da presente invenção, o polipeptídeo desejado não está particularmente limitado. O polipeptídeo pode ser qualquer polipeptídeo, tal como um anticorpo (por exemplo, anticorpo antirreceptor de IL-6, anticorpo anti-IL-6, anticorpo antiglipican-3, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-GPIIb/IIIa, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti-RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-IgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF, anticorpo anti-VLA4 e similares) ou uma proteína fisiologicamente ativa (por exemplo, fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GM-CSF), eritropoietina, interferon, interleucina, tal como IL-1 ou IL-6, t-PA, uroquínase, albumina de soro, fator de coagulação sanguínea, PTH e similares). Um anticorpo é particularmente preferido e pode ser qualquer anticorpo, tal como um anticorpo natural, um anticorpo de baixo peso molecular (por exemplo, Fab, scFv, sc(Fv)2), um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, etc.

[0039] Usando células que expressam fortemente ALT, a quantidade de um polipeptídeo produzido pelas células pode ser aumentada.

[0040] ALT é fundamentalmente conhecida como uma enzima que produz glutamato através de transferência de um grupo amino de alanina para 2-oxoglutarato. Os presentes inventores consideram que, se a reação de biossíntese de piruvato e glutamato a partir de alanina puder ser promovida através de forte expressão de ALT em células hospedeiras, tais como células CHO, os produtos poderiam ser utilizados no metabolismo durante um ciclo de TCA e na produção de glicose através de glicogênese e isso poderia aprimorar o comportamento da cultura de célula, levando à produção em alto rendimento do polipeptídeo desejado.

[0041] As células expressando fortemente ALT não são particularmente limitadas, na medida em que elas são capazes de expressão de ALT em maiores níveis do que células naturais. Células naturais incluem, mas não estão particularmente limitadas a, células que são usadas como hospedeiros na produção de proteínas recombinantes e podem ser exemplificadas por células CHO.

[0042] Uma célula a qual expressa fortemente ALT não está particularmente limitada, na medida em que a célula tenha um nível de expressão aumentado de ALT comparado com uma célula natural correspondente. A célula natural não está particularmente limitada. Uma célula a qual é usada como um hospedeiro na produção de uma proteína recombinante (por exemplo, células CHO) pode ser usada.

[0043] Como uma célula a qual expressa fortemente ALT, uma célula na qual um gene de ALT tenha sido artificialmente transferido pode ser fornecida. Uma célula na qual um gene de ALT tenha sido artificialmente transferido pode ser preparada através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, tal célula pode ser preparada através de incorporação de um gene de ALT em um vetor e transformação do vetor em uma célula. Além disso, o conceito de "células nas quais um gene de ALT tenha sido artificialmente transferido" abrange aqui células nas quais um gene de ALT endógeno tenha sido ativado através da tecnologia de ativação gênica (vide, por exemplo, Publicação Internacional WO94/12650), de modo que ALT seja fortemente expressa.

[0044] Como ALT a ser fortemente expressa em uma célula, ALT derivada de qualquer organismo pode ser usada. Especificamente, ALTs derivadas de ser humano, camundongo, rato, cão, rã Africana, mosca da fruta, nematoide, arroz Japonês, Cyanidioschyzon merolae, Saccharomyces cerevisiae, Ashbya gossypii, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Cryptococcus neoformans, Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, Leishmania major, Entamoeba histolytica e Trypanosoma cruzi são conhecidas e podem ser usadas. De preferência, ALT derivada de ser humano, um roedor ou da mesma espécie que a célula hospedeira pode ser usado. Por exemplo, quando a célula deixada expressar fortemente ALT são células de ovário de hamster Chinês (células CHO), ATL é, de preferência, derivada de um ser humano ou hamster. Para ALT em seres humanos, camundongos e levedo, existem variantes (ALT1 e ALT2). ALT2 tem 80% ou mais de homologia com a ALT1 a nível de aminoácido. ALT1 foi forçadamente expressa nos exemplos descritos depois.

[0045] Ainda, como um gene de ALT a ser fortemente expresso em uma célula, qualquer um dos DNAs (a) a (e) a seguir que codifica ALT pode ser usado: (a) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60; (b) um DNA que codifica um polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina; (c) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo 70% ou mais de homologia de sequência com a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina; (d) um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59; (e) um DNA o qual se hibridiza a um DNA complementar a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59 sob condições estringentes e ainda codifica um polipeptídeo tendo atividade de aminotransferase de alanina.

[0046] A célula a qual expressa fortemente ALT pode ser qualquer célula, por exemplo, célula eucariota, tal como células de animal, planta e levedo, célula procariota, tal como E. coli e B. Subtilis, etc.. De preferência, células animais, tais como células CHO e COS, são usadas. Células CHO são particularmente preferidas. De forma a preparar um polipeptídeo desejado, células adequadas para transferência de um gene que codifica o polipeptídeo desejado, tais como células CHO-dhfr-, são preferidas.

[0047] De preferência, a célula da presente invenção a qual expressa fortemente ALT ainda expressa um transportador de taurina fortemente de forma a preparar um polipeptídeo desejado. Transferindo um gene que codifica o polipeptídeo desejado para a célula e cultivando a célula resultante em um meio, o polipeptídeo desejado pode ser produzido em uma grande quantidade.

[0048] Quando um polipeptídeo desejado é produzido usando uma célula na qual um gene de ALT foi artificialmente transferido, a ordem da transferência de um gene de ALT e a transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado não são particularmente limitadas. Um gene que codifica um polipeptídeo desejado pode ser transferido após a transferência de um gene de ALT. Alternativamente, um gene de ALT pode ser transferido após a transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado. Também é possível transferir um gene de ALT e um gene que codifica um polipeptídeo desejado simultaneamente.

[0049] Um gene de ALT e um gene que codifica um polipeptídeo desejado podem ser transferidos simultaneamente em um único vetor. Alternativamente, eles podem ser transferidos separadamente usando uma pluralidade de vetores.

[0050] Usando uma célula a qual expressa fortemente ALT e um transportador de taurina, uma concentração de amônia intracelular pode declinar.

[0051] Sabe-se que o transportador de taurina é uma proteína da membrana tendo a função osmorregulatória de captar aminoácidos (tais como taurina e β-alanina) em células.

[0052] Uma célula a qual expressa fortemente um transportador de taurina não está particularmente limitado, na medida em que a célula tenha um nível de expressão aumentado de um transportador de taurina comparado com uma célula natural correspondente. A célula natural não está particularmente limitada. Uma célula a qual é usada como um hospedeiro na produção de uma proteína recombinante (por exemplo, células CHO) pode ser usada.

[0053] Como uma célula a qual expressa fortemente um transportador de taurina, uma célula na qual um gene de transportador de taurina tenha sido artificialmente transferido pode ser fornecida. Uma célula na qual um gene de transportador de taurina tenha sido artificialmente transferido pode ser preparada através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, tal célula pode ser preparada através de incorporação de um gene de transportador de taurina em um vetor e transformação do vetor em uma célula.

[0054] Como um transportador de taurina a ser fortemente expresso em uma célula, um transportador de taurina derivado de qualquer organismo pode ser usado. Especificamente, um transportador de taurina derivado de um ser humano ou um roedor (tal como camundongo, rato ou hamster) pode ser usado. De preferência, um transportador de taurina derivado de um ser humano, um roedor ou da mesma espécie que a célula hospedeira pode ser usado. Por exemplo, quando a célula a qual é deixada expressar fortemente um transportador de taurina são células de ovário de hamster Chinês (células CHO), o transportador de taurina é, de preferência, derivado de ser humano ou hamster.

[0055] Ainda, como um gene de transportador de taurina a ser fortemente expresso em uma célula, qualquer um dos DNAs (a1) a (e1) a seguir, que codifica um transportador de taurina, pode ser usado. (a1) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68; (b1) um DNA que codifica um polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de transportador de taurina; (c1) um DNA que codifica um polipeptídeo tendo 70% ou mais de homologia de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68 e ainda tem atividade de transportador de taurina; (d1) um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67; (e1) um DNA o qual se hibridiza a um DNA complementar a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67 sob condições estringentes e ainda codifica um polipeptídeo tendo atividade de transportador de taurina.

[0056] A produção de um polipeptídeo desejado pode ser realizada transferindo um gene que codifica o polipeptídeo desejado para uma célula a qual expressa fortemente um gene de transportador de taurina e um gene de ALT e cultura da célula resultante em um meio. Além disso, um polipeptídeo desejado pode ser preparado usando uma célula na qual um gene endógeno tenha sido ativo através da tecnologia de ativação gênica (vide, por exemplo, Publicação Internacional WO94/12650), de modo que um polipeptídeo desejado seja produzido.

[0057] Quando um polipeptídeo desejado é produzido usando uma célula na qual um gene de transportador de taurina e um gene de ALT foram artificialmente transferidos, a ordem da transferência de um gene de transportador de taurina, da transferência de um gene de ALT e da transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado não está particularmente limitada. Um gene que codifica um polipeptídeo desejado pode ser transferido após a transferência de um gene de transportador de taurina e um gene de ALT. Alternativamente, um gene de transportador de taurina e um gene de ALT podem ser transferidos após a transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado. Também é possível transferir um gene de transportador de taurina, um gene de ALT e um gene que codifica um polipeptídeo desejado simultaneamente.

[0058] Um gene de transportador de taurina, um gene de ALT e um gene que codifica um polipeptídeo desejado podem ser transferidos simultaneamente em um único vetor. Alternativamente, eles podem ser transferidos separadamente usando uma pluralidade de vetores.

[0059] Para cultura da célula a qual expressa fortemente ALT (e a qual pode expressar fortemente um transportador de taurina), meios usados em cultura (de preferência, cultura de células animais) podem ser usados. Esses meios usualmente contêm aminoácidos, vitaminas, fatores lipídicos, fontes de energia, reguladores osmóticos, fontes de ferro e reguladores de pH. Os conteúdos desses componentes são usualmente como segue: aminoácidos 0,05 a 1500 mg/L, vitaminas 0,001 a 10 mg/L, fatores lipídicos 0 a 200 mg/L, fontes de energia 1 a 20 g/L, reguladores osmóticos 0,1 a 10000 mg/L, fontes de ferro 0,1 a 500 mg/L, reguladores de pH 1 a 10000 mg/L, traços de elementos metálicos 0,00001 a 200 mg/L, tensoativos 0 a 5000 mg/L, cofatores de crescimento 0,05 a 10000 μg/L e nucleosídeos 0,001 a 50 mg/L. Contudo, os conteúdos não estão limitados a essas faixas e podem ser apropriadamente selecionados, dependendo do tipo da célula a ser cultivada, do tipo do polipeptídeo desejado e assim por diante.

[0060] Além desses componentes, traços de elementos metálicos, tensoativos, cofatores de crescimento, nucleosídeos e similares podem ser adicionados.

[0061] Exemplos específicos de tais componentes incluem aminoácidos, tais como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L- aspártico, L-cisteína, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L- valina, de preferência L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L- aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina; vitaminas, tais como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzoico, pantotenato de cálcio, cloridrato de piridoxal, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico, de preferência biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, cloridrato de piridoxal, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico; fatores lipídicos, tais como cloreto de colina, tartarato de colina, ácido linoleico, ácido oleico e colesterol, de preferência cloreto de colina; fontes de energia, tais como glicose, galactose, manose e frutose, de preferência glicose; reguladores osmóticos, tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio e nitrato de potássio, de preferência cloreto de sódio; fontes de ferro, tais como EDTA de ferro, citrato férrico, cloreto ferroso, cloreto férrico, sulfato ferroso, sulfato férrico e nitrato férrico, de preferência cloreto férrico, EDTA de ferro e citrato férrico; e reguladores de pH, tais como hidrogen carbonato de sódio, cloreto de cálcio, dihidrogen fosfato de sódio, HEPES ou MOPS, de preferência hidrogen carbonato de sódio. Meios de cultura contendo qualquer um desses componentes podem ser fornecidos como exemplos.

[0062] Além dos componentes acima, podem ser adicionados traços de elementos metálicos, tais como sulfato de cobre, sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, cloreto de níquel, cloreto de estanho, cloreto de magnésio e subsilicato de sódio, de preferência sulfato de cobre, sulfato de zinco e sulfato de magnésio; tensoativos, tais como Tween 80 e Pluronic F68; cofatores de crescimento, tais como insulina recombinante, IGF-1 recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-α recombinante, cloridrato de etanolamina, selenita de sódio, ácido retinoico e dicloridrato de putrescina, de preferência seletina de sódio, cloridrato de etanolamina, IGF-1 recombinante e dicloridrato de putrescina; e nucleosídeos, tais como desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, adenosina, citidina, guanosina e uridina. Em exemplos preferidos dos meios acima, antibióticos, tais como estreptomicina, penicilina-G potássio e gentamicina e indicadores de pH, tal como Phenol Red, podem estar contidos.

[0063] Ainda, α-cetoglutarato, que serve como um substrato para ALT, pode ser adicionado ao meio. O rendimento do polipeptídeo desejado (por exemplo, um anticorpo) pode ser aumentado através da adição de a-cetoglutarato. Nesse caso, a quantidade de a- cetoglutarato a ser adicionada normalmente está na faixa de 0,01 a 1000 mM, de preferência 0,1 a 100 mM e, mais preferivelmente, 1 a 10 mM.

[0064] O pH do meio varia, dependendo da célula a ser cultivada. Geralmente, um pH de 6,8 a 7,6 é apropriado. Em muitos casos, um pH de 7,0 a 7,4 é apropriado.

[0065] Também é possível usar um meio comercial para cultura de células animais, por exemplo, D-MEM (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco), Mistura de D-MEM/F-12 a 1:1 (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco:Mistura de Nutrientes F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), PF- ACF-CHO (Sigma-Aldrich) ou similar.

[0066] Alternativamente, o meio pode ser um meio isento de soro, tal como CD-CHO (Invitrogen).

[0067] Quando a célula a qual expressa fortemente ALT (e a qual pode expressar fortemente um transportador de taurina) são células CHO, as células CHO podem ser cultivadas através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, células CHO podem ser cultivadas usualmente em uma atmosfera com uma concentração de CO2 na fase gasosa de 0 a 40%, de preferência 2 a 10%, a 30 a 39°C, de preferência cerca de 37°C.

[0068] Além disso, no caso onde o polipeptídeo desejado, tal como um anticorpo, é produzido através de cultura de células, as células se tornam altamente confluentes no último estágio da cultura (aproximadamente 1 x 107 células/ml) e o efeito de produtos residuais, tal como lactato, se torna extremamente alto. Se o polipeptídeo desejado é produzido por células expressando fortemente ALT, uma alta proporção de sobrevivência é mantida, mesmo no último estágio da cultura e um aprimoramento no rendimento do polipeptídeo desejado também pode ser previsto.

[0069] Um período de cultura apropriado para produção de um polipeptídeo desejado usando a célula a qual expressa fortemente ALT é usualmente 1 dia a 3 meses, de preferência 1 dia a 2 meses, mais preferivelmente 1 dia a 1 mês.

[0070] Com relação aos vários dispositivos de cultura para cultura de células animais, um dispositivo de cultura em tanque do tipo fermentador, um dispositivo de cultura com elevação a ar, um dispositivo de cultura do tipo frasco de cultura, um dispositivo de cultura do tipo frasco giratório, um dispositivo de cultura do tipo microtransportador, um dispositivo de cultura do tipo leito fluidizado, um dispositivo de cultura do tipo fibra oca, um dispositivo de cultura do tipo garrafa rolante, um dispositivo de cultura do tipo leito acondicionado ou similar pode ser usado.

[0071] A cultura pode ser realizada através de qualquer método de cultura, tal como cultura em batelada, cultura alimentada em batelada ou cultura contínua. De preferência, cultura alimentada em batelada ou cultura contínua é usada. Cultura alimentada em batelada é mais preferida.

[0072] Quando a célula a qual expressa fortemente ALT (e a qual pode expressar fortemente um transportador de taurina) é cultivada, taurina pode ser adicionada ao meio de forma a promover a captação de taurina nas células. A concentração de taurina a ser adicionada ao meio não está especificamente limitada, mas normalmente está na faixa de 0 g/L a 100 g/L, de preferência 0 g/L a 20 g/L e, mais preferivelmente, 0 g/L a 10 g/L.

[0073] Quando o polipeptídeo produzido de acordo com o método da presente invenção tem uma atividade biológica útil como um produto farmacêutico, é possível produzir um produto farmacêutico através de mistura desse polipeptídeo com veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis e formulação em um preparado.

[0074] Exemplos específicos de veículos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solventes orgânicos que são farmaceuticamente aceitáveis, colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polímero de carboxivinila, carboximetil celulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextrano solúvel em água, carboximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma Arábica, caseína, ágar-ágar, polietileno glicol, diglicerina, glicerina, propileno glicol, petrolato, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose e tensoativos que são aceitáveis como aditivos farmacêuticos.

[0075] Aditivos reais podem ser selecionados a partir dos aditivos mencionados acima unicamente ou em combinação de acordo com a forma de dosagem do produto terapêutico da presente invenção, mas não estão limitados àqueles listados acima. Por exemplo, quando um polipeptídeo é usado em uma formulação injetável, o polipeptídeo purificado pode ser dissolvido em um solvente, tal como solução salina fisiológica, tampão ou uma solução de glicose e, então, um inibidor de adsorção, tal como Tween 80, Tween 20, gelatina ou albumina de soro humano, pode ser adicionado à solução. Alternativamente, um agente liofilizado pode ser usado para preparar uma forma de dosagem a qual é dissolvida e reconstituída antes de uso. Exemplos do excipiente útil para liofilização incluem álcoois de açúcar e sacarídeos, tais como manitol e glicose.

[0076] Doses eficazes do polipeptídeo podem ser apropriadamente selecionadas, dependendo do tipo do polipeptídeo, do tipo da doença a ser tratada ou prevenida, da idade do paciente, da gravidade da doença, etc.. Por exemplo, quando o polipeptídeo é um anticorpo antiglipican, a dose eficaz de anticorpo antiglipican é selecionada de uma faixa de 0,001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administração. Alternativamente, uma dose de 0,01 a 100000 mg/corpo pode ser selecionada por paciente. Contudo, a dose eficaz não está limitada a essas faixas.

[0077] O polipeptídeo pode ser administrado oral ou parenteralmente, mas administração parental é preferida. Especificamente, injeção (por exemplo, administração sistêmica ou local através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, etc.), administração transnasal, administração transpulmonar, administração transdérmica e similares podem ser enumeradas.

[0078] Na presente invenção, como um gene que codifica ALT, um DNA que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 or 60 pode ser usado. Alternativamente, um DNA que codifica um polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina pode ser usado.

[0079] O polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de aminotransferase de alanina é funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano, camundongo, rato, cão, rã Africana, mosca da fruta, nematoide, arroz Japonês, Cyanidioschyzon merolae, Saccharomyces cerevisiae, Ashbya gossypii, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Cryptococcus neoformans, Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, Leishmania major, Entamoeba histolytica ou Trypanosoma cruzi (aqui depois algumas vezes referida como "ALT derivada de um ser humano ou similar"). Tal polipeptídeo abrange, por exemplo, mutantes de ALT derivada de ser humano ou similar. No exemplo descrito abaixo, um mutante no qual quatro de 496 aminoácidos foram substituídos (R53S, Q72R, F286S e M332K) foi usado.

[0080] Como métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica para preparo de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico, métodos de introdução de mutações em polipeptídeos podem ser fornecidos. Por exemplo, aqueles versados na técnica poderiam preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar através de introdução apropriada de mutações em aminoácidos de ALT derivada de ser humano ou similar por meio de mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763- 2766). Mutações em aminoácidos podem também ocorrer naturalmente.

[0081] Exemplos específicos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido (por exemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 ou 60) da ALT derivada de ser humano ou similar através de deleção de um ou mais aminoácidos, de preferência 1 a 30 aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 10 aminoácidos; um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido da ALT derivada de ser humano ou similar através da adição de um ou mais aminoácidos, de preferência 1 a 30 aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 10 aminoácidos; e um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido da ALT derivada de ser humano ou similar através de substituição de um ou mais aminoácidos, de preferência 1 a 30 aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 10 aminoácidos, por outros aminoácidos.

[0082] Resíduos de aminoácido a sofrer mutação não estão particularmente limitados. De preferência, resíduos de aminoácido sofrem mutação para outros aminoácidos nos quais a natureza da cadeia lateral de aminoácido inicial é conservada. Exemplos específicos da natureza da cadeia lateral de aminoácido incluem aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S e T), aminoácidos com uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I e P), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo átomo de enxofre (C e M), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo amida e ácido carboxílico (D, N, E e Q), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo base (R, K e H) e aminoácidos com uma cadeia lateral contendo aromático (H, F, Y e W) (entre parênteses, estão os códigos de uma letra para aminoácidos).

[0083] Foi reportado que um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada de uma sequência de aminoácido original através de modificação (tal como deleção, adição e/ou substituição de um ou mais aminoácidos) mantém a atividade biológica do polipeptídeo original (Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. e outros, Science 224, 1431-1433; Dalbadie- McFarland, G. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 64096413).

[0084] Como um exemplo do polipeptídeo no qual um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à ALT derivada de ser humano ou similar, um polipeptídeo de fusão compreendendo a ALT derivada de ser humano ou similar pode ser fornecido. Tal polipeptídeo de fusão é composto da ALT derivada de ser humano ou similar e outro polipeptídeo fundido à mesma. Tal polipeptídeo de fusão pode ser preparado através de ligação de um gene que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar em estrutura com um gene que codifica o outro polipeptídeo, transferência do DNA resultante para um vetor de expressão e expressão do DNA em uma célula hospedeira. Métodos conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados. Não há limitação no polipeptídeo a ser fundido à ALT derivada de ser humano ou similar.

[0085] Exemplos de polipeptídeos a serem fundidos à ALT derivada de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, FLAG (Hopp, T. P. e outros, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis compreendendo seis resíduos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento do antígeno SV40T, tag lck, fragmento de a-tubulina, B-tag, fragmento de proteína C, glutationa-S-transferase (GST), hemaglutinina de influenza (HA), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e proteína de ligação à maltose (MBP).

[0086] Um gene comercialmente disponível que codifica tal polipeptídeo é fundido ao gene que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O gene fundido assim preparado é expresso para preparar um polipeptídeo fundido.

[0087] Um método alternativo conhecido por aqueles versados na técnica para preparo de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico é um método usando a técnica de hibridização (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2a ed., 9.479.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Aqueles versados na técnica poderiam isolar rotineiramente um DNA altamente homólogo à sequência de DNA (por exemplo, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59) da ALT derivada de ser humano ou similar baseado nessa sequência de DNA ou uma parte da mesma e isolar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar desse DNA.

[0088] Condições de hibridização para isolamento de um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano ou similar podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, condições de hibridização de baixa estringência podem ser fornecidas. Condições de hibridização de baixa estringência são, por exemplo, 42°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%, de preferência 50°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Mais preferivelmente, condições de alta estringência podem ser fornecidas. Por exemplo, condições de alta estringência são 65°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Sob essas condições, à medida que a temperatura de hibridização é diminuída, não apenas DNAs com alta homologia, mas também DNAs com apenas baixa homologia são obtidos. Inversamente, espera-se que apenas aqueles DNAs com alta homologia sejam obtidos à medida que a temperatura de hibridização é elevada. Contudo, não apenas a temperatura, mas também uma pluralidade de fatores (tais como concentrações de sal) afetam a estringência de hibridização. Aqueles versados na técnica poderiam selecionar apropriadamente esses fatores para obter estringência similar.

[0089] O polipeptídeo codificado por um DNA isolado através dessas técnicas de hibridização pode ter 70% ou mais de homologia e usualmente tem alta homologia com a ALT derivada de ser humano ou similar na sequência de aminoácido. O termo "alta homologia" refere- se usualmente a 97% ou mais de homologia, de preferência 98% ou mais de homologia, mais preferivelmente 99% ou mais de homologia. Para determinação da homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito em Wilbur, W. J. e Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 pode ser seguido.

[0090] O polipeptídeo pode variar quanto à sequência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presença ou ausência de cadeias de açúcar, morfologia, etc., dependendo da célula ou hospedeiro que produz o polipeptídeo ou do método de purificação que será descrito depois. Contudo, na medida em que o polipeptídeo resultante tem funções equivalentes às funções da ALT derivada de ser humano ou similar, DNA que codifica o polipeptídeo pode ser usado na presente invenção. Por exemplo, quando o polipeptídeo da presente invenção é expresso em um procariota (por exemplo, Escherichia coli), um resíduo de metionina é adicionado ao Terminal N da sequência de aminoácido inicial do polipeptídeo. Quando o polipeptídeo é expresso em um eucariota (por exemplo, uma célula de mamífero), a sequência sinalizadora de N-terminal é removida. Esses polipeptídeos podem ser usados na presente invenção.

[0091] O polipeptídeo pode ser preparado como um polipeptídeo recombinante ou um polipeptídeo natural através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Um polipeptídeo recombinante pode ser preparado através de incorporação de um DNA que codifica o polipeptídeo em um vetor de expressão apropriado, introdução do vetor em uma célula hospedeira recombinante, coleta do transformante resultante, extração de um polipeptídeo bruto e, então, purificação do polipeptídeo através de cromatografia (tal como cromatografia de troca de ions, fase reversa ou filtração em gel ou cromatografia por afinidade, na qual um anticorpo ao polipeptídeo preparado através do método da presente invenção é fixado em uma coluna) ou uma combinação dessas técnicas cromatograficas.

[0092] Quando o polipeptídeo é expresso em uma célula hospedeira (por exemplo, célula animal ou E. coli) como um polipeptídeo de fusão com polipeptídeo de glutationa-S-transferase ou como um polipeptídeo recombinante com resíduos de histidina adicionados ao mesmo, o polipeptídeo expresso pode ser purificado com uma coluna de glutationa ou uma coluna de níquel.

[0093] Após purificação de um polipeptídeo de fusão, outras regiões que não o polipeptídeo de interesse podem ser cortadas através de trombina ou fator Xa e removidas do polipeptídeo de fusão.

[0094] Quando o polipeptídeo é um polipeptídeo natural, o polipeptídeo pode ser isolado através de métodos de purificação conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um extrato de tecidos ou células expressando o polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano ou similar pode ser aplicado a uma coluna de afinidade à qual um anticorpo à ALT derivada de um ser humano ou similar é ligada. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.

[0095] Na presente invenção, como DNA que codifica ALT, um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59 pode ser usado. Alternativamente, um DNA o qual se hibridiza a um DNA complementar a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59 sob condições estringentes e ainda codifica um polipeptídeo tendo atividade de aminotransferase de alanina, pode ser usado.

[0096] O DNA que codifica ALT pode ser usado na produção in vitro ou in vivo de um polipeptídeo desejado, conforme descrito acima. Ainda, o DNA que codifica ALT pode ser usado na criação de uma célula a qual expressa fortemente ALT. O DNA que codifica ALT pode tomar qualquer forma, na medida em que ele seja capaz de codificar ALT. Isto é, o DNA pode ser, por exemplo, um cDNA sintetizado a partir de mRNA, um DNA genômico ou um DNA quimicamente sintetizado. Deverá ser notado que, na medida em que o DNA seja capaz de codificar ALT, o DNA pode ter qualquer sequência de nucleotídeo baseado na degenerância dos códigos genéticos.

[0097] O DNA que codifica ALT pode ser preparado através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o DNA pode ser preparado através de preparo de uma biblioteca de cDNA de uma célula expressando ALT e realizando hibridização usando uma parte da sequência de DNA de ALT (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59) como uma sonda. A biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, uma biblioteca de cDNA comercial pode ser usada. Também é possível preparar o DNA que codifica ALT preparando RNA a partir de uma célula expressando ALT, sintetizando moléculas de oligo DNA baseadas na sequência de DNA de ALT (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59) e realizando PCR usando as moléculas de oligo DNA como iniciadores para, desse modo, amplificar um cDNA que codifica ALT.

[0098] Ainda, determinando a sequência de nucleotídeo do cDNA resultante, é possível determinar a região de tradução que codifica ALT e obter a sequência de aminoácido de ALT. Ainda, selecionando uma biblioteca genômica usando o cDNA resultante como uma sonda, é possível isolar um DNA genômico.

[0099] Especificamente, os procedimentos a seguir podem ser usados. Primeiro, mRNA é isolado de células, tecidos ou similar expressando ALT. Para o isolamento de mRNA, o RNA total é preparado através de métodos conhecidos, por exemplo, o método de ultracentrifugação com guanidina (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) ou similar e, então, mRNA é purificado do RNA total usando o mRNA Purification Kit (Pharmacia), etc. Alternativamente, o mRNA pode ser preparado diretamente usando o QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

[00100] A partir do mRNA resultante, cDNA é sintetizado usando uma transcriptase reversa. Alternativamente, cDNA pode ser sintetizado usando um kit, tal como o AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit (SEIKAGAKU CORPORATION). Também é possível sintetizar e amplificar o cDNA de acordo com o método de 5'-RACE (Frohman, M. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) usando 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) e reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores.

[00101] Um fragmento de DNA de interesse é preparado a partir do produto de PCR resultante e ligado em um DNA de vetor para, desse modo, preparar um vetor recombinante. O vetor é introduzido em um hospedeiro (por exemplo, E. coli), seguido por seleção de colônias resultantes para, desse modo, obter um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeo do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido, tal como o método de término de cadeia de didesoxinucleotídeo.

[00102] Ainda, uma sequência de nucleotídeo de maior eficiência de expressão pode ser criada para o DNA que codifica ALT considerando-se a frequência de uso de códon no hospedeiro a ser usado para expressão (Grantham, R. e outros, Nucleic Acids Research (1981) 9, páginas 43-74). Ainda, o DNA que codifica ALT pode ser modificado usando kits comercialmente disponíveis ou métodos conhecidos. Exemplos de tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, digestão com enzimas de restrição, inserção de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de DNA apropriados, adição de ligantes e inserção de um códon inicial (ATG) e/ou um códon terminal (TAA, TGA ou TAG).

[00103] O DNA que codifica ALT também inclui um DNA o qual se hibridiza a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59 sob condições estringentes e codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT.

[00104] Condições estringentes podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica incluindo, por exemplo, condições de baixa estringência. Condições de baixa estringência se referem, por exemplo, a 42°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%, de preferência 50°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Mais preferivelmente, condições de alta estringência podem ser selecionadas. Condições de alta estringência referem-se, por exemplo, a 65°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Sob essas condições, à medida que a temperatura de hibridização é elevada, DNAs com uma maior homologia podem ser obtidos. O DNA descrito acima o qual se hibridiza é, de preferência, um DNA derivado da natureza, por exemplo, cDNA ou DNA cromossômico.

[00105] Esses DNAs isolados através de técnicas de hibridização usualmente têm uma alta identidade de sequência de nucleotídeo com um DNA que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O DNA que codifica ALT também inclui um DNA o qual codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano ou similar e tem alta identidade com um DNA que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O termo "alta identidade" refere-se usualmente a 96% ou mais de homologia, de preferência 98% ou mais de homologia, mais preferivelmente 99% ou mais de identidade. A identidade de sequências de nucleotídeo pode ser determinada através do algoritmo BLAST (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Baseado nesse algoritmo, programas tais como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Quando sequências de nucleotídeo são analisadas através do BLASTN baseado no BLAST, os parâmetros podem ser configurados como pontuação = 100 e extensão de palavra = 12, por exemplo. Procedimentos específicos para esses métodos de análise são conhecidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[00106] O DNA que codifica ALT pode ser inserido em um vetor.

[00107] Quando a célula hospedeira a ser usada é E. coli, é preferível que o vetor tenha uma origem de replicação ("ori"), de modo que o vetor seja grandemente amplificado em E. coli (por exemplo, JM109, DH5α, HB101 e XL1-Blue) e preparado em grande quantidade e também genes para seleção de E. coli transformado (por exemplo, genes de resistência a fármaco que permitem discriminação de transformantes com alguns fármacos, tais como ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol). Exemplos de vetores preferíveis incluem, mas não estão limitados a, vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript and pCR-Script. Além desses vetores, pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc., podem ser enumerados quando o vetor é usado para fins de subclonagem de um cDNA e corte do cDNA subclonado. Quando o vetor é usado para fins de produção do polipeptídeo da presente invenção, um vetor de expressão é especialmente útil. Quando expressão em E. coli é pretendida, o vetor de expressão tem, de preferência, as características acima descritas, de modo que o vetor é amplificado em E. coli e ele também tem, de preferência, um promotor o qual permite expressão eficiente em E. coli, tal como JM109, DH5α, HB101 ou XL1-Blue, por exemplo, o promotor lacZ (Ward e outros, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better e outros, Science (1988) 240, 1041-1043) ou promotor T7. Exemplos específicos de tal vetor incluem, além daqueles listados acima, pGEX-5X-1 (Pharmacia), o sistema QIAexpress (Qiagen), pEGFP ou pET (para seu hospedeiro, BL21 expressando RNA polimerase T7 é preferido).

[00108] O vetor pode compreender sequências sinalizadoras para secreção de polipeptídeo. Quando o polipeptídeo tem de ser produzido no periplasma de E. coli , a sequência sinalizadora pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada como uma sequência sinalizadora para secreção de polipeptídeo. Introdução do vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada, por exemplo, através do método com cloreto de cálcio ou eletroporação.

[00109] Em casos onde uma outra célula hospedeira que não E. coli é usada, vetores úteis para produção de um polipeptídeo desejado incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão derivados de mamífero [por exemplo, pcDNA3 da Invitrogen; pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), página 5322); pEF, pCDM8], vetores de expressão derivados de célula de inseto (por exemplo, o sistema de expressão de baculovírus Bac-to-BAC da GIBCO BRL; pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1, pMH2), vetores de expressão derivados de animais (por exemplo, pHSV, pHSV, pMV, pAdexLcw), vetores de expressão derivados de retrovírus (por exemplo, pZIpneo), vetores de expressão derivados de levedo (por exemplo, Pichia Expression Kit da Invitrogen; pNV11; SP- Q01) e vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608, pKTH50).

[00110] Quando expressão do polipeptídeo em células animais (tais como células CHO, células COS, células NIH3T3, etc.) é pretendida, o vetor tem, de preferência, um promotor necessário para expressão do polipeptídeo nessas células. Exemplos de tal promotor incluem, mas não estão limitados a, promotor SV40 (Mulligan e outros, Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV-LTR, promotor EF1a (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) e promotor CMV. Mais preferivelmente, o vetor também tem genes para seleção de células transformadas (por exemplo, genes de resistência a fármaco que permitem discriminação com fármacos, tais como neomicina ou G418). Exemplos de vetores tendo tais propriedades incluem, mas não estão limitados a, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.

[00111] Ainda, quando expressão estável de um gene de interesse e amplificação intracelular do número de cópias do gene são pretendidas, o seguinte método pode ser usado. Resumidamente, em células CHO carecendo de uma via de síntese de ácido nucleico, um vetor tendo um gene de DHFR que complementa a falta (por exemplo, pCHO1) é introduzido, seguido por amplificação com metotrexato (MTX). Por outro lado, quando expressão de um gene de interesse é pretendida, um método pode ser usado no qual células COS trazendo um gene expressando antígeno SV40T sobre o cromossoma é transformado com um vetor tendo a origem de replicação do SV40 (por exemplo, pcD). Como a origem de replicação, uma origem de replicação derivada de poliomavírus, adenovírus ou papilomavírus bovino (BPV) pode também ser usado. Ainda, o vetor de expressão pode conter marcadores selecionáveis para amplificação do número de cópias do gene em um sistema de célula hospedeira. Exemplos de tais marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, o gene de fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH), o gene de quínase de timidina (TK), o gene de fosforibosil transferase de xantina- guanina de E. coli (Ecogpt) e o gene de redutase de di-hidrofolato (dhfr).

[00112] A célula hospedeira na qual o DNA que codifica ALT (o qual pode ser incorporado em um vetor) é transferida não está particularmente limitada. Por exemplo, E. coli ou várias células animais podem ser usadas. Se DNA que codifica um polipeptídeo desejado é transferido para uma célula hospedeira na qual DNA que codifica ALT foi transferido, essa célula hospedeira pode expressar ALT fortemente, o que leva a uma produção aumentada do polipeptídeo desejado. DNA que codifica um transportador de taurina (o qual pode ser incorporado em um vetor) pode ser ainda transferido para a célula hospedeira na qual DNA que codifica ALT é transferido. Transferindo DNA que codifica um polipeptídeo desejado e DNA que codifica um transportador de taurina para uma célula hospedeira na qual DNA que codifica ALT é transferido, o rendimento do polipeptídeo desejado pode ser aumentado. Para a produção do polipeptídeo, existem sistemas de produção in vitro e in vivo. Exemplos de sistemas de produção in vitro incluem sistemas usando eucariotas e sistemas usando procariotas.

[00113] Na presente invenção, como DNA que codifica um transportador de taurina, um DNA que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68 pode ser usado. Alternativamente, um DNA que codifica um polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de transportador de taurina, pode ser usado.

[00114] O polipeptídeo o qual tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mostrado em SEQ ID NO: 62, 64, 66 ou 68 através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido e ainda tem atividade de transportador de taurina é funcionalmente equivalente a um transportador de taurina de hamster, rato, camundongo ou ser humano (aqui depois algumas vezes referido como "transportador de taurina derivado de hamster ou similar"). Tal polipeptídeo abrange, por exemplo, mutantes do transportador de taurina derivado de hamster ou similar.

[00115] Como métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica para o preparo de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico, métodos de introdução de mutações em polipeptídeos podem ser fornecidos. Por exemplo, aqueles versados na técnica poderiam preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao transportador de taurina de hamster introduzindo mutações apropriadas em aminoácidos do transportador de taurina de hamster através de mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766). Mutações em aminoácidos também podem ocorrer naturalmente.

[00116] Exemplos específicos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar incluem, mas não estão limitados a, um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido do transportador de taurina derivado de hamster ou similar através de deleção de um ou mais aminoácidos, de preferência 2-30 aminoácidos, mais preferivelmente 2-10 aminoácidos; um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido do transportador de taurina derivado de hamster ou similar através da adição de um ou mais aminoácidos, de preferência 2-30 aminoácidos, mais preferivelmente 2-10 aminoácidos; e um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido do transportador de taurina derivado de hamster ou similar através de substituição de um ou mais aminoácidos, de preferência 2-30 aminoácidos, mais preferivelmente 2-10 aminoácidos por outros aminoácidos.

[00117] Resíduos de aminoácido a sofrer mutação não estão particularmente limitados. De preferência, resíduos de aminoácido sofrem mutação para outros aminoácidos nos quais a natureza da cadeia lateral de aminoácido inicial é conservada. Exemplos específicos da natureza da cadeia lateral de aminoácido incluem aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S e T), aminoácidos com uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I e P), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo átomo de enxofre (C e M), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo amida e ácido carboxílico (D, N, E e Q), aminoácidos com uma cadeia lateral contendo base (R, K e H) e aminoácidos com uma cadeia lateral contendo aromático (H, F, Y e W) (entre parênteses, estão os códigos de uma letra para aminoácidos).

[00118] Como um exemplo do polipeptídeo no qual um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar, um polipeptídeo de fusão compreendendo o transportador de taurina derivado de hamster ou similar pode ser fornecido. Tal polipeptídeo de fusão é composto do transportador de taurina derivado de hamster ou similar e outro polipeptídeo fundido ao mesmo. Tal polipeptídeo de fusao é incluido na presente invenção. Tal polipeptídeo de fusão pode ser preparado através de ligação de um gene que codifica o transportador de taurina derivado de hamster ou similar em estrutura com um gene que codifica o outro polipeptídeo, transferência do DNA resultante para um vetor de expressão e expressão do DNA em uma célula hospedeira. Métodos conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados. Não há limitação quando ao polipeptídeo a ser fundido ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar.

[00119] Exemplos de polipeptídeos a serem fundidos ao transportador de taurina derivada de hamster ou similar incluem, mas não estão limitados a, FLAG (Hopp, T. P. e outros, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis compreendendo seis resíduos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, T7-tag, HSV-tag, Etag, fragmento do antígeno SV40T, tag lck, fragmento de α-tubulina, B- tag, fragmento de proteína C, glutationa-S-transferase (GST), hemaglutinina de influenza (HA), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e proteína de ligação maltose (MBP).

[00120] Um gene comercialmente disponível que codifica tal polipeptídeo é fundido ao gene que codifica o transportador de taurina derivado de hamster ou similar. O gene fundido assim preparado é expresso para preparar um polipeptídeo fundido.

[00121] Um método alternativo conhecido por aqueles versados na técnica para preparo de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico é um método usando a técnica de hibridização (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2a ed., 9.479.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Aqueles versados na técnica poderiam isolar rotineiramente um DNA altamente homólogo à sequência de DNA do transportador de taurina derivado de hamster ou similar baseado nessa sequência de DNA ou uma parte da mesma e isolar polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar desse DNA.

[00122] Condições de hibridização para isolamento de um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, condições de hibridização de baixa estringência podem ser fornecidas. Condições de hibridização de baixa estringência são, por exemplo, 42°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%, de preferência 50°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Mais preferivelmente, condições de alta estringência podem ser fornecidas. Por exemplo, condições de alta estringência são 65 °C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Sob essas condições, à medida que a temperatura de hibridização é diminuída, não apenas DNAs com alta homologia, mas também DNAs com apenas baixa homologia são obtidos. Inversamente, espera-se que apenas aqueles DNAs com alta homologia sejam obtidos à medida que a temperatura de hibridização é elevada. Contudo, não apenas a temperatura, mas também uma pluralidade de fatores (tais como concentrações de sal) afetam a estringência de hibridização. Aqueles versados na técnica poderiam selecionar apropriadamente esses fatores para obter estringência similar.

[00123] O polipeptídeo codificado por um DNA isolado através dessas técnicas de hibridização pode ter 70% ou mais de homologia e usualmente tem alta homologia com o transportador de taurina derivado de hamster ou similar na sequência de aminoácido. O polipeptídeo também inclui aqueles polipeptídeos os quais são funcionalmente equivalentes ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar e têm alta homologia com a sequência de aminoácido do transportador de taurina derivado de hamster ou similar. O termo "alta homologia" refere-se usualmente a 97% ou mais de homologia, de preferência 98% ou mais de homologia, mais preferivelmente 99% ou mais de homologia. Para determinação da homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito em Wilbur, W. J. e Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 pode ser seguido.

[00124] O polipeptídeo pode variar quanto à sequência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presença ou ausência de cadeias de açúcar, morfologia, etc., dependendo da célula ou hospedeiro que produz o polipeptídeo ou do método de purificação que será descrito depois. Contudo, na medida em que o polipeptídeo resultante tem funções equivalentes às funções do transportador de taurina derivado de hamster ou similar, DNA que codifica o polipeptídeo pode ser usado na presente invenção. Por exemplo, quando o polipeptídeo é expresso em um procariota (por exemplo, Escherichia coli), um resíduo de metionina é adicionado ao Terminal N da sequência de aminoácido inicial do polipeptídeo. Quando o polipeptídeo é expresso em um eucariota (por exemplo, uma célula de mamífero), a sequência sinalizadora N-terminal é removida. DNAs que codificam tais polipeptídeos podem ser usados na presente invenção.

[00125] O polipeptídeo pode ser preparado como um polipeptídeo recombinante ou um polipeptídeo natural através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Um polipeptídeo recombinante pode ser preparado através de incorporação de um DNA que codifica o polipeptídeo em um vetor de expressão apropriado, introdução do vetor em uma célula hospedeira recombinante, coleta do transformante resultante, extração de um polipeptídeo bruto e, então, purificação do polipeptídeo através de cromatografia (tal como cromatografia de troca de íons, fase reversa ou cromatografia de filtração em gel ou cromatografia por afinidade, na qual um anticorpo ao polipeptídeo preparado é fixado em uma coluna) ou uma combinação dessas técnicas cromatográficas.

[00126] Quando o polipeptídeo é expresso em uma célula hospedeira (por exemplo, célula animal ou E. coli) como um polipeptídeo de fusão com polipeptídeo de glutationa-S-transferase ou como um polipeptídeo recombinante com resíduos de histidina adicionados ao mesmo, o polipeptídeo expresso pode ser purificado com uma coluna de glutationa ou uma coluna de níquel.

[00127] Após purificação de um polipeptídeo de fusão, outras regiões que não o polipeptídeo de interesse podem ser cortadas através de trombina ou fator Xa e removidas do polipeptídeo de fusão.

[00128] Quando o polipeptídeo é um polipeptídeo natural, o polipeptídeo pode ser isolado através de métodos de purificação conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um extrato de tecidos ou células expressando o polipeptídeo pode ser aplicado a uma coluna de afinidade a qual um anticorpo ao transportador de taurina derivado de hamster ou similar é ligado. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.

[00129] Na presente invenção, como DNA que codifica um transportador de taurina, um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67 pode ser usado. Alternativamente, um DNA o qual se hibridiza a um DNA complementar a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67 sob condições estringentes e ainda codifica um polipeptídeo tendo atividade de transportador de taurina pode ser usado.

[00130] O DNA que codifica transportador de taurina pode ser usado na produção in vitro ou in vivo de um polipeptídeo desejado, conforme descrito acima. Ainda, o DNA que codifica transportador de taurina pode ser usado na criação de uma célula a qual expressa fortemente transportador de taurina. O DNA que codifica transportador de taurina pode tomar qualquer forma, na medida em que ele seja capaz de codificar um transportador de taurina. Isto é, o DNA pode ser, por exemplo, um cDNA sintetizado a partir de mRNA, um DNA genômico ou um DNA quimicamente sintetizado. Deverá ser notado que, na medida em que o DNA seja capaz de codificar um transportador de taurina, o DNA pode ter qualquer sequência de nucleotídeo baseado na degenerância dos códigos genéticos.

[00131] O DNA que codifica um transportador de taurina pode ser preparado através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o DNA pode ser preparado através de preparo de uma biblioteca de cDNA de uma célula expressando um transportador de taurina e realizando hibridização usando uma parte da sequência de DNA (por exemplo, SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67) como uma sonda. A biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, uma biblioteca de cDNA comercial pode ser usada. Também é possível preparar o DNA que codifica um transportador de taurina preparando RNA a partir de uma célula expressando um transportador de taurina, sintetizando moléculas de oligo DNA baseadas na sequência de DNA de um transportador de taurina (por exemplo, SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67) e realizando PCR usando as moléculas de oligo DNA como iniciadores para, desse modo, amplificar um cDNA que codifica um transportador de taurina.

[00132] Ainda, determinando a sequência de nucleotídeo do cDNA resultante, é possível determinar a região de tradução que codifica um transportador de taurina e obter a sequência de aminoácido do transportador de taurina. Ainda, selecionando uma biblioteca genômica usando o cDNA resultante como uma sonda, é possível isolar um DNA genômico.

[00133] Especificamente, os procedimentos a seguir podem ser usados. Primeiro, mRNA é isolado de células, tecidos ou similar expressando um transportador de taurina. Para o isolamento de mRNA, o RNA total é preparado através de métodos conhecidos, por exemplo, o método de ultracentrifugação com guanidina (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) ou similar e, então, mRNA é purificado do RNA total usando o mRNA Purification Kit (Pharmacia), etc. Alternativamente, o mRNA pode ser preparado diretamente usando o QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

[00134] A partir do mRNA resultante, cDNA é sintetizado usando uma transcriptase reversa. Alternativamente, cDNA pode ser sintetizado usando um kit, tal como o AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit (SEIKAGAKU CORPORATION). Também é possível sintetizar e amplificar o cDNA de acordo com o método de 5'-RACE (Frohman, M. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) usando 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) e reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores.

[00135] Um fragmento de DNA de interesse é preparado a partir do produto de PCR resultante e ligado em um DNA de vetor para, desse modo, preparar um vetor recombinante. O vetor é introduzido em um hospedeiro (por exemplo, E. coli), seguido por seleção de colônias resultantes para, desse modo, obter um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeo do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido, tal como o método de término de cadeia com cadeia de didesoxinucleotídeo.

[00136] Ainda, uma sequência de nucleotídeo de maior eficiência de expressão pode ser criada para o DNA que codifica um transportador de taurina considerando-se a frequência de uso de códon no hospedeiro a ser usado para expressão (Grantham, R. e outros, Nucleic Acids Research (1981) 9, páginas 43-74). Ainda, o DNA que codifica um transportador de taurina pode ser modificado usando kits comercialmente disponíveis ou métodos conhecidos. Exemplos de tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, digestão com enzimas de restrição, inserção de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de DNA apropriados, adição de ligantes e inserção de um códon inicial (ATG) e/ou um códon terminal (TAA, TGA ou TAG).

[00137] O DNA que codifica um transportador de taurina também inclui um DNA o qual se hibridiza a um DNA tendo a sequência de nucleotídeo conforme mostrado em SEQ ID NO: 61, 63, 65 ou 67 sob condições estringentes e codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente a um transportador de taurina.

[00138] Condições estringentes podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica incluindo, por exemplo, condições de baixa estringência. Condições de baixa estringência referem-se, por exemplo, a 42°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%, de preferência 50°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Mais preferivelmente, condições de alta estringência podem ser selecionadas. Condições de alta estringência referem-se, por exemplo, a 65°C, 2 x SSC e SDS a 0,1%. Sob essas condições, à medida que a temperatura de hibridização é elevada, DNAs com uma maior homologia podem ser obtidos. O DNA descrito acima o qual se hibridiza é, de preferência, um DNA derivado da natureza, por exemplo, cDNA ou DNA cromossômico.

[00139] Esses DNAs isolados através de técnicas de hibridização usualmente têm uma alta identidade de sequência de nucleotídeo com um DNA que codifica um transportador de taurina derivado de hamster, etc. O DNA também inclui um DNA o qual codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente ao transportador de taurina derivado de hamster, etc., e tem alta identidade com um DNA que codifica um transportador de taurina derivado de hamster, etc. O termo "alta identidade" refere-se usualmente a 96% ou mais de homologia, de preferência 98% ou mais de homologia, mais preferivelmente 99% ou mais de identidade. A identidade de sequências de nucleotídeo pode ser determinada através do algoritmo BLAST (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Baseado nesse algoritmo, programas tais como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Quando sequências de nucleotídeo são analisadas através do BLASTN baseado no BLAST, os parâmetros podem ser configurados como pontuação = 100 e extensão de palavra = 12, por exemplo. Procedimentos específicos para esses métodos de análise são conhecidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[00140] O DNA que codifica um transportador de taurina pode ser inserido em um vetor.

[00141] Quando a célula hospedeira a ser usada é E. coli, é preferível que o vetor tenha uma origem de replicação ("ori"), de modo que o vetor seja grandemente amplificado em E. coli (por exemplo, JM109, DH5α, HB101 e XL1-Blue) e preparado em grande quantidade e também genes para seleção de E. coli transformado (por exemplo, genes de resistência a fármaco que permitem discriminação de transformantes com alguns fármacos, tais como ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol). Exemplos de vetores preferíveis incluem, mas não estão limitados a, vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript and pCR-Script. Além desses vetores, pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc., podem ser enumerados quando o vetor é usado para fins de subclonagem de um cDNA e corte do cDNA subclonado. Quando o vetor é usado para fins de produção do polipeptídeo da presente invenção, um vetor de expressão é especialmente útil. Quando expressão em E. coli é pretendida, o vetor de expressão tem, de preferência, as características acima descritas, de modo que o vetor é amplificado em E. coli e ele também tem, de preferência, um promotor o qual permite expressão eficiente em E. coli, tal como JM109, DH5α, HB101 ou XL1-Blue, por exemplo, o promotor lacZ (Ward e outros, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better e outros, Science (1988) 240, 1041-1043) ou promotor T7. Exemplos específicos de tal vetor incluem, além daqueles listados acima, pGEX-5X-1 (Pharmacia), o sistema QIAexpress (Qiagen), pEGFP ou pET (para seu hospedeiro, BL21 expressando RNA polimerase T7 é preferido).

[00142] O vetor pode compreender sequências sinalizadoras para secreção de polipeptídeo. Quando o polipeptídeo tem de ser produzido no periplasma de E. coli , a sequência sinalizadora pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada como uma sequência sinalizadora para secreção de polipeptídeo. Introdução do vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada, por exemplo, através do método com cloreto de cálcio ou eletroporação.

[00143] Em casos onde uma outra célula hospedeira que não E. coli é usada, vetores úteis para produção de um polipeptídeo desejado incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão derivados de mamífero [por exemplo, pcDNA3 da Invitrogen; pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), página 5322); pEF, pCDM8], vetores de expressão derivados de célula de inseto (por exemplo, o sistema de expressão de baculovírus Bac-to-BAC da GIBCO BRL; pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1, pMH2), vetores de expressão derivados de animais (por exemplo, pHSV, pHSV, pMV, pAdexLcw), vetores de expressão derivados de retrovírus (por exemplo, pZIpneo), vetores de expressão derivados de levedo (por exemplo, Pichia Expression Kit da Invitrogen; pNV11; SP- Q01) e vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608, pKTH50).

[00144] Quando expressão do polipeptídeo em células animais (tais como células CHO, células COS, células NIH3T3, etc.) é pretendida, o vetor tem, de preferência, um promotor necessário para expressão do polipeptídeo nessas células. Exemplos de tal promotor incluem, mas não estão limitados a, promotor SV40 (Mulligan e outros, Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV-LTR, promotor EF1a (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) e promotor CMV. Mais preferivelmente, o vetor também tem genes para seleção de células transformadas (por exemplo, genes de resistência a fármaco que permitem discriminação com fármacos, tais como neomicina ou G418). Exemplos de vetores tendo tais propriedades incluem, mas não estado limitados a, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.

[00145] Ainda, quando expressão estável de um gene de interesse e amplificação intracelular do número de cópias do gene são pretendidas, o seguinte método pode ser usado. Resumidamente, em células CHO carecendo de uma via de síntese de ácido nucleico, um vetor tendo um gene de DHFR que complementa a falta (por exemplo, pCHOI) é introduzido, seguido por amplificação com metotrexato (MTX). Por outro lado, quando expressão de um gene de interesse é pretendida, um método pode ser usado no qual células COS trazendo um gene expressando antígeno SV40T sobre o cromossoma é transformado com um vetor tendo a origem de replicação do SV40 (por exemplo, pcD). Como a origem de replicação, uma origem de replicação derivada de poliomavírus, adenovírus ou papilomavírus bovino (BPV) pode também ser usado. Ainda, o vetor de expressão pode conter marcadores selecionáveis para amplificação do número de cópias do gene em um sistema de célula hospedeira. Exemplos de tais marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, o gene de fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH), o gene de quínase de timidina (TK), o gene de fosforibosil transferase de xantina- guanina de E. coli (Ecogpt) e o gene de redutase de di-hidrofolato (dhfr).

[00146] A presente invenção proporciona uma célula a qual tem um DNA transferido que codifica ALT e um DNA transferido que codifica um transportador de taurina ou ambos ou qualquer um deles pode ser incorporado em um vetor.

[00147] Quando eucariotas sao usados, células animais, células de planta, células fungicas, etc. podem ser usadas como o hospedeiro. Exemplos especificos de células animais incluem células de mamífero, tais como células CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), células COS, células 3T3, células de mieloma, células BHK (rim de hamster bebê), células HeLa e células Vero; células de anfíbio, tais como oócitos de Xenopus laevis (Valle e outros, Nature (1981) 291, 358-340); ou células de inseto, tais como células sf9, sf21 e Tn5. Dentre as células CHO, CHO dhfr- carecendo do gene de DHFR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4420) e CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) são usadas com vantagem particular. Quando alta expressão é pretendida em uma célula animal, células CHO são especialmente preferidas. Introdução do DNA o qual pode ser incorporado em um vetor na célula hospedeira pode ser realizada através de métodos tais como o método com fosfato de cálcio, o método com DEAE dextrana, um método usando um DOTAP de ribossoma catiônico (Boehringer-Mannheim), eletroporação, lipofecção, etc.

[00148] Como células de planta para a produção de polipeptídeo, uma célula derivada de Nicotiana tabacum é conhecida como um sistema de produção de polipeptídeo e esse pode ser submetido à cultura de caule. Como células fúngicas para produção de polipeptídeo, exemplos específicos incluem levedo pertencendo ao gênero Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e fungos filamentosos pertencendo ao gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger.

[00149] Quando procariotas são usados, sistemas de produção usando células bacterianas são conhecidos. Exemplos específicos de tais células bacterianas incluem E. coli (tais como JM109, DH5a, HB101) e Bacillus subtilis.

[00150] O polipeptídeo codificado por um gene de interesse pode ser obtido através de transformação dessas células com o gene de interesse e cultura das células transformadas in vitro. A cultura pode ser realizada através de métodos conhecidos. Por exemplo, como um caldo de cultura para células animais, um meio tal como DMEM, MEM, RPMI1640 ou IMDM pode ser usado. Um suplemento de soro, tal como soro fetal de bezerro (FCS) pode ser usado conjuntamente. Alternativamente, cultura isenta de soro pode ser realizada. O pH durante cultura é, de preferência, cerca de 6 a 8. A cultura é, usualmente, realizada em torno de 30-40°C durante cerca de 15-200 horas. Se necessário, substituição do meio, aeração e agitação são realizadas.

[00151] Por outro lado, sistemas de produção in vivo incluem aqueles usando animais ou plantas. Um gene de interesse é transferido para esses animais ou plantas para produzir o polipeptídeo nos corpos dos animais ou corpos das plantas. Então, o polipeptídeo é coletado. O termo "hospedeiro", conforme usado aqui, inclui tais animais ou plantas.

[00152] Quando animais são usados, os sistemas de produção disponíveis incluem aqueles usando mamíferos ou insetos. Cabra, porco, ovelha, camundongo e gado podem ser usados como mamíferos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Quando mamíferos são usados, animais transgênicos podem ser usados.

[00153] Primeiro, um gene de interesse é fundido a um gene que codifica um polipeptídeo produzido inerentemente em leite (tal como β- caseína de cabra) para, desse modo, preparar um gene de fusão. Um fragmento de DNA contendo esse gene de fusão é injetado em um embrião de cabra, o qual é, então, implantado no útero de uma cabra fêmea. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido a partir de leite produzido por cabras transgênicas nascidas da cabra com o embrião aceito ou prole das cabras transgênicas. De forma a aumentar o rendimento do leite contendo o polipeptídeo produzido pelas cabras transgênicas, hormônios podem ser apropriadamente administrados às cabras transgênicas (Ebert, K. M. e outros, Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

[00154] Exemplos de insetos os quais podem ser usados incluem bicho-da-seda. Nesse caso, bicho-da-seda é infectado com baculovírus trazendo um gene transferido que codifica o polipeptídeo de interesse. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido do fluido corporal do bicho-da-seda (Susumu, M. e outros, Nature (1985) 315, 592-594).

[00155] Além disso, quando plantas são usadas, tabaco pode, tipicamente, ser usado. Quando tabaco é usado, um gene que codifica o polipeptídeo de interesse é inserido em um vetor de expressão de planta (por exemplo, pMON 530) o qual é, então, transferido para uma bactéria, tal como Agrobacterium tumefaciens. Uma planta de tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacum) é infectada com a bactéria resultante. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido de folhas dessa planta (Julian, K.-C. Ma e outros, Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

[00156] O polipeptídeo assim obtido pode ser isolado de dentro da célula hospedeira ou de seu exterior (por exemplo, meio) e purificado até um polipeptídeo substancialmente puro e homogêneo. Isolamento e purificação de polipeptídeos podem ser realizados usando métodos convencionais de isolamento e purificação para polipeptídeos e não estão limitados de qualquer forma. Por exemplo, polipeptídeos podem ser isolados e purificados através de seleção apropriada e combinação de várias ferramentas e técnicas, tais como colunas de cromatografia, filtros, ultracentrifugação, desalinização, precipitação com solvente, extração com solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, focalização isoelétrica, diálise, recristalização, etc.

[00157] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia por afinidade, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia de adsorção, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Essas técnicas cromatográficas podem ser realizadas usando cromatografia de fase líquida, por exemplo, HPLC, FPLC, etc. A presente invenção também inclui aqueles polipeptídeos altamente purificados usando esses métodos de purificação.

[00158] Antes ou após a purificação, também é possível proporcionar modificações opcionais ao polipeptídeo ou remover um peptídeo parcial a partir do mesmo através de reação do polipeptídeo com uma enzima de modificação de polipeptídeo apropriada. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não estão limitadas a, tripsina, quimiotripsina, endopeptidase de lisila, quínase de proteína e glicosidase.

[00159] Na presente invenção, o conceito de "células nas quais DNA tenha sido transferido" abrange não apenas células nas quais DNA exógeno tenha sido incorporado através da tecnologia de recombinação genética; mas também células nas quais DNA endógeno tenha sido ativado através da tecnologia de ativação gênica (vide, por exemplo, Publicação Internacional WO94/12650), de modo que expressão de uma proteína correspondendo ao DNA endógeno ou transcrição do DNA seja iniciada ou aumentada.

EXEMPLOS

[00160] Aqui abaixo, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. Deve ser notado que esses Exemplos são fornecidos apenas para ilustrar a presente invenção e não para limitar o escopo da presente invenção. [EXEMPLO 1] Clonagem do gene de aminotransferase de alanina de células hepáticas humanas

[00161] Usando um Human Liver QUICK-Clone cDNA (Clontech Laboratories, Inc.) comercial como um padrão, o gene de aminotransferase de alanina (ALT1) derivado de um fígado humano foi obtido através de um método de PCR. O gene assim clonado foi sequenciado e confirmado como codificando ALT1 baseado em sua homologia com a ALT1 humana publicada. O gene de ALT1 assim obtido tinha mutações em seis locais na sequência de 1488 bases (c157a, a215g, c765t, t857c, t995a) e codificava 496 aminoácidos, incluindo quatro aminoácidos diferentes (R53S, Q72R, F286S, M332K), mas esse foi usado como um clone de PCR da ALT1 derivada de fígado humano para modulação celular. [EXEMPLO 2] Aumento no rendimento de anticorpo através de transferência de aminotransferase de alanina humana

[00162] Adicionando uma sequência de Kozak à ALT1 humana obtida através de clonagem no Exemplo 1 (a qual é aqui depois denominada ALT1), pPur-ALT1 (figura 1) e pHyg-ALT1 (figura 2), os quais eram plasmídeos de expressão do promotor de CMV, foram construídos. Os plasmídeos de expressão pPur-ALT1 ou pPur que não contêm o gene de ALT1 foram introduzidos em células CHO que produzem anticorpo antiglipican-3 como cepas precursoras (vide Publicação Internacional WO 2006/006693) através de eletroporação e cepas de células que exibiam alta proliferação em cultura estática na presença de Puromicina (6 μg/ml) (pPur-ALT1: sete cepas, pPur: três cepas) foram selecionadas. Após expansão, um RNA total foi preparado a partir das cepas de célula pPur-ALT1 e seis cepas expressando ALT1 humana em altos níveis foram selecionadas através de um método de TaqMan. Ainda, uma comparação foi feita para o rendimento de anticorpo entre células pPur-transferidas como um controle (três cepas) e quatro cepas de células ALT1 humana- transferidas que proliferaram em um nível equivalente àquele observado com as células pPur-transferidas durante a cultura com agitação. Durante cultura alimentada em batelada em um frasco de agitação de 50 ml com uma densidade celular inicial de 2 x 105 célu- las/mL, o rendimento de anticorpo antiglipican-3 de células pPur-ALT1- transferidas (quatro cepas) no dia 17 do último estágio da cultura com agitação era significativamente maior do que aquele de células pPur- transferidas (três cepas) (t-teste: p < 0,01, figura 3). Descobriu-se que A72, uma cepa expressando pPur-ALT1 e P41, uma cepa expressando pPur produziram, cada uma, a maior quantidade de um anticorpo no estudo usando cultura alimentada em batelada com agitação e elas foram submetidas à cultura alimentada em batelada em jarros de 1 L (uma densidade celular inicial de 10 x 105 células/mL). Como um resultado, o rendimento de anticorpo de A72 foi de 2,9 g/L no dia 19 da cultura, o que é maior do que o rendimento de anticorpo de P41 (2,2 g/L) (figura 4). Uma vez que nenhum aumento foi observado no rendimento de anticorpo de P41 no dia 14 ou dias subsequentes após o início da cultura, a produção em alto rendimento de um anticorpo por A72 foi considerada como sendo atribuível ao efeito de manutenção da proporção de sobrevivência (figura 5). Ainda, células pHyg/ALT-transferidas (três cepas), as quais foram selecionadas com fármaco na presença de Higromicina (200 μg/mL) através de um método similar àquele descrito acima, foram submetidas à cultura alimentada em batelada, junto com a cepa precursora, em tubos de 15 ml (uma densidade celular inicial de 1 x 105 células/mL). Como um resultado, o rendimento de anticorpo antiglipican-3 das células pHyg-ALT-transferidas no dia 10 no último estágio da cultura em tubo foi de 471 mg/L, 544 mg/L e 588 mg/L, mostrando que o rendimento de anticorpo de qualquer uma delas era maior do que aquele da cepa precursora (400 mg/L) (dados não- mostrados).

[00163] Então, pPur-ALT1 ou pPur foi cotransferida para T10, a qual era uma célula pHyg-TauT-transferida usada como uma cepa precursora (vide Exemplo de Referência 2 descrito depois). Células coexpressando TauT/ ALT1 que exibiam alta proliferação e expressam ALT1 humana em alto nível (seis cepas) e células coexpressando TauT/pPur que exibiam alta proliferação (oito cepas) foram selecionadas e submetidas à cultura em batelada em frascos de agitação de 50 mL (uma densidade celular inicial de 10 x 105 células/mL). O rendimento de anticorpo antiglipican-3 de células coexpressando TauT/ALT1, as quais eram células que expressavam ALT, no dia 4 da cultura com agitação era significativamente maior do que aquele de células TauT/pPur (t-teste: p < 0,01, figura 6).

[00164] TA41, a qual era uma cepa coexpressando TauT/ALT1 que produziu a maior quantidade de um anticorpo (881 mg/L/4 dias) e expressando mRNA de ALT1 no maior nível no estudo usando a cultura alimentada em batelada com agitação, foi submetida à cultura alimentada em batelada em um jarro de 1 L (uma densidade celular inicial de 10 x 105 células/mL). Os rendimentos de anticorpo foram tão altos quanto 1,3 g/L no dia 7 da cultura, 3,0 g/L no dia 10 da cultura, 3,5 g/L no dia 12 da cultura, 4,6 g/L no dia 17 da cultura e 5,3 g/L no dia 21 da cultura (figura 7), o que era claramente maior do que os valores para TP08 (656 mg/L/4 dias), a qual era uma cepa de controle que produziu a maior quantidade de um anticorpo entre as cepas coexpressando TauT/pPur (2,4 g/L no dia 10 da cultura).

[00165] O rendimento do anticorpo antiglipican-3 de TA41, uma cepa coexpressando TauT/ALT1, no dia 14 da cultura em um frasco de agitação de 50 ml foi aumentado através da adição de a-cetoglutarato o qual, assim como a alanina, serviu como um substrato para ALT (figura 22). O rendimento do anticorpo antiglipican-3 no dia 14 da cultura foi de 1452 mg/L na presença de a-cetoglutarato a 2,5 mM e 1239 mg/L na ausência de α-cetoglutarato.

[00166] Os resultados acima sugerem que células capazes de produção de anticorpo em alto rendimento no último estágio de cultura podem ser obtidas expressando artificialmente ATL1.

[00167] A presente invenção é aplicável à qualquer célula que produz anticorpo. [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1] Clonagem de gene transportador de taurina de hamster derivado de células CHO.

[00168] RNA total foi extraído de células que produzem anticorpo antirreceptor de IL-6 (uma célula de célula CHO DXB11 na qual um gene de anticorpo antirreceptor de IL-6 tinha sido transferido) (Publicação de Patente Japonesa Não-Examinado N° Hei 8-99902) e, então, cDNA foi sintetizado a partir da mesma de uma maneira poli(A) dependente. O gene de transportador de taurina de hamster (TauT) foi obtido através de PCR usando, como um template, o cDNA fragmentado com três enzimas de restrição, SalI, XhoI and EcoRI. Como iniciadores de PCR, aqueles contendo a sequência de extremidade 5' e extremidade 3' conservada entre TauTs de rato e camundongo foram criados. A sequência de nucleotídeo do gene clonado foi determinada. A partir de sua homologia com outros genes de TauT de espécies conhecidas, foi confirmado que o gene clonado codifica TauT (figura 8) de hamster. A sequência de aminoácido de TauT de hamster tem alta homologia com TauT de camundongo (96% de identidade), TauT de rato (6% de identidade) e TauT humana (93% de identidade); é previsto que TauT de hamster é um transportador com 12 regiões transmembrana (figura 9). [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2] Aumento na densidade de células viáveis, inibição da produção de lactato e aumento no rendimento de anticorpo, causados através de transferência do transportador de taurina de hamster.

[00169] O plasmídeo de expressão do promotor de CMV pHyg/TauT (figura 10) foi construído através da adição de uma sequência de Kozak ao gene de TauT hamster (aqui depois, TauT) obtido através de clonagem no Exemplo de Referência 1. O plasmídeo de controle pHyg sem o gene de pHyg/TauT ou TauT foi introduzido através de eletroporação na cepa precursora da célula CHO que produz anticorpo antiglipican-3 (vide WO 2006/006693). Após seleção de células plasmídeo de expressão-transferidas na presença de higromicina (400 μg/ml), todas as cepas de célula de crescimento estável foram expandidas (pHyg/TauT: 8 cepas; pHyg: 7 cepas). mRNA de TauT foi preparado. Subsequentemente, 7 cepas foram confirmadas como expressando TauT mais fortemente do que a cepa precursora através do método TaqMan; elas foram selecionadas como células pHyg/TauT-transferidas. O nível de expressão médio de mRNA dessas células transferidas (7 cepas) era cerca de 40 vezes maior do que o controle (7 cepas). Células das 14 cepas no total foram submetidas à cultura em batelada e cultura alimentada em batelada em frascos de agitação de 50 ml com uma densidade celular inicial de 2 x 105 células/ml. No dia 7 de cultura (último estágio), as densidade de células viáveis, rendimento de lactato e rendimentos de anticorpo antiglipican-3 nessas cepas foram comparados. Em cultura em batelada, substâncias inibitórias de crescimento, tal como lactato, se acumulam no caldo de cultura à medida que as células crescem e seu crescimento é inibido. Contudo, as densidades de células viáveis (figura 11) e rendimentos de lactato (figura 12) em células pHyg/TauT- transferidas foram superiores àqueles em células pHyg-transferidas (t teste; p<0,05). Com relação ao rendimento de anticorpo antiglipican-3, 4 das 7 cepas de células pHyg/TauT-transferidas mostraram rendimentos de anticorpo maior do que o maior rendimento em células pHyg-transferidas (figura 13). Ainda, uma vez que a superioridade de células pHyg/TauT-transferidas quanto ao rendimento de anticorpo antiglipican-3 se tornou mais evidente (t teste; P<0,01; figura 14) em cultura alimentada em batelada, a cepa T10 pHyg/TauT-transferida (a qual mostrou a maior capacidade de crescimento dentre as 4 cepas acima) e a cepa precursora foram submetidas à cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L. Como um resultado, a proporção viável de T10 foi mantida em 80% ou mais, mesmo no dia 32 de cultura (figura 15), com produção de lactato inibida. Consequentemente, seu rendimento de anticorpo antiglipican-3 atingiu 2,9 g/L no dia 35 de cultura (figura 16). Foi confirmado, através de análise citométrica de fluxo, que a célula T10 TauT-transferida expressava moléculas de TauT sobre a membrana celular (figura 17). Esses resultados sugerem que, expressando artificialmente Taut de hamster, é possível elevar o potencial de células que produzem anticorpo e criar cepas capazes de produção intensificada de anticorpo.

[EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3] Inibição da produção de amônia, captação de taurina, aumento no consumo de glutamina e rendimento de anticorpo não-dependente de taurina em cepas TauT de hamster- transferidas.

[00170] A cepa precursora pHyg/TauT-transferida foi alimentada em batelada em um jarro de 1 L em uma densidade celular inicial de 2 x 105 células/ml. Uma parte do caldo de cultura contendo 450 x 105 células foi tomada do jarro em pontos de tempo apropriados. Após o sobrenadante de cultura ser separado através de centrifugação, 1 ml de água estéril gelada contendo um inibidor de protease (Complete Mini; Roche Diagnostics; tabletes de coquetel inibidor de Protease) foi adicionado à pelota de célula. Então, as células foram completamente rompidas sobre gelo em um aparelho de ultrassom (MISONIX ASTRASON MODELO XL2020) com uma configuração de pulso ligado por 5 segundos e pulso desligado por 5 segundos sendo repetido 12 vezes. O volume total das células assim tratadas foi aplicado a uma unidade de filtro de centrifugação para, desse modo, preparar um filtrado com um peso molecular de 5000 ou menos. Esse filtrado foi usado como uma amostra para determinação dos aminoácidos intracelulares. Cada amostra foi submetida à detecção e comparação de absorbância a 570 nm usando um conjunto de reagente de niidrina L-8500 (Wako Pure Chemical Industries) e um modelo aprimorado de analisador de aminoácido Hitachi totalmente automático (L-8500). Assim, várias concentrações de aminoácido nas amostras foram determinadas. Uma vez que as concentrações de aminoácidos e amônia no caldo de cultura eram valores diretamente medidos, comparações de concentração da ordem de μM foram realizadas. Por outro lado, uma vez que concentrações intracelulares foram obtidas após a adição de 1 ml de água estéril gelada à pelota de célula e sujeição da mesma a ultrassom, as concentrações medidas de vários aminoácidos e amônia foram convertidas em valores por célula, seguido por comparação dos valores convertidos. Para determinar as proporções de concentração de amônia mostradas na figura 18, o valor de amônia detectado por 450 x 105 células na cepa precursora no início da cultura alimentada em batelada em jarro de 1 L foi tomada como 1 e comparada com os valores detectados no início da cultura e nos dias 6, 12 e 18 da cultura na cepa transferida. Os valores de taurina na figura 19 e os valores de glutamina na figura 20 também foram determinados através da análise de aminoácido descrita acima.

[00171] Como um resultado, a amônia intracelular na cepa pHyg/TauT-transferida foi mantida em baixa concentração no último estágio de cultura; acredita-se que isso contribui para a alta concentração de anticorpo (figura 18).

[00172] As proporções de concentração de taurina intracelular foram determinadas da mesma maneira conforme descrito acima para as concentrações de amônia (figura 19), exceto que o valor de amônia detectado por 200 x 105 células na cepa precursora no dia 4 de cultura em batelada em agitador de 50 ml foi tomado como 1.

[00173] Como um resultado, descobriu-se que a cepa pHyg/TauT- transferida tinha captado taurina de uma maneira dependente da quantidade de taurina adicionada e que sua captação era quase igual àquela pela cepa precursora. Contudo, conforme mostrado na figura 20, o consumo de glutamina na cepa pHyg/TauT-transferida era acentuadamente alto comparado com a cepa precursora e não era dependente da concentração inicial de taurina. Foi reportado que a glutamina melhora o crescimento celular, proporção de sobrevivência e capacidade de produção de anticorpo em hibridomas para, desse modo, elevando seus rendimentos de anticorpo (Enzyme and Microbial Technology 17: 47-55, 1995). Portanto, o efeito de intensificação de anticorpo da cepa pHyg/TauT-transferida pode ser causado pela captação mediada por transportador de taurina de outros aminoácidos que não-taurina (por exemplo, glutamina). As concentrações de glutamina foram obtidas convertendo os valores determinados através de análise de aminoácido do caldo de cultura no dia 4 de cultura na figura 19 em valores por 1 x 105 células.

[00174] Na verdade, o rendimento do anticorpo antiglipican-3 não era dependente da concentração inicial de taurina (0-500 mM (62,575 g/L)) no início da cultura alimentada em batelada em agitador de 50 ml (figura 21). Nenhuma diferença significativa foi observada nas cepas precursoras no efeito da concentração inicial de taurina sobre o rendimento de anticorpo.

[00175] Os resultados descritos até o momento sugerem que cepas expressando fortemente TauT têm capacidade aumentada de produção de anticorpo, mesmo se o meio não contém taurina no início da cultura e que há uma possibilidade de que tais cepas também promovam a captação de outros aminoácidos que não taurina.

[00176] A presente invenção é aplicável à qualquer célula que produz anticorpo.

[00177] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00178] A presente invenção é aplicável à produção de polipeptídeos. TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA < SEQ ID NO: 1> SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) humana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (humana): 2875). < SEQ ID NO: 2> SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) humana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (humana): 2875). < SEQ ID NO: 3> SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) humana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (humana): 84706). < SEQ ID NO: 4> SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido do mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) humana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (humana): 84706). < SEQ ID NO: 5> SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de camundongo (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (camundongo): 76282). < SEQ ID NO: 6> SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de camundongo (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (camundongo): 76282). < SEQ ID NO: 7> SEQ ID NO: 7 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) de camundongo (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 108682). < SEQ ID NO: 8> SEQ ID NO: 8 mostra a sequência de aminoácido do mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) de camundongo(KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (camundongo): 108682). < SEQ ID NO: 9> SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de rato (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rato): 81670). < SEQ ID NO: 10> SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de rato (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rato): 81670) . < SEQ ID NO: 11> SEQ ID NO: 11 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de cão (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (cão): 609510). < SEQ ID NO: 12> SEQ ID NO: 12 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de cão (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (cão): 609510). < SEQ ID NO: 13> SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de rã Africana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (rã Africana): 444533). < SEQ ID NO: 14> SEQ ID NO: 14 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de rã Africana (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (rã Africana): 444533). < SEQ ID NO: 15> SEQ ID NO: 15 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de mosca da fruta (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Drosophila melanogaster (mosca da fruta): Dmel_CG1640). < SEQ ID NO: 16> SEQ ID NO: 16 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de mosca da fruta (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (mosca da fruta): Dmel_CG1640). < SEQ ID NO: 17> SEQ ID NO: 17 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de nematoide (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematoide): C32F10.8). < SEQ ID NO: 18> SEQ ID NO: 18 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de nematoide (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Caenorhabditis elegans (nematoide): C32F10.8). < SEQ ID NO: 19> SEQ ID NO: 19 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um de dois tipos de aminotransferase de alanina de arroz Japonês (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (arroz Japonês): 4342210). < SEQ ID NO: 20> SEQ ID NO: 20 mostra a sequência de aminoácido de um de dois tipos de aminotransferase de alanina de arroz Japonês (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (arroz Japonês): 4342210). < SEQ ID NO: 21> SEQ ID NO: 21 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um de dois tipos de aminotransferase de alanina de arroz Japonês (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (arroz Japonês): 4348524). < SEQ ID NO: 22> SEQ ID NO: 22 mostra a sequência de aminoácido de um de dois tipos de aminotransferase de alanina de arroz Japonês (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (arroz Japonês): 4348524). < SEQ ID NO: 23> SEQ ID NO: 23 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Cyanidioschyzon merolae (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C). < SEQ ID NO: 24> SEQ ID NO: 24 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Cyanidioschyzon merolae (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C). < SEQ ID NO: 25> SEQ ID NO: 25 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina (ALT1) de Saccharomyces cerevisiae (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C). < SEQ ID NO: 26> SEQ ID NO: 26 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina (ALT1) de Saccharomyces cerevisiae (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C). < SEQ ID NO: 27> SEQ ID NO: 27 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) de Saccharomyces cerevisiae (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C). < SEQ ID NO: 28> SEQ ID NO: 28 mostra a sequência de aminoácido do mutante de aminotransferase de alanina (ALT2) de Saccharomyces cerevisiae (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C). < SEQ ID NO: 29> SEQ ID NO: 29 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Ashbya gossypii (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W). < SEQ ID NO: 30> SEQ ID NO: 30 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Ashbya gossypii (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W). < SEQ ID NO: 31> SEQ ID NO: 31 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Candida albicans (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346). < SEQ ID NO: 32> SEQ ID NO: 32 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Candida albicans (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346). < SEQ ID NO: 33> SEQ ID NO: 33 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Schizosaccharomyces pombe (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08). < SEQ ID NO: 34> SEQ ID NO: 34 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Schizosaccharomyces pombe (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08). < SEQ ID NO: 35> SEQ ID NO: 35 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Aspergillus nidulans(KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2). < SEQ ID NO: 36> SEQ ID NO: 36 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Aspergillus nidulans (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2). < SEQ ID NO: 37> SEQ ID NO: 37 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Aspergillus fumigatus (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770). < SEQ ID NO: 38> SEQ ID NO: 38 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Aspergillus fumigatus (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770). < SEQ ID NO: 39> SEQ ID NO: 39 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Aspergillus oryzae (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164). < SEQ ID NO: 40> SEQ ID NO: 40 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Aspergillus oryzae (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Aspergillus oryzae: AO090003000164). < SEQ ID NO: 41> SEQ ID NO: 41 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Cryptococcus neoformans (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490). < SEQ ID NO: 42> SEQ ID NO: 42 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Cryptococcus neoformans (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490). < SEQ ID NO: 43> SEQ ID NO: 43 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Dictyostelium discoideum (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Dictyostelium discoideum: DDB_0232139). < SEQ ID NO: 44> SEQ ID NO: 44 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Dictyostelium discoideum (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139). < SEQ ID NO: 45> SEQ ID NO: 45 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Trypanosoma brucei (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950). < SEQ ID NO: 46> SEQ ID NO: 46 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Trypanosoma brucei (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950). < SEQ ID NO: 47> SEQ ID NO: 47 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica aminotransferase de alanina de Leishmania major (KEGG/ ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630). < SEQ ID NO: 48> SEQ ID NO: 48 mostra a sequência de aminoácido de aminotransferase de alanina de Leishmania major (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Leishmania major: LmjF12.0630). < SEQ ID NO: 49> SEQ ID NO: 49 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos dois tipos de aminotransferase de alanina de Entamoeba histolytica (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Entamoeba histolytica: 233.t00009). < SEQ ID NO: 50> SEQ ID NO: 50 mostra a sequência de aminoácido de um dos dois tipos de aminotransferase de alanina de Entamoeba histolytica (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009). < SEQ ID NO: 51> SEQ ID NO: 51 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos dois tipos de aminotransferase de alanina de Entamoeba histolytica (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Entamoeba histolytica: 24.t00016). < SEQ ID NO: 52> SEQ ID NO: 52 mostra a sequência de aminoácido de um dos dois tipos de aminotransferase de alanina de Entamoeba histolytica (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016). < SEQ ID NO: 53> SEQ ID NO: 53 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420). < SEQ ID NO: 54> SEQ ID NO: 54 mostra a sequência de aminoácido um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420). < SEQ ID NO: 55> SEQ ID NO: 55 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.430). < SEQ ID NO: 56> SEQ ID NO: 56 mostra a sequência de aminoácido um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430). < SEQ ID NO: 57> SEQ ID NO: 57 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120). < SEQ ID NO: 58> SEQ ID NO: 58 mostra a sequência de aminoácido um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120). < SEQ ID NO: 59> SEQ ID NO: 59 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140). <SEQ ID NO: 60> SEQ ID NO: 60 mostra a sequência de aminoácido um dos quatro tipos de aminotransferase de alanina de Trypanosoma cruzi (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140). <SEQ ID NO: 61> SEQ ID NO: 61 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o transportador de taurina de hamster. <SEQ ID NO: 62> SEQ ID NO: 62 mostra a sequência de aminoácido do transportador de taurina de hamster. <SEQ ID NO: 63> SEQ ID NO: 63 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o transportador de taurina de rato (GenBank NM 017206). <SEQ ID NO: 64> SEQ ID NO: 64 mostra a sequência de aminoácido do transportador de taurina de rato (GenBank NM 017206). <SEQ ID NO: 65> SEQ ID NO: 65 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o transportador de taurina de camundongo (GenBank NM_009320). <SEQ ID NO: 66> SEQ ID NO: 66 mostra a sequência de aminoácido do transportador de taurina de camundongo (GenBank NM 009320). <SEQ ID NO: 67> SEQ ID NO: 67 mostra a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica o transportador de taurina humano (GenBank NM 003043). <SEQ ID NO: 68> SEQ ID NO: 68 mostra a sequência de aminoácido do transportador de taurina humano(GenBank NM 003043).

Claims (7)

1. Método para produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende transferir artificialmente um gene da alanina aminotransferase e um gene que codifica um polipeptídeo desejado em uma célula CHO, e cultivar a referida célula CHO a qual expressa a referida alanina aminotransferase e tem um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permitindo que a célula CHO produza o referido polipeptídeo, em que a célula CHO a qual expressa alanina aminotransferase é uma célula CHO que é transformada por um vetor incorporando um DNA que codifica a referida alanina aminotransferase, em que o polipeptídeo desejado é um anticorpo.

2. Método para produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células que expressam alanina aminotransferase ainda expressam um transportador de taurina.

3. Método para produção de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células que expressam um transportador de taurina são células nas quais DNA que codifica um transportador de taurina foi transferido.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que a célula é célula de ovário de hamster Chinês.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o DNA que codifica alanina aminotransferase é um DNA que tem a sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59.

6. Método para preparação de um produto farmacêutico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de preparação de um polipeptídeo desejado através do método como defindo em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar, em um meio contendo a- cetoglutarato, a referida célula a qual expressa alanina aminotransferase e tem o referido DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e, desse modo, permite que a célula produza o referido polipeptídeo.

Images