WO2014058025A1 - 改変宿主細胞の樹立方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the production of a recombinant protein using cultured animal cells, and more particularly to a technique for establishing a host cell that can efficiently produce a target protein.
  • a technique for improving the production efficiency of a target protein by introducing another structural gene into a host cell in addition to the gene of the target protein and expressing it in a high expression level is known.
  • a method for producing a protein comprising culturing a cell that highly expresses a taurine transporter (TauT) gene that is a membrane transport protein and into which a DNA encoding a desired protein is introduced (patent)
  • Document 1 WO2007 / 119774
  • Patent document 2 WO2009 / 051109).
  • ALT alanine aminotransferase
  • a cell line in which the genes are stably expressed can be established by introducing each of them separately.
  • a cell line in which both of the two types of foreign genes are stably expressed at a high level cannot be established.
  • the expression level of the same gene or counterpart gene in at least one of the foreign genes in the host cell is below the detection limit by qPCR, a cell line in which both of the two genes are stably highly expressed is established. I experienced something I could't do.
  • a gene of a protein having the same function or a gene of an enzyme involved in the same metabolic reaction for example, a host cell in which two types of membrane transport proteins are highly expressed, or a host in which both types of enzymes are highly expressed It was impossible to establish cells.
  • GlycArt's two types of sugar chain-related enzyme genes are expressed in host cells.
  • antibody gene-derived cells derived from highly expressed host cells are unstable in enzyme gene expression, so the afucosyl content of the antibody There were some cases that deviated from the expected range.
  • the present invention provides a novel technique for stably and highly expressing a gene that is difficult to express in a host cell used for recombinant protein production.
  • a technique for establishing a cell line that has a fast doubling time and stably grows is also provided.
  • RNAs or DNAs having such functions or their sequences as APES (Antibody Production Enhancing Sequence) (sometimes referred to as PPES (Polypeptide Production Enhancing Sequence)).
  • APES was considered to be a functional nucleic acid that activates NF- ⁇ (kappa) B through suppression of NfkBia (or I- ⁇ B) expression.
  • KSHHV miRNA-K1 and the like are also known (Lei, Xiufen et al., Nat. Cell. Biol., 12 (2), p193-199, 2010).
  • the present inventors have (1) the construction of a cell in which a specific gene that is difficult to express in normal cells is highly expressed, or (2) two or more different types that are difficult to establish in normal cells. It has been found that it has a function to stably and highly express a transgene so as to enable the construction of a cell that stably expresses the above gene.
  • the present application provides a method for stably and highly expressing a foreign gene that is difficult to express or a foreign gene that is unstable in expression by introducing the APES gene into a host cell.
  • the present application provides a method for establishing a cell that proliferates stably with a fast doubling time by introducing an APES gene into a host cell.
  • the APES gene is a DNA encoding non-coding RNA (RNA that is not translated into protein) that suppresses the expression of NfkBia.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a recombinant protein capable of stably expressing two or more foreign genes including introducing a non-coding RNA gene that suppresses NfkBia expression into a cell and expressing the gene. How to establish a cell line for production.
  • the protein having a similar function is a transporter or a metabolic enzyme.
  • the non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia is a small RNA of up to 30 bases including a continuous sequence of 19 to 25 bases that can bind to a part of the mRNA of NfkBia by base pairing.
  • mRNA type non-coding RNA up to 561 bases long comprising a non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia and includes a continuous sequence of 19 to 25 bases long capable of binding to a part of the mRNA of NfkBia by base pairing
  • the non-coding RNA gene that suppresses the expression of NfkBia is DNA having the following base sequence or a complementary sequence thereof: (A) a sequence capable of binding to any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 and 29 by base pairing; (B) the same base sequence as that of any one of SEQ ID NOS: 1 to 16 and 29 except for one or several bases; (C) a partial sequence of the 3 ′ untranslated region of the NfkBia gene, comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 16 and 29; (D) A base sequence identical to the sequence of (c) except for one or several bases.
  • a method for establishing a cell line for producing a recombinant protein capable of stably expressing two or more foreign genes according to (1) above, Introducing a first foreign gene and a non-coding RNA gene that suppresses the expression of NfkBia into a cell to express these genes, Introducing a second foreign gene into the cell and introducing a third foreign gene that is difficult to stably express simultaneously with the second foreign gene;
  • the first, second, and third foreign genes are genes encoding proteins, The above-mentioned method, wherein a cell line for production of a recombinant protein is established that expresses a gene of a non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia and the first, second, and third foreign genes that encode the protein.
  • various foreign genes can be stably and highly expressed in host cells. Therefore, using the present invention, a polypeptide that is difficult to express in normal cells can be produced as a pharmaceutical product. In addition, the expression level of antigen proteins that are difficult to express is increased, and the development of antibodies against such antigens is facilitated.
  • a cell in which a plurality of genes are stably and highly expressed can be constructed, so that a host cell for producing a recombinant protein incorporating a large number of useful genes can be produced.
  • the present invention it is possible to establish a cell that proliferates stably and has a fast doubling time. Therefore, in the production of a recombinant protein using cultured animal cells, if such a cell is used as a host, the target protein can be produced efficiently.
  • FIG. 1 shows the sequence of the identified AI462015 transcript and its location in the mouse genome.
  • FIG. 2 shows the expression intensity of the AI462015 transcript on the third day of subculture of antibody-producing cells in which Mab1 (anti-IL-6 receptor antibody) is highly expressed in CHO-DG44 cells.
  • FIG. 3 shows the expression intensity of the AI462015 transcript on the third day of subculture of antibody-producing cells in which Mab2 (anti-glypican 3 antibody) is highly expressed in CHO-DXB11s cells.
  • FIG. 4 shows the expression intensity of the AI462015 transcript on the third day of 1 L jar fed-batch culture of Mab2 (anti-glypican 3 antibody) producing cells.
  • FIG. 2 shows the expression intensity of the AI462015 transcript on the third day of 1 L jar fed-batch culture of Mab2 (anti-glypican 3 antibody) producing cells.
  • FIG. 5 shows the progression of the expression intensity of the AI462015 transcript on late 13th day of fed-batch culture of 1L jar of Mab2-producing cells.
  • FIG. 6 shows the expression intensity of the AI462015 transcript on the third day of 1 L jar fed-batch culture of cells with low Mab1 (anti-IL-6 receptor antibody) production potential.
  • FIG. 7 is an expression plasmid having a partial sequence of 434 bp of the transcript AI462015 (437p).
  • FIG. 8 is an expression plasmid having a partial sequence of 165 bp of the transcript AI462015 (437p).
  • FIG. 9 is a plasmid expressing only the hygromycin resistance gene as a control.
  • FIG. 10 shows that Mab1 production increases due to strong expression of a partial sequence of the transcript AI462015 (437p).
  • FIG. 11 shows strong expression of transcript AI462015 and suppression of NfkBia expression in high antibody-producing cells.
  • FIG. 12 shows a probe set used for NfkBia expression quantification.
  • FIG. 13 shows the quantitative results of suppression of NfkBia expression in high antibody-producing cells.
  • FIG. 14 shows eight NfkB binding sites (underlined) on the mouse MCMV IE2 promoter (SEQ ID NO: 23).
  • FIG. 15 is an outline of a method for analyzing microRNA expression.
  • FIG. 16 shows a PCR product derived from microRNA that was highly expressed in high antibody-producing cells.
  • FIG. 17 shows plasmids pPur-APES165 and pPur-ALT1 in which a partial sequence 165 bp of the transcription product AI642048 (437p) is coexpressed in pHyg-TAUT expressing cells.
  • FIG. 18 shows the results of shaker fed-batch culture showing the effect of high cell proliferation and high antibody production by strong APES expression.
  • FIG. 19 shows the results of L-Jar fed-batch culture showing the effect of high cell proliferation and high antibody production by strong APES expression.
  • FIG. 6 FIG.
  • FIG. 20 shows the correlation between the expression level of APES165 strongly expressing host candidate cells (9 strains) and the viable cell density.
  • FIG. 21 shows that the Mab1 production amount is increased by strong expression of a partial sequence of the partial sequence APES165 of the transcript AI462015 (437p).
  • FIG. 22 shows that a further partial sequence of APES165 having an effect of high antibody production in FIG. 21 contains an Nfkbia complementary sequence.
  • FIG. 23 shows that AI462015 is the complementary strand of mouse Nfkbia mRNA.
  • FIG. 24 shows that the homologous sequence of AI462015 is present in the CHO-K1 cell genome.
  • FIG. 1 shows that the homologous sequence of AI462015 is present in the CHO-K1 cell genome.
  • FIG. 25a shows that a partial sequence of AI462015 (positions 7-91 from the 5 ′ end) is conserved across species.
  • Reference Example 1 shows that a partial sequence of AI462015 (7th to 91st positions from the 5 ′ end) is conserved across species.
  • FIG. 25 c shows that a partial sequence of AI462015 (positions 7 to 91 from the 5 ′ end) is conserved across species.
  • FIG. 25d shows that a partial sequence of AI462015 (7th to 91st positions from the 5 'end) is conserved across species.
  • FIG. 25e shows that a partial sequence of AI462015 (positions 7-91 from the 5 ′ end) is conserved across species.
  • Example 1 Establishment of DXB11 / TAUT / APES (DTP) cells.
  • Example 1 The mRNA expression levels of hamster TAUT, human ALT1, and Nfkbia are shown.
  • Example 1 Establishment of DXB11 / TAUT / APES / AE1 (DTPE) cells.
  • Example 1 Establishment of DXB11 / TAUT / APES / ALT1 / PC (DTPLC) cells. (Example 1). Although the human PC expression plasmid pNeo-PC was introduced into DXB11 / TAUT / ALT1 (DTL) cells, DXB11 / TAUT / ALT1 / PC (DTLC) was not established.
  • Example 1 DXB11 (dhfr-) and DT host doubling time.
  • Example 2 Production of modified hosts by forced expression of various genes.
  • Example 2 The doubling time of the modified host.
  • Example 2 The doubling time of the
  • APES Antibody Production Enhancing Sequence
  • APES is a nucleic acid molecule that inactivates I- ⁇ B, an inhibitory protein of NF- ⁇ B, and more specifically, suppresses gene expression of I- ⁇ B ⁇ (NfkBia), a regulatory subunit of I- ⁇ B.
  • Nucleic acid molecule The main body of such a nucleic acid molecule is a non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia.
  • APES is a general term for non-coding RNA itself, DNA encoding the RNA, or a sequence thereof.
  • APES is a nucleic acid molecule comprising a base sequence capable of binding to DNA or mRNA, which is a NfkBia gene derived from human, mouse, rat or hamster, by base pairing and suppressing NfkBia expression. Such a nucleic acid molecule would be able to bind to NfkBia gene DNA or mRNA and inhibit its expression.
  • APES is a molecule that interferes with RNA of NfkBia mRNA, for example.
  • APES is a double-stranded RNA (dsRNA) or siRNA that is a short dsRNA containing a sequence that can bind to NfkBia gene DNA or mRNA from human, mouse, rat or hamster by base pairing, or a single RNA. It may be siRNA dissociated into strands, or shRNA, antisense DNA or RNA, microRNA (miRNA) or mRNA type non-coding RNA.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA siRNA that is a short dsRNA containing a sequence that can bind to NfkBia gene DNA or mRNA from human, mouse, rat or hamster by base pairing, or a single RNA. It may be siRNA dissociated into strands, or shRNA, antisense DNA or RNA, microRNA (miRNA) or mRNA type non-coding RNA.
  • APES is a nucleotide sequence consisting of a complementary sequence of NfkBia gene DNA or mRNA derived from human, mouse, rat or hamster, or a nucleotide sequence containing such a complementary sequence as a part of the sequence, and the expression of NfkBia is It is a nucleic acid molecule containing a base sequence that can be suppressed.
  • APES is a nucleic acid molecule comprising a partial sequence of NfkBia gene DNA or mRNA derived from human, mouse, rat or hamster or a complementary sequence of such a partial sequence, which can suppress the expression of NfkBia. .
  • APES can be an oligonucleotide composed of a sequence containing a sequence homologous or complementary to a part of the target NfkBiaB mRNA.
  • oligonucleotides include a low molecular weight RNA having a sequence corresponding to 19 to 25 bases of a complementary strand of NfkBia mRNA, or having the same sequence except for the base, and having the effect of suppressing the expression of NfkBia Is mentioned.
  • the low molecular RNA means SmallSnon-coding RNA (snRNA), and the snRNA includes miRNA.
  • APES may be a long mRNA type non-coding RNA, for example, from a sequence up to a length of 561 nucleotides (561 ⁇ mer) including a sequence capable of binding to NfkBia gene DNA or mRNA by base pairing. And having an effect of suppressing the expression of NfkBia.
  • APES may be a long chain (several hundred to hundreds of thousands of nucleotides) of mRNA type non-coding RNA.
  • APES can be a nucleic acid molecule or sequence that is 200-100,000 nucleotides long, or 300-300,000 nucleotides long.
  • APES may be an mRNA-type noncoding RNA having a length of 561 to 1579 bases or 500 to 1000 bases in length, including a sequence complementary to a part of mRNA of NfkBia (for example, the above-described snRNA sequence).
  • sequence that can be bound by base pair formation is not limited to a completely paired (ie, 100% complementary) sequence, and the presence of unpaired bases is allowed as long as the function is not hindered.
  • partial complementarity is preferable depending on the form of APES.
  • a sequence that is at least 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 95% homologous to a genetic DNA or mRNA containing an untranslated region of NfkBia, or a complementary sequence thereof is also " Included in “sequences capable of binding by base pairing”.
  • sequence of at least 90% homology with respect to 561-mer or 500-mer mRNA type non-coding RNA is 1-50 by base insertion, deletion or point mutation (or 1-56 in the case of 561-mer) ) Including a mutant sequence containing a mismatch base, which increases the ability to produce a recombinant polypeptide such as an antibody or suppresses the expression of NfkBia with its expression in a host cell. Is done. Therefore, for example, sequences derived from NfkBia orthologs (species homologous genes) that have a certain degree of sequence similarity, such as 70% or more homology, derived from a species different from the host cell may be used as APES. It is.
  • the sequence capable of binding by base pairing includes a sequence capable of binding to NfkBia mRNA under intracellular conditions.
  • sequences include, for example, sequences that hybridize under conditions known to those skilled in the art as highly stringent conditions and have the desired function.
  • highly stringent conditions is that polynucleotides and other polynucleotides are combined with 6 ⁇ SSPE or SSC, 50% formamide, 5 ⁇ Denhardt's reagent, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / ml fragmented modified salmon. Incubate for 12-16 hours in a hybridization buffer containing sperm DNA at a hybridization temperature of 42 ° C.
  • APES is a sequence that is homologous or complementary to a partial sequence of the NfkBia mRNA 3′-untranslated region derived from human, mouse, rat, or hamster, and includes a nucleotide sequence that can suppress the expression of NfkBia.
  • a nucleic acid molecule is a sequence that is homologous or complementary to a partial sequence of the NfkBia mRNA 3′-untranslated region derived from human, mouse, rat, or hamster.
  • RNA type non-coding RNA whose expression level is high in correlation with antibody production ability in cultured CHO cells.
  • This RNA was identified as a transcript of a known sequence consisting of 437 bases in the mouse genome (FIG. 1, GenBank Accession ID: AI462015, SEQ ID NO: 1).
  • the sequence of AI462015 and its position on the mouse genome is shown in FIG.
  • the transcript of AI462015, 437 bases corresponds to the complementary strand of the mouse NfkBia mRNA 3 'side untranslated region (513 bases) (Fig. 23).
  • the present inventors have found that the production amount of a desired polypeptide can be increased by introducing and expressing a nucleic acid molecule having a partial sequence derived from AI462015 into a host cell.
  • the above-mentioned sequence derived from AI462015 or a partial sequence thereof is conserved not only in rodents such as mice and hamsters, but also in humans, and is conserved in other mammals and animals such as fish and insects. Is considered a high sequence. Therefore, a partial sequence of the NfkBia mRNA 3 'side untranslated region derived from various animal cells corresponding to the sequence derived from AI462015 or a partial sequence thereof, or a complementary sequence thereof can also be used as the APES sequence of the present invention.
  • APES has a partial sequence derived from mouse AI462015, or a sequence in which one to several bases are substituted, deleted or added in such a partial sequence.
  • a 165-base DNA sequence (SEQ ID NO: 2, APES165) consisting of a base sequence from the 4th G to the 168th C on the 5 ′ side, or its complementary (antisense) DNA sequence or transcribed from these DNAs Or a subsequence of any length in this sequence.
  • a 434-base DNA sequence (SEQ ID NO: 3, APES434) consisting of a base sequence from the 4th G on the 5 ′ side to T at the 3 ′ end, or its complementary (antisense) DNA sequence or transcribed from these DNAs. Or a partial sequence of any length derived from this sequence.
  • a sequence containing a sequence derived from mammals such as human, hamster, rat, etc. corresponding to the sequence of mouse AI462015, or a partial sequence thereof, or a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted or added in such a partial sequence Is also included.
  • APES has a 4 ′ to 133rd nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4, APES130) in AI462015 or a partial sequence derived from this sequence.
  • SEQ ID NO: 4, APES130 a 4 ′ to 133rd nucleotide sequence in AI462015 or a partial sequence derived from this sequence.
  • the DNA sequence from the 4th to the 68th position on the 5 ′ side SEQ ID NO: 5, APES4-68), or the 69th to 133rd position (SEQ ID NO: 6, APES69-133) or its complementary DNA sequence, or from these DNAs Examples include sequences to be transcribed.
  • APES represents a sequence derived from a sequence of 52 bases (SEQ ID NO: 7) from the 40th to the 91st position on the 5 ′ side in AI462015, or a partial sequence obtained by cutting the 52 bases at an arbitrary position.
  • SEQ ID NO: 7 the DNA sequence of the first half (29 bases of APES40-68, 24 bases of APES40-63, or 22 bases of APES40-61) or the second half (23 bases of APES69-91) or its complementary DNA sequence (each sequence) No. 8 to 11) or sequences transcribed from these DNAs.
  • the above-mentioned 52 bases have the same sequence as the complementary strand of the 3 'untranslated region of the rat NfkBia gene except for one base.
  • 24 bases (APES40-63, SEQ ID NO: 9) on the 5 'side have the same sequence as the 3' side untranslated region of the human NfkBia gene.
  • 22 bases on the 5 'side (APES40-61, SEQ ID NO: 10: AAGTACCAAAATAATTACCAAC) have the same sequence as the complementary strand of the 3'-side untranslated region of NfkBia mRNA that exceeds species such as rat, rhesus monkey, dog and horse.
  • RNAi effect is expected by expressing a partial sequence complementary to the 3'-untranslated region of the NfkBia gene in the host cell.
  • RNA having a sequence complementary to 19 to 25 bases out of the 52 bases may act as microRNA (miRNA) on the untranslated region of NfkBia mRNA, thereby inhibiting translation.
  • miRNA microRNA
  • APES has a sequence of 85 bases (SEQ ID NO: 29) from 7th to 91st 5 ′ side in AI462015, or a sequence derived from a partial sequence obtained by cutting the 85 bases at an arbitrary position.
  • RNA having a sequence complementary to 19 to 25 bases out of the 85 bases may act as microRNA (miRNA) on the untranslated region of NfkBia mRNA, thereby possibly inhibiting translation.
  • miRNA microRNA
  • APES has a sequence found in a 21 base siRNA search. For example, DNA from the 84th to 104th (SEQ ID NO: 12, APES84-104), 99th to 119th (SEQ ID NO: 13, APES99-119), 101st to 121st (SEQ ID NO: 14, APES101-121) DNAs in AI462015 An miRNA sequence comprising a sequence complementary to the sequence. Since the 71st to 112th sequences (SEQ ID NO: 16) in the above-mentioned APES 69-133 are quantified on GeneChip and are actually highly expressed regions, APES84-104 functions as a miRNA. It seems likely.
  • APES may be a known non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia.
  • An example of such a nucleic acid molecule is KSVH (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) miRNA-K1. (See X ⁇ Cai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 April 12; 102 (15): 5570-5575 etc.)
  • nucleic acid molecules having activity as APES from chemical synthesis or biological sources.
  • the structural feature of APES is that it is a nucleic acid molecule that contains a sequence that is complementary to a portion of the target NfkBia mRNA.
  • the nucleic acid molecule may be in any form, whether it is DNA, DNA transcript, mRNA, cDNA, exosome RNA, chemically synthesized single-stranded RNA, or chemically synthesized double-stranded RNA. It doesn't matter.
  • a functional characteristic is that the production ability of a recombinant polypeptide such as an antibody is increased along with its expression in a host cell, or the expression of NfkBia is suppressed.
  • APES When APES is isolated from a biological source, it may be of any biological origin and is not particularly limited. Specifically, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice, rats and hamsters, livestock such as cows, pigs and goats, birds such as chickens, fishes such as zebrafish, insects such as flies APES derived from animals such as mosquitoes and nematodes, and preferably APES derived from the same species as humans, rodents or host cells.
  • cells that strongly express APES are Chinese hamster ovary cells (CHO Cell), APES derived from human, mouse or hamster is preferable.
  • nucleic acid molecules can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, total RNA is prepared from cultured cells that are highly producing recombinant polypeptides such as antibodies, oligonucleotides are synthesized based on the nucleic acid sequence of the present invention (eg, APES165 of SEQ ID NO: 2), and this is used as a primer. It can be prepared by performing a PCR reaction and amplifying a cDNA having the characteristics of APES.
  • a cDNA library is prepared after preparing low molecular weight RNA from cultured cells that produce high levels of recombinant polypeptides such as antibodies, and a partial sequence complementary to NfkBia mRNA is generated based on the base sequence of the cloned cDNA. Low molecular RNA containing can be obtained.
  • a cDNA library can also be constructed by preparing a small RNA such as microRNA (miRNA) and then, for example, by the method described in Sambrook, J. et al., Molecular ⁇ Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). .
  • genomic DNA expressing APES can be isolated by screening the genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • RNA is isolated from cells, tissues and the like that may express the APES of the present invention. Isolation of mRNA is performed by known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc., and then the RNA is further purified using RNeasy Mini Kit (QIAGEN) etc.
  • CDNA is synthesized from the obtained total RNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can also be performed using SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen) or the like.
  • primers and the like 5'-Ampli FINDER RACE Kit (manufactured by Clontech) and 5'-RACE method using polymerase chain reaction (PCR) (Frohman, MA et al., Proc. Natl. According to Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), cDNA can be synthesized and amplified.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • the obtained DNA can be modified by a commercially available kit or a known method.
  • the modification include introduction of a single base mutation by site-directed mutagenesis method.
  • a sequence modified in this way is also included in the scope of the present invention as long as it has APES activity.
  • “having APES activity” means having a function of suppressing the expression of NfkBia (I- ⁇ B ⁇ ) by being expressed in a host cell.
  • nucleic acid molecule having APES activity may be referred to as a nucleic acid molecule of the present invention.
  • the present invention includes introducing APES, that is, a non-coding RNA that suppresses the expression of NfkBia, into a host cell, and further expressing APES. , Preferably including strongly expressing APES.
  • the expression of APES strongly means that the expression level of APES is increased compared to the original cells.
  • the original cell is not particularly limited, and examples thereof include a cell used as a host in producing a recombinant protein such as CHO cell.
  • the original cell before introduction of the antibody gene has a signal value of AI462015 of 2000 if it is described along the reference examples described later.
  • the expression level of APES is increased compared to the following, for example, that the signal value of AI462015 is more than doubled.
  • a cell into which APES gene has been introduced and strongly expresses APES contains endogenous or exogenous APES in the cell.
  • Examples of cells that strongly express APES include cells into which APES has been artificially introduced.
  • Cells into which APES has been artificially introduced can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, by incorporating a DNA sequence encoding APES into a vector and transforming the vector into the cell. It is possible.
  • endogenous APES is activated by gene activation technology (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), and as a result, APES is artificially introduced into cells in which APES is strongly expressed. Included in cells.
  • a typical example of endogenous APES is APES as a DNA sequence encoded on the host cell genome.
  • cells that are strongly expressed by activation of endogenous APES transcription for some reason after antibody gene introduction can be used, regardless of gene activation technology.
  • Expression vector is useful for strongly expressing APES in host cells and for expressing foreign polypeptides such as transporters and metabolic enzymes. Expression vectors are also used for the expression of foreign polypeptides useful as pharmaceutical active ingredients and antigens.
  • expression vectors examples include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18 (17), p5322), pEF , PCDM8), insect cell-derived expression vectors (eg “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (Eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIpneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression ⁇ Kit ”(manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), Bacillus subtilis Derived expression vectors (for example, pPL608, pKTH50
  • An expression vector for expressing a foreign polypeptide includes a DNA encoding the polypeptide and an expression control sequence capable of driving the expression of the DNA.
  • an expression vector for expressing APES includes DNA encoding APES and an expression control sequence capable of driving the expression of the DNA.
  • a single vector may be constructed to express one or more polypeptides and APES. For example, when activating APES or polypeptide genes that are part of the host genome using gene activation techniques, expression control sequences that promote the expression of DNA from such host cells may be introduced. Good.
  • expression control sequences include appropriate promoters, enhancers, transcription terminators, Kozak sequences including the start codon (ie, ATG) in the gene encoding the protein, splicing signals for introns, polyadenylation sites, and stop codons.
  • start codon ie, ATG
  • stop codons ie, ATG
  • a vector can be constructed as appropriate by those skilled in the art.
  • the expression control sequence preferably contains a promoter / enhancer region capable of increasing the transcription amount of the gene in the animal cell to be used.
  • the promoter / enhancer region involved in the expression of the gene encoding the desired polypeptide may or may not contain an NF- ⁇ B binding sequence.
  • promoters required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108) It is preferable to have a MMLV-LTR promoter, an EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., “Nucleic” Acids “Res.” (1990) 18, “5322”), a CMV promoter, and the like. Further, it is more preferable if it has a gene for selecting transformation into cells (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming a cell with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the host cells used in the present invention are not particularly limited, and may be any cells such as animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and preferably Animal cells derived from insects, fish, amphibians, reptiles, and mammals, with mammalian cells being particularly preferred.
  • eukaryotic cells such as yeast
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • Examples of the origin of mammalian cells include primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice, rats and hamsters, and the like, with humans and rodents being preferred.
  • the cells of the present invention are preferably cultured mammalian cells such as CHO cells, COS cells, 3T3 cells, myeloma cells, BHK cells, HeLa cells, and Vero cells, which are commonly used for polypeptide expression.
  • mammalian cells such as CHO cells, COS cells, 3T3 cells, myeloma cells, BHK cells, HeLa cells, and Vero cells, which are commonly used for polypeptide expression.
  • CHO cells are particularly preferred for the purpose of mass expression of polypeptides useful as pharmaceuticals and antigens.
  • Examples of CHO cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be preferably used.
  • DG44 strain As the above CHO cells, DG44 strain, DXB-11 strain, K-1, and CHO-S are particularly preferable, and DG44 strain and DXB-11 strain are particularly preferable.
  • the host cell can be used as a production system for producing a desired polypeptide such as a pharmaceutical or an antigen.
  • a desired polypeptide such as a pharmaceutical or an antigen.
  • Such a cell may be a natural cell capable of producing a desired polypeptide or a cell into which DNA encoding the desired polypeptide is introduced, but DNA that encodes the desired polypeptide is introduced.
  • the transformed cells are preferred.
  • An example of a transformed cell into which a DNA encoding a desired polypeptide has been introduced is a host cell into which an expression vector containing at least a DNA encoding the desired polypeptide has been transfected.
  • a “cell into which DNA (or gene) has been introduced” refers to a cell that has been transfected with exogenous DNA, or a gene activation technique (see, for example, International Publication No. WO94 / 12650 pamphlet). Also included are cells in which endogenous DNA has been activated, and as a result, expression of a protein corresponding to the DNA or transcription of the DNA has started or increased.
  • the order of APES and the gene encoding the desired polypeptide is not particularly limited, and the desired polypeptide is introduced after APES is introduced. Or a gene encoding the desired polypeptide may be introduced and then APES may be introduced. Alternatively, APES and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously.
  • APES and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • the production amount of the desired polypeptide is increased by expressing the foreign gene in the transformed cell into which the DNA encoding the desired polypeptide is introduced.
  • foreign genes include taurine transporter (TauT), cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD), alanine aminotransferase (ALT), anion exchanger (AE), pyruvate carboxylase (PC), X-box binding protein And DNA encoding (XBP-1) and the like.
  • a plurality of foreign genes other than the gene of the desired protein can be introduced into the host cell and stably expressed. It is preferable that the production amount of the desired polypeptide is increased by expressing two or more specific exogenous genes other than the gene of the desired polypeptide in the host cell. As a result, a cell line suitable for recombinant protein production can be established.
  • Such two or more foreign genes can be genes encoding proteins that are difficult to express stably at the same time.
  • two or more foreign genes other than the desired polypeptide gene that are difficult to be expressed simultaneously can be expressed stably at the same time.
  • “difficult to express stably at the same time” means that an exogenous gene encoding two or more proteins that do not stably express at the same time in a state where APES is not introduced into the host cell. It is a combination.
  • two or more foreign genes that are difficult to stably express at the same time means an animal cell into which APES has not been introduced, preferably a host cell before the introduction of a gene of a desired protein.
  • a cell line that stably expresses the foreign gene can be established, but after performing the treatment of introducing two or more of these foreign genes, the two can be selected even if a selection process using drugs, etc. is performed. It refers to a gene for which cells that simultaneously express a foreign gene encoding the above protein cannot be obtained.
  • the expression level of the same gene or counterpart gene as at least one of the foreign genes in the host cell before introduction of the foreign gene is preferably below the detection limit by qPCR.
  • the cell of the present invention is a host cell for producing a desired protein in which a foreign gene encoding two or more proteins can be introduced, after the gene for the desired protein is introduced When performing a selection process for gene amplification of a desired protein by treatment with a drug such as MTX at least twice, at least one of the foreign genes encoding the two or more proteins before the selection process.
  • a drug such as MTX at least twice
  • the expression level is less than 50%, preferably 30% or less, more preferably 10% or less, and most preferably the expression disappears, it is difficult to stably express such a gene simultaneously in the present invention. “Two or more foreign genes”.
  • two or more foreign genes that are difficult to express stably at the same time refers to cells that have introduced a foreign gene encoding two or more proteins and have not introduced APES.
  • the expression level of at least one gene among the foreign genes encoding the two or more proteins after subculturing the cell for at least 15 generations compared to the expression level of the foreign gene at the time of selection Is less than 50%, preferably 30% or less, more preferably 10% or less, most preferably a gene whose expression is lost.
  • stable expression at the same time specifically means that, when the cell of the present invention is a host cell for producing a desired protein, APES into which a foreign gene encoding two or more proteins has been introduced. Even if a selection process for gene amplification of a desired protein is performed at least twice by a drug treatment such as MTX after introducing a gene of a desired protein into a host cell containing The expression level of foreign genes encoding the above proteins is maintained at 50% or more, preferably 70% or more.
  • stable expression at the same time means that the cell is at least 15% compared to the expression level of the foreign gene when a cell into which two or more foreign genes are introduced is selected. Even after generation subculture, the expression levels of the foreign genes encoding the two or more proteins are maintained at 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more. Say that state.
  • a cell line in which two or more foreign genes are “stablely expressed simultaneously” is maintained as an established cell line.
  • a protein that is difficult to be expressed stably at the same time can belong to a protein having a similar function.
  • combinations of proteins having similar functions that are difficult to stably express at the same time include two or more types of membrane transport proteins or accessory proteins necessary for their function, and two or more types of enzyme proteins.
  • Preferred examples include metabolic enzymes involved in the same metabolic pathway and combinations of two or more transcription factors.
  • the combination of proteins that are difficult to express stably at the same time may be a combination of two or more membrane transport proteins and one or two or more enzyme proteins.
  • the combination of proteins that are difficult to express stably at the same time may be a combination of one or more types of membrane transport proteins and two or more types of enzyme proteins.
  • a membrane transport protein refers to a protein that mediates the transport of a substance in a biological membrane, and is also referred to as a transporter, a carrier, a permease, or the like.
  • An important role of the cell membrane is to selectively permeate various ions and nutrients, and it is a membrane protein that controls the function.
  • Membrane transport proteins include proteins that mediate transport of organic substances such as sugars and amino acids, and ion pumps and ion channels that are ion transporters.
  • Various sugar or amino acid transporters (transporters, permeases) and ion transporters have been purified, and their genes are known.
  • a protein gene having a similar function can be a combination of two or more transporter genes.
  • two types of transporters are TauT and AE1.
  • a typical example of an enzyme protein having a similar function is a combination of a plurality of metabolic enzymes.
  • genes for enzyme proteins having similar functions can be two or more types of metabolic enzyme genes in the same pathway.
  • Such metabolic enzymes may be two or more enzymes that promote a continuous reaction within the same pathway.
  • the metabolic enzyme of the same pathway can be an enzyme that catalyzes an amino acid degradation reaction.
  • the metabolic enzyme can be an enzyme of the pyruvate metabolic pathway. Examples of enzymes of two or more pyruvate metabolic pathways can be ALT1 and PC.
  • an example of an enzyme protein having a similar function may be a combination of a plurality of glycosyltransferases.
  • examples of the combination of one or two or more types of membrane transport proteins and two or more types of enzyme proteins can be TauT and two types of metabolic enzymes.
  • artificially expressing APES in a host cell can be realized by artificially introducing a non-coding RNA gene that suppresses NfkBia expression into the cell and expressing the gene.
  • expression of two or more foreign genes can also be realized by artificially introducing these foreign genes into cells and expressing the genes.
  • exogenous DNA which may be incorporated into a vector
  • a host cell for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, Nucleofection method (amaxa) and lipofection can be used.
  • the “cell into which DNA (or gene) has been introduced” refers to cells transfected with exogenous DNA, as well as gene activation technology (see, for example, International Publication No. WO94 / 12650 pamphlet). Also included are cells in which endogenous DNA has been activated, and as a result, expression of a protein corresponding to the DNA or transcription of the DNA has started or increased.
  • the host cell In order to introduce two or more foreign protein genes that are difficult to be stably expressed simultaneously into a host cell for stable expression, the host cell is preliminarily introduced before the second foreign gene is introduced. It is preferable to introduce APES. When using a vector, it is preferable to introduce APES and the second and subsequent foreign genes separately using a plurality of vectors.
  • the order of introduction of the first foreign gene and APES is not particularly limited, and the first foreign gene may be introduced after the introduction of APES, or after the introduction of the first foreign gene.
  • APES may be introduced.
  • APES and the first foreign gene may be introduced simultaneously.
  • APES and the first foreign gene may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • a non-coding RNA (APES) gene that suppresses the expression of NfkBia is introduced, and the gene is expressed, so that subculture is repeated.
  • APES non-coding RNA
  • a cell line for producing a recombinant protein can be obtained that has a fast doubling time and can be stably propagated.
  • a cell may be a cell that is stably highly expressed by introducing another foreign gene in addition to APES.
  • Example 1 Establishment of a cell in which a specific gene that is difficult to express is highly expressed
  • the membrane proteins TauT and AE1 function cooperatively on the cell surface through the import / discharge of chloride ions.
  • AE1 the membrane proteins that simultaneously expressed AE1
  • PC Polyruvate Carboxylase
  • TAUT / APES / ALT1 / PC cells were established.
  • TAUT / ALT1 / PC cells that highly express ALT1 and PC were not established from TAUT / ALT1 cells not preliminarily expressing APES.
  • CHO cell DXB-11 strain was used as a host cell.
  • Example 1-1 Establishment of DXB11 / TAUT / APES cells Hamster TAUT expression plasmid pHyg-TAUT was introduced into DXB11 of a host cell by electroporation, and selected in the presence of 200 ⁇ g / mL hygromycin. In addition, DXB11 / TauT (DT), which is a hamster TAUT (taurine transporter) highly expressing cell, was established (FIG. 26).
  • DT hamster TAUT (taurine transporter) highly expressing cell
  • APES expression plasmid pPur-APES165 was introduced by electroporation and selected in the presence of 6 ⁇ g / mL puromycin, the cells were highly proliferated and APES was forcibly expressed to suppress Nfkbia mRNA expression.
  • DTP DXB11 / TAUT / APES
  • Example 1-2 Establishment of DXB11 / TAUT / APES / AE1 cells It may be difficult to establish a host cell in which two types of transporters are stably and highly expressed. For example, a stable strain in which both TAUT and AE1 (anion exchanger 1) were highly expressed in the host cell DXB11 was not established. However, the human AE1 expression plasmid pNeo-AE1 was introduced by electroporation into DXB11 / TauT / APES (DTP), a cell in which Nfkbia mRNA expression was suppressed by forcibly expressing APES with high expression of hamster TAUT in FIG.
  • DTP DXB11 / TauT / APES
  • Nfkbia mRNA expression suppression by high APES expression is required in order to achieve high expression of two coordinately functioning transporters via Cl - ion ejection by TAUT and Cl - ion uptake by AE1. Is considered necessary.
  • Example 1-3 Establishment of DXB11 / TAUT / APES / ALT1 / PC cells Establishment of a host cell in which two enzymes are stably and highly expressed may be difficult. For example, a stable strain in which both ALT1 (alanine transferase) and PC (pyruvate carboxylase) were highly expressed was not established. However, when the human ALT1 expression plasmid pNeo-ALT1 is introduced into DXB11 / TauT / APES (DTP) in FIG. 26 by electroporation and selected in the presence of 200 ⁇ g / mL G418, high growth and high expression of human ALT1 are achieved.
  • DTP DXB11 / TauT / APES
  • DXB11 / TAUT / APES / ALT1 (DTPL) was established, but the human PC expression plasmid pZeo-PC was further introduced into DTPL cells by electroporation in the presence of 200 ⁇ g / mL Zeocin.
  • DXB11 / TAUT / APES / ALT1 / PC DTPLC
  • FIG. 29 DXB11 / TAUT / APES / ALT1 / PC
  • Example 2 Method for establishing cells with fast doubling time and stably proliferating [Example 2-1] Calculation of doubling time (approximate value) The doubling time (approximate value) is determined after shaker culture with 125-mL Erlenmeyer Flask, The number of viable cells was measured and calculated by Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system (Innovatis AG, Bielefeld, Germany).
  • the subculture medium of the modified cells in which the gene was forcibly expressed contained drugs such as hygromycin used for various gene introductions, but the same medium as DXB11 (dhfr-) was used except for the drugs.
  • the doubling time (approximate value) of DXB11 (dhfr-) before modification by gene transfer was determined by subculture in a medium containing no drug ((cells with a viability of 99.5%) 4 times and 4 days of culture 3 times)) was calculated to be 27.5 ⁇ 1.7 hours (FIG. 31).
  • Example 2-2 Establishment and doubling time of various gene forced expression hosts As shown in FIG. 32, modified hosts were established by forced expression of various genes. First, a TAUT (Taurine Transporter) expression plasmid (pHyg-TAUT) was introduced into DXB11 (dhfr-) by electroporation, and after about 2-3 weeks, cells with good growth in the presence of 200 ⁇ g / mL hygromycin were obtained. Two types were selected. Furthermore, gene expression profiles during subculture were compared in GeneChip experiments using AFFYMETRIX oligonucleotide arrays (Affymetrix MOUSE430_2).
  • AFFYMETRIX oligonucleotide arrays Affymetrix MOUSE430_2
  • TAUT mRNA was highly expressed, and other expression profiles were similar to those of DXB11 (dhfr-).
  • the selected strain was used as the DT host.
  • the doubling time (estimated value) of the established DT host was determined by subculture in a medium containing a drug (hygromycin) (( And 7 times for 4 days of culture)) was 26.1 ⁇ 2.7 hours, and the doubling time was almost equivalent to that of DXB11 (dhfr-) (FIG. 31).
  • APES165 Japanese Patent Application No. 2011-082002
  • the DTP host had acquired an unprecedented character.
  • the expression plasmid (pNeo-AE1) of AE1 (Anion Exchanger 1) that could not establish a host cell that was forcibly expressed with TAUT was introduced by electroporation, and after about 2-3 weeks, in the presence of 200 ⁇ g / mL G418.
  • AE1 Organic Exchanger 1
  • the expression plasmid (pNeo-ALT1) of ALT1 (Alanine Aminotransferase 1) ⁇ that was able to establish host cells that were forcibly expressed with TAUT was introduced by electroporation, and after about 2-3 weeks, 200 ⁇ g / mL Cells with good growth in the presence of G418 were selected to construct cells with high expression of both TAUT and AE1. Since there is a correlation between ALT1 expression level and cell growth, the cells with the highest ALT1 expression level were stable even after repeated long-term culture, and the doubling time was faster than that of DTP host. (FIGS. 33 and 57, 19.8 ⁇ 4.3 hours).
  • ALT1 can establish a host cell that is co-expressed with TAUT without depending on the forced expression of APES
  • an ALT1 expression plasmid (pPur-ALT1) is introduced into the DT host by electroporation, about 2-3 weeks later
  • cells with good growth in the presence of 6 ⁇ g / mL puromycin were selected and the cells with the highest ALT1 expression level were used as DTL hosts, they were stable even after repeated long-term cultures. In comparison, there was variation in growth, and the doubling time was slower than that of the DTPL host (Fig. 33, 57 passages, 21.9 ⁇ 7.3 hours).
  • a host cell with a fast doubling time can be constructed by forcibly expressing APES.
  • a host with a high doubling time can be constructed by introducing a new gene into a host that strongly expresses APES. It shows what you can do.
  • a nucleic acid sequence having such a function is not known.
  • Reference Example The present inventors previously examined a gene that is markedly expressed in a cell line (CHO cell line) having a high ability to produce a recombinant antibody as a material. mRNA type non-coding RNA was identified. This transcript corresponded to the complementary strand of the untranslated region of NfkBia mRNA. Furthermore, it has been found that by expressing a nucleic acid molecule consisting of a part of the sequence in the transcription product in a recombinant cultured cell, the antibody producing ability of the cultured cell is remarkably improved.
  • the present inventors have shown that NfkBia expression is suppressed in high antibody-producing cells in which expression of the non-coding RNA is promoted, and that cultured cells having high antibody-producing ability suppress NfkBia expression in the cells.
  • the inventors have found that the amount of antibody production is increased by highly expressing a transcript that controls the expression of NfkBia in cultured cells.
  • cDNA was synthesized using total RNA and oligo dT primer (T7- (T) 24) containing T7 promoter sequence.
  • biotin-labeled cRNA was synthesized from cDNA by a transcription reaction using Bio-11 CTP, Bio-16 UTP and Megascript T7 Kit (Ambion).
  • high-quality cRNA whose molecular weight corresponding to 18s to 28s rRNA was confirmed by electrophoresis was fragmented to obtain a GeneChip sample having a uniform size. The GeneChip sample until use was added with a hybridization sample solution and stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • sample solution was heat-treated, centrifuged, applied to a Mouse Genome 430 2.0 Array, and incubated for 16 hours in a 45 ° C oven dedicated to hybridization while rotating the Array. Samples were collected, the arrays were washed repeatedly and scanned after staining with Streptavidin® R-Phycoerythrin.
  • MAb1 anti-IL-6R antibody; tocilizumab, trade name ⁇ Actemra
  • MAb1 anti-IL-6R antibody
  • tocilizumab trade name ⁇ Actemra
  • MAb1 anti-IL-6R antibody
  • AI462015 is an mRNA type non-coding RNA of 437 bases, but its sequence is present on the complementary strand in the vicinity of the untranslated region (56590831- 56590397) on the NfkBia 3 side of mouse genome 12.
  • the AI462015 transcript may act directly on the untranslated region of NfkBia mRNA to inhibit translation, or a partial sequence of 437 bases may function as a small RNA and degrade NfkBia mRNA. .
  • a sequence of 52 bases (AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA: SEQ ID NO: 7) including the 40th A to the 91st A in the AI462015 sequence is an untranslated region (1478-1529, GENE ID on the rat NfkBia mRNA 3 'side).
  • NfkBia matches with the complementary strand except for one base (61'A on the 5 'side in AI462015), and a sequence of 24 bases including 40th A to 63rd A of AI462015 ( AAGTACCAAAATAATTACCAACAA: SEQ ID NO: 9) is also a complementary strand of a partial sequence (TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT, 1490-1513: SEQ ID NO: 24) of the untranslated region of human NfkBia mRNA 3 ′, and is a part of 52 bases 19- It was predicted that 25 bases may act on NfkBia mRNA of CHO cells as microRNA or a partial sequence as antisense RNA.
  • the subsequent update of GeneBank information revealed that 437 bases, which are the transcript of AI462015, correspond to the complementary strand of the 3 'side untranslated region (513 bases) of the mouse NfkBia gene (Fig. 23).
  • the homologous sequence of AI462015 exists on the genome sequence of CHO-K1 cells (SEQ ID NO: 25: AI462015; SEQ ID NO: 26-27: CHO-K1 genome), and further, high antibody production. Since suppression of Nfkbia expression (Reference Example 4) was observed in CHO cells, it is considered that the homologous sequence of AI462015 is highly expressed in CHO cells and functions.
  • a sequence of 85 bases including the 5th 7th T to the 91st A ( Figure 23 and 24 underlined, SEQ ID NO: 29) (TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA) is non-NfkBia mRNA 3 '
  • taurine transporter (TauT) gene when taurine transporter (TauT) gene is strongly expressed in CHO-DG44 cells, when cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) gene is strongly expressed (data not shown), TauT and When both CSADs were strongly expressed, the expression level of the transcript AI462015 was almost the same, but Mab1 (anti-IL-6 receptor antibody) was further strongly expressed in cells that strongly expressed both TauT and CSAD. In this case, abnormal progression of AI462015 (7 times that of host cells) was observed, and the expression level was abnormally high, indicating a GeneChip signal value (10,000 or more).
  • FIG. 3 is also the same, and when MAb2 (anti-glypican 3 antibody) gene is strongly expressed in CHO-DXB11s cells, the expression enhancement of AI462015 sequence (13 times the average value of TauT, CSAD, AE1 strongly expressing cells) is MAb2. Specific to high antibody producing cells.
  • MAb1-strongly expressing DXB11s cells with low antibody production 300 mg / L or less on the 7th day of shaker culture without addition of hydrolyzate, 500 mg / L or less with addition of hydrolyzate contribute to high production. Even under the condition where the product (Hy-Fish, Procine Lysate) was added, the expression of the AI462015 sequence on the 3rd day of 1L jar culture was not observed (Fig. 6).
  • APES165 was named to produce two types of expression units (APES is an abbreviation for Antibody-Production-Enhancing-Sequence).
  • pHyg-APES434 FIG. 7
  • pHyg-APES165 FIG. 8
  • pHyg-null FIG. 9
  • Amaxa (currently LONZA) Introduced expression plasmid into MAB1-strongly expressing DXB11s cells of the low antibody-producing strain of Fig. 6 using gene transfer system Nucleofector, and selective medium containing Hygromycin (200 ⁇ g / ml) was present on a 96-well plate Below, all cell lines with high growth were selected, and the antibody production was compared after expansion of the 24-well plate.
  • RNA may interfere with RNA as microRNA and degrade NfkBia mRNA, or on an AFFYMETRIX oligonucleotide array (Affymetrix MOUSE430_2) that can quantify AI462015 expression Specific probe sequence region (CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG: SEQ ID NO: 16) 21 bases from the 71st C on the 5 ′ side corresponding to the first half of 42 bp (CATATACAACATTTACAAGAA: SEQ ID NO: 15) Since it is a complementary sequence from the 1478th to 1498th bases of rat NfkBia mRNA, the nucleic acid molecule derived from AI462015 sequence may interfere with NfkBia mRNA and suppress the expression, thereby maintaining the homeostasis of high antibody-producing CHO cells.
  • AFFYMETRIX oligonucleotide array Affymetrix MOUSE430_2
  • NfkBia mRNA expression could not be quantified because the probe sequence corresponds to the species-specific sequence of CHO cells. NfkBia mRNA expression was suppressed in the high antibody-producing cells (lanes 3 and 4) in which the expression of the AI462015 sequence was promoted compared to the gene-strongly expressing cells (lanes 1 and 2) that were not produced. Furthermore, when a TaqMan Probe Set (FIG. 12) capable of quantifying a partial sequence of 325 bp is designed and quantified by RT-PCR, it is about 50% of cells not producing an antibody in the high antibody-producing cells. NfkBia mRNA expression was suppressed (FIG. 13).
  • NfkBia mRNA is suppressed in the high antibody-producing cells, and as a result, the antibody production potential is increased.
  • there are more than one NfkB binding sites in the promoter / enhancer region of the expression plasmid we are using for antibody gene expression Fig. 14: NfkB binding sites on the mouse MCMV IE2 promoter. Since the region is an essential region for high expression of antibody genes, NfkB activated by suppression of NfkBia expression is transferred into the nucleus, and promoter activity is enhanced, which contributes to high antibody production. Conceivable.
  • mRQ 3 'primer and a microRNA-specific primer derived from the expected APES sequence APES 40-61 5' primer or APES 71-91 5 'primer
  • positive control U6 snRNA QPCR reaction 95 ° C 5 sec, 60 ° C 20 sec, 30 cycles
  • the PCR reaction solution was subjected to electrophoresis on a 3% agarose gel after purification. As shown in FIG. 16, a band of the desired size was observed in the PCR reaction using APES 40-61 5 ′ primer and U6 snRNA 5 ′ primer.
  • APES 40-61 As shown in lanes 1, 2 and 3, APES 40-61 (AAGTACCAAAATAATTACCAAC: SEQ ID NO: 10) 22 bases were highly expressed in MAb1 (anti-IL-6R antibody) high-producing cells.
  • the expression level of the positive control U6 snRNA (lane 4) was the same level in all cells, and the presence of APES 71-91 (CATATACAACATTTACAAGAA: SEQ ID NO: 15) was not confirmed (data not shown ), APES 40-61 (22 bases), whose sequence is conserved across species, was considered to contribute to higher antibody production as microRNA.
  • the average cell reaching density of APES165 strongly expressing cells was (11.5 ⁇ 1.7) ⁇ 10e6 cells / mL, and ALT1 strongly expressing cells (8.9 ⁇ 1.8) Highly proliferating cells over x10e6 cells / mL were obtained.
  • APES strong expression cells 4.4 ⁇ 0.6 g / L
  • ALT1 strong expression cells 4.0 ⁇ 0.6 g / L
  • DXB11 / before introduction TAUT / MAb1 cell Since it became higher than 3.4 g / L, it was shown that the APES strong expression effect acts positively independently of the TAUT strong expression effect (FIG. 18).
  • the positive effect of APES strong expression is remarkable in 1L-Jar fed-batch culture, and when comparing the high-proliferation cells in shaker fed-batch culture, APES strong-expressing strain is the most highly proliferated, and 5.
  • Example 2 of high production of antibody-producing cells by strong expression of APES 2 As in Reference Example 3, plasmids expressing the 5 ′ partial sequence of the AI462015 transcript were introduced into MAb1-strongly expressing DXB11s cells, and antibody production potentials were compared.
  • APES4-168 APES165
  • an expression unit of APES4-68 SEQ ID NO: 5
  • APES69-133 SEQ ID NO: 6
  • APES 4-68 showed a significant difference of p ⁇ 0.05 and APES69-133 with a significant difference of p ⁇ 0.01 (t test P ⁇ 0.001, Figure 21).
  • FIG. 22 shows to which region of the mouse AI462015 transcript each partial sequence having APES activity identified in Reference Example 3 and this Reference Example corresponds.
  • the partial sequence showing APES activity contains 23 or more bases of Nfkbia complementary sequence.
  • the present invention is applicable to recombinant polypeptide-producing cells such as all antibodies.

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Abstract

　本発明の課題は組換えタンパク質生産に使用される宿主細胞として有用な、導入遺伝子を安定的に高発現し、安定に増殖する細胞株を樹立することである。　本発明により、細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入することを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法が提供される。

Description

改変宿主細胞の樹立方法
　本発明は、培養動物細胞を用いた組換えタンパク質の製造に関し、より詳細には、目的のタンパク質を効率良く製造できるような宿主細胞を樹立する技術に関する。
　遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、原核細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。
　近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が輩出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
　従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。
　宿主細胞に、目的のタンパク質の遺伝子に加えて、他の構造遺伝子を導入して高い発現量で発現させることにより、目的のタンパク質の生産効率を向上させる技術が知られている。
　例えば、膜輸送タンパク質であるタウリントランスポーター（TauT）遺伝子を高発現し、且つ所望のタンパク質をコードするDNAが導入された細胞を培養することを含む、タンパク質の製造方法が開示されている（特許文献１：WO2007/119774、特許文献２：WO2009/051109）。
　また、タウリン合成経路の酵素であるシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（CSAD）遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献３：WO2008/114673）。
　また、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT)遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献４：WO2009/020144）。アラニンアミノトランスフェラーゼはアラニンからグルタミン酸を生成させる酵素であり、ヒト肝細胞に含まれる酵素GTP(グルタミン－ピルビン酸トランスアミナーゼ）としても知られている。
　また、Bicarbonateトランスポーター機能を有するアニオンエクスチェンジャー（AE)の遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献５：WO2009/054433）。
　さらに、CSADとTauTの共発現、ALTとTauTの共発現、BicarbonateトランスポーターとCSAD、又はBicarbonateトランスポーターとALTの共発現の結果、より一層所望のタンパク質の生産量が増加することも開示されている（特許文献３-５）。
　しかしながら、本発明者らは、今までの研究から、２種類の外来遺伝子を宿主細胞に導入する場合、其々単独で導入するとその遺伝子が安定的に発現した細胞株が樹立できる場合であっても、当該２種類の外来遺伝子を共に安定的に高発現させた細胞株が樹立できない場合があった。この場合、少なくとも一方の当該外来遺伝子と同じ遺伝子若しくはカウンターパート遺伝子の宿主細胞での発現量がqPCRで検出限界以下である場合、２種類の遺伝子を共に安定的に高発現させた細胞株が樹立できないことを経験した。特に、同じ機能を有する蛋白質の遺伝子若しくは同じ代謝系反応に関与する酵素の遺伝子、たとえば、２種類の膜輸送タンパク質を共に高発現させた宿主細胞や、２種類の酵素を共に高発現させた宿主細胞の樹立は不可能であった。また、GlycArt社の２種類の糖鎖関連酵素遺伝子は宿主細胞において発現しているが、さらに高発現させた宿主細胞由来の抗体産生細胞は、酵素遺伝子発現が不安定なため、抗体のアフコシル含量が期待される範囲を逸脱する事例がみられた。
　このように、異なる2種類以上の遺伝子を高発現させることには、困難が伴うことが多い。
WO2007/119774 WO2009/051109 WO2008/114673 WO2009/020144 WO2009/054433
　本発明は、組換えタンパク質生産に使用される宿主細胞において、発現が困難な遺伝子を安定的に高発現させるための新規な技術を提供する。また、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞株を樹立する技術も提供する。
　本発明者らの研究グループは、以前、タンパク質をコードしない核酸配列であって、宿主細胞内でRNAとして発現することにより、NfkBia（nuclear factor κB inhibitor α、又はI-κＢ（inhibitor-κＢ））の発現を制御し、組換え抗体等のタンパク質の産生能を向上させる機能を有する特定の核酸配列を見出した（PCT/JP2012/058577（WO2012/137683））。本発明者らは、そのような機能を有するＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらの配列を総称してAPES(Antibody Production Enhancing Sequence）（場合により、PPES (Polypeptide Production Enhancing Sequence)とも言う)と命名した。
　APESは、NfkBia（又はI-κＢ）の発現抑制を介してＮＦ-κ（kappa）Ｂを活性化する機能性核酸であると考えられた。また、この様な機能を有する核酸として、KSHV miRNA-K1なども知られている（Lei, Xiufen et al., Nat. Cell. Biol.,12(2), p193-199, 2010）。
　今回、本発明者らは、APESの新たな用途を見出した。
　すなわち、本発明者らは、APESが、（１）通常の細胞では発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の構築や、（２）通常の細胞では樹立が困難な異なる２種以上の遺伝子を安定的に高発現させた細胞の構築を可能にするような、導入遺伝子を安定的に高発現させる機能を持つことを見出した。
　したがって、本願は、APES遺伝子を宿主細胞に導入することにより、発現困難な外来遺伝子若しくは発現が不安定な外来遺伝子を、当該細胞内で安定的に高発現させる方法を提供する。
　また、本願は、APES遺伝子を宿主細胞に導入することによる、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞の樹立方法を提供する。
　APES遺伝子は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA（タンパク質に翻訳されないRNA）をコードするDNAである。
　本願発明の要旨は次のとおりである。
（１）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
（２）2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする、（１）の方法。
（３）同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、（２）の方法。
（４）類似の機能を有するタンパク質が、トランスポーターまたは代謝酵素である（３）の方法。
（５）細胞に２種以上のトランスポーター（TauTとAE1）の遺伝子が導入される、（１）～（４）の方法。
（６）細胞に２種以上の代謝酵素（ピルビン酸代謝経路の酵素、ALT1とPC）の遺伝子が導入される、（１）～（４）の方法。
（７）細胞にTauT及び２種の代謝酵素の遺伝子が導入される、（１）～（４）の方法。
（８）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
（９）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
（１０）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む３０塩基長までの低分子RNAである、（１）～（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１１）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む５６１塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、（１）～（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１２）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む５６１～１５７９塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、（１）～（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１３）１９～２５塩基長の連続する配列が、配列番号２で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、（１０）から（１２）の方法又は細胞。
（１４）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列を有する、（１）～（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１５）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、（１）～（８）の方法、又は（９）の細胞：
（ａ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列；
（ｂ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列；
（ｃ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
（ｄ）上記（ｃ）の配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列。
（１６）細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、（１）～（８）の方法又は（９）の細胞。
（１７）所望のタンパク質が抗体である（１６）の方法又は細胞。
（１８）上記（１）に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
　細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
　細胞に、１番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な２番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
　１番目と２番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目と２番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
（１９）上記（１）に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
　細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
　細胞に、２番目の外来遺伝子を導入すること、および
　細胞に、２番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な３番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
　１番目、２番目、および３番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目、２番目、３番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
（２０）１番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、（１８）～（２０）のいずれかに記載の方法。
　本発明により、宿主細胞中で各種の外来遺伝子を安定的に高発現させることができるようになった。したがって、本発明を利用して、通常の細胞では発現が困難なポリペプチドが医薬品として製造可能となる。また、発現が困難な抗原タンパク質の発現量を高めて、そのような抗原に対する抗体の開発が容易となる。また、本発明により、複数の遺伝子を安定的に高発現させた細胞が構築できることから、有用遺伝子を多数組み込んだ、組換えタンパク質を産生するための宿主細胞の作製が可能となる。
　また、本発明の別の態様により、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞が樹立可能となった。したがって、培養動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産において、そのような細胞を宿主として利用すれば、目的のタンパク質を効率良く生産可能である。
図１は、同定されたAI462015転写産物の配列およびマウスゲノムでの位置を示している。（参考例１） 図２は、CHO-DG44細胞にMab1(抗IL-6レセプター抗体)を高発現させた抗体産生細胞の継代培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２） 図３は、CHO-DXB11s細胞にMab2(抗グリピカン３抗体)を高発現させた抗体産生細胞の継代培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２） 図４は、Mab2(抗グリピカン３抗体)産生細胞の１Ｌジャー流加培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２） 図５は、Mab2産生細胞の1Lジャーの流加培養後期１３日目におけるAI462015転写産物の発現強度の昂進を示している。（参考例２） 図６は、Mab1(抗IL-6レセプター抗体)産生ポテンシャルの低かった細胞の１Ｌジャー流加培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２） 図７は、転写産物AI462015(437p)の一部配列434bpの発現プラスミドである。（参考例３） 図８は、転写産物AI462015(437p)の一部配列165bpの発現プラスミドである。（参考例３） 図９は、コントロールとしてハイグロマイシン耐性遺伝子のみを発現させたプラスミドである。（参考例３） 図１０は、転写産物AI462015(437p)の一部配列の強発現によってMab1産生量が増加することを示している。（参考例３） 図１１は、抗体高産生細胞での転写産物AI462015の強発現とNfkBia発現抑制を示している。（参考例４） 図１２は、NfkBia発現定量に用いたプローブセットを示している。（参考例４） 図１３は、抗体高産生細胞でのNfkBia発現抑制の定量結果を示している。（参考例４） 図１４は、マウスMCMV IE2プロモーター上（配列番号23）の８つのNfkB結合部位（下線部）を示している。（参考例４） 図１５は、microRNA発現の解析法の概略である。（参考例５） 図１６は、抗体高産生細胞で高発現していたmicroRNA由来のPCR産物を示している。（参考例５） 図１７は、pHyg-TAUT発現細胞に転写産物AI642048(437p)の一部配列165bpを共発現させたプラスミド pPur-APES165　および　ALT1を共発現させたpPur-ALT1である。（参考例６） 図１８は、ＡＰＥＳ強発現による細胞高増殖、抗体高産生効果を示したシェーカー流加培養の結果である。（参考例６） 図１９は、ＡＰＥＳ強発現による細胞高増殖、抗体高産生効果を示したL-Jar流加培養の結果である。（参考例６） 図２０は、APES165強発現宿主候補細胞（９株）のＡＰＥＳ発現量と生細胞密度の相関を示している。（参考例６） 図２１は、転写産物AI462015(437p)の一部配列APES165のさらに部分配列の強発現によってMab1産生量が増加することを示している。（参考例７） 図２２は、図２１で抗体高産生効果のあったAPES165のさらに部分配列がNfkbia相補配列を含むことを示している。（参考例７） 図２３は、AI462015がマウスNfkbia mRNAの相補鎖であることを示している。(参考例１） 図２４は、AI462015の相同配列がＣＨＯ－Ｋ１細胞ゲノムに存在することを示している。（参考例１） 図２５ａは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）図２５ｂは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１） 図２５ｃは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）図２５ｄは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１） 図２５ｅは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１） DXB11/TAUT/APES (DTP)細胞の樹立。（実施例１） ハムスターTAUT、ヒトALT1、及びNfkbia のmRNA発現レベルを示す。（実施例１） DXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) 細胞の樹立。（実施例１） DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)細胞の樹立。（実施例１）。 DXB11/TAUT/ALT1 (DTL)細胞にヒトPC発現プラスミドpNeo-PCを導入したが、DXB11/TAUT/ ALT1/PC (DTLC)は樹立されなかった。（実施例１） DXB11(dhfr-)及びDT宿主の倍加時間。（実施例２） 各種の遺伝子の強制発現による改変宿主の作製。（実施例２） 改変宿主の倍加時間。（実施例２）
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　（１）APES(Antibody Production Enhancing Sequence）
　APESは、ＮＦ-κＢの抑制タンパク質であるI-κＢを不活性化する核酸分子であり、より具体的には、I-κＢの制御サブユニットであるI-κＢα（NfkBia）の遺伝子発現を抑制する核酸分子である。そのような核酸分子の本体は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAであるが、APESは、non-coding RNA自体、若しくはそのRNAをコードするDNA又はそれらの配列の総称である。
　あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaの遺伝子であるDNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。そのような核酸分子は、NfkBia遺伝子DNAまたはmRNAに結合してその発現を阻害することができると思われる。APESは、例えば、NfkBiaのmRNAにＲＮＡ干渉する分子である。
　あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaの遺伝子DNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し得る配列を含む、二本鎖RNA（dsRNA）、または短いdsRNAであるsiRNA、もしくは一本鎖に解離したsiRNA、またはshRNA、アンチセンスDNAもしくはRNA、microRNA（miRNA）またはmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。
　あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBia遺伝子DNAまたはmRNAの相補配列からなる塩基配列、またはそのような相補配列を配列の一部に含む塩基配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
　あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBia遺伝子DNAまたはmRNAの部分配列またはそのような部分配列の相補配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
　たとえば、APESは、標的であるNfkBia mRNAの一部に相同または相補的な配列を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであることができる。そのようなオリゴヌクレオチドの例としては、NfkBia mRNA相補鎖の１９～２５塩基に相当する配列、又は当該配列と一塩基を除き同一配列を持ち、且つNfkBiaの発現を抑制する効果を有する低分子RNAが挙げられる。ここで、低分子RNAとは、Small non-coding RNA (snRNA)を意味しており、snRNAにはmiRNAが含まれる。
　あるいは、APESは、長鎖のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよく、例えばNfkBiaの遺伝子DNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し得る配列を含む長さ５６１ヌクレオチド長(561 mer)までの配列からなり、且つNfkBiaの発現を抑制する効果を有するものであることができる。あるいは、APESは、さらに長鎖（数百～数十万ヌクレオチド）のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。例えば、APESは２００－１０万ヌクレオチド長、あるいは、３００～３０万ヌクレオチド長の核酸分子または配列であることができる。APESは、NfkBiaのmRNAの一部に相補的な配列（例えば、上述のsnRNA配列）を含む、５６１～１５７９塩基長、若しくは５００～１０００塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。
　塩基対形成により結合し得る配列とは、完全に対合する（すなわち100％相補的である）ものに限られず、機能に支障のない範囲で不対合塩基の存在も許容される。あるいは、APESの形態によっては、部分的な相補性がむしろ好ましい。したがって、例えば、NfkBiaの非翻訳領域を含む遺伝子DNAまたはmRNAに少なくとも70％、より好ましくは80％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％相同であるような配列またはその相補配列も、「塩基対形成により結合し得る配列」に含まれる。例えば、561 mer若しくは500 merのmRNA型ノンコーディングRNAについて少なくとも90％相同の配列には、塩基の挿入、欠失、または点突然変異による１～５０個（若しくは561 merの場合は１～５６個）のミスマッチ塩基を含む変異配列であって、その宿主細胞中での発現に伴い、抗体等の組換えポリペプチドの産生能が増大する、或いは、NfkBiaの発現を抑制する機能を有するものが包含される。よって、例えば70％以上の相同性のような、ある程度の配列類似性を有する、宿主細胞とは異なる生物種由来のNfkBiaオルソログ（異種間相同遺伝子)由来の配列もAPESとして利用可能であると思われる。
　あるいは、塩基対形成により結合し得る配列とは、細胞内のような条件でNfkBiaのmRNAと結合し得る配列を包含する。そのような配列は、例えば、高度にストリンジェントな条件として当業者に公知の条件下でハイブリダイズし、且つ所望の機能を有する配列を含む。高度にストリンジェントな条件の一例は、ポリヌクレオチドとその他のポリヌクレオチドとを、６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの断片化した変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、４２℃のハイブリダイゼーション温度で１２～１６時間インキュベートすること（ここで一方のポリヌクレオチドが、膜のような固体表面に付着させてあってもよい）それに続いて、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液を用いて42℃以上の至適温度で数回洗浄することである。その他の具体的な条件については、Sambrook等「Molecular Cloning: A Laboratory Manual第３版」Cold Spring Harbor Laboratory Pr；および、Ausubel等「分子生物学実験プロトコール」丸善、など多数の当業者に周知の実験マニュアルを参照されたい。
　APESの別の一態様は、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaのmRNA３’側非翻訳領域の部分配列に相同または相補的な配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
　後述の参考例において説明するように、本発明者らは、培養ＣＨＯ細胞において抗体産生能と相関して発現量が高くなっているmRNA型ノンコーディングRNAを見出した。このRNAは、マウスゲノム中の437塩基からなる公知配列（図１、GenBank AccessionID:AI462015、配列番号１）の転写産物として同定された。AI462015の配列およびマウスゲノム上での位置が図１に示されている。AI462015の転写産物である437塩基はマウスNfkBia mRNA 3’側 非翻訳領域（513塩基）の相補鎖に相当する（図２３）。さらに、本発明者らは、AI462015由来の一部の配列を有する核酸分子を宿主細胞に導入して発現させることにより、所望のポリペプチドの生産量を増加させることができることを見出した。
　上述のAI462015由来の配列またはその一部の配列は、マウス、ハムスター等のげっ歯類のみならず、ヒトにおいても保存されており、他の哺乳動物や、魚類、昆虫等の動物においても保存性が高い配列と考えられる。従って、AI462015由来の配列またはその一部の配列に対応する各種動物細胞の由来のNfkBia mRNA 3’側 非翻訳領域の部分配列若しくはその相補配列も本発明のAPESの配列として使用できる。
　APESの一つの具体例は、マウスAI462015由来の一部の配列、あるいはそのような部分配列において１～数個の塩基が置換、欠損又は付加された配列を有する。特に、5’側4番目のGから168番目までのCまでの塩基配列からなる１６５塩基のDNA配列（配列番号２、APES165）、もしくはその相補（アンチセンス）DNA配列またはこれらのDNAから転写されるRNA配列を含む配列、またはこの配列中の任意の長さの部分配列が挙げられる。あるいは、5’側4番目のGから3’末端のTまでの塩基配列からなる４３４塩基のDNA配列（配列番号３、APES434）、もしくはその相補（アンチセンス）DNA配列またはこれらのDNAから転写されるRNA配列を含む配列、またはこの配列に由来する任意の長さの部分配列が挙げられる。マウスAI462015の配列に対応するヒト、ハムスター、ラット等の哺乳類由来の配列を含む配列若しくはそれらの部分配列、あるいはそのような部分配列において１～数個の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列も含まれる。
　一態様において、APESは、AI462015中の5’側4番目から133番目までの塩基配列（配列番号４、APES130）またはこの配列由来の一部の配列を有する。例えば、5’側4番目から68番目まで（配列番号５、APES4-68）、または69番目から133番目まで（配列番号６、APES69-133）のDNA配列もしくはその相補DNA配列またはこれらのDNAから転写される配列が挙げられる。
　一態様において、APESは、AI462015中の5’側40番目から91番目までの５２塩基（配列番号７）の配列、または該５２塩基が任意の位置で切断された一部配列に由来する配列を有する。例えば、前半部分（APES40-68の２９塩基、もしくはAPES40-63の２４塩基、もしくはAPES40-61の２２塩基）または後半部分（APES69-91の２３塩基）のDNA配列もしくはその相補DNA配列（それぞれ配列番号８～１１に相当）またはこれらのDNAから転写される配列が挙げられる。
　上述の５２塩基は、一塩基を除いてラットNfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域の相補鎖と同一配列である。また、その5’側の24塩基(APES40-63、配列番号９)はヒトNfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域と同一配列である。また、5’側の22塩基（APES40-61、配列番号１０：AAGTACCAAAATAATTACCAAC）はラット、アカゲザル、イヌ、ウマなど種を超えたNfkBia mRNAの3’側非翻訳領域の相補鎖と同一配列である。NfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域に相補的な一部の配列を宿主細胞中で発現させることでRNAi効果が期待される。たとえば、上記52塩基中の19～25塩基に相補的な配列を有するRNAが、microRNA（miRNA）としてNfkBiaのmRNAの非翻訳領域に作用することにより、翻訳が阻害される可能性がある。
　あるいは、APESは、AI462015中の5’側７番目から91番目までの８５塩基（配列番号２９）の配列、または該８５塩基が任意の位置で切断された一部配列に由来する配列を有する。上記８５塩基中の19～25塩基に相補的な配列を有するRNAが、microRNA（miRNA）としてNfkBiaのmRNAの非翻訳領域に作用することにより、翻訳が阻害される可能性がある。
　一態様において、APESは21塩基のsiRNAサーチで見出される配列を有する。例えばAI462015中の８４番目から１０４番目（配列番号１２、APES84-104）、９９番目から１１９番目（配列番号１３、APES99-119）、１０１番目から１２１番目（配列番号１４、APES101-121）のDNA配列に相補的な配列を含むmiRNA配列である。上述のAPES 69-133中の７１番目から１１２番目の配列（配列番号１６）がGeneChip上で定量されており、実際に高発現している領域であることから、APES84-104がmiRNAとして機能する可能性が高いと思われる。
　別の一態様において、APESはNfkBiaの発現を抑制する公知のnon-coding RNAであってもよい。そのような核酸分子の例として、KSHV（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) miRNA-K1が挙げられる。（配列情報はX Cai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 April 12; 102(15): 5570-5575などを参照）
　また、APESの構造的又は機能的な特徴に基づき、新たにAPESとしての活性を有する核酸分子を化学合成あるいは生物源から単離することが可能である。APESの構造的特徴は、標的であるNfkBia mRNAの一部に相補的な配列を含む核酸分子であることである。核酸分子の形態は、いかなる形態でもよく、DNA、DNAの転写産物、mRNA、cDNAであるか、exosome RNAであるか、化学合成一本鎖RNAであるか、化学合成二本鎖RNAであるかなどを問わない。機能的特徴は、その宿主細胞中での発現に伴い、抗体等の組換えポリペプチドの産生能が増大していること、或いは、NfkBiaの発現が抑制されていることである。
　生物源からAPESを単離する場合には、如何なる生物由来でもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、ウシ、豚、ヤギ、などの家畜類、ニワトリなどの鳥類、ゼブラフィッシュなどの魚類、ハエ等の昆虫類、線虫類などの動物由来のAPESが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のAPESであることが好ましく、例えば、APESを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト、マウス或いはハムスター由来のAPESであることが好ましい。
　このような核酸分子は、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、抗体等の組換えポリペプチドを高産生している培養細胞より全RNAを調製し、本発明の核酸配列（例えば、配列番号２のAPES165）に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、APESとしての特徴を有するcDNAを増幅させることにより調製すればよい。また、抗体等の組換えポリペプチドを高産生している培養細胞より低分子ＲＮＡを調製後にｃＤＮＡライブラリーを作製し、クローニングされたｃＤＮＡの塩基配列に基づき、NfkBia mRNAに相補的な部分配列を含む低分子ＲＮＡを得ることができる。cDNAライブラリーは、microRNA（miRNA）などの低分子ＲＮＡを調製後に、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により構築することも可能である。
　また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、APESが発現されるゲノムDNAを単離することができる。
　具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のAPESを発現する可能性のある細胞、組織などから、全RNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製したのち、RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 等を使用して全RNAをさらに精製する。
　得られた全RNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
　得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
　また、得られたDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、site-directed mutagenesis 法による一塩基変異導入等が挙げられる。このようにして改変された配列も、APES活性を有するものである限り、本発明の範囲に包含される。ここで、「APES活性を有する」とは、宿主細胞内で発現することによってNfkBia（I-κＢα）の発現を抑制する機能を有することを言う。
　本明細書中では、APES活性を有する核酸分子を本発明の核酸分子と呼ぶことがある。
　（２）APESの宿主細胞への導入及び発現
本発明は、APES、すなわち、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA、の遺伝子を宿主細胞に導入することを含み、さらに、APESを発現させること、好ましくはAPESを強発現させることを含む。
　APESを強発現するとは、もとの細胞と比較してAPESの発現量が増加しているという意味である。もとの細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。具体例としては、後述の参考例に沿って説明するならば、AFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を使ったGeneChip実験において、抗体遺伝子導入前のもとの細胞はAI462015のシグナル値が２０００以下のものであり、これと比較してAPESの発現量が増加しているとは、例えば、AI462015のシグナル値が２倍以上となることである。
　APES遺伝子が導入され、APESを強発現する細胞は、内因性あるいは外来のAPESを細胞内に含む。APESを強発現する細胞として、例えば、APESが人為的に導入された細胞を挙げることができる。
　APESが人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、APESをコードするDNA配列をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。
　さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性APESが活性化され、その結果、APESが強発現した細胞もAPESが人為的に導入された細胞に包含される。
　内因性APESの典型的な例は、宿主細胞のゲノム上にコードされたDNA配列としてのAPESである。また、本発明においては、遺伝子活性化技術によらず、例えば、抗体遺伝子導入後に何らかの要因で内因性APESの転写が活性化して、強発現した細胞も利用可能である。
　（３）発現ベクター
発現ベクターは、宿主細胞にAPESを強発現させるため、及びトランスポーターや代謝酵素等の外来のポリペプチドを発現させるために有用である。また、医薬品の有効成分や抗原として有用な外来のポリペプチドの発現にも、発現ベクターが使用される。
　本発明において使用可能な発現ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
　外来のポリペプチドを発現させるための発現ベクターは、該ポリペプチドをコードするDNAおよび当該DNAの発現を推進可能な発現制御配列を含む。同様に、APESを発現させるための発現ベクターは、APESをコードするDNAおよび当該DNAの発現を推進可能な発現制御配列を含む。単一のベクターが、一種以上のポリペプチドおよびAPESを発現させるように構築されてもよい。遺伝子活性化技術を用いて、例えば宿主ゲノムの一部であるようなAPESまたはポリペプチド遺伝子を活性化する場合、そのような宿主細胞由来のDNAの発現を促進する発現制御配列が導入されてもよい。
　発現制御配列の例としては、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちATG）を含むコザック配列、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等があり、ベクターの構築は当業者が適宜行うことができる。
　発現制御配列は、使用する動物細胞において遺伝子の転写量を増大させることが可能なプロモーター／エンハンサー領域を含むことが好ましい。所望のポリペプチドをコードする遺伝子の発現に関与するプロモーター／エンハンサー領域は、NF-κB結合配列を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の哺乳動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましい。また、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　（４）宿主細胞
本発明において用いる宿主細胞は、特に限定されることなく、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、大腸菌、枯草菌などの原核細胞など如何なる細胞でもよく、好ましくは、昆虫、魚、両生類、爬虫類、哺乳類由来の動物細胞であり、特に哺乳動物細胞が好ましい。哺乳動物細胞の由来としては、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、その他が挙げられ、ヒト、げっ歯類であることが好ましい。さらに本発明の細胞としては、通常ポリペプチドの発現によく用いられる、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞などの哺乳動物培養細胞が好ましい。
　医薬品や抗原として有用なポリペプチドの大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220 ）やCHO K-1 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。
　上記のCHO細胞としては特に、DG44株、DXB-11株、K-1、CHO-Sが好ましく、特にDG44株及びDXB-11株が好ましい。
　宿主細胞は、例えば、医薬品や抗原のような所望のポリペプチドの製造のための産生系として使用することができる。そのような細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であっても、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞であってもよいが、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞が好ましい。
　所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞の一例は、少なくとも所望のポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターがトランスフェクトされている宿主細胞である。
　さらに、本発明において、「ＤＮＡ（あるいは遺伝子）を導入した」細胞とは、外来性ＤＮＡがトランスフェクトされた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する。
　APESが人為的に導入された細胞を用いて所望のポリペプチドを製造する場合、APESと所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入の順序は特に制限されず、APESを導入した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した後にAPESを導入してもよい。又、APESと所望のポリペプチドをコードする遺伝子を同時に導入してもよい。
　ベクターを用いる場合、APES及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　（５）外来遺伝子
本発明では、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、発現困難な外来遺伝子若しくは発現が不安定な外来遺伝子を、細胞内で安定的に高発現させることができる。
　宿主細胞を所望のポリペプチドの製造のために使用する場合、製造の目的である所望のポリペプチドの遺伝子に加えて、それ以外の外来遺伝子を導入して、細胞内で安定的に高発現させることができる。
　所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された形質転換細胞内で、外来遺伝子が発現することによって、所望のポリペプチドの生産量が増加することが好ましい。そのような外来遺伝子としては、タウリントランスポーター（TauT）、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（CSAD）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT)、アニオンエクスチェンジャー（AE)、ピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）、X-box binding protein (XBP-1)等をコードするDNAが挙げられる。
　本発明では、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、所望のタンパク質の遺伝子以外の複数の外来遺伝子を当該宿主細胞に導入して安定的に発現させることができる。宿主細胞中で、所望のポリペプチドの遺伝子に加えて、それ以外の特定の2つ以上の外来遺伝子が発現することによって、所望のポリペプチドの生産量が増加することが好ましい。その結果、組換えタンパク質生産に適した細胞株を樹立することが可能となる。
　そのような2つ以上の外来遺伝子は、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする遺伝子であることができる。つまり、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、所望のポリペプチドの遺伝子以外の、同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子を同時に安定的に発現させることが可能となる。したがって、「同時に安定的に発現することが困難」とは、宿主細胞中にAPESが導入されていない状態では、同時に安定的に発現することがない、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の組み合わせである。
　ここで、「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」とは、APESを導入していない動物細胞、好ましくは所望のタンパク質の遺伝子を導入する前の宿主細胞に、其々単独で導入するとその外来遺伝子が安定的に発現する細胞株が樹立できるが、これらの外来遺伝子を2つ以上導入する処理を行った後、薬剤等による選抜処理を行っても、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を同時に発現する細胞が得られないような遺伝子を言う。この場合、少なくとも一方の当該外来遺伝子と同じ遺伝子若しくはカウンターパート遺伝子の、当該外来遺伝子導入前の宿主細胞における発現量が、qPCRで検出限界以下であることが好ましい。
　また、本発明の細胞が、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入することができた、所望のタンパク質を産生するための宿主細胞であっても、所望のタンパク質の遺伝子を導入した後、少なくとも２回、MTX等の薬剤処理により所望のタンパク質の遺伝子増幅のための選抜処理を行う際に、当該選抜処理前の当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子の発現量が50%未満、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10％以下、最も好ましくは発現が消失してしまうとき、本発明においてこの様な遺伝子を「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」と言う。
　また、別の側面としては「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」とは、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入し、APESを導入していない細胞を選抜した時の、当該外来遺伝子の発現量に比して、当該細胞を少なくとも15世代継代培養を行った後、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子の発現量が50%未満、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10％以下、最も好ましくは発現が消失してしまう遺伝子を言う。
　「同時に安定的に発現する」とは、具体的には、本発明の細胞が所望のタンパク質を産生するための宿主細胞である場合、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した、APESを含む宿主細胞に、所望のタンパク質の遺伝子を導入した後、少なくとも２回、MTX等の薬剤処理により所望のタンパク質の遺伝子増幅のための選抜処理を行っても、当該選抜処理前の当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の発現量が其々50%以上、好ましくは70%以上の発現量が維持されている状態を言う。
　また、別の側面としては「同時に安定的に発現する」とは、2つ以上の外来遺伝子を導入した細胞を選抜した時の、当該外来遺伝子の発現量に比して、当該細胞を少なくとも15世代継代培養を行った後においても、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の発現量が其々50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80％以上の発現量が維持されている状態を言う。
　本発明において、上述の如く、２つ以上の外来遺伝子が「同時に安定的に発現している」状態が維持されている細胞株を、樹立された細胞株という。
　本発明における「同時に安定的に発現することが困難なタンパク質」は、類似の機能を有するタンパク質に属することができる。同時に安定的に発現することが困難な、類似の機能を有するタンパク質の組み合わせの例としては、２種類以上の膜輸送タンパク質若しくはそれが機能するために必要なアクセサリープロテインや、２種類以上の酵素タンパク質、好ましくは同一の代謝経路に関与する代謝酵素や、２種類以上の転写因子の組み合わせが挙げられる。
　あるいは、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質の組み合わせは、２種類以上の膜輸送タンパク質と１若しくは２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせであってもよい。あるいは、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質の組み合わせは、１若しくは２種類以上の膜輸送タンパク質と２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせであってもよい。
　膜輸送タンパク質は、生体膜にあって、物質の輸送を仲介するタンパク質を指し、輸送体（トランスポーター）、担体（キャリヤー）、透過酵素（パーミアーゼ）等ともいわれる。細胞膜の重要な役割として各種イオンや栄養素等を選択的に透過させる機能が有り、その機能をつかさどる膜タンパク質である。膜輸送タンパク質には、糖やアミノ酸等の有機物質の輸送を仲介するタンパク質、並びにイオン輸送体であるイオンポンプ及びイオンチャンネルも含まれる。各種の糖若しくはアミノ酸の輸送体（トランスポーター、パーミアーゼ）及びイオン輸送体が精製されており、それらの遺伝子が公知である。
　本発明において、例えば、類似の機能を有するタンパク質の遺伝子は、２種類以上のトランスポーター遺伝子の組み合わせであることができる。２種類のトランスポーターの例としては、TauTとAE1が挙げられる。
　類似の機能を有する酵素タンパク質の代表例は、複数の代謝酵素の組み合わせである。例えば、類似の機能を有する酵素タンパク質の遺伝子は、同一経路の２種類以上の代謝酵素遺伝子であることができる。そのような代謝酵素は、同一経路内の連続した反応を促進する２種以上の酵素であってもよい。例えば、同一経路の代謝酵素は、アミノ酸の分解反応を触媒する酵素であることができる。また、例えば、代謝酵素は、ピルビン酸代謝経路の酵素であることができる。２種以上のピルビン酸代謝経路の酵素の例は、ALT1とPCであることができる。
　あるいは、類似の機能を有する酵素タンパク質の例は、複数の糖転移酵素の組み合わせであってもよい。
　また、１若しくは２種類以上の膜輸送タンパク質と２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせの例は、TauT及び２種の代謝酵素であることができる。
　上述したように、宿主細胞にAPESを人為的に発現させることは、細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を人為的に導入して、該遺伝子を発現させることより実現できる。2つ以上の外来遺伝子の発現も、同様に、細胞にそれらの外来遺伝子を人為的に導入して、該遺伝子を発現させることより実現できる。
　宿主細胞への外来性DNA（ベクターに組み込まれていてもよい）の導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、Nucleofection法（amaxa社）、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　さらに、本発明において、「ＤＮＡ（あるいは遺伝子）を導入した」細胞とは、外来性DNAがトランスフェクトされた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する。
　同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来タンパク質の遺伝子を宿主細胞に導入して安定的に発現させるには、２番目の外来遺伝子を導入するよりも前に、宿主細胞にあらかじめAPESを導入しておくことが好ましい。ベクターを用いる場合、APES及び２番目以降の外来遺伝子の導入は、複数のベクターを用いて別々に導入することが好ましい。
　一方、1つ目の外来遺伝子とAPESの導入の順番には特に制限がなく、APESを導入した後に1つ目の外来遺伝子を導入してもよいし、1つ目の外来遺伝子を導入した後にAPESを導入してもよい。又、APESと1つ目の外来遺伝子を同時に導入してもよい。ベクターを用いる場合、APES及び1つ目の外来遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　（６）組換えタンパク質生産のための細胞株
本発明では、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA（APES）の遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることにより、継代培養を繰り返しても複数のタンパク質をコードする外来遺伝子が安定的に高発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株を得ることができる。
　また、APESの遺伝子を宿主細胞に導入することにより、倍加時間が速く、安定に増殖することができる、組換えタンパク質生産のための細胞株を得ることができる。そのような細胞は、APESに加えて、さらに別の外来遺伝子が導入されて安定的に高発現する細胞であってもよい。
　本発明で提供される細胞の例としては、後述の実施例では、先ずTauT高発現な細胞にAPES165（配列番号２： gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacac）を導入した細胞を樹立し、次いで、当該細胞にさらに別のトランスポーター遺伝子を導入することにより、協調的に機能する２種のトランスポーターが共に安定的に高発現する細胞が樹立されている。また、先ずTauT高発現な細胞にAPES165を導入した細胞を樹立し、次いで、当該細胞にさらに２種のピルビン酸代謝経路の酵素の遺伝子を導入することにより、TauT並びにピルビン酸代謝経路の連続した反応を促進する２種の酵素が共に安定的に高発現する細胞が樹立されている。これらの細胞は、組換えタンパク質生産のために好ましい性質を有するので、医薬品や抗原として有用な所望のタンパク質を生産するための宿主細胞として好適である。これらの細胞を宿主として、所望のタンパク質の遺伝子を人為的に導入したものを培養し、所望のタンパク質を産生させ、産生したタンパク質を回収することにより、当該所望のタンパク質を製造することができる。
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
　実施例１：発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の樹立
　（１）膜タンパクのTauTとAE1は細胞表面上で塩素イオンの搬入・排出を通して協同的に機能する。これまで、TauT高発現細胞のTauT機能増強のために、AE1を同時に高発現させた宿主細胞の樹立を繰り返し試みたが、薬剤選抜過程で浮遊細胞の付着化がみられ、共発現細胞は樹立されなかった。この場合、宿主細胞における元々のAE1の発現量はqPCRで検出限界以下であった。
　（２）酵素のALT1とPC（Pyruvate Carboxylase）は、アラニンからピルビン酸、ピルビン酸からオキサロ酢酸を生合成する。これまで、TCA回路へと続く代謝経路の反応を促進するために、ALT1高発現宿主細胞にPCを高発現させようとしたが、共発現細胞は樹立されなかった。この場合、宿主細胞における元々のALT1の発現量はqPCRで検出限界以下であった。
　ところが、上記２例において、２番目の遺伝子導入の前にあらかじめAPESを高発現させておくと、APESを含めて３種類以上の遺伝子を高発現する細胞が樹立された。つまり、（１）ではTauT高発現細胞にAPESを高発現させたTAUT/APES細胞を構築したのち、AE1を導入することで、TauTとAE1を高発現する高増殖なTAUT/APES/AE1細胞が樹立された。（２）においても、（１）のTAUT/APES高発現細胞からALT1が高発現なTAUT/APES/ALT1細胞を構築した後、PCを導入することで、ALT1とPCを高発現する高増殖なTAUT/APES/ALT1/PC細胞が樹立された。一方、あらかじめAPESを高発現させていないTAUT/ALT1細胞からは、ALT1とPCを高発現するTAUT/ALT1/PC細胞は樹立されなかった。
　なお、本実施例においては、宿主細胞としてCHO細胞DXB-11株を用いた。
　〔実施例１－１〕DXB11/TAUT/APES細胞の樹立
ハムスターTAUT発現プラスミドpHyg-TAUTを宿主細胞のDXB11にエレクトロポレーション法で導入し、200μg/mLハイグロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUT(taurine transporter)高発現な細胞であるDXB11/TauT (DT)が樹立された（図２６）。さらに、APES発現プラスミドpPur-APES165をエレクトロポレーション法で導入し、6 μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TAUT/APES (DTP)（図２６）が樹立された。DTP細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現、Nfkbia mRNA発現抑制が継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７）。
　〔実施例１－2〕DXB11/TAUT/APES/AE1細胞の樹立
２種のトランスポーターを共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立には困難を伴う場合がある。たとえば、宿主細胞DXB11にTAUTとAE1(anion exchanger 1)を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図２６のハムスターTAUT高発現でAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトAE1発現プラスミドpNeo-AE1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUTとヒトAE1を共に高発現している細胞であるDXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) が樹立された（図２８）。
　DTPE細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現、ヒトAE1 mRNA高発現、Nfkbia mRNA発現抑制が、継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７、図２８）。
　一方、APES導入前のDXB11/TAUT (DT)細胞にヒトAE1発現プラスミドpPur-AE1をエレクトロポレーション法で導入し、6 μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、DXB11/TAUT/AE1 (DTE)細胞は樹立されなかった。
　以上より、TAUTによるCl-イオンの排出、AE1によるCl-イオンの取り込みを介して、協調的に機能する２種のトランスポーターを共に高発現させるためには、APES高発現によるNfkbia mRNAの発現抑制が必要であると考えられる。
　〔実施例１－3〕DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC細胞の樹立
２種の酵素を共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立にも困難を伴う場合がある。たとえば、ALT1(alanine transferase)とPC(pyruvate carboxylase) を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図２６のDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトALT1発現プラスミドpNeo-ALT1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つ ヒトALT1高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1 (DTPL) が樹立されたが、さらに、DTPL細胞にヒトPC発現プラスミドpZeo-PCをエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLの Zeocin存在下で選抜することで高増殖、且つヒトPC高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)が樹立された（図２９）。
　DTPLC細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現, ヒトALT1 mRNA高発現、、 Nfkbia発現抑制、ヒトPC mRNA高発現が継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７、図２９）。
　一方、APES導入前のDXB11/TAUT (DT)細胞にヒトALT1発現プラスミドpPur-ALT1をエレクトロポレーション法で導入し、6μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つ ヒトALT1高発現な細胞であるDXB11/TAUT/ALT1 (DTL) が樹立されたが、さらに、DTL細胞にヒトPC発現プラスミドpNeo-PCをエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLの G418存在下で選抜すると、DXB11/TAUT/ ALT1/PC (DTLC)は樹立されなかった（図３０）。
　以上より、ピルビン酸代謝経路の連続した反応を促進する酵素であるALT1とPCを共に高発現させるためには、APES高発現によるNfkbia mRNAの発現抑制が必要であると考えられる。
　実施例２：倍加時間が速く、安定に増殖する細胞の樹立方法
〔実施例２－１〕倍加時間（概算値）の算出
倍加時間（概算値）は、125-mL Erlenmeyer Flaskによるシェーカー培養後、Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system (Innovatis AG, Bielefeld, Germany) によって生細胞数を測定、算出した。Viabilityが90%以上に維持された状態の個々の細胞から継代培養を開始して、初発細胞密度2×105 cells/mLからの3日間培養、あるいは初発細胞密度1×105 cells/mLからの４日間培養などによって過増殖にならないように培養を繰り返しおこない、Viabilityを90%以上に維持しながら継代間の倍加時間を算出した。遺伝子を強制発現させた改変細胞の継代培地には各種遺伝子導入に用いたハイグロマイシン等の薬剤が含まれるが、薬剤以外はDXB11(dhfr-)と同一培地を使用した。
　遺伝子導入による改変前のDXB11(dhfr-)の倍加時間（概算値）は、薬剤を含まない培地での継代培養（（Viabilityが99.5%の細胞から継代培養を7回（3日間培養を4回、4日間培養を3回））で算出したところ、27.5 ±1.7時間であった（図３１）。
　〔実施例２－２〕各種の遺伝子強制発現宿主の樹立と倍加時間
図３２に示したように、各種の遺伝子の強制発現によって改変宿主を樹立した。まずはDXB11(dhfr-)にTAUT (Taurine Transporter) の発現プラスミド（pHyg-TAUT）をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に200 μg/mL ハイグロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を２種類選抜した。さらに、継代培養時の遺伝子発現プロファイルをAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を用いたGeneChip実験で比較し、TAUT mRNAが高発現で、その他の発現プロファイルはDXB11(dhfr-)と類似していた選抜株をDT宿主とした。樹立されたDT宿主の倍加時間（概算値）は、薬剤（ハイグロマイシン）を含む培地での継代培養（（（Viabilityが90.0%以上の細胞から継代培養を１１回（3日間培養を4回、4日間培養を7回））で算出したところ、26.1 ±2.7時間であり、倍加時間はDXB11(dhfr-)に対してほぼ同等であった（図３１）。
　次に、DT宿主をさらに改変するために抗体産生細胞において発現が異常に亢進されていたAPESの一部配列APES165（特願2011-082002）を強制発現させた。DT宿主にpPur-APES165をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に6 μg/mL ピューロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を９株選抜すると、APES発現量と細胞増殖に相関 (R2=0.701)がみられた（図20）。
　TAUTとAPESが共に高発現しており、倍加時間が20.8時間と最も速かった細胞株をDTP宿主とすると、DTP宿主はいままでにない形質を獲得していた。たとえば、TAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できなかったAE1(Anion Exchanger 1)の発現プラスミド(pNeo-AE1)をエレクトロポレーション法導入、約2-3週間後に200 μg/mL G418存在下で増殖良好であった細胞を選抜すると、TAUTとAE1が共に高発現な細胞が構築された。最もAE1発現量の高かった細胞をDTPE宿主とすると、長期間培養を繰り返しても安定であり、倍加時間はDTP宿主よりも速かった(図３３、57継代、19.9 ±4.3時間)。
　次の例としては、TAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できたALT1 (Alanine Aminotransferase 1) の発現プラスミド(pNeo-ALT1)をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に200 μg/mL G418存在下で増殖良好であった細胞を選抜して、TAUTとAE1が共に高発現な細胞を構築した。ALT1発現量と細胞増殖には相関がみられるため、最もALT1発現量の高かった細胞をDTPL宿主とすると、こちらも長期間培養を繰り返しても安定であり、倍加時間はDTP宿主よりも速かった(図３３、57継代、19.8 ±4.3時間)。ALT1はAPESの強制発現に依存せずにTAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できるので、DT宿主にALT1の発現プラスミド（pPur-ALT1）をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に6 μg/mL ピューロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を選抜し、最もALT1発現量の高かった細胞をDTL宿主とすると、長期間培養を繰り返しても安定であったが、DTPL宿主との比較では増殖にばらつきがみられ、倍加時間はDTPL宿主よりも遅かった( 図３３、57継代、21.9 ±7.3時間)。
　以上の結果は、（１）APESを強制発現させることで倍加時間の速い宿主細胞を構築できること、（２）APES強発現宿主はさらに新しい遺伝子を導入することで、倍加時間のより速い細胞を構築できることを示している。このような機能をもつ核酸配列は知られていない。
　参考例
本発明者らは、以前、高い組換え抗体産生能を有する培養細胞株（CHO細胞株）を材料として、当該細胞株で発現が顕著な遺伝子について検討を行い、一つのｍRNA型ノンコーディングRNAを同定した。この転写産物はNfkBiaのmRNAの非翻訳領域の相補鎖に相当した。さらに、この転写産物中の一部の配列からなる核酸分子を組換え培養細胞中で発現させることにより、当該培養細胞の抗体産生能を顕著に向上させることを見出した。また、本発明者らは当該ノンコーディングRNAの発現が昂進された抗体高産生細胞ではNfkBiaの発現が抑制されていること、高い抗体産生能を有する培養細胞が細胞内でNfkBiaの発現を抑制していること、培養細胞内のNfkBiaの発現を制御する転写産物を高発現させることにより、抗体の生産量が増加することを見出した。
　これらの事項を、以下の参考例により説明する。
　〔参考例１〕各種遺伝子導入CHO細胞のGeneChip解析実験
GeneChip実験は、AFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を用いて通常の手順にしたがった。ただし、Hamster Arrayは商品化されていないためMouse Genome 430 2.0 Arrayを用いた。ハイブリダイゼーション条件の最適化によって、Test 3 array 上のMouse Gene１６種のプローブ中、８種のプローブでPresent Callが得られるようになり、Mouseとの塩基配列相同性が約９０%以上の場合は、Hamster転写産物の発現定量が可能になった。
　各種遺伝子を強発現させた細胞から高純度total RNAを調製したのち、total RNAとT7プロモーター配列を含むオリゴdTプライマー(T7-(T)24)を用いてcDNAを合成した。つぎに、Bio-11 CTP, Bio-16 UTPとMegascript T7 Kit(Ambion)を用いた転写反応により、cDNAからビオチンラベルcRNAを合成した。cRNAはカラム精製後、電気泳動上で18sから28s rRNAに相当する分子量が確認された高品質cRNAを断片化し、均一なサイズをもつGeneChipサンプルとした。使用までのGeneChipサンプルは、ハイブリダイゼーションサンプル溶液を加えて－８０℃で凍結保存した。サンプル溶液は使用直前に熱処理、遠心、Mouse Genome 430 2.0 Arrayにアプライし、Arrayを回転させながら４５℃のハイブリダイゼーション専用オーブンで１６時間インキュベーションした。サンプルを回収、Arrayを繰り返し洗ってStreptavidin R-Phycoerythrinで染色後にスキャンした。
　Array上の転写物（約45,000）のGeneChipシグナル値を比較することで、１Lジャー流加培養１０日目に９００ｍｇ/L以上のMAb1(抗IL-6R抗体；tocilizumab、商品名 アクテムラ)を産生するMAb1(抗IL-6R抗体)強発現 TAUT強発現 CSAD強発現DG44細胞の継代培養細胞において、発現強度が高く且つ発現昂進が著しい転写産物としてマウスゲノム上のｍRNA型ノンコーディングRNAUG_GENE=AI462015（Affymetrix MOUSE430_2, 1420088_AT）を同定した(図１：AI462015転写産物の配列)。
　AI462015は437塩基のｍRNA型ノンコーディングRNAであるが、その配列はマウスゲノム１２のNfkBia mRNA ３’側の非翻訳領域近傍（56590831- 56590397）の相補鎖上に存在する。AI462015転写産物が直接にNfkBia mRNAの非翻訳領域に作用して翻訳を阻害する可能性、あるいは437塩基の一部の配列が低分子 RNAとして機能してNfkBia mRNAを分解する可能性が考えられた。
　たとえば、AI462015配列中の５’側４０番目のAから９１番目のAを含む５２塩基の配列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA：配列番号７)は、ラット NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域(1478-1529, GENE ID: 25493 NfkBia) の相補鎖と一塩基（AI462015中の５’側６１番目のA）を除いて一致しており、さらにはAI462015の４０番目のAから６３番目のAを含む２４塩基の配列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAA：配列番号９)は、ヒト NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域の一部配列（TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT, 1490 - 1513：配列番号２４)の相補鎖でもあることから、５２塩基の一部である19-25塩基がmicroRNAとして、あるいは一部配列がアンチセンスRNAとしてCHO細胞のNfkBia mRNAに作用する可能性が予測された。
　さらに、その後のGeneBankの情報更新によって、AI462015の転写産物である437塩基はマウスNfkBia 遺伝子の3’側 非翻訳領域（513塩基）の相補鎖に相当することが明らかになった（図２３）。図２４に示したように、CHO-K1細胞のゲノム配列上にAI462015の相同配列が存在すること(配列番号25：AI462015；配列番号26-27：CHO-K1ゲノム）、さらに、抗体高産生なCHO細胞においてNfkbia の発現抑制（参考例４）がみられたことから、CHO細胞ではAI462015の相同配列が高発現されて機能するものと考えられる。
　たとえば、AI462015配列中の５’側７番目のTから９１番目のAを含む８５塩基の配列（図２３と２４の下線部、配列番号２９）(TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA)は、ラット NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域(1478-1562, GENE ID: 25493 NfkBia、配列番号３１) の相補鎖と一塩基（AI462015中の５’側７０番目のA）を除いて一致しており(Matching = 84/85、図２５ｂ)、同様に、ヒト（Matching = 75/85、図２５ａ、配列番号３０）、チンパンジー（Matching = 75/85、図２５ｃ、配列番号３２）、アカゲザル（Matching = 74/85、図２５ｄ、配列番号３３）、ウシ（Matching = 76/85、図２５ｅ、配列番号３４）でも相同性が確認された。よって、この８５塩基（Conserved Sequence 7-91）の一部である19-25塩基がmicroRNAとして、あるいは一部配列がアンチセンスRNAとして種を超えて動物細胞、若しくは哺乳動物細胞に作用すると考えられる。従って、動物培養細胞、好ましくはCHO細胞のような哺乳動物細胞のNfkBia mRNAにも作用することが予測された。
　〔参考例２〕抗体高産生細胞において発現昂進された転写産物の同定
参考例１で、MAb1(抗IL-6R抗体；tocilizumab、商品名 アクテムラ)高産生DG44細胞で転写産物AI462015の発現量が昂進されたが（図２）、異なる宿主細胞（CHO-DXB11s）に異なる抗体（MAb2：抗グリピカン３抗体；GC33（WO2006/006693参照））を高産生させた場合も同様にAI462015転写産物の発現昂進がみられた（図３）。
　図２に示したように、CHO-DG44細胞にタウリントランスポーター (TauT)遺伝子を強発現させた場合、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ(CSAD)遺伝子を強発現させた場合（data not shown）、TauTとCSADを共に強発現させた場合、いずれも転写産物AI462015の発現量は同程度であったが、TauTとCSADを共に強発現させた細胞にさらにMab1(抗IL-6レセプター抗体)を強発現させた場合は、AI462015の異常な昂進（宿主細胞の７倍）がみられ、発現量も異常に高いGeneChipシグナル値（10,000以上）を示した。コントロールのGAPDH発現強度は細胞間で同レベルであったことから、転写産物AI462015の発現昂進はMab1抗体高産生細胞に特異的であった。図３も同様であり、CHO-DXB11s細胞にMAb2(抗グリピカン３抗体)遺伝子を強発現させた場合、AI462015配列の発現昂進（TauT, CSAD, AE1強発現細胞の平均値の１３倍）はMAb2抗体高産生細胞に特異的であった。
　以上の結果は、シェーカー継代培養３日目で安定増殖している抗体高産生細胞は、AI462015配列を異常に高発現していることを示している。
　また、１Ｌジャー培養3日目の生産培養条件下においてもAI462015配列の異常な発現昂進がみられた。図４に示したように１Lジャー流加培養の１０日目に約１２００－１４００ｍｇ/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する2種の抗体高産生細胞は5,000以上の高いGeneChipシグナル値を示した。培養条件の違いから、１Lジャー流加培養３日目のシグナル値はシェーカー培養の５０％程度であったが、培養後期１３日目にAI462015配列の発現強度はシェーカー継代培養と同程度にまで昂進され、異常に高いシグナル値を示した（図５）。一方、抗体産生量の低いMAb1強発現DXB11s細胞（加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で300mg/L以下、加水分解物添加でも500mg/L以下）は、高産生化に寄与する加水分解物（Hy-Fish、Procine Lysate）を添加した条件でも、１Ｌジャー培養3日目の AI462015配列の発現昂進はみられなかった（図６）。
　図２で高いシグナル値を示したMAb1強発現TauT強発現CSAD強発現DG44細胞の抗体産生量が高かったこと（加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で640mg/L）、図３で高いシグナル値を示したMAb2強発現DXB11s細胞の抗体産生量が高かったこと(加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で640mg/L）、図６で抗体高産生化に寄与する加水分解物を加えた場合もシグナル値が昂進されなかった実験結果に基づいて、「AI462015配列の発現量が高い細胞は抗体産生ポテンシャルが高い」と考えられた。
　〔参考例３〕APES強発現による抗体産生細胞の高産生化例
AI462015配列発現量の高さが抗体産生ポテンシャルの高さと相関することを示すため、図６で抗体産生ポテンシャルの低かったMAb1強発現DXB11s細胞にAI462015配列の一部を発現するプラスミドを導入し、強発現させて抗体産生ポテンシャルを比較した。
　マウスゲノム由来の転写産物AI462015(図１、437塩基) 配列の一部（Affymetrix GeneChipのAI462015 Probe Sequenceを含む）5’側4番目のGから3’末端のTまでをAPES434、5’側4番目のGから168番目のCまでをAPES165と命名して、２種類の発現ユニットを作成した（APESとはAntibody Production Enhancing Sequenceの略称）。Kozak配列を加えた発現ユニットを合成することで、ＣＭＶプロモーター下で高発現するpHyg-APES434（図７）、 pHyg-APES165（図８）、pHyg-null（図９）を構築した。
　Amaxa社（現、LONZA社） 遺伝子導入システムNucleofectorによって、図６の抗体低産生株の MAb1強発現DXB11s細胞に発現プラスミドを導入し、９６ウェルプレート上でHygromycin(200μg/ml) を含む選択培地存在下で高増殖だった全細胞株を選抜し、２４ウェルプレート拡大後に抗体産生量を比較した。選抜された株数はそれぞれpHyg-APES434（N＝38）, pHyg-APES165（N＝60）、pHyg-null（N＝11）であり、それらの株数はAPES強発現プラスミド導入によるポジティブ効果を期待させた。１mＬ継代培地を含む24ウェルプレートでの静置培養は、培養13日目に細胞増殖がみられなかったので、抗体産生量および細胞数を測定した。抗体産生量の平均値はpHyg-APES434（44.3 mg/L）、 pHyg-APES165（41.2 mg/L）、pHyg-null（21.9 mg/L）、細胞数（平均値）はpHyg-APES434（9.27x105cells/mL）、 pHyg-APES165（11.39x105 cells/mL）、pHyg-null（7.76x105cells/mL）であり、pHyg-APES434、 pHyg-APES165導入細胞は共にコントロールのpHyg-nullに対して統計的に優位であった（t検定  P< 0.001, 図１０）。
　以上の結果は、AI462015転写産物の5’側165bpを含む核酸配列（例えば配列番号２のDNAの転写産物であるAPES165、又は配列番号３のDNAの転写産物であるAPES434）を強発現させると、細胞の抗体産生ポテンシャルが上がったことを示している。
　〔参考例４〕抗体高産生ＣＨＯ細胞におけるNfkBiaの発現抑制
参考例１で述べたように、AI462015配列はマウスゲノム１２のNfkBia 遺伝子の３’側の非翻訳領域近傍（3’側78bp）の相補鎖上に存在すること、AI462015配列に含まれる２２塩基(AAGTACCAAAATAATTACCAAC：配列番号10)はヒトNfkBia 遺伝子の３’側非翻訳領域（1492-1513）の相補鎖と同一配列であり、さらにラット、アカゲザル、イヌ、ウマなど種を超えて保存されていることからmicroＲＮＡとしてＲＮＡ干渉してNfkBia mRNAを分解する可能性があること、あるいはAI462015発現を定量できるAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）上の特異的プローブ配列領域（CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG：配列番号16）42bpの前半部分に相当する5’側71番目のCからの２１塩基（CATATACAACATTTACAAGAA：配列番号15）がラットNfkBia mRNAの1478から1498塩基目の相補配列であることから、AI462015配列由来の核酸分子がNfkBia mRNA にRNA干渉し、発現を抑制することで抗体高産生CHO細胞のホメオスタシスを維持する可能性が考えられた（ノックアウトマウスのlethality はpostnatal）。（注記：後に、AI462015の転写産物はマウスNfkBia 遺伝子の3’側513塩基の非翻訳領域の相補鎖に相当することが判明した。参考例８参照。また、マウスGeneChipで定量されたAI462015の71番目から112番目の配列(配列番号16)はＣＨＯ細胞での転写産物として確認された。）
　そこで、抗体産生ポテンシャルが高かったAI462015高発現細胞でのNfkBia mRNA 発現量を定量し、その発現が抑制されていることを確認することにした。
　CHO細胞のNfkBia mRNA配列は未知であったため、マウスとラットのアミノ酸コード領域（共に942塩基：314アミノ酸）で保存されている配列からプローブ（ 5’ACTTGGTGACTTTGGGTGCT、 5’GCCTCCAAACACACAGTCAT ）(配列番号17、18)を設計して３２５bpのPCR産物を得た。 PCRクローニングされた３２５bp は、その配列相同性からCHO細胞由来NfkBia mRNAの一部配列であると考えられる（図１１）。
　Mouse Genome 430 2.0 Array（参考例１）では、そのプローブ配列がCHO細胞の種特異的配列に相当するためなのか、NfkBia mRNA発現を定量できなかったが、３２５bp PCR産物量を比較すると、抗体を産生させていない遺伝子強発現細胞（レーン１，２）に対して、AI462015配列の発現が昂進された抗体高産生細胞（レーン３，４）ではNfkBia mRNA発現が抑制されていた。さらに、３２５bp の一部の配列を定量可能なTaqMan Probe Set（図１２）を設計し、RT-PCR法で定量すると、抗体高産生細胞では、抗体を産生させていない細胞の約５０％にまでNfkBia mRNA発現が抑制されていた（図１３）。
　以上から、抗体高産生細胞ではNfkBia mRNAの発現が抑制されており、その結果、抗体産生ポテンシャルが上がると考えられる。実際、われわれが抗体遺伝子発現に用いている発現プラスミドのプロモーター/エンハンサー領域には 複数個以上のNfkB結合部位が存在しており（図１４：マウスMCMV IE2プロモーター上のNfkB結合部位）、それらのエンハンサー領域は抗体遺伝子の高発現に必須の領域であることから、NfkBia発現抑制によって活性化されたNfkBが核内に移行し、プロモーター活性が増強されることが、抗体高産生の一因であると考えられる。
　〔参考例５〕抗体高産生ＣＨＯ細胞で亢進されているmicroRNAの解析
microRNAを解析するために、図１５に示したようにMir-XTMmiRNA First-Strand Sythesis Kit (Clontech)を用いて、継代培養中のMAb1(抗IL-6R抗体)高産生DXB11s細胞とMAb1(抗IL-6R抗体)高産生TAUT強発現DXB11s細胞、さらに抗体遺伝子導入前のDXB11s宿主細胞から調製したsmall RNAの３’側にpoly(A)タグを付加したのち、オリゴｄTを３’側にPCRプライマー配列（ｍRQ　３’Primer）を５’側にもつアダプターをプライミングして一次鎖ｃDNAを合成した。得られたｃDNAを鋳型にして、mRQ 3’ primer   と 予想されたAPES配列由来のmicroRNA-specific Primer（APES 40-61  5’ primer, あるいは APES 71-91  5’ primer）、さらに ポジティブコントロールのU6 snRNA    5’ primerを用いてｑPCR反応(95℃ 5sec, 60℃ 20sec, 30cycles)をおこなった。PCR反応液は、精製後、３％アガロースゲルで電気泳動した。図１６に示したように、APES 40-61  5’ primerとU6 snRNA 5’ primerによるPCR反応で目的の大きさのバンドがみられた。レーン1,2,3で示したように、APES 40-61(AAGTACCAAAATAATTACCAAC：配列番号10)２２塩基がMAb1（抗IL-6R抗体) 高産生細胞中で高発現していた。ポジティブコントロールのU6 snRNA（レーン4）の発現量はいずれの細胞においても同レベルであったこと、またAPES 71-91（CATATACAACATTTACAAGAA：配列番号１５）の存在は確認されなかったことから(data not shown)、種を超えて配列が保存されているAPES 40-61（２２塩基）がmicroRNAとして抗体高産生化に寄与すると考えられた。
　〔参考例６〕APES強発現による抗体産生用宿主細胞の高増殖化例
抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTから、１Lジャー流加培養１４日目に３．９ｇ/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する抗体高産生細胞（DXB11/TAUT/MAb1）が得られ、ＴＡＵＴの生存率維持能によって培養３１日目に８．１ｇ/Lを産生したが、実生産を考慮して培養１４日目に高産生にするには、細胞最高到達密度（4.1 x10e6 cells/mL）を増加させる必要があった。APES強発現によるNfkbia mRNAの発現抑制（参考例４）がNfkbの活性化を促進するのであれば、増殖関連遺伝子の発現が亢進されるため、細胞最高到達密度は上がる可能性がある。APESと同様に抗体高産生化に寄与したALT1の共発現用プラスミドをそれぞれ(pPur-APES165, pPur-ALT1, 図１７)、上記抗体高産生細胞DXB11/TAUT/MAb1（親株）に導入して高増殖な上位３株ずつを選抜し、シェーカー流加培養をおこなうと、ＡＰＥＳ１６５強発現細胞の細胞最高到達密度の平均値は(11.5±1.7)x10e6 cells/mLであり、ＡＬＴ１強発現細胞の(8.9±1.8) x10e6 cells/mL以上に高増殖な細胞が得られた。さらにシェーカー流加培養１４日目の抗体産生量の平均値は、ＡＰＥＳ強発現細胞：４．４±0.6 g/L, ＡＬＴ１強発現細胞：４．０±0.6 g/Lと導入前のDXB11/TAUT/MAb1細胞：３.４g/L以上に高くなったことから、ＡＰＥＳ強発現効果はＴＡＵＴ強発現効果に独立してポジティブに作用することが示された（図１８）。APES強発現による正の効果は１L-Jar流加培養において顕著であり、それぞれシェーカー流加培養での高増殖細胞を比較すると、ＡＰＥＳ強発現株は最も高増殖で、培養１２日目で５．３g/Lと親株の３．２g/L, ＡＬＴ１強発現株４．４g/Lに対して短期間培養で高産生である長所が示された（図１９）。以上の結果に基づき、抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTをより高増殖な宿主細胞に改変することにし、ＡＰＥＳ１６５強発現宿主DXB11/TAUT/APESを作成した。DXB11/TAUT宿主にpPur-APES165をエレクトロポレーション法で遺伝子導入し、薬剤選抜後に生存率、増殖ともに良好であった宿主候補の９株について、継代培養時のAPES snRNA (small non-coding RNA)発現量を定量した。APES発現量の高かったDXB11/TAUT/APES宿主候補株は培養時の生細胞密度が高く、相関（Ｒ２＝０．７０）が示された(図２０)。
〔参考例７〕APES強発現による抗体産生細胞の高産生化例２
　参考例３と同様に、MAb1強発現DXB11s細胞にAI462015転写産物の5’側の部分配列を発現するプラスミドを導入し、抗体産生ポテンシャルを比較した。
　APES4-168（APES165）に加えて、さらにその一部配列からなるAPES4-68（配列番号５）およびAPES69-133（配列番号６）の発現ユニットを作成して、細胞の抗体産生ポテンシャルを検討した。空ベクター強発現(null)に対して APES 4-68は p<0.05, APES69-133は p<0.01の有意差で抗体高産生でとなった（t検定  P< 0.001、 図２１）。
　参考例３および本参考例において同定された、APES活性を有する部分配列が、それぞれ、マウスAI462015転写産物のどの領域に相当するのかを図２２に示した。APES活性を示した部分配列はNfkbia相補配列を２３塩基以上含んでいる。
　本発明は、あらゆる抗体等の組換えポリペプチド産生細胞へ応用可能である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (21)

  1. 　細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
  2. 　2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１の方法。
  3. 　同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、請求項２の方法。
  4. 　類似の機能を有するタンパク質がトランスポーターまたは代謝酵素である請求項３の方法。
  5. 　細胞に２種以上のトランスポーターの遺伝子を導入することを含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　細胞に２種以上の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  7. 　細胞にTauT及び２種の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  8. 　細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
  9. 　細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
  10. 　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む３０塩基長までの低分子RNAである、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
  11. 　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む５６１塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
  12. 　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９～２５塩基長の連続する配列を含む５６１～１５７９塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
  13. 　１９～２５塩基長の連続する配列が、配列番号２で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法又は細胞。
  14. 　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列を有する、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
  15. 　NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞：
    （ａ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列；
    （ｂ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列；
    （ｃ）配列番号１～１６及び２９のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
    （ｄ）上記（ｃ）の配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列からなる配列。
  16. 細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、請求項１～８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
  17. 所望のタンパク質が抗体である、請求項１６記載の方法又は細胞。
  18. 請求項１に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
    細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
    細胞に、１番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な２番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
    １番目と２番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
    NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目と２番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
  19. 請求項１に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
    細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
    細胞に、２番目の外来遺伝子を導入すること、および
    細胞に、２番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な３番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
    １番目、２番目、および３番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
    NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目、２番目、３番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
  20. 　１番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 　細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、請求項１８～２０のいずれかに記載の方法。
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