KR20210014223A

KR20210014223A - 개변 숙주 세포의 수립 방법

Info

Publication number: KR20210014223A
Application number: KR1020217003094A
Authority: KR
Inventors: 히사히로 다부치
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2013-10-10
Publication date: 2021-02-08
Also published as: TWI642779B; JP2019022508A; US11608508B2; JPWO2014058025A1; US20150275230A1; EP2921554A1; WO2014058025A1; CN112522353A; KR102358375B1; EP2921554A4; CN104718291A; TW201439319A; TWI692526B; JP6463634B2; KR20150065812A; JP6680848B2; TW201903153A; EP2921554B1; HK1208497A1; CN104718291B

Abstract

본 발명의 과제는 재조합 단백질 생산에 사용되는 숙주 세포로서 유용한, 도입 유전자를 안정적으로 고발현하고, 안정적으로 증식하는 세포주를 수립하는 것이다.
본 발명에 의해, 세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하는 것을 포함하는, 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법이 제공된다.

Description

개변 숙주 세포의 수립 방법 {METHOD OF ESTABLISHING MODIFIED HOST CELL}

본 발명은 배양 동물 세포를 이용한 재조합 단백질의 제조에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 목적으로 하는 단백질을 효율적으로 제조할 수 있는 숙주 세포를 수립하는 기술에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술을 이용하여, 의약으로서 유용한 단백질을 생산할 때에, 동물 세포를 사용하면, 원핵 세포가 실시할 수 없는 복잡한 번역 후 수식이나 폴딩이 가능해지기 때문에, 동물 세포는 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포로서 다용되어 오고 있다.

최근, 항체나 생리 활성 단백질 등의 많은 바이오 의약품이 배출되고 있는데, 재조합 단백질을 효율적으로 동물 세포에 생산시키는 기술은, 바이오 의약품의 저코스트화로 이어져, 환자로의 안정적인 공급을 약속하는 것이다.

따라서, 보다 생산 효율이 높은 단백질의 제조 방법이 요망되고 있다.

숙주 세포에, 목적으로 하는 단백질의 유전자에 더하여, 다른 구조 유전자를 도입하여 높은 발현량으로 발현시킴으로써, 목적으로 하는 단백질의 생산 효율을 향상시키는 기술이 알려져 있다.

예를 들어, 막 수송 단백질인 타우린 트랜스포터 (TauT) 유전자를 고발현하고, 또한 원하는 단백질을 코드하는 DNA 가 도입된 세포를 배양하는 것을 포함하는, 단백질의 제조 방법이 개시되어 있다 (특허문헌 1：WO2007/119774, 특허문헌 2：WO2009/051109).

또, 타우린 합성 경로의 효소인 시스테인술핀산디카르복시라아제 (CSAD) 유전자가 도입된 세포를 사용함으로써 원하는 단백질의 생산량이 증가하는 것이 개시되어 있다 (특허문헌 3：WO2008/114673).

또, 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT) 유전자가 도입된 세포를 사용함으로써 원하는 단백질의 생산량이 증가하는 것이 개시되어 있다 (특허문헌 4：WO2009/020144). 알라닌아미노트랜스페라아제는 알라닌으로부터 글루타민산을 생성시키는 효소이며, 인간 간 세포에 포함되는 효소 GTP (글루타민-피루브산트랜스아미나아제) 로도 알려져 있다.

또, Bicarbonate 트랜스포터 기능을 갖는 아니온 익스체인저 (AE) 의 유전자가 도입된 세포를 사용함으로써 원하는 단백질의 생산량이 증가하는 것이 개시되어 있다 (특허문헌 5：WO2009/054433).

또한, CSAD 와 TauT 의 공발현, ALT 와 TauT 의 공발현, Bicarbonate 트랜스포터와 CSAD, 또는 Bicarbonate 트랜스포터와 ALT 의 공발현의 결과, 보다 한층 원하는 단백질의 생산량이 증가하는 것도 개시되어 있다 (특허문헌 3-5).

그러나, 본 발명자들은, 지금까지의 연구로부터, 2 종류의 외래 유전자를 숙주 세포에 도입하는 경우, 각기 단독으로 도입하면, 그 유전자가 안정적으로 발현한 세포주를 수립할 수 있는 경우이더라도, 당해 2 종류의 외래 유전자를 함께 안정적으로 고발현시킨 세포주를 수립할 수 없는 경우가 있었다. 이 경우, 적어도 일방의 당해 외래 유전자와 동일한 유전자 혹은 카운터 파트 유전자의 숙주 세포에서의 발현량이 qPCR 로 검출 한계 이하인 경우, 2 종류의 유전자를 함께 안정적으로 고발현시킨 세포주를 수립할 수 없는 것을 경험하였다. 특히, 동일한 기능을 갖는 단백질의 유전자 혹은 동일한 대사계 반응에 관여하는 효소의 유전자, 예를 들어, 2 종류의 막 수송 단백질을 함께 고발현시킨 숙주 세포나, 2 종류의 효소를 함께 고발현시킨 숙주 세포의 수립은 불가능하였다. 또, GlycArt 사의 2 종류의 당 사슬 관련 효소 유전자는 숙주 세포에 있어서 발현하고 있지만, 더욱 고발현시킨 숙주 세포 유래의 항체 산생 세포는, 효소 유전자 발현이 불안정하기 때문에, 항체의 아푸코실 함량이 기대되는 범위를 일탈하는 사례가 보였다.

이와 같이, 상이한 2 종류 이상의 유전자를 고발현시키는 것에는, 곤란이 수반되는 경우가 많다.

WO2007/119774 WO2009/051109 WO2008/114673 WO2009/020144 WO2009/054433

본 발명은, 재조합 단백질 생산에 사용되는 숙주 세포에 있어서, 발현이 곤란한 유전자를 안정적으로 고발현시키기 위한 신규 기술을 제공한다. 또, 배가 시간이 빠르고, 안정적으로 증식하는 세포주를 수립하는 기술도 제공한다.

본 발명자들의 연구 그룹은, 이전, 단백질을 코드하지 않는 핵산 배열로서, 숙주 세포 내에서 RNA 로서 발현함으로써, NfkBia (nuclear factor κB inhibitor α, 또는 I-κB (inhibitor-κB)) 의 발현을 제어하고, 재조합 항체 등의 단백질의 산생능을 향상시키는 기능을 갖는 특정한 핵산 배열을 알아내었다 (PCT/JP2012/058577 (WO2012/137683)). 본 발명자들은 그와 같은 기능을 갖는 RNA 혹은 DNA 또는 그들의 배열을 총칭하여 APES (Antibody Production Enhancing Sequence) (경우에 따라, PPES (Polypeptide Production Enhancing Sequence) 라고도 한다) 라고 명명하였다.

APES 는 NfkBia (또는 I-κB) 의 발현 억제를 통해서 NF-κ(kappa)B 를 활성화하는 기능성 핵산인 것으로 생각되었다. 또, 이와 같은 기능을 갖는 핵산으로서, KSHV miRNA-K1 등도 알려져 있다 (Lei, Xiufen et al., Nat. Cell. Biol., 12 (2), p 193-199, 2010).

이번에, 본 발명자들은 APES 의 새로운 용도를 알아내었다.

즉, 본 발명자들은, APES 가 (1) 통상적인 세포에서는 발현이 곤란한 특정한 유전자를 고발현시킨 세포의 구축이나, (2) 통상적인 세포에서는 수립이 곤란한 상이한 2 종 이상의 유전자를 안정적으로 고발현시킨 세포의 구축을 가능하게 하는, 도입 유전자를 안정적으로 고발현시키는 기능을 갖는 것을 알아내었다.

따라서, 본원은, APES 유전자를 숙주 세포에 도입함으로써, 발현 곤란한 외래 유전자 혹은 발현이 불안정한 외래 유전자를, 당해 세포 내에서 안정적으로 고발현시키는 방법을 제공한다.

또, 본원은, APES 유전자를 숙주 세포에 도입하는 것에 의한, 배가 시간이 빠르고, 안정적으로 증식하는 세포의 수립 방법을 제공한다.

APES 유전자는 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA (단백질로 번역되지 않는 RNA) 를 코드하는 DNA 이다.

본원 발명의 요지는 다음과 같다.

(1) 세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 그 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법.

(2) 2 개 이상의 외래 유전자가 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질을 코드하는 (1) 의 방법.

(3) 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질이 모두 유사 기능을 갖는 단백질에 속하는 것을 특징으로 하는 (2) 의 방법.

(4) 유사 기능을 갖는 단백질이 트랜스포터 또는 대사 효소인 (3) 의 방법.

(5) 세포에 2 종 이상의 트랜스포터 (TauT 와 AE1) 의 유전자가 도입되는 (1) ∼ (4) 의 방법.

(6) 세포에 2 종 이상의 대사 효소 (피루브산 대사 경로의 효소, ALT1 과 PC) 의 유전자가 도입되는 (1) ∼ (4) 의 방법.

(7) 세포에 TauT 및 2 종의 대사 효소의 유전자가 도입되는 (1) ∼ (4) 의 방법.

(8) 세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 포함하는 DNA 구축물을 도입하고, 그 non-coding RNA 를 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 배가 시간이 빠른 세포를 구축하는 방법.

(9) 세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 그 유전자를 발현시키고, 또한, 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킨 세포.

(10) NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 30 염기 길이까지의 저분자 RNA 인 (1) ∼ (8) 의 방법, 또는 (9) 의 세포.

(11) NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 561 염기 길이까지의 mRNA 형 논코딩 RNA 인 (1) ∼ (8) 의 방법, 또는 (9) 의 세포.

(12) NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 561 ∼ 1579 염기 길이의 mRNA 형 논코딩 RNA 인 (1) ∼ (8) 의 방법, 또는 (9) 의 세포.

(13) 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열이 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열 중의 임의의 부분 배열 또는 그 상보 배열인 (10) 내지 (12) 의 방법 또는 세포.

(14) NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자가 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열을 갖는 (1) ∼ (8) 의 방법, 또는 (9) 의 세포.

(15) NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자가 이하의 염기 배열 또는 그 상보 배열을 갖는 DNA 인 (1) ∼ (8) 방법, 또는 (9) 의 세포：

(a) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열；

(b) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열과 1 또는 수 (數) 염기를 제외하고 동일한 염기 배열；

(c) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열을 포함하는, NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역의 부분 배열;

(d) 상기 (c) 의 배열과 1 또는 수 염기를 제외하고 동일한 염기 배열.

(16) 세포에, 추가로 원하는 단백질의 유전자가 도입되어 있는 (1) ∼ (8) 방법 또는 (9) 의 세포.

(17) 원하는 단백질이 항체인 (16) 의 방법 또는 세포.

(18) 상기 (1) 에 기재된 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법으로서,

세포에, 1 번째의 외래 유전자 및 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 이들 유전자를 발현시키는 것, 및

세포에, 1 번째의 외래 유전자와 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 번째의 외래 유전자를 도입하는 것을 포함하고,

1 번째와 2 번째의 외래 유전자는 단백질을 코드하는 유전자이고,

NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자, 및 단백질을 코드하는 1 번째와 2 번째의 외래 유전자를 발현하는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주가 수립되는 상기 방법.

(19) 상기 (1) 에 기재된 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법으로서,

세포에, 1 번째의 외래 유전자 및 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 이들 유전자를 발현시키는 것,

세포에, 2 번째의 외래 유전자를 도입하는 것, 및

세포에, 2 번째의 외래 유전자와 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 3 번째의 외래 유전자를 도입하는 것을 포함하고,

1 번째, 2 번째, 및 3 번째의 외래 유전자는 단백질을 코드하는 유전자이고,

NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자, 및 단백질을 코드하는 1 번째, 2 번째, 3 번째의 외래 유전자를 발현하는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주가 수립되는 상기 방법.

(20) 1 번째의 외래 유전자가 TAUT (taurine transporter) 유전자인 (18) 또는 (19) 에 기재된 방법.

(21) 세포에, 추가로 원하는 단백질의 유전자가 도입되어 있고, 당해 원하는 단백질의 생산을 위한 숙주 세포주가 수립되는 (18) ∼ (20) 중 어느 하나에 기재된 방법.

본 발명에 의해, 숙주 세포 중에서 각종 외래 유전자를 안정적으로 고발현시킬 수 있도록 되었다. 따라서, 본 발명을 이용하여, 통상적인 세포에서는 발현이 곤란한 폴리펩티드가 의약품으로서 제조 가능해진다. 또, 발현이 곤란한 항원 단백질의 발현량을 높여, 그와 같은 항원에 대한 항체의 개발이 용이해진다. 또, 본 발명에 의해, 복수의 유전자를 안정적으로 고발현시킨 세포를 구축할 수 있기 때문에, 유용 유전자를 다수 삽입한, 재조합 단백질을 산생하기 위한 숙주 세포의 제조가 가능해진다.

또, 본 발명의 다른 양태에 의해, 배가 시간이 빠르고, 안정적으로 증식하는 세포가 수립 가능해졌다. 따라서, 배양 동물 세포를 사용한 재조합 단백질의 생산에 있어서, 그와 같은 세포를 숙주로서 이용하면, 목적으로 하는 단백질을 효율적으로 생산 가능하다.

도 1 은 동정된 AI462015 전사 산물의 배열 및 마우스 게놈에서의 위치를 나타내고 있다.(참고예 1)
도 2 는 CHO-DG44 세포에 Mab1 (항 IL-6 리셉터 항체) 을 고발현시킨 항체 산생 세포의 계대 배양 3 일째에 있어서의 AI462015 전사 산물의 발현 강도를 나타내고 있다.(참고예 2)
도 3 은 CHO-DXB11s 세포에 Mab2 (항글리피칸 3 항체) 를 고발현시킨 항체 산생 세포의 계대 배양 3 일째에 있어서의 AI462015 전사 산물의 발현 강도를 나타내고 있다.(참고예 2)
도 4 는 Mab2 (항글리피칸 3 항체) 산생 세포의 1 ℓ 자 (jar) 유가 배양 3 일째에 있어서의 AI462015 전사 산물의 발현 강도를 나타내고 있다.(참고예 2)
도 5 는 Mab2 산생 세포의 1 ℓ 자의 유가 배양 후기 13 일째에 있어서의 AI462015 전사 산물의 발현 강도의 항진을 나타내고 있다.(참고예 2)
도 6 은 Mab1 (항 IL-6 리셉터 항체) 산생 포텐셜이 낮았던 세포의 1 ℓ 자 유가 배양 3 일째에 있어서의 AI462015 전사 산물의 발현 강도를 나타내고 있다. (참고예 2)
도 7 은 전사 산물 AI462015 (437p) 의 일부 배열 434 bp 의 발현 플라스미드이다.(참고예 3)
도 8 은 전사 산물 AI462015 (437p) 의 일부 배열 165 bp 의 발현 플라스미드이다.(참고예 3)
도 9 는 컨트롤로서 하이그로마이신 내성 유전자만을 발현시킨 플라스미드이다.(참고예 3)
도 10 은 전사 산물 AI462015 (437p) 의 일부 배열의 강발현에 의해 Mab1 산생량이 증가하는 것을 나타내고 있다.(참고예 3)
도 11 은 항체 고산생 세포에서의 전사 산물 AI462015 의 강발현과 NfkBia 발현 억제를 나타내고 있다.(참고예 4)
도 12 는 NfkBia 발현 정량에 사용한 프로브 세트를 나타내고 있다.(참고예 4)
도 13 은 항체 고산생 세포에서의 NfkBia 발현 억제의 정량 결과를 나타내고 있다.(참고예 4)
도 14 는 마우스 MCMV IE2 프로모터 상 (배열 번호 23) 의 8 개의 NfkB 결합 부위 (밑줄부) 를 나타내고 있다.(참고예 4)
도 15 는 microRNA 발현의 해석법의 개략이다.(참고예 5)
도 16 은 항체 고산생 세포에서 고발현하고 있었던 microRNA 유래의 PCR 산물을 나타내고 있다.(참고예 5)
도 17 은 pHyg-TAUT 발현 세포에 전사 산물 AI642048 (437p) 의 일부 배열 165 bp 를 공발현시킨 플라스미드 pPur-APES 165 및 ALT1 을 공발현시킨 pPur-ALT1 이다.(참고예 6)
도 18 은 APES 강발현에 의한 세포 고증식, 항체 고산생 효과를 나타낸 셰이커 유가 배양의 결과이다.(참고예 6)
도 19 는 APES 강발현에 의한 세포 고증식, 항체 고산생 효과를 나타낸 L-Jar 유가 배양의 결과이다.(참고예 6)
도 20 은 APES 165 강발현 숙주 후보 세포 (9 주) 의 APES 발현량과 생 (生) 세포 밀도의 상관을 나타내고 있다.(참고예 6)
도 21 은 전사 산물 AI462015 (437p) 의 일부 배열 APES 165 의 또한 부분 배열의 강발현에 의해 Mab1 산생량이 증가하는 것을 나타내고 있다.(참고예 7)
도 22 는 도 21 에서 항체 고산생 효과가 있었던 APES 165 의 또한 부분 배열이 NfkBia 상보 배열을 포함하는 것을 나타내고 있다.(참고예 7)
도 23 은 AI462015 가 마우스 NfkBia mRNA 의 상보 사슬인 것을 나타내고 있다.(참고예 1)
도 24 는 AI462015 의 상동 배열이 CHO-K1 세포 게놈에 존재하는 것을 나타내고 있다.(참고예 1)
도 25-1 의 도 25a 는 AI462015 의 일부 배열 (5' 말단으로부터 7-91 번째) 이 종을 넘어서 보존되어 있는 것을 나타내고 있다.(참고예 1) 도 25b 는 AI462015 의 일부 배열 (5' 말단으로부터 7-91 번째) 이 종을 넘어서 보존되어 있는 것을 나타내고 있다.(참고예 1)
도 25-2 의 도 25c 는 AI462015 의 일부 배열 (5' 말단으로부터 7-91 번째) 이 종을 넘어서 보존되어 있는 것을 나타내고 있다.(참고예 1) 도 25d 는 AI462015 의 일부 배열 (5' 말단으로부터 7-91 번째) 이 종을 넘어서 보존되어 있는 것을 나타내고 있다.(참고예 1)
도 25-3 의 도 25e 는 AI462015 의 일부 배열 (5' 말단으로부터 7-91 번째) 이 종을 넘어서 보존되어 있는 것을 나타내고 있다.(참고예 1)
도 26 은 DXB11/TAUT/APES (DTP) 세포의 수립.(실시예 1)
도 27 은 햄스터 TAUT, 인간 ALT1, 및 NfkBia 의 mRNA 발현 레벨을 나타낸다.(실시예 1)
도 28 은 DXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) 세포의 수립.(실시예 1)
도 29 는 DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC) 세포의 수립.(실시예 1).
도 30 은 DXB11/TAUT/ALT1 (DTL) 세포에 인간 PC 발현 플라스미드 pNeo-PC 를 도입했지만, DXB11/TAUT/ALT1/PC (DTLC) 는 수립되지 않았다.(실시예 1)
도 31 은 DXB11 (dhfr-) 및 DT 숙주의 배가 시간.(실시예 2)
도 32 는 각종 유전자의 강제 발현에 의한 개변 숙주의 제조.(실시예 2)
도 33 은 개변 숙주의 배가 시간.(실시예 2)

이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

(1) APES (Antibody Production Enhancing Sequence)

APES 는 NF-κB 의 억제 단백질인 I-κB 를 불활성화하는 핵산 분자이며, 보다 구체적으로는, I-κB 의 제어 서브유닛인 I-κBα (NfkBia) 의 유전자 발현을 억제하는 핵산 분자이다. 그와 같은 핵산 분자의 본체는 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 이지만, APES 는 non-coding RNA 자체, 혹은 그 RNA 를 코드하는 DNA 또는 그들 배열의 총칭이다.

혹은, APES 는 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 NfkBia 의 유전자인 DNA 또는 mRNA 에 염기쌍 형성에 의해 결합하고, NfkBia 의 발현을 억제할 수 있는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자이다. 그와 같은 핵산 분자는 NfkBia 유전자 DNA 또는 mRNA 에 결합하여 그 발현을 저해할 수 있는 것으로 생각된다. APES 는, 예를 들어, NfkBia 의 mRNA 에 RNA 간섭하는 분자이다.

혹은, APES 는, 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 NfkBia 의 유전자 DNA 또는 mRNA 에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열을 포함하는, 2 개 사슬 RNA (dsRNA), 또는 짧은 dsRNA인 siRNA, 혹은 1 개 사슬에 해리한 siRNA, 또는 shRNA, 안티센스 DNA 혹은 RNA, microRNA (miRNA) 또는 mRNA 형 논코딩 RNA 여도 된다.

혹은, APES 는, 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 NfkBia 유전자 DNA 또는 mRNA 의 상보 배열로 이루어지는 염기 배열, 또는 그와 같은 상보 배열을 배열의 일부에 포함하는 염기 배열로서, NfkBia 의 발현을 억제할 수 있는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자이다.

혹은, APES 는, 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 NfkBia 유전자 DNA 또는 mRNA 의 부분 배열 또는 그와 같은 부분 배열의 상보 배열로서, NfkBia 의 발현을 억제할 수 있는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자이다.

예를 들어, APES 는 표적인 NfkBia mRNA 의 일부에 상동 또는 상보적인 배열을 포함하는 배열로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드일 수 있다. 그와 같은 올리고 뉴클레오티드의 예로는, NfkBia mRNA 상보 사슬의 19 ∼ 25 염기에 상당하는 배열, 또는 당해 배열과 1 염기를 제외하고 동일 배열을 갖고, 또한 NfkBia 의 발현을 억제하는 효과를 갖는 저분자 RNA 를 들 수 있다. 여기서, 저분자 RNA 란, Small non-coding RNA (snRNA) 를 의미하고 있고, snRNA 에는 miRNA 가 포함된다.

혹은, APES 는 장사슬의 mRNA 형 논코딩 RNA 여도 되고, 예를 들어 NfkBia 의 유전자 DNA 또는 mRNA 에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열을 포함하는 길이 561 뉴클레오티드 길이 (561 mer) 까지의 배열로 이루어지고, 또한 NfkBia 의 발현을 억제하는 효과를 갖는 것일 수 있다. 혹은, APES 는 추가로 장사슬 (수백 ∼ 수십만 뉴클레오티드) 의 mRNA 형 논코딩 RNA 여도 된다. 예를 들어, APES 는 200-10 만 뉴클레오티드 길이, 혹은, 300 ∼ 30 만 뉴클레오티드 길이의 핵산 분자 또는 배열일 수 있다. APES 는, NfkBia 의 mRNA 의 일부에 상보적인 배열 (예를 들어, 상기 서술한 snRNA 배열) 을 포함하는, 561 ∼ 1579 염기 길이, 혹은 500 ∼ 1000 염기 길이의 mRNA 형 논코딩 RNA 여도 된다.

염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열이란, 완전히 대합 (對合) 하는 (즉 100 ％ 상보적이다) 것에 한정되지 않고, 기능에 지장이 없는 범위에서 부대합 (不對合) 염기의 존재도 허용된다. 혹은, APES 의 형태에 따라서는, 부분적인 상보성이 오히려 바람직하다. 따라서, 예를 들어, NfkBia 의 비번역 영역을 포함하는 유전자 DNA 또는 mRNA 에 적어도 70 ％, 보다 바람직하게는 80 ％, 더욱 바람직하게는 90 ％, 가장 바람직하게는 95 ％ 상동인 배열 또는 그 상보 배열도 「염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열」 에 포함된다. 예를 들어, 561 mer 혹은 500 mer 의 mRNA 형 논코딩 RNA 에 대해 적어도 90 ％ 상동의 배열에는, 염기의 삽입, 결실, 또는 점 돌연변이에 의한 1 ∼ 50 개 (혹은 561 mer 의 경우에는 1 ∼ 56 개) 의 미스매치 염기를 포함하는 변이 배열로서, 그 숙주 세포 중에서의 발현에 수반하여, 항체 등의 재조합 폴리펩티드의 산생능이 증대하는, 혹은, NfkBia 의 발현을 억제하는 기능을 갖는 것이 포함된다. 따라서, 예를 들어 70 ％ 이상의 상동성과 같은, 어느 정도의 배열 유사성을 갖는, 숙주 세포와는 상이한 생물종 유래의 NfkBia 오르토 로그 (이종간 상동 유전자) 유래의 배열도 APES 로서 이용 가능한 것으로 생각된다.

혹은, 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열이란, 세포 내와 같은 조건으로 NfkBia 의 mRNA 와 결합할 수 있는 배열을 포함한다. 그와 같은 배열은, 예를 들어, 고도로 스트린젠트한 조건으로서 당업자에게 공지된 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 원하는 기능을 갖는 배열을 포함한다. 고도로 스트린젠트한 조건의 일례는, 폴리뉴클레오티드와 그 밖의 폴리뉴클레오티드를, 6×SSPE 또는 SSC, 50 ％ 포름아미드, 5×덴하르트 시약, 0.5 ％ SDS, 100 ㎍/㎖ 의 단편화한 변성 연어 정자 DNA 를 포함하는 하이브리다이제이션 완충액 중에서, 42 ℃ 의 하이브리다이제이션 온도에서 12 ∼ 16 시간 인큐베이트 하는 것 (여기서 일방의 폴리뉴클레오티드가 막과 같은 고체 표면에 부착시켜 있어도 된다) 거기에 계속해서, 1×SSC, 0.5 ％ SDS 를 포함하는 세정 완충액을 사용하여 42 ℃ 이상의 매우 적합한 온도에서 수 회 세정하는 것이다. 그 밖의 구체적인 조건에 대해서는, Sambrook 등 「Molecular Cloning : A Laboratory Manual 제 3 판」 Cold Spring Harbor Laboratory Pr；및, Ausubel 등 「분자 생물학 실험 프로토콜」 마루젠, 등 다수의 당업자에게 주지인 실험 매뉴얼을 참조하고자 한다.

APES 의 다른 일 양태는, 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 NfkBia 의 mRNA 3' 측 비번역 영역의 부분 배열에 상동 또는 상보적인 배열로서, NfkBia 의 발현을 억제할 수 있는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자이다.

후술하는 참고예에 있어서 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 배양 CHO 세포에 있어서 항체 산생능과 상관하여 발현량이 높아져 있는 mRNA 형 논코딩 RNA 를 알아내었다. 이 RNA 는 마우스 게놈 중의 437 염기로 이루어지는 공지 배열 (도 1, GenBank Accession ID:AI462015, 배열 번호 1) 의 전사 산물로서 동정되었다. AI462015 의 배열 및 마우스 게놈 상에서의 위치가 도 1 에 나타나 있다. AI462015 의 전사 산물인 437 염기는 마우스 NfkBia mRNA 3' 측 비번역 영역 (513 염기) 의 상보 사슬에 상당한다 (도 23). 또한, 본 발명자들은, AI462015 유래의 일부의 배열을 갖는 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하여 발현시킴으로써, 원하는 폴리펩티드의 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 알아내었다.

상기 서술한 AI462015 유래의 배열 또는 그 일부의 배열은 마우스, 햄스터 등의 설치류뿐만 아니라, 인간에게 있어서도 보존되어 있고, 다른 포유 동물이나, 어류, 곤충 등의 동물에게 있어서도 보존성이 높은 배열인 것으로 생각된다. 따라서, AI462015 유래의 배열 또는 그 일부의 배열에 대응하는 각종 동물 세포 유래의 NfkBia mRNA 3' 측 비번역 영역의 부분 배열 혹은 그 상보 배열도 본 발명의 APES 의 배열로서 사용할 수 있다.

APES 의 하나의 구체예는 마우스 AI462015 유래의 일부 배열, 혹은 그와 같은 부분 배열에 있어서 1 ∼ 수 개의 염기가 치환, 결손 또는 부가된 배열을 갖는다. 특히, 5' 측 4 번째의 G 로부터 168 번째까지의 C 까지의 염기 배열로 이루어지는 165 염기의 DNA 배열 (배열 번호 2, APES 165), 혹은 그 상보 (안티센스) DNA 배열 또는 이들의 DNA 로부터 전사되는 RNA 배열을 포함하는 배열, 또는 이 배열 중 임의 길이의 부분 배열을 들 수 있다. 혹은, 5' 측 4 번째의 G 로부터 3' 말단의 T 까지의 염기 배열로 이루어지는 434 염기의 DNA 배열 (배열 번호 3, APES 434), 혹은 그 상보 (안티센스) DNA 배열 또는 이들의 DNA 로부터 전사되는 RNA 배열을 포함하는 배열, 또는 이 배열에서 유래하는 임의 길이의 부분 배열을 들 수 있다. 마우스 AI462015 의 배열에 대응하는 인간, 햄스터, 래트 등의 포유류 유래의 배열을 포함하는 배열 혹은 그들의 부분 배열, 혹은 그와 같은 부분 배열에 있어서 1 ∼ 수 개의 염기가 치환, 결손 또는 부가된 염기 배열도 포함된다.

일 양태에 있어서, APES 는 AI462015 중의 5' 측 4 번째부터 133 번째까지의 염기 배열 (배열 번호 4, APES 130) 또는 이 배열 유래의 일부의 배열을 갖는다. 예를 들어, 5' 측 4 번째부터 68 번째까지 (배열 번호 5, APES 4-68), 또는 69 번째부터 133 번째까지 (배열 번호 6, APES 69-133) 의 DNA 배열 혹은 그 상보 DNA 배열 또는 이들의 DNA 로부터 전사되는 배열을 들 수 있다.

일 양태에 있어서, APES 는 AI462015 중의 5' 측 40 번째부터 91 번째까지의 52 염기 (배열 번호 7) 의 배열, 또는 그 52 염기가 임의의 위치에서 절단된 일부 배열에서 유래하는 배열을 갖는다. 예를 들어, 전반 부분 (APES 40-68 의 29 염기, 혹은 APES 40-63 의 24 염기, 혹은 APES 40-61 의 22 염기) 또는 후반 부분 (APES 69-91 의 23 염기) 의 DNA 배열 혹은 그 상보 DNA 배열 (각각 배열 번호 8 ∼ 11 에 상당) 또는 이들의 DNA 로부터 전사되는 배열을 들 수 있다.

상기 서술한 52 염기는 1 염기를 제외하고 래트 NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역의 상보 사슬과 동일 배열이다. 또, 그 5' 측의 24 염기 (APES 40-63, 배열 번호 9) 는 인간 NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역과 동일 배열이다. 또, 5' 측의 22 염기 (APES 40-61, 배열 번호 10：AAGTACCAAAATAATTACCAAC) 는 래트, 붉은 털 원숭이, 개, 말 등 종을 넘어선 NfkBia mRNA 의 3' 측 비번역 영역의 상보 사슬과 동일 배열이다. NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역에 상보적인 일부의 배열을 숙주 세포 중에서 발현시킴으로써 RNAi 효과가 기대된다. 예를 들어, 상기 52 염기 중의 19 ∼ 25 염기에 상보적인 배열을 갖는 RNA 가, microRNA (miRNA) 로서 NfkBia 의 mRNA 의 비번역 영역에 작용함으로써, 번역이 저해될 가능성이 있다.

혹은, APES 는 AI462015 중의 5' 측 7 번째부터 91 번째까지의 85 염기 (배열 번호 29) 의 배열, 또는 그 85 염기가 임의의 위치에서 절단된 일부 배열에서 유래하는 배열을 갖는다. 상기 85 염기 중의 19 ∼ 25 염기에 상보적인 배열을 갖는 RNA 가, microRNA (miRNA) 로서 NfkBia 의 mRNA 의 비번역 영역에 작용함으로써, 번역이 저해될 가능성이 있다.

일 양태에 있어서, APES 는 21 염기의 siRNA 서치로 발견되는 배열을 갖는다. 예를 들어 AI462015 중의 84 번째부터 104 번째 (배열 번호 12, APES 84-104), 99 번째부터 119 번째 (배열 번호 13, APES 99-119), 101 번째부터 121 번째 (배열 번호 14, APES 101-121) 의 DNA 배열에 상보적인 배열을 포함하는 miRNA 배열이다. 상기 서술한 APES 69-133 중의 71 번째부터 112 번째의 배열 (배열 번호 16) 이 GeneChip 상에서 정량되어 있고, 실제로 고발현하고 있는 영역이기 때문에, APES 84-104 가 miRNA 로서 기능할 가능성이 높은 것으로 생각된다.

다른 일 양태에 있어서, APES 는 NfkBia 의 발현을 억제하는 공지된 non-coding RNA 여도 된다. 그와 같은 핵산 분자의 예로서, KSHV (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) miRNA-K1 을 들 수 있다. (배열 정보는 X Cai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 April 12 ; 102 (15) : 5570-5575 등을 참조)

또, APES 의 구조적 또는 기능적인 특징에 기초하여, 새롭게 APES 로서의 활성을 갖는 핵산 분자를 화학 합성 혹은 생물원으로부터 단리하는 것이 가능하다. APES 의 구조적 특징은 표적인 NfkBia mRNA 의 일부에 상보적인 배열을 포함하는 핵산 분자인 것이다. 핵산 분자의 형태는 어떠한 형태여도 되고, DNA, DNA 의 전사 산물, mRNA, cDNA 이거나, exosome RNA 이거나, 화학 합성 1 개 사슬 RNA 이거나, 화학 합성 2 개 사슬 RNA 이거나 등을 불문한다. 기능적 특징은, 그 숙주 세포 중에서의 발현에 수반하여, 항체 등의 재조합 폴리펩티드의 산생능이 증대하고 있는 것, 혹은, NfkBia 의 발현이 억제되고 있는 것이다.

생물원으로부터 APES 를 단리하는 경우에는, 어떠한 생물 유래여도 되고 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 인간, 침팬지 등의 영장류, 마우스, 래트, 햄스터 등의 설치류, 소, 돼지, 염소 등의 가축류, 닭 등의 조류, 제브러피쉬 등의 어류, 파리 등의 곤충류, 선충류 등의 동물 유래의 APES 를 들 수 있으며, 인간, 설치류 혹은 숙주 세포와 동일 종 유래의 APES 인 것이 바람직하고, 예를 들어, APES 를 강발현시키는 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 인 경우에는, 인간, 마우스 혹은 햄스터 유래의 APES 인 것이 바람직하다.

이와 같은 핵산 분자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들어, 항체 등의 재조합 폴리펩티드를 고산생하고 있는 배양 세포로부터 전체 RNA 를 조제하고, 본 발명의 핵산 배열 (예를 들어, 배열 번호 2 의 APES 165) 에 기초하여 올리고 뉴클레오티드를 합성하고, 이것을 프라이머로서 이용하여 PCR 반응을 실시하고, APES 로서의 특징을 갖는 cDNA 를 증폭시킴으로써 조제하면 된다. 또, 항체 등의 재조합 폴리펩티드를 고산생하고 있는 배양 세포로부터 저분자 RNA 를 조제 후에 cDNA 라이브러리를 제조하고, 클로닝된 cDNA 의 염기 배열에 기초하여, NfkBia mRNA 에 상보적인 부분 배열을 포함하는 저분자 RNA 를 얻을 수 있다. cDNA 라이브러리는, microRNA (miRNA) 등의 저분자 RNA 를 조제 후에, 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 에 기재된 방법에 의해 구축하는 것도 가능하다.

또, 얻어진 cDNA 의 염기 배열을 결정함으로써, 얻어진 cDNA 를 프로브로 하여 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, APES 가 발현되는 게놈 DNA 를 단리할 수 있다.

구체적으로는, 다음과 같이 하면 된다. 먼저, 본 발명의 APES 를 발현할 가능성이 있는 세포, 조직 등으로부터, 전체 RNA 를 단리한다. mRNA 의 단리는 공지된 방법, 예를 들어, 구아니딘 초원심법 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC 법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전체 RNA 를 조제한 후, RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 등을 사용하여 전체 RNA 를 추가로 정제한다.

얻어진 전체 RNA 로부터 역전사 효소를 사용하여 cDNA 를 합성한다. cDNA 의 합성은 SuperScript^TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen) 등을 사용하여 실시할 수도 있다. 또, 프라이머 등을 사용하여, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 제조) 및 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction ; PCR) 을 이용한 5'-RACE 법 (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 에 따라, cDNA 의 합성 및 증폭을 실시할 수 있다.

얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 조제하고, 벡터 DNA 와 연결한다. 또한, 이로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택하여 원하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA 의 염기 배열은 공지된 방법, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법에 의해 확인할 수 있다.

또, 얻어진 DNA 는 시판되는 키트나 공지된 방법에 의해 개변할 수 있다. 개변으로는, 예를 들어, site-directed mutagenesis 법에 의한 1 염기 변이 도입 등을 들 수 있다. 이와 같이 하여 개편된 배열도, APES 활성을 갖는 것인 한, 본 발명의 범위에 포함된다. 여기서, 「APES 활성을 갖는다」 란, 숙주 세포 내에서 발현함으로써 NfkBia (I-κBα) 의 발현을 억제하는 기능을 갖는 것을 말한다.

본 명세서 중에서는, APES 활성을 갖는 핵산 분자를 본 발명의 핵산 분자라고 부르는 경우가 있다.

(2) APES 의 숙주 세포로의 도입 및 발현

본 발명은 APES, 즉, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하고, 또한, APES 를 발현시키는 것, 바람직하게는 APES 를 강발현시키는 것을 포함한다.

APES 를 강발현한다는 것은, 원래의 세포와 비교하여 APES 의 발현량이 증가하고 있다는 의미이다. 원래의 세포는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 CHO 세포 등 재조합 단백질을 제조할 때에 숙주로서 이용되고 있는 세포를 들 수 있다. 구체예로는, 후술하는 참고예를 따라 설명하면, AFFYMETRIX 사의 올리고 뉴클레오티드 어레이 (Affymetrix MOUSE430_2) 를 사용한 GeneChip 실험에 있어서, 항체 유전자 도입 전의 원래의 세포는 AI462015 의 시그널값이 2000 이하인 것이며, 이것과 비교하여 APES 의 발현량이 증가하고 있다는 것은, 예를 들어, AI462015 의 시그널값이 2 배 이상이 되는 것이다.

APES 유전자가 도입되어, APES 를 강발현하는 세포는 내인성 혹은 외래의 APES 를 세포 내에 포함한다. APES 를 강발현하는 세포로서, 예를 들어, APES 가 인위적으로 도입된 세포를 들 수 있다.

APES 가 인위적으로 도입된 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조하는 것이 가능하고, 예를 들어, APES 를 코드하는 DNA 배열을 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 세포로 형질 전환함으로써 제조하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에서는 유전자 활성화 기술 (예를 들어, 국제 공개 제WO94/12650호 팜플렛 참조) 에 의해 내인성 APES 가 활성화되고, 그 결과, APES 가 강발현한 세포도 APES 가 인위적으로 도입된 세포에 포함된다.

내인성 APES 의 전형적인 예는 숙주 세포의 게놈 상에 코드된 DNA 배열로서의 APES 이다. 또, 본 발명에 있어서는, 유전자 활성화 기술에 상관없이, 예를 들어, 항체 유전자 도입 후에 어떠한 요인으로 내인성 APES 의 전사가 활성화하여, 강발현한 세포도 이용 가능하다.

(3) 발현 벡터

발현 벡터는, 숙주 세포에 APES 를 강발현시키기 위해서, 및 트랜스포터나 대사 효소 등의 외래의 폴리펩티드를 발현시키기 위해서 유용하다. 또, 의약품의 유효 성분이나 항원으로서 유용한 외래의 폴리펩티드의 발현에도, 발현 벡터가 사용된다.

본 발명에 있어서 사용 가능한 발현 벡터로는, 예를 들어, 포유 동물 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3 (Invitrogen 사 제조) 이나, pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p 5322), pEF, pCDM8), 곤충 세포 유래의 발현 벡터 (예를 들어 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」 (GIBCO BRL 사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터 (예를 들어 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pZIpneo), 효모 유래의 발현 벡터 (예를 들어, 「Pichia Expression Kit」 (Invitrogen 사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터 (예를 들어, pPL608, pKTH50) 등을 들 수 있다.

외래의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터는 그 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 당해 DNA 의 발현을 추진 가능한 발현 제어 배열을 포함한다. 마찬가지로, APES 를 발현시키기 위한 발현 벡터는 APES 를 코드하는 DNA 및 당해 DNA 의 발현을 추진 가능한 발현 제어 배열을 포함한다. 단일의 벡터가 1 종 이상의 폴리펩티드 및 APES 를 발현시키도록 구축되어도 된다. 유전자 활성화 기술을 이용하여, 예를 들어 숙주 게놈의 일부인 APES 또는 폴리펩티드 유전자를 활성화하는 경우, 그와 같은 숙주 세포 유래의 DNA 의 발현을 촉진하는 발현 제어 배열이 도입되어도 된다.

발현 제어 배열의 예로는, 적당한 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, 단백질을 코드하는 유전자에 있어서의 개시 코돈 (즉 ATG) 을 포함하는 코작 배열, 인트론을 위한 스플라이싱 시그널, 폴리아데닐화 부위, 및 스톱 코돈 등이 있으며, 벡터의 구축은 당업자가 적절히 실시할 수 있다.

발현 제어 배열은 사용하는 동물 세포에 있어서 유전자의 전사량을 증대시키는 것이 가능한 프로모터/인핸서 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현에 관여하는 프로모터/인핸서 영역은 NF-κB 결합 배열을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 포유 동물 세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해서 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터 (Mulligan 들, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터 (Mizushima 들, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또, 세포로의 형질 전환을 선발하기 위한 유전자 (예를 들어, 약제 (네오마이신, G418 등) 에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자) 를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포 내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터 (예를 들어, pCHOI 등) 를 도입하고, 메토트렉세이트 (MTX) 에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있으며, 또, 유전자의 일과성의 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 이용하여 SV40 의 복제 기점을 갖는 벡터 (pcD 등) 로 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로는, 또, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파피로마바이러스 (BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수도 있다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해서, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드트랜스페라아제 (APH) 유전자, 티미딘키나아제 (TK) 유전자, 대장균 잔틴구아닌포스포리보실트랜스페라아제 (Ecogpt) 유전자, 디하이드로 엽산 환원 효소 (dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

(4) 숙주 세포

본 발명에 있어서 사용하는 숙주 세포는, 특별히 한정되는 일 없이, 동물 세포, 식물 세포, 효모 등의 진핵 세포, 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 등 어떠한 세포여도 되고, 바람직하게는, 곤충, 물고기, 양서류, 파충류, 포유류 유래의 동물 세포이며, 특히 포유 동물 세포가 바람직하다. 포유 동물 세포의 유래로는, 인간, 침팬지 등의 영장류, 마우스, 래트, 햄스터 등의 설치류, 그 외를 들 수 있으며, 인간, 설치류인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 세포로는, 통상적으로 폴리펩티드의 발현에 자주 사용되는, CHO 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등의 포유 동물 배양 세포가 바람직하다.

의약품이나 항원으로서 유용한 폴리펩티드의 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. CHO 세포로는, 특히, DHFR 유전자를 결손 한 CHO 세포인 dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) 나 CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 을 적합하게 사용할 수 있다.

상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1, CHO-S 가 바람직하고, 특히 DG44 주 및 DXB-11 주가 바람직하다.

숙주 세포는, 예를 들어, 의약품이나 항원과 같은 원하는 폴리펩티드의 제조를 위한 산생계로서 사용할 수 있다. 그와 같은 세포는 원하는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 천연의 세포여도 되고, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 세포여도 되지만, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 형질 전환 세포가 바람직하다.

원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 형질 전환 세포의 일례는 적어도 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터가 트랜스펙트되어 있는 숙주 세포이다.

또한, 본 발명에 있어서, 「DNA (혹은 유전자) 를 도입한」 세포란, 외래성 DNA 가 트랜스펙트된 세포 외에, 유전자 활성화 기술 (예를 들어, 국제 공개 제WO94/12650호 팜플렛 참조) 에 의해 내인성 DNA 가 활성화되고, 그 결과, 당해 DNA 에 대응하는 단백질의 발현 혹은 당해 DNA 의 전사가 개시 혹은 증가한 세포도 포함한다.

APES 가 인위적으로 도입된 세포를 사용하여 원하는 폴리펩티드를 제조하는 경우, APES 와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입 순서는 특별히 제한되지 않고, APES 를 도입한 후에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입해도 되고, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입한 후에 APES 를 도입해도 된다. 또, APES 와 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 동시에 도입해도 된다.

벡터를 사용하는 경우, APES 및 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 도입은 단일의 벡터에 의해 동시에 도입해도 되고, 복수의 벡터를 사용하여 따로 따로 도입해도 된다.

(5) 외래 유전자

본 발명에서는, 숙주 세포에 미리 APES 를 도입하여 강발현시킴으로써, 발현 곤란한 외래 유전자 혹은 발현이 불안정한 외래 유전자를 세포 내에서 안정적으로 고발현시킬 수 있다.

숙주 세포를 원하는 폴리펩티드의 제조를 위해서 사용하는 경우, 제조의 목적인 원하는 폴리펩티드의 유전자에 더하여, 그 이외의 외래 유전자를 도입하여, 세포 내에서 안정적으로 고발현시킬 수 있다.

원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 가 도입된 형질 전환 세포 내에서, 외래 유전자가 발현함으로써, 원하는 폴리펩티드의 생산량이 증가하는 것이 바람직하다. 그와 같은 외래 유전자로는, 타우린 트랜스포터 (TauT), 시스테인술핀산디카르복시라아제 (CSAD), 알라닌아미노트랜스페라아제 (ALT), 아니온 익스체인저 (AE), 피루브산카르복시라아제 (PC), X-box binding protein (XBP-1) 등을 코드하는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명에서는, 숙주 세포에 미리 APES 를 도입하여 강발현시킴으로써, 원하는 단백질의 유전자 이외의 복수의 외래 유전자를 당해 숙주 세포에 도입하여 안정적으로 발현시킬 수 있다. 숙주 세포 중에서, 원하는 폴리펩티드의 유전자에 더하여, 그 이외의 특정한 2 개 이상의 외래 유전자가 발현함으로써, 원하는 폴리펩티드의 생산량이 증가하는 것이 바람직하다. 그 결과, 재조합 단백질 생산에 적절한 세포주를 수립하는 것이 가능해진다.

그와 같은 2 개 이상의 외래 유전자는 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질을 코드하는 유전자일 수 있다. 즉, 숙주 세포에 미리 APES 를 도입하여 강발현시킴으로써, 원하는 폴리펩티드의 유전자 이외의, 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 개 이상의 외래 유전자를 동시에 안정적으로 발현시키는 것이 가능해진다. 따라서, 「동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란」 하다는 것은, 숙주 세포 중에 APES 가 도입되어 있지 않은 상태에서는, 동시에 안정적으로 발현하는 경우가 없는, 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자의 조합이다.

여기서, 「동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 개 이상의 외래 유전자」 란, APES 를 도입하고 있지 않은 동물 세포, 바람직하게는 원하는 단백질의 유전자를 도입하기 전의 숙주 세포에, 각기 단독으로 도입하면, 그 외래 유전자가 안정적으로 발현하는 세포주를 수립할 수 있지만, 이들 외래 유전자를 2 개 이상 도입하는 처리를 실시한 후, 약제 등에 의한 선발 처리를 실시해도, 당해 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자를 동시에 발현하는 세포가 얻어지지 않는 유전자를 말한다. 이 경우, 적어도 일방의 당해 외래 유전자와 동일한 유전자 혹은 카운터 파트 유전자의, 당해 외래 유전자 도입 전의 숙주 세포에 있어서의 발현량이 qPCR 로 검출 한계 이하인 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 세포가, 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입할 수 있었던, 원하는 단백질을 산생하기 위한 숙주 세포이더라도, 원하는 단백질의 유전자를 도입한 후, 적어도 2 회, MTX 등의 약제 처리에 의해 원하는 단백질의 유전자 증폭을 위한 선발 처리를 실시할 때에, 당해 선발 처리 전의 당해 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자 중 적어도 1 개의 유전자의 발현량이 50 ％ 미만, 바람직하게는 30 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이하, 가장 바람직하게는 발현이 소실해 버릴 때, 본 발명에 있어서 이와 같은 유전자를 「동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 개 이상의 외래 유전자」 라고 말한다.

또, 다른 측면으로는 「동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 개 이상의 외래 유전자」 란, 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입하고, APES 를 도입하고 있지 않은 세포를 선발했을 때의, 당해 외래 유전자의 발현량에 비해, 당해 세포를 적어도 15 세대 계대 배양을 실시한 후, 당해 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자 중 적어도 1 개의 유전자의 발현량이 50 ％ 미만, 바람직하게는 30 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 10 ％ 이하, 가장 바람직하게는 발현이 소실해 버리는 유전자를 말한다.

「동시에 안정적으로 발현한다」 란, 구체적으로는, 본 발명의 세포가 원하는 단백질을 산생하기 위한 숙주 세포인 경우, 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입한, APES 를 포함하는 숙주 세포에, 원하는 단백질의 유전자를 도입한 후, 적어도 2 회, MTX 등의 약제 처리에 의해 원하는 단백질의 유전자 증폭을 위한 선발 처리를 실시해도, 당해 선발 처리 전의 당해 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자의 발현량이 각기 50 ％ 이상, 바람직하게는 70 ％ 이상의 발현량이 유지되고 있는 상태를 말한다.

또, 다른 측면으로는 「동시에 안정적으로 발현한다」 란, 2 개 이상의 외래 유전자를 도입한 세포를 선발했을 때의, 당해 외래 유전자의 발현량에 비해, 당해 세포를 적어도 15 세대 계대 배양을 실시한 후에 있어서도, 당해 2 개 이상의 단백질을 코드하는 외래 유전자의 발현량이 각기 50 ％ 이상, 바람직하게는 70 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상의 발현량이 유지되고 있는 상태를 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 서술한 바와 같이, 2 개 이상의 외래 유전자가 「동시에 안정적으로 발현하고 있는」 상태가 유지되고 있는 세포주를 수립된 세포주라고 한다.

본 발명에 있어서의 「동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질」 은 유사 기능을 갖는 단백질에 속할 수 있다. 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한, 유사 기능을 갖는 단백질의 조합의 예로는, 2 종류 이상의 막 수송 단백질 혹은 그것이 기능하기 위해서 필요한 액세서리 프로테인이나, 2 종류 이상의 효소 단백질, 바람직하게는 동일한 대사 경로에 관여하는 대사 효소나, 2 종류 이상의 전사 인자의 조합을 들 수 있다.

혹은, 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질의 조합은 2 종류 이상의 막 수송 단백질과 1 혹은 2 종류 이상의 효소 단백질의 조합이어도 된다. 혹은, 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질의 조합은 1 혹은 2 종류 이상의 막 수송 단백질과 2 종류 이상의 효소 단백질의 조합이어도 된다.

막 수송 단백질은, 생체막에 있어, 물질의 수송을 중개하는 단백질을 가리키며, 수송체 (트랜스포터), 담체 (캐리어), 투과 효소 (파미아제) 등으로도 일컬어진다. 세포막의 중요한 역할로서 각종 이온이나 영양소 등을 선택적으로 투과시키는 기능이 있으며, 그 기능을 담당하는 막 단백질이다. 막 수송 단백질에는, 당이나 아미노산 등의 유기 물질의 수송을 중개하는 단백질, 그리고 이온 수송체인 이온 펌프 및 이온 채널도 포함된다. 각종의 당 혹은 아미노산의 수송체 (트랜스포터, 파미아제) 및 이온 수송체가 정제되어 있고, 그들의 유전자가 공지이다.

본 발명에 있어서, 예를 들어, 유사 기능을 갖는 단백질의 유전자는 2 종류 이상의 트랜스포터 유전자의 조합일 수 있다. 2 종류의 트랜스포터의 예로는, TauT 와 AE1 을 들 수 있다.

유사 기능을 갖는 효소 단백질의 대표예는 복수의 대사 효소의 조합이다. 예를 들어, 유사 기능을 갖는 효소 단백질의 유전자는 동일 경로의 2 종류 이상의 대사 효소 유전자일 수 있다. 그와 같은 대사 효소는 동일 경로 내의 연속한 반응을 촉진하는 2 종 이상의 효소여도 된다. 예를 들어, 동일 경로의 대사 효소는 아미노산의 분해 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 또, 예를 들어, 대사 효소는 피루브산 대사 경로의 효소일 수 있다. 2 종 이상의 피루브산 대사 경로의 효소의 예는 ALT1 과 PC 일 수 있다.

혹은, 유사 기능을 갖는 효소 단백질의 예는 복수의 당 전이 효소의 조합이어도 된다.

또, 1 혹은 2 종류 이상의 막 수송 단백질과 2 종류 이상의 효소 단백질의 조합의 예는 TauT 및 2 종의 대사 효소일 수 있다.

상기 서술한 바와 같이, 숙주 세포에 APES 를 인위적으로 발현시키는 것은, 세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 인위적으로 도입하여, 그 유전자를 발현시킴으로써 실현될 수 있다. 2 개 이상의 외래 유전자의 발현도, 마찬가지로, 세포에 그들 외래 유전자를 인위적으로 도입하여, 그 유전자를 발현시킴으로써 실현될 수 있다.

숙주 세포로의 외래성 DNA (벡터에 도입되어 있어도 된다) 의 도입은, 예를 들어, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 카티오닉 리보좀 DOTAP (베링거 맨하임사 제조) 를 사용한 방법, 일렉트로포레이션법, Nucleofection 법 (amaxa 사), 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.

동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 개 이상의 외래 단백질의 유전자를 숙주 세포에 도입하여 안정적으로 발현시키려면, 2 번째의 외래 유전자를 도입하기보다도 전에, 숙주 세포에 미리 APES 를 도입해 두는 것이 바람직하다. 벡터를 사용하는 경우, APES 및 2 번째 이후의 외래 유전자의 도입은 복수의 벡터를 사용하여 따로 따로 도입하는 것이 바람직하다.

한편, 1 번째의 외래 유전자와 APES 의 도입 순번에는 특별히 제한이 없고, APES 를 도입한 후에 1 번째의 외래 유전자를 도입해도 되고, 1 번째의 외래 유전자를 도입한 후에 APES 를 도입해도 된다. 또, APES 와 1 번째의 외래 유전자를 동시에 도입해도 된다. 벡터를 사용하는 경우, APES 및 1 번째의 외래 유전자의 도입은 단일의 벡터에 의해 동시에 도입해도 되고, 복수의 벡터를 이용하여 따로 따로 도입해도 된다.

(6) 재조합 단백질 생산을 위한 세포주

본 발명에서는, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA (APES) 의 유전자를 도입하여, 그 유전자를 발현시킴으로써, 계대 배양을 반복해도 복수의 단백질을 코드하는 외래 유전자가 안정적으로 고발현하는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 얻을 수 있다.

또, APES 의 유전자를 숙주 세포에 도입함으로써, 배가 시간이 빠르고, 안정적으로 증식할 수 있는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 얻을 수 있다. 그와 같은 세포는, APES 에 더하여, 또 다른 외래 유전자가 도입되어 안정적으로 고발현하는 세포여도 된다.

본 발명에서 제공되는 세포의 예로는, 후술하는 실시예에서는, 먼저 TauT 고발현인 세포에 APES 165 (배열 번호 2：gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacac) 를 도입한 세포를 수립하고, 이어서, 당해 세포에 또 다른 트랜스포터 유전자를 도입함으로써, 협조적으로 기능하는 2 종의 트랜스포터가 함께 안정적으로 고발현하는 세포가 수립되어 있다. 또, 먼저 TauT 고발현인 세포에 APES 165 를 도입한 세포를 수립하고, 이어서, 당해 세포에 또한 2 종의 피루브산 대사 경로의 효소의 유전자를 도입함으로써, TauT 그리고 피루브산 대사 경로의 연속한 반응을 촉진하는 2 종의 효소가 함께 안정적으로 고발현하는 세포가 수립되어 있다. 이들 세포는, 재조합 단백질 생산을 위해서 바람직한 성질을 갖기 때문에, 의약품이나 항원으로서 유용한 원하는 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포로서 적합하다. 이들 세포를 숙주로 하여, 원하는 단백질의 유전자를 인위적으로 도입한 것을 배양하고, 원하는 단백질을 산생시키고, 산생한 단백질을 회수함으로써, 당해 원하는 단백질을 제조할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1：발현이 곤란한 특정한 유전자를 고발현시킨 세포의 수립

(1) 막 단백의 TauT 와 AE1 은 세포 표면 상에서 염소 이온의 반입·배출을 통하여 협동적으로 기능한다. 지금까지, TauT 고발현 세포의 TauT 기능 증강을 위해서, AE1 을 동시에 고발현시킨 숙주 세포의 수립을 반복 시험해 보았지만, 약제 선발 과정에서 부유 세포의 부착화가 보여, 공발현 세포는 수립되지 않았다. 이 경우, 숙주 세포에 있어서의 원래의 AE1 의 발현량은 qPCR 로 검출 한계 이하였다.

(2) 효소의 ALT1 과 PC (Pyruvate Carboxylase) 는 알라닌으로부터 피루브산, 피루브산으로부터 옥살로아세트산을 생합성한다. 지금까지, TCA 회로로 이어지는 대사 경로의 반응을 촉진하기 위해서, ALT1 고발현 숙주 세포에 PC 를 고발현시키고자 했지만, 공발현 세포는 수립되지 않았다. 이 경우, 숙주 세포에 있어서의 원래의 ALT1 의 발현량은 qPCR 로 검출 한계 이하였다.

그런데, 상기 2 예에 있어서, 2 번째의 유전자 도입 전에 미리 APES 를 고발현시켜 두면, APES 를 포함하여 3 종류 이상의 유전자를 고발현하는 세포가 수립되었다. 즉, (1) 에서는 TauT 고발현 세포에 APES 를 고발현시킨 TAUT/APES 세포를 구축한 후, AE1 을 도입함으로써, TauT 와 AE1 을 고발현하는 고증식인 TAUT/APES/AE1 세포가 수립되었다. (2) 에 있어서도, (1) 의 TAUT/APES 고발현 세포로부터 ALT1 이 고발현인 TAUT/APES/ALT1 세포를 구축한 후, PC 를 도입함으로써, ALT1 과 PC 를 고발현하는 고증식인 TAUT/APES/ALT1/PC 세포가 수립되었다. 한편, 미리 APES 를 고발현시키지 않은 TAUT/ALT1 세포로부터는, ALT1 과 PC 를 고발현하는 TAUT/ALT1/PC 세포는 수립되지 않았다.

또한, 본 실시예에 있어서는, 숙주 세포로서 CHO 세포 DXB-11 주를 사용하였다.

[실시예 1-1] DXB11/TAUT/APES 세포의 수립

햄스터 TAUT 발현 플라스미드 pHyg-TAUT 를 숙주 세포의 DXB11 에 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신 존재하에서 선발하면, 고증식, 또한 햄스터 TAUT (taurine transporter) 고발현인 세포인 DXB11/TauT (DT) 가 수립되었다 (도 26). 또한, APES 발현 플라스미드 pPur-APES 165 를 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 6 ㎍/㎖ 의 퓨로마이신 존재하에서 선발하면, 고증식, 또한 APES 를 강제 발현시킴으로써 NfkBia mRNA 발현이 억제된 세포인 DXB11/TAUT/APES (DTP) (도 26) 가 수립되었다. DTP 세포에 있어서, 햄스터 TAUT mRNA 고발현, NfkBia mRNA 발현 억제가 계대 배양을 반복해도 안정적으로 유지되는 것은 Taqman 법으로 확인되었다 (도 27).

[실시예 1-2] DXB11/TAUT/APES/AE1 세포의 수립

2 종의 트랜스포터를 함께 안정적으로 고발현시킨 숙주 세포의 수립에는 곤란을 수반하는 경우가 있다. 예를 들어, 숙주 세포 DXB11 에 TAUT 와 AE1 (anion exchanger 1) 을 함께 고발현시킨 안정주는 수립되지 않았다. 그러나, 도 26 의 햄스터 TAUT 고발현으로 APES 를 강제 발현시킴으로써 NfkBia mRNA 발현이 억제된 세포인 DXB11/TauT/APES (DTP) 에 인간 AE1 발현 플라스미드 pNeo-AE1 을 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 200 ㎍/㎖ 의 G418 존재하에서 선발하면, 고증식, 또한 햄스터 TAUT 와 인간 AE1 을 함께 고발현하고 있는 세포인 DXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) 이 수립되었다 (도 28).

DTPE 세포에 있어서, 햄스터 TAUT mRNA 고발현, 인간 AE1 mRNA 고발현, NfkBia mRNA 발현 억제가 계대 배양을 반복해도 안정적으로 유지되는 것은 Taqman 법으로 확인되었다 (도 27, 도 28).

한편, APES 도입 전의 DXB11/TAUT (DT) 세포에 인간 AE1 발현 플라스미드 pPur-AE1 을 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 6 ㎍/㎖ 의 퓨로마이신 존재하에서 선발하면, DXB11/TAUT/AE1 (DTE) 세포는 수립되지 않았다.

이상으로부터, TAUT 에 의한 Cl^- 이온의 배출, AE1 에 의한 Cl^- 이온의 삽입을 통해서, 협조적으로 기능하는 2 종의 트랜스포터를 함께 고발현시키기 위해서는, APES 고발현에 의한 NfkBia mRNA 의 발현 억제가 필요한 것으로 생각된다.

[실시예 1-3] DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC 세포의 수립

2 종의 효소를 함께 안정적으로 고발현시킨 숙주 세포의 수립에도 곤란을 수반하는 경우가 있다. 예를 들어, ALT1 (alanine transferase) 과 PC (pyruvate carboxylase) 를 함께 고발현시킨 안정주는 수립되지 않았다. 그러나, 도 26 의 DXB11/TauT/APES (DTP) 에 인간 ALT1 발현 플라스미드 pNeo-ALT1 을 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 200 ㎍/㎖ 의 G418 존재하에서 선발하면, 고증식, 또한 인간 ALT1 고발현인 세포인 DXB11/TAUT/APES/ALT1 (DTPL) 이 수립되었지만, 또한, DTPL 세포에 인간 PC 발현 플라스미드 pZeo-PC 를 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 200 ㎍/㎖ 의 Zeocin 존재하에서 선발함으로써 고증식, 또한 인간 PC 고발현인 세포인 DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC) 가 수립되었다 (도 29).

DTPLC 세포에 있어서, 햄스터 TAUT mRNA 고발현, 인간 ALT1 mRNA 고발현, NfkBia 발현 억제, 인간 PC mRNA 고발현이 계대 배양을 반복해도 안정적으로 유지되는 것은 Taqman 법으로 확인되었다 (도 27, 도 29).

한편, APES 도입 전의 DXB11/TAUT (DT) 세포에 인간 ALT1 발현 플라스미드 pPur-ALT1 을 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 6 ㎍/㎖ 의 퓨로마이신 존재하에서 선발하면, 고증식, 또한 인간 ALT1 고발현인 세포인 DXB11/TAUT/ALT1 (DTL) 이 수립되었지만, 또한, DTL 세포에 인간 PC 발현 플라스미드 pNeo-PC 를 일렉트로포레이션법으로 도입하고, 200 ㎍/㎖ 의 G418 존재하에서 선발하면, DXB11/TAUT/ ALT1/PC (DTLC) 는 수립되지 않았다 (도 30).

이상으로부터, 피루브산 대사 경로의 연속한 반응을 촉진하는 효소인 ALT1 과 PC 를 함께 고발현시키기 위해서는, APES 고발현에 의한 NfkBia mRNA 의 발현 억제가 필요한 것으로 생각된다.

실시예 2：배가 시간이 빠르고, 안정적으로 증식하는 세포의 수립 방법

[실시예 2-1] 배가 시간 (개산값) 의 산출

배가 시간 (개산값) 은, 125-㎖ Erlenmeyer Flask 에 의한 셰이커 배양 후, Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system (Innovatis AG, Bielefeld, Germany) 에 의해 생 세포수를 측정, 산출하였다. Viability 가 90 ％ 이상으로 유지된 상태의 개개의 세포로부터 계대 배양을 개시하여, 처음 세포 밀도 2×10⁵ cells/㎖ 로부터의 3 일간 배양, 혹은 처음 세포 밀도 1×10⁵ cells/㎖ 로부터의 4 일간 배양 등에 의해 과증식이 되지 않도록 배양을 반복 실시하고, Viability 를 90 ％ 이상으로 유지하면서 계대간의 배가 시간을 산출하였다. 유전자를 강제 발현시킨 개변 세포의 계대 배지에는 각종 유전자 도입에 사용한 하이그로마이신 등의 약제가 포함되지만, 약제 이외에는 DXB11 (dhfr-) 과 동일 배지를 사용하였다.

유전자 도입에 의한 개변 전의 DXB11 (dhfr-) 의 배가 시간 (개산값) 은, 약제를 포함하지 않는 배지에서의 계대 배양 ((Viability 가 99.5 ％ 인 세포로부터 계대 배양을 7 회 (3 일간 배양을 4 회, 4 일간 배양을 3 회)) 로 산출한 결과, 27.5 ± 1.7 시간이었다 (도 31).

[실시예 2-2] 각종 유전자 강제 발현 숙주의 수립과 배가 시간

도 32 에 나타낸 바와 같이, 각종 유전자의 강제 발현에 의해 개변 숙주를 수립하였다. 우선은 DXB11 (dhfr-) 에 TAUT (Taurine Transporter) 의 발현 플라스미드 (pHyg-TAUT) 를 일렉트로포레이션법으로 도입, 약 2-3 주일 후에 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신 존재하에서 증식 양호하였던 세포를 2 종류 선발하였다. 또한, 계대 배양시의 유전자 발현 프로파일을 AFFYMETRIX 사의 올리고 뉴클레오티드 어레이 (Affymetrix MOUSE430_2) 를 사용한 GeneChip 실험으로 비교하고, TAUT mRNA 가 고발현이고, 그 밖의 발현 프로파일은 DXB11 (dhfr-) 과 유사한 선발주를 DT 숙주으로 하였다. 수립된 DT 숙주의 배가 시간 (개산값) 은, 약제 (하이그로마이신) 를 포함하는 배지에서의 계대 배양 (((Viability 가 90.0 ％ 이상인 세포로부터 계대 배양을 11 회 (3 일간 배양을 4 회, 4 일간 배양을 7 회)) 로 산출한 결과, 26.1 ± 2.7 시간이며, 배가 시간은 DXB11 (dhfr-) 에 대해 거의 동등하였다 (도 31).

다음으로, DT 숙주를 더욱 개변하기 위해서 항체 산생 세포에 있어서 발현이 비정상적으로 항진되어 있던 APES 의 일부 배열 APES 165 (일본 특허출원 2011-082002) 를 강제 발현시켰다. DT 숙주에 pPur-APES 165 를 일렉트로포레이션법으로 도입, 약 2-3 주일 후에 6 ㎍/㎖ 퓨로마이신 존재하에서 증식 양호하였던 세포를 9 주 선발하면, APES 발현량과 세포 증식에 상관 (R2 = 0.701) 이 보였다 (도 20).

TAUT 와 APES 가 함께 고발현하고 있고, 배가 시간이 20.8 시간으로 가장 빨랐던 세포주를 DTP 숙주로 하면, DTP 숙주는 지금까지 없던 형질을 획득하고 있었다. 예를 들어, TAUT 와 함께 강제 발현시킨 숙주 세포를 수립할 수 없었던 AE1 (Anion Exchanger 1) 의 발현 플라스미드 (pNeo-AE1) 를 일렉트로포레이션법 도입, 약 2-3 주일 후에 200 ㎍/㎖ G418 존재하에서 증식 양호하였던 세포를 선발하면, TAUT 와 AE1 이 함께 고발현인 세포가 구축되었다. 가장 AE1 발현량이 높았던 세포를 DTPE 숙주로 하면, 장기간 배양을 반복해도 안정적이고, 배가 시간은 DTP 숙주보다 빨랐다 (도 33, 57 계대, 19.9 ± 4.3 시간).

다음의 예로는, TAUT 와 함께 강제 발현시킨 숙주 세포를 수립할 수 있었던 ALT1 (Alanine Aminotransferase 1) 의 발현 플라스미드 (pNeo-ALT1) 를 일렉트로포레이션법으로 도입, 약 2-3 주일 후에 200 ㎍/㎖ G418 존재하에서 증식 양호하였던 세포를 선발하여, TAUT 와 AE1 이 함께 고발현인 세포를 구축하였다. ALT1 발현량과 세포 증식에는 상관이 보이기 때문에, 가장 ALT1 발현량이 높았던 세포를 DTPL 숙주로 하면, 이쪽도 장기간 배양을 반복해도 안정적이고, 배가 시간은 DTP 숙주보다 빨랐다 (도 33, 57 계대, 19.8 ± 4.3 시간). ALT1 은 APES 의 강제 발현에 의존하지 않고 TAUT 와 함께 강제 발현시킨 숙주 세포를 수립할 수 있으므로, DT 숙주에 ALT1 의 발현 플라스미드 (pPur-ALT1) 를 일렉트로포레이션법으로 도입, 약 2-3 주일 후에 6 ㎍/㎖ 퓨로마이신 존재하에서 증식 양호하였던 세포를 선발하고, 가장 ALT1 발현량이 높았던 세포를 DTL 숙주로 하면, 장기간 배양을 반복해도 안정적이었지만, DTPL 숙주와의 비교에서는 증식에 편차가 보이고, 배가 시간은 DTPL 숙주보다 늦었다 (도 33, 57 계대, 21.9 ± 7.3 시간).

이상의 결과는, (1) APES 를 강제 발현시킴으로써 배가 시간이 빠른 숙주 세포를 구축할 수 있는 것, (2) APES 강발현 숙주는 더 새로운 유전자를 도입함으로써, 배가 시간이 보다 빠른 세포를 구축할 수 있는 것을 나타내고 있다. 이와 같은 기능을 갖는 핵산 배열은 알려져 있지 않다.

참고예

본 발명자들은, 이전, 높은 재조합 항체 산생능을 갖는 배양 세포주 (CHO 세포주) 를 재료로 하여, 당해 세포주에서 발현이 현저한 유전자에 대해 검토를 실시하고, 하나의 mRNA 형 논코딩 RNA 를 동정하였다. 이 전사 산물은 NfkBia 의 mRNA 의 비번역 영역의 상보 사슬에 상당하였다. 또한, 이 전사 산물 중의 일부의 배열로 이루어지는 핵산 분자를 재조합 배양 세포 중에서 발현시킴으로써, 당해 배양 세포의 항체 산생능을 현저하게 향상시키는 것을 알아내었다. 또, 본 발명자들은 당해 논코딩 RNA 의 발현이 항진된 항체 고산생 세포에서는 NfkBia 의 발현이 억제되고 있는 것, 높은 항체 산생능을 갖는 배양 세포가 세포 내에서 NfkBia 의 발현을 억제하고 있는 것, 배양 세포 내의 NfkBia 의 발현을 제어하는 전사 산물을 고발현시킴으로써, 항체의 생산량이 증가하는 것을 알아내었다.

이들 사항을 이하의 참고예에 의해 설명한다.

[참고예 1] 각종 유전자 도입 CHO 세포의 GeneChip 해석 실험

GeneChip 실험은 AFFYMETRIX 사의 올리고 뉴클레오티드 어레이 (Affymetrix MOUSE430_2) 를 사용하여 통상적인 순서에 따랐다. 단, Hamster Array 는 상품화되어 있지 않기 때문에 Mouse Genome 430 2.0 Array 를 사용하였다. 하이브리다이제이션 조건의 최적화에 의해, Test 3 array 상의 Mouse Gene 16 종의 프로브 중, 8 종의 프로브에서 Present Call 이 얻어지도록 되어, Mouse 와의 염기 배열 상동성이 약 90 ％ 이상인 경우에는, Hamster 전사 산물의 발현 정량이 가능해졌다.

각종 유전자를 강발현시킨 세포로부터 고순도 total RNA 를 조제한 후, total RNA 와 T7 프로모터 배열을 포함하는 올리고 dT 프라이머 (T7-(T)24) 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 다음에, Bio-11 CTP, Bio-16 UTP 와 Megascript T7 Kit (Ambion) 를 사용한 전사 반응에 의해, cDNA 로부터 비오틴 라벨 cRNA 를 합성하였다. cRNA 는 칼럼 정제 후, 전기 영동 상에서 18s 내지 28s rRNA 에 상당하는 분자량이 확인된 고품질 cRNA 를 단편화하여, 균일한 사이즈를 갖는 GeneChip 샘플로 하였다. 사용까지의 GeneChip 샘플은 하이브리다이제이션 샘플 용액을 첨가하여 －80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 샘플 용액은 사용 직전에 열 처리, 원심, Mouse Genome 430 2.0 Array 에 어플라이하고, Array 를 회전시키면서 45 ℃ 의 하이브리다이제이션 전용 오븐으로 16 시간 인큐베이션하였다. 샘플을 회수, Array 를 반복 씻어 Streptavidin R-Phycoerythrin 으로 염색 후에 스캔하였다.

Array 상의 전사물 (약 45,000) 의 GeneChip 시그널값을 비교함으로써, 1 ℓ 자 유가 배양 10 일째에 900 ㎎/ℓ 이상의 MAb1 (항 IL-6R 항체；tocilizumab, 상품명 악템라) 을 산생하는 MAb1 (항 IL-6R 항체) 강발현 TAUT 강발현 CSAD 강발현 DG44 세포의 계대 배양 세포에 있어서, 발현 강도가 높고 또한 발현 항진이 현저한 전사 산물로서 마우스 게놈 상의 mRNA 형 논코딩 RNAUG_GENE = AI462015 (Affymetrix MOUSE430_2, 1420088_AT) 를 동정하였다 (도 1：AI462015 전사 산물의 배열).

AI462015 는 437 염기의 mRNA 형 논코딩 RNA 이지만, 그 배열은 마우스 게놈 12 의 NfkBia mRNA 3' 측의 비번역 영역 근방 (56590831- 56590397) 의 상보 사슬 상에 존재한다. AI462015 전사 산물이 직접 NfkBia mRNA 의 비번역 영역에 작용하여 번역을 저해할 가능성, 혹은 437 염기의 일부의 배열이 저분자 RNA 로서 기능하여 NfkBia mRNA 를 분해할 가능성이 생각되었다.

예를 들어, AI462015 배열 중의 5' 측 40 번째의 A 로부터 91 번째의 A 를 포함하는 52 염기의 배열 (AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA：배열 번호 7) 은, 래트 NfkBia mRNA 3' 측의 비번역 영역 (1478-1529, GENE ID:25493 NfkBia) 의 상보 사슬과 1 염기 (AI462015 중의 5' 측 61 번째의 A) 를 제외하고 일치하고 있고, 나아가서는 AI462015 의 40 번째의 A 부터 63 번째의 A 를 포함하는 24 염기의 배열 (AAGTACCAAAATAATTACCAACAA：배열 번호 9) 은, 인간 NfkBia mRNA 3' 측의 비번역 영역의 일부 배열 (TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT, 1490 - 1513：배열 번호 24) 의 상보 사슬이기도 하기 때문에, 52 염기의 일부인 19-25 염기가 microRNA 로서, 혹은 일부 배열이 안티센스 RNA 로서 CHO 세포의 NfkBia mRNA 에 작용할 가능성이 예측되었다.

또한, 그 후의 GeneBank 의 정보 갱신에 의해, AI462015 의 전사 산물인 437 염기는 마우스 NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역 (513 염기) 의 상보 사슬에 상당하는 것이 밝혀졌다 (도 23). 도 24 에 나타낸 바와 같이, CHO-K1 세포의 게놈 배열 상에 AI462015 의 상동 배열이 존재하는 것 (배열 번호 25：AI462015；배열 번호 26-27：CHO-K1 게놈), 또한, 항체 고산생 CHO 세포에 있어서 NfkBia 의 발현 억제 (참고예 4) 가 보였기 때문에, CHO 세포에서는 AI462015 의 상동 배열이 고발현되어 기능하는 것으로 생각된다.

예를 들어, AI462015 배열 중의 5' 측 7 번째의 T 로부터 91 번째의 A 를 포함하는 85 염기의 배열 (도 23 과 24 의 밑줄부, 배열 번호 29) (TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA) 은, 래트 NfkBia mRNA 3' 측의 비번역 영역 (1478-1562, GENE ID : 25493 NfkBia, 배열 번호 31) 의 상보 사슬과 1 염기 (AI462015 중의 5' 측 70 번째의 A) 를 제외하고 일치하고 있고 (Matching = 84/85, 도 25b), 마찬가지로, 인간 (Matching = 75/85, 도 25a, 배열 번호 30), 침팬지 (Matching = 75/85, 도 25c, 배열 번호 32), 붉은 털 원숭이 (Matching = 74/85, 도 25d, 배열 번호 33), 소 (Matching = 76/85, 도 25e, 배열 번호 34) 에서도 상동성이 확인되었다. 따라서, 이 85 염기 (Conserved Sequence 7-91) 의 일부인 19-25 염기가 microRNA 로서, 혹은 일부 배열이 안티센스 RNA 로서 종을 넘어서 동물 세포, 혹은 포유 동물 세포에 작용하는 것으로 생각된다. 따라서, 동물 배양 세포, 바람직하게는 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포의 NfkBia mRNA 에도 작용하는 것이 예측되었다.

[참고예 2] 항체 고산생 세포에 있어서 발현 항진된 전사 산물의 동정

참고예 1 에서, MAb1 (항 IL-6R 항체；tocilizumab, 상품명 악템라) 고산생 DG44 세포에서 전사 산물 AI462015 의 발현량이 항진되었지만 (도 2), 상이한 숙주 세포 (CHO-DXB11s) 에 상이한 항체 (MAb2：항글리피칸 3 항체；GC33 (WO2006/006693 참조)) 를 고산생시킨 경우도 동일하게 AI462015 전사 산물의 발현 항진이 보였다 (도 3).

도 2 에 나타낸 바와 같이, CHO-DG44 세포에 타우린 트랜스포터 (TauT) 유전자를 강발현시킨 경우, 시스테인술핀산디카르복시라아제 (CSAD) 유전자를 강발현시킨 경우 (data not shown), TauT 와 CSAD 를 함께 강발현시킨 경우, 모두 전사 산물 AI462015 의 발현량은 동일한 정도였지만, TauT 와 CSAD 를 함께 강발현시킨 세포에 추가로 Mab1 (항 IL-6 리셉터 항체) 을 강발현시킨 경우에는, AI462015 의 비정상적인 항진 (숙주 세포의 7 배) 이 보이고, 발현량도 비정상적으로 높은 GeneChip 시그널값 (10,000 이상) 을 나타내었다. 컨트롤의 GAPDH 발현 강도는 세포간에서 동 레벨이었기 때문에, 전사 산물 AI462015 의 발현 항진은 Mab1 항체 고산생 세포에 특이적이었다. 도 3 도 동일하며, CHO-DXB11s 세포에 MAb2 (항글리피칸 3 항체) 유전자를 강발현시킨 경우, AI462015 배열의 발현 항진 (TauT, CSAD, AE1 강발현 세포의 평균값의 13 배) 은 MAb2 항체 고산생 세포에 특이적이었다.

이상의 결과는, 셰이커 계대 배양 3 일째에 안정 증식하고 있는 항체 고산생 세포는 AI462015 배열을 비정상적으로 고발현하고 있는 것을 나타내고 있다.

또, 1 ℓ 자 배양 3 일째의 생산 배양 조건하에 있어서도 AI462015 배열의 비정상적인 발현 항진이 보였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이 1 ℓ 자 유가 배양의 10 일째에 약 1200-1400 ㎎/ℓ 의 MAb1 (항 IL-6R 항체) 를 산생하는 2 종의 항체 고산생 세포는 5,000 이상의 높은 GeneChip 시그널값을 나타내었다. 배양 조건의 차이로부터, 1 ℓ 자 유가 배양 3 일째의 시그널값은 셰이커 배양의 50 ％ 정도였지만, 배양 후기 13 일째에 AI462015 배열의 발현 강도는 셰이커 계대 배양과 동일한 정도로까지 항진되어, 비정상적으로 높은 시그널값을 나타내었다 (도 5). 한편, 항체 산생량이 낮은 MAb1 강발현 DXB11s 세포 (가수 분해물 무첨가의 셰이커 배양 7 일째에 300 ㎎/ℓ 이하, 가수 분해물 첨가로도 500 ㎎/ℓ 이하) 는, 고산생화에 기여하는 가수 분해물 (Hy-Fish, Procine Lysate) 을 첨가한 조건에서도, 1 ℓ 자 배양 3 일째의 AI462015 배열의 발현 항진은 보이지 않았다 (도 6).

도 2 에서 높은 시그널값을 나타낸 MAb1 강발현 TauT 강발현 CSAD 강발현 DG44 세포의 항체 산생량이 높았던 것 (가수 분해물 무첨가의 셰이커 배양 7 일째에 640 ㎎/ℓ), 도 3 에서 높은 시그널값을 나타낸 MAb2 강발현 DXB11s 세포의 항체 산생량이 높았던 것 (가수 분해물 무첨가의 셰이커 배양 7 일째에 640 ㎎/ℓ), 도 6 에서 항체 고산생화에 기여하는 가수 분해물을 첨가한 경우에도 시그널값이 항진되지 않은 실험 결과에 기초하여, 「AI462015 배열의 발현량이 높은 세포는 항체 산생 포텐셜이 높다」 라고 생각되었다.

[참고예 3] APES 강발현에 의한 항체 산생 세포의 고산생화 예

AI462015 배열 발현량의 높이가 항체 산생 포텐셜의 높이와 상관하는 것을 나타내기 위해서, 도 6 에서 항체 산생 포텐셜이 낮았던 MAb1 강발현 DXB11s 세포에 AI462015 배열의 일부를 발현하는 플라스미드를 도입하고, 강발현시켜 항체 산생 포텐셜을 비교하였다.

마우스 게놈 유래의 전사 산물 AI462015 (도 1, 437 염기) 배열의 일부 (Affymetrix GeneChip 의 AI462015 Probe Sequence 를 포함한다) 5' 측 4 번째의 G 로부터 3' 말단의 T 까지를 APES 434, 5' 측 4 번째의 G 로부터 168 번째의 C 까지를 APES 165 라고 명명하고, 2 종류의 발현 유닛을 작성하였다 (APES 란 Antibody Production Enhancing Sequence 의 약칭). Kozak 배열을 더한 발현 유닛을 합성함으로써, CMV 프로모터하에서 고발현하는 pHyg-APES 434 (도 7), pHyg-APES 165 (도 8), pHyg-null (도 9) 을 구축하였다.

Amaxa 사 (현, LONZA 사) 유전자 도입 시스템 Nucleofector 에 의해, 도 6 의 항체 저산생주의 MAb1 강발현 DXB11s 세포에 발현 플라스미드를 도입하고, 96 웰 플레이트 상에서 Hygromycin (200 ㎍/㎖) 을 포함하는 선택 배지 존재하에서 고증식이었던 전체 세포주를 선발하고, 24 웰 플레이트 확대 후에 항체 산생량을 비교하였다. 선발된 주 수는 각각 pHyg-APES 434 (N = 38), pHyg-APES 165 (N = 60), pHyg-null (N = 11) 이며, 그들의 주 수는 APES 강발현 플라스미드 도입에 의한 포지티브 효과를 기대시켰다. 1 ㎖ 계대 배지를 포함하는 24 웰 플레이트에서의 정치 배양은, 배양 13 일째에 세포 증식이 보이지 않았기 때문에, 항체 산생량 및 세포수를 측정하였다. 항체 산생량의 평균값은 pHyg-APES 434 (44.3 ㎎/ℓ), pHyg-APES 165 (41.2 ㎎/ℓ), pHyg-null (21.9 ㎎/ℓ), 세포수 (평균값) 는 pHyg-APES 434 (9.27 x 10⁵ cells/㎖), pHyg-APES 165 (11.39 x 10⁵ cells/㎖), pHyg-null (7.76 x 10⁵ cells/㎖) 이며, pHyg-APES 434, pHyg-APES 165 도입 세포는 함께 컨트롤의 pHyg-null 에 대해 통계적으로 우위였다 (t 검정 p < 0.001, 도 10).

이상의 결과는, AI462015 전사 산물의 5' 측 165 bp 를 포함하는 핵산 배열 (예를 들어 배열 번호 2 의 DNA 의 전사 산물인 APES 165, 또는 배열 번호 3 의 DNA 의 전사 산물인 APES 434) 을 강발현시키면, 세포의 항체 산생 포텐셜이 올라간 것을 나타내고 있다.

[참고예 4] 항체 고산생 CHO 세포에 있어서의 NfkBia 의 발현 억제

참고예 1 에서 서술한 바와 같이, AI462015 배열은 마우스 게놈 12 의 NfkBia 유전자의 3' 측의 비번역 영역 근방 (3' 측 78 bp) 의 상보 사슬 상에 존재하는 것, AI462015 배열에 포함되는 22 염기 (AAGTACCAAAATAATTACCAAC：배열 번호 10) 는 인간 NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역 (1492-1513) 의 상보 사슬과 동일 배열이며, 또한 래트, 붉은 털 원숭이, 개, 말 등 종을 넘어서 보존되어 있기 때문에 microRNA 로서 RNA 간섭하여 NfkBia mRNA 를 분해할 가능성이 있는 것, 혹은 AI462015 발현을 정량할 수 있는 AFFYMETRIX 사의 올리고 뉴클레오티드 어레이 (Affymetrix MOUSE430_2) 상의 특이적 프로브 배열 영역 (CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG：배열 번호 16) 42 bp 의 전반 부분에 상당하는 5' 측 71 번째의 C 로부터의 21 염기 (CATATACAACATTTACAAGAA：배열 번호 15) 가 래트 NfkBia mRNA 의 1478 내지 1498 염기목의 상보 배열이기 때문에, AI462015 배열 유래의 핵산 분자가 NfkBia mRNA 에 RNA 간섭하고, 발현을 억제함으로써 항체 고산생 CHO 세포의 호메오스타시스를 유지할 가능성이 생각되었다 (녹아웃 마우스의 lethality 는 postnatal). (주기：후에, AI462015 의 전사 산물은 마우스 NfkBia 유전자의 3' 측 513 염기의 비번역 영역의 상보 사슬에 상당하는 것이 판명되었다. 참고예 8 참조. 또, 마우스 GeneChip 로 정량된 AI462015 의 71 번째 내지 112 번째의 배열 (배열 번호 16) 은 CHO 세포에서의 전사 산물로서 확인되었다.)

그래서, 항체 산생 포텐셜이 높았던 AI462015 고발현 세포에서의 NfkBia mRNA 발현량을 정량하고, 그 발현이 억제되고 있는 것을 확인하기로 하였다.

CHO 세포의 NfkBia mRNA 배열은 미지였기 때문에, 마우스와 래트의 아미노산 코드 영역 (함께 942 염기：314 아미노산) 에서 보존되고 있는 배열로부터 프로브 (5' ACTTGGTGACTTTGGGTGCT, 5' GCCTCCAAACACACAGTCAT) (배열 번호 17, 18) 를 설계하여 325 bp 의 PCR 산물을 얻었다. PCR 클로닝된 325 bp 는 그 배열 상동성으로부터 CHO 세포 유래 NfkBia mRNA 의 일부 배열인 것으로 생각된다 (도 11).

Mouse Genome 430 2.0 Array (참고예 1) 에서는, 그 프로브 배열이 CHO 세포의 종 특이적 배열에 상당하기 때문인지, NfkBia mRNA 발현을 정량할 수 없었지만, 325 bp PCR 산물량을 비교하면, 항체를 산생시키지 않은 유전자 강발현 세포 (레인 1, 2) 에 대해, AI462015 배열의 발현이 항진된 항체 고산생 세포 (레인 3, 4) 에서는 NfkBia mRNA 발현이 억제되고 있었다. 또한, 325 bp 의 일부의 배열을 정량 가능한 TaqMan Probe Set (도 12) 를 설계하고, RT-PCR 법으로 정량하면, 항체 고산생 세포에서는, 항체를 산생시키지 않은 세포의 약 50 ％ 에까지 NfkBia mRNA 발현이 억제되고 있었다 (도 13).

이상으로부터, 항체 고산생 세포에서는 NfkBia mRNA 의 발현이 억제되고 있고, 그 결과, 항체 산생 포텐셜이 올라가는 것으로 생각된다. 실제, 우리가 항체 유전자 발현에 이용하고 있는 발현 플라스미드의 프로모터/인핸서 영역에는 복수 개 이상의 NfkB 결합 부위가 존재하고 있고 (도 14：마우스 MCMV IE2 프로모터 상의 NfkB 결합 부위), 그들 인핸서 영역은 항체 유전자의 고발현에 필수 영역이기 때문에, NfkBia 발현 억제에 의해 활성화된 NfkB 가 핵 내로 이행하고, 프로모터 활성이 증강되는 것이, 항체 고산생의 한 요인인 것으로 생각된다.

[참고예 5] 항체 고산생 CHO 세포에서 항진되어 있는 microRNA 의 해석

microRNA 를 해석하기 위해서, 도 15 에 나타낸 바와 같이 Mir-X^TMmiRNA First-Strand Sythesis Kit (Clontech) 를 사용하여, 계대 배양 중의 MAb1 (항 IL-6R 항체) 고산생 DXB11s 세포와 MAb1 (항 IL-6R 항체) 고산생 TAUT 강발현 DXB11s 세포, 또한 항체 유전자 도입 전의 DXB11s 숙주 세포로부터 조제한 small RNA 의 3' 측에 poly (A) 태그를 부가한 후, 올리고 dT 를 3' 측에 PCR 프라이머 배열 (mRQ 3' Primer) 을 5' 측에 갖는 어댑터를 프라이밍하여 1 차 사슬 cDNA 를 합성하였다. 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여, mRQ 3' primer 로 예상된 APES 배열 유래의 microRNA-specific Primer (APES 40-61 5' primer, 혹은 APES 71-91 5' primer), 또한 포지티브 컨트롤의 U6 snRNA 5' primer 를 사용하여 qPCR 반응 (95 ℃ 5 sec, 60 ℃ 20 sec, 30 cycles) 을 실시하였다. PCR 반응액은, 정제 후, 3 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하였다. 도 16 에 나타낸 바와 같이, APES 40-61 5' primer 와 U6 snRNA 5' primer 에 의한 PCR 반응으로 목적으로 하는 크기의 밴드가 보였다. 레인 1, 2, 3 으로 나타낸 바와 같이, APES 40-61 (AAGTACCAAAATAATTACCAAC：배열 번호 10) 22 염기가 MAb1 (항 IL-6R 항체) 고산생 세포 중에서 고발현하고 있었다. 포지티브 컨트롤의 U6 snRNA (레인 4) 의 발현량은 어느 세포에 있어서도 동 레벨이었던 것, 또 APES 71-91 (CATATACAACATTTACAAGAA：배열 번호 15) 의 존재는 확인되지 않았던 것으로부터 (data not shown), 종을 넘어서 배열이 보존되어 있는 APES 40-61 (22 염기) 이 microRNA 로서 항체 고산생화에 기여하는 것으로 생각되었다.

[참고예 6] APES 강발현에 의한 항체 산생용 숙주 세포의 고증식화 예

항체 산생용 숙주 세포 DXB11/TAUT 로부터, 1 ℓ 자 유가 배양 14 일째에 3.9 g/ℓ 의 MAb1 (항 IL-6R 항체) 을 산생하는 항체 고산생 세포 (DXB11/TAUT/MAb1) 가 얻어지고, TAUT 의 생존률 유지능에 의해 배양 31 일째에 8.1 g/ℓ 를 산생했지만, 실제 생산을 고려하여 배양 14 일째에 고산생으로 하려면, 세포 최고 도달 밀도 (4.1 x 10e6 cells/㎖) 를 증가시킬 필요가 있었다. APES 강발현에 의한 NfkBia mRNA 의 발현 억제 (참고예 4) 가 NfkB 의 활성화를 촉진한다면, 증식 관련 유전자의 발현이 항진되기 때문에, 세포 최고 도달 밀도는 올라갈 가능성이 있다. APES 와 마찬가지로 항체 고산생화에 기여한 ALT1 의 공발현용 플라스미드를 각각 (pPur-APES 165, pPur-ALT1, 도 17), 상기 항체 고산생 세포 DXB11/TAUT/MAb1 (친주) 에 도입하여 고증식인 상위 3 주씩을 선발하고, 셰이커 유가 배양을 실시하면, APES 165 강발현 세포의 세포 최고 도달 밀도의 평균값은 (11.5 ± 1.7) x 10e6 cells/㎖ 이고, ALT1 강발현 세포의 (8.9 ± 1.8) x 10e6 cells/㎖ 이상으로 고증식인 세포가 얻어졌다. 또한 셰이커 유가 배양 14 일째의 항체 산생량의 평균값은, APES 강발현 세포：4.4 ± 0.6 g/ℓ, ALT1 강발현 세포：4.0 ± 0.6 g/ℓ 와 도입 전의 DXB11/TAUT/MAb1 세포：3.4 g/ℓ 이상으로 높아졌기 때문에, APES 강발현 효과는 TAUT 강발현 효과에 독립적으로 포지티브로 작용하는 것이 나타났다 (도 18). APES 강발현에 의한 정 (正) 의 효과는 1 ℓ-Jar 유가 배양에 있어서 현저하고, 각각 셰이커 유가 배양에서의 고증식 세포를 비교하면, APES 강발현주는 가장 고증식으로, 배양 12 일째에 5.3 g/ℓ 와 친주의 3.2 g/ℓ, ALT1 강발현주 4.4 g/ℓ 에 대해 단기간 배양으로 고산생인 장점이 나타났다 (도 19). 이상의 결과에 기초하여, 항체 산생용 숙주 세포 DXB11/TAUT 를 보다 고증식인 숙주 세포로 개변하기로 하고, APES 165 강발현 숙주 DXB11/TAUT/APES 를 작성하였다. DXB11/TAUT 숙주에 pPur-APES 165 를 일렉트로포레이션법으로 유전자 도입하고, 약제 선발 후에 생존률, 증식 모두 양호하였던 숙주 후보의 9 주에 대해, 계대 배양시의 APES snRNA (small non-coding RNA) 발현량을 정량하였다. APES 발현량이 높았던 DXB11/TAUT/APES 숙주 후보주는 배양시의 생세포 밀도가 높고, 상관 (R² = 0.70) 이 나타났다 (도 20).

[참고예 7] APES 강발현에 의한 항체 산생 세포의 고산생화 예 2

참고예 3 과 동일하게, MAb1 강발현 DXB11s 세포에 AI462015 전사 산물의 5' 측의 부분 배열을 발현하는 플라스미드를 도입하고, 항체 산생 포텐셜을 비교하였다.

APES 4-168 (APES 165) 에 더하여, 추가로 그 일부 배열로 이루어지는 APES 4-68 (배열 번호 5) 및 APES 69-133 (배열 번호 6) 의 발현 유닛을 작성하여, 세포의 항체 산생 포텐셜을 검토하였다. 공 (空) 벡터 강발현 (null) 에 대해 APES 4-68 은 p < 0.05, APES 69-133 은 p < 0.01 의 유의차로 항체 고산생이 되었다 (t 검정 p < 0.001, 도 21).

참고예 3 및 본 참고예에 있어서 동정된, APES 활성을 갖는 부분 배열이, 각각, 마우스 AI462015 전사 산물의 어느 영역에 상당하는지를 도 22 에 나타내었다. APES 활성을 나타낸 부분 배열은 NfkBia 상보 배열을 23 염기 이상 포함하고 있다.

본 발명은 모든 항체 등의 재조합 폴리펩티드 산생 세포에 응용 가능하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 있어 받아들이는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Methods to generate host cells having improved properties <130> FA0001-13079 <150> JP 2012-225537 <151> 2012-10-10 <160> 35 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 437 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 tttgtctgta aaaatctgtt taataaatat acatcttaga agtaccaaaa taattaccaa 60 caaaatacaa catatacaac atttacaaga aggcgacaca gaccttagtt gggggcgact 120 tttaagcaca tgccactgaa cacctggctc ttacatggga ggacacactg ggctcactta 180 ctaggtctat ggtggttcaa tcaaaagcac aataaataaa acgtggtcct ttcattaggt 240 tctggaaaat cacctccccc ccccccaaaa aaaatcccac aaacatgaac cttaagagac 300 attttctttg aatttcagtg atctgtttcc ccggatttca caaagacaac agccgaatca 360 ccccagtaaa atgcctgggt ctaggcgctg tgtggtgtgg tgctaagtat accctttctc 420 attttttttc tttttct 437 <210> 2 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES165 <400> 2 gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa 60 aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt 120 aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacac 165 <210> 3 <211> 434 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES434 <400> 3 gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa 60 aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt 120 aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacactgggc tcacttacta 180 ggtctatggt ggttcaatca aaagcacaat aaataaaacg tggtcctttc attaggttct 240 ggaaaatcac ctcccccccc cccaaaaaaa atcccacaaa catgaacctt aagagacatt 300 ttctttgaat ttcagtgatc tgtttccccg gatttcacaa agacaacagc cgaatcaccc 360 cagtaaaatg cctgggtcta ggcgctgtgt ggtgtggtgc taagtatacc ctttctcatt 420 ttttttcttt ttct 434 <210> 4 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES130 <400> 4 gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa 60 aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt 120 aagcacatgc 130 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES 4-68 <400> 5 gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa 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<223> APES 101-121 <400> 14 gaccttagtt gggggcgact t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES 71-91 <400> 15 catatacaac atttacaaga a 21 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> APES 71-112 <400> 16 catatacaac atttacaaga aggcgacaca gaccttagtt gg 42 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 17 acttggtgac tttgggtgct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 18 gcctccaaac acacagtcat 20 <210> 19 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Part of Hamster Nfkbia mRNA <400> 19 agtacccgga tacagcagca gctgggccag ctgacccggg aaaatcttca gatgctgccc 60 gagagtgagg atgaggagag ctacgacaca gagtcagaat tcacggagga tgagctgccc 120 tatgatgact gtgtgtttgg aggca 145 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 20 cagctgaccc gggaaaatc 19 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 21 tgactctgtg tcgtagctct cctc 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 22 tcagatgctg cccgagagtg agga 24 <210> 23 <211> 1394 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 ctctgggctc gaatggcatg ggggacagct tttatatggt taactccgcc cgttttatga 60 ctagaaccaa tagtttttaa tgccaaatgc actgaaatcc cctaatttgc aaagccaaac 120 gccccctatg tgagtaatac ggggactttt tacccaattt cccaagcgga aagcccccta 180 atacactcat atggcatatg aatcagcacg gtcatgcact ctaatggcgg cccataggga 240 ctttccacat agggggcgtt caccatttcc cagcataggg gtggtgactc aatggccttt 300 acccaagtac attgggtcaa tgggaggtaa gccaatgggt ttttcccatt actggcaagc 360 acactgagtc aaatgggact ttccactggg ttttgcccaa gtacattggg tcaatgggag 420 gtgagccaat gggaaaaacc cattgctgcc aagtacactg actcaatagg gactttccaa 480 tgggtttttc cattgttggc aagcatataa ggtcaatgtg ggtgagtcaa tagggacttt 540 ccattgtatt ctgcccagta cataaggtca atagggggtg aatcaacagg aaagtcccat 600 tggagccaag tacactgcgt caatagggac tttccattgg gttttgccca gtacataagg 660 tcaatagggg atgagtcaat gggaaaaacc cattggagcc aagtacactg actcaatagg 720 gactttccat tgggttttgc ccagtacata gggtcaatag ggggtgagtc aacaggaaag 780 ttccattgga gccaagtaca ttgagtcaat agggactttc caatgggttt tgcccagtac 840 ataaggtcaa tgggaggtaa gccaatgggt ttttcccatt actggcacgt atactgagtc 900 attagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt caataggggt gaatcaacag 960 gaaagtccca ttggagccaa gtacactgag tcaataggga ctttccattg ggttttgccc 1020 agtacaaaag gtcaataggg ggtgagtcaa tgggtttttc ccattattgg cacgtacata 1080 aggtcaatag gggtgagtca ttgggttttt ccagccaatt taattaaaac gccatgtact 1140 ttcccaccat tgacgtcaat gggctattga aactaatgca acgtgacctt taaacggtac 1200 tttcccatag ctgattaatg ggaaagtacc gttctcgagc caatacacgt caatgggaag 1260 tgaaagggca gccaaaacgt aacaccgccc cggttttccc ctggaaattc catattggca 1320 cgcattctat tggctgagct gcgttctacg tgggtataag aggcgcgacc agcgtcggta 1380 ccgtcgcagt cttg 1394 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ttgttggtaa ttattttggt actt 24 <210> 25 <211> 433 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 tgtctgtaaa aatctgttta ataaatatac atcttagaag taccaaaata attaccaaca 60 aaatacaaca tatacaacat ttacaagaag gcgacacaga ccttagttgg gggcgacttt 120 taagcacatg ccactgaaca cctggctctt acatgggagg acacactggg ctcacttact 180 aggtctatgg tggttcaatc aaaagcacaa taaataaaac gtggtccttt cattaggttc 240 tggaaaatca cctccccccc ccccaaaaaa aatcccacaa acatgaacct taagagacat 300 tttctttgaa tttcagtgat ctgtttcccc ggatttcaca aagacaacag ccgaatcacc 360 ccagtaaaat gcctgggtct aggcgctgtg tggtgtggtg ctaagtatac cctttctcat 420 tttttttctt ttt 433 <210> 26 <211> 414 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 26 tgtctgtaaa aatctgttta ataaatatac atcttagaag taccaaaata attaccaaca 60 aaatacacca tatacaacat ttacaagagg gtaacaaaaa cctcagtcgg gagtgactag 120 cacataccac tcaacacctg gttctacatg tgaggacata ccaggctcag ctaccagatc 180 taccgttcag tcaaaagcac aataaataga atgtggtccc tttcatcagt ctggaaaacc 240 acctcccaaa acctcacgaa tgtgagcttt aaaagacatt ttctttgaat tccaatgatc 300 tgtttcccca tttcacaaaa ataacaatct gccatcacca gagtaagatg cttgggggca 360 ggctgtgtgc agtgtggtgg taagtatatc cctttctttc ttttttttct tctt 414 <210> 27 <211> 414 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 27 aagaagaaaa aaaagaaaga aagggatata cttaccacca cactgcacac agcctgcccc 60 caagcatctt actctggtga tggcagattg ttatttttgt gaaatgggga aacagatcat 120 tggaattcaa agaaaatgtc ttttaaagct cacattcgtg aggttttggg aggtggtttt 180 ccagactgat gaaagggacc acattctatt tattgtgctt ttgactgaac ggtagatctg 240 gtagctgagc ctggtatgtc ctcacatgta gaaccaggtg ttgagtggta tgtgctagtc 300 actcccgact gaggtttttg ttaccctctt gtaaatgttg tatatggtgt attttgttgg 360 taattatttt ggtacttcta agatgtatat ttattaaaca gatttttaca gaca 414 <210> 28 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Part of Hamster Nfkbis mRNA (134bp) <400> 28 agtacccgga tacagcagca gctgggccag ctgacccggg aaaatcttca gatgctgccc 60 gagagtgagg atgaggagag ctacgacaca gagtcagaat tcacggagga tgagctgccc 120 tatgatgact gtgt 134 <210> 29 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Conserved Sequence 7-91 <400> 29 tgtaaaaatc tgtttaataa atatacatct tagaagtacc aaaataatta ccaacaaaat 60 acaacatata caacatttac aagaa 85 <210> 30 <211> 83 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 tgtaaaaatc tgtttaataa atatacatca taaaagtacc aaaataatta ccaacaatac 60 attatgtaca ccatttacag gag 83 <210> 31 <211> 85 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 31 tgtaaaaatc tgtttaataa atatacatct tagaagtacc aaaataatta ccaacaaaat 60 acaccatata caacatttac aagaa 85 <210> 32 <211> 89 <212> DNA <213> Pan troglodytes <400> 32 tgtaaaaatc tgtttaataa atatacatca taaaagtacc aaaataatta ctaacaatac 60 attatgtaca tcatttacag gagggtaac 89 <210> 33 <211> 89 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 33 tggaaaaatc tgtttaataa atatacataa taaaagtacc aaaataatta ccaacaatac 60 actatgtaca ccatttacag aagggtaac 89 <210> 34 <211> 90 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 34 tgtaaaaatc tgtttaataa atatacatct taaaagtacc aaaataatta ctgacaaaat 60 acactatgta cactatttac aggaggggaa 90 <210> 35 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> kB motif <400> 35 gggactttcc 10

Claims

세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 그 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법.
제 1 항에 있어서,
2 개 이상의 외래 유전자가 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질을 코드하는 유전자인 방법.
제 2 항에 있어서,
동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 단백질이 모두 유사 기능을 갖는 단백질에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
유사 기능을 갖는 단백질이 트랜스포터 또는 대사 효소인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포에 2 종 이상의 트랜스포터의 유전자를 도입하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포에 2 종 이상의 대사 효소의 유전자를 도입하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포에 TauT 및 2 종의 대사 효소의 유전자를 도입하는 것을 포함하는 방법.
세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 포함하는 DNA 구축물을 도입하고, 그 non-coding RNA 를 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 배가 시간이 빠른 세포를 구축하는 방법.
세포에, NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 그 유전자를 발현시키고, 또한, 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킨 세포.
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 30 염기 길이까지의 저분자 RNA 인, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포.
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 561 염기 길이까지의 mRNA 형 논코딩 RNA 인, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포.
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 가 NfkBia 의 mRNA 의 일부에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열을 포함하는 561 ∼ 1579 염기 길이의 mRNA 형 논코딩 RNA 인, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포.
19 ∼ 25 염기 길이의 연속하는 배열이, 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열 중의 임의의 부분 배열 또는 그 상보 배열인, 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 방법 또는 세포.
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자가 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열을 갖는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포.
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자가 이하의 염기 배열 또는 그 상보 배열을 갖는 DNA 인, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포：
(a) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열에 염기쌍 형성에 의해 결합할 수 있는 배열；
(b) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열과 1 또는 수 (數) 염기를 제외하고 동일한 염기 배열；
(c) 배열 번호 1 ∼ 16 및 29 중 어느 것의 염기 배열을 포함하는, NfkBia 유전자의 3' 측 비번역 영역의 부분 배열;
(d) 상기 (c) 의 배열과 1 또는 수 염기를 제외하고 동일한 염기 배열로 이루어지는 배열.
세포에, 추가로 원하는 단백질의 유전자가 도입되어 있는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법, 또는 제 9 항에 기재된 세포.
원하는 단백질이 항체인, 제 16 항에 기재된 방법 또는 세포.
제 1 항에 기재된 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법으로서,
세포에, 1 번째의 외래 유전자 및 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 이들 유전자를 발현시키는 것, 및
세포에, 1 번째의 외래 유전자와 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 2 번째의 외래 유전자를 도입하는 것을 포함하고,
1 번째와 2 번째의 외래 유전자는 단백질을 코드하는 유전자이며,
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자, 및 단백질을 코드하는 1 번째와 2 번째의 외래 유전자를 발현하는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주가 수립되는 상기 방법.
제 1 항에 기재된 2 개 이상의 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 단백질 생산을 위한 세포주를 수립하는 방법으로서,
세포에, 1 번째의 외래 유전자 및 NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자를 도입하여, 이들 유전자를 발현시키는 것,
세포에, 2 번째의 외래 유전자를 도입하는 것, 및
세포에, 2 번째의 외래 유전자와 동시에 안정적으로 발현하는 것이 곤란한 3 번째의 외래 유전자를 도입하는 것을 포함하고,
1 번째, 2 번째, 및 3 번째의 외래 유전자는 단백질을 코드하는 유전자이며,
NfkBia 의 발현을 억제하는 non-coding RNA 의 유전자, 및 단백질을 코드하는 1 번째, 2 번째, 3 번째의 외래 유전자를 발현하는, 재조합 단백질 생산을 위한 세포주가 수립되는 상기 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
1 번째의 외래 유전자가 TAUT (taurine transporter) 유전자인 방법.
제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포에, 추가로 원하는 단백질의 유전자가 도입되어 있고, 당해 원하는 단백질의 생산을 위한 숙주 세포주가 수립되는 방법.