TWI692526B

TWI692526B - 改變宿主細胞的建立方法

Info

Publication number: TWI692526B
Application number: TW107130544A
Authority: TW
Inventors: 田淵久大
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2020-05-01
Also published as: WO2014058025A1; SG11201502801RA; JP2019022508A; TW201439319A; EP2921554A1; CN104718291B; TW201903153A; KR102213583B1; EP2921554A4; HK1208497A1; CN104718291A; US11608508B2; KR102358375B1; KR20210014223A; TWI642779B; CN112522353A; EP2921554B1; JPWO2014058025A1; US20150275230A1; JP6680848B2

Abstract

本發明之課題係建立適用於作為使用於生產重組蛋白質之宿主細胞，且安定地大量表現導入之基因，並安定地增殖之細胞株。藉由本發明，可提供建立目的為生產重組蛋白質之細胞株之方法，其係包含將抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因導入細胞，及可安定地表現2個以上的外來基因。

Description

改變宿主細胞的建立方法

本發明係有關經使用培養動物細胞之重組蛋白質之製造，更詳細係有關建立可以極佳效率製造目標蛋白質之宿主細胞之技術。

使用基因重組技術生產作為醫藥有用的蛋白質時，由於使用動物細胞，可進行原核細胞無法進行之複雜的轉譯後修飾與摺疊(folding)，動物細胞係已被用作為目的為生產重組蛋白質之宿主細胞。

近年來，抗體與具生理活性之蛋白質等許多生物醫藥品出現，使動物細胞有效率地生產重組蛋白質之技術，與使生物醫藥品低成本化相連，同時亦為對患者安定的供給之保證。

因此，目前正期望以更高的生產效率製造蛋白質之方法。

已知於宿主細胞中，除了目標蛋白質之基因以外，藉由導入其他構造基因並使其大量表現，可提昇目標蛋白質之生產效率。

例如，目前已揭示一種蛋白質之製造方法，其係包含培養使膜輸送蛋白之牛磺酸轉運蛋白(TauT)之基因大量表現，且經導入編碼所期望蛋白質之DNA之細胞(專利文獻1：WO2007/119774，專利文獻2：WO2009/051109)。

另外，亦揭示藉由使用經導入牛磺酸生合成路徑酵素之半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)基因之細胞，增加所期望蛋白質之生產量(專利文獻3：WO2008/114673)。

以及，揭示藉由使用經導入丙胺酸轉胺酶(ALT)基因之細胞，增加所期望蛋白質之生產量(專利文獻4：WO2009/020144)。丙胺酸轉胺酶係使自丙胺酸生成麩胺酸之酵素，亦已知為人類肝細胞中所含之酵素GTP(麩胺酸丙酮酸轉胺酶)。

目前揭示藉由使用經導入具有碳酸氫根離子轉運蛋白功能之陰離子交換蛋白(AE)基因之細胞，增加所期望蛋白質之生產量(專利文獻5：WO2009/054433)。

進而，亦揭示CSAD與TauT之共同表現、ALT與TauT之共同表現、碳酸氫根離子轉運蛋白與CSAD、或碳酸氫根離子轉運蛋白與ALT之共同表現之結果，能夠更增加所期望蛋白質之生產量(專利文獻3-5)。

然而，本發明團隊發現至今之研究中，將2種外來基因導入宿主細胞時，即使為可建立分別單獨將該基因導入細胞並使其安定表現之細胞株，但卻無法建立可使該2種外來基因共同且安定地大量表現之細胞株。此時，曾經歷過與至少一種該外來基因相同之基因或對照基因，在宿主細胞之表現量係qPCR之檢測極限以下之情況，無法建立可使2種基因共同且安定地大量表現之細胞株。特別係具有相同功能之蛋白質之基因，或與相同代謝系反應有關之酵素之基因，例如，無法建立使2種膜轉運蛋白共同且大量表現之宿主細胞，與使2種酵素共同且大量表現之宿主細胞。另外，克雷雅(GlycArt)公司之2種與糖鏈有關之酵素基因雖可於宿主細胞內表現，但進而來自大量表現之宿主細胞之產生抗體細胞，發現由於酵素基因表現不穩定，抗體之非典型岩藻醣含量脫離期待範圍之事例。

綜上所述，欲使相異的2種以上之基因大量表現，伴隨有許多困難。〔先前技術文獻〕〔專利文獻〕

專利文獻1：WO2007/119774 專利文獻2：WO2009/051109 專利文獻3：WO2008/114673 專利文獻4：WO2009/020144 專利文獻5：WO2009/054433

〔發明欲解決之課題〕

本發明係提供一種目的為使被用於生產重組蛋白質之宿主細胞，可安定且大量表現難以表現之基因之新穎的技術。另外，亦提供建立使倍增時間變快，且安定地增殖之細胞株之技術。〔解決課題之手段〕

本發明者之研究團隊先前已發現，控制使未編碼蛋白質之核酸序列，藉由於宿主細胞內以RNA方式表現之NfkBia(細胞核因子κB抑制劑α，nuclear factor κB inhibitor α，或I-κB (inhibitor-κB))之表現，且具有提昇重組抗體等蛋白質之生產能力功能之特定的核酸序列(PCT/JP2012/058577(WO2012/137683))。本發明團隊將具有該功能之RNA或DNA或該等之序列總稱並命名為APES (Antibody Production Enhancing Sequence，抗體製造增強序列)(依不同情況有時亦稱作PPES (Polypeptide Production Enhancing Sequence，多肽製造增強序列))。

APES被認為係介由抑制NfkBia(或I-κB)之表現，而活性化NF-κ(kappa)B之功能性核酸。另外，具有該等功能之核酸已知為KSHV miRNA-K1等(Lei, Xiufen et al., Nat. Cell. Biol., 12(2), p193-199, 2010)。

此次，本發明團隊發現APES之新穎的用途。

亦即，本發明團隊發現APES係具有如(1)構築使於一般細胞難以表現之特定基因可大量表現之細胞，與(2)可構築於一般細胞難以建立之使相異的2種以上的基因安定且大量表現之細胞，使導入基因安定且大量表現之功能。

因此，本申請案係提供藉由於宿主細胞導入APES基因，使表現困難的外來基因或表現不安定的外來基因，可於該細胞內安定且大量表現之方法。

另外，本申請案係提供藉由將APES基因導入宿主細胞，建立使倍增時間加快，可安定地增殖之細胞之方法。

APES基因係編碼可抑制NfkBia表現之non-coding RNA(無法被轉譯為蛋白質之RNA)之DNA。

本申請案之要旨係如下所述。 (1) 一種方法，其係建立目的為生產重組蛋白質之細胞株之方法，係包含將抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因導入細胞，並使該基因表現，及可安定地表現2個以上的外來基因。 (2) 如(1)之方法，其中2個以上的外來基因，係編碼難以同時且安定地表現之蛋白質。 (3) 如(2)之方法，其中難以同時且安定地表現之蛋白質，係屬於均具有類似功能之蛋白質。 (4) 如(3)之方法，其中具有類似功能之蛋白質係轉運蛋白或代謝酵素。 (5) 如(1)～(4)項中任一項之方法，其係包含將2種以上的轉運蛋白(TauT與AE1)之基因導入細胞。 (6) 如(1)～(4)項中任一項之方法，其係包含將2種以上的代謝酵素(丙酮酸代謝路徑之酵素，ALT1與PC)之基因導入細胞。 (7) 如(1)～(4)項中任一項之方法，其係包含將TauT以及2種代謝酵素之基因導入細胞。 (8) 一種方法，其係構築倍增時間較快之細胞之方法，係包含將含有抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因之DNA構築物導入細胞，且使該non-coding RNA於細胞內表現。 (9) 一種細胞，其係經導入抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因，並使該基因表現，且，可使2個以上的外來基因安定地表現。 (10) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)，係包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19～25個鹼基長之連續的序列，最長至30個鹼基長之低分子RNA。 (11) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)，係包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19～25個鹼基長之連續的序列，最長至561個鹼基長之mRNA型非編碼RNA。 (12) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)，係包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19～25個鹼基長之連續的序列，係561～1579個鹼基長之mRNA型非編碼RNA。 (13) 如(10)～(12)項中任一項之方法或細胞，其中19～25個鹼基長之連續的序列，係序列編號2所示之鹼基序列中之任意的部分序列或其互補序列。 (14) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因，係具有序列編號1～16以及29之任一之鹼基序列。 (15) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因，係具有下述之鹼基序列或其互補序列之DNA： (a)與序列編號1～16以及29之任一之鹼基序列能藉由形成鹼基配對結合之序列； (b)與序列編號1～16以及29之任一之鹼基序列除了1個或數個鹼基之外相同之鹼基序列； (c)包含序列編號1～16以及29之任一之鹼基序列之NfkBia基因的3’端非轉譯區域之部分序列； (d)與上述(c)之序列除了1個或數個鹼基之外相同之鹼基序列。 (16) 如(1)～(8)項中任一項之方法，或(9)之細胞，其中係進而將期望的蛋白質之基因導入細胞。 (17) 如(16)之方法或細胞，其中期望的蛋白質係抗體。 (18) 一種方法，其係建立可使(1)之2個以上的外來基因安定地表現，目的為生產重組蛋白質之細胞株之方法，係包含：將第1個外來基因以及抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因導入細胞，且使該等基因表現、以及將難以與第1個外來基因同時且安定地表現之第2個外來基因導入細胞；且第1個與第2個外來基因係編碼蛋白質之基因，該方法係建立目的為生產重組蛋白質之細胞株，其係表現抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因、以及編碼蛋白質之第1個與第2個外來基因。 (19) 一種方法，其係建立可使(1)之2個以上的外來基因安定地表現，目的為生產重組蛋白質之細胞株之方法，係包含：將第1個外來基因以及抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因導入細胞，且使該等基因表現、將第2個外來基因導入細胞、以及將難以與第2個外來基因同時且安定地表現之第3個外來基因導入細胞；且第1個、第2個、以及第3個外來基因係編碼蛋白質之基因，該方法係建立目的為生產重組蛋白質之細胞株，其係表現抑制NfkBia表現之non-coding RNA(非編碼核糖核酸)之基因、以及編碼蛋白質之第1個、第2個、以及第3個外來基因。 (20) 如(18)或(19)項之方法，其中第1個外來基因係TAUT(taurine transporter，牛磺酸轉運蛋白)基因。 (21) 如(18)～(20)項中任一項之方法，其中係進而將期望的蛋白質之基因導入細胞，並建立目的為生產該期望的蛋白質之宿主細胞株。〔發明的效果〕

藉由本發明，可於宿主細胞中使各種外來基因安定且大量表現。因此，利用本發明可使在一般細胞表現有困難之多肽，製造為醫藥品。另外，提高表現有困難的抗原蛋白質之表現量，使開發相對於該等抗原之抗體變為容易。另外，由於藉由本發明，可構築使複數個基因安定地大量表現之細胞，使製作包含多數組有用基因，且為了生產重組蛋白質之宿主細胞變為可能。

另外，根據本發明其他的實施方式，使建立倍增時間加快，且安定地增殖之細胞變為可能。因此，經使用培養動物細胞生產重組蛋白質之情況，若利用該等細胞作為宿主，可有效率地生產目標的蛋白質。

以下，針對本發明之實施方式更詳細地說明。

(1)APES(Antibody Production Enhancing Sequence) APES係NF-κB的抑制蛋白質之使I-κB不活性化之核酸分子，更具體而言，係抑制I-κB的控制次單元I-κBα (NfkBia)基因表現之核酸分子。該等核酸分子本身係抑制NfkBia表現之non-coding RNA，APES係non-coding RNA本身，或編碼其RNA之DNA或該等序列的總稱。

或者，APES係能夠藉由與來自人類、小鼠、大鼠或倉鼠的NfkBia基因之DNA或mRNA形成鹼基配對而結合，包含可抑制NfkBia表現的鹼基序列之核酸分子。該等核酸分子被認為與NfkBia基因DNA或mRNA結合，而可阻礙其表現。APES係例如對NfkBia的mRNA進行RNA干涉的分子。

或者，APES係包含能藉由與來自人類、小鼠、大鼠或倉鼠的NfkBia基因DNA或mRNA形成鹼基配對而可結合之序列，可為雙股RNA (dsRNA)、或短dsRNA之siRNA、或解離為單股之siRNA、或shRNA、反意DNA或RNA、microRNA (miRNA)或mRNA型非編碼RNA。

或者，APES係來自人類、小鼠、大鼠或倉鼠的NfkBia基因DNA或mRNA之互補序列形成之鹼基序列，或該等互補序列包含於序列之一部分中之鹼基序列，為含有可抑制NfkBia表現之鹼基序列之核酸分子。

或者，APES係來自人類、小鼠、大鼠或倉鼠的NfkBia基因DNA或mRNA之部分序列或該等部分序列的互補序列，係含有可抑制NfkBia表現之鹼基序列之核酸分子。

例如，APES，可為由含有與標的之NfkBia mRNA的一部分相同或互補的序列所構成之寡核苷酸。該等寡核苷酸之例，可舉出相當於NfkBia mRNA互補鏈之19～25鹼基的序列、或具有與該序列除了一鹼基之外為相同序列、且具有抑制NfkBia之表現效果的低分子RNA。此處，低分子RNA係指Small non-coding RNA(小非編碼RNA，snRNA)，snRNA中包含miRNA。

或者，APES亦可為長鏈的mRNA型非編碼RNA，例如可為由包含藉由於NfkBia之基因DNA或mRNA形成鹼基配對而可結合之序列的長度最多為561核苷酸長(561mer)的序列所構成，且具有抑制NfkBia之表現效果者。或者，APES可為更加長鏈(數百～數十萬核苷酸)的mRNA型非編碼RNA。例如，APES可為200～10萬核苷酸長、或300～30萬核苷酸長之核酸分子或序列。APES係包含與NfkBia之mRNA的一部分互補的序列(例如上述之snRNA序列)，可為561～1579鹼基長，或500～1000鹼基長之mRNA型非編碼RNA。

藉由形成鹼基配對而可結合之序列，意指不限於完全對合(亦即100%互補)者，在不妨礙功能的範圍亦容許不對合鹼基的存在。或者，依APES之形態不同，部分的互補性反而更佳。因此，例如於包含NfkBia之非轉譯區域的基因DNA或mRNA中，有至少70%、更佳為80%、又更佳為90%、最佳為95%相同之序列或其互補序列，亦包含於「藉由形成鹼基配對而可結合之序列」中。例如561mer或500mer之mRNA型非編碼RNA之至少90%相似的序列中，亦包含含有由於鹼基之插入、缺失、或點突變所造成之1～50個(或561mer之情況為1～56個)之失配鹼基的變異序列，且伴隨其於宿主細胞中的表現、抗體等重組多肽的產生能力會增大，或具有抑制NfkBia表現之功能者。因此，例如如同具有70%以上的相同性，具有某種程度的序列類似性，且來自與宿主細胞不同物種之NfkBia同源基因(異種間相同基因)而來之序列，亦可被利用為APES。

或者，藉由形成鹼基配對而可結合之序列，亦包含於在如細胞內之條件下，可與NfkBia mRNA結合之序列。該等序列係包含例如在作為高度嚴格的條件下相關業者周知之條件下進行雜交，且具有所期望的功能之序列。高度嚴格的條件下之一例係將聚核苷酸與其他多核苷酸，在含有6×SSPE或SSC、50%甲醯胺、5×Denhardt’s試藥(丹哈特試藥)、0.5%SDS、100μg/ml之片段化變性鮭魚精子DNA之雜交緩衝溶液中，放置於42℃之雜交溫度孵育12～16小時(此時，一方之多核苷酸亦可使其附著於如膜般的固體表面)，接著，使用含有1×SSC、0.5%SDS之洗淨緩衝液，以42℃以上的最適溫度進行數次洗淨。針對其他具體條件，可參照山布魯克(Sambrook)等「分子純化繁殖：實驗手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第3版」冷泉港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Pr)；以及，奧蘇貝爾(Ausubel)等「分子生物學實驗流程」丸善，等多數相關業者周知之實驗手冊。

APES之另一實施方式係與來自人類、小鼠、大鼠或倉鼠的NfkBia的mRNA之3’端非轉譯區域之部分序列相同或互補的序列，且含有可抑制NfkBia表現之鹼基序列之核酸分子。

如後述之參考例中之說明般，本發明團隊發現於培養CHO細胞中，與抗體產生能力相關的可使表現量提高之mRNA型非編碼RNA。該RNA被鑑定為係由小鼠基因體中437鹼基構成之周知序列(圖1，基因資料庫登錄碼(GenBank Accession ID)：AI462015，序列編號1)的轉錄產物。AI462015的序列以及小鼠基因體上之位置係示於圖1。AI462015的轉錄產物437鹼基係相當於小鼠NfkBia的mRNA之3’端非轉譯區域(513鹼基)的互補鏈(圖23)。進而，本發明團隊發現藉由將具有來自AI462015的一部分序列之核酸分子導入宿主細胞並使其表現，可使所期望的多肽生產量增加。

上述來自AI462015之序列或一部分序列，被認為不僅是小鼠、倉鼠等囓齒類，亦被保存於人類、其他哺乳類、魚類、昆蟲等動物亦為保存性高的序列。因此，對應來自AI462015之序列或一部分序列之來自各種動物細胞的NfkBia的mRNA之3’端非轉譯區域的部分序列或其互補序列，亦可使用為本發明APES序列。

APES之一具體例係來自小鼠AI462015的一部分的序列，或具有如該等部分序列中有1～數個鹼基經取代、缺失或附加的序列。特別可舉出自5’端第4號之G至第168號之C為止的鹼基序列所構成之165鹼基的DNA序列(序列編號2，APES165)，或其互補(反意)DNA序列或包含自該等DNA轉錄之RNA序列的序列，或此序列中之任意長度的部分序列。或者，可舉出自5’端第4號之G至3’末端的T為止的鹼基序列所構成之434鹼基的DNA序列(序列編號3，APES434)，或其互補(反意)DNA序列或包含自該等DNA轉錄之RNA序列的序列，或來自此序列中之任意長度的部分序列。包含對應於小鼠AI462015序列之來自人類、倉鼠，大鼠等哺乳類之序列的序列，或該等之部分序列，或如該等部分序列中，有1～數個鹼基經取代、缺失或附加的鹼基序列亦包含於其中。

於其中一實施方式中，APES係具有AI462015中自5’端第4號至第133號為止的鹼基序列(序列編號4，APES130)或來自該序列之一部分的序列。例如可舉出自5’端第4號至第68號為止(序列編號5，APES4-68)，或自第69號至第133號為止(序列編號6，APES69-133)之DNA序列或其互補DNA序列或自該等之DNA經轉錄之序列。

一實施方式中，APES係具有AI462015中自5’端第40號至第91號為止的52鹼基(序列編號7)的序列，或來自該52鹼基於任意位置經被切斷的一部分序列之序列。可舉出例如前半部分(APES40-68之29鹼基、APES40-63之24鹼基、或APES40-61之22鹼基)、或後半部分(APES69-91之23鹼基)的DNA序列、其互補DNA序列(分別相當於序列編號8～11)、或經自該等DNA轉錄之序列。

上述之52鹼基，除一鹼基之外，為與大鼠NfkBia基因之3’端非轉譯區域的互補鏈相同之序列。另外，其5’端之24鹼基(APES40-63，序列編號9)係與人類NfkBia基因之3’端非轉譯區域相同序列。另外，5’端之22鹼基(APES40-61，序列編號10：AAGTACCAAAATAATTACCAAC)係與大鼠、恆河猴、狗、馬等超越物種之NfkBia mRNA之3’端非轉譯區域的互補鏈相同之序列。藉由使與NfkBia基因3’端非轉譯區域互補的一部分序列宿主細胞中表現，可期待RNAi效果。例如，具有與上述52鹼基中19～25鹼基互補序列之RNA，藉由作為microRNA(微小RNA，miRNA)而作用於NfkBia的mRNA非轉譯區域，具有阻礙轉譯之可能性。

或者，APES係具有AI462015中自5’端第7號至第91號為止的85鹼基(序列編號29)的序列，或來自該85鹼基於任意位置經被切斷的一部分序列之序列。具有與上述85鹼基中19～25鹼基互補序列之RNA，藉由作為microRNA(miRNA)而作用於NfkBia的mRNA非轉譯區域，具有阻礙轉譯之可能性。

於一實施方式中，APES係具有於21鹼基之siRNA搜尋中發現之序列。例如包含與AI462015中自第84號至第104號(序列編號12，APES84-104)、自第99號至第119號(序列編號13，APES99-119)、自第101號至第121號(序列編號14，APES101-121)之DNA序列互補的序列之miRNA序列。上述之APES 69-133中第71號至第112號之序列(序列編號16)經於GeneChip(基因晶片)上定量，由於其為實際上大量表現之區域，認為APES84-104有作為miRNA之功能之可能性極高。

另一實施方式，APES亦可為抑制NfkBia表現之周知之non-coding RNA。該等核酸分子之例係可舉出KSHV (Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒)miRNA-K1。(序列訊息係參照X Cai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 April 12; 102 (15): 5570-5575等)

另外，基於APES之構造上或功能上特徵，可重新將具有作為APES活性之核酸分子，由化學合成或生物源進行單離。APES之構造上的特徵係包含與標的之NfkBia mRNA之一部分互補的序列之核酸分子。核酸分子的形態可為任一形態，可為DNA、DNA的轉錄產物、mRNA、cDNA、或exosome RNA(外吐小體RNA)、化學合成之單股RNA、化學合成之雙股RNA等。功能上的特徵係伴隨於其宿主細胞中之表現，使抗體等重組多肽的生產能力增大，或，抑制NfkBia之表現。

自生物源單離APES時，並未特別限制來自何種生物。具體而言，可舉出來自人類、黑猩猩等靈長類；小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒類；牛、豬、山羊等家畜類；雞等鳥類；斑馬魚等魚類；蒼蠅等昆蟲類；線蟲類等動物之APES，來自人類、囓齒類或與宿主細胞相同種的APES，例如使APES大量表現細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)時，使用來自人類、小鼠或倉鼠之APES為佳。

該等核酸分子可依據相關業者周知之方法調製。例如，由大量產生抗體等重組多肽之培養細胞調製全RNA，再以本發明之核酸序列(例如序列編號2之APES165)為基礎來合成寡核苷酸，使用其作為引子進行PCR反應，藉由使具有作為APES特徵的cDNA增幅而進行調製。另外，大量產生抗體等重組多肽之培養細胞於調製低分子RNA之後，製作cDNA基因庫，基於經選殖之cDNA鹼基序列，可得到包含與NfkBia mRNA互補的部分序列之低分子RNA。cDNA基因庫亦能夠於調製microRNA (miRNA)等低分子RNA後，藉由利用Sambrook, J. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)之方法構築。

可藉由決定所得之cDNA鹼基序列，將所得之cDNA作為探針來篩選基因體DNA基因庫，藉以分離表現APES之基因體DNA。

具體而言可如下述方式進行。首先，可自表現本發明之APES之細胞、組織等，分離出全RNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等而調製全RNA，再使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)等將全RNA再進而純化。

使用逆轉錄酵素自所得之全RNA合成cDNA。cDNA之合成可使用SuperScript^TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen，英杰公司)等而進行。另外，使用引子等，遵循使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)，以及聚合脢連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)之5’- RACE法(Frohman, M. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。

自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌等後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。

由所得之DNA可藉由市售試劑組與周知之方法而改變。改變可舉出例如利用site-directed mutagenesis(定位突變)法之一鹼基變異導入等。經如此改變後之序列，只要具有APES活性，均包含於本發明之範圍內。此處，「具有APES活性」係指具有藉由於宿主細胞內表現而抑制NfkBia(I-κBα)表現之功能。

本說明書中，有時將具有APES活性之核酸分子稱為本發明之核酸分子。

(2)APES對宿主細胞之導入以及表現本發明係包含將APES，亦即抑制NfkBia表現之non-coding RNA，之基因導入宿主細胞，進而，使APES表現，較佳係包含使APES大量表現。

使APES大量表現係指與原本的細胞相比，APES之表現量增加之意。並未特別限制原本的細胞，可舉出例如CHO細胞等製造重組蛋白質時作為宿主而使用之細胞。作為具體例，若依下述參考例說明，於使用了AFFYMETRIX(艾菲矩陣)公司寡核苷酸陣列(Affymetrix MOUSE430_2)之GeneChip實驗中，將抗體基因導入前之原本的細胞，AI462015訊息值為2000以下，相較於此，APES之表現量增加係指例如AI462015之訊息值變為2倍以上。

經導入APES基因，APES大量表現的細胞，係於細胞內含有內因性或外來APES。大量表現APES之細胞可舉出例如將APES經人為地導入之細胞。

將APES經人為地導入之細胞可依據相關業者周知之方法而製作，例如，可藉由將編碼APES之DNA序列接入載體，再將該載體對細胞轉形而製作。

進而，本說明書中藉由基因活化技術(參照例如國際公開第WO94/12650號公報)活化內因性APES，其結果，大量表現APES細胞亦包含於將APES經人為地導入之細胞。

內因性APES典型的例子，係作為宿主細胞基因體上被編碼之DNA序列之APES。另外，本發明亦可不利用基因活化技術，例如抗體基因導入後以某種重要因子活化內因性APES之轉錄，而利用為大量表現之細胞。

(3)表現載體表現載體係適用於為了於宿主細胞中大量表現APES，以及為了使轉運蛋白與代謝酵素等外來的多肽表現。另外，對作為醫藥品有效成分與抗原之有用的外來多肽之表現，亦使用表現載體。

本發明中可使用之表現載體，可舉出例如來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322)，pEF，pCDM8)、來自昆蟲細胞之表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system，昆蟲桿狀病毒表現系統」(GIBCO BRL公司製，pBacPAK8)、來自植物之表現載體(例如pMH1，pMH2)、來自動物病毒之表現載體(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)、來自輪狀病毒之表現載體(例如pZIpneo)、來自酵母菌之表現載體(例如「Pichia Expression Kit，酵母表現試劑組」(Invitrogen公司製)，pNV11，SP-Q01)、來自枯草桿菌之表現載體(例如pPL608，pKTH50)等。

為了使外來的多肽表現之表現載體，係包含編碼該多肽的DNA以及可促進該DNA表現的表現控制序列。相同的，為使APES表現之表現載體，係包含編碼APES的DNA以及可促進該DNA表現的表現控制序列。單一的載體，可為一種以上的多肽以及以為了使APES表現而構築。使用基因活化技術，例如使宿主基因體的一部分的APES或使多肽基因活化之情況，亦可為經導入促進該等來自宿主細胞的DNA的表現之表現控制序列。

表現控制序列之例係具有適當的啟動子、加強子、轉錄終止子、含有編碼蛋白質基因中之開始密碼子(亦即ATG)之Kozak序列、用於內含子之剪接訊息、多腺苷酸化部位及終止密碼子等，相關業者可適當地進行構築載體。

表現控制序列，在所使用之動物細胞中，以含有可增大基因之轉錄量的啟動子/加強子區域為佳。與編碼所期望的多肽之基因之表現相關的啟動子/加強子區域，可含有NF-κB結合序列，亦可為不含。

以於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等哺乳動物細胞進行表現為目的時，為使於細胞內進行表現所必須的啟動子以具有例如SV40啟動子(Mulligan等人, Nature(1979)277, 108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等人, Nucleic Acids Res.(1990)18, 5322)、CMV啟動子等為佳。以具有選拔細胞轉形之基因(例如藉由藥劑(紐奧黴素、G418等)可判別之耐藥劑性基因)為佳。具有該特性之載體，可舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

進而為使基因安定地進行表現，並且，以使細胞內之基因拷貝數增加為目的時，可舉出於核酸合成路徑缺損之CHO細胞，導入具有可與其互補之DHFR基因之載體(例如pCHOI等)，藉由滅殺除癌錠(MTX)使其增幅之方法，另外，以使基因短暫表現為目的時，可舉出使用於染色體上具有表現SV40 T抗原基因之COS細胞，以具有SV40複製起點之載體(pcD等)進行轉形之方法。複製起點可使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒 (BPV) 等者。進而為於宿主細胞系增幅基因之拷貝數，表現載體之選擇標記為可含有胺基糖磷酸轉移酶(APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。

(4)宿主細胞本發明中使用之宿主細胞並無特別限制，可使用動物細胞、植物細胞、酵母等真核細胞、大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞等任一種細胞，較佳係來自昆蟲、魚、兩棲類、爬蟲類、哺乳類等動物細胞，以哺乳動物細胞較佳。哺乳動物細胞的來源可舉出人類、黑猩猩等靈長類、小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒類、及其他，以使用人類、囓齒類為佳。進而作為本發明之細胞，可為一般於表現多肽常使用之CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞等哺乳動物培養細胞為佳。

以大量表現適用作為醫藥品與抗原之多肽為目的時特別以CHO細胞為佳。CHO細胞則特別適合使用有DHFR基因缺損之CHO細胞之dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)及CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)。

上述之CHO細胞特別係以DG44株、DXB-11株、K-1、CHO-S為佳，以DG44株以及DXB-11株為佳。

宿主細胞可使用例如作為為了製造如醫藥品與抗原之所期望的多肽之產生系。該等細胞，可為可產生所期待的多肽之天然細胞，亦可為經導入編碼所期待多肽之DNA之細胞，以經導入編碼所期待多肽之DNA之轉形細胞為佳。

經導入編碼所期待多肽之DNA之轉形細胞之一例，係至少轉染含有編碼所期待多肽之DNA之表現載體之宿主細胞。

進而，於本發明中，「經導入DNA(或基因)」之細胞，係經轉染外來性DNA之細胞之外，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號公報)，使內因性之DNA被活化，其結果係包含細胞開始或增加對應相關DNA之蛋白質表現或相關DNA之轉錄。

使用經人為地導入APES之細胞製造所期望的多肽時，APES與編碼所期望的多肽之基因的導入順序並無特別限制，可為導入APES後再導入編碼所期望的多肽之基因，亦可於導入編碼所期望的多肽之基因之後，再導入APES。另外，亦可同時導入APES與編碼所期望的多肽之基因。

使用載體時，APES以及編碼所期望的多肽之基因的導入係可藉由單一的載體同時間進行導入，亦可使用複數個載體分別進行導入。

(5)外來基因本發明中，藉由預先於宿主細胞中導入APES並使其大量表現，可使難以表現的外來基因或表現不安定的外來基因，於細胞內安定且大量表現。

使用宿主細胞以製造所期望的多肽時，除了製造標的所期望的多肽之基因之外，導入其以外的外來基因，可使其於細胞內安定且大量表現。

經導入編碼所期待多肽之DNA之轉形細胞內，以藉由表現外來基因，增加所期望的多肽之生產量為佳。該等外來基因係可舉出編碼牛磺酸轉運蛋白(TauT)、半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、陰離子交換蛋白(AE)、丙酮酸羧化酶(PC)、X-box binding protein (XBP-1，X框結合蛋白-1)等之DNA。

本發明中，藉由預先於宿主細胞中導入APES並使其大量表現，可使所期望的蛋白質基因以外的複數外來基因導入該宿主細胞後安定地表現。宿主細胞中，除了所期望的多肽的基因之外，以藉由使其以外的特定的2個以上外來基因表現，增加所期望的多肽的生產量為佳。其結果，可建立適用於生產重組蛋白之細胞株。

該等2個以上之外來基因，係可編碼難以同時且安定表現之蛋白質之基因。亦即，藉由預先於宿主細胞中導入APES並使其大量表現，除了所期望的多肽的基因之外，可使2個以上的外來基因同時且安定地表現。因此，「難以同時且安定地表現」係指於宿主細胞中未導入APES之狀態時，無同時且安定地表現，且為編碼2個以上的蛋白質之外來基因之組合。

此處，「難以同時且安定地表現之2個以上的外來基因」係指未導入APES之動物細胞，較佳係於導入所期望的蛋白質之基因前的宿主細胞，分別單獨導入時可建立該外來基因安定地表現之細胞株，但於進行將該等2個以上的外來基因導入處理後，即使藉由藥劑等進行選拔處理，亦無法獲得使編碼該2個以上的蛋白質之外來基因同時表現之細胞之基因。此時，至少與一方該外來基因相同之基因、或對照基因之於該外來基因導入前之宿主細胞中表現量，係利用qPCR檢測極限以下為佳。

另外，本發明之細胞係已導入編碼2個以上的蛋白質之外來基因，即使為為了生產所期望的蛋白質之宿主細胞，導入所期望的蛋白質之基因後，藉由至少2次以MTX等藥劑處理、進行為了增幅所期望蛋白質的基因之選拔處理時，該當選拔處理前之編碼該當2個以上的蛋白質的外來基因中、至少1個基因的表現量未達50%，較佳係30%以下，進而更佳係10%以下，最佳係表現消失時，本發明中將該等基因稱為「難以同時且安定地表現之2個以上的外來基因」。

另外，自其他角度而言，「難以同時且安定地表現之2個以上的外來基因」係指選拔導入編碼2個以上的蛋白質之外來基因、未導入APES之細胞時之，與該外來基因之表現量相比，該細胞至少進行15代繼代培養後，該編碼2個以上的蛋白質之外來基因中至少1個基因的表現量未達50%，較佳係30%以下，進而更佳係10%以下，最佳係表現消失之基因。

「同時且安定地表現」係指，具體而言，本發明之細胞為為了生產所期望的蛋白質之宿主細胞時，經導入編碼2個以上的蛋白質之外來基因、於含APES之宿主細胞中、導入所期望的蛋白質的基因後，即使藉由至少2次以MTX等藥劑處理、進行為了增幅所期望蛋白質的基因之選拔處理，該當選拔處理前之編碼該當2個以上的蛋白質的外來基因之表現量，分別維持於50%以上，較佳係70%以上之表現量之狀態。

另外，自其他角度而言，「同時且安定地表現」係指選拔經導入2個以上的外來基因之細胞時，與該外來基因之表現量相比，即使於該細胞至少進行15代繼代培養後，該編碼2個以上的蛋白質之外來基因的表現量分別維持為50%以上，較佳係70%以上，進而更佳係80%以上的表現量之狀態。

本發明中，係如上所述，將維持2個以上的外來基因為「同時且安定地表現」狀態之細胞株，稱為經建立的細胞株。

本發明中「難以同時且安定地表現之蛋白質」係可為屬於具有類似功能之蛋白質。難以同時且安定地表現、具有類似功能之蛋白質之組合例，係可舉出2種以上的膜輸送蛋白質或為了該功能所必須的輔助蛋白、及2種以上的酵素蛋白質、較佳係與相同代謝路徑有關之代謝酵素、以及2種以上的轉錄因子之組合。

或者，難以同時且安定地表現之蛋白質之組合，係亦可為2種以上的膜輸送蛋白質與1或2種以上的酵素蛋白質之組合。或者，難以同時且安定地表現之蛋白質之組合，係亦可為1或2種以上的膜輸送蛋白質與2種以上的酵素蛋白質之組合。

膜輸送蛋白質係指生體膜、為仲介物質輸送之蛋白質，亦被稱為輸送體(轉運蛋白)、担體(担體)、穿透酵素(穿透酵素)等。所扮演的細胞膜的重要角色係使各種離子與營養素等選擇性地通過之功能，為掌管該功能之膜蛋白質。膜輸送蛋白質中亦包含仲介糖與胺基酸等有機物質之輸送之蛋白質、以及離子輸送體之離子幫浦以及離子通道。各種糖或胺基酸的輸送體(轉運蛋白、穿透酵素)以及離子輸送體目前已被純化出來，且該等之基因係已周知。

本發明中，例如，具有類似功能的蛋白質的基因，係可為2種以上的轉運蛋白基因之組合。2種的轉運蛋白之例可舉出TauT與AE1。

具有類似功能的酵素蛋白質的代表例，係複數的代謝酵素之組合。例如，具有類似功能的酵素蛋白質的基因，係可為相同路徑之2種以上的代謝酵素基因。該等代謝酵素可為促進相同路徑內的連續反應之2種以上的酵素。例如，相同路徑的代謝酵素，係可為觸媒胺基酸的分解反應之酵素。另外，代謝酵素之例可舉出丙酮酸代謝路徑之酵素。2種以上的丙酮酸代謝路徑之酵素之例，係可為ALT1與PC。

或者，具有類似功能的酵素蛋白質之例，係亦可為複數的糖轉移酵素的組合。

另外，1或2種以上的膜輸送蛋白質與2種以上的酵素蛋白質之組合之例，係可為TauT以及2種代謝酵素。

如上所述，為使宿主細胞人為地表現APES，係於細胞中人為地導入抑制NfkBia表現之non-coding RNA之基因，藉由使該基因表現而可實現。2個以上的外來基因表現，亦可同樣地，於細胞中人為地導入該等外來基因，藉由使該基因表現而可實現。

對宿主細胞的外來性DNA(亦可為插入於載體者)之導入，係例如使用磷酸鈣法、DEAE葡聚醣法、陽離子脂質體DOTAP(Boehringer-mannheim公司製)之方法、電穿孔法、Nucleofection(單孔細胞核轉染)法(amaxa公司)、微脂粒感染法等方法進行。

進而，本發明中，「經導入DNA(或基因)」細胞係指將外來性DNA經轉染之細胞之外，藉由基因活化技術(參照例如國際公開第WO94/12650號公報)活化內因性DNA，其結果，亦包含對應該DNA之蛋白質表現或該DNA之轉錄為開始或增加之細胞。

於宿主細胞中導入難以同時且安定地表現之2個以上的外來蛋白質之基因、並使其安定地表現，係於導入第2個外來基因之前，預先於宿主細胞中導入APES為佳。使用載體之情況，APES以及第2個以後的外來基因之導入，係使用複數個載體分別進行導入為佳。

另一方面，並未特別限制第一個外來基因與APES導入的順序，可於導入APES之後再導入第1個外來基因，亦可於導入第1個基因之後再導入APES。另外，亦可同時導入APES與第1個外來基因。使用載體之情況，APES與第1個外來基因之導入係可利用單一的載體同時地進行導入，亦可使用複數個載體分別進行導入。

(6)為了生產重組蛋白質之細胞株本發明中，係藉由導入抑制NfkBia表現之non-coding RNA(APES)之基因，並使該基因表現，可獲得即使重複進行繼代培養、編碼複數個蛋白質之外來基因亦可安定且大量表現之為了生產重組蛋白質之細胞株。

另外，藉由於宿主細胞中導入APES的基因，可使倍增時間變快、且可安定地增殖、獲得為了生產重組蛋白質之細胞株。該等細胞，除了APES之外，亦可為進而導入其他外來基因並可安定地大量表現之細胞。

本發明所提供之細胞之例，於後述之實施例中，首先建立於TauT大量表現的細胞中經導入APES165(序列編號2：gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacac)之細胞，接著，藉由於該細胞中進而導入其他的轉運蛋白基因，建立具有協調的功能之2種轉運蛋白為共同且安定地大量表現之細胞。另外，首先建立於TauT大量表現之細胞中經導入APES165之細胞，其次，藉由於該細胞中進而導入2種丙酮酸代謝路徑之酵素之基因，建立促進TauT以及丙酮酸代謝路徑連續反應的2種酵素為共同且安定地大量表現之細胞。該等細胞，由於具有為了生產重組蛋白所希望具有的性質，可適用於為了生產作為醫藥品及抗原有用的所期望的蛋白質之宿主細胞。將該等細胞作為宿主，培養經人為地導入所期望的蛋白質之基因者，使其產生所期望的蛋白質，並藉由回收產生之蛋白質，可製造該所期望的蛋白質。〔實施例〕

以下藉由實施例具體說明本發明。尚且，該等實施例係用於說明本發明者，並非限定本發明之範圍。

實施例1：建立使難以表現的特定的基因大量表現之細胞 (1)膜蛋白之TauT與AE1係於細胞膜表面上透過氯離子的搬入、排出而發揮協同的功能。至今，為了TauT大量表現細胞之TauT功能增強，已重複嘗試建立使AE1同時且大量表現之宿主細胞，但於藥劑選拔過程中發現浮游細胞的附著化，而無法建立共表現細胞。此時，宿主細胞中原本的AE1表現量係qPCR之檢測極限以下。 (2)酵素ALT1與PC(Pyruvate Carboxylase，丙酮酸羧化酶)係進行自丙胺酸至丙酮酸、丙酮酸至草醯乙酸之生合成。至今，為了促進與TCA循環連續的代謝路徑的反應，嘗試使ALT1大量表現的宿主細胞能夠大量表現PC，但無法建立共表現細胞。此時，宿主細胞中原本的ALT1表現量係qPCR之檢測極限以下。

然而，於上述2例中，在第2號基因導入前預先使APES大量表現時，可建立包含APES之3種以上的基因大量表現之細胞。亦即，(1)中於構築在TauT大量表現細胞中使APES大量表現之TAUT/APES細胞之後，藉由導入AE1，可建立TauT與AE1大量表現之大量增殖的TAUT/APES/AE1細胞。於(2)中亦同樣的，自(1)之TAUT/APES大量表現細胞，構築ALT1大量表現的TAUT/APES/ALT1細胞後，藉由導入PC，可建立ALT1與PC大量表現之大量增殖的TAUT/APES/ ALT1/PC細胞。反之，自未預先使APES大量表現之TAUT/ALT1細胞，則無法建立ALT1與PC大量表現之TAUT/ALT1/PC細胞。

且本實施例中，宿主細胞係使用CHO細胞DXB-11株。

[實施例1-1] 建立DXB11/TAUT/APES細胞將倉鼠TAUT表現質體pHyg-TAUT，利用電穿孔法導入宿主細胞DXB11，且於200μg/mL潮黴素(Hygromycin)存在下進行選拔時，建立了具高增殖、且倉鼠TAUT(taurine transporter，牛磺酸轉運蛋白)大量表現的細胞之DXB11/TauT (DT)(圖26)。進而，利用電穿孔法導入APES表現質體pPur-APES165，於6μg/mL嘌呤黴素(Puromycin)存在下進行選拔時，建立了具高增殖、且藉由使APES強制表現之Nfkbia mRNA表現被抑制的細胞之DXB11/TAUT/APES(DTP)(圖26)。DTP細胞中，倉鼠TAUT mRNA大量表現、且Nfkbia mRNA表現抑制係利用Taqman法確認了即使重複進行繼代培養亦安定地維持著(圖27)。

[實施例1-2] 建立DXB11/TAUT/APES/AE1細胞建立使2種轉運蛋白共同且安定地大量表現之宿主細胞，有時會伴隨著困難。例如，尚未建立使宿主細胞DXB11共同且大量表現TAUT與AE1(anion exchanger 1，陰離子交換蛋白)之安定株。然而，於因圖26之倉鼠TAUT大量表現、藉由使APES強制表現、Nfkbia mRNA表現被抑制的細胞之DXB11/TauT/APES (DTP)中，利用電穿孔法導入AE1表現質體pNeo-AE1，於200μg/mL之G418存在下進行選拔時，建立了具高增殖、且使倉鼠TAUT與人類AE1共同且大量表現之細胞之DXB11/TAUT/APES/AE1(DTPE)(圖28)。

DTPE細胞中，倉鼠TAUT mRNA大量表現、人類AE1 mRNA大量表現、Nfkbia mRNA表現抑制、係利用Taqman法確認了即使重複進行繼代培養亦安定地維持著(圖27、圖28)。

反之，於APES導入前之DXB11/TAUT(DT)細胞中，利用電穿孔法導入AE1表現質體pPur-AE1，於6μg/mL之嘌呤黴素存在下進行選拔時，無法建立DXB11/TAUT/AE1(DTE)細胞。

綜上所述，為了使藉由利用TAUT的Cl^- 離子的排出，利用AE1的Cl^- 離子的送入，具有協調的功能的2種轉運蛋白共同且大量表現，認為藉由APES大量表現的Nfkbia mRNA的表現抑制係為必要。

[實施例1-3] 建立DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC細胞建立使2種轉運蛋白共同且安定地大量表現之宿主細胞有時亦伴隨著困難。例如，尚未建立使ALT1(alanine transferase，丙胺酸轉胺酶)與PC(pyruvate carboxylase，丙酮酸羧化酶)共同且大量表現之安定株。然而，於圖26之DXB11/ TauT/APES(DTP)中，利用電穿孔法導入人類ALT1表現質體pNeo-ALT1，於200μg/mL之G418存在下進行選拔時，建立了具高增殖、且人類ALT1大量表現的細胞之DXB11/TAUT/APES/ALT1(DTPL)，進而，於DTPL細胞中利用電穿孔法導入人類PC表現質體pZeo-PC，於200μg/mL之Zeocin(博萊黴素)存在下進行選拔時，建立了具高增殖、且人類PC大量表現的細胞之DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)(圖29)。

DTPLC細胞中，倉鼠TAUT mRNA大量表現、人類ALT1 mRNA大量表現、Nfkbia mRNA表現抑制、人類PC mRNA大量表現、係利用Taqman法確認了即使重複進行繼代培養亦安定地維持著(圖27、圖29)。

反之，於APES導入前之DXB11/TAUT(DT)細胞中，利用電穿孔法導入人類ALT1表現質體pPur-ALT1，於6μg/mL之嘌呤黴素存在下進行選拔時，建立了人類ALT1大量表現的細胞之DXB11/TAUT/ALT1(DTL)細胞，進而，於DTL細胞中利用電穿孔法導入人類PC表現質體pNeo-PC，於200μg/mL之G418存在下進行選拔時，未建立DXB11/TAUT/ALT1/PC(DTLC)(圖30)。

綜上所述，為了使促進丙酮酸代謝路徑的連續反應之酵素之ALT1與PC大量表現，認為藉由APES大量表現的Nfkbia mRNA的表現抑制係為必要。

實施例2：建立倍增時間變快、安定地增殖之細胞之方法 [實施例2-1]倍增時間(概算值)之算出倍增時間(概算值)係利用125-mL Erlenmeyer Flask(艾氏燒瓶)震盪器培養後，以Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system(羅氏細胞計數器及分析系統)(Innovatis AG, Bielefeld, Germany)測定活細胞數，並進行計算。自Viability(存活率)維持於90%以上狀態的各個細胞開始繼代培養，藉由自初始細胞密度2×10⁵ cells/mL開始3天培養，或藉由初始細胞密度1×10⁵ cells/mL開始4天培養等、以不使細胞過增殖之方式重複進行培養，計算出Viability(存活率)維持於90%以上的繼代期間的倍增時間。經使基因強制表現改變細胞的繼代培養基中包含各種基因導入時使用的潮黴素等藥劑，除了藥劑之外係使用與DXB11(dhfr-)相同的培養基。

因基因導入改變前的DXB11(dhfr-)相同的倍增時間(概算值)係以未含藥劑培養基的繼代培養(自Viability(存活率)為99.5%的細胞開始繼代培養7次(3天培養為4次，4天培養為3次))計算後，為27.5±1.7小時(圖31)。

[實施例2-2]建立各種基因強制表現宿主與倍增時間如圖32所示，建立因各種基因的強制表現改變宿主。首先於DXB11(dhfr-)利用電穿孔法導入TAUT (Taurine Transporter，牛磺酸轉運蛋白)表現質體(pHyg-TAUT)，約2-3週後於200μg/mL 潮黴素(Hygromycin)存在下選拔2種增殖良好的細胞。進而，繼代培養時的基因表現分析使用了AFFYMETRIX(艾菲矩陣)公司寡核苷酸陣列(Affymetrix MOUSE430_2)之GeneChip實驗進行比較，將TAUT mRNA為大量表現，且其他表現分析係與DXB11(dhfr-)類似的選拔株作為DT宿主。被建立的DT宿主的倍增時間(概算值)係於含有藥劑(潮黴素)培養基的繼代培養(自Viability(存活率)為90.0%以上的細胞開始繼代培養11次(3天培養為4次，4天培養為7次))計算後，為26.1±2.7小時，倍增時間幾乎同等於DXB11(dhfr-) (圖31)。

其次，為進而改變DT宿主細胞、使於抗體產生細胞中表現異常亢進的APES的一部分序列APES165(專利2011-082002)強制表現。於DT宿主利用電穿孔法導入pPur-APES165，約2-3週後於6μg/mL嘌呤黴素存在下選拔9株增殖良好的細胞、發現APES表現量與細胞增殖相關(R2=0.701)(圖20)。

將TAUT與APES共同且大量表現，且倍增時間係20.8小時為最快的細胞株作為DTP宿主時，DTP宿主獲得至今不存在的形質。例如，利用電穿孔法，於無法建立的使與TAUT共同且大量表現的宿主細胞，導入AE1 (Anion Exchanger 1，陰離子交換蛋白1)之表現質體(pNeo-AE1)，約2-3週後於200μg/mL G418存在下選拔增殖良好的細胞時，構築成TAUT與AE1共同且大量表現的細胞。以AE1表現量最高的細胞作為DTPE宿主時，即使經重複長時間培養亦維持安定，倍增時間係較DTP宿主更快(圖33，57繼代，19.9±4.3小時)。

下一例示係利用電穿孔法，於建立的使與TAUT共同且強制表現的宿主細胞，導入ALT1 (Alanine Aminotransferase 1，丙胺酸轉胺酶1)之表現質體(pNeo-ALT1)，約2-3週後於200μg/mL G418存在下選拔增殖良好的細胞後，構築成TAUT與AE1共同且大量表現的細胞。由於發現ALT1表現量與細胞增殖相關，以ALT1表現量最高的細胞作為DTPL宿主時，該細胞亦即使經重複長時間培養亦維持安定，倍增時間係較DTP宿主更快(圖33，57繼代，19.8±4.3小時)。由於ALT1係不依賴APES的強制表現可建立使與TAUT共同且強制表現的宿主細胞，利用電穿孔法，於DT宿主導入ALT1之表現質體(pPru-ALT1)，約2-3週後於6μg/mL嘌呤黴素存在下選拔增殖良好的細胞，並以ALT1表現量最高的細胞作為DLT宿主時，雖然即使經重複長時間培養亦維持安定，但與DTPL宿主相比發現增殖情形不一，倍增時間係亦較DTPL宿主為慢(圖33，57繼代，21.9±7.3小時)。

以上結果係顯示(1)藉由使APES強制表現可構築倍增時間快的宿主細胞，與(2)APES大量表現宿主係藉由進而導入新的基因，可構築倍增時間更快的細胞。目前尚未知具有該等功能的核酸序列。

參考例本發明團隊，先前，將具有高生產重組抗體功能的培養細胞株(CHO細胞株)作為材料，以該細胞株針對表現顯著的基因進行檢討，鑑定了一個mRNA型非編碼RNA。該轉錄產物係相當於NfkBia的mRNA的非轉譯區域的互補鏈。進而，藉由使該轉錄產物中的一部分序列構成的核酸分子於重組培養細胞中表現，發現可顯著提昇該培養細胞的產生抗體能力。另外，本發明團隊發現自該非編碼RNA表現亢進的大量產生抗體細胞中NfkBia的表現被抑制、具有大量產生抗體能力的培養細胞係抑制細胞內NfkBia的表現、控制培養細胞內NfkBia的表現使轉錄產物大量表現，抗體的生產量增加。

藉由以下的參考例說明該等事項。

[參考例1]各種基因導入CHO細胞之GeneChip解析實驗 GeneChip(基因晶片)實驗係使用AFFYMETRIX(艾菲矩陣)公司之寡核苷酸陣列(Affymetrix MOUSE430_2)並遵循一般的實驗順序。但由於Hamster Array(倉鼠陣列)係尚未被商品化，而使用Mouse Genome 430 2.0 Array(小鼠基因體430 2.0陣列)。藉由雜交條件的最佳化，Test 3 array(試驗3陣列)上的Mouse Gene(小鼠基因)16種的探針中，於8種探針可得到Present Call，與Mouse(小鼠)之鹼基序列相同性為約90%以上時，能夠定量Hamster(倉鼠)轉錄產物的表現。

自使各種基因大量表現的細胞調製高純度total RNA(全RNA)後，使用含有total RNA與T7啟動子序列之寡dT引子(T7-(T)24)合成cDNA。接著，藉由使用Bio-11 CTP、Bio-16 UTP與Megascript T7 Kit(Ambion)之轉錄反應，由cDNA合成生物標記素(biotin labeled)之cRNA。將cRNA以管柱純化後，將於電泳上經確認相當於由18s至28s rRNA之分子量的高品質cRNA片段化，使其成為具有均一大小的GeneChip樣品。使用之GeneChip樣品係添加雜交樣品溶液並於-80℃冷凍保存。樣品溶液於使用前經熱處理、離心、塗抹於Mouse Genome 430 2.0 Array(小鼠基因體430 2.0陣列)上，使Array旋轉，同時於45℃的雜交專用烘箱孵育16小時。回收樣品，重複洗滌Array，以Streptavidin R-Phycoerythrin染色後進行掃描。

藉由比較Array上的轉錄物(約45,000)的GeneChip訊息值，鑑定1L發酵槽饋料批式培養於第10天產生900 mg/L以上的MAb1(抗IL-6R抗體，tocilizumab，商品名Actemra (安挺樂))之MAb1(抗IL-6R抗體)大量表現TAUT大量表現CSAD大量表現DG44細胞的繼代培養細胞中，作為表現強度高且表現顯著亢進的轉錄產物小鼠基因體上之mRNA型非編碼RNA UG_GENE=AI462015 (Affymetrix MOUSE430_2，1420088_AT)(圖1：AI462015轉錄產物之序列)。

AI462015雖為437鹼基之mRNA型非編碼RNA，但其序列係存在於小鼠基因體12之NfkBia mRNA之3’端非轉譯區域附近(56590831-56590397)的互補鏈上。認為AI462015轉錄產物有直接作用於NfkBia mRNA之非轉譯區域而阻礙轉譯之可能性，或437鹼基之一部分序列發揮作為低分子RNA之功能而使NfkBia mRNA分解之可能性。

例如，包含自AI462015序列中之5’端第40號之A至第91號之A之52鹼基之序列 (AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA：序列編號7)，與大鼠NfkBia mRNA之3’端非轉譯區域(1478-1529，GENE ID：25493 NfkBia)的互補鏈除了一鹼基(AI462015中之5’端第61號之A)之外，其餘為一致，進而包含AI462015之第40號之A至第63號之A之24鹼基序列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAA：序列編號9)，亦為人類NfkBia mRNA之3’端非轉譯區域的一部分序列(TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT，1490-1513：序列編號24)的互補鏈，可預測52鹼基之一部分之19-25鹼基作為microRNA、或一部分序列做為反意RNA作用於CHO細胞之NfkBia mRNA之可能性。

進而，根據之後GeneBank(基因庫)的資訊更新，明確得知AI462015的轉錄產物之437鹼基係相當於小鼠NfkBia基因的3’端非轉譯區域(513鹼基)的互補鏈(圖23)。如圖24所示般，CHO-K1細胞的基因體序列上存在與AI462015的相同序列(序列編號25：AI462015；序列編號26-27：CHO-K1基因體)，進而，由於在大量產生抗體的CHO細胞中發現Nfkbia的表現抑制(參考例4)，認為在CHO細胞中，AI462015的相同序列係高表現功能者。

例如，包含AI462015序列中的5’端第7號之T至第91號之A之85鹼基的序列(圖23與24的下線部分，序列編號：29) (TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA)，係與大鼠NfkBia mRNA之3’端非轉譯區域(1478-1562，GENE ID：25493 NfkBia，序列編號31)的互補鏈除了一鹼基(AI462015中之5’端第70號之A)之外，其餘為一致(Matching=84/85，圖25b)，同樣的，人類(Matching=75/85，圖25a，序列編號30)、黑猩猩(Matching=75/85，圖25c，序列編號32)、恆河猴(Matching=74/85，圖25d，序列編號33)、牛(Matching=76/85，圖25e，序列編號34)亦被確認了相同性。因此，可認為該85鹼基(Conserved Sequence(被保留的序列)7-91)的一部分之19-25鹼基係作為microRNA，或一部分序列做為反意RNA而超越物種作用於動物細胞、或哺乳動物細胞。因此可預測其亦可作用於動物培養細胞、較佳係如CHO細胞般之哺乳動物細胞的NfkBia mRNA。

[參考例2]大量產生抗體細胞中表現亢進的轉錄產物之鑑定參考例1中，大量產生MAb1(抗IL-6R抗體，tocilizumab，商品名Actemra (安挺樂))之DG44細胞中轉錄產物AI462015的表現量亢進(圖2)，但於相異的宿主細胞(CHO-DXB11s)使不同抗體(MAb2：抗磷脂肌醇蛋白聚糖3抗體；GC33(參照WO2006/006693))時，亦同樣發現到AI462015轉錄產物的表現亢進(圖3)。

如圖2所示，於CHO-DG44細胞中使牛磺酸轉運蛋白(TauT)基因大量表現時、使半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)基因大量表現時(data not shown，未揭示數據)、使TauT與CASD一同大量表現時，轉錄產物AI462015的表現量均為相同程度，但於使TauT與CASD一同大量表現的細胞中進而使Mab1(抗IL-6R抗體)大量表現時，發現AI462015的異常的亢進(宿主細胞的7倍)，表現量亦顯示異常高的GeneChip訊號值(10,000以上)。由控制組之GAPDH表現強度係於細胞間為相同等級，轉錄產物AI462015之表現亢進為Mab1大量產生抗體細胞中特異的現象。圖3亦同樣的，於CHO-DXB11s細胞中使MAb2 (抗磷脂肌醇蛋白聚糖3抗體)基因大量表現時，AI462015序列之表現亢進(TauT、CSAD、AE1大量表現細胞的平均值的13倍)係MAb2抗體大量產生細胞特異的現象。

上述結果顯示以震盪器繼代培養第3天安定增殖的大量產生抗體細胞，異常的大量表現AI462015序列。

另外，於1L Jar培養第3天的生產培養條件中亦發現了AI462015序列的異常的亢進。如圖4所示般，1L Jar饋料批式培養第10天產生約1200-1400 mg/L的MAb1(抗IL-6R抗體)之2種大量產生抗體細胞係顯示5,000以上的高GeneChip訊號值。由於培養條件的不同，1L Jar饋料批式培養第3天的訊號值係震盪器培養的約50%，但於培養後期的第13天時，AI462015序列的表現強度係亢進到與震盪器繼代培養相同程度，顯示了異常高的訊號值(圖5)。另一方面，抗體產生量低的MAb1大量表現DXB11s細胞(未添加水解物的震盪器培養第7天為300 mg/L以下，添加水解物亦為500 mg/L以下)係即使於添加了會造成高產生化的水解物(Hy-Fish、Procine Lysate)之條件下，亦無法觀察到1L Jar培養第3天的AI462015序列的表現亢進(圖6)。

基於圖2顯示高訊號值的MAb1大量表現TauT大量表現CSAD大量表現DG44細胞的抗體產生量為高(未添加水解物的震盪器培養第7天為640 mg/L)、圖3顯示高訊號值的MAb2大量表現DXB11s細胞的抗體產生量為高(未添加水解物的震盪器培養第7天為640 mg/L)、圖6即使添加了會造成高產生化的水解物其訊號值亦無亢進的實驗結果，認為「AI462015序列的表現量高係具高抗體產生潛能」。

[參考例3]因APES大量表現抗體產生細胞之高產生化之例由於AI462015序列表現量的程度係顯示與抗體產生潛能的程度相關，於圖6中抗體產生潛能低之MAb1大量表現DXB11s細胞中，導入表現AI462015序列一部分的質體，使其大量表現並比較抗體產生潛能。

來自小鼠基因體的轉錄產物AI462015(圖1，437鹼基)序列的一部分(包含Affymetrix GeneChip 之AI462015 Probe Sequence)5’端第4號之G至3’末端之T，命名為APES434，5’端第4號之G至第168號之C，命名為APES165，製成2種表現單元(APES係Antibody Production Enhancing Sequence的簡稱)。藉由合成添加了Kozak序列的表現單元，構築於CMV啟動子下大量表現的pHyg-APES434 (圖7)、pHyg-APES165(圖8)、pHyg-null(圖9)。

藉由Amaxa公司(現為LONZA公司)基因導入系統Nucleofector，於圖6之抗體低產生株之MAb1大量表現DXB11s細胞中導入表現質體，於96微孔盤上，在含有潮黴素(Hygromycin，200μg/mL)的選擇性培養基存在下選拔高增殖的全細胞株，於24微孔盤擴大後比較抗體產生量。經選拔出的株數分別為pHyg-APES434(N=38)、pHyg-APES165(N=60)、pHyg-null(N=11)，該等株數係被期待藉由導入APES大量表現質體之正效果。由於含有1mL繼代培養基的24微孔盤的靜置培養於培養第13天未發現細胞增殖，測定抗體產生量以及細胞數。抗體產生量的平均值為pHyg-APES434(44.3mg/L)、pHyg-APES165(41.2mg/L)、pHyg-null(21.9mg/L)，細胞數(平均值)為pHyg-APES434(9.27×10⁵ cells/mL)、pHyg- APES165(11.39×10⁵ cells/mL)、pHyg-null(7.76×10⁵ cells/mL)，pHyg-APES434、pHyg-APES165導入細胞係均相對於控制組之pHyg-null在統計上為優位(t檢定P＜0.001，圖10)。

以上結果顯示，使包含AI462015轉錄產物之5’端165bp的核酸序列(例如序列編號2的DNA的轉錄產物之APES165，或序列編號3的DNA的轉錄產物之APES434)大量表現時，細胞抗體產生潛能提高。

[參考例4]於抗體大量產生CHO細胞中NfkBia之表現抑制如參考例1所述般，AI462015序列係存在於小鼠基因體12的NfkBia基因的3’端非轉譯區域附近(3’端78bp)的互補鏈上，及AI462015序列中所含之22鹼基(AAGTACCAAAATAATTACCAAC：序列編號10)係與人類NfkBia基因的3’端非轉譯區域(1492-1513)的互補鏈為相同序列，進而，自超越大鼠、恆河猴、狗、馬等物種而被保留而言，可考慮具有作為microRNA 進行RNA干涉而分解NfkBia mRNA之可能性，或由相當於可定量AI462015表現之AFFYMETRIX(艾菲矩陣)公司寡核苷酸陣列(Affymetrix MOUSE430_2)上特異的探針序列區域(CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG：序列編號16)42bp的前半部分5’端第71號之C之21鹼基(CATATACAACATTTACAAGAA：序列編號15)為大鼠NfkBia mRNA的第1478至1498鹼基的互補序列，認為來自AI462015序列的核酸分子對NfkBia mRNA進行RNA干涉而抑制表現，藉以維持抗體大量產生CHO細胞之恆定性的可能性(基因剔除小鼠之lethality(致死)係postnatal(出生後))。(註：之後，判明了AI462015的轉錄產物係相當於小鼠NfkBia基因的3’端513鹼基的非轉譯區域的互補鏈。參照參考例8。另外，以小鼠GeneChip定量之AI462015之第71號至第112號之序列(序列編號16)係作為CHO細胞中的轉錄產物而被確認)。

因此，定量抗體高產生潛能高的AI462015大量表現細胞中之NfkBia mRNA表現量，而確認其表現被抑制。

由於CHO細胞之NfkBia mRNA序列係未知，由小鼠與大鼠的胺基酸編碼區域(均為942鹼基：314胺基酸)中被保留的序列設計探針(5’ACTTGGTGACTTTGGGTGCT、5’GCCTCCAAACACACAGTCAT)(序列編號17、18)，獲得325bp的PCR產物。經PCR選殖的325bp由其序列相同性認為係來自CHO細胞之NfkBia mRNA序列的一部分序列(圖11)。

Mouse Genome 430 2.0 Array(參考例1)中，可能因為其探針序列相當於CHO細胞的種特異性序列，無法定量NfkBia mRNA表現，但比較325bp的PCR產物時，相對於無法使抗體產生的基因大量表現細胞(位置(lane)1、2)，AI462015序列表現亢進之抗體大量產生細胞(位置(lane)3、4)中，NfkBia mRNA表現被抑制。進而，設計能夠定量325bp的一部分的序列的TaqMan Probe Set(圖12)，以RT-PCR法定量時，於抗體大量產生細胞中，NfkBia mRNA之表現被抑制至未使抗體產生之細胞的約50%。

自上述結果，於抗體大量產生細胞中NfkBia mRNA之表現被抑制，其結果，認為抗體產生潛能提高。實際上，本發明團隊認為用於抗體基因表現之表現質體的啟動子/加強子區域中存在複數個以上的NfkB結合部位(圖14：小鼠MCMV IE2 啟動子上的NfkB結合部位)，該等加強子區域係抗體基因大量表現所必須的區域，藉由NfkBia表現抑制而被活性化的NfkB移動至核內，使啟動子活性增強，為抗體大量產生之一要因。

[參考例5] 於抗體大量產生CHO細胞中亢進的microRNA的解析為解析microRNA，使用如圖15所示之Mir-X^TM miRNA First-Strand Sythesis Kit(Clontech)，繼代培養中MAb1(抗IL-6R抗體)大量產生DXB11s細胞與MAb1(抗IL-6R抗體)大量產生TAUT大量表現DXB11s細胞、進而抗體基因導入前的DXB11s宿主細胞調製之small RNA的3’端附加poly(A)標記後，使於3’端具有寡dT且於5’端具有PCR引子序列(mRQ 3’Primer)之轉接序列起始，合成一次鏈cDNA。以所得之cDNA為模板，使用mRQ 3’primer，與預測來自APES序列之microRNA-specific Primer(APES 40-61 5’primer，或APES 71-91 5’primer)，進而使用正向控制之U6 snRNA 5’primer，進行qPCR反應(95℃ 5 sec，60℃ 20 sec，30 cycles)。PCR反應液係於純化後以3%洋菜凝膠進行電泳。如圖16所示般，藉由APES 40-61 5’primer與U6 snRNA 5’primer之PCR反應，可觀察到目標大小的譜帶。如位置(lane)1、2、3所示般，APES 40-61 (AAGTACCAAAATAATTACCAAC：序列編號10)22鹼基係MAb1(抗IL-6R抗體)大量產生細胞中有大量表現。正控制組之U6 snRNA(位置(lane)4)的表現量於各細胞中均為相同程度，另外，由於未確認APES 71-91 (CATATACAACATTTACAAGAA：序列編號15)之存在(data not shown，未揭示數據)，認為超越物種而被保存的APES 40-61(22鹼基)係作為microRNA而對抗體大量產生化有所貢獻。

[參考例6]因APES大量表現之抗體產生用宿主細胞之高增殖化之例自抗體產生用宿主細胞DXB11/TAUT，於1L發酵槽饋料批式培養第14天，獲得產生3.9 g/L的MAb1(抗IL-6R抗體)之抗體大量產生細胞(DXB11/TAUT/MAb1)，藉由TAUT生存率維持能力，培養第31天雖產生8.1 g/L，但考慮實際生產，欲於培養第14天達到大量產生，必須使細胞最高到達密度(4.1×10e6 cells/mL)增加。若因APES大量表現導致之Nfkbia mRNA的表現抑制(參考例4)促進Nfkb活性化，則增殖相關連基因的表現亢進而可能提高細胞最高到達密度。將與APES同樣會對抗體高產生化做出貢獻的ALT1的共同表現用質體(pPur-APES165、pPur-ALT1，圖17)，分別導入前述抗體大量產生細胞DXB11/TAUT/MAb1(親株)，並選拔高增殖最多的3株，進行震盪器饋料批式培養，獲得APES165大量表現細胞的細胞最高到達密度的平均值為(11.5±1.7)×10e6 cells/mL，為ALT1大量表現細胞的(8.9±1.8)×10e6 cells/mL以上的高增殖的細胞。進而，由於震盪器饋料批式培養第14天的抗體產生量的平均值，APES大量表現細胞：4.4±0.6 g/L、ALT1大量表現細胞：4.0±0.6 g/L，較導入前的DXB11/TAUT/MAb1細胞：3.4 g/L以上更為提高，因此顯示APES大量表現效果係與TAUT大量表現效果獨立產生正面作用(圖18)。因APES大量表現的正面的效果係於1L-Jar饋料批式培養中有顯著效果，比較分別於震盪器饋料批式培養的高增殖細胞，於APES大量表現株最高增殖，培養第12天為5.3 g/L，相對於親株之3.2 g/L、ALT1大量表現株之4.4g/L，顯示在短時間培養之高產生之優點(圖19)。基於上述結果，係使抗體產生用宿主細胞DXB11/TAUT改變為更加高增殖的宿主細胞，製作為APES165大量表現之DXB11/TAUT/APES。於DXB11/TAUT宿主中以電穿孔法基因導入pPru-APES165，針對藥劑選拔後生存率、增殖均為良好的宿主候補9株，定量繼代培養時的APES snRNA(small non-coding RNA，小非編碼RNA)表現量。顯示APES表現量較高的DXB11/TAUT/APES宿主候補株培養時的活細胞密度高，顯示相關性(R² =0.70)(圖20)。

[參考例7] 因APES大量表現之抗體產生細胞之高產生化之例2 與參考例3相同地，於MAb1大量表現DXB11s細胞導入表現AI462015轉錄產物之5’端的部分序列之質體，比較抗體產生潛能。

除了APES4-168(APES165)之外，亦進而製成由其一部分序列所構成的APES4-68(序列編號5)以及APES69-133(序列編號6)的表現單元，檢討細胞的抗體產生潛能。相對於空載體大量表現(null)，APES 4-68係p＜0.05，APES69-133係p＜0.01，於抗體高產生為有意義之差異(t 檢定P＜0.001，圖21)。

圖22係表示參考例3以及本參考例中之經鑑定、具有APES活性之部分序列，分別相當於小鼠AI462015轉錄產物之何區域。顯示APES活性的部分序列係包含Nfkbia互補序列23鹼基以上。

本發明可應用於任何抗體等重組多肽產生細胞。

本說明書所引用之全部刊物、專利以及專利申請案，係直接作為參考而加入本說明書中。

無

[圖1] 圖1係顯示經鑑定之AI462015轉錄產物之序列以及於小鼠基因體之位置。(參考例1) [圖2] 圖2係顯示CHO-DG44細胞中，使Mab1(抗IL-6受體抗體)大量表現之抗體產生細胞之繼代培養第3天時，AI462015轉錄產物之表現強度。(參考例2) [圖3] 圖3係顯示CHO-DXB11s細胞中，使Mab2(抗磷脂肌醇蛋白聚糖3抗體)大量表現之抗體產生細胞之繼代培養第3天時，AI462015轉錄產物之表現強度。(參考例2) [圖4] 圖4係顯示Mab2(抗磷脂肌醇蛋白聚糖3抗體)產生細胞之1L發酵槽饋料批式培養第3天時，AI462015轉錄產物之表現強度。(參考例2) [圖5] 圖5係顯示Mab2產生細胞之1L發酵槽饋料批式培養後期第13天時，AI462015轉錄產物之表現強度之亢進。(參考例2) [圖6] 圖6係顯示Mab1(抗IL-6受體抗體)產生潛能低之細胞之1L發酵槽饋料批式培養第3天時，AI462015轉錄產物之表現強度。(參考例2) [圖7] 圖7係轉錄產物AI462015(437p)之一部分序列434bp之表現質體。(參考例3) [圖8] 圖8係轉錄產物AI462015(437p)之一部分序列165bp之表現質體。(參考例3) [圖9] 圖9係作為控制組之僅表現潮黴素抗性基因之質體。(參考例3) [圖10] 圖10係顯示藉由轉錄產物AI462015(437p)之一部分序列大量表現，增加Mab1產生量。(參考例3) [圖11] 圖11係顯示在大量產生抗體細胞中，轉錄產物AI462015之大量表現與NfkBia表現抑制。(參考例4) [圖12] 圖12係顯示用於NfkBia表現定量之探針組。(參考例4) [圖13] 圖13係顯示在大量產生抗體細胞中，NfkBia表現抑制之定量結果。(參考例4) [圖14] 圖14係顯示小鼠MCMV IE2啟動子上(序列編號23)之8個NfkB結合部位(下線部分)。(參考例4) [圖15] 圖15係microRNA表現之解析法概略。(參考例5) [圖16] 圖16係顯示在大量產生抗體細胞中，大量表現來自microRNA之PCR產物。(參考例5) [圖17] 圖17係於pHyg-TAUT表現細胞中，轉錄產物AI642048(437p)之一部分序列165bp共同表現之質體pPur-APES165及使ALT1共同表現之pPur-ALT1。(參考例6) [圖18] 圖18係顯示因APES大量表現而使細胞大量增殖、抗體大量產生效果之震盪器饋料批式培養結果。(參考例6) [圖19] 圖19係顯示因APES大量表現而使細胞大量增殖、抗體大量產生效果之L-Jar饋料批式培養結果。(參考例6) [圖20] 圖20係顯示APES165大量表現宿主候選細胞(9株)APES表現量與活細胞密度的相關。(參考例6) [圖21] 圖21係表示藉由轉錄產物AI462015(437p)之一部分序列APES165之更進一步的部分序列大量表現，會增加Mab1產生量。(參考例7) [圖22] 圖22係表示於圖21中顯示具有抗體大量產生效果之APES165之更進一步的部分序列，係含有Nfkbia互補序列。(參考例7) [圖23] 圖23係表示AI462015為小鼠Nfkbia mRNA之互補鏈。(參考例1) [圖24] 圖24係表示AI462015的相同序列係存在於CHO-K1細胞基因體中。(參考例1) [圖25-1] 圖25a係表示AI462015之一部分序列(由5’端起第7-91號)係超越物種而被保存。(參考例1)圖25b係表示AI462015之一部分序列(由5’端起第7-91號)係超越物種而被保存。(參考例1) [圖25-2] 圖25c係表示AI462015之一部分序列(由5’端起第7-91號)係超越物種而被保存。(參考例1)圖25d係表示AI462015之一部分序列(由5’端起第7-91號)係超越物種而被保存。(參考例1) [圖25-3] 圖25e係表示AI462015之一部分序列(由5’端起第7-91號)係超越物種而被保存。(參考例1) [圖26] 係建立DXB11/TAUT/APES(DTP)細胞。(實施例1) [圖27] 係表示倉鼠TAUT、人類ALT1以及Nfkbia之mRNA表現程度。(實施例1) [圖28] 係建立DXB11/TAUT/APES/AE1(DTPE)細胞。(實施例1) [圖29] 係建立DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)細胞。(實施例1) [圖30] 係經於DXB11/TAUT/ALT1(DTL)細胞中導入人類PC表現質體pNeo-PC，但未建立DXB11/TAUT/ALT1/PC (DTLC)。(實施例1) [圖31] 係DXB11(dhfr-)以及DT宿主之倍增時間。(實施例2) [圖32] 係藉由各種基因之強制表現而改變宿主的製作。(實施例2) [圖33] 係改變宿主之倍增時間。(實施例2)

Claims

一種蛋白質的製造方法，其係使用動物細胞之所期望的蛋白質的製造方法，動物細胞係為了生產重組蛋白質所建立之細胞株，其除了所期望的蛋白質的基因外，還安定地表現抑制NfkBia表現之非編碼核糖核酸(non-coding RNA)、及2個以上的編碼蛋白質的外來基因(protein-encoding foreign genes)，培養以該細胞作為宿主而經導入所期望的蛋白質的基因之細胞，使所期望的蛋白質產生，並回收所產生的蛋白質，藉此製造所期望的蛋白質。其中該抑制NfkBia表現之非編碼核糖核酸係選自以下：(1)包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19~25個鹼基長之連續的序列，最長至30個鹼基長之低分子RNA或其互補序列，其中19~25個鹼基長之連續的序列，係從序列編號2所示之鹼基序列中之任意的部分序列所轉錄之RNA序列；(2)包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19~25個鹼基長之連續的序列，最長至561個鹼基長之mRNA型非編碼RNA或其互補序列，其中19~25個鹼基長之連續的序列，係從序列編號2所示之鹼基序列中之任意的部分序列所轉錄之RNA序列；(3)包含與NfkBia之mRNA的一部分能藉由形成鹼基配對結合之19~25個鹼基長之連續的序列，係561~1579個鹼基長之mRNA型非編碼RNA或其互補序列，其中19~25個鹼基長之連續的序列，係從序列編號2所示之鹼基序列中之任意的部分序列所轉錄之RNA序列；(4)藉由序列編號1~16以及29~34之任一之鹼基序列而被編碼的RNA； (5)藉由具有下述之鹼基序列或其互補序列之DNA而被編碼的RNA(5a)與序列編號1~16以及29之任一之鹼基序列能藉由形成鹼基配對結合之序列；(5b)與序列編號1~16以及29之任一之鹼基序列除了1個鹼基之外相同之鹼基序列；(5c)包含序列編號1~16以及29~34之任一之鹼基序列之NfkBia基因的3’端非轉譯區域之部分序列；(5d)與上述(5c)之序列除了1個鹼基之外相同之鹼基序列所形成之序列；(6)由序列編號2之部分序列或其互補序列所編碼的RNA；(7)由NfkBia基因的3’端非轉譯區域之部分序列，其包括序列編號2之部分序列或其互補序列，所編碼的RNA。
如請求項1之方法，其中所期望的蛋白質為抗體。
如請求項1之方法，其中2個以上的外來基因，係編碼難以同時且安定地表現之2個以上的蛋白質之基因。
如請求項1或2之方法，其中該2個以上的外來基因，係難以同時且安定地表現之2種以上的轉運蛋白之基因。
如請求項1或2之方法，其中該2個以上的外來基因，係難以同時且安定地表現之2種以上的代謝酵素之基因。
如請求項1或2之方法，其中該2個以上的外來基因，係TauT(taurine transporter，牛磺酸轉運蛋白)基因、以及難以與TauT同時且安定地表現之別的轉運蛋白之基因。
如請求項1或2之方法，其中該2個以上的外來基因，係TauT基因、以及難以同時且安定地表現之2種的代謝酵素之基因。
如請求項1或2之方法，其中該2個以上的外來基因編碼2個以上的蛋白質，該2個以上的蛋白質選自難以同時且安定地表現之以下2個以上的蛋白質的組合：(1-1)2個以上的膜輸送蛋白質；(1-2)為了2個以上的膜輸送蛋白質的功能所必須的輔助蛋白；(2)2個以上的酵素蛋白質；(3)2個以上的代謝酵素；(4)2個以上的轉錄因子；(5)2個以上的膜輸送蛋白質與1個或2個以上的酵素蛋白質；(6)1個或2個以上的膜輸送蛋白質與2個以上的酵素蛋白質；(7)2個以上的轉運蛋白；(8)相同代謝路徑中的2個以上的代謝酵素；(9)相同代謝路徑中，催化胺基酸分解反應的2個以上的代謝酵素；(10)丙酮酸代謝路徑的2個以上的代謝酵素；(11)2個以上的糖轉移酵素；(12)TauT及2個代謝酵素；(13)1個轉運蛋白及1個酵素蛋白質；(14)TauT及1個酵素蛋白質；(15)TauT及ALT1(Alanine Aminotransferase 1，丙胺酸轉胺酶1)；(16)2個轉運蛋白；(17)TauT及AE1(Anion Exchanger 1，陰離子交換蛋白1)； (18)2個酵素蛋白質；(19)ALT1及PC(Pyruvate Carboxylase，丙酮酸羧化酶)；以及(20)TauT、ALT1及PC。
如請求項1或2之方法，其中動物細胞為CHO細胞。