JP2019022508A - 改変宿主細胞の樹立方法 - Google Patents
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Abstract
Description
宿主細胞に、目的のタンパク質の遺伝子に加えて、他の構造遺伝子を導入して高い発現量で発現させることにより、目的のタンパク質の生産効率を向上させる技術が知られている。
すなわち、本発明者らは、APESが、(1)通常の細胞では発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の構築や、(2)通常の細胞では樹立が困難な異なる2種以上の遺伝子を安定的に高発現させた細胞の構築を可能にするような、導入遺伝子を安定的に高発現させる機能を持つことを見出した。
APES遺伝子は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA(タンパク質に翻訳されないRNA)をコードするDNAである。
(1)細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
(2)2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする、(1)の方法。
(3)同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、(2)の方法。
(4)類似の機能を有するタンパク質が、トランスポーターまたは代謝酵素である(3)の方法。
(5)細胞に2種以上のトランスポーター(TauTとAE1)の遺伝子が導入される、(1)〜(4)の方法。
(6)細胞に2種以上の代謝酵素(ピルビン酸代謝経路の酵素、ALT1とPC)の遺伝子が導入される、(1)〜(4)の方法。
(7)細胞にTauT及び2種の代謝酵素の遺伝子が導入される、(1)〜(4)の方法。
(8)細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
(9)細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
(10)NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む30塩基長までの低分子RNAである、(1)〜(8)の方法、又は(9)の細胞。
(11)NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む561塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、(1)〜(8)の方法、又は(9)の細胞。
(12)NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む561〜1579塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、(1)〜(8)の方法、又は(9)の細胞。
(13)19〜25塩基長の連続する配列が、配列番号2で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、(10)から(12)の方法又は細胞。
(14)NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列を有する、(1)〜(8)の方法、又は(9)の細胞。
(15)NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、(1)〜(8)の方法、又は(9)の細胞:
(a)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列;
(b)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列と1または数塩基を除き同一の塩基配列;
(c)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
(d)上記(c)の配列と1または数塩基を除き同一の塩基配列。
(16)細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、(1)〜(8)の方法又は(9)の細胞。
(17)所望のタンパク質が抗体である(16)の方法又は細胞。
(18)上記(1)に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、1番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
細胞に、1番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な2番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
1番目と2番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする1番目と2番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
(19)上記(1)に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、1番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
細胞に、2番目の外来遺伝子を導入すること、および
細胞に、2番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な3番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
1番目、2番目、および3番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする1番目、2番目、3番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
(20)1番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、(18)または(19)に記載の方法。
(21)細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、(18)〜(20)のいずれかに記載の方法。
(1)APES(Antibody Production Enhancing Sequence)
APESは、NF-κBの抑制タンパク質であるI-κBを不活性化する核酸分子であり、より具体的には、I-κBの制御サブユニットであるI-κBα(NfkBia)の遺伝子発現を抑制する核酸分子である。そのような核酸分子の本体は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAであるが、APESは、non-coding RNA自体、若しくはそのRNAをコードするDNA又はそれらの配列の総称である。
また、APESの構造的又は機能的な特徴に基づき、新たにAPESとしての活性を有する核酸分子を化学合成あるいは生物源から単離することが可能である。APESの構造的特徴は、標的であるNfkBia mRNAの一部に相補的な配列を含む核酸分子であることである。核酸分子の形態は、いかなる形態でもよく、DNA、DNAの転写産物、mRNA、cDNAであるか、exosome RNAであるか、化学合成一本鎖RNAであるか、化学合成二本鎖RNAであるかなどを問わない。機能的特徴は、その宿主細胞中での発現に伴い、抗体等の組換えポリペプチドの産生能が増大していること、或いは、NfkBiaの発現が抑制されていることである。
(2)APESの宿主細胞への導入及び発現
本発明は、APES、すなわち、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA、の遺伝子を宿主細胞に導入することを含み、さらに、APESを発現させること、好ましくはAPESを強発現させることを含む。
発現ベクターは、宿主細胞にAPESを強発現させるため、及びトランスポーターや代謝酵素等の外来のポリペプチドを発現させるために有用である。また、医薬品の有効成分や抗原として有用な外来のポリペプチドの発現にも、発現ベクターが使用される。
本発明において用いる宿主細胞は、特に限定されることなく、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、大腸菌、枯草菌などの原核細胞など如何なる細胞でもよく、好ましくは、昆虫、魚、両生類、爬虫類、哺乳類由来の動物細胞であり、特に哺乳動物細胞が好ましい。哺乳動物細胞の由来としては、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、その他が挙げられ、ヒト、げっ歯類であることが好ましい。さらに本発明の細胞としては、通常ポリペプチドの発現によく用いられる、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、ミエローマ細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞などの哺乳動物培養細胞が好ましい。
宿主細胞は、例えば、医薬品や抗原のような所望のポリペプチドの製造のための産生系として使用することができる。そのような細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であっても、所望のポリペプチドをコードするDNAを導入した細胞であってもよいが、所望のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞が好ましい。
本発明では、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、発現困難な外来遺伝子若しくは発現が不安定な外来遺伝子を、細胞内で安定的に高発現させることができる。
本発明における「同時に安定的に発現することが困難なタンパク質」は、類似の機能を有するタンパク質に属することができる。同時に安定的に発現することが困難な、類似の機能を有するタンパク質の組み合わせの例としては、2種類以上の膜輸送タンパク質若しくはそれが機能するために必要なアクセサリープロテインや、2種類以上の酵素タンパク質、好ましくは同一の代謝経路に関与する代謝酵素や、2種類以上の転写因子の組み合わせが挙げられる。
また、1若しくは2種類以上の膜輸送タンパク質と2種類以上の酵素タンパク質の組み合わせの例は、TauT及び2種の代謝酵素であることができる。
本発明では、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA(APES)の遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることにより、継代培養を繰り返しても複数のタンパク質をコードする外来遺伝子が安定的に高発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株を得ることができる。
実施例1:発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の樹立
(1)膜タンパクのTauTとAE1は細胞表面上で塩素イオンの搬入・排出を通して協同的に機能する。これまで、TauT高発現細胞のTauT機能増強のために、AE1を同時に高発現させた宿主細胞の樹立を繰り返し試みたが、薬剤選抜過程で浮遊細胞の付着化がみられ、共発現細胞は樹立されなかった。この場合、宿主細胞における元々のAE1の発現量はqPCRで検出限界以下であった。
〔実施例1−1〕DXB11/TAUT/APES細胞の樹立
ハムスターTAUT発現プラスミドpHyg-TAUTを宿主細胞のDXB11にエレクトロポレーション法で導入し、200μg/mLハイグロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUT(taurine transporter)高発現な細胞であるDXB11/TauT (DT)が樹立された(図26)。さらに、APES発現プラスミドpPur-APES165をエレクトロポレーション法で導入し、6 μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TAUT/APES (DTP)(図26)が樹立された。DTP細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現、Nfkbia mRNA発現抑制が継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された(図27)。
2種のトランスポーターを共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立には困難を伴う場合がある。たとえば、宿主細胞DXB11にTAUTとAE1(anion exchanger 1)を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図26のハムスターTAUT高発現でAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトAE1発現プラスミドpNeo-AE1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUTとヒトAE1を共に高発現している細胞であるDXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) が樹立された(図28)。
2種の酵素を共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立にも困難を伴う場合がある。たとえば、ALT1(alanine transferase)とPC(pyruvate carboxylase) を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図26のDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトALT1発現プラスミドpNeo-ALT1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つ ヒトALT1高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1 (DTPL) が樹立されたが、さらに、DTPL細胞にヒトPC発現プラスミドpZeo-PCをエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLの Zeocin存在下で選抜することで高増殖、且つヒトPC高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)が樹立された(図29)。
〔実施例2−1〕倍加時間(概算値)の算出
倍加時間(概算値)は、125-mL Erlenmeyer Flaskによるシェーカー培養後、Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system (Innovatis AG, Bielefeld, Germany) によって生細胞数を測定、算出した。Viabilityが90%以上に維持された状態の個々の細胞から継代培養を開始して、初発細胞密度2×105 cells/mLからの3日間培養、あるいは初発細胞密度1×105 cells/mLからの4日間培養などによって過増殖にならないように培養を繰り返しおこない、Viabilityを90%以上に維持しながら継代間の倍加時間を算出した。遺伝子を強制発現させた改変細胞の継代培地には各種遺伝子導入に用いたハイグロマイシン等の薬剤が含まれるが、薬剤以外はDXB11(dhfr-)と同一培地を使用した。
図32に示したように、各種の遺伝子の強制発現によって改変宿主を樹立した。まずはDXB11(dhfr-)にTAUT (Taurine Transporter) の発現プラスミド(pHyg-TAUT)をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に200 μg/mL ハイグロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を2種類選抜した。さらに、継代培養時の遺伝子発現プロファイルをAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix MOUSE430_2)を用いたGeneChip実験で比較し、TAUT mRNAが高発現で、その他の発現プロファイルはDXB11(dhfr-)と類似していた選抜株をDT宿主とした。樹立されたDT宿主の倍加時間(概算値)は、薬剤(ハイグロマイシン)を含む培地での継代培養(((Viabilityが90.0%以上の細胞から継代培養を11回(3日間培養を4回、4日間培養を7回))で算出したところ、26.1 ±2.7時間であり、倍加時間はDXB11(dhfr-)に対してほぼ同等であった(図31)。
本発明者らは、以前、高い組換え抗体産生能を有する培養細胞株(CHO細胞株)を材料として、当該細胞株で発現が顕著な遺伝子について検討を行い、一つのmRNA型ノンコーディングRNAを同定した。この転写産物はNfkBiaのmRNAの非翻訳領域の相補鎖に相当した。さらに、この転写産物中の一部の配列からなる核酸分子を組換え培養細胞中で発現させることにより、当該培養細胞の抗体産生能を顕著に向上させることを見出した。また、本発明者らは当該ノンコーディングRNAの発現が昂進された抗体高産生細胞ではNfkBiaの発現が抑制されていること、高い抗体産生能を有する培養細胞が細胞内でNfkBiaの発現を抑制していること、培養細胞内のNfkBiaの発現を制御する転写産物を高発現させることにより、抗体の生産量が増加することを見出した。
〔参考例1〕各種遺伝子導入CHO細胞のGeneChip解析実験
GeneChip実験は、AFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix MOUSE430_2)を用いて通常の手順にしたがった。ただし、Hamster Arrayは商品化されていないためMouse Genome 430 2.0 Arrayを用いた。ハイブリダイゼーション条件の最適化によって、Test 3 array 上のMouse Gene16種のプローブ中、8種のプローブでPresent Callが得られるようになり、Mouseとの塩基配列相同性が約90%以上の場合は、Hamster転写産物の発現定量が可能になった。
参考例1で、MAb1(抗IL-6R抗体;tocilizumab、商品名 アクテムラ)高産生DG44細胞で転写産物AI462015の発現量が昂進されたが(図2)、異なる宿主細胞(CHO-DXB11s)に異なる抗体(MAb2:抗グリピカン3抗体;GC33(WO2006/006693参照))を高産生させた場合も同様にAI462015転写産物の発現昂進がみられた(図3)。
また、1Lジャー培養3日目の生産培養条件下においてもAI462015配列の異常な発現昂進がみられた。図4に示したように1Lジャー流加培養の10日目に約1200−1400mg/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する2種の抗体高産生細胞は5,000以上の高いGeneChipシグナル値を示した。培養条件の違いから、1Lジャー流加培養3日目のシグナル値はシェーカー培養の50%程度であったが、培養後期13日目にAI462015配列の発現強度はシェーカー継代培養と同程度にまで昂進され、異常に高いシグナル値を示した(図5)。一方、抗体産生量の低いMAb1強発現DXB11s細胞(加水分解物無添加のシェーカー培養7日目で300mg/L以下、加水分解物添加でも500mg/L以下)は、高産生化に寄与する加水分解物(Hy-Fish、Procine Lysate)を添加した条件でも、1Lジャー培養3日目の AI462015配列の発現昂進はみられなかった(図6)。
AI462015配列発現量の高さが抗体産生ポテンシャルの高さと相関することを示すため、図6で抗体産生ポテンシャルの低かったMAb1強発現DXB11s細胞にAI462015配列の一部を発現するプラスミドを導入し、強発現させて抗体産生ポテンシャルを比較した。
参考例1で述べたように、AI462015配列はマウスゲノム12のNfkBia 遺伝子の3’側の非翻訳領域近傍(3’側78bp)の相補鎖上に存在すること、AI462015配列に含まれる22塩基(AAGTACCAAAATAATTACCAAC:配列番号10)はヒトNfkBia 遺伝子の3’側非翻訳領域(1492-1513)の相補鎖と同一配列であり、さらにラット、アカゲザル、イヌ、ウマなど種を超えて保存されていることからmicroRNAとしてRNA干渉してNfkBia mRNAを分解する可能性があること、あるいはAI462015発現を定量できるAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix MOUSE430_2)上の特異的プローブ配列領域(CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG:配列番号16)42bpの前半部分に相当する5’側71番目のCからの21塩基(CATATACAACATTTACAAGAA:配列番号15)がラットNfkBia mRNAの1478から1498塩基目の相補配列であることから、AI462015配列由来の核酸分子がNfkBia mRNA にRNA干渉し、発現を抑制することで抗体高産生CHO細胞のホメオスタシスを維持する可能性が考えられた(ノックアウトマウスのlethality はpostnatal)。(注記:後に、AI462015の転写産物はマウスNfkBia 遺伝子の3’側513塩基の非翻訳領域の相補鎖に相当することが判明した。参考例8参照。また、マウスGeneChipで定量されたAI462015の71番目から112番目の配列(配列番号16)はCHO細胞での転写産物として確認された。)
そこで、抗体産生ポテンシャルが高かったAI462015高発現細胞でのNfkBia mRNA 発現量を定量し、その発現が抑制されていることを確認することにした。
microRNAを解析するために、図15に示したようにMir-XTMmiRNA First-Strand Sythesis Kit (Clontech)を用いて、継代培養中のMAb1(抗IL-6R抗体)高産生DXB11s細胞とMAb1(抗IL-6R抗体)高産生TAUT強発現DXB11s細胞、さらに抗体遺伝子導入前のDXB11s宿主細胞から調製したsmall RNAの3’側にpoly(A)タグを付加したのち、オリゴdTを3’側にPCRプライマー配列(mRQ 3’Primer)を5’側にもつアダプターをプライミングして一次鎖cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にして、mRQ 3’primer と 予想されたAPES配列由来のmicroRNA-specific Primer(APES 40-61 5’ primer, あるいは APES 71-91 5’ primer)、さらに ポジティブコントロールのU6 snRNA 5’primerを用いてqPCR反応(95℃ 5sec, 60℃ 20sec, 30cycles)をおこなった。PCR反応液は、精製後、3%アガロースゲルで電気泳動した。図16に示したように、APES 40-61 5’primerとU6 snRNA 5’ primerによるPCR反応で目的の大きさのバンドがみられた。レーン1,2,3で示したように、APES 40-61(AAGTACCAAAATAATTACCAAC:配列番号10)22塩基がMAb1(抗IL-6R抗体) 高産生細胞中で高発現していた。ポジティブコントロールのU6 snRNA(レーン4)の発現量はいずれの細胞においても同レベルであったこと、またAPES 71-91(CATATACAACATTTACAAGAA:配列番号15)の存在は確認されなかったことから(data not shown)、種を超えて配列が保存されているAPES 40-61(22塩基)がmicroRNAとして抗体高産生化に寄与すると考えられた。
抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTから、1Lジャー流加培養14日目に3.9g/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する抗体高産生細胞(DXB11/TAUT/MAb1)が得られ、TAUTの生存率維持能によって培養31日目に8.1g/Lを産生したが、実生産を考慮して培養14日目に高産生にするには、細胞最高到達密度(4.1 x10e6 cells/mL)を増加させる必要があった。APES強発現によるNfkbia mRNAの発現抑制(参考例4)がNfkbの活性化を促進するのであれば、増殖関連遺伝子の発現が亢進されるため、細胞最高到達密度は上がる可能性がある。APESと同様に抗体高産生化に寄与したALT1の共発現用プラスミドをそれぞれ(pPur-APES165, pPur-ALT1, 図17)、上記抗体高産生細胞DXB11/TAUT/MAb1(親株)に導入して高増殖な上位3株ずつを選抜し、シェーカー流加培養をおこなうと、APES165強発現細胞の細胞最高到達密度の平均値は(11.5±1.7)x10e6 cells/mLであり、ALT1強発現細胞の(8.9±1.8) x10e6 cells/mL以上に高増殖な細胞が得られた。さらにシェーカー流加培養14日目の抗体産生量の平均値は、APES強発現細胞:4.4±0.6 g/L, ALT1強発現細胞:4.0±0.6 g/Lと導入前のDXB11/TAUT/MAb1細胞:3.4g/L以上に高くなったことから、APES強発現効果はTAUT強発現効果に独立してポジティブに作用することが示された(図18)。APES強発現による正の効果は1L-Jar流加培養において顕著であり、それぞれシェーカー流加培養での高増殖細胞を比較すると、APES強発現株は最も高増殖で、培養12日目で5.3g/Lと親株の3.2g/L, ALT1強発現株4.4g/Lに対して短期間培養で高産生である長所が示された(図19)。以上の結果に基づき、抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTをより高増殖な宿主細胞に改変することにし、APES165強発現宿主DXB11/TAUT/APESを作成した。DXB11/TAUT宿主にpPur-APES165をエレクトロポレーション法で遺伝子導入し、薬剤選抜後に生存率、増殖ともに良好であった宿主候補の9株について、継代培養時のAPES snRNA (small non-coding RNA)発現量を定量した。APES発現量の高かったDXB11/TAUT/APES宿主候補株は培養時の生細胞密度が高く、相関(R2=0.70)が示された(図20)。
〔参考例7〕APES強発現による抗体産生細胞の高産生化例2
参考例3と同様に、MAb1強発現DXB11s細胞にAI462015転写産物の5’側の部分配列を発現するプラスミドを導入し、抗体産生ポテンシャルを比較した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (21)
- 細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
- 2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1の方法。
- 同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、請求項2の方法。
- 類似の機能を有するタンパク質がトランスポーターまたは代謝酵素である請求項3の方法。
- 細胞に2種以上のトランスポーターの遺伝子を導入することを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 細胞に2種以上の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 細胞にTauT及び2種の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
- 細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
- NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む30塩基長までの低分子RNAである、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞。
- NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む561塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞。
- NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る19〜25塩基長の連続する配列を含む561〜1579塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞。
- 19〜25塩基長の連続する配列が、配列番号2で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、請求項10〜12のいずれかに記載の方法又は細胞。
- NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列を有する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞。
- NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞:
(a)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列;
(b)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列と1または数塩基を除き同一の塩基配列;
(c)配列番号1〜16及び29のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
(d)上記(c)の配列と1または数塩基を除き同一の塩基配列からなる配列。 - 細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、請求項1〜8のいずれかに記載の方法、又は請求項9に記載の細胞。
- 所望のタンパク質が抗体である、請求項16記載の方法又は細胞。
- 請求項1に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、1番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
細胞に、1番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な2番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
1番目と2番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする1番目と2番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。 - 請求項1に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、1番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
細胞に、2番目の外来遺伝子を導入すること、および
細胞に、2番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な3番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
1番目、2番目、および3番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする1番目、2番目、3番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。 - 1番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、請求項18または19に記載の方法。
- 細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、請求項18〜20のいずれかに記載の方法。
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