TWI463013B - Manufacture of dissimilar proteins - Google Patents

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TWI463013B
TWI463013B TW97130081A TW97130081A TWI463013B TW I463013 B TWI463013 B TW I463013B TW 97130081 A TW97130081 A TW 97130081A TW 97130081 A TW97130081 A TW 97130081A TW I463013 B TWI463013 B TW I463013B
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Hisahiro Tabuchi
Tomoya Sugiyama
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

異種蛋白質之製造方法
本發明係有關異種蛋白質的製造方法，更詳細而言，係關於使用大量表現丙胺酸轉胺酵素之細胞，製造多肽之方法。
使用基因重組技術生產適用為醫藥之蛋白質時，因使用動物細胞，使原核細胞無法進行的複雜的轉譯後修飾及摺疊變為可能，遂使動物細胞廣泛用於為生產重組蛋白質的宿主細胞。
近年來，雖然許多抗體及具生理活性的蛋白質等生技藥品不斷被開發，但可使動物細胞有效率地生產重組蛋白質之技術係與生技醫藥品的低成本化相關連，且以能穩定供給患者為重。
因此，尋求更高生產效率的蛋白質製造方法。
丙胺酸為構成蛋白質的胺基酸的一種，為非必須胺基酸。於生物體內藉由將麩胺酸之胺基轉移至丙酮酸上而進行生合成。而以逆反應的方式進行分解。
已知丙胺酸的分解酵素為丙胺酸轉胺酵素(EC2.6.1.2)(非專利文件1)，該酵素會使丙胺酸之胺基轉移至2-酮戊二酸，而使麩胺酸生成。丙胺酸轉胺酵素亦稱作麩胺酸-丙酮酸轉胺酵素，略稱為GPT(非專利文件2)。GPT與GOT(天門冬胺酸轉胺酵素)同為肝臟所含之酵素，因當肝臟細胞被破壞時會被釋放於血液中，而於GPT與GOT顯示異常高值時，診斷為肝臟產生某種程度的損害。
因此，丙胺酸轉胺酵素被利用為肝機能的指標，但針對使丙胺酸轉胺酵素大量表現的CHO細胞等宿主細胞，丙胺酸轉胺酵素顯示何種動向，目前仍屬未知。
[非專利文件1]
Sanjay B.,et. al.,Hepatology(2004)39(5),1297-1302
[非專利文件2]
Melanie M. S.,et. al.,Genomics(1997)40,247-252
本發明係以提供可以高產量製造天然型蛋白質或重組蛋白質之方法為目的。
本發明之發明者們，為解決上述課題專心研究後，發現藉由使用可大量表現丙胺酸轉胺酵素(以下亦有記做「ALT」)之細胞，可使所期望的多肽的產生量增加，本發明遂至完成。進而，藉由使用同時表現ALT與牛磺酸轉運蛋白的細胞，可使所期望的多肽的產生量更加增加。於細胞培養時，因丙胺酸經時的大量地被生產，蓄積於細胞內之丙胺酸會分泌至培養基中。藉由大量表現ALT，可促進自丙胺酸進行丙酮酸及麩胺酸之生合成反應，使於TCA循環之代謝，以及因糖新生而利用於葡萄糖之生成，改善細胞培養動向，而可期待所期望之多肽之高產量。
本發明之要旨如下所述。
(1)一種多肽之製造方法，其係包含培養可大量表現丙胺酸轉胺酵素，且經導入編碼所期望多肽之DNA之細胞，並使其產生所期望的多肽。
(2)如(1)之製造方法，其中可大量表現丙胺酸轉胺酵素之細胞，係經導入編碼丙胺酸轉胺酵素之DNA之細胞。
(3)如(1)或(2)之製造方法，其中可大量表現丙胺酸轉胺酵素之細胞，進而可大量表現牛磺酸轉運蛋白。
(4)如(3)之製造方法，其中可大量表現牛磺酸轉運蛋白之細胞，係經導入編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA之細胞。
(5)如(2)或(4)之製造方法，其中該細胞係中國倉鼠卵巢細胞。
(6)如(1)～(5)中任一項之製造方法，其中所期望之多肽係抗體。
(7)如(2)～(6)中任一項之製造方法，其中編碼丙胺酸轉胺酵素之DNA係下述(a)～(e)之任何一種，
(a)編碼具有序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列的多肽之DNA
(b)編碼於序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA
(c)編碼具有與序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列70%以上之相似性，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA
(d)具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA
(e)編碼使具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA。
(8)一種醫藥品之製造方法，其係含有以(1)～(7)項中任一項之方法所製造之多肽。
(9)一種細胞，其係導入有編碼丙胺酸轉胺酵素之DNA與編碼所期望的多肽之DNA。
(10)如(9)之細胞，其係進而導入有編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。
(11)一種細胞，其係導入有編碼丙胺酸轉胺酵素之DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。
(12)一種多肽之製造方法，其係包含將已導入可大量表現丙胺酸轉胺酵素，且編碼所期望多肽之DNA之細胞，以含α-酮戊二酸之培養基進行培養，並使其產生所期望的多肽。
根據本發明，可使所期望之多肽之生產量增加。
本說明書係包含為本申請案之優先權基礎之日本專利申請專利2007-205158之說明書以及/或圖面所記載之內容。
以下針對本發明之實施方式更詳細地加以說明。
本發明係包含培養可大量表現ALT，且已導入編碼所期望之多肽的DNA之細胞，並使其產生所期望之多肽，提供多肽的製造方法。
本發明之方法中，細胞為可產生所期望之多肽的天然細胞，亦可為導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞，但以導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞為佳。
本發明之方法中，並未特別限定所期望之多肽，可為抗體(例如抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗聚醣蛋白-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗RGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗CD11a、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)，及生理活性蛋白質(顆粒細胞生長激素(G-CSF)、巨噬細胞生長激素(GM-CSF)、紅血球生成素、干擾素、IL-1及IL-6等干擾素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、PTH等)等各種多肽，但以抗體特佳。抗體可為天然抗體、Fab、scFv、sc(Fv)2等低分子化抗體、嵌合體抗體、人類化抗體等任一種抗體。
藉由使用可大量表現ALT之細胞，而可使藉由該細胞之多肽產生量增加。
已知ALT係使丙胺酸之胺基轉移至2-酮戊二酸，而使麩胺酸生成之酵素。本發明之發明者們認為藉由使其於CHO細胞等宿主細胞內大量表現，可促進自丙胺酸進行丙酮酸及麩胺酸之生合成反應，使於TCA循環之代謝，以及因糖新生而利用於葡萄糖之生成，改善細胞培養動向，而可期待所期望之多肽之高產量。
大量表現ALT之細胞，若為與天然細胞相比ALT的表現量為增加之細胞，則無特別限定。未特別限定為天然的細胞，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白質時用為宿主之細胞。
大量表現ALT之細胞可舉出例如經人為地導入ALT基因之細胞。經人為地導入ALT基因之細胞可依相關業者周知之方法進行製作，例如可將ALT之基因插入載體，再以該載體使細胞成為轉化細胞而進行製作。進而，於本說明書中，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，使內源性ALT基因被活化，其結果包含大量表現ALT之細胞及經人為導入ALT基因之細胞。
使細胞大量表現ALT之基因，並未特別限定為來自何種生物之ALT。具體而言周知為人類，小鼠、大鼠、犬類、非洲爪蟾、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、日本米、原始紅藻、麵包酵母、棉蚜、白色念珠菌、裂殖酵母菌、小巢狀麴菌、煙色麴菌、清酒麴菌米麴菌、新型隱球菌、黏黴菌、錐蟲、細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種、痢疾阿米巴或細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲等之ALT，可利用該等生物，但以與人類、囓齒類或與宿主細胞相同種來源的ALT為佳，例如大量表現ALT之中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，以使用來自人類或倉鼠之ALT為佳。人類、小鼠、酵母菌等ALT存在有異型體(ALT1與ALT2)。ALT2相對於ALT1於胺基酸層次具有80%以上之相似性。於後述之實施例中，使ALT1強制表現。
ALT之基因，可舉出下列(a)～(e)之任一種DNA。
(a)編碼具有序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列的多肽之DNA
(b)編碼於序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列中具有1個或複數個(例如有數個)胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有ALT活性之多肽之DNA
(c)編碼具有與序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列70%以上之相似性，且具有ALT活性之多肽之DNA
(d)具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA
(e)編碼使具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有ALT活性之多肽之DNA。
大量表現ALT之細胞可為動物細胞、植物細胞、酵母等真核細胞；大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞之任一種細胞，以CHO細胞、COS細胞等動物細胞為佳，CHO細胞特佳。另外，為製造所期望的多肽，以使用CHO dhfr-細胞等適合導入所期望的基因之細胞為佳。
大量表現ALT之細胞，為製造所期望的多肽，以進而大量表現牛磺酸轉運蛋白為佳。藉由於相關細胞中導入編碼所期望的多肽之基因，再將該細胞於培養基中進行培養，可製造更大量的所期望的多肽。
使用經人為導入ALT基因之細胞製造所期望的多肽時，並未特別限制ALT基因與編碼所期望的多肽之基因導入的順序，可於導入ALT基因後，再導入編碼所期望的多肽之基因，亦可於導入編碼所期望的多肽之基因後，再導入ALT基因。另外，可同時導入ALT基因與編碼所期望的多肽之基因。
ALT基因及編碼所期望的多肽之基因之導入，可藉由單一載體同時進行導入，亦可使用複數個載體分別進行導入。
藉由使用除了ALT之外亦大量表現牛磺酸轉運蛋白之細胞，可抑制細胞內氨濃度。
牛磺酸轉運蛋白可使牛磺酸、β-丙胺酸及各種胺基酸進入細胞內，為一種具滲透壓調節功能的膜蛋白。
大量表現牛磺酸轉運蛋白的細胞，若為與天然的細胞相比為牛磺酸轉運蛋白的表現量增加之細胞則無特限定。未特別限定為天然的細胞，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白質時使用為宿主之細胞。
大量表現牛磺酸轉運蛋白之細胞，可舉出例如經人為導入牛磺酸轉運蛋白基因的細胞。可根據相關業者周知之方法，製作經人為導入牛磺酸轉運蛋白基因的細胞，例如可藉由將牛磺酸轉運蛋白之基因插入載體，再以該載體使細胞成為轉化細胞而進行製作。
使細胞大量表現牛磺酸轉運蛋白基因，並未特別限定為來自何種生物之牛磺酸轉運蛋白。具體可舉出來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒類之來自生物的牛磺酸轉運蛋白，以來自人類、囓齒類或與宿主細胞相同種來源的牛磺酸轉運蛋白為佳，例如使細胞大量表現牛磺酸轉運蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，以來自人類或倉鼠之牛磺酸轉運蛋白為佳。
牛磺酸轉運蛋白基因，可舉出編碼牛磺酸轉運蛋白之下列(a1 )～(e1 )之任一種DNA。
(a1 )可編碼具序列編號62、64、66或68之胺基酸序列的多肽之DNA
(b1 )編碼於序列編號62、64、66或68之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如有數個)胺基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的胺基酸序列，且具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽之DNA
(c1 )編碼具有與序列編號62、64、66或68之胺基酸序列70%以上相同性，且具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽之DNA
(d1 )具有序列編號61、63、65或67之鹼基序列之DNA
(e1 )於具有序列編號61、63、65或67之鹼基序列之DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽之DNA
製造所期望的多肽時，於大量表現牛磺酸轉運蛋白與ALT基因之細胞中，導入編碼所期望的多肽之基因，再藉由於培養基中培養該細胞而可進行製造。進而，於本說明書中，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，藉由使該細胞內源性的基因被活化，使用可產生所期望的多肽之細胞，而可製造所期望的多肽。
使用經人為導入牛磺酸轉運蛋白基因與ALT基因之細胞而製造所期望的多肽時，並未特別限制牛磺酸轉運蛋白基因與ALT基因與編碼所期望的多肽之基因導入的順序，可於導入牛磺酸轉運蛋白基因與ALT基因後，再導入編碼所期望的多肽之基因，亦可於導入編碼所期望的多肽之基因後，再導入牛磺酸轉運蛋白基因與ALT基因。另外，可同時導入牛磺酸轉運蛋白基因與ALT基因與編碼所期望的多肽之基因。
牛磺酸轉運蛋白基因，ALT基因及編碼所期望的多肽之基因之導入，可藉由單一載體同時進行導入，亦可使用複數個載體分別進行導入。
培養大量表現ALT(亦可大量表現牛磺酸轉運蛋白)時，可使用於培養一般的細胞(動物細胞為佳)時所使用的培養基。一般於該等培養基中包含胺基酸、維他命類、脂質因子、能量來源、滲透壓調節劑、鐵質來源、pH緩衝劑。該等成分的含量一般適當的範圍在胺基酸為0.05-1500mg/L、維他命類0.001-10mg/L、脂質因子0-200mg/L、能量來源1-20g/L、滲透壓調節劑0.1-10000mg/L、鐵質來源0.1-500mg/L、pH緩衝劑1-10000mg/L、微量金屬元素0.00001-200mg/L、界面活性劑0-5000mg/L、增殖輔助因子0.05-10000μg/L以及核苷酸0.001-50mg/L，但並未限定在此範圍，可根據培養的細胞種類、期望的多肽種類等而適宜地決定。
除上述成分外，亦可添加微量金屬元素、界面活性劑、增殖輔助因子、核苷酸等。
具體而言可舉例為含有L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-鳥胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-羥丁胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸等，以L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-羥丁胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸等胺基酸類為佳；i-肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼胺、菸鹼酸、對胺基安息香酸、泛酸鈣、哆醛鹽酸鹽、維他命B6、維他命B2、維他命B1、維他命B12、抗壞血酸等，以生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼胺、泛酸鈣、哆醛鹽酸鹽、維他命B2、維他命B1、維他命B12、抗壞血酸等維他命類為佳；氯化膽鹼、酒石酸膽鹼、亞麻油酸、油酸、膽固醇等，以氯化膽鹼等脂質因子為佳；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，以葡萄糖等能量來源為佳；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，以氯化鈉等滲透壓調節劑為佳；EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等，以氯化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵質來源為佳；碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，以碳酸氫鈉等pH緩衝劑的培養基為佳。
除上述成分外，亦可添加例如硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞矽酸鈉等，以硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素為佳；Tween80、Pluronic F68等界面活性劑；以及重組型胰島素、重組型IGF-1、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重組型TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、維他命A酸、鹽酸四甲烯二胺等，以亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF-1、鹽酸四甲烯二胺等增殖輔助因子為佳；去氧腺苷、去氧胞苷、去氧鳥糞嘌呤、腺苷酸、胞嘧啶、鳥糞嘌呤、尿嘧啶等核苷酸。於適合上述培養基之例中，含有鏈黴素、苄青黴素鉀以及紫黴素等抗生素，及酚紅等pH指示劑亦可。
另外於培養基中亦可添加ALT之基質之α-酮戊二酸。藉由添加α-酮戊二酸可使所期望的多肽(例如抗體)之生產量增加。此時α-酮戊二酸之添加量一般以範圍在0.01～1000mM為佳，0.1～100mM更佳，進而以1～10mM最佳。
培養基的pH依培養細胞而有所不同，但一般為pH6.8～7.6，大部分以pH7.0～7.4為適當。
培養基係市售之動物細胞培養用培養基，亦可使用例如D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1:1Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12)、PRMI1640、CHO-S-SFMⅡ(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL 301(JRH Biosciences公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培養基。
培養基亦可為無血清培養基例如CD-CHO(Invitrogen公司)。
大量表現ALT細胞(大量表現牛磺酸轉運蛋白亦可)為CHO細胞時，CHO細胞之培養可使用相關業者周知之方法進行培養。例如一般可於氣相CO2 濃度0-40%，2-10%為佳，以30-39℃，37℃為佳之下進行培養。
進而使培養細胞產生抗體等所期望的多肽時，於培養後期細胞變為相當高密度的狀態(約1×107 cells/mL)，乳酸等老舊廢物的影響變為極高。若藉由大量表現ALT細胞製造所期望的多肽，於培養後期亦可維持高生存率，亦可期待所期望的多肽的生產量增加。
為使用大量表現ALT細胞產生所期望的多肽，適當的培養期間一般為1天～3個月，以1天～2個月為佳，1天～1個月更佳。
動物細胞培養用的各種培養裝置，可使用例如發酵槽型桶狀培養裝置、air lift型培養裝置、培養瓶型培養裝置、攪拌式反應瓶型培養裝置、微載體型培養裝置、流動層型培養裝置、中空纖維型培養裝置、旋轉瓶型培養裝置、充填槽型培養裝置等進行培養。
培養時可使用批次培養(batch culture)、饋料批次培養(fed-batch culture)、連續培養(continuous culture)等任一種方法，但以饋料批次培養或連續培養為佳，饋料批次培養更佳。
培養大量表現ALT的細胞(亦可大量表現牛磺酸轉運蛋白)時，為增進細胞攝取牛磺酸，可於培養基中添加牛磺酸。並未特別限定添加於培養基中之牛磺酸濃度，一般為0g/L～100g/L，以0g/L～20g/L為佳，以0g/L～10g/L最佳。
根據本發明之方法所製造之多肽，具有可利用為醫藥的生物學活性時，可藉由將該多肽與醫藥上所容許的載體或添加劑進行混合而製劑化，而可製造為醫藥品。
醫藥上所容許的載體以及添加劑可舉出例如水、醫藥上所容許之有機溶劑、膠質、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡萄聚糖、羧基甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、洋菜、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬酯酸、人類血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、被容許為醫藥添加物之界面活性劑等。
實際之添加物可因應本發明治療劑之劑型，自上述之成分中以單一成分或適宜地組合選擇，當然亦未限定於該等物質。例如使用為注射用劑時，可使用將經純化的多肽溶解於溶劑例如生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等中，再將其與加入防止吸附劑例如Tween 80、Tween 20、明膠、人類血清白蛋白等者混合所得之溶液。亦可以為了於使用前再構成之劑型而經凍結乾燥者，提供為凍結乾燥之賦形劑可使用例如甘露醇、葡萄糖等糖醇及糖類。
多肽之有效投予量可根據多肽之種類、做為治療及預防對象之疾病的種類、患者年齡、疾病嚴重程度等適宜地加以選擇。例如多肽為抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白抗體時，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白抗體之有效投予量為每回每公斤之體重可選擇自0.001mg至1000mg之範圍。或可選擇每位患者0.01～100000mg/body之投予量。然而並未限制於該等投予量。
多肽之投予方法可為經口、非經口投予之任一種，以非經口投予為佳，具體而言可舉出注射(例如藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等進行全身或局部投予)、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。
本發明中編碼ALT之基因係可使用具有編碼序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60胺基酸序列之多肽之DNA。其他亦可使用編碼於序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有ALT活性之多肽之DNA。
於序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有ALT活性之多肽之多肽，係與人類，小鼠、大鼠、犬類、非洲爪蟾、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、日本米、原始紅藻、麵包酵母、棉蚜、白色念珠菌、裂殖酵母菌、小巢狀麴菌、煙色麴菌、清酒麴菌米麴菌、新型隱球菌、黏黴菌、錐蟲、細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種、痢疾阿米巴或細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲之ALT(以下亦記做「人類等之ALT」)機能相同的多肽。於該類型之多肽包含例如人類等之ALT之異型體。於後述之實施例中，已公開之編碼人類ALT1基因之496個胺基酸中，使用4個胺基酸(R53S、Q72R、F286S、M332K)被取代之異型體。
為調製與某種多肽機能相同的多肽，相關業者熟知之方法已知有將突變導入多肽之方法。例如該領域之業者可使用特定部位的誘發突變法(Hashimoto-Gotoh,T. et al.(1995)Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W. et al.(1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，藉由於人類等之ALT之胺基酸導入適當的突變，可調製與人類等之ALT機能相同的多肽。自然界亦會產生胺基酸之突變。
與人類等之ALT機能相同的多肽具體而言可舉出人類等之ALT之胺基酸序列(例如序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60)中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為缺失者，人類等之ALT之胺基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為附加者，人類等之ALT之胺基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為被取代者。
突變的胺基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存胺基酸支鏈性質而被突變為其他胺基酸。胺基酸支鏈性質可舉出例如為疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族支鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)，具含羥基支鏈之胺基酸(S、T、Y)，具含硫磺原子支鏈之胺基酸(C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸(D、N、E、Q)，具含鹼基支鏈之胺基酸(R、K、H)，具含芳香族支鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內係表示各胺基酸之縮寫)。
對某些胺基酸，具有藉由1個或複數個胺基酸殘基之缺失、附加及/或以其他胺基酸取代修飾後之胺基酸序列之多肽，已知其如何維持生物學上的活性(Mark,D. F. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500、Wang,A. et al.,Science 224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79,6409-6413)。
於人類等之ALT經附加1個或複數個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含人類等之ALT之融合多肽。融合多肽係人類等之ALT，與其他多肽進行融合後者。製作融合多肽之方法，可使編碼人類等之ALT之基因與編碼其他多肽之基因之框架一致而進行連結，再將其導入表現載體，於宿主內使其表現，可使用相關業者周知之方法。並未特別限定與人類等之ALT進行融合所附加的其他多肽。
與人類等之ALT進行融合所附加的其他多肽可舉出例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、由6個His(組胺酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-tubulin片段、B-tag、Protein C、GST(麩胺基硫轉移酶)、HA(流感病毒血凝素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。
使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼人類等之ALT之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表現，而可調製融合多肽。
相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之方法，可舉出利用雜交技術(Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼人類等之ALT之DNA序列(例如序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之DNA序列)或其一部分為基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分離出與人類等之ALT同等功能之多肽。
為分離出編碼具有與人類等之ALT同等功能之多肽之DNA，相關業者可適當地選擇進行雜交之條件。雜交的條件可舉出例如低限制條件。低限制條件係可舉出例如於42℃，2×SSC，0.1%SDS，以50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件，降低溫度程度，不僅可獲得具有高相似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升高溫度，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影響雜交嚴格條件的要素認為除溫度之外，尚有鹽濃度等複數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可實現相同的嚴格條件。
藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多肽，若為與人類等之ALT之胺基酸序列具70%以上之相似性者為佳，一般具有與人類等之ALT高相似性的胺基酸序列。高相似性一般係指具有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻(Wilbur W. J,and Lipman D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80,726-730)所記載之規則系統為佳。
本發明之多肽，可藉由後述之生產細胞及宿主，或是純化方法，獲得不同的胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈及型態等。然而所得之多肽不限於與人類等之ALT具同等功能，亦可於本發明中利用編碼其之DNA。例如使用原核細胞例如大腸桿菌表現多肽時，於原本的多肽之胺基酸序列N端末端上附加甲硫胺酸殘基。另外，以真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息序列會被除去。可於本發明中利用編碼該類型多肽之DNA。
本發明之多肽可根據相關業者周知之方法，調製為重組多肽或天然多肽。若為重組多肽，可將編碼本發明之多肽之DNA，插入可適宜地表現之載體中，再將其導入適當的宿主細胞後，回收所得之轉化體，而在獲得萃取物後，藉由離子交換、逆相、膠體過濾等色層分析，或通過將對抗本發明多肽的抗體固定於管柱後之親和性色層分析，甚或藉由組合複數個管柱而進行純化、調製。
將麩胺基硫轉移酶多肽與本發明之多肽融合後之多肽，或附加上複數個組胺酸之重組多肽於宿主細胞(例如動物細胞及大腸桿菌等)內進行表現時，可藉由麩胺基硫管柱或鎳管柱而純化使被表現之重組多肽。
於純化融合多肽後，可因應需要將融合多肽中目標多肽以外之區域，以凝血蛋白酵素或Xa因子進行切斷、去除。
天然之多肽可根據相關業者周知之方法，例如對於表現具有與人類等之ALT同等功能之多肽之組織及細胞萃取物，使其與人類等之ALT結合之抗體進行結合後之親和性管柱進行作用後，再藉由純化而可進行分離。抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體。
本發明中，編碼ALT之DNA，可使用具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA。其他亦可使用編碼使具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有ALT活性之多肽之DNA。
編碼ALT之DNA，除可利用於如上所述之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產之外，亦可用於製作大量表現ALT之細胞。編碼ALT之DNA若為可編碼編碼ALT者，可為任何一種型態。亦即，不限制為自mRNA所合成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可編碼ALT之DNA，包含具有以基因密碼之退化程度為基礎之任意鹼基序列之DNA。
編碼ALT之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製。例如以表現ALT之細胞製作cDNA庫，再將ALT之DNA序列(例如序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59)之一部分做為探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可根據例如Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)記載之方法進行調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現ALT之細胞製作RNA，再以ALT之DNA序列(例如序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59)為基礎而合成寡DNA，再將其使用為引子進行PCR反應，藉由使編碼ALT之cDNA增幅而可進行調製。
藉由決定所得之cDNA之鹼基序列，可決定編碼其之轉譯區域，而可獲得ALT的胺基酸序列。藉由將所得之cDNA做為探針篩選染色體DNA庫，可分離出染色體DNA。
具體以如下所述為佳。首先，自表現ALT的細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P. and Sacchi,N.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等而調製全RNA，再使用mRNA Purification Kit(Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外，亦可藉由使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia)而直接調製mRNA。
使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA之合成可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業)而進行。另外，使用引子等，遵循使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)以及聚合脢連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)之5’-RACE法(Frohman,M. A.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1988)85,8998～9002；Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。
自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。
編碼ALT之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列(Grantham,R. et al.,Nucleic Acids Research(1981)9,r43-74)。編碼ALT之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插入適當的DNA質體，連結子之附加，起始密碼子(ATG)以及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)之插入等。
編碼ALT之DNA又包含使具有序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交之DNA，且編碼具有與ALT同等功能之多肽之DNA。
高度嚴格的條件，相關業者可適當地選擇，可舉出例如低限制條件。低限制條件可舉出例如42℃，2×SSC，0.1%SDS，50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源之DNA為佳，例如cDNA或染色體DNA。
該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼ALT之DNA於鹼基序列具有高相似性。編碼ALT之DNA，可編碼與ALT具同等功能之多肽，亦包含與編碼人類等之ALT之DNA具有高相似性的DNA。高相似性一般係指具有96%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可根據Karlin and Altschul之規則系統BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)而加以決定。以該規則系統為基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.,215:403,1990)。根據以BLAST為基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100，wordlength=12。該等解析方法之具體步驟可見於網頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
亦可將編碼ALT之DNA插入載體。
所使用之載體，於例如以大腸桿菌做為宿主時，為使以大腸桿菌(例如JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)等大量增幅且大量調製載體，於大腸桿菌中具有為進行增幅之「ori」，進而以具有轉化後大腸桿菌選擇基因(例如可藉由某些藥劑(氨比西林及四環黴素、克耐黴素、氯絲菌素)而可進行判別之耐藥劑性基因)者為佳。載體可舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外以cDNA之次擇殖、切出為目的時，除上述載體之外，可舉出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。於生產所期望的多肽此一目的而使用載體時，特別適合表現載體。表現或體為例如以於大腸桿菌進行表現為目的時，載體除了具有如可使大腸桿菌進行增幅之上述特徵，以JM109、DH5α、HB101、XL1Blue等做為宿主時，以具有可使大腸桿菌以高效率表現之啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB啟動子(Better等人，Science(1988)240,1041-1043)或T7啟動子等為佳。該等載體除上述載體外可舉出pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(Qiagen公司製)、pEGFP或pET(此時宿主為表現T7 RNA聚合酶之BL21為佳)等。
於載體亦可含有為分泌多肽之訊息序列。為分泌多肽之訊息序列，於使大腸桿菌之胞質週緣區生產時，可使用pelB訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol.(1987)169,4379)。對宿主細胞導入載體時，可使用氯化鈣法，電穿孔法進行。
於使用大腸桿菌為宿主之外時，例如為製造所期望之多肽所使用之載體，可舉出來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)，及pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17),p5322)，pEF，pCDM8)，來自昆蟲細胞之表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL公司製，pBacPAK8)，來自植物之表現載體(例如pMH1，pMH2)，來自動物病毒之表現載體(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自輪狀病毒之表現載體(例如pZIpneo)，來自酵母菌之表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)，pNV11，SP-Q01)，來自枯草桿菌之表現載體(例如pPL608，pKTH50)等。
以於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞進行表現為目的時、為使於細胞內進行表現所必須的啟動子以具有例如SV40啟動子(Mulligan等人，Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res. (1990)18,5322)、CMV啟動子等為佳，以具有選殖轉化細胞之基因(例如藉由藥劑(紐奧黴素、G418等)可判別之耐藥劑性基因)為佳。具有該特性之載體，可舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
進而為使基因安定地進行表現，並且，以使細胞內之基因拷貝數增加為目的時，可舉出於核酸合成路徑缺損之CHO細胞，導入具有可與其互補之DHFR基因之載體(例如pCHOI)，藉由滅殺除癌錠(MTX)使其增幅之方法。另外，以使基因短暫表現為目的時，可舉出使用於染色體上具有表現SV40 T抗原基因之COS細胞，以具有SV40複製起點之載體(pcD等)進行轉化之方法。複製起點可使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等者。進而為於宿主細胞系增幅基因之拷貝數，表現載體之選擇標記為可含有胺基糖磷酸轉移酶(APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhrf)基因等。
導入有編碼ALT之DNA(可為已插入載體者)之宿主細胞並無特別限制，可使用例如大腸桿菌等各種動物細胞。將可編碼所期望之多肽之DNA導入已導入有編碼ALT之DNA之宿主細胞時，該宿主細胞可大量表現ALT，可增加所期望之多肽之生產。亦可於已導入有編碼ALT之DNA之宿主細胞中，進而導入可編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA(可為已插入載體者)。藉由於已導入有編碼ALT之DNA之宿主細胞中，再導入編碼所期望之多肽之DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA，可增加所期望之多肽之生產量。為製造多肽之生產系有in vitro及in vivo之生產系。in vitro之生產系可舉出使用真核細胞之生產系及使用原核細胞之生產系。
本發明中編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA，可使用具有編碼序列編號62、64、66或68之胺基酸序列之多肽之DNA。其他亦可使用編碼於序列編號62、64、66或68之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如有數個)胺基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的胺基酸序列，且具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽之DNA。
於序列編號62、64、66或68之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如有數個)胺基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的胺基酸序列，且具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽，係具有與倉鼠、大鼠、小鼠以及人類牛磺酸轉運蛋白(以下亦記做「倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白」)機能相同的多肽。於該類型之多肽中亦包含倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之異型體等。
為調製與某種多肽機能相同的多肽，相關業者熟知之方法已知有將突變導入多肽之方法。例如該領域之業者可使用特定部位的誘發突變法(Hashimoto-Gotoh,T. et al.(1995)Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W. et al.(1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，藉由於倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸導入適當的突變，可調製與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白機能相同的多肽。自然界亦會產生胺基酸之突變。
與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白機能相同的多肽，具體而言可舉出倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列中之1個或2個以上，2個以上30個以下更佳，最佳為2個以上10個以下之胺基酸為缺失者，倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列中之1個或2個以上，2個以上30個以下更佳，最佳為2個以上10個以下之胺基酸為附加者，倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列中之1個或2個以上，2個以上30個以下更佳，最佳為2個以上10個以下之胺基酸為被取代者。
突變的胺基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存胺基酸支鏈性質而被突變為其他胺基酸。胺基酸支鏈性質可舉出例如為疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族支鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)，具含羥基支鏈之胺基酸(S、T、Y)，具含硫磺原子支鏈之胺基酸(C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸(D、N、E、Q)，具含鹼基支鏈之胺基酸(R、K、H)，具含芳香族支鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內係表示各胺基酸之縮寫)。
於倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白經附加1個或複數個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之融合多肽。融合多肽係倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白，與其他多肽進行融合後者，包含於本發明中。製作融合多肽之方法，可使編碼倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之基因與編碼其他多肽之基因之框架一致而進行連結，再將其導入表現載體，於宿主內使其表現，可使用相關業者周知之方法。並未特別限定與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白進行融合所附加的其他多肽。
與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白進行融合所附加的其他多肽可舉出例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、由6個His(組胺酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-tubulin片段、B-tag、Protein C、GST(麩胺基硫轉移酶)、HA(流感病毒血凝素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。
使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表現，而可調製融合多肽。
相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之方法，可舉出利用雜交技術(Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之DNA序列或其一部分為基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分離出與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白同等功能之多肽。
為分離出編碼具有與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白同等功能之多肽之DNA，相關業者可適當地選擇進行雜交之條件。雜交的條件可舉出例如低限制條件。低限制條件係可舉出例如於42℃，2×SSC，0.1%SDS，以50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件，降低溫度程度，不僅可獲得具有高相似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升高溫度，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影響雜交嚴格條件的要素認為除溫度之外，尚有鹽濃度等複數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可實現相同的嚴格條件。
藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多肽，若為與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列具70%以上之相似性者為佳，一般具有與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白高相似性的胺基酸序列。於前述之多肽中，亦包含與本發明之倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白同等機能，且具有與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列相似性高之多肽。高相似性一般係指具有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻(Wilbur W. J, and Lipman D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80,726-730)所記載之規則系統為佳。
本發明之多肽，可藉由後述之生產細胞及宿主，或是純化方法，獲得不同的胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈及型態等。然而所得之多肽不限於與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白具同等功能，亦可於本發明中利用編碼其之DNA。例如使用原核細胞例如大腸桿菌表現多肽時，於原本的多肽之胺基酸序列N端末端上附加甲硫胺酸殘基。另外，以真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息序列會被除去。可於本發明中利用編碼該類型多肽之DNA。
本發明之多肽可根據相關業者周知之方法，調製為重組多肽或天然多肽。若為重組多肽，可將編碼本發明之多肽之DNA，插入可適宜地表現之載體中，再將其導入適當的宿主細胞後，回收所得之轉化體，而在獲得萃取物後，藉由離子交換、逆相、膠體過濾等色層分析，或通過將對抗本發明多肽的抗體固定於管柱後之親和性色層分析，甚或藉由組合複數個管柱而進行純化、調製。
將麩胺基硫轉移酶多肽與本發明之多肽融合後之多肽，或附加上複數個組胺酸之重組多肽於宿主細胞(例如動物細胞及大腸桿菌等)內進行表現時，可藉由麩胺基硫管柱或鎳管柱而純化使被表現之重組多肽。
於純化融合多肽後，可因應需要將融合多肽中目標多肽以外之區域，以凝血蛋白酵素或Xa因子進行切斷、去除。
天然之多肽可根據相關業者周知之方法，例如對於表現多肽之組織及細胞萃取物，使其與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白結合之抗體進行結合後之親和性管柱進行作用後，再藉由純化而可進行分離。抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體。
本發明中，編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA，可使用具有序列編號61、63、65或67之鹼基序列之DNA。其他亦可使用編碼使具有序列編號61、63、65或67之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有牛磺酸轉運蛋白活性之多肽之DNA。
編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA，除可利用於如上所述之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產之外，亦可用於製作大量表現牛磺酸轉運蛋白之細胞。編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA若為可編碼編碼牛磺酸轉運蛋白者，可為任何一種型態。亦即，不限制為自mRNA所合成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA，包含具有以基因密碼之退化程度為基礎之任意鹼基序列之DNA。
編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製。例如以表現牛磺酸轉運蛋白之細胞製作cDNA庫，再將編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA序列(例如序列編號61、63、65或67)之一部分做為探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可根據例如Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)記載之方法進行調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現牛磺酸轉運蛋白之細胞製作RNA，再以牛磺酸轉運蛋白之DNA序列(例如序列編號61、63、65或67)為基礎而合成寡DNA，再將其使用為引子進行PCR反應，藉由使編碼牛磺酸轉運蛋白之cDNA增幅而可進行調製。
藉由決定所得之cDNA之鹼基序列，可決定編碼其之轉譯區域，而可獲得牛磺酸轉運蛋白的胺基酸序列。藉由將所得之cDNA做為探針篩選染色體DNA庫，可分離出染色體DNA。
具體以如下所述為佳。首先，自表現牛磺酸轉運蛋白的細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P. and Sacchi,N.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等而調製全RNA，再使用mRNA Purification Kit(Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外，亦可藉由使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia)而直接調製mRNA。
使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA之合成可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業)而進行。另外，使用引子等，遵循使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)以及聚合脢連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)之5’-RACE法(Frohman,M. A.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1988)85,8998～9002；Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。
自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。
編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列(Grantham,R. et al.,Nucleic Acids Research(1981)9,r43-74)。編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插入適當的DNA質體，連結子之附加，起始密碼子(ATG)以及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)之插入等。
編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA又包含使具有序列編號61、63、65或67之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交之DNA，且編碼具有與牛磺酸轉運蛋白同等功能之多肽之DNA。
高度嚴格的條件，相關業者可適當地選擇，可舉出例如低限制條件。低限制條件可舉出例如42℃，2×SSC，0.1%SDS，50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源之DNA為佳，例如cDNA或染色體DNA。
該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之DNA於鹼基序列具有高相似性。該等DNA為可編碼與倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白同等功能之多肽，亦包含與編碼倉鼠等之牛磺酸轉運蛋白之DNA具有高相似性的DNA。高相似性一般係指具有96%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可根據Karlin and Altschul之規則系統BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)而加以決定。以該規則系統為基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.,215:403-410,1990)。根據以BLAST為基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100，wordlngth=12。該等解析方法之具體步驟可見於網頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov .)。
亦可將編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA插入載體。
所使用之載體，於例如以大腸桿菌做為宿主時，為使以大腸桿菌(例如JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)等大量增幅且大量調製載體，於大腸桿菌中具有為進行增幅之「ori」，進而以具有轉化後大腸桿菌選擇基因(例如可藉由某些藥劑(氨比西林及四環黴素、克耐黴素、氯絲菌素)而可進行判別之耐藥劑性基因)者為佳。載體可舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外以cDNA之次擇殖、切出為目的時，除上述載體之外，可舉出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。於生產所期望的多肽此一目的而使用載體時，特別適合表現載體。表現載體為例如以於大腸桿菌進行表現為目的時，載體除了具有如可使大腸桿菌進行增幅之上述特徵，以JM109、DH5α、HB101、XL1Blue等做為宿主時，以具有可使大腸桿菌以高效率表現之啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB啟動子(Better等人，Science(1988)240,1041-1043)或T7啟動子等為佳。該等載體除上述載體外可舉出pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(Qiagen公司製)、pEGFP或pET(此時宿主為表現T7 RNA聚合酶之BL21為佳)等。
於載體亦可含有為分泌多肽之訊息序列。為分泌多肽之訊息序列，於使大腸桿菌之胞質週緣區生產時，可使用pelB訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol. (1987)169,4379)。對宿主細胞導入載體時，可使用氯化鈣法，電穿孔法進行。
於使用大腸桿菌為宿主之外時，例如為製造所期望之多肽所使用之載體，可舉出來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)，及pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,17(17),p5322)，pEF，pCDM8)，來自昆蟲細胞之表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL公司製，pBacPAK8)，來自植物之表現載體(例如pMH1，pMH2)，來自動物病毒之表現載體(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自輪狀病毒之表現載體(例如pZIpneo)，來自酵母菌之表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)，pNV11，SP-Q01)，來自枯草桿菌之表現載體(例如pPL608，pKTH50)等。
以於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞進行表現為目的時、為使於細胞內進行表現所必須的啟動子以具有例如SV40啟動子(Mulligan等人,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res. (1990)18,5322)、CMV啟動子等為佳，以具有選殖轉化細胞之基因(例如藉由藥劑(紐奧黴素、G418等)可判別之耐藥劑性基因)為佳。具有該特性之載體，可舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
進而為使基因安定地進行表現，並且，以使細胞內之基因拷貝數增加為目的時，可舉出於核酸合成路徑缺損之CHO細胞，導入具有可與其互補之DHFR基因之載體(例如pCHOI等)，藉由滅殺除癌錠(MTX)使其增幅之方法。另外，以使基因短暫表現為目的時，可舉出使用於染色體上具有表現SV40 T抗原基因之COS細胞，以具有SV40複製起點之載體(pcD等)進行轉化之方法。複製起點可使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等者。進而為於宿主細胞系增幅基因之拷貝數，表現載體之選擇標記為可含有胺基糖磷酸轉移酶(APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhrf)基因等。
本發明亦提供導入有編碼ALT之DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA之細胞(DNA均可為已插入載體者)。
使用真核細胞時，可使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞做為宿主。動物細胞已知有哺乳動物細胞例如CHO(J. Exp. Med.(1995)108,945)、COS、3T3、骨髓瘤細胞、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、兩棲類細胞例如非洲爪蛙卵母細胞(Valle,et al.,Nature(1981)291,340-358)、或昆蟲細胞例如Sf9、Sf21、Tn5。CHO細胞則特別適合使用有DHFR基因缺損之CHO細胞dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77,4216-4220)及CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1968)60,1275)。動物細胞中，以大量表現為目的時以CHO細胞細胞為特佳。對宿主細胞導入DNA(可為已插入載體者)時可使用例如磷酸鈣法，DEAE葡聚醣法，陽離子脂質體DOTAP(Boehringer-mannheim公司製)之方法，電穿孔法，微脂粒感染等方法進行。
植物細胞已知有例如來自菸草(Nicotiana tabacum)之細胞做為多肽之生產系，可將其進行癒創組織培養。真菌細胞之酵母菌，已知有例如酵母菌(Saccharomyces)屬，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線狀菌，例如麴菌(Aspergillus)屬，例如黑麴菌(AspergilluSniger)。
使用原核細胞時有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞可舉出大腸桿菌(E.coli)，例如JM109、DH5α、HB101等，其他已知有枯草桿菌。
該等細胞藉由目標之基因進行轉化，經進行轉化後之細胞可藉由in vitro培養，而得編碼目標基因之多肽。培養係可遵循周知之方法。例如動物細胞之培養液可使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時可併用牛胎兒血清(FCS)等血清輔助液，亦可為無血清培養。培養時之pH以約6～8為佳。培養一般於約30～40℃下進行15～200小時，可根據需要加入更換培養液、通氣、攪拌。
另外，於invivo多肽之生產系可舉出例如使用動物之生產系及使用植物之生產系。將目標之基因導入該等動物或植物中，於動物或植物體內使多肽產生，再進行回收。於本發明中「宿主」係包含該等動物、植物。
使用動物時有使用哺乳類動物、昆蟲之生產系。哺乳類動物可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。使用哺乳動物時可使用基因轉殖動物。
例如，將目標之基因，調製為與可編碼如山羊β-酪蛋白般於乳汁中原本會產生之多肽之基因之融合基因。其次，將含有該融合基因之基因片段注入山羊之胚胎中，再將該胚胎移植入雌山羊體內。自接受胚胎隻山羊所產出之轉殖山羊或其後代所生產的乳汁中，可獲得目標之多肽。為增加自轉殖山羊所生產的含有多肽之乳汁量，亦可適當地對轉殖山羊使用荷爾蒙(Ebert, K.M. et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
昆蟲可使用例如蠶。使用蠶時可藉由使蠶感染已插入可編碼目標多肽之基因之桿狀病毒，而可自該蠶肢體液中獲得目標之多肽(Susumu,M. et al.,Nature(1985)315,592-594)。
進而，使用植物時可使用例如菸草。使用菸草時，將可編碼目標多肽之基因插入植物表現用載體，例如pMON530，再將該載體導入如農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)般之細菌中。使該細菌感染菸草，例如菸草(Nicotiana tabacum)，可自該菸草之葉子獲得所期望之多肽(Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994)24,131-138)。
如此所得之多肽可自宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離出來，可純化為實質的純粹且均一的多肽。多肽之分離與純化一般係可使用用於多肽純化時之分離、純化方法，並無任何特別的限定。例如可適宜地選擇層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、溶媒沉澱、溶媒萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯胺膠體電泳、等電點電泳、透析、再結晶等，亦可將其組合而進行多肽之分離與純化。
層析法可舉出例如親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization： A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。該等層析方法中，可使用液相層析例如HPLC、FPLC等液相層析而進行。本發明使用該等純化方法，亦包含經高度純化之多肽。
可藉由於多肽純化前或純化後，使適當的多肽修飾酵素進行作用，而除去任意地加上修飾之部分的多肽。多肽修飾酵素可使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、離胺基內切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
本發明中「經導入DNA之細胞」包含以基因重組技術將外來性DNA納入細胞之外，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，使內源性之DNA被活化，其結果包含開始或增加了表現對應相關DNA之蛋白質或相關DNA之輯錄之細胞此概念。
 實施例
以下根據實施例具體說明本發明。且該等實施例係為說明本發明，並未限定本發明之範圍。
[實施例1]選殖人類肝細胞丙胺酸轉胺酵素(Alanine aminotransferase)之基因
以市售之Human Liver QUICK-Clone cDNA(Clontech公司)為鑄型，以PCR法獲得來自人類肝細胞Alanine aminotransferase(ALT1)基因。決定被選殖基因之鹼基序列，自與已公開之人類ALT1之相似性，確認可編碼ALT1。所得之ALT1基因，發現1488個鹼基中有5個位置(c157a、a215g、c765t、t857c、t995a)產生變異，編碼的胺基酸，496個中有4個胺基酸(R53S、Q72R、F286S、M332K)不同，將其做為來自人類肝細胞ALT1 PCR複製產物用於改變細胞。
[實施例2]藉由導入人類丙胺酸轉胺酵素而使抗體產生量增加
藉由於實施例1之選殖取得之人類ALT1(以下記為ALT1)之基因中加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pPur-ALT1(圖1)，pHyg-ALT1(圖2)。將未含有pPur-ALT1或ALT1基因之pPur表現質體，以電穿孔法導入做為母株之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生細胞之CHO細胞(參照國際公開第WO2006/006693號冊子)。於Puromycin(6μg/ml)存在下，選拔出靜置培養下高增殖之細胞株(pPur-ALT1：7株，pPur：3株)。擴張後自pPur-ALT1細胞株調製Total RNA，根據TaqMan法選拔大量表現人類ALT1之6株，進而於震動培養下，比較做為控制組之導入pPur細胞(3株)與相同程度增殖之4株做為導入人類ALT1細胞其抗體產生量。於初始密度為2×105 cells/mL之50mL搖瓶饋料批次培養中，搖動培養後其第17天，導入pPur-ALT1細胞(4株)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，較導入pPur細胞(3株)有優勢表現(t檢定P<0.01，圖3)。於搖動饋料批次培養之檢討中，當產生最多抗體之pPur-ALT1表現株A72以及pPur表現株P41分別進行初始為2×105 cells/mL之1L瓶中饋料批次培養時，A72之抗體產生量於培養第19天為2.9g/L，較P41之抗體產生量(2.2g/L)為高生產量(圖4)。培養第14天之後，因未發現P41之產生量增加，認為A72之抗體高產生量係由於生存率維持之效果(圖5)。另外，於Hygromycin(200μg/mL)存在下，以與上述相同之方法將經藥劑選拔之導入pHyg/ALT細胞(3株)與母株，同時以初始密度為1×105 cells/m L進行15m L試管饋料批次培養，於試管培養後期第10天，導入pHyg-ALT細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量為471mg/L、544mg/L、588mg/L，均為母株(400mg/L)以上(未顯示數據)。
其次，將導入pHyg-TauT細胞T10(參照後述之參考例2)做為母株，與pPur-ALTl 或 pPur共同導入，選拔出高增殖且大量表現人類ALTl之 TauT/ALTl共同表現細胞(6株)以及高增殖之TauT/pPur共同表現細胞(8株)，以初始密度為10×105 cells/m L進行50mL搖瓶饋料批次培養。ALT表現細胞之TauT/ALT1共同表現株之震動培養第4天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，相對於TauT/pPur細胞為優勢(t檢定P<0.01，圖6)。
於搖動饋料批次培養之檢討中，當產生最多抗體且表現最高ALTlmRNA 之 TauT/ALTl共同表現株TA41(881mg/L/4days)進行初始為10×105 cells /mL 之1L瓶中饋料批次培養時，其抗體產生量於培養第7天為1.3g/L，培養第10天為3.0g/L，培養第12天為3.5g/L，培養第17天為4.6g/L，培養第21天為5.3g/L之高值(圖7)，較TauT/pPur共同表現株中產生量最高之控制組株TP08(656mg/L/4days)明顯為高(培養第10天為2.4g/L)。
於TauT/ALT1共同表現株TA41之50mL搖瓶饋料批次培養第14天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，當添加與丙胺酸同為基質之α-酮戊二酸時即增加(圖22)。培養第14天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，於2.5mM之α-酮戊二酸存在下為1452mg/L，未存在α-酮戊二酸下為1239mg/L。
上述結果顯示藉由人為地使ALT1表現，可得於培養後期大量產生抗體之細胞。
本發明可應用於全部產生抗體細胞。
[參考例1]選殖來自CHO細胞之倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因
自經導入IL-6接受器抗體基因之抗IL-6接受器抗體產生細胞(特開平8-99902號公報)之CHO DXB11細胞，進行萃取total RNA後，合成依賴Poly A之cDNA。以經Sal I、Xho I、EcoR I三種限制酶進行片段化後之cDNA為鑄型，藉由PCR獲得Hamster牛磺酸轉運蛋白(TauT)基因。PCR引子使用已知之設計Rat/Mouse TauT被保存的基因序列之含有3’5’者。決定被選殖之基因之鹼基序列，自與已知之生物種的TauT之相同性，確認可編碼Hamster TauT(圖8)。Hamster TauT胺基酸序列為Mouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(93% Identity)，對TauT具高相似性，預測具12之膜貫通區域之轉運子(圖9)。
[參考例2]藉由導入倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因而使生存細胞密度增加、抑制乳酸產生量以及增加抗體產生量
藉由參考例1之選殖取得之Hamster TauT(以下稱做TauT)基因中加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pHyg/TauT(圖10)。將除了pHyg/TauT或TauT基因之控制組質體pHyg以電穿孔法導入做為母株之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生細胞之CHO細胞(參照國際公開第WO2006/006693號冊子)。於Hygromycin(400μg/mL)存在下選拔導入表現質體之細胞後，將安定後增殖之細胞株均擴張(pHyg/TauT：8株，pHyg:7株)。調製TauT之mRNA後根據TaqMan法，可確認相對於母株具優勢表現之7株做為導入pHyg/TauT細胞。導入細胞(7株)之mRNA平均表現量為控制組(7株)之約40倍。將共計14株之細胞以初始密度為2×105 cells/mL，進行50mL之搖瓶批次(batch)培養以及饋料批次(Fed-batch)培養，並比較培養後期第7天之生存細胞密度，乳酸產生量，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量。批次培養中伴隨細胞增殖，於培養液中蓄積乳酸等阻礙生長物質，使增殖被抑制，但導入pHyg/TauT細胞之生存細胞密度(圖11)以及乳酸產生量(圖12)，相對於導入pHyg細胞為優勢(t檢定P<0.05)。關於抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量，導入pHyg/TauT細胞之7株中有4株為導入pHyg細胞之最高值以上(圖13)。導入pHyg/TauT細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量之優勢性(t檢定P<0.01，圖14)可自饋料批次培養明確反應，上述4株中增殖能最高之導入pHyg/TauT細胞(T10)與母株，進行1L之瓶中饋料批次培養後，T10於培養第32天亦維持80%以上之生存率(圖15)且抑制乳酸產生。其結果，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量於培養第35天達成2.9g/L(圖16)。導入TauT之T10細胞於其細胞膜上表現TauT分子係以流式細胞儀分析(圖17)而確認。上述結果，顯示藉由經人為地使Hamster TauT表現，可提高產生抗體細胞之潛能，而可獲得大量產生抗體株。
[參考例3]導入倉鼠牛磺酸轉運蛋白株之抑制氨產生量，攝取牛磺酸，麩胺酸消耗量增加，以及不依賴牛磺酸之抗體產生量
將母株及導入pHyg/TauT株，以初始2×105 cells/mL進行1L瓶中饋料批次培養，並適時地自培養槽中採取含450×105 細胞之培養液。藉由離心取出培養上清液後，於細胞沉澱物中加入含蛋白酶阻礙劑(Complete Mini,Roche Diagnostics公司，Protease inhibitor cocktail tablets)之冷卻滅菌水1mL，於冰上使用超音波細胞破碎機(MISONIX ASTRASON MODEL XL2020)，以脈衝輸送5秒操作後，休止5秒為一個循環，共計12個循環進行反覆處理，使細胞完全破碎。將處理後之溶液全量加入微量離心濃縮管，調製為分子量5000以下之濾液，做為細胞內胺基酸測定用試樣。各試樣再進而使用寧海德林試液-L8500組(和光純藥工業)以及日立製全自動胺基酸分析裝置(L-8500)之改良型，檢出、比較於570mm之吸光度，並求出試樣中各種胺基酸濃度。培養液中各種胺基酸以及氨之濃度為直接測定之值，並未進行μM層次之濃度比較，另外，細胞內濃度係於細胞沉澱物中加入冷卻滅菌水1mL，進行超音波細胞破碎後，將各種胺基酸以及氨等之測定值換算為每細胞之值，再進行其換算值之比較。圖18中氨濃度比規定為1L瓶中饋料批次培養開始時每450×105 個之母株之氨檢出值為1，再與開始培養時，第6天，第12天，第18天之檢出值進行比較，再求出比。圖19，圖20之牛磺酸與麩胺酸亦根據上述之胺基酸分析而進行測定。
其結果，針對導入pHyg/TauT株於培養後期，細胞內氨被維持在低濃度，認為對大量產生抗體有所貢獻(圖18)。
細胞內之牛磺酸濃度比係以與上述之氨大致相同之方法而求得(圖19)。相異點在於將50mL震動批次培養於第4天每200×105 個母株細胞之氨檢出值規定為1。
其結果，導入pHyg/TauT株係依賴牛磺酸之添加量而攝取牛磺酸，其攝取量與母株相同。然而如圖20所示，導入pHyg/TauT株之麩胺酸消耗量相對於母株來得顯著，並未依賴初始牛磺酸濃度。麩胺酸經報告可改善融合瘤之細胞增殖率及生存率，以及抗體之產生能力且具有使抗體產生量提高之功效(Enzyme and Microbial Technology 17：47-55,1995)。因此，導入pHyg/TauT株之增強產生抗體效果，係認為有以牛磺酸轉運蛋白為介後，因牛磺酸以外之胺基酸(麩胺酸等)之攝取所引起之可能性。另外，麩胺酸之濃度係將於圖19之培養第4天之培養液，進行胺基酸分析後之測定值，換算為每1×105 個細胞後之值。
實際上，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，並未依賴開始進行50mL震動饋料批次培養時初始牛磺酸濃度(0～500mM(62.575g/L)，圖21)。另外，針對母株亦未發現因初始牛磺酸濃度而影響抗體產生量之優勢之差異。
由以上結果，無論於培養開始時之培養基中是否含有牛磺酸，大量表現TauT株顯示具有較高的促進抗體產生能力，而認為其亦有促進牛磺酸之外的胺基酸等之攝取之可能性。
本說明書所引用之全部刊物、專利以及專利申請，係以直接參考之方式而加入本說明書中。
本發明可利用於多肽之生產。
序列表之非關鍵文字
<序列編號1>序列編號1係編碼人類丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875)。
<序列編號2>序列編號2係人類丙胺酸轉胺酵素(ALT1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875)。
<序列編號3>序列編號3係編碼人類丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT2)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706)。
<序列編號4>序列編號4係人類丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT2)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homosapiens(human)：84706)。
<序列編號5>序列編號5係編碼小鼠丙胺酸轉胺酵素(ALT1)之基因(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282)之鹼基序列。
<序列編號6>序列編號6係小鼠丙胺酸轉胺酵素(ALT1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282)。
<序列編號7>序列編號7係編碼小鼠丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT2)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682)。
<序列編號8>序列編號8係小鼠丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT2)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682)。
<序列編號9>序列編號9係編碼大鼠丙胺酸轉胺酵素(ALT1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670)。
<序列編號10>序列編號10係大鼠丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670)。
<序列編號11>序列編號11係編碼犬丙胺酸轉胺酵素(ALT1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510)。
<序列編號12>序列編號12係犬丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510)。
<序列編號13>序列編號13係編碼非洲爪蟾丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533)。
<序列編號14>序列編號14係非洲爪蟾丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533)。
<序列編號15>序列編號15係編碼黑腹果蠅丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640)。
<序列編號16>序列編號16係黑腹果蠅丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640)。
<序列編號17>序列編號17係編碼秀麗隱桿線蟲丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/CaenorhabditiS elegans(nematode)：C32F10.8)。
<序列編號18>序列編號18係秀麗隱桿線蟲丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8)。
<序列編號19>序列編號19係編碼日本米丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice )：4342210)。
<序列編號20>序列編號20係日本米丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210)。
<序列編號21>序列編號21係編碼日本米丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524)。
<序列編號22>序列編號22係日本米丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524)。
<序列編號23>序列編號23係編碼原始紅藻丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C)。
<序列編號24>序列編號24係原始紅藻丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C)。
<序列編號25>序列編號25係編碼麵包酵母丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C)。
<序列編號26>序列編號26係麵包酵母丙胺酸轉胺酵素(ALT 1)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C)。
<序列編號27>序列編號27係編碼麵包酵母丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT 2)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C)。
<序列編號28>序列編號28係麵包酵母丙胺酸轉胺酵素異型體(ALT 2)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C)。
<序列編號29>序列編號29係編碼棉蚜丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGRO85W)。
<序列編號30>序列編號30係棉蚜丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGos_AGRO85W)。
<序列編號31>序列編號31係編碼白色念珠菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：Ca019_346)。
<序列編號32>序列編號32係白色念珠菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：Ca019_346)。
<序列編號33>序列編號33係編碼裂殖酵母菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08)。
<序列編號34>序列編號34係裂殖酵母菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08)。
<序列編號35>序列編號35係編碼小巢狀麴菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2)。
<序列編號36>序列編號36係小巢狀麴菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2)。
<序列編號37>序列編號37係編碼煙色麴菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770)。
<序列編號38>序列編號38係煙色麴菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770)。
<序列編號39>序列編號39係編碼清酒麴菌米麴菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：A0090003000164)。
<序列編號40>序列編號40係清酒麴菌米麴菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：A0090003000164)。
<序列編號41>序列編號41係編碼新型隱球菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490)。
<序列編號42>序列編號42係新型隱球菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490)。
<序列編號43>序列編號43係編碼細胞性黏菌黏黴菌丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139)。
<序列編號44>序列編號44係細胞性黏菌黏黴菌丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139)。
<序列編號45>序列編號45係編碼錐蟲丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950)。
<序列編號46>序列編號46係錐蟲丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950)。
<序列編號47>序列編號47係編碼細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種丙胺酸轉胺酵素之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630)。
<序列編號48>序列編號48係細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種丙胺酸轉胺酵素之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630)。
<序列編號49>序列編號49係編碼痢疾阿米巴丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009)。
<序列編號50>序列編號50係痢疾阿米巴丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009)。
<序列編號51>序列編號51係編碼痢疾阿米巴丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016)。
<序列編號52>序列編號52係痢疾阿米巴丙胺酸轉胺酵素(2種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016)。
＜序列編號53＞序列編號53係編碼細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420)。
＜序列編號54＞序列編號54係細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420)。
＜序列編號55＞序列編號55係編碼細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430)。
＜序列編號56＞序列編號56係細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430)。
＜序列編號57＞序列編號57係編碼細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120)。
＜序列編號58＞序列編號58係細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120)。
＜序列編號59＞序列編號59係編碼細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140)。
＜序列編號60＞序列編號60係細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲丙胺酸轉胺酵素(4種中之1個)之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140)。
＜序列編號61＞序列編號61係編碼倉鼠牛磺酸轉運蛋白之基因之鹼基序列。
＜序列編號62＞序列編號62係倉鼠牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列。
＜序列編號63＞序列編號63係編碼大鼠牛磺酸轉運蛋白之基因之鹼基序列(GenBank NM_017206)。
＜序列編號64＞序列編號64係大鼠牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列(GenBank NM_017206)。
＜序列編號65＞序列編號65係編碼小鼠牛磺酸轉運蛋白之基因之鹼基序列(GenBank NM_009320)。
＜序列編號66＞序列編號66係小鼠牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列(GenBank NM_009320)。
＜序列編號67＞序列編號係編碼人類牛磺酸轉運蛋白之基因之鹼基序列(GenBank NM_003043)。
＜序列編號68＞序列編號68係人類牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列(GenBank NM_003043)。
[圖1]圖1係使人類ALT1(496個胺基酸)表現之Puromycin選拔用之質體。
[圖2]圖2係使人類ALT1(496個胺基酸)表現之Hygromycin選拔用之質體。
[圖3]圖3係於50ml搖瓶饋料批次培養第17天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。導入pPur-ALT1細胞(n=4)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之產生量，相對於導入pPur細胞(n=3)較佔優勢(P＜0.01)。
[圖4]圖4係ALT1表現株之A72以及控制組株P41於1L瓶中饋料批次培養之抗體產生量圖。於培養第19天A72之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量為2.9g/L，較P41為高。
[圖5]圖5係ALT1表現株之A72以及控制組株P41之生存率圖。於培養後期A72之生存率較P41為高。
[圖6]圖6係於50ml搖瓶饋料批次培養第4天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。共同導入pHyg-TauT/pPur-ALT1細胞細胞(n=6)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之產生量，相對於共同導入pHyg-TauT/pPur細胞(n=8)較佔優勢(P＜0.01]。
[圖7]圖7係TauT/ALT1共同表現株之TA41之1L瓶中饋料批次培養之抗體產生量圖。於培養第21天抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量為5.3g/L。
[圖8]圖8表示被選殖之源自CHO細胞之倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因之鹼基序列以及胺基酸序列。
[圖9]圖9係新穎地經選殖之源自CHO細胞之牛磺酸轉運蛋白膜拓僕。
[圖10]圖10係使Hamster TauT(622個胺基酸)表現之質體。
[圖11]圖11係於50ml搖瓶批次培養第7天活細胞密度圖。導入pHyg/TauT細胞之活細胞密度，相對於導入pHyg細胞較佔優勢。
[圖12]圖12係於50ml搖瓶批次培養第7天乳酸產生量圖。導入pHyg/TauT細胞乳酸產生量低，相對於導入pHyg細胞較佔優勢。
[圖13]圖13係於50ml搖瓶批次培養第7天抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。導入pHyg/TauT細胞7株中之4株，具有導入pHyg細胞之最高值以上之抗體產生量。
[圖14]圖14係於50ml搖瓶饋料批次培養第7天抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。導入pHyg/TauT細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體，相對於導入pHyg細胞較佔優勢。
[圖15]圖15係增殖能較高之導入pHyg/TauT細胞之T10，於1L瓶中饋料批次培養的生存率圖。T10之生存率於培養第32天仍有80%以上。
[圖16]圖16係於靜置培養之擴張過程中增殖能較高之導入pHyg/TauT細胞之T10，於1L瓶中饋料批次培養的抗體產生量圖。於培養第35天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量為2.9g/L。
[圖17]圖17係導入TauT之T10細胞，於細胞膜上表現TauT分子之流式細胞儀分析結果圖。
[圖18]圖18係1L瓶中饋料批次培養中細胞內氨含量(濃度比)之圖。與母株非常不同，導入pHyg/TauT株出現顯著的氨抑制。
[圖19]圖19係依賴培養基中之牛磺酸濃度而顯示攝取入細胞內之量之圖。牛磺酸之攝取量於導入pHyg/TauT株與母株並無差異。
[圖20]圖20係顯示培養基中麩胺酸消耗之圖。導入pHyg/TauT株相對於母株，並不依賴培養基中之牛磺酸濃度每單位細胞麩胺酸之消耗量顯著地高。
[圖21]圖21係顯示導入pHyg/TauT株之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，並未依賴開始培養時培養基中之牛磺酸濃度，為相同程度。
[圖22]圖22係TauT/ALT共同表現株之TA41之震動饋料批次培養第14天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。藉由添加α-酮戊二酸可增加抗體產生量。

Claims (11)

  1. 一種多肽之製造方法，其係包含培養經導入編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA，且經導入編碼所期望多肽之DNA之中國倉鼠卵巢細胞，並使其產生所期望的多肽。
  2. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中經導入編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA之中國倉鼠卵巢細胞，進而可大量表現牛磺酸轉運蛋白。
  3. 如申請專利範圍第2項之製造方法，其中可大量表現牛磺酸轉運蛋白之中國倉鼠卵巢細胞，係經導入編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA之細胞。
  4. 如申請專利範圍第1~3項中任一項之製造方法，其中所期望之多肽係抗體。
  5. 如申請專利範圍第1~3項中任一項之製造方法，其中編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA係下述(a)~(e)之任何一種，(a)編碼具有序列編號2或4之胺基酸序列的多肽之DNA(b)編碼於序列編號2或4之胺基酸序列中具有1個以上、4個以下之胺基酸被取代、缺失、附加或/及插入之胺基酸序列，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA(c)編碼具有與序列編號2或4之胺基酸序列97%以上之相似性，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA (d)具有序列編號1或3之鹼基序列之DNA(e)與具有序列編號1或3之鹼基序列之DNA所互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA。
  6. 如申請專利範圍第4項之製造方法，其中編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA係下述(a)~(e)之任何一種，(a)編碼具有序列編號2或4之胺基酸序列的多肽之DNA(b)編碼於序列編號2或4之胺基酸序列中具有1個以上、4個以下之胺基酸被取代、缺失、附加或/及插入之胺基酸序列，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA(c)編碼具有與序列編號2或4之胺基酸序列97%以上之相似性，且具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA(d)具有序列編號1或3之鹼基序列之DNA(e)與具有序列編號1或3之鹼基序列之DNA所互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有丙胺酸轉胺酵素活性之多肽之DNA。
  7. 一種醫藥品之製造方法，該醫藥品係含有以如申請專利範圍第1~6項中任一項之方法所製造之多肽。
  8. 一種中國倉鼠卵巢細胞，其係導入有編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA與編碼所期望的多肽之DNA。
  9. 如申請專利範圍第8項之中國倉鼠卵巢細胞，其係進而導入有編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。
  10. 一種中國倉鼠卵巢細胞，其係導入有編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。
  11. 一種多肽之製造方法，其係包含將經導入編碼人類丙胺酸轉胺酵素之DNA，且經導入編碼所期望多肽之DNA之中國倉鼠卵巢細胞，以含α-酮戊二酸之培養基進行培養，並使其產生所期望的多肽。
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