JP7402604B2 - 組換えコラーゲンの水酸化を調節する酵母株及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年7月31日に出願された米国仮出願第62/539,213号の優先権を主張し、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用される。
本発明は、遺伝子組換え酵母株、及び組換えまたは人工コラーゲンを含有するバイオファブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラーゲンの製造方法に関する。酵母株を改変し、酵母株が、特定の組換えコラーゲン水酸化度を選択することによって組換えコラーゲンの構造的及び質感上の特性を調節できるようにする。これにより、例えば様々な異なる動物試験を行っていない及び環境保護的なバイオファブリケートレザー及び同様の素材に組み込むために、特定の最終用途に組換えコラーゲンの特性を適合させることが可能になる。
皮革は、家具の室内装飾品、衣類、靴、荷物、ハンドバッグ及びアクセサリー、ならびに自動車用途など、広範囲の用途に使用されている。皮革の世界貿易推定額は、年間およそ1000億ドルであり(Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade, United Nations Industrial Development Organization、ウィーン、2010)、皮革製品の需要は継続してますます高まっている。皮革を製造する経済的、環境的、社会的コストの観点から、この需要を満たす新規方法が必要とされている。皮革製品の生産者及びユーザーは、技術的及び審美的トレンドに追いつくために、優れた強度、均一性、加工性及び天然成分を組み込んだファッショナブルかつ魅力的な審美的特性を示す新規素材を探求している。
本発明の一態様は、コラーゲンを効率的に発現させ、発現するコラーゲン中のリジン残基及びプロリン残基の水酸化度を調節するように改変した組換え酵母株に関する。本発明のこの態様は、コラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基の数に基づいて、選択した水酸化度のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基を有する組換えコラーゲンを発現することができる組換え酵母を提供する。コラーゲンの水酸化度は、コラーゲン三重らせんまたはトロポコラーゲンの弛緩度または緊密度、ならびに組換えコラーゲンで作製したバイオファブリケートレザーなどの製品の機能的及び審美的特性と相関する。
本明細書に例示するように、Pichia pastorisを用いて、異なる水酸化度を有する組換えIII型ウシコラーゲンを発現させた。組換えコラーゲンの水酸化は、ウシプロリル-4-ヒドロキシラーゼの、それぞれα及びβサブユニットをコードするウシP4HA及びウシP4HBの同時発現によって達成される。しかしながら、本発明は、III型コラーゲンの産物及び発現に限定されず、他の種類のコラーゲンのサブユニットをコードするポリヌクレオチドならびにプロリン残基、リジン残基、またはプロリン残基とリジン残基の両方を水酸化する酵素で実施することができる。III型トロポコラーゲンはホモ三量体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、コラーゲンは、最初に2つのプロα1(I)鎖及び1つのプロα2(I)鎖から構成されるI型コラーゲンなどの異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ三量体を形成する。
本発明の非限定的な実施形態として、以下が挙げられるが、これらに限定されない:
ウシコラーゲン、例えばI型もしくはIII型コラーゲン、またはコラーゲン変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにコードされたコラーゲン中のプロリン、リジン、またはリジン及びプロリン残基を水酸化する少なくとも1つの酵素をコードするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、天然コラーゲンもしくはヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部について、ポリヌクレオチドをコドン改変するか、または酵母プロモーター配列などの発現調節エレメントを組み込んで宿主酵母細胞内でのコラーゲンまたはヒドロキシラーゼの発現を促進する。酵母内で発現する場合、改変したポリヌクレオチドは、同一の条件下で発現させた同じコラーゲン配列をコードする未改変ポリペプチドに比べて、コラーゲンの発現を10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100または>100重量%高め得る。
非水酸化コラーゲンを産生するための遺伝子改変酵母株であって、(i)酵母株;及び(ii)コラーゲンのDNA配列;コラーゲンプロモーターのDNA配列;コラーゲンターミネーターのDNA配列;選択マーカーのDNA配列、選択マーカー用のプロモーターのDNA配列;選択マーカー用のターミネーターのDNA配列;細菌用のもの、及び酵母用のものから選択される複製起点のDNA配列;及び酵母ゲノムに対して相同性を有するDNA配列を有するベクターを含み、ベクターは酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。本実施形態では、酵母株は、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよい。上記の実施形態では、ベクターは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのDNA配列を有し得る。本実施形態では、コラーゲンのDNA配列は、天然コラーゲンDNA、改変(engineered)コラーゲンDNA、及びコドン改変コラーゲンDNAから選択してもよい。
Pichia pastoris株BG10(野生型)はATUM(以前のDNA2.0)から入手した。コラーゲン配列を含むMMV63(配列番号11)(「配列番号9」)DNA配列及びベクターを野生型Pichia pastorisに挿入し、PP28株を生成した。MMV63をPmeIで消化し、PP1(野生型Pichia pastoris株)に形質転換してPP28を生成した。ベクターMMV63を図1に示す。
ペプシン処理の前に、Thermo Scientificのプロトコールに従って各試料の全タンパク質を得るためのBCAアッセイを実施した。すべての試料について、全タンパク質量を、0.5mg/mlまたはそれを上回る最低濃度に正規化した。
100uLの試料の溶解物をマイクロ遠心チューブに入れた。以下を含有するマスターミックスを作製した:37%HC1(100μL当たり0.6μLの酸)、及び
脱イオン水中の1mg/mLのペプシンストック。添加したペプシンの量は、ペプシン:全タンパク質の比で1:25(重量:重量)であった。
以下の変更を加えたうえで、実施例1を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:Pichiaにおける発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列(配列番号3)(「配列2」)を含むDNA MMV77(配列番号12)(「配列10」)配列を酵母に挿入した。pAOX1プロモーター(配列番号5)(「配列3」)を用いて、コラーゲン配列を発現させた。500ug/mlのゼオシンを含有するYPDプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株はPP8であった。ベクターMMV77を図2に示す。制限酵素消化は、PmeIを用いて行った。株をBMMY培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表1に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例1を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:Pichiaでの発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列を含むDNA MMV-129(配列番号13)(「配列11」)配列を、酵母に挿入した。pCATプロモーター(配列番号9)(「配列7」)を使用してコラーゲン配列を発現させた。500ug/mlのゼオシンを含有するYPDプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株はPP123であった。MMV129をSwaIで消化し、PP1に形質転換してPP123を生成した。ベクターMMV129を図3に示す。株をBMGY培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表1に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例1を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:
Pichiaでの発現を高めるように改変したウシCol3A1(III型)コラーゲン配列(配列番号3)(「配列2」)を含む、DNA MMV-130(配列番号14)(「配列12」)配列を酵母に挿入した。配列番号8(「配列6」)に示すpDFプロモーターを使用してコラーゲン配列を発現させた。PmeIによって切断されるAOX1ランディングパッド(配列番号10)(「配列8」)を使用してPichiaゲノムへのベクターの部位特異的組込みを促進した。500ug/mlのゼオシンを含有するYPDプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株をPP153と命名した。MMV130をPmeIで消化し、PP1に形質転換してPP153を生成した。改変ウシcol3A1配列は、配列番号3(「配列2」)によって与えられる。
以下の変更を加えたうえで、実施例2を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:最適化したウシP4HA(配列番号6)(「配列4」)及びウシP4HB(配列番号7)(「配列5」)配列を有する1つのDNAベクターMMV-78(配列番号15)(「配列13」)を酵母に挿入した。MMV78をPmeIで消化し、PP1に形質転換してPP8を生成した。P4HA及びP4HBはいずれも、その内在性シグナルペプチドを含み、Das1-Das2二方向性プロモーター(配列番号27)(「配列24」)によって駆動される。DNAをKpnIで消化し、PP8に形質転換してPP3を生成した。ベクターMMV78を図5に示す。株をBMMY培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表1に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例2を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:ウシP4HA配列及びウシP4HB配列の両方を有する1つのDNAベクター、MMV-78を酵母に挿入した。P4HA及びP4HBはいずれも、それらの内在性シグナルペプチドを含み、Das1-Das2二方向性プロモーターによって駆動した。DNAをKpnIで消化し、PP8に形質転換してPP3を生成した。
以下の変更を加えたうえで、実施例4を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:ウシP4HA及びウシP4HB配列の両方を含む1つのDNAベクター、MMV-156(配列番号17)(「配列15」)を酵母に挿入した。P4HAは、その内在性シグナルペプチドを含み、P4HBシグナル配列はαファクタープレ(配列番号23)(「配列21」)配列で置換した。両方の遺伝子をpHTX1二方向性プロモーター(配列番号26)(「配列25」)によって駆動した。MMV156をBamHIで消化し、PP153に形質転換してPP154を生成した。ベクターMMV156を図7に示す。株をBMGY培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表1に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例4を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:ウシP4HA配列及びウシP4HB配列の両方を有する1つのDNAベクターMMV-156を酵母に挿入した。P4HAはその内在性シグナルペプチドを含み、P4HBシグナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、pHTX1二方向プロモーターによって駆動した。DNAをSwaIで消化し、PP153に形質転換してPP154を生成した。
実施例1の方法及び手順を利用してオールインワンベクターを作製した。オールインワンベクターは、コラーゲンのDNAならびに付随するプロモーター及びターミネーター、コラーゲンを水酸化する酵素のDNAならびに付随するプロモーター及びターミネーター、マーカー発現用のDNAならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点(複数可)のDNA、及び組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有するDNA(複数可)を含む。オールインワンベクターは、5’、3’、または上記の構成要素内に戦略的に配置された固有の制限酵素部位を有する。コラーゲン発現または他のベクター構成要素の改変を所望する場合、選択した構成要素のDNAを、制限酵素で容易に切除し、ユーザーが選択するクローニング方法を用いて置換することができる。オールインワンベクターの最も単純なバージョン、MMV208(配列番号19)(「配列17」)は、ヒドロキシラーゼ酵素のプロモーター(複数可)を除いて、上記のすべての構成要素を含む。ベクターMMV208は、以下の構成要素を用いて作製する:MMV84(配列番号20)(「配列18」)由来のAOX相同性、MMV150(配列番号21)(「配列19」)由来のリボソーム相同性、MMV140(配列番号22)(「配列20」)由来の細菌及び酵母起源の複製起点、MMV140由来のゼオシンマーカー、ならびにMMV129由来のCol3A1。Genscriptにより、以下の各制限酵素部位を除去したP4HA及びBならびに関連するターミネーターの改変バージョンを合成した:AvrII、NotI、PvuI、PmeI、BamHI、SacII、SwaI、XbaI、SpeI。ベクターをPP1株に形質転換した。
表1
実施例1の方法及び手順を利用して、キメラCol3A1ベクターを作製した。ベクターMMV132を、キメラコラーゲンのDNAならびに付随するプロモーターPDF及びターミネーターAOX1TT、マーカー発現用のDNAならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点(複数可)のDNA、ならびに組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有するDNA(複数可)を含むように改変した。ベクターMMV63は、未改変Col3A1ドメインの供給源のDNAであった。ベクターMMV128(図21)は、改変Col3A1ドメインの供給源のDNAであった。Col3A1ポリペプチドの全長は1465アミノ酸(aa)である。プラスミドは、天然ウシDNA配列(未修飾)及びPichia Pastorisコドン改変DNA配列を組み込むように設計した。Col3A1の改変配列と未改変配列との間の移行がaa 710、1,200、及び1,331位になるようにプラスミドを設計した。これらの方法を使用して、プラスミドMMV193、MMV194、MMV195、MMV197、MMV198、及びMMV199を作製した。得られたプラスミドベクターを、比較のために完全に最適化したプラスミドMMV130及び完全に最適化していないプラスミドMMV200(図20)を用いて以下の表2に示す。
表2
以下の変更を加えたうえで、実施例2を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:PP1及びPP97が得られた。PP97は、2つのプロテアーゼ遺伝子(PEP4及びPRB1)を宿主株からノックアウトした株であった。Pichia発現用の改変及び未改変ウシコラーゲン配列DNAの異なる組合せを含むDNA MMV194、MMV195、MMV130及びMMV200配列を酵母に挿入した。pDFプロモーターを用いてコラーゲン配列を発現させた。500ug/mlのゼオシンを含有するYPDプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。ベクターに対し、SwaIを用いて制限酵素消化を行い、組み込むためにDNAを直鎖状化し、Pme1で消化して200ngのDNAを形質転換したMMV130を除いて、3~5ugの切断DNAを形質転換した。得られた株を以下の表3に示す。
表3
以下の変更を加えたうえで、実施例7を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:ウシP4HA配列及びウシP4HB配列の両方を有する1つのDNAベクター、MMV-156を酵母に挿入した。P4HAはその内在性シグナルペプチドを含み、P4HBシグナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、pHTX1二方向性プロモーターによって駆動した。DNAをBamH1で消化し、形質転換した。株及び形質転換の情報については、表4を参照されたい。
表4
以下の変更を加えたうえで、実施例8を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:溶解緩衝液を、50mM Na2PO4、1mM EDTA、5%グリセロールで作製し、pHを酢酸で7.4に調整した。P4HA及びP4HBの両方を含む別のベクター、MMV-191もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのP4HAは、その内在性シグナルペプチドを含み、余剰コピーのP4HBのシグナル配列は、αファクタープレプロ配列で置換した。余剰コピーのP4HA及びP4HBを、pGCW14-GAP1二方向性プロモーターによって駆動した。DNAをBamHIで消化し、形質転換した。形質転換及び新規株の情報については、表5を参照されたい。株をBMGY培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。
表5
以下の変更を加えたうえで、実施例2を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した:ウシP4HA配列及びウシP4HB配列の両方を有する1つのDNAベクター、MMV-78を酵母に挿入した。P4HA及びP4HBを、Das1-Das2二方向性プロモーターによって駆動する。DNAをKpnIで消化し、PP8に形質転換して、配列番号3(「配列2」)のコラーゲン配列を保有するPP3を生成した。pAOX1プロモーターにより駆動されるP4HBを有する別のベクター、MMV-94(配列番号16)(「配列14」)を使用し、同様に酵母に挿入した。P4HBの内在性シグナルペプチドを、PHO1シグナルペプチドで置換した。得られた株はPP38であった。
本明細書中で言及するように、すべての組成割合は、特に明記しない限り、全組成物に対する重量百分率である。本明細書中で使用する場合、用語「含む(include)」及びその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、リスト内の項目の列挙は、本技術の素材、組成物、装置、及び方法においても有用であり得る他の同様の項目を除外するものではない。同様に、用語「できる(can)」及び「してもよい(may)」ならびにその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、一実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるか、またはそれらを含んでもよいことについての列挙は、それらの要素または特徴を含まない本発明の他の実施形態を除外するものではない。
以下の態様が包含され得る。
[1] 非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって:
(i)酵母株;ならびに
(ii)コラーゲンのDNA配列;コラーゲンプロモーターのDNA配列;コラーゲンターミネーターのDNA配列;選択マーカーのDNA配列、前記選択マーカー用のプロモーターのDNA配列;前記選択マーカー用のターミネーターのDNA配列;細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のDNA配列;及び前記酵母のゲノムと相同性を有するDNA配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
[2] 前記酵母株が、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[1]に記載の酵母株。
[3] 前記コラーゲンのDNA配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[1]に記載の酵母株。
[4] 前記コラーゲンのDNA配列が、天然コラーゲンDNA、改変(engineered)コラーゲンDNA及びコドン改変コラーゲンDNAから選択される、上記[3]に記載の酵母株。
[5] 前記プロモーターのDNA配列が、AOX1メタノール誘導性プロモーターのDNA、pDF抑制解除プロモーターのDNA、pCAT抑制解除プロモーターのDNA、Das1-Das2メタノール誘導性二方向性プロモーターのDNA、pHTX1構成的二方向性プロモーターのDNA、pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNA及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[1]に記載の酵母株。
[6] 前記選択マーカーのDNA配列が、抗生物質耐性のDNA及び栄養要求性マーカーのDNAからなる群から選択される、上記[1]に記載の酵母株。
[7] 前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[6]に記載の酵母株。
[8] 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記[1]に記載の酵母株。
[9] 非水酸化コラーゲンの製造方法であって:
(i)上記[1]の酵母株を提供し;及び
(ii)コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
[10] 前記酵母株が、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[11] 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地(BMGY)、緩衝メタノール複合培地(BMMY)、及び酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)からなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[12] 前記期間が、24時間~72時間である、上記[9]に記載の方法。
[13] 前記酵母が、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[14] 前記コラーゲンのDNA配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[15] 前記プロモーターのDNA配列が、前記pHTX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[16] 前記選択マーカーのDNA配列が、前記抗生物質耐性DNAのDNA及び前記栄養要求性マーカーのDNAからなる群から選択される、上記[9]に記載の方法。
[17] 水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって:
(i)酵母株;
(ii)コラーゲンのDNA配列;コラーゲンプロモーターのDNA配列;ターミネーターのDNA配列;選択マーカーのDNA配列;前記選択マーカー用のプロモーターのDNA配列;前記選択マーカー用のターミネーターのDNA配列;細菌及び/または酵母の複製起点のDNA配列;前記酵母のゲノムと相同性を有するDNA配列を含むベクターであって;前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター;ならびに
(iii)P4HA1のDNA配列;P4HBのDNA配列;及びプロモーター用の少なくとも1つのDNA配列を含む第二のベクターであって;前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
[18] 前記酵母株が、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[19] 前記コラーゲンのDNA配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[20] 前記コラーゲンのDNA配列が、天然コラーゲンDNA、改変(engineered)コラーゲンDNA及び改変(modified)コラーゲンDNAから選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[21] 前記プロモーターのDNA配列が、前記AOX1メタノール誘導性プロモーターのDNA、前記pDF抑制解除プロモーターのDNA、前記pCAT抑制解除プロモーターのDNA、前記Das1-Das2メタノール誘導性二方向性プロモーターのDNA、前記pHTX1構成的二方向性プロモーターのDNA、前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNA、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[22] 前記プロモーターのDNA配列が、前記pHTX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[23] 前記選択マーカーの前記DNA配列が、前記抗生物質耐性DNAのDNA及び前記栄養要求性マーカーのDNAからなる群から選択される、上記[17]に記載の酵母株。
[24] 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、上記[23]に記載の酵母株。
[25] 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記[17]に記載の酵母株。
[26] 水酸化コラーゲンの製造方法であって:
(i)上記[17]の酵母株を提供し;及び
(ii)コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
[27] 前記酵母株が、Candida、Komatagaella、Pichia、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[28] 前記培地が、BMGY、BMMY、及びYPDからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[29] 前記期間が、24時間~72時間である、上記[26]に記載の方法。
[30] 前記酵母が、Candida、Komatagaella、Pichia、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[31] 前記コラーゲンのDNAが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[32] 前記プロモーターのDNAが、前記pTHX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[33] 前記選択マーカーのDNAが、前記抗生物質耐性DNAのDNA及び前記栄養要求性マーカーのDNAからなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[34] (i)プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なDNA;
(ii)プロモーター及びターミネーターを含む、P4HA1及びP4HBからなる群から選択される水酸化酵素のDNA;
(iii)プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのDNA;
(iv)酵母及び細菌の複製起点のDNA;
(v)ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するDNA;ならびに
(vi)モジュラー式クローニングを可能にする、上記のDNA内の5’、3’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
[35] コラーゲン産生に必要な前記DNA配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記[34]に記載のオールインワンベクター。
[36] 前記プロモーターのDNA配列が、前記pTHX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択される、上記[34]に記載のオールインワンベクター。
[37] 前記選択マーカーのDNA配列が、前記抗生物質耐性のDNA及び前記栄養要求性マーカーのDNAである、上記[34]に記載のオールインワンベクター。
[38] 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、上記[37]に記載のオールインワンベクター。
[39] 最適化したDNAを、キメラコラーゲンDNAの全長に基づいて10~40%または60~90%含む、キメラコラーゲンDNA配列。
[40] 前記最適化したDNAが、C末端から始まる、上記[39]に記載のキメラコラーゲンDNA配列。
[41] 前記最適化したDNAが、N末端から始まる、上記[39]に記載のキメラコラーゲンDNA配列。
[42] 上記[39]に記載のキメラコラーゲンのDNA配列;
コラーゲンプロモーターのDNA配列;
ターミネーターのDNA配列;選択マーカーのDNA配列;
前記選択マーカー用のプロモーターのDNA配列;
前記選択マーカー用のターミネーターのDNA配列;
細菌及び/または酵母の複製起点のDNA配列;及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するDNA配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
[43] 前記プロモーターのDNAが、前記pTHX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択される、上記[42]に記載の酵母株。
[44] 前記選択マーカーのDNAが、前記少なくとも1つの抗生物質耐性をコードするDNA及び少なくとも1つの栄養要求性マーカーをコードするDNAからなる群から選択される、上記[42]に記載の酵母株。
[45] 水酸化コラーゲンの製造方法であって:
(i)上記[42]のコラーゲン産生酵母株を提供し;及び
(ii)コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
[46] 前記酵母株が、Candida、Komatagaella、Hansenula、Saccharomyces、Cryptococcus属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記[45]に記載の方法。
[47] 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、上記[45]に記載の方法。
[48] 前記期間が、24時間~72時間の範囲である、上記[45]に記載の方法。
[49] 前記酵母株が、前記pTHX1構成的二方向性プロモーターのDNA及び前記pGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターのDNAからなる群から選択されるプロモーターを含む、上記[45]に記載の方法。
[50] 前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするDNA及び栄養要求性マーカーをコードするDNAからなる群から選択される少なくとも1つの選択マーカーを含む、上記[45]に記載の方法。
Claims (12)
- 配列番号30又は配列番号31に記載の配列を有する、キメラコラーゲンDNA。
- 配列番号30および配列番号31が、それぞれ、Pichia pastorisでの発現のために最適化されている配列番号1の少なくとも1つのセクションと、最適化されていない配列番号1の少なくとも1つのセクションとを含む、請求項1に記載のキメラコラーゲンDNA。
- 前記Pichia pastorisでの発現のために最適化されている配列番号1のセクションが、コラーゲン分子のN末端のアミノ酸セグメントをコードする、請求項2に記載のキメラコラーゲンDNA。
- 請求項1に記載のキメラコラーゲンのDNAを含むベクターを含む、コラーゲン産生酵母株。
- 水酸化コラーゲンの製造方法であって:
請求項4のコラーゲン産生酵母株を、コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含み、
キメラコラーゲンのDNA配列が、P4HA1およびP4HBをコードするポリヌクレオチド配列に連結している、前記製造方法。 - 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記期間が、24時間~72時間の範囲である、請求項5に記載の方法。
- 前記ベクターが、pTHX1構成的二方向性プロモーター又はpGCW14-pGAP1構成的二方向性プロモーターをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ベクターが、抗生物質耐性をコードするDNA及び栄養要求性マーカーをコードするDNAからなる群から選択される少なくとも1つの選択マーカーをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記キメラコラーゲンDNA配列がIII型コラーゲンをコードする、請求項1に記載のキメラコラーゲンDNA。
- 前記キメラコラーゲンDNA配列がP4HA1およびP4HBをコードするポリヌクレオチド配列に連結している、請求項1に記載のキメラコラーゲンDNA。
- P4HA1およびP4HBをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項4に記載の酵母株。
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