KR20190013627A - 재조합 콜라겐의 수산화를 제어하기 위한 효모 균주 및 방법 - Google Patents

재조합 콜라겐의 수산화를 제어하기 위한 효모 균주 및 방법 Download PDF

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Abstract

비-히드록실화된 콜라겐 또는 히드록실화된 콜라겐의 증가된 양을 생산하기 위한 유전적으로 조작된 효모 균주가 기술된다. 키메라 콜라겐 DN의 총 길이에 기반하여 10 내지 40 퍼센트 또는 60 내지 90 퍼센트의 최적화된 DNA를 포함하는, 키메라 콜라겐 DNA 서열. 콜라겐, 프로모터, 및 히드록실화 효소를 생산하는데 필수적인 DNA를 포함하는 올인원(all-in-one) 벡터가 또한 기술된다. 비-히드록실화 또는 히드록실화된 콜라겐을 생산하기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

재조합 콜라겐의 히드록실화를 제어하기 위한 효모 균주 및 방법{Yeast Strains and Methods for controlling hydroxylation of recombinant collagen}
관련 분야에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 31일자에 출원된 미국 가출원 제62/539,213호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
본 출원은 발명의 명칭이 "Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils"인 미국 특허 출원 제15/433,566호 및 발명의 명칭이 "Method for Making a Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils"인 제15/433,650호(참고로 포함됨)에 관한 것이다.
기술분야
본 발명은 재조합 또는 조작된 콜라겐을 함유하는 생체조직제조된 가죽(biofabricated leather) 또는 가죽 유사 특성을 갖는 재료를 제조하기 위해 사용되는 재조합 콜라겐을 제조하기 위한 유전자 조작된 효모 균주 및 방법에 관한 것이다. 효모 균주는 재조합 콜라겐의 수산화의 특정한 정도를 선택함으로써 재조합 콜라겐의 구조적 및 조직적 특성을 제어하게 하도록 조작된다. 이것은 예를 들어 다양한 상이한 동물 실험이 없고(cruelty-free), 그린(green)인 생체조직제조된 가죽 및 유사한 재료로 도입하기 위해 특정한 최종 사용에 재조합 콜라겐의 특성을 맞추도록 허용한다.
가죽은 가구 덮개, 의류, 신발, 수화물, 핸드백 및 액세서리, 및 자동차 분야를 포함하는 매우 다양한 분야에서 사용된다. 가죽에서의 예상된 세계적인 무역 가치는 매년 대략 US 1000억 달러이고(Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade, United Nations Industrial Development Organization, Vienna, 2010), 가죽 제품의 계속적이고 증가하는 수요가 존재한다. 이러한 요구를 만족시키는 새로운 방식은 가죽을 제조하는 것의 경제적인, 환경적인 및 사회적 비용의 관점에서 필요하다. 기술적 및 심미적 경향에 발맞추기 위해, 가죽 제품의 생산자 및 사용자는 천연 성분을 혼입한 더 탁월한 강도, 균일성, 가공성 및 패셔너블하고 어필하는 심미적 특성을 나타내는 새로운 재료를 추구한다.
인구 성장 및 세계적인 환경을 고려하여, 가죽 유사 심미성 및 개선된 기능성을 갖는 대안적인 재료의 수요가 존재할 것이다. 가죽은 동물 생가죽이고, 거의 전부 콜라겐으로 이루어진다. 생체조직제조된 가죽 재료로 혼입될 수 있는 콜라겐의 새로운 공급원의 수요가 존재한다.
재조합으로 발현된 콜라겐을 사용한 생체조직제조된 가죽의 제조는 다양한 상업적 분야에 필요한 형태 및 분량으로 콜라겐을 효율적으로 제조하기 위한 방법의 수요를 포함하는 다수의 도전과제에 직면한다. 몇몇 분야에 대해, 더 연질이고 더 투과성인 콜라겐 성분이 원해지고, 다른 분야에 대해, 더 경질이고 더 저항성이고 내구성인 콜라겐 성분이 필요하다.
몇몇 콜라겐 및 콜라겐 유사 단백질의 재조합 발현은 공지되어 있고; 문헌[Bell, EP 1232182B1, Bovine collagen and method for producing recombinant gelatin; Olsen 등의 미국 특허 제6,428,978호, Methods for the production of gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells; VanHeerde 등의 미국 특허 제8,188,230호, Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagen-like polypeptides](이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 이러한 재조합 콜라겐은 가죽 또는 생체조직제조된 가죽 제품을 제조하기 위해 사용되지 않는다.
효모에서 단백질을 발현하기에 유용한 벡터는 공지되어 있고; 문헌[Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Chapter 13 Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. (1987), Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y. 153:516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter (1987), Heterologous Gene Expression in Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152:673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982)](이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 효모 발현 벡터는 예를 들어 ThermoFisher Scientific (www._thermofisher.com); ATUM (https://www._atum.bio/products/expression-vectors/yeast); 또는 IBA(https://www._iba-lifesciences.com/cloning-yeast-vectors.html)(2018년 7월 16일에 마지막 접속, 참고로 포함됨)에서의 카탈로그에 기재된 바대로 상업적으로 구입 가능하다.
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 바이오의약품 단백질, 예컨대 인간 인터페론 감마를 재조합으로 발현하기 위해 사용된 효모 종이고, 문헌[Razaghi, et al., Biologicals 45: 52-60 (2017)]을 참조한다. 이것은 III형 콜라겐 및 프롤릴-4-수산화효소를 발현하기 위해 사용되고, 문헌[Vuorela, et al., EMBO J. 16:6702-6712 (1997)]을 참조한다. 콜라겐 및 프롤릴-4-수산화효소는 콜라겐성 재료를 제조하기 위해 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 또한 발현되고, 문헌[Pinkas, et al., ACS Chem. Biol. 6(4):320-324 (2011)]을 참조한다.
수산화의 선택 정도에 의해 트로포콜라겐을 제공하고 이로써 생물조작된 가죽의 제조에서 사용하기 위한 상이한 콜라겐 재료의 범위를 제공하고자 하는 코돈 변형의 이용은 이전에 조사되지 않았다.
본 발명자들은 수산화의 선택적인 정도를 특징으로 하는 상이한 형태로 콜라겐을 풍부하게 발현할 수 있는 재조합 효모를 조작함으로써 이 도전과제를 해소하고자 추구하였다.
본 발명의 일 양태는 콜라겐을 효율적으로 발현하고 발현된 콜라겐에서 라이신 및 프롤린 잔기의 수산화의 정도를 제어하도록 조작된 재조합 효모 균주에 관한 것이다. 본 발명의 이 양태는, 콜라겐에서의 라이신, 프롤린, 또는 라이신 및 프롤린 잔기의 수에 기초하여, 라이신, 프롤린, 또는 라이신 및 프롤린 잔기에 대한 수산화의 선택 정도를 갖는 재조합 콜라겐을 발현할 수 있는 재조합 효모를 제공한다. 콜라겐의 수산화의 정도는 콜라겐 삼중 나선 또는 트로포콜라겐의 헐거움 또는 단단함 및 재조합 콜라겐에 의해 제조된 제품, 예컨대 생체조직제조된 가죽의 기능적 및 심미적 특성과 상관된다.
본 발명의 다른 실시형태는 콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 코돈 변형된 핵산 서열, 콜라겐 및 수산화효소(들)를 코딩하는 벡터, 예컨대 "올-인-온 벡터" 및 재조합 콜라겐을 제조하고 사용하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 수산화 콜라겐 및 비수산화 콜라겐을 생성하기에 유용한 효모 숙주에서의 키메라 DNA 서열을 제공한다.
도 1은 비수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-63의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 2는 비수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-77의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 3은 비수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-129의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 4는 비수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-130의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 5는 수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-78의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 6은 수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-94의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 7은 수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-156의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 8은 수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 MMV-191의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 9는 비수산화 콜라겐 또는 수산화 콜라겐을 제조하도록 설계된 올-인-원 벡터 MMV-208을 보여준다.
도 10은 MMV-84의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 11은 MMV-150의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 12는 MMV-140의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 13은 MMV-132의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 14는 MMV-193의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 15는 MMV-194의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 16은 MMV-195의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 17은 MMV-197의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 18은 MMV-198의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 19는 MMV-199의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 20은 MMV-200의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 21은 MMV-128의 벡터 다이어그램을 보여준다.
도 22는 Col3A1 키메라 분자를 기재한다.
본 명세서에 예시된 바대로, 피치아 파스토리스는 수산화의 상이한 정도를 갖는 재조합 III형 소 콜라겐을 발현하도록 사용된다. 재조합 콜라겐의 수산화는 알파 및 베타 하위단위 소 프롤릴-4-수산화효소를 각각 코딩하는 소 P4HA 및 소 P4HB의 동시발현에 의해 달성된다. 그러나, 본 발명은 III형 콜라겐의 산물 및 발현으로 제한되지 않고, 콜라겐의 다른 종류의 하위단위, 및 프롤린 잔기, 라이신 잔기, 또는 프롤린 및 라이신 잔기 둘 다를 수산화시키는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 실행될 수 있다. III형 트로포콜라겐은 동종삼합체이다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 콜라겐은 상이한 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이종삼합체, 예컨대 처음에 2개의 프로-α1(I) 사슬 및 1개의 프로-α2(I) 사슬로 이루어진 I형 콜라겐을 형성할 것이다.
콜라겐. 콜라겐은 가죽의 주성분이다. 껍질 또는 동물 생가죽은 섬유성 단백질인 콜라겐의 상당한 양을 함유한다. 콜라겐은 적어도 28개의 구별되는 콜라겐 유형의 패밀리에 대한 포괄적인 용어이고, 동물 껍질은 통상적으로 I형 콜라겐이지만, 콜라겐의 다른 유형은 III형 콜라겐을 포함하는 가죽을 형성하는 데 사용될 수 있다. 용어 "콜라겐"은 비가공처리된 콜라겐(예를 들어, 프로콜라겐), 및 삼중 나선 구조를 갖는 번역 후 변형되고 단백질분해된 콜라겐을 포함한다.
콜라겐은 -(Gly-X-Y)n-인 아미노산의 반복 트리플렛을 특징으로 하고, 콜라겐에서의 아미노산 잔기의 대략 ⅓은 글라이신이다. X는 대개 프롤린이고, Y는 대개 하이드록시프롤린이지만, 가능한 Gly-X-Y 트리플렛이 400개 이하일 수 있다. 상이한 동물은 상이한 아미노산 조성을 갖는 콜라겐을 생성할 수 있고, 이것은 콜라겐에 상이한 특성을 부여하고 상이한 특성 또는 외관을 갖는 가죽을 생성할 수 있다.
콜라겐의 구조는 다른 길이의 3개의 뒤얽힌 펩타이드 사슬로 이루어질 수 있다. 콜라겐 삼중 나선(또는 단량체)은 약 1,050개의 아미노산 길이의 알파 사슬로부터 생성될 수 있어서, 삼중 나선은, 대략 1.5㎚의 직경으로, 대략 300㎚ 길이의 봉의 형태를 취할 수 있다.
콜라겐 섬유는 동물 생가죽의 유형에 따라 직경의 범위를 가질 수 있다. I형 콜라겐 이외에, 껍질(생가죽)은 III형 콜라겐(레티큘린), IV형 콜라겐 및 VII형 콜라겐을 포함하는 콜라겐의 다른 유형을 또한 포함할 수 있다.
포유류 신체에 걸쳐 다양한 유형의 콜라겐이 존재한다. 예를 들어, 껍질 및 동물 생가죽의 주성분 이외에, I형 콜라겐은 또한 연골, 힘줄, 혈관 결찰, 장기, 근육 및 골의 유기 부분에 존재한다. 동물 껍질 또는 생가죽 이외에 포유류 신체의 다양한 영역으로부터 콜라겐을 분리하기 위한 성공적인 노력이 이루어졌다. 10년 전에, 조사자들은 중성 pH에서 산 가용화된 콜라겐이 네이티브 조직에서 관찰된 동일한 횡문근 패턴으로 이루어진 피브릴로 자가조립된다는 것을 발견하였다; Schmitt F.O.　J. Cell. Comp Physiol.　1942;20:11. 이것은 조직 엔지니어링 및 다양한 생물의학 분야에서의 콜라겐의 사용을 발생시킨다. 더 최근의 년에, 콜라겐은 재조합 기법을 이용하여 박테리아 및 효모로부터 수확되었다.
콜라겐은, 정전기 상호작용, 예컨대 염 브릿징, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 힘, 분극력, 소수성 상호작용 및 효소 반응에 의해 대개 촉매화되는 공유 결합을 포함하는, 물리적 및 화학적 상호작용의 조합을 통해 형성되고 안정화된다. 다양한 구별되는 콜라겐 유형은 소, 양, 돼지, 닭 및 인간 콜라겐을 포함하는 척추동물에서 확인되었다.
본 발명은 콜라겐의 하나 이상의 유형을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 실행될 수 있다. 일반적으로, 콜라겐 유형은 로마 숫자로 넘버링되고, 각각의 콜라겐 유형에서 발견되는 사슬은 아라비아 숫자로 식별된다. 천연 발생 콜라겐의 다양한 상이한 유형의 구조 및 생물학적 기능의 상세한 설명은 당해 분야에서 이용 가능하고, 예를 들어 문헌[Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E., and Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution" in Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, C. M. et al. (1993) "The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix," Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. and B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; 및 Prockop, D.J- and K.I. Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy," Annu. Rev. Biochem., 64:403-434]을 참조한다.
I형 콜라겐은 유기체의 전체 콜라겐의 대략 80% 내지 90%를 포함하는 골 및 껍질의 주요 원섬유 콜라겐이다. I형 콜라겐은 다세포 유기체의 세포외 기질에 존재하는 주요한 구조적 거대분자이고, 전체 단백질 질량의 대략 20%를 포함한다. I형 콜라겐은, 각각 COL1A1 및 COL1A2 유전자에 의해 코딩되는, 2개의 α1(I) 사슬 및 1개의 α2(I) 사슬을 포함하는 이종삼합체 분자이다. 생체내, I형 콜라겐 피브릴, 섬유 및 섬유 다발의 어셈블리는 발생 동안 생기고, 세포 이동성 및 영양소 운반을 허용하면서 조직에 대한 기계적 지원을 제공한다. 다른 콜라겐 유형은 I형 콜라겐보다 덜 풍부하고, 상이한 분포 패턴을 나타낸다. 예를 들어, II형 콜라겐은 연골 및 유리체액에서 주요 콜라겐인 한편, III형 콜라겐은 혈관에서 높은 수준으로 발견되고 껍질에서 더 적은 정도로 발견된다.
II형 콜라겐은 COL2A1 유전자에 의해 코딩된 3개의 동일한 al(II) 사슬을 포함하는 동종삼합체 콜라겐이다. 정제된 II형 콜라겐은 예를 들어 문헌[Miller and Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64]에 기재된 절차에 의해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 조직으로부터 제조될 수 있다.
III형 콜라겐은 껍질 및 혈관 조직에서 발견되는 주요 원섬유 콜라겐이다. III형 콜라겐은 COL3A1 유전자에 의해 코딩되는 3개의 동일한 α1(III) 사슬을 포함하는 동종삼합체 콜라겐이다. 조직으로부터 III형 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어 문헌[Byers et al. (1974) Biochemistry 13:5243-5248]; 및 상기 Miller 및 Rhodes의 문헌에서 발견될 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 발현된 콜라겐과 조합되어 사용될 수 있다.
IV형 콜라겐은 피브릴보다는 시트의 형태로 기저막에서 발견된다. 가장 흔히, IV형 콜라겐은 2개의 α1(IV) 사슬 및 1개의 α2(IV) 사슬을 함유한다. IV형 콜라겐을 포함하는 특정한 사슬은 조직 특이적이다. IV형 콜라겐은 예를 들어 문헌[Furuto and Miller (1987) Methods in Enzymology, 144:41-61, Academic Press]에 기재된 절차를 이용하여 정제될 수 있다.
V형 콜라겐은 주로 골, 힘줄, 각막, 피부 및 혈관에서 발견되는 원섬유 콜라겐이다. V형 콜라겐은 동종삼합체 및 이종삼합체 형태 둘 다로 존재한다. V형 콜라겐의 하나의 형태는 2개의 α1(V) 사슬 및 1개의 α2(V) 사슬의 이종삼합체이다. V형 콜라겐의 또 다른 형태는 α1(V), α2(V) 및 α3(V) 사슬의 이종삼합체이다. V형 콜라겐의 추가의 형태는 α1(V)의 동종삼합체이다. 천연 공급원으로부터 V형 콜라겐을 단리하는 방법은 예를 들어 문헌[Elstow and Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, and Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2:493-502]에서 발견될 수 있다.
VI형 콜라겐은 작은 삼중 나선 영역 및 2개의 큰 비콜라겐성 잔여 부분을 갖는다. VI형 콜라겐은 α1(VI), α2(VI) 및 α3(VI) 사슬을 포함하는 이종삼합체이다. VI형 콜라겐은 많은 연결 조직에서 발견된다. 천연 공급원으로부터 VI형 콜라겐을 어떻게 정제하는지의 설명은 예를 들어 문헌[Wu et al. (1987) Biochem. J. 248:373-381, and Kielty et al. (1991) J. Cell Sci. 99:797-807]에서 발견될 수 있다.
VII형 콜라겐은 특정한 상피 조직에서 발견되는 원섬유 콜라겐이다. VII형 콜라겐은 3개의 α1(VII) 사슬의 동종삼합체 분자이다. 조직으로부터 VII형 콜라겐을 어떻게 정제하는지의 설명은 예를 들어 문헌[Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048, 및 Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3168-3172]에서 발견될 수 있다. VIII형 콜라겐은 각막에서의 데스메막(Descemet's membrane)에서 발견될 수 있다. VIII형 콜라겐은 2개의 α1(VIII) 사슬 및 1개의 α2(VIII) 사슬을 포함하는 이종삼합체이지만, 다른 사슬 조성물이 보고되어 있다. 자연으로부터 VIII형 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어 문헌[Benya and Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261:4160-4169, 및 Kapoor et al. (1986) Biochemistry 25:3930-3937]에서 발견될 수 있다.
IX형 콜라겐은 연골 및 유리체액에서 발견되는 피브릴 연관된 콜라겐이다. IX형 콜라겐은 α1(IX), α2(IX) 및 α3(IX) 사슬을 포함하는 이종삼합체 분자이다. IX형 콜라겐은 비삼중 나선 도메인에 의해 분리된 몇몇 삼중 나선 도메인을 보유하는 FACIT(Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices: 중단된 삼중 나선을 갖는 피브릴 연관된 콜라겐) 콜라겐으로 분류된다. IX형 콜라겐을 정제하기 위한 절차는 예를 들어 문헌[Duance, et al. (1984) Biochem. J. 221:885-889; Ayad et al. (1989) Biochem. J. 262:753-761; 및 Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A. M., ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 3-28]에서 발견될 수 있다.
X형 콜라겐은 α1(X) 사슬의 동종삼합체 화합물이다. X형 콜라겐은 예를 들어 성장판에서 발견되는 비대성 연골로부터 단리되고, 예를 들어, 문헌[Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1):217-24]을 참조한다.
XI형 콜라겐은 II형 및 IX형 콜라겐과 연관된 연골질 조직 및 신체에서의 다른 위치에서 발견될 수 있다. XI형 콜라겐은 α1(XI), α2(XI) 및 α3(XI) 사슬을 포함하는 이종삼합체 분자이다. XI형 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어 상기 Grant 등의 문헌에서 발견될 수 있다.
XII형 콜라겐은 I형 콜라겐과 연관되어 주로 발견되는 FACIT 콜라겐이다. XII형 콜라겐은 3개의 α1(XII) 사슬을 포함하는 동종삼합체 분자이다. XII형 콜라겐 및 이의 변이체를 정제하는 방법은 예를 들어 문헌[Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; 및 Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20093-20099]에서 발견될 수 있다.
XIII형은 예를 들어 껍질, 장, 골, 연골 및 횡문근에서 발견되는 비원섬유 콜라겐이다. XIII형 콜라겐의 상세한 설명은 예를 들어 문헌[Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700-24707]에서 발견될 수 있다.
XIV형은 α1(XIV) 사슬을 포함하는 동종삼합체 분자로서 규명되는 FACIT 콜라겐이다. XIV형 콜라겐을 단리하는 방법은 예를 들어 문헌[Aubert-Foucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764] 및 상기 Watt 등의 문헌에서 발견될 수 있다.
XV형 콜라겐은 XVIII형 콜라겐에 대한 구조에서 상동성이다. 천연 XV형 콜라겐의 구조 및 단리에 관한 정보는 예를 들어 문헌[Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14:220-224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:4773-4779; 및 Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264:4042-4046]에서 발견될 수 있다.
XVI형 콜라겐은 예를 들어 껍질, 폐 섬유아세포 및 각질세포에서 발견되는 피브릴 연관된 콜라겐이다. XVI형 콜라겐 및 XVI형 콜라겐을 코딩하는 유전자의 구조에 관한 정보는 예를 들어 문헌[Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; 및 Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112:856-863]에서 발견될 수 있다.
XVII형 콜라겐은 수포성 유천포창 항원으로도 공지된 반데스모솜 막관통 콜라겐이다. XVII형 콜라겐 및 XVII형 콜라겐을 코딩하는 유전자의 구조에 관한 정보는 예를 들어 문헌[Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; 및 McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1):83-86]에서 발견될 수 있다.
XVIII형 콜라겐은 XV형 콜라겐과 구조에서 유사하고, 간으로부터 단리될 수 있다. XVIII형 콜라겐의 구조 및 천연 공급원으로부터의 단리의 설명은 예를 들어 문헌[Rehn and Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4234-4238; Oh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; 및 Oh et al. (1994) Genomics 19:494-499]에서 발견될 수 있다.
XIX형 콜라겐은 FACIT 콜라겐 패밀리의 또 다른 구성원인 것으로 생각되고, 횡문근육종 세포로부터 단리된 mRNA에서 발견된다. XIX형 콜라겐의 구조 및 단리의 설명은 예를 들어 문헌[Inoguchi et al. (1995) J. Biochem. 117:137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13:884-886; 및 Myers et al., J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994)]에서 발견될 수 있다.
XX형 콜라겐은 FACIT 콜라겐성 패밀리의 새로 발견된 구성원이고, 병아리 각막에서 확인되었고, 예를 들어 문헌[Gordon et al. (1999) FASEB Journal 13:A1119; and Gordon et al. (1998), IOVS 39:S1128]을 참조한다.
콜라겐의 하나 이상의 종류는 본 발명의 방법 및 상기 인용된 참고(모든 목적을 위해 참고로 포함됨)로 기재된 바와 같이 추가로 가공처리되거나 정제된 발현된 콜라겐을 이용하여 발현될 수 있다.
용어 "콜라겐"은 상기 기재된 I형 내지 XX형 콜라겐을 포함하는 공지된 콜라겐 유형 중 임의의 하나, 및 천연, 합성, 반합성 또는 재조합이든 임의의 다른 콜라겐을 의미한다. 이것은 본 명세서에 기재된 모든 콜라겐, 변형된 콜라겐 및 콜라겐 유사 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 모티프 (Gly-X-Y)n(식 중, n은 정수임)을 포함하는 프로콜라겐 및 콜라겐 유사 단백질 또는 콜라겐성 단백질을 포함한다. 이것은 콜라겐 및 콜라겐 유사 단백질의 분자, 콜라겐 분자의 삼합체, 콜라겐의 피브릴 및 콜라겐 피브릴의 섬유를 포함한다. 이것은 또한 피브릴화될 수 있는 화학적으로, 효소로 또는 재조합으로 변형된 콜라겐 또는 콜라겐 유사 분자, 및 나노섬유로 재조립될 수 있는 콜라겐, 콜라겐 유사 분자 및 콜라겐성 분자의 단편을 의미한다. 재조합 콜라겐 분자는 네이티브이든 또는 조작되든 본 명세서에 기재된 반복된 -(Gly-X-Y)n- 서열을 일반적으로 포함할 것이다.
콜라겐에서의 프롤린 및 라이신 잔기의 수산화. 콜라겐의 폴리펩타이드의 주요 번역 후 변형은 4-하이드록시프롤린, 3-하이드록시프롤린(Hyp) 및/또는 하이드록시라이신(Hyl)을 생성시키기 위한 프롤린 및/또는 라이신 잔기의 수산화, 및 하이드록시라이실 잔기의 글라이코실화이다. 이 변형은 3개의 수산화효소(프롤릴 4-수산화효소, 프롤릴 3-수산화효소 및 라이실 수산화효소) 및 2개의 글라이코실 전환효소에 의해 촉매화된다. 폴리펩타이드가 삼중-나선 콜라겐 구조를 형성할 때까지(추가의 변형을 저해함), 생체내 이 반응이 발생한다.
프롤릴 -4-수산화효소. 이 효소는 (2S,4R)-4-하이드록시프롤린(Hyp)으로의 프롤린 잔기의 수산화를 촉매화한다. Gorres, et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 45 (2): (2010)(참고로 포함됨). 하기 예는 P4HA(서열 번호 54) 및 P4HB(서열 번호 52)에 의해 코딩된 사합체 소 프롤릴-4-수산화효소(2 알파 및 2 베타 사슬)를 이용하지만, 비-소 공급원으로부터의 아이소폼, 오르토로그, 변이체, 단편 및 프롤릴-4-수산화효소는, 이들이 효모 숙주 세포에서 수산화효소 활성을 보유하는 한 또한 사용될 수 있다. 추가로 P4HA1은 http://_www.omim.org/entry/176710에 의해 기재되고, P4HB1 및 P4HB1은 http://www.omim.org/entry/176790에 의해 기재된다(둘 다 참고로 포함됨).
프롤릴 3-수산화효소. 이 효소는 프롤린 잔기의 수산화를 촉매화한다. 프롤릴 3-수산화효소 1 전구체[보스 타우루스(Bos taurus)]는 NCBI 기준 서열: NP_001096761.1 또는 NM_001103291.1(서열 번호 48)에 의해 기재된다. 추가의 설명을 위해, 문헌[Vranka, et al., J. Biol. Chem. 279: 23615-23621 (2004) 또는 hhttp://_www.omim.org/entry/610339(2017년 7월 14일에 마지막 접속)](참고로 포함됨)을 참조한다. 이 효소는 이의 네이티브 형태로 사용될 수 있다. 그러나, 비-소 공급원으로부터의 아이소폼, 오르토로그, 변이체, 단편 및 프롤릴-3-수산화효소는, 이들이 효모 숙주 세포에서 수산화효소 활성을 보유하는 한 또한 사용될 수 있다.
라이실 수산화효소. 라이실 수산화효소(EC 1.14.11.4)는 X-lys-gly 서열에서의 라이신 잔기의 수산화에 의해 콜라겐 유사 아미노산 서열에 의한 콜라겐 및 다른 단백질에서의 하이드록시라이신의 형성을 촉매화한다. 효소는 약 85kD의 분자 질량을 갖는 하위단위로 이루어진 동종이합체이다. 이들 2개의 콜라겐 수산화효소 사이의 동역학 특성에서의 현저한 유사성에도 불구하고, 라이실 수산화효소의 1차 구조와 프롤릴-4-수산화효소의 하위단위의 2개의 유형(176710, 176790) 사이에 상당한 상동성이 발견되지 않았다. 라이실 수산화효소 반응에서 형성된 하이드록시라이신 잔기는 2개의 중요한 기능을 갖는다: 처음에, 이의 하이드록시기는 모노사카라이드 갈락토스 또는 이당류 글루코실갈락토스인 탄수화물 단위에 대한 부착의 부위로서 작용하고; 둘째로, 이들은 분자간 콜라겐 가교결합을 안정화시킨다.
PLOD1 프로콜라겐-라이신,2-옥소글루타레이트 5-다이옥시게나제 1[보스 타우루스(소)]은 2017년 5월 25일에 업데이트된 Gene ID: 281409에 의해 기재되고, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409(2017년 7월 14일에 마지막 접속)에 참조하여 포함된다. 또 다른 예는 보스 타우루스 라이실 산화효소(LOX)를 기재하는 서열 번호 50에 의해 기재된다. 이 효소는 이의 네이티브 형태로 사용될 수 있다. 그러나, 비-소 공급원으로부터의 아이소폼, 오르토로그, 변이체, 단편 및 라이실 수산화효소는, 이들이 효모 숙주 세포에서 수산화효소 활성을 보유하는 한 또한 사용될 수 있다.
재조합 콜라겐에서의 프롤린 잔기의 수산화의 정도의 검정. 재조합 콜라겐에서의 프롤린 잔기의 수산화의 정도는, 문헌[Chan, et al., BMC Biotechnology 12:51 (2012)](참고로 포함됨)에 의해 기재된 바대로, 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 포함하는 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
재조합 콜라겐에서의 라이신 잔기의 수산화의 정도의 검정. 콜라겐의 라이신 수산화 및 가교결합은 문헌[Yamauchi, et al., Methods in Molecular Biology, vol. 446, pages 95-108; Humana Press (2008))](참고로 포함됨)에 의해 기재되어 있다. 재조합 콜라겐에서의 라이신 잔기의 수산화의 정도는 문헌[Hausmann, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 133(3): 591-593 (1967)](참고로 포함됨)에 의해 기재된 방법을 포함하는 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
콜라겐 융점. 콜라겐에서의 프롤린, 라이신 또는 프롤린 및 라이신 잔기의 수산화의 정도는 공지된 함량의 수산화 아미노산 잔기를 갖는 대조군 콜라겐과 비교하여 수화 콜라겐, 예컨대 하이드로겔의 융점에 의해 예상될 수 있다. 콜라겐 융점은 25 내지 40℃의 범위일 수 있고, 더 고도로 수산화된 콜라겐은 더 높은 융점을 일반적으로 갖는다. 이 범위는 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40을 포함하는 모든 중간 하위범위 및 값을 포함한다.
코돈 변형. 이 과정은 효모, 예컨대 피치아 파스토리스에 의해 발현된 재조합 콜라겐의 양을 변형시키기 위해, 재조합 효모에 의해 분비된 재조합 콜라겐의 양을 변형시키기 위해, 재조합 효모에서의 재조합 콜라겐의 발현의 속도를 변형시키기 위해, 또는 재조합 콜라겐에서의 라이신 또는 프롤린 잔기의 수산화의 정도를 변형시키기 위해 자연에서 발견되는 콜라겐 DNA 서열과 같은 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 변경을 포함한다. 코돈 변형은 유사한 목적을 위해 또는 특정한 세포내 또는 세포외 구획에 수산화효소를 표적화하기 위해, 예를 들어 재조합 콜라겐 분자와 동일한 구획, 예컨대 소포체에 프롤린 수산화효소를 표적화하기 위해 다른 단백질, 예컨대 수산화효소에 또한 적용될 수 있다.
코돈 선택은 RNA 2차 구조에 대한 효과, 전사 및 유전자 발현에 대한 효과, 번역 연장의 속도에 대한 효과, 및/또는 단백질 폴딩에 대한 효과에 기초하여 만들어질 수 있다.
콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 코돈은 재조합 콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 mRNA에서의 2차 구조를 감소시키거나 증가시키도록 변형될 수 있거나, 대체로 효모에서의 모든 단백질 코딩 서열에 기초하여 효모 숙주 세포에 의해 가장 빈번히 사용되는(예를 들어, 코돈 샘플링), 효모에서의 모든 단백질 코딩 서열에 기초하여 효모 숙주 세포에 의해 가장 덜 빈번히 사용되는(예를 들어, 코돈 샘플링) 코돈, 또는 효모 숙주 세포에 의해 풍부하게 발현된 단백질에 보이거나 효모 숙주 세포에 의해 분비된 단백질에서 보이는 중복성 코돈(예를 들어, 유전자를 고도로 발현된 유전자 또는 발현 숙주로부터 분비 가능한 단백질을 코딩하는 유전자와 "같이 보이게" 만드는 높은 코돈 적응 지수(High Codon Adaptation Index)에 기초한 코돈 선택)에 의해 중복성 코돈을 대체하도록 변형될 수 있다.
코돈 변형은 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부에, 예를 들어 코딩 서열 또는 이들의 조합의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10의 10% 중 적어도 하나에 적용될 수 있다. 이것은 또한 특정한 아미노산을 코딩하는 코돈 또는 중복성 코돈에 의해 코딩된 모든 아미노산이 아닌 몇몇 아미노산을 코딩하는 코돈에 선택적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 류신 및 페닐알라닌에 대한 코돈만이 상기 기재된 바대로 코돈 변형될 수 있다. 하나 초과의 코돈에 의해 코딩된 아미노산은 당해 분야에 널리 공지되고 https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table(2017년 7월 13일에 마지막 접속)에 참고로 포함된 코돈 표에 의해 기재된다.
코돈 변형은 https://www.atum.bio/services/genegps(2017년 7월 13일에 마지막 접속), https://www.idtdna.com/CodonOpt; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1523223/ 또는 https://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm(각각 참고로 포함됨)에 의해 기재된 소위 코돈 최적화 방법을 포함한다.
코돈 변형은 또한 mRNA 2차 구조의 형성을 허용하도록 또는 2차 구조를 최소화하거나 제거하도록 코돈의 선택을 포함한다. 이의 예는 리보솜-결합 부위 또는 개시 코돈에서 또는 이 주위에서 2차 구조 강한 2차 구조를 제거하거나 감소시키거나 약하게 하도록 코돈 선택을 만드는 것이다.
콜라겐 단편. 재조합 콜라겐 분자는 트로포콜라겐(삼합체 콜라겐)을 형성할 수 있는 네이티브 콜라겐 분자 또는 수탁 번호 NP_001029211.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252, 2017년 2월 9일에 마지막 접속), NP_776945.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257, 2017년 2월 9일에 마지막 접속) 및 NP_001070299.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881, 2017년 2월 9일에 마지막 접속)(참고로 포함됨)에 의해 기재된, Col1A1, Col1A2 및 Col3A1의 아미노산 서열의 것과 같은 네이티브 콜라겐 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜라겐 분자 또는 절두된 콜라겐 분자(또는 이의 피브릴 형성 영역 또는 실질적으로 [Gly-X-Y]n을 포함하는 분절)의 아미노산 서열의 단편을 포함할 수 있다.
콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 유전자는 절두되거나 그렇지 않으면 서열을 부가하거나 제거하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 리뉴클레오타이드 또는 벡터의 크기를 맞춤화하도록, 소포체 또는 다른 세포 또는 세포외 구획으로 발현된 단백질을 표적화하도록, 또는 코딩된 단백질의 길이를 제어하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 Pre 서열만을 함유하는 작제물이 전체 Pre-pro 서열을 함유하는 것보다 대개 더 양호하게 일한다는 것을 발견하였다. Pre 서열은 P4HB에 융합되어 ER에서 P4HB를 국재화하고, 여기서 콜라겐은 또한 국재화된다.
콜라겐 및 수산화효소에 대한 변형된 코딩 서열. 콜라겐 또는 수산화효소, 또는 다른 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열은 공지된 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100% 동일하거나 유사하고, 비변형된 분자의 본질적인 특성, 예를 들어 트로포콜라겐을 형성하는 능력 또는 콜라겐에서 프롤린 또는 라이신 잔기를 수산화하는 능력을 보유하는 단백질을 코딩하도록 변형될 수 있다. 콜라겐 분자에서의 글라이코실화 부위는 제거되거나 부가될 수 있다. 변형은 효모 숙주 세포에 의한 콜라겐 생성 또는 이의 분비를 수월하게 하도록 또는 이의 구조적, 기능적 또는 심미적 특성을 변경하도록 이루어질 수 있다. 변형된 콜라겐 또는 수산화효소 코딩 서열은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 코돈 변형될 수 있다.
용어 "네이티브 콜라겐", "네이티브 폴리펩타이드" 또는 "네이티브 폴리뉴클레오타이드"는, 예를 들어 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환, 예컨대 코돈 변형에 의한 변경에 의해, 예를 들어 아미노산 잔기의 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 결실, 치환의 부가 없이, 네이티브 서열의 변경 없이, 자연에서 발견되면서 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에 기재된 콜라겐 및 효소의 유형은 이의 네이티브 형태, 및 네이티브 콜라겐 또는 효소의 생물학적 활성을 보유하는 변형된 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 변형된 형태는 상응하는 네이티브 서열과 특정한 정도의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 것에 의해 확인될 수 있다. 변형된 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 벡터 또는 예를 들어 도 1 내지 도 20에 도시된 바와 같은 이 벡터를 구성하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 유전요소와 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 것을 포함한다.
BLASTN은 기준 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 수산화효소, 또는 신호, 리더 또는 분비 펩타이드 또는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 단백질과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 또는 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하도록 사용될 수 있다. 매우 유사한 서열을 발견하도록 변형된 대표적인 BLASTN 설정은 10의 예상 한계치(Expect Threshold) 및 28의 워드크기, 0의 쿼리 범위에서의 최대 일치, 1/-2의 일치/비일치 점수 및 선형 갭 비용을 이용한다. 낮은 복합 영역은 여과되거나 마스킹될 수 있다. 표준 뉴클레오타이드 BLAST의 디폴트 설정은 https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome(2017년 7월 13일에 마지막 접속)에 의해 기재되고 이에 참고로 포함된다.
BLASTP는 유사성 매트릭스, 예컨대 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80(여기서, BLOSUM45는 밀접하게 관련된 서열에 사용될 수 있음), 중간범위 서열에 대한 BLOSUM62 및 더 멀리 관련된 서열에 대한 BLOSUM80을 이용하여 기준 아미노산, 예컨대 콜라겐 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 또는 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 확인하도록 사용될 수 있다. 달리 표시되지 않은 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용에 기초할 것이다. BLASTP를 이용할 때, 유사성 백분율은 BLASTP 양수 점수에 기초하고, 서열 동일성 백분율은 BLASTP 동일성 점수에 기초한다. BLASTP "동일성"은 동일한 높은 스코어링 서열 쌍에서의 전체 잔기의 수 및 분획을 보여주고, BLASTP "양수"는 정렬 점수가 양의 값을 갖고 서로에 유사한 잔기의 수 및 분획을 보여준다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열과 이 정도의 동일성 또는 유사성의 또는 동일성 또는 유사성의 임의의 중간 정도를 갖는 아미노산 서열이 고려되고, 본 개시내용에 의해 포함된다. 10의 예상 한계치, 3의 워드 크기, 매트릭스로서의 BLOSUM 62 및 11(존재) 및 1(연장)의 갭 패널티 및 조건부 구성 점수 매트릭스 조정을 이용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 다른 디폴트 설정은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome(2017년 7월 13일에 마지막 접속)에 의해 기재되고, 여기서 이용 가능한 본 개시내용에 참고로 포함된다.
용어 "이의 유도체", "변형된 서열" 또는 "유사체"는, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드에 적용된 바대로, 생물학적 활성 분자의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 유도체는 네이티브의 아미노산 서열 또는 이전에 조작된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 유도체는 네이티브의 아미노산 서열 또는 이전에 조작된 분자에 대한 부가, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도체는 네이티브 콜라겐 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 프롤린 또는 라이신 잔기를 도입하거나 결실시킬 수 있다. 이러한 선택은 재조합 트로포콜라겐 또는 피브릴화 콜라겐의 느슨함 또는 단단함을 변형시키도록 만들어질 수 있다.
유도체는 아미노산 잔기의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 내지 15개, 16개 내지 20개, 21개 내지 25개, 또는 26개 내지 30개의 부가, 치환 또는 결실을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 부가 또는 치환은 또한 비천연 발생 아미노산 또는 변형된 아미노산의 사용을 포함한다. 유도체는 또한 폴리펩타이드에 대한 화학 변형, 예컨대 시스테인 잔기, 또는 수산화 또는 글라이코실화 잔기 사이의 가교결합을 포함할 수 있다. 유도체는 본 명세서에 개시된 콜라겐 및 효소를 포함하는 모든 폴리펩타이드의 것을 포함한다. 일반적으로, 유도체는 비변형된 모 분자의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가질 것이고, 이에 의해 효소 유도체는 일반적으로 모 효소 및 콜라겐 유도체의 효소 활성, 모 콜라겐의 적어도 하나의 구조적, 화학적 또는 생물학적 특성을 가질 것이다.
생체조직제조된 가죽. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 피브릴화되고 가교결합될 수 있는 콜라겐, 절두된 콜라겐, 비변형된 또는 번역 후 변형된, 또는 아미노산 서열 변형된 콜라겐의 임의의 유형을 사용하여 생체조직제조된 재료 또는 생체조직제조된 가죽을 제조할 수 있다. 생체조직제조된 가죽은 실질적으로 균일한 콜라겐, 예컨대 오직 I형 또는 III형 콜라겐을 함유할 수 있거나, 콜라겐의 2종, 3종, 4종 또는 이것 초과의 상이한 종류의 혼합물을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 콜라겐, 예를 들어 생체조직제조된 가죽의 성분은 수산화된 이의 라이신, 프롤린, 또는 라이신 및 프롤린 잔기 중 어느 것도 가지지 않을 것이다. 다른 실시형태에서, 재조합 콜라겐에서의 라이신, 프롤린, 또는 라이신 및 프롤린 잔기의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%(또는 하위범위의 임의의 중간 값)는 수산화될 것이다.
효모 균주. 본 발명은 콜라겐을 생성하도록 효모를 이용한다. 적합한 효모는 피치아, 칸디다(Candida), 코마타가엘라(Komatagaella), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코커스(Cryptococcus) 속의 것 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 효모는 변형되거나 혼성화될 수 있다. 혼성화된 효모는 동일한 종의 상이한 균주, 동일한 속의 상이한 종 또는 상이한 속의 균주의 혼합 교배에 의해 제조된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 몇몇 효모 균주는 피치아 파스토리스, 피치아 멤브라니파시엔스(Pichia membranifaciens), 피치아 데세르티콜라(Pichia deserticola), 피치아 세팔로세레아나(Pichia cephalocereana), 피치아 에레모필라(Pichia eremophila), 피치아 메이안마렌시스(Pichia myanmarensis), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 나카세이(Pichia nakasei), 피치아 시아멘시스(Pichia siamensis), 피치아 헤디(Pichia heedii), 피치아 바르케리(Pichia barkeri), 피치아 노르베겐시스(Pichia norvegensis), 피치아 써모메탄올리카(Pichia thermomethanolica), 피치아 스티피테스(Pichia stipites), 피치아 수브펠리쿨로사(Pichia subpelliculosa), 피치아 엑시구아(Pichia exigua), 피치아 옥시덴탈리스(Pichia occidentalis) 및 피치아 칵토필라(Pichia cactophila)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 콜라겐 및/또는 수산화효소(들)를 코딩하는 코돈 변형된 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작된 피치아 파스토리스 균주에 관한 것이다. 유용한 피치아 파스토리스 숙주 균주는 BG10(야생형)(균주 PPS-9010); BG 11, aox1Δ(MutS)(균주 PPS-9011)(PPS-9010의 느린 메탄올 이용 유도체임); 및 BG16, pep4Δ, prb4Δ(균주 PPS-9016)(프로테아제 결핍됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 균주는 공중에게 이용 가능하고, https://www._atum.bio/products/cell-strains에서 ATUM으로부터 얻어질 수 있다.
효모를 위한 폴리펩타이드 분비 서열. 몇몇 실시형태에서, 효모 숙주 세포에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 효모로부터의 이의 분비를 수월하게 하는 폴리펩타이드 서열로 융합될 것이고, 예를 들어 벡터는 분비 펩타이드를 코딩하는 서열에 융합된 콜라겐에 대한 코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자를 코딩할 수 있다. 이 목적에 사용될 수 있는 분비 서열은 사카로마이세스 알파 메이팅 인자 Prepro 서열, 사카로마이세스 알파 메이팅 인자 Pre 서열, PHO1 분비 신호, 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 α-아밀라제 신호 서열, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로부터의 글루코아밀라제 신호 서열, 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 혈청 알부민 신호 서열, 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromcyes maxianus)로부터의 이눌리나제 신호 서열, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 인베르타제 신호 서열, 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 살해 단백질 신호 서열 및 갈루스 갈루스(Gallus gallus)로부터의 라이소짐 신호 서열을 포함한다. 당해 분야에 공지된 다른 분비 서열을 또한 사용할 수 있다.
효모 촉진자 및 종결자. 몇몇 실시형태에서, 하기 효모 촉진자 중 하나 이상은 콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 mRNA의 촉진자 전사에 벡터로 도입될 수 있다. 촉진자는 당해 분야에 공지되어 있고, pAOX1, pDas1, pDas2,ppmP20, pCAT, pDF, pGAP, pFDH1, pFLD1, pTAL1, pFBA2, pAOX2, pRKI1, pRPE2, pPEX5, pDAK1, pFGH1, pADH2, pTPI1, pFBP1, pTAL1, pPFK1, pGPM1 및 pGCW14를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 효모 종결자 서열은 콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 mRNA의 전사를 종료시키도록 벡터로 도입된다. 종결자는 AOX1 TT, Das1 TT, Das2 TT, AOD TT, PMP TT, Cat1 TT, TPI TT, FDH1 TT, TEF1 TT, FLD1 TT, GCW14 TT, FBA2 TT, ADH2 TT, FBP1 TT 및 GAP TT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
펩신 이외의 펩티다제 . 펩신은 N 말단 및 C 말단 서열을 제거함으로써 트로폴라겐으로 콜라겐을 가공 처리하도록 사용될 수 있다. 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 파파인, 피카인 및 브로멜라인(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다른 프로테아제는 이 목적에 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "안정한 콜라겐"은 펩신 또는 또 다른 프로테아제의 특정한 농도에 노출된 후 콜라겐의 초기 농도의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(또는 임의의 중간 값 또는 하위범위)가 여전히 존재한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 안정한 콜라겐의 적어도 75%는 동일한 시간의 양 동안 동일한 조건 하에 처리되는 비안정한 콜라겐과 비교하여 펩신 또는 또 다른 프로테아제에 의한 처리 후 남을 것이다. 번역 후 변형 전에, 콜라겐은 비수산화되고, 높은 펩신 농도(예를 들어, 1:200 또는 이것 초과의 펩신:단백질 비율)의 존재 하에 분해된다.
번역 후 변형되면, 콜라겐은 펩신 또는 또 다른 프로테아제와 접촉하여 콜라겐의 N 말단 및 C 말단 프로펩타이드를 절단할 수 있어서, 콜라겐 피브릴화가 가능하게 한다. 수산화 콜라겐은 비수산화 콜라겐과 비교하여 더 양호한 열안정성을 갖고, 예를 들어 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, 내지 1:1(또는 임의의 중간 값)의 펩신:전체 단백질 비율에서 높은 농도 펩신 분해에 저항적이다. 따라서, 재조합 콜라겐의 조기 단백질분해를 피하기 위해, 수산화 콜라겐을 제공하는 것이 유용하다.
대안적인 발현 시스템. 콜라겐은 피치아 파스토리스 이외의 다른 종류의 효모 세포에서 발현될 수 있고, 예를 들어 또 다른 효모, 메틸영양균성 효모 또는 다른 유기체에서 발현될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시아에는 임의의 많은 수의 발현 벡터와 사용될 수 있다. 흔히 사용되는 발현 벡터는, 외래 유전자의 효율적인 전사를 위해, 이. 콜라이에 대한 Col E1 기원 및 효모에서의 전파를 위한 2P 복제 기원을 함유하는 셔틀 벡터이다. 2P 플라스미드에 기초한 이러한 벡터의 통상적인 예는 pWYG4이고, 이것은 2P ORI-STB 유전요소, GAL1-10 촉진자 및 2P D 유전자 종결자를 갖는다. 이 벡터에서, Ncol 클로닝 부위는 발현시키고자 하는 폴리펩타이드에 대한 유전자를 삽입하고 ATG 출발 코돈을 제공하도록 사용된다.
또 다른 발현 벡터는 pWYG7L(이것은 온전한 2αORI, STB, REP1 및 REP2를 가짐) 및 GAL1-10 촉진자이고, FLP 종결자를 사용한다. 이 벡터에서, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 BamHI 또는 Ncol 부위에서 이의 5' 말단에 의해 폴리링커에서 삽입된다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 세포벽의 제거 후 에스. 세레비시아에로 형질전환되어서, 칼슘 및 폴리에틸렌 글라이콜에 의한 처리에서 또는 리튬 이온에 의한 온전한 세포의 처리에 의해 DNA를 흡수하는 스페로플라스트(spheroplast)를 생성한다.
대안적으로, DNA는 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 형질전환체는 선택 가능한 마커 유전자, 예컨대 LEU2, TRP1, URA3, HIS3 또는 LEU2-D와 함께 류신, 트립토판, 유라실 또는 히스티딘에 대해 영양요구성인 예를 들어 숙주 효모 세포를 사용하여 선택될 수 있다.
메틸영양균성 효모, 예컨대 피치아 파스토리스에서의 다수의 메탄올 반응성 유전자가 존재하고, 이들 각각의 발현은 촉진자라고도 불리는 메탄올 반응성 조절 영역에 의해 제어된다. 임의의 이러한 메탄올 반응성 촉진자는 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합하다. 특정한 조절 영역의 예는 AOX1 촉진자, AOX2 촉진자, 다이하이드록시아세톤 합성효소(DAS), P40 촉진자 및 피. 파스토리스로부터의 카탈라아제 유전자에 대한 촉진자 등을 포함한다.
메틸영양균성 효모 한세눌라 폴리모르파를 또한 사용할 수 있다. 메탄올에서의 성장은 MOX(메탄올 산화효소), DAS(다이하이드록시아세톤 합성효소) 및 FMHD(폼에이트 탈수소효소)와 같은 메탄올 대사의 중요한 효소의 유도를 발생시킨다. 이 효소는 전체 세포 단백질의 30% 내지 40%까지 구성할 수 있다. MOX, DAS 및 FMDH 생성을 코딩하는 유전자는 메탄올에서의 성장에 의해 유도되고 글루코스에서의 성장에 의해 억제된 강한 촉진자에 의해 제어된다. 이들 촉진자 중 임의의 또는 모든 3개는 에이치. 폴리모르파에서의 비상동성 유전자의 높은 수준 발현을 얻도록 사용될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 동물 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편 또는 변이체는 유도성 에이치. 폴리모르파 촉진자의 제어 하에 발현 벡터로 클로닝된다. 생성물의 분비가 원해지는 경우, 효모에서의 분비를 위한 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드와 프레임으로 융합된다. 추가의 실시형태에서, 발현 벡터는 바람직하게는 영양요구성 숙주의 결핍성을 보완하도록 사용될 수 있는 영양요구성 마커 유전자, 예컨대 URA3 또는 LEU2를 함유한다.
이후, 발현 벡터는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기법을 이용하여 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 형질전환시키도록 사용된다. 에이치. 폴리모르파 형질전환의 유용한 특징은 게놈으로의 발현 벡터의 100개 이하의 카피의 자발적인 통합이다. 대부분의 경우에, 통합된 폴리뉴클레오타이드는 머리 대 꼬리 배열을 나타내는 다합체를 형성한다. 통합된 외래 폴리뉴클레오타이드는 비선택적 조건 하에서도 몇몇 재조합 균주에서 유사분열로 안정한 것으로 나타났다. 높은 카피 통합의 이 현상은 시스템의 높은 생산성 가능성을 추가로 증가시킨다.
외래 DNA는 효모 게놈으로 삽입되거나 에피솜으로 유지되어서 콜라겐을 생성한다. 콜라겐에 대한 DNA 서열은 벡터를 통해 효모로 도입된다. 외래 DNA는 임의의 비효모 숙주 DNA이고, 포유류, 카이노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 및 박테리아로부터의 것을 포함하지만, 예를 들어 이들로 제한되지는 않는다. 효모에서의 콜라겐 생성에 적합한 포유류 DNA는 소, 말, 돼지, 캥거루, 코끼리, 코뿔소, 하마, 고래, 돌고래, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 염소 및 양(어린 양)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 콜라겐 생성을 위한 다른 DNA는 파충류(예컨대, 앨리게이터(alligator), 악어(crocodile), 거북이, 이구아나, 도마뱀, 뱀), 조류(예를 들어, 타조, 에뮤, 모아), 공룡, 양서류 및 어류(예를 들어, 틸리피아, 농어, 연어, 송어, 상어, 장어 콜라겐) 및 이들의 조합으로부터의 것을 포함한다.
DNA는 벡터에서 삽입되고, 적합한 벡터는 pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-P4HB 하이그로, pHTX1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB 하이그로, pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-Prepro-P4HB G418, pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB 하이그로 pDF-Col3A1 변형된 제오신, pCAT-Col3A1 변형된 제오신, AOX1 랜딩 패드에 의한 pDF-Col3A1 변형된 제오신, pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-Pro-P4HB 하이그로를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 벡터는 통상적으로 DNA의 선형화를 위한 적어도 하나의 제한 부위를 포함한다.
선택 촉진자는 재조합 단백질의 생성을 개선할 수 있고, 콜라겐 또는 수산화효소를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진자는 AOX1 메탄올 유도된 촉진자, pDF 탈억제된 촉진자, pCAT 탈억제된 촉진자, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 메탄올 유도된 촉진자는 AOX2, Das 1, Das 2, pDF, pCAT,ppmP20, pFDH1, pFLD1, pTAL2, pFBA2, pPEX5, pDAK1, pFGH1, pRKI1, pREP2 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
올-인-원 벡터를 포함하는 본 발명에 따른 벡터에서, 종결자는 효모로 도입된 벡터에서 이용된 각각의 오픈 리딩 프레임의 말단에 위치할 수 있다. 종결자에 대한 DNA 서열은 벡터로 삽입된다. 복제 벡터에 대해, 복제 기원은 복제를 개시시키도록 필요하다. 복제 기원에 대한 DNA 서열은 벡터로 삽입된다. 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 하나 이상의 DNA 서열은 벡터로 도입되어서, 재조합 및 효모 게놈으로의 도입을 촉진하거나 효모 세포로 형질전환되면 벡터를 안정화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 또한 일반적으로 성공적으로 형질전환된 효모 세포를 선택하기 위해 사용된 적어도 하나의 선택적 마커를 포함할 것이다. 마커는 때때로 항생제 내성과 관련되고, 마커는 또한 소정의 아미노산에 의해 또는 이것 없이(영양요구성 마커) 성장하는 능력과 관련될 수 있다. 적합한 영양요구성 마커는 ADE, HIS, URA, LEU, LYS, TRP 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 재조합 벡터를 함유하는 효모 세포의 선택을 제공하도록, 선택 마커에 대한 적어도 하나의 DNA 서열은 벡터로 도입된다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 재조합 효모 발현된 콜라겐 또는 콜라겐 유사 단백질에서의 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 및 프롤린은 수산화가 결여될 수 있거나, 상응하는 천연 또는 비변형된 콜라겐 또는 콜라겐 유사 단백질보다 더 적거나 높은 정도의 수산화를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 콜라겐 또는 콜라겐 유사 단백질에서의 아미노산 잔기는 글라이코실화가 결여될 수 있거나, 상응하는 천연 또는 비변형된 콜라겐 또는 콜라겐 유사 단백질보다 더 적거나 높은 정도의 글라이코실화를 가질 수 있다.
수산화 콜라겐은 비수산화 또는 수산화이하 콜라겐(32℃ 미만)보다 더 높은 융점(37℃ 초과)을 갖고, 또한 비수산화 또는 수산화이하 콜라겐보다 더 양호하게 피브릴화하고, 재료로서 사용하기에 더 강하고 더 내구성인 구조를 형성한다. 콜라겐 제제의 융점을 이용하여 이의 수산화 정도를 예측할 수 있고, 예를 들어 30 내지 40℃, 및 모든 중간 값, 예컨대 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40℃의 범위일 수 있다. 수산화이하 콜라겐은 내구성 물품, 예컨대 신발 또는 백에 적합하지 않지만, 더 부드럽거나 더 흡수성인 제품으로 제제화될 수 있는 젤로(jello) 또는 젤라틴 유사 재료를 오직 형성할 수 있다.
콜라겐 조성물에서의 콜라겐은 균일하고 단일 유형의 콜라겐 분자, 예컨대 100% 소 I형 콜라겐 또는 100% III형 소 콜라겐을 함유할 수 있거나, 콜라겐 분자 또는 콜라겐 유사 분자의 상이한 종류의 혼합물, 예컨대 소 I형 및 III형 분자의 혼합물을 함유할 수 있다. 이러한 혼합물은 개별 콜라겐 또는 콜라겐 유사 단백질 성분의 0% 초과, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 미만(또는 임의의 중간 값 또는 하위범위)을 포함할 수 있다. 이 범위는 모든 중간 값을 포함한다. 예를 들어, 콜라겐 조성물은 30%의 I형 콜라겐 및 70%의 III형 콜라겐을 함유할 수 있거나, 33.3%의 I형 콜라겐, 33.3%의 II형 콜라겐 및 33.3%의 III형 콜라겐을 함유할 수 있고, 여기서 콜라겐의 백분율은 조성물 내의 콜라겐의 전체 질량 또는 콜라겐 분자의 분자 백분율에 기초한다.
상기 기재된 조작된 효모 세포는 콜라겐을 생성하도록 사용될 수 있다. 이렇게 하기 위해, 세포는 발효 챔버 내에 배지에 배치되고, 12시간 내지 1주의 범위의 시간 기간 동안 제어된 pH 조건 하에 용존 산소 및 탄소원이 공급된다. 적합한 배지는 완충 글라이세롤 복합 배지(buffered glycerol complex media: BMGY), 완충 메탄올 복합 배지(buffered methanol complex media: BMMY) 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(yeast extract peptone dextrose: YPD)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 콜라겐이 효모 세포에서 생성된다는 사실로 인해, 콜라겐을 단리하기 위해, 효모의 분비성 균주를 사용하거나 효모 세포를 용해시켜서 콜라겐을 방출시켜야 한다. 이후, 콜라겐은 종래의 기법, 예컨대 원심분리, 침전, 여과, 크로마토그래피 등을 통해 정제될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 수산화 콜라겐 및 비수산화 콜라겐을 생성하기에 유용한 효모 숙주에서 키메라 DNA 서열을 제공한다. 키메라 DNA 서열은 비변형된 DNA 서열 및 변형된 DNA 서열을 조합함으로써 생성된다. 비변형된 DNA 서열은 다양한 염기 쌍 위치에서 절단될 수 있다. 변형된 DNA 서열은 상응하는 염기 쌍 위치에서 또한 절단될 수 있다. 비변형된 절단 및 변형된 절단은 앞에서 뒤로 및 뒤에서 앞으로 조합될 수 있다. 키메라 DNA 서열은 상기로부터 촉진자, 벡터, 종결자 및 선택 마커와 조합되고 숙주로 삽입되어서, 수산화 콜라겐 및 비수산화 콜라겐을 생성할 수 있는 효모를 생성할 수 있다.
최적화된 DNA 및 비최적화된 DNA의 백분율은 서열의 전체 길이에 기초하여 계산될 수 있다. 키메라 균주는 N 말단에서의 최적화된 DNA 및 C 말단에서의 비최적화된 DNA의 조합일 수 있다. 최적화된 DNA의 백분율은 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 내지 99%(또는 임의의 중간 값 또는 하위범위)의 범위일 수 있고, 예를 들어 이것은 10 내지 40% 및 60 내지 90%의 범위일 수 있다. 대안적으로, 키메라 균주는 N 말단에서의 비최적화된 DNA 및 C 말단에서의 최적화된 DNA의 조합일 수 있다. 비최적화된 DNA의 백분율은 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 내지 99%(또는 임의의 중간 값 또는 하위범위)의 범위일 수 있고, 예를 들어 이것은 10 내지 40% 및 60 내지 90%의 범위일 수 있다. 예를 들어, 1331에서 1486개의 염기 쌍 절단을 갖는 DNA 서열은 0개 내지 1331개의 최적화된 DNA 및 1332개 내지 1486개의 비최적화된 DNA를 제공할 것이고, 키메라는 90% 최적화될 것이다. 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열은 C 말단, N 말단에서, 또는 콜라겐 분자의 바디 내의 그 외에서 콜라겐의 분절을 코딩할 수 있고, 예를 들어 이것은 콜라겐 분자의 처음의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 콜라겐 분자의 마지막의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 코딩할 수 있다.
대안적으로, 키메라 균주는 함께 융합된 최적화된 DNA 및 비최적화된 DNA의 2개, 3개 또는 4개 또는 이것 초과까지의 섹션으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 1,500개의 염기 쌍을 갖는 DNA 서열은 0개 내지 500개의 최적화된 DNA 섹션, 501개 내지 1,000개의 비최적화된 DNA 섹션 및 1001개 내지 1500개의 최적화된 DNA 섹션을 가질 수 있다.
본 명세서에 개시된 콜라겐은 생체조직제조된 가죽을 제조하는 것이 가능하게 한다. 콜라겐을 생체조직제조된 가죽으로 변환하는 방법은 계류 중인 특허 출원 미국 출원 번호 15/433566, 15/433650, 15/433632, 15/433693, 15/433777, 15/433675, 15/433676 및 15/433877(이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 교시되어 있다.
본 발명의 실시형태
본 발명의 비제한적인 실시형태는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
소 콜라겐, 예컨대 I형 또는 III형 콜라겐, 또는 콜라겐 변이체 또는 유도체 및 코딩된 콜라겐에서의 프롤린, 라이신, 또는 라이신 및 프롤린 잔기를 수산화시키는 적어도 하나의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 네이티브 콜라겐 또는 수산화효소 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 코돈 변형시키거나, 숙주 효모 세포에서의 콜라겐 또는 수산화효소의 발현을 수월하게 하도록 발현 제어 유전요소, 예컨대 효모 촉진자 서열을 도입할 것이다. 변형된 폴리뉴클레오타이드는 효모에서 발현될 때 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100중량% 초과만큼 동일한 콜라겐 서열을 코딩하는 동일한 조건 하에 발현된 비변형된 폴리펩타이드와 비교하여 콜라겐 발현을 증가시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 콜라겐 또는 수산화효소 단백질의 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배 또는 이것 초과의 배수 발현이 획득될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, III형 콜라겐 또는 콜라겐 변이체는 발현될 것이고, 여기서 변이체는 서열 번호 2의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시형태에서, 소 콜라겐은 α1(I) 사슬 및 α2(I) 사슬 둘 다를 코딩하거나, 네이티브 I형 콜라겐 사슬과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 하나 이상의 콜라겐 사슬을 코딩하는 I형 소 콜라겐 또는 콜라겐 변이체이다.
상기 기재된 소 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프롤릴 4-수산화효소의 P4HA 및 P4HB 하위단위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 분절 또는 이것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프롤릴-3-수산화효소, 라이실 수산화효소 및/또는 라이실 산화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 분절 또는 이것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2의 III형 소 콜라겐 아미노산 서열과 적어도 75% 내지 99% 동일한 폴리펩타이드 및 각각 서열 번호 54 및 52와 적어도 75% 내지 99% 동일한 P4HA 및 P4HB 하위단위를 포함하는 수산화효소를 코딩하는 분절을 코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 I형 콜라겐, III형 콜라겐 또는 본 명세서에 기재된 몇몇 다른 콜라겐일 수 있는 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 일반적으로 인접하게 배치된 효모에서 작동적인 폴리펩타이드 분비 서열을 추가로 코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 콜라겐 또는 효소, 예컨대 수산화효소의 발현을 수월하게 하거나 제어하는 촉진자 또는 다른 서열을 추가로 함유할 수 있고, 예를 들어 이것은 AOX1 메탄올 유도된 촉진자, DN pDF 탈억제된 촉진자, pCAT 탈억제된 촉진자, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자 또는 이들의 조합 중 적어도 하나를 함유할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 다른 유전요소, 예컨대 알파 인자 pre- 또는 알파 인자 pre-pro 서열, 예컨대 서열 번호 23 및 24에 의해 각각 코딩된 것을 또한 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 서열은 효소, 예컨대 수산화효소 또는 본 명세서에 기재된 다른 효소, 예컨대 P4HA(서열 번호 54) 또는 P4HB(서열 번호 52)를 발현하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이것과 적어도 75%, 80%, 90% 또는 95% 내지 100% 동일한 변이체 효소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터는 본 발명의 추가 실시형태를 나타낸다. 이것은 본 명세서에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 콜라겐, 절두된 콜라겐, 콜라겐 변이체 및 효소, 예컨대 수산화효소 또는 본 명세서에 기재된 다른 효소를 코딩하는 키메라 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 콜라겐을 코딩하는 서열 및 수산화효소 또는 다른 효소를 코딩하는 서열은 동일한 벡터에 있을 것이고, 다른 실시형태에서 이들은 상이한 벡터에 있을 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 벡터를 함유하는 숙주 세포, 예컨대 효모 숙주 세포를 또한 고려한다. 몇몇 실시형태에서, 이 벡터는 비효모 세포, 예컨대 박테리아 숙주 세포에서 생성되고, 차후 콜라겐 또는 수산화 콜라겐을 발현하는 효모 숙주 세포, 예컨대 피치아 파스토루스 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 1% 미만, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%를 갖는 재조합 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 피치아 파스토루스 또는 또 다른 적합한 효모 숙주 세포(또는 진핵생물 숙주 세포)를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 수반하고, 상기 벡터는 프롤린 잔기의 1% 이하, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양 또는 형태를 발현하도록 구성된다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 III형 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 피치아 파스토루스 또는 다른 적합한 효모 숙주 세포를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 수반하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 1% 미만, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%를 갖는 재조합 III형 콜라겐을 제조하는 방법이고, 상기 벡터는 프롤린 잔기의 1% 이하, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양을 발현하도록 구성된다. 콜라겐 및 수산화효소 둘 다를 코딩하는 올-인-원 벡터는 예를 들어 수산화효소에 대한 유도성 또는 온도 민감한 촉진자의 사용에 의해 기능적 수산화효소가 발현되지 않거나 거의 발현되지 않도록 구성될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 또는 또 다른 적합한 효모 숙주 세포를 배양하는 것 및 콜라겐을 회수하는 것에 의해 수산화된 이의 프롤린 잔기의 10% 초과, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 갖는 재조합 콜라겐을 제조하는 방법이고, 벡터는 콜라겐 내의 프롤린 잔기의 10% 초과, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과 또는 이것 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양 또는 형태를 발현하도록 구성된다. 배양 시간 및 조건 및 수산화효소의 양 또는 활성은 수산화의 양을 제어하도록 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 III형 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 발명에 따른 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 숙주 세포를 배양하는 단계 및 III형 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 갖는 재조합 III형 콜라겐을 제조하는 방법이고, 벡터는 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과 또는 이것 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양 또는 형태를 발현하도록 구성된다. 배양 시간 및 조건 및 수산화효소의 양 또는 활성은 수산화의 양을 제어하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 발명의 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 또는 다른 적합한 효모 숙주 세포를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과 또는 이것 초과를 갖는 재조합 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이고, 벡터는 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과 또는 이것 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양을 발현하도록 구성된다. 배양 시간 및 조건 및 수산화효소의 양 또는 활성은 수산화의 양을 제어하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 발명의 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 또는 다른 효모 숙주 세포를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 갖는 재조합 III형 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 벡터는 프롤린 잔기의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양을 발현하도록 구성된다. 배양 시간 및 조건 및 수산화효소의 양 또는 활성은 수산화의 양을 제어하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 발명의 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 또는 다른 효모 숙주 세포를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 75%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 갖는 재조합 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 벡터는 프롤린 잔기의 75%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양을 발현하도록 구성된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 콜라겐을 제조하기에 적합한 시간 동안 및 이러한 조건 하에 본 발명의 벡터를 함유하는 피치아 파스토루스 또는 다른 효모 숙주 세포를 배양하는 단계 및 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 수산화된 이의 프롤린 잔기의 75%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과를 갖는 재조합 III형 콜라겐을 제조하는 방법이고, 상기 벡터는 프롤린 잔기의 75%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과 또는 이것 초과를 수산화시키는 프롤릴-4-수산화효소의 양을 발현하도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 재조합 콜라겐이다. 이러한 재조합 콜라겐은 수산화된 이의 프롤린 또는 라이신 잔기 수산화를 갖지 않거나, 수산화된 프롤린, 라이신 또는 프롤린 및 라이신 잔기의 0% 초과, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 가질 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 콜라겐을 포함하거나 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 생체조직제조된 가죽 또는 다른 재료이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 수산화 콜라겐 및 비수산화 콜라겐을 생성하기에 유용한 효모 숙주 세포에서의 키메라 DNA 서열을 제공한다. 키메라 DNA 서열은 비변형된 DNA 서열 및 변형된 DNA 서열을 조합함으로써 생성된다. 비변형된 DNA 서열은 다양한 염기 쌍 위치에서 절단될 수 있다. 변형된 DNA 서열은 상응하는 염기 쌍 위치에서 또한 절단될 수 있다. 비변형된 절단 및 변형된 절단은 앞에서 뒤로 및 뒤에서 앞으로 조합될 수 있다. 키메라 DNA 서열은 상기로부터 촉진자, 벡터, 종결자 및 선택 마커와 조합되고 숙주로 삽입되어서, 수산화 콜라겐 및 비수산화 콜라겐을 생성할 수 있는 효모를 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
(ⅰ) 효모의 균주; 및 (ⅱ) 콜라겐에 대한 DNA 서열; 콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열; 콜라겐 종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열; 박테리아에 대한 것 및 효모에 대한 것으로부터 선택된 복제 기원에 대한 DNA 서열; 및 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 포함하는, 효모의 균주로 삽입된, 벡터를 포함하는, 비수산화 콜라겐을 생성하도록 유전자 조작된 효모의 균주. 이 실시형태에서, 효모의 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 실시형태에서, 벡터는 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜라겐에 대한 DNA 서열을 함유할 수 있다. 이 실시형태에서, 콜라겐에 대한 DNA 서열은 네이티브 콜라겐 DNA, 조작된 콜라겐 DNA 및 코돈 변형된 콜라겐 DNA로부터 선택될 수 있다.
이 실시형태에서, 촉진자에 대한 DNA 서열은 AOX1 메탄올 유도된 촉진자에 대한 DNA, pDF 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, pCAT 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 선택 마커는 이 실시형태에서 항생제 내성에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어 항생제 내성은 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제일 수 있다.
상기 실시형태에 기재된 바와 같은 효모 균주는 전기천공, 화학 형질전환 및 메이팅으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 통해 효모로 삽입된 벡터를 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (ⅰ) 상기 실시형태에 의해 기재된 바와 같은 효모의 균주를 제공하는 단계; 및 (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 균주를 성장시키는 단계를 포함하는 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 효모는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나, 배지는 완충 글라이세롤 복합 배지(BMGY), 완충 메탄올 복합 배지(BMMY) 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 효모 균주는 24, 48, 또는 72의 범위의 시간 기간 동안 또는 임의의 중간 시간 기간 동안 배양되거나 재배될 수 있다. 이 방법에서, 효모 균주는 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜라겐에 대한 DNA 서열을 발현할 수 있다. 이 방법에서, 효모 균주에서의 촉진자에 대한 DNA 서열은 pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나, 선택 마커는 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (ⅰ) 효모의 균주 및 (ⅱ) 콜라겐에 대한 DNA 서열; 콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열; 종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열; 박테리아 및/또는 효모에 대한 복제 기원에 대한 DNA 서열; 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 함유하는, 효모의 균주로 삽입된, 벡터; 및 (ⅲ) P4HA1에 대한 DNA 서열; P4HB에 대한 DNA 서열; 및 촉진자에 대한 적어도 하나의 DNA 서열을 포함하는, 효모의 균주로 삽입된, 제2 벡터를 포함하는 수산화 콜라겐을 제조하도록 조작된 효모 유전자의 균주이다. 이 실시형태에서, 효모 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나, 효모 균주는 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜라겐에 대한 DNA 서열을 발현할 수 있다. 이 방법의 몇몇 실시형태에서, 콜라겐에 대한 DNA 서열은 네이티브 콜라겐 DNA, 조작된 콜라겐 DNA 및 변형된 콜라겐 DNA로부터 선택되고/되거나, 촉진자에 대한 DNA 서열은 AOX1 메탄올 유도된 촉진자에 대한 DNA, pDF 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, pCAT 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 효모의 균주에서, 촉진자에 대한 DNA 서열은 pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나, 선택 마커에 대한 DNA 서열은 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항생제 내성 유전자 또는 DNA의 몇몇 예는 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제에 대한 내성을 포함하지만, 다른 공지된 항생제 내성 유전자를 또한 사용할 수 있다. 벡터는 전기천공, 화학 형질전환 및 메이팅으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 통해 효모 균주로 삽입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 바와 같은 효모의 균주를 제공하는 단계 및 (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 균주를 성장시키는 단계를 포함하는 수산화 콜라겐을 제조하는 방법이다. 효모의 균주는 칸디다, 코마타가엘라, 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 효모 균주에 의해 발현된 콜라겐 DNA는 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 또는 이들의 조합을 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나, 배지는 BMGY, BMMY 및 YPD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 효모 균주는 약 24시간, 48시간 또는 72시간의 범위의 기간 동안 배양되거나 재배될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자에 대한 DNA는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 선택 마커에 대한 DNA는 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (ⅰ) 발현될 때 콜라겐, 촉진자 및 종결자를 생성하는 DNA; (ⅱ) 촉진자 및 종결자를 포함하는, P4HA1 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수산화 효소에 대한 적어도 하나의 DNA; (ⅲ) 촉진자 및 종결자를 포함하는, 선택 마커에 대한 적어도 하나의 DNA; (ⅳ) 효모 및 박테리아에 대한 복제 기원에 대한 적어도 하나의 DNA; (ⅴ) 게놈으로의 통합을 위한 효모 게놈에 대한 상동성을 갖는 하나 이상의 DNA; 및 (ⅳ) 모듈식 클로닝을 허용하는, 5', 3', 상기 DNA 내 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 올-인-원 벡터에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 올-인-원 벡터는 발현될 때 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜라겐을 생성하는 하나 이상의 DNA 서열을 함유할 것이다.
올-인-원 벡터는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 촉진자를 포함할 수 있고, 선택 마커, 예컨대 항생제 내성 및/또는 영양요구성 마커에 대한 하나 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 항생제 내성 마커는 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제에 대한 내성을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 키메라 콜라겐 DNA의 전체 길이를 기준으로 최적화된 DNA의 10%, 20%, 30% 내지 40% 또는 60%, 70%, 80% 내지 90%를 함유하는 키메라 콜라겐 DNA 서열에 관한 것이다. 이 키메라 콜라겐 DNA 서열에서, 최적화된 DNA는 C 말단에서 기원할 수 있거나, 최적화된 DNA는 N 말단에서 기원할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 콜라겐에 대한 DNA 서열; 콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열; 종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열; 박테리아 및/또는 효모에 대한 복제 기원에 대한 DNA 서열; 및 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 콜라겐 생성 효모의 균주에 관한 것이다. 이 실시형태에서, 효모의 균주는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 촉진자에 대한 DNA를 함유할 수 있다. 효모의 균주는 적어도 하나의 항생제 내성을 코딩하는 DNA 및 적어도 하나의 영양요구성 마커를 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 선택 마커를 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 바와 같은 효모의 균주를 제공하는 단계; 및 (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 균주를 성장시키는 단계를 포함하는 수산화 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 실시형태에서, 효모의 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 배지는 완충 글라이세롤 복합 배지, 완충 메탄올 복합 배지 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 배양 또는 재배 시간은 24시간, 48시간 또는 72시간의 범위일 수 있다. 이 방법의 몇몇 실시형태에서, 효모의 균주는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 촉진자를 포함한다. 이 방법의 다른 실시형태에서, 효모의 균주는 항생제 내성을 코딩하는 DNA 및 영양요구성 마커를 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 예시한다. 본 발명의 범위는 이 실시예에 기재된 세부사항으로 제한되지 않는다.
실시예 1
피치아 파스토리스 균주 BG10(야생형)을 ATUM(이전에 DNA 2.0)으로부터 얻었다. 콜라겐 서열 및 벡터를 포함하는 MMV 63(서열 번호 11)("서열 9") DNA 서열을 균주 PP28을 생성시키는 야생형 피치아 파스토리스로 삽입하였다. MMV63을 Pme I에 의해 분해하고, PP1(야생형 피치아 파스토리스 균주)로 형질전환시켜 PP28을 생성시켰다. 벡터 MMV63은 도 1에 도시되어 있다.
네이티브 III형 소 콜라겐을 코딩하는 DNA를 서열분석하고(서열 번호 1), 서열을 중합효소 연쇄 반응 "PCR" 프로토콜에 의해 증폭시켜 선형 DNA 서열을 생성하였다.
DNA를 피치아 전기천공 프로토콜(Bio-Rad Gene Pulser Xcell(상표명) Total System #1652660)을 이용하여 DNA 2.0으로부터 야생형 피치아 효모 세포(PP1)로 형질전환시켰다. 효모 세포를 Hygro 플레이트에 대해 선택된 P4HA/B 동시발현 플라스미드 및 형질전환체(예를 들어, 클론 #4)(200㎍/㎖)에 의해 형질전환시켰다.
클론 #4의 단일 콜로니를 100㎖의 YPD 배지 중에 접종하고, 215rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 배양물이 OD600 ~ 3.5(약 3 내지 5 X 107개 세포/OD600)에 도달할 때, 이것을 새로운 YPD에 의해 OD600 ~ 1.7로 희석하고, 215rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 또 다른 시간 동안 성장시켰다.
이후, 세포를 3,500g에서 5분 동안 스핀 다운하고, 물에 의해 1회 세척하고, 10㎖의 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM LiAc, 10mM DTT(새로 첨가됨) 및 0.6M 소르비톨 중에 재현탁시켰다.
각각의 형질전환에 대해, 8 X 108개 세포의 분취량을 8㎖의 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM LiAc, 10mM DTT, 0.6M 소르비톨에 위치시키고, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다.
세포를 5000g에서 5분 동안 스핀 다운하고, 아주 차가운 1.5㎖의 1M 소르비톨에 의해 3회 세척하고, 80㎕의 아주 차가운 1M 소르비톨 중에 재현탁시켰다.
다양한 양(약 5㎍)의 선형화된 DNA를 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하였다.
세포 및 DNA 혼합물(80 내지 100㎕)을 0.2㎝ 큐벳에 첨가하고, 1500v, 25uF 및 200Ω에서 피치아에 대해 프로토콜에 따라 펄스화하였다.
이후, 이것을 YPD 및 1M 소르비톨(1:1)의 1㎖의 혼합물로 즉시 옮기고, 2시간 초과 동안 30℃에서 항온처리하였다.
세포를 상이한 밀도에서 플레이팅하였다.
단일 콜로니를 24 딥웰 플레이트에서 2㎖의 BMGY 배지로 접종하고, 900rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 적어도 48시간 동안 성장시켰다. 생성된 세포를 하기 절차에 따라 세포 용해, SDS-page 및 펩신 검정을 이용하여 콜라겐에 대해 시험하였다.
효모 세포를 1분 동안 계속해서 30Hz의 속도에서 Qiagen TissueLyser를 사용하여 1x 용해 완충제 중에 용해시켰다. 용해 완충제를 2.5㎖의 1M HEPES(최종 농도 50mM)로부터 제조하였다; 438.3㎎ NaCl; 최종 농도 150mM; 5㎖ 글라이세롤; 최종 농도 10%; 0.5㎖ Triton X-100; 최종 농도 1%; 및 42㎖ Millipure 물.
용해된 세포를 테이블탑 원심분리기에서 15분 동안 2,500rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 보유하고, 펠렛을 버렸다.
SDS-PAGE. 2-머캅토에탄올의 존재 하에 SDS-PAGE를 상청액, 분자량 마커, 음성 대조군 및 양성 대조군에서 수행하였다. 전기천공 후, 겔을 제거하고, 쿠마시 블루에 의해 염색하고, 이후 물 중에 탈염색하였다.
펩신 검정. 펩신 검정을 하기 절차에 의해 수행하였다:
펩신 처리 전에 Thermo Scientific 프로토콜에 따라 각각의 샘플의 전체 단백질을 얻기 위한 BCA 검정을 수행하였다. 전체 단백질의 양을 모든 샘플에 대해 0.5㎎/㎖ 이상에서의 최저 농도로 정규화하였다. 용리물의 100㎕의 샘플을 마이크로원심분리기 관에 위치시켰다. 하기를 함유하는 마스터 믹스를 제조하였다: 탈이온수 중의 1mg/㎖에서의 37% HCl(100㎕당 0.6㎕의 산) 및 펩신 스톡. 첨가된 펩신의 양은 1:25 비율의 펩신:전체 단백질(중량:중량)이었다.
펩신의 첨가 후, 샘플을 피펫에 의해 3회 혼합하고, 펩신 반응이 일어나도록 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 1시간 후, β-머캅토에탄올을 함유하는 LDS 로딩 완충제의 1:1 용적을 각각의 샘플에 첨가하고, 70℃에서 7분 동안 항온처리되게 하였다. 항온처리 후, 샘플을 14,000rpm에서 1분 동안 스핀하여 혼탁도를 제거하였다.
이후, 샘플의 상부로부터의 18㎕를 TAE 완충제를 사용하여 3% 내지 8% TAE에 첨가하고, 150V에서 1시간 10분 동안 겔에서 수행하였다. 하기 표 1은 결과를 보고한다.
실시예 2
실시예 1을 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 피치아(서열 번호 3)("서열 2")에서의 발현을 증가시키도록 변형된 소 콜라겐 서열을 포함하는 DNA MMV77(서열 번호 12)("서열 10") 서열을 효모로 삽입하였다. pAOX1 촉진자(서열 번호 5)("서열 3")를 사용하여 콜라겐 서열의 발현을 추진하였다. 500㎍/㎖에서의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트를 사용하여 성공적인 형질전환체를 선택하였다. 생성된 균주는 PP8이었다. 벡터 MMV77은 도 2에 도시되어 있다. Pme I를 사용하여 제한 분해를 수행하였다. 균주를 BMMY 배지에서 성장시키고, 콜라겐에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 3
실시예 1을 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 피치아 발현을 증가시키도록 변형된 소 콜라겐 서열을 포함하는 DNA MMV-129(서열 번호 13)("서열 11") 서열을 효모로 삽입하였다. pCAT 촉진자(서열 번호 9)("서열 7")를 사용하여 콜라겐 서열의 발현을 추진하였다. 500㎍/㎖에서의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트를 사용하여 성공적인 형질전환체를 선택하였다. 생성된 균주는 PP123이었다. MMV129를 Swa I에 의해 분해하고, PP1로 형질전환시켜 PP123을 생성시켰다. 벡터 MMV129는 도 3에 도시되어 있다. 균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 4
실시예 1을 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 피치아에서의 발현을 증가시키도록 변형된 소 Col3A1(III형) 콜라겐 서열(서열 번호 3)("서열 2")을 포함하는 DNA MMV-130(서열 번호 14)("서열 12") 서열을 효모로 삽입하였다. 서열 번호 8("서열 6")에 기재된 pDF 촉진자를 사용하여 콜라겐 서열의 발현을 추진하였다. Pme I에 의해 절단된 AOX1 랜딩 패드(서열 번호 10)("서열 8")를 사용하여 피치아 게놈으로의 벡터의 부위 특이적 통합을 수월하게 하였다. 500㎍/㎖에서의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트를 사용하여 성공적인 형질전환체를 선택하였다. 생성된 균주는 PP153이라 지칭된다. MMV130을 Pme I에 의해 분해하고, PP1로 형질전환시켜 PP153을 생성시켰다. 변형된 소 col3A1 서열은 서열 번호 3("서열 2")에 의해 기재된다.
PureLink PCR 정제 키트를 페놀 추출 대신에 사용하여 선형화된 DNA를 회수하였다. 균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 5
실시예 2를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 최적화된 소 P4HA(서열 번호 6)("서열 4") 및 소 P4HB(서열 번호 7)("서열 5") 서열을 함유하는 MMV-78(서열 번호 15)("서열 13")인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. MMV78을 Pme I에 의해 분해하고, PP1로 형질전환시켜 PP8을 생성시켰다. P4HA 및 P4HB 둘 다는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, Das1-Das2 이방향성 촉진자(서열 번호 27)("서열 24")에 의해 추진되었다. DNA를 Kpn I에 의해 분해하고, PP8로 형질전환시켜 PP3을 생성시켰다. 벡터 MMV78은 도 5에 도시되어 있다. 균주를 BMMY 배지에서 성장시키고, 콜라겐 및 수산화에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 6
실시예 2를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 소 P4HA 및 소 P4HB 서열 둘 다를 함유하는 MMV-78인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. P4HA 및 P4HB 둘 다는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, Das1-Das2 이방향성 촉진자에 의해 추진되었다. DNA를 Kpn I에 의해 분해하고, PP8로 형질전환시켜 PP3을 생성시켰다.
pAOX1 촉진자에 의해 추진된 P4HB를 함유하는 MMV-94(서열 번호 16)("서열 14")인 또 다른 벡터를 사용하고, 또한 효모로 삽입하였다. P4HB의 내인성 신호 펩타이드를 PHO1 신호 펩타이드에 의해 대체하였다. 생성된 균주는 PP38이었다. MMV94를 Avr II에 의해 분해하고, PP3으로 형질전환시켜 PP38을 생성시켰다. 벡터 MMV94는 도 6에 도시되어 있다. 균주를 BMMY 배지에서 성장시키고, 콜라겐 및 수산화에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 7
실시예 4를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 소 P4HA 및 소 P4HB 서열 둘 다를 함유하는 MMV-156(서열 번호 17)("서열 15")인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. P4HA는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, P4HB 신호 서열을 알파-인자 Pre(서열 번호 23)("서열 21") 서열에 의해 대체하였다. 유전자 둘 다는 pHTX1 이방향성 촉진자(서열 번호 26)("서열 25")에 의해 추진되었다. MMV156을 Bam HI에 의해 분해하고, PP153으로 형질전환시켜 PP154를 생성시켰다. 벡터 MMV156은 도 7에 도시되어 있다. 균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐 및 수산화에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 8
실시예 4를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 소 P4HA 및 소 P4HB 서열 둘 다를 함유하는 MMV-156인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. P4HA는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, P4HB 신호 서열을 알파-인자 Pre 서열에 의해 대체하였다. 유전자 둘 다는 pHTX1 이방향성 촉진자에 의해 추진되었다. DNA를 Swa I에 의해 분해하고, PP153으로 형질전환시켜 PP154를 생성시켰다.
P4HA 및 P4HB 둘 다를 함유하는 MMV-191(서열 번호 18)("서열 16")인 또 다른 벡터를 또한 효모로 삽입하였다. P4HA의 추가의 카피는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, P4HB의 추가의 카피의 신호 서열을 알파-인자 Pre-Pro(서열 번호 24)("서열 22") 서열에 의해 대체하였다. P4HA 및 P4HB의 추가의 카피는 pGCW14-GAP1 이방향성 촉진자(서열 번호 25)("서열 23")에 의해 추진되었다. MMV191을 Bam HI에 의해 분해하고, PP154로 형질전환시켜 PP268을 생성시켰다. 벡터 MMV191은 도 8에 도시되어 있다. 균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐 및 수산화에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
실시예 9
실시예 1의 방법 및 절차를 이용하여 올-인-원 벡터를 생성하였다. 올-인-원 벡터는 콜라겐 및 연관된 촉진자 및 종결자의 DNA, 콜라겐 및 연관된 촉진자 및 종결자를 수산화시키는 효소를 위한 DNA, 마커 발현 및 연관된 촉진자 및 종결자를 위한 DNA, 박테리아 및 효모를 위한 복제 기원(들)을 위한 DNA 및 통합을 위한 효모 게놈에 대한 상동성을 갖는 DNA(들)를 함유한다. 올-인-원 벡터는 전략적으로 배치된 고유한 제한 부위 5', 3', 또는 상기 성분 내를 함유한다. 콜라겐 발현 또는 다른 벡터 성분에 대한 임의의 변형이 원해질 때, 선택 성분에 대한 DNA는 제한 효소에 의해 쉽게 절제되고, 사용자의 선택된 클로닝 방법에 의해 대체될 수 있다. 올-인-원 벡터 MMV208(서열 번호 19)("서열 17")의 가장 단순한 버전은 수산화효소 효소에 대한 촉진자(들)를 제외하고 상기 성분 모두를 함유한다. 벡터 MMV208을 하기 성분을 사용하여 제조하였다: MMV84(서열 번호 20)("서열 18")로부터의 AOX 상동성, MMV150(서열 번호 21)("서열 19")으로부터의 리보솜 상동성, MMV140(서열 번호 22)("서열 20")으로부터의 박테리아 및 효모 복제 기원, MMV140으로부터의 제오신 마커 및 MMV129로부터의 Col3A1. P4HA 및 B 및 연관된 종결자의 변형된 버전을 Genscript로부터 합성하여 하기 제한 부위를 제거하였다: AvrII, NotI, PvuI, PmeI, BamHI, SacII, SwaI, XbaI, SpeI. 벡터를 균주 PP1로 형질전환시켰다.
균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐 및 수산화에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 기재된다.
표 1은 g/ℓ 단위로 생성된 콜라겐의 양, 및 수산화 콜라겐의 백분율을 기재한다. 겔을 쿠마쉬 블루 염료에 의해 염색하고, 콜라겐 함량에 대해 표준 곡선에 대해 결과를 비교함으로써 발현된 콜라겐의 양을 정량화하였다. 1:25 펩신 처리 후 샘플 밴드를 표준 밴드와 비교함으로써 수산화 콜라겐의 양을 결정하였다. 피치아에 의한 수산화 콜라겐의 발현이 유리한데, 왜냐하면 수산화 콜라겐은 콜라겐 폴리펩타이드를 추가로 가공 처리하는 데 필요한 펩신의 높은 농도에서 안정하기 때문이다.
Figure pat00001
실시예 1 및 2에서의 데이터는 III형 소 콜라겐 서열의 코돈 변형이 피치아에 의해 발현된 콜라겐의 양을 배가시킨다는 것을 보여준다. 실시예 2 및 3으로부터의 데이터의 비교는 III형 소 콜라겐의 발현이 pCAT 촉진자를 갖는 III형 콜라겐 코딩 서열의 전사를 추진시킴으로써 5의 인수로 추가로 증가한다는 것을 보여준다. 실시예 2 및 4로부터의 데이터의 비교는 소 III형 콜라겐 발현이 pDF 촉진자를 갖는 III형 콜라겐 코딩 서열의 전사를 추진시키고, 피치아의 게놈 DNA로의 벡터의 통합을 수월하게 하도록 AOX1 랜딩 패드를 제공함으로써 10배 내지 15배 증가한다는 것을 보여준다. 실시예 2 및 5 및 6으로부터의 데이터의 비교는 프롤린 수산화효소(P4HA + P4HB)에 대한 코딩 서열에 의한 피치아의 형질전환이 수산화 콜라겐을 생성시키고, 프롤린 수산화효소의 발현을 추가로 조절함으로써 수산화 콜라겐의 양이 증가할 수 있다는 것을 보여준다. 실시예 7 내지 9는 콜라겐 발현이 5배 내지 15배 부스팅될 수 있고, 수산화 콜라겐의 양이 2개의 벡터를 도입함으로써 또는 올-인-원 벡터 접근법(여기서, 콜라겐 및 수산화효소 서열 둘 다는 동일한 벡터에 의해 코딩됨)에 의해 증가한다는 것을 보여준다.
실시예 10
실시예 1의 방법 및 절차를 이용하여 키메라 Col3A1 벡터를 생성하였다. 벡터 MMV132는 키메라 콜라겐 및 연관된 촉진자 PDF 및 종결자 AOX1TT의 DNA, 마커 발현 및 연관된 촉진자 및 종결자에 대한 DNA, 박테리아 및 효모에 대한 복제 기원(들)에 대한 DNA 및 통합을 위한 효모 게놈에 대한 상동성을 갖는 DNA(들)를 포함하도록 변형되었다. 벡터 MMV63은 비변형된 Col3A1 도메인에 대한 소스 DNA이다. 벡터 MMV128(도 21)은 변형된 Col3A1 도메인에 대한 소스 DNA이다. Col3A1 폴리펩타이드의 전체 길이는 1465개의 아미노산(aa)이다. 플라스미드는 네이티브 소 DNA 서열(비변형된) 및 피치아 파스토리스 코돈 변형된 DNA 서열을 도입하도록 설계되었다. 플라스미드는 Col3A1의 변형된 서열과 비변형된 서열 사이의 전이가 710번, 1,200번 및 1,331번 aa에 있도록 설계되었다. 이들 방법은 플라스미드 MMV193, MMV194, MMV195, MMV197, MMV198 및 MMV199를 생성하도록 사용되었다. 생성된 플라스미드 벡터는 비교를 위해 완전히 최적화된 플라스미드 MMV130 및 완전히 비최적화된 플라스미드 MMV200(도 20)에 의해 하기 표 2에 기재된다.
Figure pat00002
실시예 11
실시예 2를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: PP1 및 PP97을 얻었다. PP97은 2개의 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)가 숙주 균주로부터 넛아웃된 균주이었다. 피치아 발현을 위해 변형된 및 비변형된 소 콜라겐 서열 DNA의 상이한 조합을 포함하는 DNA MMV194, MMV195, MMV130 및 MMV200 서열을 효모로 삽입하였다. pDF 촉진자를 사용하여 콜라겐 서열의 발현을 추진하였다. 500㎍/㎖에서의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트를 사용하여 성공적인 형질전환체를 선택하였다. Swa I를 사용하여 제한 분해를 수행하여 통합을 위해 DNA를 선형화시키고, Pme1 및 200ng의 DNA에 의해 분해된 MMV130을 형질전환시킨다는 것을 제외하고 3 내지 5㎍의 절단된 DNA를 벡터에 대해 형질전환시켰다. 생성된 균주는 하기 표 3에 기재된다.
Figure pat00003
실시예 12
실시예 7을 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 소 P4HA 및 소 P4HB 서열 둘 다를 함유하는 MMV-156인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. P4HA는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, P4HB 신호 서열을 알파-인자 Pre 서열에 의해 대체하였다. 유전자 둘 다는 pHTX1 이방향성 촉진자에 의해 추진되었다. DNA를 BamHI에 의해 분해하고 형질전환시켰다. 균주 및 형질전환 정보에 대해 표 4를 참조한다.
Figure pat00004
실시예 13
실시예 8을 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 용해 완충제를 50mM Na2PO4, 1mM EDTA, 5% 글라이세롤, 및 아세트산에 의해 7.4로 조정된 pH에 의해 제조하였다. P4HA 및 P4HB 둘 다를 함유하는 MMV-191인 또 다른 벡터를 또한 효모로 삽입하였다. P4HA의 추가의 카피는 이의 내인성 신호 펩타이드를 함유하고, P4HB의 추가의 카피의 신호 서열을 알파-인자 Pre-Pro 서열에 의해 대체하였다. P4HA 및 P4HB의 추가의 카피는 pGCW14-GAP1 이방향성 촉진자에 의해 추진되었다. DNA를 BamHI에 의해 분해하고 형질전환시켰다. 형질전환 및 새로운 균주 정보에 대해 표 5를 참조한다. 균주를 BMGY 배지에서 성장시키고, 콜라겐에 대해 시험하였다.
Figure pat00005
실시예 14
실시예 2를 하기 변경에 의해 동일한 절차 및 프로토콜에 따라 반복하였다: 소 P4HA 및 소 P4HB 서열 둘 다를 함유하는 MMV-78인 하나의 DNA 벡터를 효모로 삽입하였다. P4HA 및 P4HB는 Das1-Das2 이방향성 촉진자에 의해 추진되었다. DNA를 Kpn I에 의해 분해하고, PP8로 형질전환시켜 서열 번호 3("서열 2")의 콜라겐 서열을 함유하는 PP3을 생성시켰다. pAOX1 촉진자에 의해 추진된 P4HB를 함유하는 MMV-94(서열 번호 16)("서열 14")인 또 다른 벡터를 사용하고, 또한 효모로 삽입하였다. P4HB의 내인성 신호 펩타이드를 PHO1 신호 펩타이드에 의해 대체하였다. 생성된 균주는 PP38이었다.
24 딥웰 플레이트를 각각의 웰에서 2㎖의 YPD에 의해 충전하고, 균주 PP38의 단일 콜로니를 접종하였다. 콜로니를 900rpm에서 진탕시키면서 24시간 동안 YPD 중에 성장시켰다. 세포를 3,000rpm에서 5분 동안 스핀 다운하고, 상청액을 제거하였다. 메탄올 비함유 유도를 위해, 상청액을 2㎖의 BMGY(1%)에 의해 대체하고, 또 다른 48시간 동안 성장시켰다. 메탄올 유도를 위해, 메탄올을 최종 농도 0.5%로 첨가하고, 세포를 24시간 동안 성장시켰다. 메탄올을 다시 첨가하고, 세포를 또 다른 24시간 동안 성장시켰다. 유도의 종료 시, 분석을 위해 1㎖의 샘플을 제거하였다.
실시예 1에 기재된 쿠마쉬 염색 및 SDS-PAGE를 사용하여 콜라겐에 대해 샘플을 시험하였다. 메탄올 비함유 유도 샘플에 대한 밴드는 메탄올 유도된 샘플에 대한 밴드보다 더 어두워서, 메탄올 비함유 유도 샘플이 발현된 콜라겐의 더 높은 농도를 갖는다는 것을 보여준다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "최적화된" 또는 "최적화한다"와 같은 용어는 키메라 DNA 작제물의 특징 또는 다른 중요한 공정 변수의 조심스런 선택에 의해 실현된 값 또는 특징을 포함하고, 공지된 결과-유효 변수의 사용을 의미하지 않는다.
본 명세서에 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용된 표제(예컨대, "배경기술" 및 "발명의 내용") 및 하위표제는 오직 본 발명 내의 주제의 일반 체계화를 위해 의도되고, 본 발명의 개시내용 또는 이의 임의의 양태를 제한하도록 의도되지 않는다. 특히, "배경기술"에 개시된 대상은 신규한 기술을 포함할 수 있고, 선행 기술의 인용을 구성하지 않을 수 있다. "발명의 내용"에 개시된 대상은 기술의 전체 범위의 배타적이거나 완전한 개시내용 또는 이의 임의의 실시형태가 아니다. 특정한 유용성을 갖는 것으로 본 명세서의 부문 내의 재료의 분류 또는 토의는 편의를 위해 이루어지고, 이것이 임의의 소정의 조성물에서 사용될 때 반드시 또는 오로지 본 명세서에서의 이의 분류에 따라 기능하지 않아야 한다는 추론이 도출되지 않아야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 단수 형태 "하나", "일" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 표시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "및/또는"은 연관된 기재된 항목의 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함하고, "/"로 축약될 수 있다.
링크는 "www" 앞의 스페이스 또는 밑줄 친 스페이스의 삽입에 의해 비활성화되고, 스페이스의 제거에 의해 재활성화될 수 있다.
예에서 사용되는 것을 포함하여, 명확히 달리 기재되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 본 명세서에 사용된 바대로, 모든 숫자는 그 용어가 명확히 나타내지 않는 경우에도 단어 "실질적으로", "약" 또는 "대략"이 앞에 있는 것처럼 읽혀질 수 있다. 구절 "약" 또는 "대략"은 기재된 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합당한 예상된 범위 내에 있다는 것을 나타내도록 규모 및/또는 위치를 기재할 때 사용될 수 있다. 예를 들어, 숫자 값은 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±0.1%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±1%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±2%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±5%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±10%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±15%, 기재된 값(또는 값의 범위)의 ±20% 등인 값을 가질 수 있다. 본 명세서에서 기재된 임의의 숫자 범위는 여기에 포함된 모든 하위범위를 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 상황 하에 소정의 이익을 제공하는 기술의 실시형태를 의미한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에 다른 실시형태가 또한 바람직할 수 있다. 더구나, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 언급은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않고, 기술의 범위로부터 다른 실시형태를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에 언급된 바대로, 모든 조성 백분율은 달리 기재되지 않는 한 전체 조성물의 중량을 기준으로 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포함한다" 및 이의 변형어는 비제한적인 것으로 의도되어서, 목록에서의 항목의 언급은 이 기술의 재료, 조성물, 장치 및 방법에서 또한 유용할 수 있는 다른 유사한 항목의 배제가 아니다. 유사하게, 용어 "할 수 있다" 및 "일 것이다" 및 이의 변형어는 비제한적인 것으로 의도되어서, 실시형태가 소정의 구성요소 또는 특징부를 포함할 수 있거나 포함할 것이라는 언급은 이 구성요소 또는 특징부를 함유하지 않는 본 발명의 다른 실시형태를 배제하지 않는다.
용어 "제1" 및 "제2"는 다양한 특징부/구성요소(단계 포함)를 기술하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있지만, 이 특징부/구성요소는, 문맥이 달리 표시하지 않는 한, 이들 용어에 의해 제한되지 않아야 한다. 이들 용어는 하나의 특징부/구성요소를 또 다른 특징부/구성요소로부터 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하기 기재된 제1 특징부/구성요소는 제2 특징부/구성요소라 불릴 수 있고, 유사하게, 하기 기재된 제2 특징부/구성요소는 본 발명의 교시내용으로부터 벗어나지 않으면서 제1 특징부/구성요소라 불릴 수 있다.
"밑에", "아래에", "하부", "위에", "상부" 등과 같은 공간상 상대적인 용어는 도면에 예시된 바와 같은 또 다른 구성요소(들) 또는 특징부(들)에 대한 하나의 구성요소 또는 특징부의 관계식을 기술하기 위해 서술의 편의를 위해 본 명세서에서 사용될 수 있다. 공간상 상대적인 용어는 도면에 도시된 배향 이외에 사용 또는 조작 시 장치의 상이한 배향을 포함하도록 의도되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서의 장치가 뒤집혀 있을 때, 다른 구성요소 또는 특징부 "아래에" 또는 "밑에"로 기재된 구성요소는 이후 다른 구성요소 또는 특징부 "위에" 배향될 것이다. 따라서, 예시적인 용어 "밑에"는 위의 또는 밑의 배향 둘 다를 포함할 수 있다. 장치는 달리 배향(90° 또는 다른 배향으로 회전)될 수 있고, 본 명세서에 사용된 공간상 상대적인 기술자는 이렇게 해석될 수 있다. 유사하게, 용어 "상향으로", "하향으로", "수직", "수평" 등은, 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 오직 설명의 목적을 위해 본 명세서에 사용된다.
특징부 또는 구성요소가 본 명세서에서 또 다른 특징부 또는 구성요소"에 있는" 것으로 기재될 때, 이것은 직접적으로 다른 특징부 또는 구성요소에 있을 수 있거나, 개재하는 특징 및/또는 구성요소가 또한 존재할 수 있다. 반대로, 특징부 또는 구성요소가 또 다른 특징부 또는 구성요소에 "직접적으로 있는" 것으로 기재될 때, 개재하는 특징부 또는 구성요소가 존재하지 않는다. 특징부 또는 구성요소가 또 다른 특징부 또는 구성요소에 "연결된", "부착된" 또는 "커플링된" 것으로 기재될 때, 이것은 다른 특징부 또는 구성요소에 직접적으로 연결되거나, 부착되거나 커플링될 수 있거나, 개재하는 특징부 또는 구성요소가 존재할 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다. 반대로, 특징부 또는 구성요소가 또 다른 특징부 또는 구성요소에 "직접적으로 연결된", "직접적으로 부착된" 또는 "직접적으로 커플링된" 것으로 기재될 때, 개재하는 특징부 또는 구성요소가 존재할 수 없다. 일 실시형태와 관련하여 기재되거나 표시되어 있지만, 이렇게 기재되거나 표시된 특징부 및 구성요소는 다른 실시형태에 적용될 수 있다. 또 다른 특징부에 "인접하게" 배치된 구조 또는 특징부의 언급이 인접한 특징부를 중첩시키거나 이의 기저가 되는 부분을 가질 수 있는 것으로 당해 분야의 숙련자에 의해 또한 이해될 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 같이, 동일한 정도로 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되고, 참고에 의한 포함이 보이는 명세서의 동일한 문장, 문단, 페이지 또는 부문에 보이는 개시내용은 특별히 참고된다. 본 명세서에서의 참고문헌의 인용은 이 참고문헌이 선행 기술이거나 본 명세서에 개시된 기술의 특허능력에 대한 어떤 관련성을 갖는다는 인정을 구성하지 않는다. 인용된 참고문헌의 내용의 임의의 토의는 단지 참고문헌의 저자가 한 주장의 일반적인 요약을 제공하도록 의도되고, 이러한 참고문헌의 내용의 정확도에 관한 인정을 구성하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Modern Meadow <120> YEAST STRAINS AND METHODS FOR CONTROLLING HYDROXYLATION OF RECOMBINANT COLLAGEN <130> 515112US <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4401 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> CDS <222> (1)..(4401) <223> Collagen Sequence 1: cDNA sequence - unoptimized natural DNA sequence from cow <400> 1 atg atg agc ttt gtg caa aag ggg acc tgg tta ctt ttc gct ctg ctt 48 Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Thr Trp Leu Leu Phe Ala Leu Leu 1 5 10 15 cat ccc act gtt att ttg gca caa cag gaa gct gtt gac gga gga tgc 96 His Pro Thr Val Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Asp Gly Gly Cys 20 25 30 tcc cat ctc ggt cag tct tat gca gat aga gat gta tgg aaa cca gaa 144 Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu 35 40 45 ccg tgc caa ata tgc gtc tgt gac tca gga tcc gtt ctc tgt gat gac 192 Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp 50 55 60 ata ata tgt gac gac caa gaa tta gac tgc ccc aac cct gaa atc ccg 240 Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro 65 70 75 80 ttt gga gaa tgt tgt gca gtt tgc cca cag cct cca aca gct ccc act 288 Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr 85 90 95 cgc cct cct aat ggt caa gga cct caa ggc ccc aag gga gat cca ggt 336 Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly 100 105 110 cct cct ggt att cct ggg cga aat ggc gat cct ggt cct cca gga tca 384 Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ser 115 120 125 cca ggc tcc cca ggt tct ccc ggc cct cct gga atc tgt gaa tca tgt 432 Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys 130 135 140 cct act ggt ggc cag aac tat tct ccc cag tac gaa gca tat gat gtc 480 Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Glu Ala Tyr Asp Val 145 150 155 160 aag tct gga gta gca gga gga gga atc gca ggc tat cct ggg cca gct 528 Lys Ser Gly Val Ala Gly Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala 165 170 175 ggt cct cct ggc cca ccc gga ccc cct ggc aca tct ggc cat cct ggt 576 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly 180 185 190 gcc cct ggc gct cca gga tac caa ggt ccc ccc ggt gaa cct ggg caa 624 Ala Pro Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln 195 200 205 gct ggt ccg gca ggt cct cca gga cct cct ggt gct ata ggt cca tct 672 Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser 210 215 220 ggc cct gct gga aaa gat ggg gaa tca gga aga ccc gga cga cct gga 720 Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly 225 230 235 240 gag cga gga ttt cct ggc cct cct ggt atg aaa ggc cca gct ggt atg 768 Glu Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Met Lys Gly Pro Ala Gly Met 245 250 255 cct gga ttc cct ggt atg aaa gga cac aga ggc ttt gat gga cga aat 816 Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn 260 265 270 gga gag aaa ggc gaa act ggt gct cct gga tta aag ggg gaa aat ggc 864 Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly 275 280 285 gtt cca ggt gaa aat gga gct cct gga ccc atg ggt cca aga ggg gct 912 Val Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala 290 295 300 ccc ggt gag aga gga cgg cca gga ctt cct gga gcc gca ggg gct cga 960 Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg 305 310 315 320 ggt aat gat gga gct cga gga agt gat gga caa ccg ggc ccc cct ggt 1008 Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly 325 330 335 cct cct gga act gca gga ttc cct ggt tcc cct ggt gct aag ggt gaa 1056 Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu 340 345 350 gtt gga cct gca gga tct cct ggt tca agt ggc gcc cct gga caa aga 1104 Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg 355 360 365 gga gaa cct gga cct cag gga cat gct ggt gct cca ggt ccc cct ggg 1152 Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly 370 375 380 cct cct ggg agt aat ggt agt cct ggt ggc aaa ggt gaa atg ggt cct 1200 Pro Pro Gly Ser Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro 385 390 395 400 gct ggc att cct ggg gct cct ggg ctg ata gga gct cgt ggt cct cca 1248 Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Ile Gly Ala Arg Gly Pro Pro 405 410 415 ggg cca cct ggc acc aat ggt gtt ccc ggg caa cga ggt gct gca ggt 1296 Gly Pro Pro Gly Thr Asn Gly Val Pro Gly Gln Arg Gly Ala Ala Gly 420 425 430 gaa ccc ggt aag aat gga gcc aaa gga gac cca gga cca cgt ggg gaa 1344 Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Asp Pro Gly Pro Arg Gly Glu 435 440 445 cgc gga gaa gct ggt tct cca ggt atc gca gga cct aag ggt gaa gat 1392 Arg Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Glu Asp 450 455 460 ggc aaa gat ggt tct cct gga gaa cct ggt gca aat gga ctt cct gga 1440 Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly 465 470 475 480 gct gca gga gaa agg ggt gtg cct gga ttc cga gga cct gct gga gca 1488 Ala Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Ala 485 490 495 aat ggc ctt cca gga gaa aag ggt cct cct ggg gac cgt ggt ggc cca 1536 Asn Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Asp Arg Gly Gly Pro 500 505 510 ggc cct gca ggg ccc aga ggt gtt gct gga gag ccc ggc aga gat ggt 1584 Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly 515 520 525 ctc cct gga ggt cca gga ttg agg ggt att cct ggt agc ccc gga gga 1632 Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Arg Gly Ile Pro Gly Ser Pro Gly Gly 530 535 540 cca ggc agt gat ggg aaa cca ggg cct cct gga agc caa gga gag acg 1680 Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Thr 545 550 555 560 ggt cga ccc ggt cct cca ggt tca cct ggt ccg cga ggc cag cct ggt 1728 Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly 565 570 575 gtc atg ggc ttc cct ggt ccc aaa gga aac gat ggt gct cct gga aaa 1776 Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys 580 585 590 aat gga gaa cga ggt ggc cct gga ggt cct ggc cct cag ggt cct gct 1824 Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala 595 600 605 gga aag aat ggt gag acc gga cct cag ggt cct cca gga cct act ggc 1872 Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly 610 615 620 cct tct ggt gac aaa gga gac aca gga ccc cct ggt cca caa gga cta 1920 Pro Ser Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu 625 630 635 640 caa ggc ttg cct gga acg agt ggt ccc cca gga gaa aac gga aaa cct 1968 Gln Gly Leu Pro Gly Thr Ser Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro 645 650 655 ggt gaa cct ggt cca aag ggt gag gct ggt gca cct gga att cca gga 2016 Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly 660 665 670 ggc aag ggt gat tct ggt gct ccc ggt gaa cgc gga cct cct gga gca 2064 Gly Lys Gly Asp Ser Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Ala 675 680 685 gga ggg ccc cct gga cct aga ggt gga gct ggc ccc cct ggt ccc gaa 2112 Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu 690 695 700 gga gga aag ggt gct gct ggt ccc cct ggg cca cct ggt tct gct ggt 2160 Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly 705 710 715 720 aca cct ggt ctg caa gga atg cct gga gaa aga ggg ggt cct gga ggc 2208 Thr Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly 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Gly Pro Ala Gly Gly Ser 835 840 845 ggg cct gcc ggt ccc cca ggc ccc caa ggt gtc aaa ggc gaa cgt ggc 2592 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly 850 855 860 agt cct ggt ggt cct ggt gct gct ggc ttc ccc ggt ggt cgt ggt cct 2640 Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Gly Arg Gly Pro 865 870 875 880 cct ggc cct cct ggc agt aat ggt aac cca ggc ccc cca ggc tcc agt 2688 Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ser 885 890 895 ggt gct cca ggc aaa gat ggt ccc cca ggt cca cct ggc agt aat ggt 2736 Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly 900 905 910 gct cct ggc agc ccc ggg atc tct gga cca aag ggt gat tct ggt cca 2784 Ala Pro Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ser Gly Pro 915 920 925 cca ggt gag agg gga gca cct ggc ccc cag ggc cct ccg gga gct cca 2832 Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro 930 935 940 ggc cca cta gga att gca gga ctt act gga gca cga ggt ctt gca ggc 2880 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Leu Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly 945 950 955 960 cca cca ggc atg cca ggt gct agg ggc agc ccc ggc cca cag ggc atc 2928 Pro Pro Gly Met Pro Gly Ala Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Ile 965 970 975 aag ggt gaa aat ggt aaa cca gga cct agt ggt cag aat gga gaa cgt 2976 Lys Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Pro Ser Gly Gln Asn Gly Glu Arg 980 985 990 ggt cct cct ggc ccc cag ggt ctt cct ggt ctg gct ggt aca gct ggt 3024 Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly 995 1000 1005 gag cct gga aga gat gga aac cct gga tca gat ggt ctg cca ggc 3069 Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly 1010 1015 1020 cga gat gga gct cca ggt gcc aag ggt gac cgt ggt gaa aat ggc 3114 Arg Asp Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly 1025 1030 1035 tct cct ggt gcc cct gga gct cct ggt cac cca ggc cct cct ggt 3159 Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly 1040 1045 1050 cct gtc ggt cca gct gga aag agc ggt gac aga gga gaa act ggc 3204 Pro Val Gly Pro 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Asn Arg Gly Glu Arg Gly 1160 1165 1170 tct gag ggc tcc cca ggc cac cca gga caa cca ggc cct cct gga 3564 Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly 1175 1180 1185 cct cct ggt gcc cct ggt cca tgt tgt ggt gct ggc ggg gtt gct 3609 Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Ala Gly Gly Val Ala 1190 1195 1200 gcc att gct ggt gtt gga gcc gaa aaa gct ggt ggt ttt gcc cca 3654 Ala Ile Ala Gly Val Gly Ala Glu Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro 1205 1210 1215 tat tat gga gat gaa ccg ata gat ttc aaa atc aac acc gat gag 3699 Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Ile Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu 1220 1225 1230 att atg acc tca ctc aaa tca gtc aat gga caa ata gaa agc ctc 3744 Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu 1235 1240 1245 att agt cct gat ggt tcc cgt aaa aac cct gca cgg aac tgc agg 3789 Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg 1250 1255 1260 gac ctg aaa ttc tgc cat cct gaa ctc cag agt gga gaa tat tgg 3834 Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Gln Ser Gly Glu Tyr 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ggg aat gta aag aaa gcc ttg aag ctg atg ggg tca aat gaa ggt 4194 Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly 1385 1390 1395 gaa ttc aag gct gaa gga aat agc aaa ttc aca tac aca gtt ctg 4239 Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu 1400 1405 1410 gag gat ggt tgc aca aaa cac act ggg gaa tgg ggc aaa aca gtc 4284 Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Gly Lys Thr Val 1415 1420 1425 ttc cag tat caa aca cgc aag gcc gtc aga cta cct att gta gat 4329 Phe Gln Tyr Gln Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp 1430 1435 1440 att gca ccc tat gat atc ggt ggt cct gat caa gaa ttt ggt gcg 4374 Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Ala 1445 1450 1455 gac att ggc cct gtt tgc ttt tta taa 4401 Asp Ile Gly Pro Val Cys Phe Leu 1460 1465 <210> 2 <211> 1466 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 2 Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Thr Trp Leu Leu Phe Ala Leu Leu 1 5 10 15 His Pro Thr Val Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Asp Gly Gly Cys 20 25 30 Ser His Leu Gly 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ccg ggt 336 Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly 100 105 110 cca cct ggt att cct ggt aga aat ggt gac cct gga cct ccc ggt tcc 384 Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ser 115 120 125 cca ggt agc cca gga tca cct ggg cct cct gga ata tgt gaa tcc tgc 432 Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys 130 135 140 cca act ggt ggt cag aac tat agc cca caa tac gag gcc tac gac gtc 480 Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Glu Ala Tyr Asp Val 145 150 155 160 aaa tct ggt gtt gct gga gga ggt att gca ggc tac cct ggt ccc gca 528 Lys Ser Gly Val Ala Gly Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala 165 170 175 ggg ccc cca ggt ccg ccg ggt ccg ccc gga aca tca ggt cat ccc gga 576 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly 180 185 190 gcc cct ggt gca cca ggt tat cag gga ccg ccc gga gag cct gga caa 624 Ala Pro Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln 195 200 205 gct ggt ccc gct gga ccc cct ggt cca cca ggt gct att gga cca agt 672 Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser 210 215 220 ggt cct gcc gga aaa gac ggt gaa tcc ggt aga cct ggt aga ccc ggc 720 Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly 225 230 235 240 gaa agg ggt ttc cca ggt cct ccc gga atg aag ggt cca gcc ggt atg 768 Glu Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Met Lys Gly Pro Ala Gly Met 245 250 255 ccc ggt ttt cct ggg atg aag ggt cac aga gga ttt gat ggt aga aac 816 Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn 260 265 270 gga gag aaa ggc gaa acc ggt gct ccc gga ctg aag ggt gaa aac ggt 864 Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly 275 280 285 gtc cct ggt gag aac ggc gct cct gga cct atg ggt cca cgt ggt gct 912 Val Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala 290 295 300 cca gga gaa aga ggc aga cca gga ttg cct ggt gca gct ggt gct aga 960 Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg 305 310 315 320 ggt aac gat ggt gcc cgt ggt tcc gat gga caa ccc ggg cca ccc ggc 1008 Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly 325 330 335 cct cca ggt acc gct gga ttt cct gga agc cct ggt gct aag ggg gag 1056 Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu 340 345 350 gtt ggt ccg gct ggt agt ccc gga agt agc ggt gcc cca ggt caa aga 1104 Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg 355 360 365 ggc gaa cca ggc cct cag ggt cac gca gga gca cct gga ccg cct ggt 1152 Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly 370 375 380 cct cct ggt tcg aat ggt tcg cct gga gga aaa ggt gaa atg ggg ccc 1200 Pro Pro Gly Ser Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro 385 390 395 400 gca gga atc ccc ggt gcg cct ggt ctt att ggt gcc agg ggt cct cca 1248 Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Ile Gly Ala Arg Gly Pro Pro 405 410 415 ggc ccg cca ggt aca aat ggt gta ccc gga cag cga gga gca gct ggt 1296 Gly Pro Pro Gly Thr Asn Gly Val Pro Gly Gln Arg Gly Ala Ala Gly 420 425 430 gaa cct ggt aaa aac ggt gcc aaa gga gat cca ggt cct cgt gga gag 1344 Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Asp Pro Gly Pro Arg Gly Glu 435 440 445 cgt ggt gaa gct ggc tct ccc ggt atc gcc ggt cca aaa ggt gag gac 1392 Arg Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Glu Asp 450 455 460 ggt aag gac ggt tcc cct ggt gag cca ggt gcg aac gga ctg cca ggt 1440 Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly 465 470 475 480 gca gcc gga gag cga gga gtc cca gga ttc agg gga cca gcc ggt gct 1488 Ala Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Ala 485 490 495 aac ggc ttg cct ggt gaa aaa ggg ccc cct ggt gat agg gga gga ccc 1536 Asn Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Asp Arg Gly Gly Pro 500 505 510 ggt cca gca ggc cct cgt gga gtt gct ggt gag cct gga cgt gac ggt 1584 Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly 515 520 525 tta cca gga ggg cca ggt ttg agg ggt att ccc ggg tcc cct ggc ggt 1632 Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Arg Gly Ile Pro Gly Ser Pro Gly Gly 530 535 540 cct gga tcg gat gga aaa cca ggg cca cca ggt tcg cag ggt gaa aca 1680 Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Thr 545 550 555 560 gga cgt cca ggc cca ccc ggc tca cct ggt cca agg ggt cag cct ggt 1728 Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly 565 570 575 gtc atg ggt ttc ccc ggt cca aag ggt aat gac gga gca ccg ggt aaa 1776 Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys 580 585 590 aat ggt gaa cgt ggt ggc cca ggt ggt cca gga ccc caa ggt cca gct 1824 Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala 595 600 605 gga aaa aac ggt gag aca ggt cct caa gga cct cca gga cct acc ggt 1872 Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly 610 615 620 cct agc gga gat aag gga gat acg gga ccg cca gga cct caa gga ttg 1920 Pro Ser Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu 625 630 635 640 caa ggt ttg cct ggt aca tct ggc cct ccc gga gaa aat ggt aag cct 1968 Gln Gly Leu Pro Gly Thr Ser Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro 645 650 655 gga gag cca gga cca aaa ggc gaa gct gga gcc cca ggt atc ccc gga 2016 Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly 660 665 670 ggt aag gga gac tca ggt gct ccg ggt gag cgt ggt cct ccg ggt gcc 2064 Gly Lys Gly Asp Ser Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Ala 675 680 685 ggt ggt cca cct gga cct aga ggt ggt gcc ggg ccg cca ggt cct gaa 2112 Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu 690 695 700 ggt ggt aaa ggt gct gct ggt cca ccg gga ccg cct ggc tct gct ggt 2160 Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly 705 710 715 720 act cct ggc ttg cag gga atg cca gga gag aga ggt gga cct gga ggt 2208 Thr Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly 725 730 735 ccc ggt ccg aag ggt gat aaa ggg gag cca gga tca tcc ggt gtt gac 2256 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ser Gly Val Asp 740 745 750 ggc gca cct ggt aaa gac gga cca agg gga cca acg ggt cca atc gga 2304 Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly 755 760 765 cca cca gga ccc gct ggc cag cca gga gat aaa ggc gag tcc gga gca 2352 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Ala 770 775 780 ccc ggt gtt cct ggt ata gct gga ccc agg ggt ggt ccc ggt gaa aga 2400 Pro Gly Val Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg Gly Gly Pro Gly Glu Arg 785 790 795 800 ggt gaa cag ggc cca ccg ggt ccc gcc ggt ttc cct ggc gcc cct ggt 2448 Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly 805 810 815 caa aat gga gaa cca ggt gca aag ggc gag aga gga gcc cca gga gaa 2496 Gln Asn Gly Glu Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu 820 825 830 aag ggt gag gga gga cca ccc ggt gct gcc ggt cca gct ggg ggt tca 2544 Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Gly Ser 835 840 845 ggt cct gct gga cca cca ggt cca cag ggc gtt aaa ggt gag aga gga 2592 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly 850 855 860 agt cca ggt ggt cct gga gct gct gga ttc cca ggt ggc cgt gga cct 2640 Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Gly Arg Gly Pro 865 870 875 880 cct ggt ccc cct gga tcg aat ggt aat cct ggt ccg cca ggt agt tcg 2688 Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ser 885 890 895 ggt gct cct ggg aag gac ggt cca cct ggc ccc cca ggt agt aac ggt 2736 Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly 900 905 910 gca cct ggt agt cca ggt ata tcc gga cct aaa gga gat tcc ggt cca 2784 Ala Pro Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ser Gly Pro 915 920 925 cca ggc gaa aga ggg gcc cca ggc cca cag ggt cca cca gga gcc ccc 2832 Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro 930 935 940 ggt cct ctg ggt att gct ggt ctt act ggt gca cgt gga ctg gcc ggt 2880 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Leu Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly 945 950 955 960 cca ccc gga atg cct gga gca aga ggt tca cct gga cca caa ggt att 2928 Pro Pro Gly Met Pro Gly Ala Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Ile 965 970 975 aaa gga gag aac ggt aaa cct gga cct tcc ggt caa aac gga gag cgg 2976 Lys Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Pro Ser Gly Gln Asn Gly Glu Arg 980 985 990 gga ccc cca ggc ccc caa ggt ctg cca gga cta gct ggt acc gca ggg 3024 Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly 995 1000 1005 gaa cca gga aga gat gga aat cca ggt tca gac gga cta ccc ggt 3069 Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly 1010 1015 1020 aga gat ggt gca ccg ggg gcc aag ggc gac agg ggt gag aat gga 3114 Arg Asp Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly 1025 1030 1035 tct cct ggt gcg cca ggg gca cca ggc cac cca ggt ccc cca ggt 3159 Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly 1040 1045 1050 cct gtg ggc cct gct gga aag tca ggt gac agg gga gag aca ggc 3204 Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly 1055 1060 1065 ccg gct ggt cca tct ggc gca ccc gga cca gct ggt tcc aga ggc 3249 Pro Ala Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly 1070 1075 1080 cca cct ggt ccg caa ggc cct aga ggt gac aag gga gag act gga 3294 Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly 1085 1090 1095 gaa cga ggt gct atg ggt atc aag ggt cat aga ggt ttt ccg ggt 3339 Glu Arg Gly Ala Met Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly 1100 1105 1110 aat ccc ggc gcc cca ggt tct cct ggt cca gct ggc cat caa ggt 3384 Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly His Gln Gly 1115 1120 1125 gca gtc gga tcg ccc ggc cca gcc ggt ccc agg ggc cct gtt ggt 3429 Ala Val Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly 1130 1135 1140 cca tcc ggt cct cca gga aag gat ggt gct tct gga cac cca gga 3474 Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ala Ser Gly His Pro Gly 1145 1150 1155 cct atc gga cct ccg ggt cct aga ggt aat aga gga gaa cgt gga 3519 Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly 1160 1165 1170 tcc gag ggt agt cct ggt cac cct ggt caa cct ggc cca cca ggg 3564 Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly 1175 1180 1185 cct cca ggt gca ccc ggt cca tgt tgt ggt gca ggc ggt gtg gct 3609 Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Ala Gly Gly Val Ala 1190 1195 1200 gca att gct ggt gtg ggt gct gaa aag gcc ggc ggt ttc gct cca 3654 Ala Ile Ala Gly Val Gly Ala Glu Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro 1205 1210 1215 tat tat ggt gat gaa ccg att gat ttt aag atc aat act gac gaa 3699 Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Ile Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu 1220 1225 1230 atc atg act tcc tta aag tcc gtt aat ggt caa att gag tct cta 3744 Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu 1235 1240 1245 atc tcc cca gat ggt tca cgt aaa aat cct gct aga aat tgt aga 3789 Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg 1250 1255 1260 gat ttg aag ttt tgt cac ccc gag ttg cag tcc ggt gag tac tgg 3834 Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Gln Ser Gly Glu Tyr Trp 1265 1270 1275 gtg gac ccc aat caa ggt tgt aag tta gac gct att aaa gtt tac 3879 Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Tyr 1280 1285 1290 tgc aat atg gag aca gga gaa act tgc atc agc gct tct cca ttg 3924 Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu 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aaa gtc ccc acg gac gaa tgc tgc ccc gtc tgc ccc 406 Cys Pro Asn Ala Lys Val Pro Thr Asp Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro 85 90 95 gaa ggc cag gaa tca ccc acg gac caa gaa acc acc gga gtc gag gga 454 Glu Gly Gln Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly 100 105 110 ccg aaa gga gac act ggc ccc cga ggc cca agg gga ccc gcc ggc ccc 502 Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro 115 120 125 ccc ggc cga gat ggc atc cct gga caa cct gga ctt ccc gga ccc cct 550 Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 130 135 140 gga ccc ccc gga cct ccc gga ccc cct ggc ctc gga gga aac ttt gct 598 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala 145 150 155 160 ccc cag ttg tct tac ggc tat gat gag aaa tca aca gga att tcc gtg 646 Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Ile Ser Val 165 170 175 cct ggt ccc atg ggt cct tct ggt cct cgt ggt ctc cct ggc ccc cct 694 Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro 180 185 190 ggc gca 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Ala Arg Gly Pro 405 410 415 tct gga ccc cag ggc ccc agc ggc ccc cct ggc ccc aag ggt aac agc 1414 Ser Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser 420 425 430 ggt gaa cct ggt gct cct ggc agc aaa gga gac act ggc gcc aag gga 1462 Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly 435 440 445 gaa ccc ggt ccc act ggt att caa ggc ccc cct ggc ccc gct ggg gaa 1510 Glu Pro Gly Pro Thr Gly Ile Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu 450 455 460 gaa gga aag cga gga gcc cga ggt gaa cct gga cct gct ggc ctg cct 1558 Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro 465 470 475 480 gga ccc cct ggc gag cgt ggt gga cct gga agc cgt ggt ttc cct ggc 1606 Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly 485 490 495 gcc gac ggt gtt gct ggt ccc aag ggt cct gct ggt gaa cgc ggt gct 1654 Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala 500 505 510 cct ggc cct gct ggc ccc aaa ggt tct cct ggt gaa gct ggt cgc ccc 1702 Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys 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ggt cct gct ggt ccc att ggc ccc gtt ggt gcc cgt 3367 Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Pro Val Gly Ala Arg 1070 1075 1080 ggc ccc gct gga ccc caa ggc ccc cgt ggt gac aag ggt gag aca 3412 Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr 1085 1090 1095 ggc gaa cag ggc gac aga ggc att aag ggt cac cgt ggc ttc tct 3457 Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser 1100 1105 1110 ggt ctc cag ggt ccc ccc ggc cct ccc ggc tct cct ggt gag caa 3502 Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln 1115 1120 1125 ggt cct tcc gga gcc tct ggt cct gct ggt ccc cgc ggt ccc cct 3547 Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro 1130 1135 1140 ggc tct gct ggt tct ccc ggc aaa gat gga ctc aat ggt ctc cca 3592 Gly Ser Ala Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro 1145 1150 1155 ggc ccc atc ggt ccc cct ggg cct cga ggt cgc act ggt gat gct 3637 Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala 1160 1165 1170 ggt cct gct ggt cct ccc ggc cct cct gga ccc cct ggt ccc cca 3682 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1175 1180 1185 ggt cct ccc agc ggc ggc tac gac ttg agc ttc ctg ccc cag cca 3727 Gly Pro Pro Ser Gly Gly Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Pro Gln Pro 1190 1195 1200 cct caa gag aag gct cac gat ggt ggc cgc tac tac cgg gct gat 3772 Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp 1205 1210 1215 gat gcc aat gtg gtc cgt gac cgt gac ctc gag gtg gac acc acc 3817 Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr 1220 1225 1230 ctc aag agc ctg agc cag cag atc gag aac atc cgg agc cct gaa 3862 Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu 1235 1240 1245 ggc agc cgc aag aac ccc gcc cgc acc tgc cgt gac ctc aag atg 3907 Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met 1250 1255 1260 tgc cac tct gac tgg aag agc gga gaa tac tgg att gac ccc aac 3952 Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn 1265 1270 1275 caa ggc tgc aac ctg gat gcc att aag gtc ttc tgc aac 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<213> Bos taurus <400> 36 Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu 20 25 30 Glu Asp Ile Pro Pro Val Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His 35 40 45 Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Val Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp 50 55 60 Asn Gly Asn Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Cys Pro Asn Ala Lys Val Pro Thr Asp Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro 85 90 95 Glu Gly Gln Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly 100 105 110 Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala 145 150 155 160 Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Ile Ser Val 165 170 175 Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly 195 200 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Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro 1040 1045 1050 Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr 1055 1060 1065 Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Pro Val Gly Ala Arg 1070 1075 1080 Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr 1085 1090 1095 Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser 1100 1105 1110 Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln 1115 1120 1125 Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro 1130 1135 1140 Gly Ser Ala Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro 1145 1150 1155 Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala 1160 1165 1170 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1175 1180 1185 Gly Pro Pro Ser Gly Gly Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Pro Gln Pro 1190 1195 1200 Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp 1205 1210 1215 Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr 1220 1225 1230 Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu 1235 1240 1245 Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met 1250 1255 1260 Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn 1265 1270 1275 Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu 1280 1285 1290 Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln 1295 1300 1305 Lys Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Glu Lys Arg His Val 1310 1315 1320 Trp Tyr Gly Glu Ser Met Thr Gly Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly 1325 1330 1335 Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe 1340 1345 1350 Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His 1355 1360 1365 Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu 1370 1375 1380 Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg 1385 1390 1395 Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Asp Gly 1400 1405 1410 Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr 1415 1420 1425 Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro 1430 1435 1440 Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly 1445 1450 1455 Pro Ala Cys Phe Leu 1460 <210> 37 <211> 4628 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4628) <223> Bos taurus collagen type I alpha 2 chain (COL1A2), mRNA; NCBI Reference Sequence: NM_174520.2 <220> <221> CDS <222> (111)..(4205) <400> 37 taagttggag gtactggcca cgactgcatg cctgcgcccg ccaggtgata cctccgccgg 60 tgacccaggg gctctgcgac acaaggagtc tgcatgtctg agtggtagac atg ctc 116 Met Leu 1 agc ttt gtg gat acg cgg act ttg ttg ctg ctt gca gta act tcg tgc 164 Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr Ser Cys 5 10 15 cta gca aca tgc caa tcc tta caa gag gca act gca aga aag ggc cca 212 Leu Ala Thr Cys Gln Ser Leu Gln Glu Ala Thr Ala Arg Lys Gly Pro 20 25 30 agt gga gat aga gga cca cgc gga gaa agg ggt cca cca ggc cca cca 260 Ser Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro 35 40 45 50 ggc aga gat ggt gat gac ggc atc cca ggc cct cct ggc ccc cct ggc 308 Gly Arg Asp Gly Asp Asp Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 55 60 65 cct cct ggc ccc cct ggt ctt ggc ggg aac ttt gct gct cag ttt gat 356 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln Phe Asp 70 75 80 gca aaa gga ggt ggc cct gga cca atg ggg ctg atg gga cct cgc ggc 404 Ala Lys Gly Gly Gly Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly 85 90 95 cct cct ggg gct tct gga gcc cct ggc cct caa ggt ttc cag gga cct 452 Pro Pro Gly Ala Ser Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro 100 105 110 ccg ggt gag cct ggt gaa cct ggt cag act ggt cct gca ggt gct cgt 500 Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg 115 120 125 130 ggc ccg cct ggc cct cct ggc aag gct ggt gag gat ggt cac cct gga 548 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly 135 140 145 aaa cct gga cga cct ggt gag aga ggg gtt gtt gga cca cag ggt gct 596 Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala 150 155 160 cgt ggc ttt cct gga act cct gga ctc cct ggc ttc aag ggc att agg 644 Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg 165 170 175 ggt cac aat ggt ctg gat gga ttg aag gga cag cct ggt gct cca ggt 692 Gly His Asn Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly 180 185 190 gtg aag ggt gaa cct ggt gcc cct ggt gaa aat gga act cca ggt caa 740 Val Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln 195 200 205 210 acg gga gcc cgt ggt ctt cct ggt gag aga gga cgt gtt ggt gcc cct 788 Thr Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro 215 220 225 ggc cca gct ggt gcc cgt gga agt gat gga agt gtg ggt cct gtg ggc 836 Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly 230 235 240 cct gct ggt ccc att ggg tct gct ggc cct cca ggc ttc cca ggt gct 884 Pro Ala Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala 245 250 255 cct ggc ccc aag ggt gaa ctc gga cct gtt ggt aac cct ggc cct gct 932 Pro Gly Pro Lys Gly Glu Leu Gly Pro Val Gly Asn Pro Gly Pro Ala 260 265 270 ggt ccc gcg ggt ccc cgt ggt gaa gtg ggt ctc cca ggc ctt tct ggc 980 Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly 275 280 285 290 cct gtc gga cct cct gga aac ccc gga gcc aat ggg ctt cct ggc gct 1028 Pro Val Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Ala 295 300 305 aag ggt gct gct ggc ctt ccc ggt gtt gct ggg gct ccc ggc ctc cct 1076 Lys Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro 310 315 320 gga ccc cgg ggt att cct ggc cct gtt ggc gct gct ggt gct act ggc 1124 Gly Pro Arg Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly 325 330 335 gcc aga gga ctt gtt ggt gag ccc ggc cca gct ggt tcg aaa gga gag 1172 Ala Arg Gly Leu Val Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu 340 345 350 agc ggc aac aag ggc gag cct ggt gct gtt ggg cag cca ggt cct cct 1220 Ser Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Ala Val Gly Gln Pro Gly Pro Pro 355 360 365 370 ggc ccc agt ggt gaa gaa gga aag aga ggc tcc act gga gaa atc gga 1268 Gly Pro Ser Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ser Thr Gly Glu Ile Gly 375 380 385 ccc gct ggc ccc cca gga cct cct ggg ctg agg gga aat cct ggc tcc 1316 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Asn Pro Gly Ser 390 395 400 cgt ggt cta cct gga gct gac ggc aga gct ggt gtc atg ggt cct gct 1364 Arg Gly Leu Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Ala 405 410 415 ggt agc cgt ggt gca act ggc cct gct ggt gtg cga ggt ccc aat gga 1412 Gly Ser Arg Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly 420 425 430 gat tct ggt cgc cct gga gag cct ggc ctc atg gga ccc cga ggt ttc 1460 Asp Ser Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Phe 435 440 445 450 cca ggt tcc cct gga aat atc ggc cca gct ggt aaa gaa ggt cct gtg 1508 Pro Gly Ser Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val 455 460 465 ggt ctc cct ggt att gac ggc aga cct ggg ccc att ggc cca gcg gga 1556 Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly 470 475 480 gca aga gga gag cct ggc aac att gga ttc cct gga ccc aaa ggc ccc 1604 Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro 485 490 495 agt ggt gat cct ggc aaa gct ggt gaa aaa ggt cat gct ggt ctt gct 1652 Ser Gly Asp Pro Gly Lys Ala Gly Glu Lys Gly His Ala Gly Leu Ala 500 505 510 ggt gct cgg ggc gct cca ggt ccc gat ggc aac aac ggt gct cag gga 1700 Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly 515 520 525 530 ccc cct gga cta cag ggt gtc caa ggt gga aaa ggt gaa cag ggt cct 1748 Pro Pro Gly Leu Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro 535 540 545 gct ggt cct cca ggc ttc cag ggt ctg cct ggc cct gca ggc aca gct 1796 Ala Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Thr Ala 550 555 560 ggt gaa gct ggc aaa cca gga gaa agg ggt atc cct ggt gaa ttt ggt 1844 Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Ile Pro Gly Glu Phe Gly 565 570 575 ctc cct ggc cct gct ggt gca aga ggg gag cgg ggg ccc cca ggt gaa 1892 Leu Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu 580 585 590 agt ggt gct gct ggg cct act ggg cct att gga agc cga ggt cct tct 1940 Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser 595 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Pro Val Gly Arg Ser Gly Glu Thr Gly Ala 820 825 830 tct ggc cct cct ggc ttt gtt ggt gag aag ggt ccc tct gga gag cct 2660 Ser Gly Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro 835 840 845 850 ggt act gct ggg cct cct gga acc cca ggt cca caa ggc ctt ctt ggt 2708 Gly Thr Ala Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly 855 860 865 gct cct ggt ttt ctg ggt ctc cca ggc tct aga ggt gag cgt ggt cta 2756 Ala Pro Gly Phe Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu 870 875 880 cca ggt gtc gct gga tct gtg ggt gaa cct ggc ccc ctc ggc atc gca 2804 Pro Gly Val Ala Gly Ser Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala 885 890 895 ggc cca cct ggg gcc cgt ggt ccc cct ggt aat gtc ggt aat cct ggc 2852 Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Asn Val Gly Asn Pro Gly 900 905 910 gtc aat ggt gct cct ggt gaa gcc ggt cgt gac ggc aac cct ggg aat 2900 Val Asn Gly Ala Pro Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn 915 920 925 930 gac ggt ccc cca ggc cgc gat ggt caa ccc gga cac aag ggg gag cgt 2948 Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg 935 940 945 ggt tac ccc ggt aac gca ggt cct gtt ggt gct gcc ggt gct cct ggc 2996 Gly Tyr Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly 950 955 960 cct caa ggc cct gtg ggt ccc gtt ggt aaa cac gga aac cgt ggt gaa 3044 Pro Gln Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu 965 970 975 ccg ggt cct gcc ggt gct gtt ggt cct gct ggt gcc gtt ggc cca aga 3092 Pro Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg 980 985 990 ggt ccc agt ggc cca caa ggt att cga ggt gac aag gga gag cct 3137 Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro 995 1000 1005 ggt gat aag ggt ccc aga ggt ctt cct ggc tta aag gga cac aat 3182 Gly Asp Lys Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Lys Gly His Asn 1010 1015 1020 ggg ttg caa ggt ctc ccg ggt ctt gct ggt cat cat ggc gat caa 3227 Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly His His Gly Asp Gln 1025 1030 1035 ggt gct ccc ggt gct gtg ggt ccc gct ggt ccc agg ggc cct gct 3272 Gly Ala Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala 1040 1045 1050 ggt cct tct ggc ccc gct ggc aaa gac ggt cgc att gga cag cct 3317 Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Ile Gly Gln Pro 1055 1060 1065 ggt gca gtc gga cct gct ggc att cgt ggc tct cag ggt agc caa 3362 Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg Gly Ser Gln Gly Ser Gln 1070 1075 1080 ggt cct gct ggc cct cct ggt ccc cct ggc cct cct gga cct cct 3407 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1085 1090 1095 ggc cca agt ggt ggt ggt tac gag ttt ggt ttt gat gga gac ttc 3452 Gly Pro Ser Gly Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Phe Asp Gly Asp Phe 1100 1105 1110 tac agg gct gac cag cct cgc tca cca act tct ctc aga ccc aag 3497 Tyr Arg Ala Asp Gln Pro Arg Ser Pro Thr Ser Leu Arg Pro Lys 1115 1120 1125 gat tat gaa gtt gat gct act ctg aaa tct ctc aac aac cag att 3542 Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile 1130 1135 1140 gag acc ctt ctt act cca gaa ggc tct agg aag aac cca gct cgc 3587 Glu Thr Leu Leu Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg 1145 1150 1155 aca tgc cga gac ttg aga ctc agc cac cca gaa tgg agc agt ggt 3632 Thr Cys Arg Asp Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly 1160 1165 1170 tac tac tgg att gac cct aac caa gga tgt act atg gat gct atc 3677 Tyr Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Asp Ala Ile 1175 1180 1185 aaa gta tac tgt gat ttc tct act ggc gaa acc tgc atc cgg gct 3722 Lys Val Tyr Cys Asp Phe Ser Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala 1190 1195 1200 caa cct gaa gac atc cca gtc aag aac tgg tac aga aat tcc aag 3767 Gln Pro Glu Asp Ile Pro Val Lys Asn Trp Tyr Arg Asn Ser Lys 1205 1210 1215 gcc aag aag cat gtc tgg gta gga gaa act atc aac ggt ggt acc 3812 Ala Lys Lys His Val Trp Val Gly Glu Thr Ile Asn Gly Gly Thr 1220 1225 1230 cag ttt gaa tat aat gtt gaa gga gta acc acc aag gaa atg gct 3857 Gln Phe Glu Tyr Asn Val Glu Gly Val Thr Thr Lys Glu Met Ala 1235 1240 1245 acc caa ctt gcc ttc atg cgt ctg ctg gcc aac cat gcc tct cag 3902 Thr Gln Leu Ala Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn 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agaaaaagga aatctgaaac atttctcttg gccatttctt tttcttcttt 4275 cctaactgaa agctgaatcc ttccatttct tctgcacatc tacttgctta aattgtggca 4335 aaagaggaga aggattgatc agagcattgt gcaatacaat ttaattcact ccccctccct 4395 tttcccctct ccaaaagatt tggaattttt tttttttcaa cactcttaca cctgttgtgg 4455 aaaatgtcaa cctttgtaag aaaaccaaaa taaaaattga aaaataaaaa ccatgaacat 4515 ttgcaccact tgtggctttt gaatatcttc cacggaggga agtttaaaac ccaaacttcc 4575 aaaggtttaa actacctcaa aacactttcc tgtgagtgtg atccacacct cgt 4628 <210> 38 <211> 1364 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 38 Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr 1 5 10 15 Ser Cys Leu Ala Thr Cys Gln Ser Leu Gln Glu Ala Thr Ala Arg Lys 20 25 30 Gly Pro Ser Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Pro Gly Arg Asp Gly Asp Asp Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro 50 55 60 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln 65 70 75 80 Phe Asp Ala Lys Gly Gly Gly Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro 85 90 95 Arg Gly Pro Pro Gly Ala 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagaaaataa aaaaaaaaga 2326 <210> 47 <211> 487 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 47 Met Lys Pro Trp Glu Ser Thr Leu Leu Val Ala Trp Phe Gly Val Leu 1 5 10 15 Ser Cys Val Gln Ala Glu Phe Phe Thr Ser Ile Gly His Met Thr Asp 20 25 30 Leu Ile Tyr Ala Glu Lys Asp Leu Val Gln Ser Leu Lys Glu Tyr Ile 35 40 45 Leu Val Glu Glu Ala Lys Leu Ser Lys Ile Lys Ser Trp Ala Asp Lys 50 55 60 Met Glu Ala Leu Thr Ser Lys Ser Ala Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu 65 70 75 80 Ala His Pro Val Asn Ala Tyr Lys Leu Val Lys Arg Leu Asn Thr Asp 85 90 95 Trp Pro Ala Leu Glu Asp Leu Val Leu Gln Asn Ser Ala Ala Gly Thr 100 105 110 Lys Tyr Gln Ala Met Leu Ser Val Asp Asp Cys Phe Gly Met Gly Arg 115 120 125 Ser Ala Tyr Asn Glu Gly Asp Tyr Tyr His Thr Val Leu Trp Met Glu 130 135 140 Gln Val Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Glu Glu Ala Thr Thr Ser Lys 145 150 155 160 Ala Gln Val Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Phe Gln Leu Gly Asp 165 170 175 Leu His Arg Ala Val Glu Leu Thr Arg Arg Leu Leu Ser Leu Asp Pro 180 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1158 Ala Gln Glu Tyr Arg Gln Arg Ser Leu Leu Glu Lys Glu Leu Leu Phe 365 370 375 ttc gcc tat gac gtt ttt gga att ccc ttt gtt gat ccg gat tca tgg 1206 Phe Ala Tyr Asp Val Phe Gly Ile Pro Phe Val Asp Pro Asp Ser Trp 380 385 390 act cca gtg gag gtg att cct aag aga ctg caa gag aaa cag aag tca 1254 Thr Pro Val Glu Val Ile Pro Lys Arg Leu Gln Glu Lys Gln Lys Ser 395 400 405 gaa cgg gaa aca gct gcc cgc atc tcc cag gaa atc ggg aac ctt atg 1302 Glu Arg Glu Thr Ala Ala Arg Ile Ser Gln Glu Ile Gly Asn Leu Met 410 415 420 425 aag gag atc gag acc ctc gtg gag gag aag acc aag gag tca ctg gac 1350 Lys Glu Ile Glu Thr Leu Val Glu Glu Lys Thr Lys Glu Ser Leu Asp 430 435 440 gtg agc agg ctg acc cgg gaa ggt ggc ccc ctg ctg tat gat ggc atc 1398 Val Ser Arg Leu Thr Arg Glu Gly Gly Pro Leu Leu Tyr Asp Gly Ile 445 450 455 aga ctc acc atg aac tcc aaa gtc ctg aat ggt tcc cag cgg gtg gtg 1446 Arg Leu Thr Met Asn Ser Lys Val Leu Asn Gly Ser Gln Arg Val Val 460 465 470 atg gat ggc gtc atc tct gac gag gag tgc cag 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ttt agc cca gaa gag atg gac ctc ccc cac gag cag ccc caa gaa gcc 2166 Phe Ser Pro Glu Glu Met Asp Leu Pro His Glu Gln Pro Gln Glu Ala 700 705 710 cag gag ggg acc ccc gag ccc cta cag gag ccc gtc tcc agc agt gag 2214 Gln Glu Gly Thr Pro Glu Pro Leu Gln Glu Pro Val Ser Ser Ser Glu 715 720 725 tca ggg cac aag gat gag ctc tga caactcccgt ggatggtgat cagacccaca 2268 Ser Gly His Lys Asp Glu Leu 730 735 cgagggactc tgtcctgcag cctggactgg ccagccccgg gcgaggagca gtgggaaccc 2328 aggcctgccg cccagctgag ggggctctgc tcacggccgt ccgcatggtg ctgctgctct 2388 tggagtggac atggcgagat ggccctctcc cctctgggcc tgactgaggg ctcaggacgc 2448 aggcccagag ccactctggg ggcccacaca ggcagccacg tgacagcaat acagtattta 2508 agtgcctgtg tagacaacca aagaataaat gattcgtggt tttttttaaa aaaaaaaaaa 2568 aaaaaaaaaa aa 2580 <210> 49 <211> 736 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 49 Met Ala Ala Arg Ala Leu Arg Leu Leu Thr Ile Leu Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Gln Ala Glu Ala Glu Ser Glu Ala Gly Trp Asp Leu 20 25 30 Thr Ala Pro Asp Leu Leu Phe 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tct gat ttc cta cca agt 867 Phe Pro Gln Arg Val Lys Asn Gln Gly Thr Ser Asp Phe Leu Pro Ser 270 275 280 cga cca aga tat tcc tgg gaa tgg cac agt tgt cac cag cat tac cac 915 Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu Trp His Ser Cys His Gln His Tyr His 285 290 295 agc atg gat gaa ttc agc cac tat gac ctg ctt gat gcc agc acc cag 963 Ser Met Asp Glu Phe Ser His Tyr Asp Leu Leu Asp Ala Ser Thr Gln 300 305 310 agg aga gtg gct gag ggc cat aaa gcg agt ttc tgt ctt gag gac aca 1011 Arg Arg Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr 315 320 325 tcg tgt gac tac ggc tac cac agg cga ttt gca tgt act gca cac aca 1059 Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His Arg Arg Phe Ala Cys Thr Ala His Thr 330 335 340 345 cag ggc ttg agt cct ggc tgc tat gat acc tat aat gca gac ata gac 1107 Gln Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr Asp Thr Tyr Asn Ala Asp Ile Asp 350 355 360 tgc caa tgg att gat atc act gat gtc aaa cct gga aac tat att ctc 1155 Cys Gln Trp Ile Asp Ile Thr Asp Val Lys Pro Gly Asn Tyr Ile Leu 365 370 375 aag gtc agt gtg aat ccc agc tat ttg gtg cct gag tcg gat tat tcc 1203 Lys Val Ser Val Asn Pro Ser Tyr Leu Val Pro Glu Ser Asp Tyr Ser 380 385 390 aac aat gtc gtc cgc tgt gaa att cgc tac aca gga cat cac gca tat 1251 Asn Asn Val Val Arg Cys Glu Ile Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr 395 400 405 gcc tcg ggc tgc aca att tca ccg tat tag aaagcaagcc aaaactccca 1301 Ala Ser Gly Cys Thr Ile Ser Pro Tyr 410 415 aaggatatat cagtgcctgg tgttctgaag tggaaaaaaa tagattaact tcagtaggat 1361 ttatgtattt tgaaagagag aacagaaaac aacaaaagaa tttttgtttg gactgtttta 1421 taacaaagca cataactgga ttttgaacat ttcaatcggc attatttggg aaatttttaa 1481 tattattatt cacattactt tgtgaattaa cacagtgttt caattctgta attgcacact 1541 tggctctttc tgagaaatcc aaatttctta tgcttcttct gaaattatag tgcaaaaggg 1601 aaaaaaaatt cgatgaatga gtcaaaatta ttttaaaact gagaattttc taaagttcta 1661 aaactttagt gaaccttaat aataactggc ttatatatgt cctagcatag atcactttag 1721 aaatgaagct cctactgttt aaatagatat ggacacattt ggtactgagg gaggaataaa 1781 caggttacca ttggtgtcaa gaaatgttac tatatagcag agaaatggca atgtatgtat 1841 tcagatagtt acatccctat ataaaatttg tttacatttt aaaaattagt agataaactc 1901 ctttctttct gtcaagtgta caagttcatt ctgacttaag tcagcttttg ttgtggaaca 1961 aattaagtaa ttgagctgcc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2021 aaaaaaaaa 2030 <210> 51 <211> 418 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 51 Met Arg Phe Ala Trp Thr Ala Leu Leu Gly Ser Leu Gln Leu Cys Ala 1 5 10 15 Leu Val Arg Cys Ala Pro Pro Ala Ala Ser His Arg Gln Pro Pro Arg 20 25 30 Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Ala Trp Arg Gln Lys Ile Gln Trp Glu 35 40 45 Asn Asn Gly Gln Val Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gln Tyr Gln 50 55 60 Pro Gln Arg Arg Arg Asp Pro Gly Ala Thr Ala Pro Gly Ala Ala Asn 65 70 75 80 Ala Thr Ala Pro Gln Met Arg Thr Pro Ile Leu Leu Leu Arg Asn Asn 85 90 95 Arg Thr Ala Ala Ala Arg Val Arg Thr Ala Gly Pro Ser Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Gly Arg Pro Arg Pro Ala Ala Arg His Trp Phe Gln Ala Gly Tyr 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Ala His Asp Ala Gly Thr Ser Arg Ala Asp Asn Gln 130 135 140 Thr Ala Pro Gly Glu Val Pro Thr 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ggc cac tgc aag gct ctg gcc ccg gag tat gcc aaa 206 Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys 35 40 45 gca gct ggg aag ctg aag gca gaa ggt tct gag atc aga ctg gcc aag 254 Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys 50 55 60 gtg gat gcc act gaa gag tct gac ctg gcc cag cag tat ggt gtc cga 302 Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg 65 70 75 ggc tac ccc acc atc aag ttc ttc aag aat gga gac aca gct tcc ccc 350 Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Lys Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro 80 85 90 95 aaa gag tac aca gct ggc cga gaa gcg gat gat atc gtg aac tgg ctg 398 Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu 100 105 110 aag aag cgc acg ggc ccc gct gcc agc acg ctg tcc gac ggg gct gct 446 Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Ser Thr Leu Ser Asp Gly Ala Ala 115 120 125 gca gag gcc ttg gtg gag tcc agt gag gtg gcc gtc att ggc ttc ttc 494 Ala Glu Ala Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe 130 135 140 aag gac atg gag tcg gac tcc gca aag cag ttc ttc ttg gca gca gag 542 Lys Asp Met Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Phe Leu Ala Ala Glu 145 150 155 gtc att gat gac atc ccc ttc ggg atc aca tct aac agc gat gtg ttc 590 Val Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe 160 165 170 175 tcc aaa tac cag ctg gac aag gat ggg gtt gtc ctc ttt aag aag ttt 638 Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe 180 185 190 gac gaa ggc cgg aac aac ttt gag ggg gag gtc acc aaa gaa aag ctt 686 Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Lys Leu 195 200 205 ctg gac ttc atc aag cac aac cag ttg ccc ctg gtc att gag ttc acc 734 Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr 210 215 220 gag cag aca gcc ccg aag atc ttc gga ggg gaa atc aag act cac atc 782 Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile 225 230 235 ctg ctg ttc ctg ccg aaa agc gtg tct gac tat gag ggc aag ctg agc 830 Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Glu Gly Lys Leu Ser 240 245 250 255 aac ttc aaa aaa gcg gct gag agc ttc aag ggc aag atc ctg ttt atc 878 Asn Phe Lys Lys Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile 260 265 270 ttc atc gac agc gac cac act gac aac cag cgc atc ctg gaa ttc ttc 926 Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe 275 280 285 ggc cta aag aaa gag gag tgc ccg gcc gtg cgc ctc atc acg ctg gag 974 Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu 290 295 300 gag gag atg acc aaa tat aag cca gag tca gat gag ctg acg gca gag 1022 Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Asp Glu Leu Thr Ala Glu 305 310 315 aag atc acc gag ttc tgc cac cgc ttc ctg gag ggc aag att aag ccc 1070 Lys Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro 320 325 330 335 cac ctg atg agc cag gag ctg cct gac gac tgg gac aag cag cct gtc 1118 His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Asp Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val 340 345 350 aaa gtg ctg gtt ggg aag aac ttt gaa gag gtt gct ttt gat gag aaa 1166 Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Glu Val Ala Phe Asp Glu 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Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln Arg Ala Asn Gly Asn 230 235 240 tta aaa tac ttt gag tat ata atg gct aaa gaa aaa gat gcc aat aag 883 Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu Lys Asp Ala Asn Lys 245 250 255 260 tct tct tca gat gac caa tct gat cag aaa acc aca ctg aag aag aaa 931 Ser Ser Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr Thr Leu Lys Lys Lys 265 270 275 ggt gct gct gtg gat tac ctg cca gag aga cag aag tac gaa atg ctg 979 Gly Ala Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln Lys Tyr Glu Met Leu 280 285 290 tgc cgt ggg gag ggt atc aaa atg act cct cgg aga cag aaa aaa ctc 1027 Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg Arg Gln Lys Lys Leu 295 300 305 ttc tgt cgc tac cat gat gga aac cgg aat cct aaa ttt atc ctg gct 1075 Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro Lys Phe Ile Leu Ala 310 315 320 cca gcc aaa cag gag gat gag tgg gac aag cct cgt att atc cgc ttc 1123 Pro Ala Lys Gln Glu Asp Glu Trp Asp Lys Pro Arg Ile Ile Arg Phe 325 330 335 340 cat gat att att tct gat gca gaa att gaa gtc gtt aaa gat cta gca 1171 His Asp Ile Ile Ser Asp Ala Glu Ile Glu Val Val Lys Asp Leu Ala 345 350 355 aaa cca agg ctg agg cga gcc acc att tca aac cca ata aca gga gac 1219 Lys Pro Arg Leu Arg Arg Ala Thr Ile Ser Asn Pro Ile Thr Gly Asp 360 365 370 ttg gag acg gta cat tac aga att agc aaa agt gcc tgg ctg tct ggc 1267 Leu Glu Thr Val His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Ala Trp Leu Ser Gly 375 380 385 tat gaa aac cct gtg gtg tca cga att aat atg aga atc caa gat ctg 1315 Tyr Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Ile Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu 390 395 400 aca gga cta gat gtc tcc aca gca gag gaa tta cag gta gca aat tat 1363 Thr Gly Leu Asp Val Ser Thr Ala Glu Glu Leu Gln Val Ala Asn Tyr 405 410 415 420 gga gtt gga gga cag tat gaa ccc cat ttt gat ttt gca cgg aaa gat 1411 Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp Phe Ala Arg Lys Asp 425 430 435 gag cca gat gct ttc aaa gag ctg ggg aca gga aat aga att gct aca 1459 Glu Pro Asp Ala Phe Lys Glu Leu Gly Thr Gly Asn Arg Ile Ala Thr 440 445 450 tgg ctg ttt tat atg agt gat gtg tta gca gga gga gcc act gtt ttt 1507 Trp Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Leu Ala Gly Gly Ala Thr Val Phe 455 460 465 cct gaa gta gga gct agt gtt tgg ccc aaa aag gga act gct gtt ttc 1555 Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys Gly Thr Ala Val Phe 470 475 480 tgg tat aat ctg ttt gcc agt gga gaa gga gat tat agt aca cgg cat 1603 Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp Tyr Ser Thr Arg His 485 490 495 500 gca gcc tgt cca gtg ctg gtt gga aac aaa tgg gta tcc aat aaa tgg 1651 Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp Val Ser Asn Lys Trp 505 510 515 ctc cat gaa cgt gga cag gaa ttt cga aga cca tgc acc ttg tca gaa 1699 Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro Cys Thr Leu Ser Glu 520 525 530 ttg gaa tga caaatgaact ttctctcctg ttgtactcta atgtgtctga 1748 Leu Glu tacacacaat tcccagtctt aactttcaag agtttacaat tgactaacac tccgtgattg 1808 attcagtcat gaacctcatc ccatgtttca tctgtggaca atcactaact ttgtggggtt 1868 tgtttttttt ttcttttaaa agtaacacta aatcaccaca ttgtacatat aaaaaacctt 1928 aaagttcagt 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aaaaaaaa 2786 <210> 55 <211> 534 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 55 Met Ile Trp Tyr Ile Leu Val Val Gly Ile Leu Leu Pro Gln Ser Leu 1 5 10 15 Ala His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu Ile 20 25 30 His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys Ala 35 40 45 Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu Asp 50 55 60 Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly His 65 70 75 80 Pro Val Asn Ala Phe Lys Leu Met Lys Arg Leu Asn Thr Glu Trp Ser 85 90 95 Glu Leu Glu Asn Leu Val Leu Lys Asp Met Ser Asp Gly Phe Ile Ser 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Arg Gln Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Gln Val 115 120 125 Gly Ala Ala Lys Ala Leu Leu Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Asn Leu Asp 130 135 140 Thr Asp Thr Ile Ser Lys Gly Asp Leu Pro Gly Val Lys His Lys Ser 145 150 155 160 Phe Leu Thr Val Glu Asp Cys Phe Glu Leu Gly Lys Val Ala Tyr Thr 165 170 175 Glu Ala Asp Tyr Tyr His Thr Glu Leu Trp Met Glu Gln Ala Leu Arg 180 185 190 Gln Leu Asp Glu Gly Glu Val Ser Thr Val Asp Lys Val Ser Val Leu 195 200 205 Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Tyr Gln Gln Gly Asp Leu Asp Lys Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln Arg 225 230 235 240 Ala Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu Lys 245 250 255 Asp Ala Asn Lys Ser Ser Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr Thr 260 265 270 Leu Lys Lys Lys Gly Ala Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln Lys 275 280 285 Tyr Glu Met Leu Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg Arg 290 295 300 Gln Lys Lys Leu Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro Lys 305 310 315 320 Phe Ile Leu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Asp Glu Trp Asp Lys Pro Arg 325 330 335 Ile Ile Arg Phe His Asp Ile Ile Ser Asp Ala Glu Ile Glu Val Val 340 345 350 Lys Asp Leu Ala Lys Pro Arg Leu Arg Arg Ala Thr Ile Ser Asn Pro 355 360 365 Ile Thr Gly Asp Leu Glu Thr Val His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Ala 370 375 380 Trp Leu Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Ile Asn Met Arg 385 390 395 400 Ile Gln Asp Leu Thr Gly Leu Asp Val Ser Thr Ala Glu Glu Leu Gln 405 410 415 Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp Phe 420 425 430 Ala Arg Lys Asp Glu Pro Asp Ala Phe Lys Glu Leu Gly Thr Gly Asn 435 440 445 Arg Ile Ala Thr Trp Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Leu Ala Gly Gly 450 455 460 Ala Thr Val Phe Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys Gly 465 470 475 480 Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp Tyr 485 490 495 Ser Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp Val 500 505 510 Ser Asn Lys Trp Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro Cys 515 520 525 Thr Leu Ser Glu Leu Glu 530

Claims (50)

  1. 비수산화 콜라겐을 제조하기 위해 유전자 조작된 효모의 균주로서,
    (ⅰ) 효모의 균주; 및
    (ⅱ) 콜라겐에 대한 DNA 서열; 콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열; 콜라겐 종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열; 박테리아에 대한 것 및 효모에 대한 것으로부터 선택된 복제 기원에 대한 DNA 서열; 및 상기 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 포함하는, 상기 효모의 균주로 삽입된, 벡터를 포함하는, 효모의 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모의 균주는 피치아(Pichia), 칸디다(Candida), 코마타가엘라(Komatagaella), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코커스(Cryptococcus) 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA 서열은 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터(alligator), 악어(crocodile), 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA 서열은 네이티브 콜라겐 DNA, 조작된 콜라겐 DNA 및 코돈 변형된 콜라겐 DNA로부터 선택된, 효모의 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA 서열은 AOX1 메탄올 유도된 촉진자에 대한 DNA, pDF 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, pCAT 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA 서열은 항생제 내성에 대한 DNA 및 영양요구성 마커(auxotrophic marker)에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항생제 내성 마커는 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  8. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 전기천공, 화학 형질전환 및 메이팅(mating)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 통해 상기 효모로 삽입된, 효모의 균주.
  9. 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 제1항에 따른 효모의 균주를 제공하는 단계; 및
    (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 상기 균주를 성장시키는 단계를 포함하는, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효모의 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 배지는 완충 글라이세롤 복합 배지(buffered glycerol complex media: BMGY), 완충 메탄올 복합 배지(buffered methanol complex media: BMMY) 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(yeast extract peptone dextrose: YPD)로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 시간 기간은 24시간 내지 72시간인, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 효모는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA 서열은 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA 서열은 pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA 서열은 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 비수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  17. 수산화 콜라겐을 제조하기 위해 유전자 조작된 효모의 균주로서,
    (ⅰ) 효모의 균주;
    (ⅱ) 콜라겐에 대한 DNA 서열; 콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열; 종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열; 박테리아 및/또는 효모에 대한 복제 기원에 대한 DNA 서열; 상기 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 포함하는, 상기 효모의 균주로 삽입된, 벡터; 및
    (ⅲ) P4HA1에 대한 DNA 서열; P4HB에 대한 DNA 서열; 및 촉진자에 대한 적어도 하나의 DNA 서열을 포함하는, 상기 효모의 균주로 삽입된, 제2 벡터를 포함하는, 수산화 콜라겐을 제조하기 위해 유전자 조작된 효모의 균주.
  18. 제17항에 있어서, 상기 효모의 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  19. 제17항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA 서열은 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  20. 제17항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA 서열은 네이티브 콜라겐 DNA, 조작된 콜라겐 DNA 및 변형된 콜라겐 DNA로부터 선택된, 효모의 균주.
  21. 제17항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA 서열은 AOX1 메탄올 유도된 촉진자에 대한 DNA, pDF 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, pCAT 탈억제된 촉진자에 대한 DNA, Das1-Das2 메탄올 유도된 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA, pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  22. 제17항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA 서열은 pHTX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  23. 제17항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA 서열은 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  24. 제23항에 있어서, 상기 선택 마커는 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제 내성에 대한 것인, 효모의 균주.
  25. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 전기천공, 화학 형질전환 및 메이팅으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 통해 상기 효모로 삽입된, 효모의 균주.
  26. 수산화 콜라겐을 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 제17항에 따른 효모의 균주를 제공하는 단계; 및
    (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 상기 균주를 성장시키는 단계를 포함하는, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 효모의 균주는 칸디다, 코마타가엘라, 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 배지는 BMGY, BMMY 및 YPD로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 시간 기간은 24시간 내지 72시간인, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 효모는 칸디다, 코마타가엘라, 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법
  31. 제26항에 있어서, 상기 콜라겐에 대한 DNA는 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA는 항생제 내성 DNA에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  34. 올-인-원 벡터(all-in-one vector)로서,
    (ⅰ) 촉진자 및 종결자를 포함하는, 콜라겐을 제조하기 위해 필요한 DNA;
    (ⅱ) 촉진자 및 종결자를 포함하는, P4HA1 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 수산화 효소에 대한 DNA;
    (ⅲ) 촉진자 및 종결자를 포함하는, 선택 마커에 대한 DNA;
    (ⅳ) 효모 및 박테리아에 대한 복제 기원에 대한 DNA;
    (ⅴ) 상기 게놈으로의 통합을 위한 상기 효모 게놈에 대한 상동성을 갖는 DNA; 및
    (ⅵ) 모듈식 클로닝을 허용하는, 5', 3', 상기 DNA 내 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 제한 부위를 포함하는, 올-인-원 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 콜라겐을 제조하기 위해 필요한 DNA 서열은 소, 돼지, 캥거루, 앨리게이터, 악어, 코끼리, 기린, 얼룩말, 라마, 알파카, 어린양, 공룡 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 올-인-원 벡터.
  36. 제34항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA 서열은 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 올-인-원 벡터.
  37. 제34항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA 서열은 항생제 내성에 대한 DNA 및 영양요구성 마커에 대한 DNA인, 올-인-원 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 선택 마커는 하이그로마이신, 제오신, 제네티신 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제에 대한 항생제 내성에 대한 것인, 올-인-원 벡터.
  39. 키메라 콜라겐 DNA 서열로서, 상기 키메라 콜라겐 DNA의 전체 길이를 기준으로, 최적화된 DNA의 10 내지 40% 또는 60 내지 90%를 포함하는, 키메라 콜라겐 DNA 서열.
  40. 제39항에 있어서, 상기 최적화된 DNA는 C 말단에서 기원하는, 키메라 콜라겐 DNA 서열.
  41. 제39항에 있어서, 상기 최적화된 DNA는 N 말단에서 기원하는, 키메라 콜라겐 DNA 서열.
  42. 콜라겐 생성 효모의 균주로서,
    제39항의 키메라 콜라겐에 대한 DNA 서열을 포함하는 벡터;
    콜라겐 촉진자에 대한 DNA 서열;
    종결자에 대한 DNA 서열; 선택 마커에 대한 DNA 서열;
    선택 마커에 대한 촉진자에 대한 DNA 서열;
    선택 마커에 대한 종결자에 대한 DNA 서열;
    박테리아 및/또는 효모에 대한 복제 기원에 대한 DNA 서열; 및
    상기 효모 게놈에 대한 상동성을 함유하는 DNA 서열을 포함하는, 효모의 균주.
  43. 제42항에 있어서, 상기 촉진자에 대한 DNA는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  44. 제42항에 있어서, 상기 선택 마커에 대한 DNA는 적어도 하나의 항생제 내성을 코딩하는 DNA 및 적어도 하나의 영양요구성 마커를 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된, 효모의 균주.
  45. 수산화 콜라겐을 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 제42항에 따른 콜라겐 생성 효모의 균주를 제공하는 단계; 및
    (ⅱ) 콜라겐을 제조하기에 충분한 시간 기간 동안 배지 중에 상기 균주를 성장시키는 단계를 포함하는, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 효모의 균주는 피치아, 칸디다, 코마타가엘라, 한세눌라, 사카로마이세스, 크립토코커스 속으로부터의 것 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 배지는 완충 글라이세롤 복합 배지, 완충 메탄올 복합 배지 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 시간 기간은 24시간 내지 72시간의 범위인, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 효모의 균주는 pTHX1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA 및 pGCW14-pGAP1 구성적 이방향성 촉진자에 대한 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 촉진자를 포함하는, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
  50. 제45항에 있어서, 상기 효모의 균주는 항생제 내성을 코딩하는 DNA 및 영양요구성 마커를 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는, 수산화 콜라겐을 제조하는 방법.
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