BR102018015599A2

BR102018015599A2 - Cepa de levedura, método para produzir colágeno, vetor multifuncional, e, sequência de dna de colágeno quimérico.

Info

Publication number: BR102018015599A2
Application number: BR102018015599-7A
Authority: BR
Inventors: Lixin DAI; Julia Borden; Jeffrey Nelson; Kristin Ruebling-Jass
Original assignee: Modern Meadow, Inc.
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2019-03-26
Also published as: CN109321480B; FI3438125T3; JP7402604B2; JP2023179488A; EP3438125B1; KR20190013627A; JP2019047774A; US20190040400A1; DK3438125T3; CN109321480A; CA3012006A1; ES2967088T3; EP3438125A1

Abstract

são descritas cepas de levedura geneticamente manipuladas para produzir quantidades aumentadas de colágeno não hidroxilado ou de colágeno hidroxilado. uma sequência de dna de colágeno quimérico compreendendo de 10 a 40 por cento ou de 60 a 90 por cento de dna otimizado com base no comprimento total do dn de colágeno quimérico. também é descrito um vetor multifuncional que inclui o dna necessário para produzir colágeno, promotores e enzimas de hidroxilação. também são fornecidos métodos para a produção de colágeno não hidroxilado ou hidroxilado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US

N. 62/539,213, depositado em 31 de julho de 2017, que é incorporado por referência neste documento.

[002] Este pedido é relacionado aos pedidos de patente US N.^o

15/433,566, intitulado Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils e 15/433,650, intitulado Method for Making a Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils que são incorporados por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO [003] Esta invenção refere-se a cepas de levedura geneticamente manipuladas e modos para produzir colágeno recombinante que é utilizado para produzir couro biofabricado ou um material com propriedades semelhantes a couro contendo o colágeno recombinante ou manipulado. As cepas de levedura foram concebidas para permitir o controle das propriedades estruturais e texturais do colágeno recombinante, selecionando um grau particular de hidroxilação do colágeno recombinante. Isto permite adaptar as propriedades de um colágeno recombinante a uma utilização final particular, por exemplo, para incorporação numa variedade de diferentes couros ecológicos biofabricados sem crueldade e materiais semelhantes.

Descrição da Técnica Relacionada [004] Utiliza-se couro em uma ampla variedade de aplicações, incluindo por estofamento de móveis, roupas, sapatos, malas, bolsas, acessórios e aplicações automotivas. O valor comercial global estimado em couro é de aproximadamente US$ 100 bilhões por ano (Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade, Organização das Nações Unidas

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 8/102 / 62 para o Desenvolvimento Industrial, Viena, 2010) e há uma demanda contínua e crescente por produtos de couro. São necessárias novas formas de atender a essa demanda em vista dos custos econômicos, ambientais e sociais da produção de couro. Para acompanhar as tendências tecnológicas e estéticas, os produtores e usuários de produtos de couro buscam novos materiais que exibem resistência superior, uniformidade, processabilidade e propriedades estéticas elegantes e atraentes que incorporam componentes naturais.

[005] Dado o crescimento populacional e o meio ambiente global haverá a necessidade de materiais alternativos que tenham estética semelhante ao couro e funcionalidades aprimoradas. O couro é a pele de animal e consiste quase inteiramente em colágeno. Há necessidade de novas fontes de colágeno que possam ser incorporadas em materiais de couro biofabricados.

[006] A produção de couro biofabricado usando colágeno expresso de forma recombinante enfrenta uma série de desafios, incluindo a necessidade de um método para produzir eficientemente o colágeno em formas e quantidades necessárias para diversos pedidos comerciais. Para alguns pedidos, um componente de colágeno mais macio e permeável é desejado; em outros, um componente de colágeno mais duro, mais resistente e durável é necessário.

[007] A expressão recombinante de alguns colágenos e proteínas semelhantes ao colágeno é conhecida; veja Bell, EP 1232182B1, Bovine collagen and methodfor producing recombinant gelatin; Olsen, et al., Patente U.S. N.° 6,428,978, Methods for the production of gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells; VanHeerde, et al., Patente U.S. NÃ 8,188,230, Método para expressão de micro-organismos recombinantes e isolamento de polipeptídeos do tipo colágeno, as divulgações dos quais são incorporadas por referência neste documento. Tais colágenos recombinantes não têm sido utilizados para produzir couro ou produtos de couro biofabricados.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 9/102 / 62 [008] Vetores úteis para expressar proteínas em leveduras são conhecidos; ver Ausubel et al., Em: Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Capítulo 13 Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. (1987), Expression and Secretion Vectors for Yeast, em Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, NY 153: 516-544; Glover (1986) DNA Cloning, vol. II, IRL Press, Wash., DC, Ch. 3; Bitter (1987), Heterologous Gene Expression in Yeast, em Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152:673-684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II (1982), as divulgações dos quais são incorporadas neste documento por referência. Os vetores de expressão de leveduras são disponibilizados comercialmente, por exemplo, conforme descrito nos catálogos da ThermoFisher Scientific (www._thermofisher.com); ATUM (https://www._atum.bio/products/expression-vectors/yeast); ou IBA (https://www._iba-lifesciences.com/cloning-yeast-vectors.html) (todos eles acessados pela última vez em 16 de julho de 2018, e incorporados por referência).

[009] Pichia pastoris é uma espécie de levedura que foi utilizada para expressar proteínas bioterapêuticas de maneira recombinante, tais como o interferon gama humano, ver Razaghi, et al., Biologicals 45: 52-60 (2017). Este foi utilizado para expressar colágeno de tipo III e prolil-4-hidroxilase, ver Vuorela, et al., EMBO J. 16: 6702-6712 (1997). O colágeno e a prolil-4hidroxilase também foram expressos em Escherichia coli para produzir um material colagenoso, ver Pinkas, et al., ACS Chem. Biol. 6(4):320-324 (2011).

[0010] O uso de modificação de códon para fornecer tropocolágeno com um grau seleto de hidroxilação, fornecendo assim uma gama de diferentes materiais de colágeno para uso na produção de couros de bioengenharia, não foi explorado anteriormente.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 10/102 / 62 [0011] Os inventores procuraram abordar estes desafios através da engenharia de leveduras recombinantes que podem expressar abundantemente colágeno em diferentes formas caracterizadas por um grau seletivo de hidroxilação.

RESUMO DA INVENÇÃO [0012] Um aspecto da invenção é direcionado a uma cepa de levedura recombinante manipulada para expressar colágeno eficientemente e para controlar um grau de hidroxilação de resíduos de lisina e prolina no colágeno expresso. Este aspecto da invenção proporciona uma levedura recombinante que pode expressar colágeno recombinante possuindo um grau selecionado de hidroxilação para resíduos de lisina, prolina ou lisina e prolina, com base no número de resíduos de lisina, prolina ou lisina e prolina no colágeno. O grau de hidroxilação do colágeno se correlaciona com a frouxidão ou firmeza da tripla hélice de colágeno ou tropocolágeno e com propriedades funcionais e estéticas dos produtos, tais como couros biofabricados, feitos com o colágeno recombinante.

[0013] Outras modalidades da invenção incluem sequências de códon modificadas de ácidos nucleicos que codificam o colágeno ou hidroxilases, vetores, tais como “vetores all-in-one” que codificam colágeno e hidroxilase(s), e métodos para a produção e utilização de colágenos recombinantes. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona sequências de DNA quimérico em hospedeiros de levedura que são úteis na produção de colágeno hidroxilado e não hidroxilado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0014] A FIG. 1 mostra o diagrama vetorial de MMV 63 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

[0015] A FIG. 2 mostra o diagrama vetorial de MMV-77 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

[0016] A FIG. 3 mostra o diagrama vetorial de MMV-129 que foi

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 11/102 / 62 projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

[0017] A FIG. 4 mostra o diagrama vetorial de MMV-130 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

[0018] A FIG. 5 mostra o diagrama vetorial de MMV-78 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

[0019] A FIG. 6 mostra o diagrama vetorial de MMV-94 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

[0020] A FIG. 7 mostra o diagrama vetorial de MMV-156 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

[0021] A FIG. 8 mostra o diagrama vetorial de MMV-191 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

[0022] A FIG. 9 mostra um vetor MMV-208 multifuncional que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado ou hidroxilado.

[0023] A FIG. 10 mostra o diagrama vetorial de MMV-84.

[0024] A FIG. 11 mostra o diagrama vetorial de MMV-150.

[0025] A FIG. 12 mostra o diagrama vetorial de MMV-140.

[0026] A FIG. 13 mostra o diagrama vetorial de MMV-132.

[0027] A FIG. 14 mostra o diagrama vetorial de MMV-193.

[0028] A FIG. 15 mostra o diagrama vetorial de MMV-194 [0029] A FIG. 16 mostra o diagrama vetorial de MMV-195, [0030] A FIG. 17 mostra o diagrama vetorial de MMV-197.

[0031] A FIG. 18 mostra o diagrama vetorial de MMV-198.

[0032] A FIG. 19 mostra o diagrama vetorial de MMV-199.

[0033] A FIG. 20 mostra o diagrama vetorial de MMV-200.

[0034] A FIG. 21 mostra o diagrama vetorial de MMV-128.

[0035] A FIG. 22 descreve moléculas quiméricas de Col3A1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0036] Como exemplificado neste documento, Pichia pastoris foi utilizado para expressar colágeno bovino Tipo III recombinante com

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 12/102 / 62 diferentes graus de hidroxilação. A hidroxilação do colágeno recombinante foi conseguida por co-expressão de P4HA bovina e P4HB bovina que codificam respectivamente as subunidades alfa e beta prolil-4-hidroxilase bovina. No entanto, a invenção não está limitada a produtos e expressão de colágeno de Tipo III e pode ser praticado com polinucleotídeos que codificam as subunidades de outros tipos de colágenos, bem como com enzimas que hidroxilam resíduos de prolina, resíduos de lisina ou ambos resíduos de prolina e lisina. O tropocolágeno tipo III é um homotrímero. No entanto, em algumas modalidades, um colágeno irá formar um heterotrímero composto por diferentes cadeias polipeptídicas, tais como o colágeno Tipo I, que é inicialmente composto por duas cadeias pro-a1 (I) e uma cadeia pro-a2 (I).

[0037] Colágeno. O colágeno é o principal componente do couro. A pele de animais contém quantidades significativas de colágeno, uma proteína fibrosa. O colágeno é um termo genérico para uma família de pelo menos 28 tipos distintos de colágeno; a pele do animal é, normalmente, colágeno tipo I, embora outros tipos de colágeno possam ser utilizados na formação de couro, incluindo o colágeno tipo III. O termo “colágeno” engloba não processado (por exemplo, procolágenos) bem como colágenos modificados pós-tradução e proteolisados possuindo uma estrutura helicoidal tripla.

[0038] Os colágenos são caracterizados pela repetição de um tripleto de aminoácidos, -(Gly-X-Y)n-, e aproximadamente um terço dos resíduos de aminoácidos no colágenos são glicina. X, muitas vezes, é prolina e Y, muitas vezes, é hidroxiprolina, embora possa haver até 400 tripletos de Gly-X-Y possíveis. Diferentes animais podem produzir colágenos com diferentes composições de aminoácidos, que podem conferir propriedades diferentes ao colágeno e produzir couros com propriedades ou aparências diferentes.

[0039] A estrutura de colágeno pode consistir em três cadeias peptídicas entrelaçadas de comprimentos diferentes. Hélices triplas de colágenos (ou monômeros) podem ser produzidas a partir de cadeias alfa de

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 13/102 / 62 cerca de 1.050 aminoácidos de comprimento, de modo que a hélice tripla assuma a forma de uma haste com aproximadamente 300 nm de comprimento, com um diâmetro de aproximadamente 1,5 nm.

[0040] As fibras de colágeno podem ter uma faixa de diâmetros, dependendo do tipo de pele de animal. Além do colágeno tipo I, a pele (couro) também pode incluir outros tipos de colágeno, incluindo colágeno tipo III (reticulina), colágeno tipo IV e colágeno tipo VII.

[0041] Existem vários tipos de colágeno em todo o corpo dos mamíferos. Por exemplo, além de ser o principal componente da pele e do couro animal, o colágeno tipo I também existe na cartilagem, no tendão, na ligadura vascular, nos órgãos, nos músculos e na porção orgânica do osso. Esforços bem-sucedidos foram realizados para isolar o colágeno de várias regiões do corpo de mamíferos, além da pele ou couro do animal. Décadas atrás, pesquisadores descobriram que, em pH neutro, o colágeno solubilizado por ácido se auto-montava em fibrilas compostas pelos mesmos padrões cruzados que se observavam no tecido nativo; Schmitt F.O. J. Cell. Comp Physiol.1942;20:11. Isso levou à utilização de colágeno na engenharia de tecidos e em uma variedade de aplicações biomédicas. Em anos mais recentes, colágeno foi colhido de bactérias e leveduras utilizando técnicas recombinantes.

[0042] Colágenos são formados e estabilizados por meio de uma combinação de interações físicas e químicas, tal como interações eletrostáticas incluindo interações de pontes de sal, ligações de hidrogênio, de Van der Waals, forças dipolo-dipolo, forças de polarização, interações hidrofóbicas e ligações covalentes, muitas vezes catalisadas por reações enzimáticas. Vários tipos distintos de colágeno foram identificados em vertebrados, incluindo colágenos bovinos, ovinos, suínos, de frango e humanos.

[0043] A invenção pode ser praticada com polinucleotídeos que

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 14/102 / 62 codificam um ou mais tipos de colágeno. Em geral, os tipos de colágeno são numerados por algarismos romanos e as cadeias encontradas em cada tipo de colágeno são identificadas por algarismos arábicos. Descrições detalhadas da estrutura e funções biológicas dos vários tipos diferentes de colágenos de ocorrência natural são disponíveis na técnica; vide, por exemplo, Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E., e Nimmi (1992) Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution em Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, C. M. et al. (1993) The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix, Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. e B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; e Prockop, D.J- and K.I. Kivirikko (1995) Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy, Annu. Rev. Biochem., 64:403-434.) [0044] O colágeno tipo I é o principal colágeno fibrilar de osso e pele, compreendendo aproximadamente 80-90% do colágeno total de um organismo. O colágeno tipo I é a macromolécula estrutural principal presente na matriz extracelular de organismos multicelulares e compreende aproximadamente 20% da massa total de proteínas. O colágeno tipo I é uma molécula heterotrimérica que compreende duas cadeias α1 (I) e uma cadeia α2 (I), codificadas pelos genes COL1A1 e COL1A2, respectivamente. In vivo, a montagem de fibrilas, fibras e feixes de fibras de colágeno Tipo I ocorre durante o desenvolvimento e fornece suporte mecânico ao tecido enquanto permite a mobilidade celular e o transporte de nutrientes. Outros tipos de colágeno são menos abundantes que o colágeno tipo I e exibem padrões de distribuição diferentes. Por exemplo, o colágeno tipo II é o colágeno predominante em cartilagem e humor vítreo, ao passo que o colágeno tipo III é encontrado em níveis elevados nos vasos sanguíneos e, em menor grau, na pele.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 15/102 / 62 [0045] O colágeno tipo II é um colágeno homotrimérico compreendendo três cadeias idênticas de al(II) codificadas pelo gene COL2A1. O colágeno tipo II purificado pode ser preparado a partir de tecidos por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por procedimentos descritos em Miller e Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64.

[0046] O colágeno tipo III é um importante colágeno fibrilar encontrado na pele e nos tecidos vasculares. O colágeno tipo III é um colágeno homotrimérico compreendendo três cadeias a1(III) idênticas codificadas pelo gene COL3A1. Os métodos para purificar o colágeno de tipo

III dos tecidos podem ser encontrados, por exemplo, em Byers et al. (1974) Biochemistry 13: 5243-5248; e Miller e Rhodes, supra e pode ser usado em conjunção com colágeno expresso por um método da invenção [0047] Encontra-se colágeno tipo IV em membranas basais na forma de folhas em vez de fibrilas. Mais comumente, o colágeno tipo IV contém duas cadeias α1 (IV) e uma cadeia α2 (IV). As cadeias particulares compreendendo colágeno tipo IV são específicas do tecido. O colágeno tipo

IV pode ser purificado utilizando-se, por exemplo, os procedimentos descritos em Furuto e Miller (1987) Methods in Enzymology, 144:41-61, Academic Press.

[0048] O colágeno tipo V é um colágeno fibrilar encontrado principalmente em ossos, tendões, córnea, pele e vasos sanguíneos. O colágeno tipo V existe tanto em formas homotriméricas como heterotriméricas. Uma forma de colágeno tipo V é um heterotrímero de duas cadeias α1 (V) e uma cadeia α2 (V). Outra forma de colágeno do tipo V é um heterotrímero das cadeias α1 (V), α2 (V) e α3 (V). Uma forma adicional de colágeno tipo V é um homotrímero de a1(V). Métodos para isolar o colágeno tipo V de fontes naturais podem ser encontrados, por exemplo, em Elstow e Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, e Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2:493-502.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 16/102 / 62 [0049] O colágeno tipo VI possui uma região helicoidal tripla pequena e duas porções remanescentes não colagenosas grandes. O colágeno tipo VI é um heterotrímero que compreende as cadeias a1(VI), a2(VI) e a3(VI). Encontra-se colágeno tipo VI em muitos tecidos conjuntivos. Descrições de como purificar o colágeno tipo VI de fontes naturais podem ser encontradas, por exemplo, em Wu et al. (1987) Biochem. J. 248:373-381, e Kielty et al. (1991) J. Cell Sci. 99:797-807.

[0050] O colágeno tipo VII é um colágeno fibrilar encontrado em determinados tecidos epiteliais. O colágeno tipo VII é uma molécula homotrimérica de três cadeias a1(VII). Descrições de como purificar o colágeno tipo VII do tecido podem ser encontradas, por exemplo, em Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048 e Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3168-3172.O colágeno tipo VIII pode ser encontrado na membrana de Descemet na córnea. O colágeno tipo VIII é um heterotrímero que compreende duas cadeias a1(VIII) e uma cadeia a2(VIII), embora outras composições de cadeias tenham sido relatadas. Métodos para a purificação de colágeno tipo VIII da natureza podem ser encontrados, por exemplo, em Benya e Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261:4160-4169, e Kapoor et al. (1986) Biochemistry 25:3930-3937.

[0051] O colágeno tipo IX é um colágeno associado à fibrila encontrado em cartilagem e humor vítreo. O colágeno tipo IX é uma molécula heterotrimérica que compreende cadeias a1(IX), a2(IX) e a3(IX). O colágeno tipo IX foi classificado como um colágeno FACIT (Colágenos associados à fibrilação com hélice tripla interrompida), possuindo vários domínios helicoidais triplas separados por domínios helicoidais não triplos. Os procedimentos para purificar o colágeno tipo IX podem ser encontrados, por exemplo, em Duance, et al. (1984) Biochem. J. 221:885-889; Ayad et al. (1989) Biochem. J. 262:753-761; e Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A. M., ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdã, pp. 3Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 17/102 / 62

28.

[0052] O colágeno tipo X é um composto homotrimérico de cadeias a1(X). O colágeno tipo X foi isolado de, por exemplo, cartilagem hipertrófica encontrada em placas de crescimento; vide, por exemplo, Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1):217-24.

[0053] O colágeno tipo XI pode ser encontrado em tecidos cartilaginosos associados a colágenos tipo II, tipo IX e em outros locais do corpo. O colágeno tipo IX é uma molécula heterotrimérica que compreende cadeias a1(XI), a2(XI) e a3(XI). Os métodos de purificação de colágeno tipo XI podem ser encontrados, por exemplo, em Grant et al., supra.

[0054] O colágeno tipo XII é um colágeno FACIT encontrado principalmente em associação com o colágeno tipo I. O colágeno tipo XII é uma molécula homotrimérica compreendendo três cadeias a1(XII). Métodos para purificar o colágeno tipo XII e suas variantes podem ser encontrados, por exemplo, em Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; e Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20093-20099.

[0055] O tipo XIII é um colágeno não fibrilar encontrado, por exemplo, na pele, intestino, osso, cartilagem e músculo estriado. Uma descrição detalhada do colágeno tipo XIII pode ser encontrada, por exemplo, em Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700-24707.

[0056] O tipo XIV é um colágeno FACIT caracterizado como uma molécula homotrimérica compreendendo cadeias a1(XIV). Métodos para isolar o colágeno tipo XIV podem ser encontrados, por exemplo, em AubertFoucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764, e Watt et al., supra.

[0057] O colágeno tipo XV é homólogo em estrutura ao colágeno tipo

XVIII. Informações sobre a estrutura e isolamento do colágeno tipo XV natural podem ser encontradas, por exemplo, em Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics

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14:220-224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 4773-4779; e Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264:4042-4046.

[0058] O colágeno tipo XVI é um colágeno associado à fibrila, encontrado, por exemplo, na pele, nos fibroblastos pulmonares e nos queratinócitos. Informações sobre a estrutura do colágeno tipo XVI e o gene que codifica o colágeno tipo XVI podem ser encontradas, por exemplo, em Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; e Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112:856-863.

[0059] O colágeno tipo XVII é um colágeno transmembrana hemidesmosal, também conhecido como antígeno penfigoide bolhoso. Informações sobre a estrutura do colágeno tipo XVII e o gene que codifica o colágeno tipo XVII podem ser encontradas, por exemplo, em Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; e McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1):83-86.

[0060] O colágeno tipo XVIII é semelhante em estrutura ao colágeno tipo XV e pode ser isolado do fígado. Descrições das estruturas e isolamento do colágeno tipo XVIII a partir de fontes naturais podem ser encontradas, por exemplo, em Rehn e Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:42344238; Oh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; e Oh et al. (1994) Genomics 19: 494-499.

[0061] Acredita-se que o colágeno tipo XIX seja outro membro da família de colágeno FACIT e foi encontrado em mRNA isolado de células de rabdomiossarcoma. Descrições das estruturas e isolamento do colágeno tipo XIX podem ser encontradas, por exemplo, em Inoguchi et al. (1995) J. Biochem. 117:137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13:884-886; and Myers et al., J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994).

[0062] O colágeno tipo XX é um membro recém encontrado da família colágena FACIT e foi identificado na córnea de galinha; veja, por

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 19/102 / 62 exemplo, Gordon et al. (1999) FASEB Journal 13:A1119; e Gordon et al. (1998), IOVS 39:S1128.

[0063] Um ou mais tipos de colágeno podem ser expressos utilizando um método da invenção e o colágeno expresso adicionalmente processado ou purificado como descrito pelas referências citadas acima, as quais são incorporadas por referência para todos os fins.

[0064] O termo colágeno se refere a qualquer um dos tipos de colágenos conhecidos, incluindo os colágenos de tipo I a XX acima descritos, assim como a quaisquer outros colágenos, sejam naturais, sintéticos, semissintéticos ou recombinantes. Inclui-se todos os colágenos, colágenos modificados e proteínas semelhantes a colágeno descritas neste documento. O termo também abrange pró-colágenos e proteínas semelhantes a colágeno ou proteínas colagenosas compreendendo o motivo (Gly-X-Y)n no qual n é um número inteiro. Engloba-se moléculas de colágeno e proteínas semelhantes ao colágeno, trímeros de moléculas de colágeno, fibrilas de colágeno e fibras de fibrilas de colágeno. Refere-se também a colágenos quimica, enzimatica ou recombinantemente modificados ou moléculas semelhantes a colágeno que podem ser fibrilados, assim como fragmentos de colágeno, moléculas semelhantes a colágeno e moléculas colágenas capazes de se montar em uma nanofibra. As moléculas de colágeno recombinantes, sejam elas nativas ou manipuladas, compreenderão geralmente a sequência não repetida (Gly-X-Y) descrita neste documento.

[0065] Hidroxilação de resíduos de prolina e lisina em colágeno. As principais modificações pós-tradução dos polipeptídeos de colágeno são a hidroxilação de resíduos de prolina e/ou lisina para dar 4-hidroxiprolina, 3hidroxiprolina (Hyp) e/ou hidroxilisina (Hyl) e glicosilação dos resíduos de hidroxilisil. Essas modificações são catalisadas por três hidroxilases-- prolil 4hidroxilase, prolil 3-hidroxilase e lisil hidroxilase -- e duas transferases glicosil. In Vivo, estas reações ocorrem até os polipeptídeos formarem a

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 20/102 / 62 estrutura de colágeno helicoidal triplo, que inibe modificações adicionais.

[0066] Prolil-4-hidroxilase. Esta enzima catalisa a hidroxilação de resíduos de prolina em (2S, 4R) -4-hidroxiprolina (Hyp). Gorres, et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 45 (2): (2010) que é incorporado por referência. Os Exemplos abaixo empregam prolil-4hidroxilase bovina tetramérica (cadeias 2 alfa e 2 beta) codificadas por P4HA (SEQ ID NO: 54) e P4HB (SEQ ID NO: 52), no entanto, isoformas, ortólogas, variantes, fragmentos e prolil-4-hidroxilase de fontes não-bovinas podem também ser utilizados desde que mantenham a atividade de hidroxilase numa célula hospedeira de levedura. O P4HA1 é adicionalmente descrito por http://omom.org/entry/176710 e P4HB1 e P4HB1 por http://www.omim.org/entry/176790, ambos incorporados por referência.

[0067] Prolil 3-hidroxilase. Esta enzima catalisa a hidroxilação de resíduos de prolina. O precursor 1 de prolil 3-hidroxilase [Bos taurus] é descrito pela Sequência de Referência NCBI: NP_001096761.1 ou por NM_001103291.1 (SEQ ID NO: 48). Para descrição adicional, ver Vranka, et al., J. Biol. Chem. 279: 23615-23621 (2004) ou http:

//_www.omim.org/entry/610339 (acessado pela última vez em 14 de julho de 2017) que é incorporado por referência. Esta enzima pode ser usada em sua forma nativa. Contudo, isoformas, ortólogos, variantes, fragmentos e prolil-3hidroxilase de fontes não-bovinas podem também ser utilizados desde que mantenham a atividade de hidroxilase numa célula hospedeira de levedura.

[0068] Lisil-hidroxilase. A lisil-hidroxilase (EC 1.14.11.4) catalisa a formação de hidroxilisina em colágenos e outras proteínas com sequências de aminoácidos semelhantes ao colágeno, pela hidroxilação de resíduos de lisina em sequências X-lys-gly. A enzima é um homodímero que consiste em subunidades com uma massa molecular de cerca de 85 kD. Não foi encontrada homologia significativa entre as estruturas primárias da lisilhidroxilase e os 2 tipos de subunidades da prolil-4-hidroxilase (176710,

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176790), apesar das semelhanças marcantes nas propriedades cinéticas entre estas 2 hidroxilases de colágeno. Os resíduos de hidroxilisina formados na reação lisil-hidroxilase têm 2 funções importantes: primeiro, os seus grupos hidroxil servem como locais de ligação para unidades de carboidrato, quer o monossacarídeo galactose quer o dissacarídeo glucosilgalactose; e segundo, estabilizam as ligações cruzadas intermoleculares de colágeno.

[0069] PLOD1 procolágeno-lisina,2-oxoglutarato 5-dioxigenase 1 [Bos taurus (bovinos)] é descrita pelo Gene ID: 281409, atualizado em 25 de maio de 2017 e incorporado por referência a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409 (acessado pela última vez em 14 de julho de 2017). Outro exemplo é descrito pela SEQ ID NO: 50, que descreve Bos taurus lisil oxidase (LOX). Esta enzima pode ser usada em sua forma nativa. Contudo, isoformas, ortólogos, variantes, fragmentos e lisilhidroxilase de fontes não-bovinas podem também ser utilizados desde que mantenham a atividade de hidroxilase numa célula hospedeira de levedura.

[0070] Ensaio do grau de hidroxilação de resíduos de prolina em colágeno recombinante. O grau de hidroxilação de resíduos de prolina em colágeno recombinante pode ser ensaiado por métodos conhecidos, incluindo por espectrometria de massa com cromatografia líquida, como descrito por Chan, et al. Biotecnologia BMC 12:51 (2012), que é incorporado por referência.

[0071] Ensaio do grau de hidroxilação de resíduos de lisina em colágeno recombinante. Hidroxilação de lisina e reticulação do colágeno é descrita por Yamauchi, et al., Methods in Molecular Biology, vol. 446, pgs 95-108.; Humana Press (2008), que é incorporado por referência. O grau de hidroxilação de resíduos de lisina em colágeno recombinante pode ser ensaiado por métodos conhecidos, incluindo pelo método descrito por Hausmann, Biochimica e Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 133 (3): 591-593 (1967) que é incorporado por referência.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 22/102 / 62 [0072] Ponto de fusão de colágeno. O grau de hidroxilação dos resíduos prolina, lisina ou prolina e lisina no colágeno pode ser estimado pela temperatura de fusão de um colágeno hidratado, tal como um hidrogel, em comparação com um colágeno de controle possuindo um conteúdo conhecido de resíduos de aminoácidos hidroxilados. As temperaturas de fusão do colágeno podem variar entre 25 e 40^oC com colágenos mais altamente hidroxilados, geralmente com temperaturas de fusão mais elevadas. Este faixa inclui todos os sub-intervalos e valores intermediários, incluindo 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 e 40.

[0073] Modificação de códon. Este processo inclui a alteração de uma sequência polinucleotídica codificando colágeno, tal como a sequência de DNA de colágeno encontrada na natureza, para modificar a quantidade de colágeno recombinante expresso por uma levedura, tal como Pichia pastoris, para modificar a quantidade de colágeno recombinante segregado pela levedura recombinante, para modificar a velocidade de expressão do colágeno recombinante na levedura recombinante, ou para modificar o grau de hidroxilação de resíduos de lisina ou prolina no colágeno recombinante. A modificação de códons pode também ser aplicada a outras proteínas, tais como hidroxilases, para fins semelhantes ou para direcionar hidroxilases para compartimentos intracelulares ou extracelulares particulares, por exemplo, para direcionar uma prolina hidroxilase para o mesmo compartimento, tal como o retículo endoplasmático, como molécula de colágeno recombinante.

[0074] As seleções de códons podem ser feitas com base no efeito na estrutura secundária de RNA, efeito na transcrição e expressão de gene, efeito na velocidade de elongação da tradução e/ou no efeito no enrolamento de proteína.

[0075] Códons que codificam colágeno ou hidroxilase podem ser modificados para reduzir ou aumentar a estrutura secundária em mRNA codificando colágeno recombinante ou a hidroxilase ou podem ser

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 23/102 / 62 modificados para substituir um códon redundante por um códon que, em média, é utilizado mais frequentemente por uma célula hospedeira de levedura em todas as sequências de codificação de proteínas na levedura (por exemplo, amostragem por códon), é utilizada com menor frequência por uma célula hospedeira de levedura com base em todas as sequências de codificação de proteína na levedura (por exemplo, amostragem de códon), ou códons redundantes que aparecem em proteínas que são abundantemente expressas por células hospedeiras de levedura ou que aparecem em proteínas que são secretadas por células hospedeiras de levedura (por exemplo, uma seleção de códon baseada em um Alto Índice de Adaptação de Códon que faz com que o gene “pareça” um gene ou gene altamente expresso que codifica uma proteína secretável do hospedeiro de expressão).

[0076] A modificação de códon pode ser aplicada ao todo ou a parte de uma sequência codificadora de proteína, por exemplo, a pelo menos um dentre os primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo 10% de uma sequência de codificação, ou combinações dos mesmos. Pode também ser aplicada seletivamente a um códon codificando um aminoácido particular ou a códons codificando alguns, mas não todos, dos aminoácidos que são codificados por códons redundantes. Por exemplo, apenas códons para leucina e fenilalanina podem ser modificados por códon como descrito acima. Os aminoácidos codificados por mais do que um códon são descritos pela tabela de códons em que é bem conhecida na técnica e que é incorporada por referência a https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table (última acesso em 13 de Julho de 2017 ).

[0077] A modificação de códons inclui os chamados métodos de otimização de códons descritos em https://www.atum.bio/services/genegps (último acesso em 13 de julho de 2017), por https://www.idtdna.com/CodonOpt; por

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 24/102 / 62 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1523223/, ou por https://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm, que são incorporados por referência.

[0078] A modificação de códons também inclui a seleção de códons de modo a permitir a formação de estrutura secundária de mRNA ou a minimizar ou eliminar a estrutura secundária. Um exemplo disto é fazer seleções de códons de modo a eliminar, reduzir ou enfraquecer a estrutura secundária forte da estrutura secundária em ou à volta de um local de ligação ao ribossoma ou códon de iniciação.

[0079] Fragmentos de Colágeno. Uma molécula de colágeno recombinante pode compreender um fragmento da sequência de aminoácidos de uma molécula de colágeno nativa capaz de formar tropocolágeno (colágeno trimérico) ou uma molécula de colágeno modificada ou molécula de colágeno truncada possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idênticas ou semelhantes a uma sequência de aminoácidos de colágeno nativo (ou a uma região de formação de fibril deste ou a um segmento compreendendo substancialmente [Gly-X-Y] n), tais como as das sequências de aminoácidos de Col1A1 Col1A2 e Col3A1, descritos pelos N.^os de acesso NP_001029211.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252, acessado pela última vez em 9 de fevereiro, 2017), NP_776945.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257 acessado pela última vez em 9 de fevereiro, 2017) e NP_001070299.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881 acessado pela última vez em 9 de fevereiro, 2017) que são incorporados neste documento por referência.

[0080] Um gene que codifica colágeno ou uma hidroxilase pode ser truncado ou modificado de outro modo para adicionar ou remover sequências. Tais modificações podem ser feitas para personalizar o tamanho de um

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 25/102 / 62 polinucleotídeo ou vetor, para direcionar a proteína expressa para o retículo endoplasmático ou outro compartimento celular ou extracelular, ou para controlar o comprimento de uma proteína codificada. Por exemplo, os inventores descobriram que os construtos contendo apenas a sequência Pre geralmente funcionam melhor do que aquelas contendo toda a sequência Prepro. A sequência Pre foi fundida ao P4HB para localizar o P4HB no ER, onde o colágeno também se localiza.

[0081] Sequências de codificação modificadas para colágenos e hidroxilases. Uma sequência de codificação polinucleotídica para colágeno ou hidroxilase, ou outras proteínas, pode ser modificada para codificar uma proteína que é pelo menos 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 100% idêntica ou semelhante a uma sequência de aminoácido conhecido e que retém as propriedades essenciais da molécula não modificada, por exemplo, a capacidade de formar tropocolágeno ou a capacidade de hidroxilase prolina ou resíduos de lisina no colágeno. Sítios de glicosilação numa molécula de colágeno podem ser removidos ou adicionados. Modificações podem ser feitas para facilitar o rendimento de colágeno ou a sua secreção por uma célula hospedeira de levedura ou para alterar as suas propriedades estruturais, funcionais ou estéticas. Uma sequência de codificação de colágeno ou hidroxilase modificada pode também ser modificada por códon como descrito neste documento.

[0082] Os termos “colágeno nativo”, “polipeptídeo nativo” ou “polinucleotídeo nativo” referem-se ao polipeptídeo ou sequência polinucleotídica, tal como são encontrados na natureza, por exemplo, sem deleção, adição de substituição de resíduos de aminoácidos ou polinucleotídeos, sem alteração da sequência nativa, por exemplo, por deleção, inserção ou substituição de um nucleotídeo, tal como uma alteração por modificação de códon. Os tipos de colágenos e enzimas descritos neste documento incluem as suas formas nativas bem como formas modificadas que

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 26/102 / 62 retêm uma atividade biológica do colágeno nativo ou enzima. Formas modificadas de polinucleotídeos e polipeptídeos podem ser identificadas por aqueles que possuem um grau particular de identidade de sequência ou semelhança com uma sequência nativa correspondente. As sequências polinucleotídicas modificadas incluem também aquelas com 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade ou semelhança de sequência com qualquer um dos vetores descritos neste documento ou com qualquer um dos elementos polinucleotídicos que constituem estes vetores tal como representado por exemplo nas FIGS. 1-20.

[0083] BLASTN pode ser utilizado para identificar uma sequência polinucleotídica com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% ou <100% de identidade de sequência a um polinucleotídeo de referência, tal como um polinucleotídeo que codifica um colágeno, uma ou mais hidroxilases descritas neste documento, ou peptídeos de sinal, líder ou de secreção ou quaisquer outras proteínas divulgadas neste documento. Uma configuração de BLASTN representativa modificada para encontrar sequências altamente semelhantes utiliza um Expect thresold de 10 e um Wordsize de 28, correspondências máximas na faixa de consulta de 0, pontuações de correspondência/incompatibilidade de 1/-2 e custo de intervalo linear. Regiões de baixa complexidade podem ser filtradas ou mascaradas. As configurações padrão de um BLAST padrão de nucleotídico são descritas e incorporadas por referência a https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE= BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (último acesso em 13 de julho de 2017).

[0084] O BLASTP pode ser utilizado para identificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98% , 99% ou <100% de identidade de sequência ou semelhança com um aminoácido de referência, tal como uma sequência de

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 27/102 / 62 aminoácido de colágeno, utilizando uma matriz de semelhança tal como BLOSUM45, BLOSUM62 ou BLOSUM80, na qual BLOSUM45 pode ser utilizado para sequências aproximadamente relacionadas, BLOSUM62 para sequência de intervalo médio e BLOSUM80 para sequência mais distantemente relacionadas. Exceto quando indicado, uma pontuação de similaridade será baseada na utilização de BLOSUM62. Quando o BLASTP é utilizado, a similaridade percentual é baseada na pontuação positiva de BLASTP e a identidade de sequência percentual é baseada na pontuação de identidades do BLASTP. As identidades BLASTP mostram o número e a fração de resíduos totais nos pares de sequências de alta pontuação que são idênticos; e Positivos BLASTP mostram o número e a fração de resíduos para os quais as pontuações de alinhamento têm valores positivos e que são semelhantes entre si. As sequências de aminoácidos com estes graus de identidade ou semelhança ou qualquer grau intermediário de identidade ou semelhança com as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento são contempladas e abrangidas por esta divulgação. Uma configuração de BLASTP representativa que utiliza um Expect Threshold de 10, um Wordsize de 3, BLOSUM 62 como uma matriz e uma Gap Penalty de 11 (Existência) e 1 (Extensão) e um ajuste de matriz de escore condicional de composição. Outras configurações padrão do BLASTP são descritas e incorporadas por referência à divulgação, disponíveis em:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE= BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (último acesso em 13 de julho de 2017 ).

[0085] O termo seu derivado, sequência modificada ou análogo como aplicado aos polipeptídeos divulgados neste documento, referem-se a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70, 80, 90, 95 ou 99% idêntico ou semelhante à sequência de aminoácidos de uma molécula biologicamente ativa. Em algumas

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 28/102 / 62 modalidades, o derivado compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma sequência nativa ou previamente modificada. O derivado pode compreender adições, deleções, substituições ou uma sua combinação à sequência de aminoácidos de uma molécula nativa ou previamente modificada. Por exemplo, um derivado pode incorporar ou eliminar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de prolina ou lisina em comparação com uma sequência de colágeno nativa. Tais seleções podem ser feitas para modificar a frouxidão ou estanqueidade de um tropocolágeno recombinante ou colágeno fibrilado.

[0086] Um derivado pode incluir um polipeptídeo mutante com 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20, 21-25 ou 26-30 adições, substituições ou deleções de resíduos de aminoácidos. Adições ou substituições também incluem o uso de aminoácidos de ocorrência não natural ou aminoácidos modificados. Um derivado pode também incluir modificações químicas a um polipeptídeo, tais como ligações cruzadas entre resíduos de cisteína, ou resíduos hidroxilados ou glicosilados. Derivados incluem aqueles de todos os polipeptídeos, incluindo colágenos e enzimas, divulgados neste documento. Geralmente, um derivado terá pelo menos uma atividade biológica da molécula parental não modificada, assim um derivado de enzima terá geralmente a atividade enzimática da enzima parental e um derivado de colágeno pelo menos uma propriedade estrutural, química ou biológica do colágeno progenitor.

[0087] Couro Biofabricado. Qualquer tipo de colágeno, colágeno truncado, não modificado ou pós-traducionalmente modificado, ou colágeno modificado por sequência de aminoácido que pode ser fibrilado e reticulado pelos métodos descritos neste documento pode ser utilizado para produzir um material biofabricado ou couro biofabricado. O couro biofabricado pode

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 29/102 / 62 conter um colágeno substancialmente homogêneo, tal como apenas colágeno Tipo I ou Tipo III, ou pode conter misturas de 2, 3, 4 ou mais tipos diferentes de colágeno. Em algumas modalidades, um colágeno recombinante, por exemplo, um componente de um couro biofabricado, não terá nenhum dos seus resíduos de lisina, prolina ou lisina e prolina hidroxilados. Em outros, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% ou 100% (ou qualquer valor intermediário de sub-intervalo) da lisina, prolina, ou resíduos de lisina e prolina num colágeno recombinante serão hidroxilados.

[0088] Cepas de levedura. A presente invenção utiliza levedura para produzir colágeno. Leveduras adequadas incluem, mas não estão limitadas àquelas do gênero Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações das mesmas. A levedura pode ser modificada ou hibridizada. As leveduras hibridizadas são produzidas por criações mistas de diferentes cepas da mesma espécie, espécies diferentes do mesmo gênero ou cepas de diferentes gêneros. Algumas cepas de levedura que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem Pichia pastoris, Pichia membranifaciens, Pichia deserticola, Pichia cephalocereana, Pichia eremophila, Pichia myanmarensis, Pichia anomala, Pichia nakasei, Pichia siamensis, Pichia heedii, Pichia barkeri, Pichia norvegensis, Pichia thermomethanolica, Pichia stipites, Pichia subpelliculosa, Pichia exigua, Pichia occidentalis, e Pichia cactophila.

[0089] Em uma modalidade, a invenção é voltada a cepas Pichia pastoris que foram modificadas para expressar polinucleotídeos modificados por códons que codificam colágeno e/ou hidroxilase(s). As cepas hospedeiras Pichia pastoris úteis incluem, mas não estão limitadas a BG10 (tipo selvagem) (Cepa PPS-9010); BG 11, aox1A(MutS) (Cepa PPS-9011) que é um derivado de utilização lenta de metanol do PPS-9010; e BG16, pep4A, prb4A(cepa PPS-9016) que é deficiente em protease. Essas cepas estão disponíveis publicamente e podem ser obtidas no ATUM em

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[0090] Sequências de secreção de polipeptídeos para leveduras. Em algumas modalidades, um polipeptídeo codificado por uma célula hospedeira de levedura será fundido a uma sequência polipeptídica que facilita a sua secreção a partir da levedura, por exemplo, um vetor pode codificar um gene quimérico compreendendo uma sequência codificadora para colágeno fundido com uma sequência que codifica uma secreção peptídeo. Sequências de secreção que podem ser usadas para este propósito incluem sequência Pre-pro do fator de acoplamento alfa de Saccharomyces, sequência Pre do fator de acoplamento alfa de Saccharomyces, sinal de secreção de PHO1, sequência sinal da α-amilase de Aspergillus niger, Sequência sinal da glucoamilase de Aspergillus awamori, sequência de sinal de albumina sérica de Homo sapiens, sequência sinal de inulinase de Kluyveromcyes maxianus, Sequência sinal de invertase de Saccharomyces cerevisiae, Sequência sinal de proteína assassina de Saccharomyces cerevisiae e sequência sinal de lisozima de Gallus gallus. Outras sequências de secreção conhecidas na técnica podem também ser utilizadas.

[0091] Promotores de levedura e terminadores. Em algumas modalidades, um ou mais dos seguintes promotores de levedura podem ser incorporados num vetor para promover a transcrição de mRNA codificando colágeno ou uma hidroxilase. Os promotores são conhecidos na técnica e incluem pAOX1, pDas1, pDas2, pPMP20, pCAT, pDF, pGAP, pFDH1, pFLD1, pTAL1, pFBA2, pAOX2, pRKI1, pRPE2, pPEX5, pDAK1, pFGH1, pADH2, pTPI1, pFBP1, pTAL1, pPFK1, pGPM1, e pGCW14.

[0092] Em algumas modalidades, uma sequência terminadora de levedura é incorporada num vetor para terminar a transcrição de mRNA codificando colágeno ou uma hidroxilase. Os terminadores incluem, mas não se limitam a AOX1 TT, Das1 TT, Das2 TT, AODTT, PMPTT, Cat1TT, TPITT, FDH1TT, TEF1TT, FLD1TT, GCW14TT, FBA2TT, ADH2TT,

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FBP1TT e GAP TT.

[0093] Outras peptidases além da pepsina. A pepsina pode ser utilizada para processar o colágeno em tropolágeno, removendo as sequências dos terminais N e terminais C. Outras proteases, incluindo, mas não limitadas a colagenase, tripsina, quimiotripsina, papaína, ficina e bromelaína, podem também ser usadas para este propósito. Como utilizado neste documento, “colágeno estável” significa que, após ser exposto a uma concentração particular de pepsina ou outra protease, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% (ou qualquer valor intermediário ou sub-intervalo) da concentração inicial de colágeno ainda está presente. De preferência, pelo menos 75% de um colágeno estável permanecerá após tratamento com pepsina ou outra protease em comparação com um colágeno instável tratado nas mesmas condições durante o mesmo período de tempo. Antes da modificação pós-traducional, o colágeno não é hidroxilado e se degrada na presença de uma alta concentração de pepsina (por exemplo, uma proporção de pepsina:proteína de 1:200 ou mais).

[0094] Uma vez modificado pós-traducionalmente, um colágeno pode ser colocado em contato com a pepsina ou outra protease para clivar os própeptídeos do terminal N e terminal C do colágeno, permitindo assim a fibrilação do colágeno. O colágeno hidroxilado tem melhor termoestabilidade em comparação ao colágeno não hidroxilado e é resistente à digestão de alta concentração de pepsina, por exemplo, em uma relação de pepsina: proteína total de 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, para 1:1 (ou qualquer valor intermediário). Portanto, para evitar a proteólise prematura do colágeno recombinante, é útil fornecer colágeno hidroxilado.

[0095] Sistemas de expressão alternativos. O colágeno pode ser expresso em outros tipos de células de levedura além Pichia pastoris, por exemplo, pode ser expresso em outra levedura, levedura metilotrófica ou outro organismo. Saccharomyces cerevisiae pode ser usado com qualquer um

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 32/102 / 62 de um grande número de vetores de expressão. Vetores de expressão utilizados normalmente são vetores de transporte contendo a origem 2P de replicação para propagação em levedura e a origem Col E1 para E. coli, para transcrição eficiente do gene estrangeiro. Um exemplo típico de tais vetores baseado em plasmídeos 2P é o pWYG4, que tem os elementos 2P ORI-STB, o promotor GAL1-10 e o terminador de gene 2P D. Neste vetor, utiliza-se um sítio de clonagem Ncol para inserir o gene para o polipeptídeo a ser expresso e para fornecer um códon de iniciação ATG.

[0096] Outro vetor de expressão é o pWYG7L, que possui 2aORI,

STB, REP1 e REP2 intactos e o promotor GAL1-10 e utiliza o terminador FLP. Neste vetor, o polinucleotídeo codificante é inserido no poliligante com as suas extremidades 5’ em um local BamHI ou Ncol. O vetor contendo o polinucleotídeo inserido é transformado em S. cerevisiae ou após a remoção da parede celular para produzir esferoplastos que absorvem DNA no tratamento com cálcio e polietileno glicol ou por tratamento de células intactas com íons de lítio.

[0097] Alternativamente, o DNA pode ser introduzido por eletroporação. Os transformantes podem ser selecionados, por exemplo, utilizando células de levedura hospedeiras que são auxotróficas para leucina, triptofano, uracil ou histidina em conjunto com genes marcadores selecionáveis tais como LEU2, TRP1, URA3, HIS3 ou LEU2-D.

[0098] Há diversos genes responsivos ao metanol em leveduras metilotróficas, tais como Pichia pastoris, sendo que a expressão de cada uma controlada por regiões reguladoras responsivas ao metanol, também referenciadas como promotores. Qualquer um de tais promotores responsivos ao metanol é adequado para utilização na prática da presente invenção. Exemplos de regiões reguladoras específicas incluem o promotor AOX1, o promotor AOX2, a sintetase di-hidroxiacetona (DAS), o promotor P40 e o promotor para o gene catalase de P. pastoris, etc.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 33/102 / 62 [0099] A levedura metilotrófica Hansenula polymorpha também pode ser empregada. O crescimento do metanol resulta na indução de enzimas chave do metabolismo do metanol, tais como MOX (metanol oxidase), DAS (sintetase di-hidroxiacetona) e FMHD (formia desidrogenase). Estas enzimas podem constituir até de 30 a 40% da proteína celular total. Os genes que codificam a produção de MOX, DAS e FMDH são controlados por promotores fortes induzidos por crescimento em metanol e reprimidos por crescimento em glicose. Qualquer um ou todos esses três promotores podem ser utilizados para obter expressão de alto nível de genes heterólogos em H. polymorpha. Portanto, em um aspecto, um polinucleotídeo que codifica o colágeno animal, fragmentos ou variantes deste, é clonado em um vetor de expressão sob o controle de um gene promotor H. polymorpha indutível. Caso seja desejada a secreção do produto, um polinucleotídeo que codifica uma sequência de sinal para secreção em levedura é fundido in-frame com o polinucleotídeo. Em uma modalidade adicional, o vetor de expressão contém, preferencialmente, um gene marcador auxotrófico, tal como URA3 ou LEU2, que pode ser utilizado para complementar a deficiência de um hospedeiro auxotrófico.

[00100] O vetor de expressão é, em seguida, utilizado para transformar células hospedeiras H. polymorpha utilizando técnicas conhecidas àqueles versados na técnica. Um recurso útil de transformação H. polymorpha é a integração espontânea de até 100 cópias do vetor de expressão dentro do genoma. Na maioria dos casos, o polinucleotídeo integrado forma multímeros exibindo um arranjo cabeça-cauda. Demonstrou-se que o polinucleotídeo estrangeiro integrado é mitoticamente estável em várias cepas recombinantes, mesmo em condições não seletivas. Esse fenômeno de alta integração de cópias aumenta ainda mais o potencial de produtividade alta do sistema.

[00101] DNA estranho é inserido no genoma da levedura ou mantido episomalmente para produzir colágeno. A sequência de DNA para o colágeno

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 34/102 / 62 é introduzida dentro da levedura através de um vetor. Os DNA estranhos são qualquer DNA hospedeiro não de levedura e incluem, por exemplo, mas não limitando a, mamíferos, Caenorhabditis elegans e bactérias. DNA de mamífero adequado para produção de colágeno em levedura inclui, mas não está limitado ao bovino, equino, porcino, canguru, elefante, rinoceronte, hipopótamo, baleia, golfinho, girafa, zebra, lhama, alpaca, cabra e ovelha (cabrito). Outros DNAs para a produção de colágeno incluem aqueles de répteis (como jacaré, crocodilo, tartaruga, iguana, lagarto, cobra), aviária (por exemplo, avestruz, emu, moa), dinossauros, anfíbios e peixes (por exemplo, tilápia, robalo, salmão, truta, tubarão, colágeno de enguia) e combinações dos mesmos.

[00102] DNA é inserido em um vetor, vetores adequados incluem, mas não estão limitados ao pHTX1- BiDi-P4HA-Pre-P4HB hygro, pHTX1- BiDiP4HA-PHO1-P4HB hygro, pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-Prepro-P4HB G418, pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-PHO1-P4HB Hygro, Zeoci modificado por pDF-Col3A1, Zeocin modificado por pCAT-Col3A1, Zeoci modificado por pDF-Col3A1 com aterrisagem AOX1, pHTX1- BiDi-P4HA-Pre-ProP4HB hygro. Os vetores incluíram, normalmente, pelo menos um sítio de restrição para a linearização do DNA.

[00103] Um promotor selecionado pode melhorar a produção de uma proteína recombinante e pode ser incluído num vetor compreendendo sequências que codificam colágeno ou hidroxilatos. Promotores adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não são limitados ao promotor induzido por metanol AOX1, promotor desreprimido por pDF, promotor desreprimido por pCAT, promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, promotor constitutivo bidirecional pHTX1, promotor constitutivo bidirecional pGCW14-pGAP1 e combinações destes. Promotores induzidos por metanol adequados incluem, mas não estão limitados a AOX2, Das1, Das2, pDF, pCAT, pPMP20, pFDH1, pFLD1, pTAL2, pFBA2, pPEX5,

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 35/102 / 62 pDAKl, pFGHl, pRKIl, pREP2 e suas combinações.

[00104] Nos vetores de acordo com a invenção, incluindo o vetor tudo em um, um terminador pode ser colocado no final de cada frame de leitura aberto utilizado nos vetores incorporados na levedura. A sequência de DNA para o terminador é inserida dentro do vetor. Para vetores de replicação, uma origem de replicação é necessária para iniciar a replicação. Insere-se o DNA para a origem de replicação dentro do vetor. Uma ou mais sequências de DNA contendo homologia com o genoma da levedura podem ser incorporadas no vetor para facilitar a recombinação e incorporação no genoma da levedura ou para estabilizar o vetor uma vez transformado na célula de levedura.

[00105] Um vetor de acordo com a invenção também incluirá geralmente pelo menos um marcador seletivo que é utilizado para selecionar células de levedura que foram transformadas com sucesso. Os marcadores às vezes estão relacionados à resistência a antibióticos e os marcadores também podem estar relacionados à capacidade de crescer com ou sem certos aminoácidos (marcadores auxotróficos). Marcadores auxotróficos adequados incluíram, mas não são limitados a ADE, HIS, URA, LEU, LYS, TRP e combinações destes. Para proporcionar a seleção de células de levedura contendo um vetor recombinante, incorpora-se pelo menos uma sequência de DNA para um marcador de seleção no vetor.

[00106] Em algumas modalidades da invenção, os resíduos de aminoácidos, tais como lisina e prolina, em um colágeno expresso por levedura recombinante ou proteína semelhante a colágeno pode carecer hidroxilação ou pode ter um grau menor de hidroxilação que um colágeno ou proteína semelhante a colágeno natural ou não modificada. Em outras modalidades, resíduos de aminoácidos em um colágeno ou proteína semelhante a colágeno pode carecer de glicosilação ou ter um grau de glicosilação menor ou maior que um colágeno ou proteína semelhante a

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 36/102 / 62 colágeno natural ou não modificado.

[00107] O colágeno hidroxilado tem uma temperatura de fusão mais alta (> 37^oC) do que não-hidroxilado ou sob colágeno hidroxilado (<32^oC) e também fibrilados melhor do que o não-hidroxilado ou sob o colágeno hidroxilado e forma estruturas mais duráveis para uso como materiais. A temperatura de fusão de uma preparação de colágeno pode ser usada para estimar seu grau de hidroxilação e pode variar, por exemplo, de 30 a 40^oC, assim como todos os valores intermediários, como 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 e 40^oC. Sob colágeno hidroxilado, pode-se formar somente um material tipo gelatina ou gelatina não adequado para itens duráveis, como sapatos ou bolsas, mas que podem ser formulados em produtos mais macios ou mais absorventes.

[00108] O colágeno em uma composição de colágeno pode ser homogêneo e conter um único tipo de molécula de colágeno, tal como colágeno tipo I 100% bovino ou colágeno tipo III 100% bovino, ou pode conter uma mistura de diferentes tipos de moléculas de colágeno ou moléculas semelhantes a colágeno, tais como uma mistura de moléculas bovinas de Tipo I e Tipo III. Tais misturas podem incluir> 0%, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ou <100% (ou qualquer valor ou sub-intervalo intermediário) dos componentes individuais de colágeno ou proteína do tipo colágeno. Esse intervalo inclui todos os valores intermediários. Por exemplo, uma composição de colágeno pode conter 30% de colágeno tipo I e 70% de colágeno tipo III, ou pode conter 33,3% de colágeno tipo I, 33,3% de colágeno tipo II e 33,3% de colágeno tipo III, na qual a porcentagem de colágeno tem como base a massa total de colágeno na composição ou nas percentagens moleculares das moléculas de colágeno.

[00109] As células de levedura descritas acima podem ser utilizadas para produzir colágeno. Para tal, as células são colocadas em meios dentro de uma câmara de fermentação e alimentado com oxigênio dissolvido e uma

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 37/102 / 62 fonte de carbono, sob condições controladas de pH, por um período de tempo variando de doze horas a 1 semana. Os meios adequados incluem, mas não são limitados ao meio tamponado complexo contendo gliceral (BMGY), meio tamponado complexo contendo metanol (BMMY) e extrato de levedura peptona dextrose (YPD). Devido ao fato de que o colágeno é produzido na célula de levedura, a fim de isolar o colágeno, deve-se utilizar uma cepa secretória de levedura ou lisar as células de levedura para liberar o colágeno. O colágeno pode, em seguida, ser purificado através de técnicas convencionais, tais como centrifugação, precipitação, filtração, cromatografia e semelhantes.

[00110] Noutra modalidades, a invenção proporciona sequências de DNA quimérico em hospedeiros de levedura que são úteis para produção de colágeno hidroxilado e não hidroxilado. As sequências de DNA quiméricas são produzidas combinando sequências de DNA não modificadas e modificadas. A sequência de DNA não modificada pode ser cortada em várias localizações de pares de bases. A sequência de DNA modificada também pode ser cortada em locais de pares de bases correspondentes. Os cortes não modificados e modificados podem ser combinados de frente para trás e de trás para frente. As sequências de DNA quimérico podem ser combinadas com promotores, vetores, terminadores e marcadores de seleção a partir de cima e inseridos num hospedeiro para gerar levedura que pode produzir colágeno hidroxilado e não hidroxilado.

[00111] A porcentagem de DNA otimizado e não otimizado pode ser calculada com base no comprimento total da sequência. A cepa quimera pode ser uma combinação de DNA otimizado no terminal N e DNA não otimizado no terminal C. O percentual de DNA otimizado pode variar de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 99% (ou qualquer valor intermediário ou subintervalo), por exemplo, pode variar de 10 a 40% e 60 a 90%. Alternativamente, a cepa quimera pode ser uma combinação de DNA não

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 38/102 / 62 otimizado no terminal N e DNA otimizado no terminal C. A porcentagem de DNA não otimizado pode variar de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 99% (ou qualquer valor intermediário ou sub-intervalo), por exemplo, pode variar de 10 a 40% e 60 a 90%. Por exemplo, uma sequência de DNA com 1486 pares de bases cortados em 1331 fornecerá 0-1331 DNA otimizado e 1332-1486 DNA não otimizado e a quimera será 90% otimizada. Uma sequência polinucleotídica otimizada pode codificar um segmento de colágeno no terminal C, o terminal N, ou noutra parte do corpo da molécula de colágeno, por exemplo, pode codificar os primeiros 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da molécula de colágeno ou os últimos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% de uma molécula de colágeno.

[00112] Alternativamente, a cepa quimérica pode ser composta de duas, três ou quatro ou mais seções de DNA otimizado e não otimizado fundidos. Por exemplo, uma sequência de DNA com 1.500 pares de bases pode ter uma seção de DNA otimizada de 0 a 500, um DNA não otimizado de 501 a 1.000 e uma seção de DNA otimizada de 1001 a 1500.

[00113] O colágeno divulgado neste documento torna possível produzir um couro biofabricado. Os métodos para conversão de colágeno em couro biofabricado são ensinados nos pedidos de patente U.S. co-pendentes N^os15/433566, 15/433650, 15/433632, 15/433693, 15/433777, 15/433675, 15/433676 e 15/433877, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência.

MODALIDADES DA INVENÇÃO [00114] As modalidades não limitativas da invenção incluem, mas não estão limitadas a:

Polinucleotídeo que codifica colágeno bovino, tal como colágeno Tipo I ou Tipo III, ou uma variante ou derivado de colágeno e pelo menos uma enzima que hidroxila resíduos de prolina, lisina ou lisina e prolina no colágeno codificado. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 39/102 / 62 modificará a totalidade ou parte das sequências polinucleotídicas de colágeno ou hidroxilase nativas ou incorporará elementos de controle de expressão, tais como sequências promotoras de levedura, para facilitar a expressão do colágeno ou hidroxilase numa célula de levedura hospedeira. O polinucleotídeo modificado quando expresso em levedura pode aumentar a expressão de colágeno por comparação com um polipeptídeo não modificado expresso em condições idênticas que codifica a mesma sequência de colágeno em 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou> 100% em peso.

[00115] Em algumas modalidades, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais vezes de proteínas de colágeno ou hidroxilase podem ser obtidas. Em algumas modalidades, uma variante de colágeno ou colágeno Tipo III será expressa, em que a variante possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica ao da SEQ ID NO: 2. Noutras modalidades, o colágeno bovino é uma variante de colágeno ou colágeno de bovino Tipo I que codifica tanto cadeias a1(I) como uma cadeia a2(I) ou que codifica uma ou mais cadeias de colágeno que tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idênticas às cadeias de colágeno Tipo I nativas.

[00116] O polinucleotídeo que codifica o colágeno bovino descrito acima pode incluir uma sequência polinucleotídica ou segmento que codifica as subunidades P4HA e P4HB da prolil-4-hidroxilase ou uma sequência polinucleotídica que codifica uma enzima que é pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idênticos aos mesmos. Noutras modalidades, o polinucleotídeo pode conter uma sequência ou segmento polinucleotídico que codifica prolil-3-hidroxilase, lisil-hidroxilase e / ou lisil-oxidase ou uma sequência polinucleotídica que codifica uma enzima que é pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idênticos aos mesmos. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode codificar um polipeptídeo que é pelo menos 75-99% idêntico à sequência de aminoácidos de colágeno bovino Tipo

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III da SEQ ID NO: 2 e um segmento que codifica uma hidroxilase compreendendo subunidades P4HA e P4HB que são pelo menos 75-99% idênticas a SEQ ID NOS: 54 e 52, respectivamente.

[00117] Uma sequência polinucleotídica da invenção pode ainda codificar uma sequência de secreção polipeptídica operativa em levedura que é geralmente colocada adjacente a uma sequência polinucleotídica codificando o colágeno que pode ser colágeno Tipo I, colágeno Tipo III ou algum outro colágeno descrito neste documento.

[00118] Uma sequência polinucleotídica da invenção pode ainda conter um promotor ou outra sequência que facilita ou controla a expressão de colágeno ou enzimas, tais como hidroxilases, por exemplo, pode conter pelo menos um de um Promotor induzido por metanol AOX1, promotor desprimido DN pDF, promotor sem reprograma pCAT, promotor bidirecional Das1-Das2 metanólico induzido, promotor constitutivo Bi-direcional pHTX1, promotor constitutivo Bi-direcional pGCW14-pGAP1, ou suas combinações.

[00119] Um polinucleotídeo da invenção também pode conter outros elementos, tais como uma sequência pre-pro do fator alfa pre-pro ou alfa, tal como aqueles respectivamente codificados pelas SEQ ID NOS: 23 e 24. Em algumas modalidades, tal sequência pode ser operativamente ligada a uma sequência polinucleotídica que expressa uma enzima, tal como uma hidroxilase ou outras enzimas descritas neste documento, tais como P4HA (SEQ ID NO: 54) ou P4HB (SEQ ID NO: 52), ou a uma enzima variante que é pelo menos 75, 80, 90 ou 95-100% idêntica à mesma.

[00120] Os vetores contendo as sequências polinucleotídicas divulgadas acima representam modalidades adicionais da invenção. Estes incluem um vetor que contém qualquer uma das sequências polinucleotídicas descrita neste documentos, tais como sequências polinucleotídicas quiméricas codificando colágeno, um colágeno truncado, uma variante de colágeno e uma enzima tal como as hidroxilases ou outras enzimas descrita neste documentos.

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Em algumas modalidades, a sequência que codifica o colágeno e a sequência que codifica uma hidroxilase ou outra enzima estará no mesmo vetor; em outros, podem estar em vetores diferentes.

[00121] A invenção também contempla células hospedeiras, tais como células hospedeiras de levedura, que contêm os vetores descrito neste documentos. Em algumas modalidades, estes vetores podem ser produzidos em células não levedura, tal como em células hospedeiras bacterianas e mais tarde transformadas em células hospedeiras de levedura, tais como células hospedeiras Pichia pastorus, que expressam colágeno ou colágeno hidroxilado.

[00122] Outro aspecto da invenção é direcionado a um método para produzir colágeno recombinante que tem menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% dos seus resíduos de prolina hidroxilados. Este método envolve a cultura de Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura adequada (ou célula hospedeira eucariótica) durante um tempo e sob condições adequadas para a produção de colágeno e recuperação do colágeno; em que o referido vetor está configurado para expressar uma quantidade ou forma de prolil-4hidroxilase que hidroxila não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% dos resíduos de prolina. Outra modalidade da invenção é um método para produzir colágeno recombinante do Tipo III que tem menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% dos seus resíduos de prolina hidroxilados envolvendo a cultura de um Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura adequada durante um tempo e sob condições adequadas para produzir colágeno do Tipo III e recuperar o colágeno; em que o referido vetor está configurado para expressar uma quantidade de prolil-4-hidroxilase que hidroxila não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% dos resíduos de prolina. Um vetor todo-em-um que codifica o colágeno e a hidroxilase pode ser configurado de forma que pouca ou nenhuma hidroxilase funcional seja expressa, por exemplo, por utilização de um promotor indutível ou sensível à temperatura para a hidroxilase.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 42/102 / 62 [00123] Uma outra modalidade da invenção é um método para produzir colágeno recombinante que tenha> 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% dos seus resíduos de prolina hidroxilados por cultura Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura adequada contendo um vetor como descrito neste documento durante um tempo e sob condições adequadas para a produção de colágeno e recuperação do colágeno; em que o vetor está configurado para expressar uma quantidade ou forma de prolil-4-hidroxilase que hidroxila> 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou> 90% ou mais dos resíduos de prolina no colágeno. O tempo e condições de cultura e a quantidade ou atividade da hidroxilase podem ser utilizados para controlar a quantidade de hidroxilação. Outra modalidade da invenção é um método para produzir colágeno recombinante do Tipo III que tem 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% dos seus resíduos prolina hidroxilados compreendendo a cultura de uma célula hospedeira Pichia pastorus contendo um vetor de acordo com a invenção durante um tempo e sob condições adequadas para produzir colágeno do Tipo III e recuperar o colágeno Tipo III; em que o vetor está configurado para expressar uma quantidade ou forma de prolil-4-hidroxilase que hidroxila 50, 60, 70, 80, 90 ou> 90% ou mais dos resíduos de prolina. O tempo e condições de cultura e a quantidade ou atividade da hidroxilase podem ser utilizados para controlar a quantidade de hidroxilação.

[00124] Outra modalidade da invenção refere-se a um método para produzir colágeno recombinante que tem 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% ou mais dos seus resíduos de prolina hidroxilados compreendendo a cultura da Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura adequada contendo um vetor da invenção durante um tempo e sob condições adequadas para a produção de colágeno e recuperação do colágeno; em que o vetor está configurado para expressar uma quantidade de prolil-4-hidroxilase que hidroxila 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% ou mais dos resíduos de prolina. O tempo e condições de cultura e a quantidade ou atividade da hidroxilase

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 43/102 / 62 podem ser utilizados para controlar a quantidade de hidroxilação.

[00125] Outra modalidade da invenção refere-se a um método para produzir colágeno recombinante do Tipo III que tem 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% dos seus resíduos de prolina hidroxilados compreendendo a cultura de uma Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura contendo um vetor da invenção durante um tempo e sob condições adequadas para produzir colágeno e recuperar o colágeno; em que o referido vetor está configurado para expressar uma quantidade de prolil-4-hidroxilase que hidroxila 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou> 95% dos resíduos de prolina. O tempo e condições de cultura e a quantidade ou atividade da hidroxilase podem ser utilizados para controlar a quantidade de hidroxilação.

[00126] Outra modalidade da invenção refere-se a um método para produzir colágeno recombinante que tem 75, 80, 90, 95 ou> 95% dos seus resíduos de prolina hidroxilados incluindo a cultura da Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura contendo um vetor da invenção durante um tempo e sob condições adequadas para produzir colágeno e recuperar o colágeno; em que o referido vetor está configurado para expressar uma quantidade de prolil-4-hidroxilase que hidroxila 75, 80, 90, 95 ou> 95% dos resíduos de prolina.

[00127] Uma outra modalidade é um método para a produção recombinante do colágeno Tipo III, que tem 75, 80, 90, 95 ou >95% dos seus resíduos de prolina hidroxilado compreendendo a cultura da Pichia pastorus ou outra célula hospedeira de levedura contendo um vetor da invenção durante um tempo e sob condições adequadas para produzir colágeno e recuperar o colágeno; em que o referido vetor está configurado para expressar uma quantidade de prolil-4-hidroxilase que hidroxila 75, 80, 90, 95 ou> 95% ou mais dos resíduos de prolina.

[00128] Outra modalidade da invenção é um colágeno recombinante feito por qualquer um dos métodos descrito neste documentos. Tal colágeno

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 44/102 / 62 recombinante pode não ter nenhum dos seus resíduos prolina ou lisina hidroxilados ou pode ter> 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% da prolina, lisina ou prolina e resíduos de lisina hidroxilados.

[00129] Uma outra modalidade da invenção é um couro biofabricado ou outro material compreendendo o colágeno recombinante como descrito neste documento ou que é feito por um método descrito neste documento.

[00130] Em outra modalidade, a invenção proporciona sequências de DNA quiméricas em células hospedeiras de levedura que são úteis para a produção de colágeno hidroxilado e não hidroxilado. As sequências de DNA quiméricas são produzidas combinando sequências de DNA não modificadas e modificadas. A sequência de DNA não modificada pode ser cortada em várias localizações de pares de bases. A sequência de DNA modificada também pode ser cortada em locais de pares de bases correspondentes. Os cortes não modificados e modificados podem ser combinados de frente para trás e de trás para frente. As sequências de DNA quimérico podem ser combinadas com promotores, vetores, terminadores e marcadores de seleção a partir de cima e inseridos num hospedeiro para gerar levedura que pode produzir colágeno hidroxilado e não hidroxilado.

[00131] Outras modalidades da invenção incluem, mas não estão limitadas a:

Uma cepa de levedura geneticamente modificada para produzir colágeno não hidroxilado, incluindo (i) uma cepa de levedura; e (ii) um vetor compreendendo uma sequência de DNA para colágeno; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador de colágeno; uma sequência de DNA para um marcador de seleção, uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para um terminador para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para uma origem de replicação selecionada de uma para bactérias e uma para levedura; e uma sequência de DNA

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 45/102 / 62 contendo homologia com o genoma da levedura, em que o vetor foi inserido na cepa de levedura. Nesta modalidade, a cepa de levedura pode ser selecionada do grupo que consiste daquelas do gênero Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos. Na modalidade acima, o vetor pode conter uma sequência de DNA para o colágeno selecionado do grupo que consiste no colágeno bovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, de dinossauro e combinações dos mesmos. Nesta modalidade, a sequência de DNA para o colágeno pode ser selecionada a partir de DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno modificado e DNA de colágeno modificado por códon.

[00132] Nesta modalidade, a sequência de DNA para o promotor pode ser selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor induzido por metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido pDF, DNA para o promotor desreprimido pCAT, DNA para o promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pHTX1, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1 e combinações dos mesmos. O marcador de seleção nesta modalidade pode ser selecionado do grupo que consiste em um DNA para resistência a antibióticos e um DNA para marcador auxotrófico, por exemplo, a resistência a antibióticos pode ser, antibiótico selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e suas combinações.

[00133] A cepa de levedura como descrita na modalidade acima pode conter um vetor que foi inserido na levedura através de um método selecionado do grupo consistindo de eletroporação, transformação química e acasalamento.

[00134] Outra modalidade da invenção refere-se a um método para produzir colágeno não hidroxilado, incluindo (i) proporcionar uma cepa de levedura como descrito pelas modalidades acima; e (ii) aumentar a cepa em

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 46/102 / 62 uma mídia por um período de tempo suficiente para produzir colágeno. Neste método, a levedura pode ser selecionada do grupo que consiste daquelas do gênero Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos e / ou o meio selecionado a partir do grupo consistindo de meio complexo de glicerol tamponado (BMGY), meio complexo de metanol tamponado (BMMY) e extrato de levedura peptona dextrose (YPD). A cepa de levedura pode ser cultivada ou cultivada por um período de tempo que varia de 24, 48 ou 72 ou qualquer período de tempo intermediário. Neste método, a cepa de levedura pode expressar uma Sequência de DNA para o colágeno selecionado do grupo que consiste no colágeno bovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, dinossauro e combinações dos mesmos. Neste método, a sequência de DNA para o promotor na cepa de levedura pode ser selecionada do grupo que consiste no DNA para o promotor bi-direcional constitutivo de pHTX1 e o DNA para o promotor constitutivo bi-direcional de pGCW14-pGAP1; e / ou o marcador de seleção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de DNA para resistência a antibióticos DNA e DNA para o marcador auxotrófico.

[00135] Outra modalidade da invenção é uma cepa de levedura geneticamente manipulada para produzir colágeno hidroxilado que inclui (i) uma cepa de levedura e (ii) um vetor contendo uma sequência de DNA para colágeno; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador; uma sequência de DNA para um marcador de seleção; uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para um terminador para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para uma origem de replicação para bactérias e / ou leveduras; uma sequência de DNA contendo homologia com o genoma da levedura; em que o vetor foi inserido na cepa de levedura; e (iii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de DNA para P4HA1;

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 47/102 / 62 uma sequência de DNA para P4HB; e pelo menos uma sequência de DNA para um promotor, em que os vetores foram inseridos na cepa de levedura. Nesta modalidade, a cepa de levedura pode ser selecionada do grupo consistindo daquelas do gênero Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos; e / ou a cepa de levedura pode expressar uma sequência de DNA para o colágeno selecionado do grupo constituído por colágeno bovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, dinossauro e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades deste método, a sequência de DNA para colágeno é selecionado a partir de DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno modificado e DNA de colágeno modificado; e / ou a sequência de DNA para o promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em DNA para o promotor induzido por metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido de pDF, DNA para o promotor não reprimido de pCAT, DNA para o promotor bi-direcional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor bi-direcional constitutivo pHTX1, DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pGCW14-pGAP1 e suas combinações. Na linhagem de levedura, a sequência de DNA para o promotor pode ser selecionada do grupo que consiste no DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pHTX1 e o DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pGCW14pGAP1; e / ou a sequência de DNA para o marcador de seleção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste no DNA para o DNA de resistência a antibióticos e o DNA para o marcador auxotrófico. Alguns exemplos de genes de resistência a antibióticos ou DNA incluem resistência ao antibiótico selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e combinações dos mesmos, embora também possam ser utilizados outros genes conhecidos de resistência a antibióticos. O vetor pode ser inserido na linhagem de levedura através de um método selecionado do grupo consistindo de eletroporação, transformação química e acoplamento.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 48/102 / 62 [00136] Outra modalidade da invenção é um método para produzir colágeno hidroxilado que inclui (i) proporcionar uma cepa de levedura como descrito neste documento e (ii) aumentar a cepa num meio durante um período de tempo suficiente para produzir colágeno. A cepa de levedura pode ser selecionada do grupo que consiste daquelas do gênero Candida, Komatagaella, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos; o DNA de colágeno expresso pela cepa de levedura pode ser selecionado do grupo que consiste no DNA codificador de colágeno bovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, dinossauro ou combinações dos mesmos; e / ou o meio selecionado do grupo que consiste em BMGY, BMMY e YPD. A cepa de levedura pode ser cultivada ou cultivada por um período de tempo que varia de cerca de 24, 48 ou 72 horas. Em algumas modalidades, o DNA para o promotor é selecionado do grupo que consiste no DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pTHX1 e o DNA para o promotor constitutivo bidirecional pGCW14-pGAP1; e / ou o DNA para o marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste no DNA para o DNA de resistência a antibióticos e o DNA para o marcador auxotrófico.

[00137] Outra modalidade da invenção direcionada a um vetor todoem-um que inclui (i) um DNA que, quando expresso, produz colágeno, um promotor e um terminador; (ii) pelo menos um DNA para uma ou mais enzimas de hidroxilação selecionadas do grupo que consiste em P4HA1 e P4HB, incluindo promotores e terminadores; (iii) pelo menos um DNA para um marcador de seleção; incluindo um promotor e um terminador; (iv) pelo menos um DNA para uma origem de replicação para levedura e bactérias; (v) um ou mais DNAs com homologia ao genoma da levedura para integração no genoma; e (iv) um ou mais sítios de restrição numa posição selecionada do grupo que consiste em 5', 3', dentro dos DNA acima, e suas combinações permitindo a clonagem modular. Em algumas modalidades, o vetor tudo em

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 49/102 / 62 um conterá uma ou mais sequências de DNA que, quando expresso, produz um colágeno selecionado do grupo que consiste no colágenobovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, dinossauro e combinações dos mesmos.

[00138] O vetor all-in-one pode incluir um promotor selecionado do grupo que consiste no DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pTHX1 e o DNA para o promotor constitutivo bi-direcional pGCW14pGAP1; pode incluir um ou mais sequências de DNA para marcadores de seleção, como resistência a antibióticos e / ou marcadores auxotróficos. Marcadores de resistência aos antibióticos incluem resistência ao antibiótico selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e suas combinações.

[00139] Outra modalidade da invenção direcionada a uma sequência de DNA de colágeno quimérico, que contém de 10, 20, 30 a 40 por cento ou 60, 70, 80, a 90 por cento de DNA otimizado com base no comprimento total do DNA de colágeno quimérico. Nesta sequência de DNA de colágeno quimérico, o DNA otimizado pode originar no terminal C ou o DNA otimizado pode originar no terminal N.

[00140] Outra modalidade da invenção refere-se a uma cepa de levedura produtora de colágeno que inclui um vetor compreendendo uma sequência de DNA para um colágeno quimérico, como descrito neste documento; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador; uma sequência de DNA para um marcador de seleção; uma sequência DNA para um terminador para um marcador de seleção; uma sequência DNA para uma origem de replicação para bactéria e/ou levedura; e uma sequência de DNA contendo homologia ao genoma de levedura. Nesta modalidade, a cepa de levedura pode conter um DNA para o promotor selecionado do grupo que consiste no DNA para o promotor bi-direcional constitutivo de pTHX1 e o DNA para o promotor bi

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 50/102 / 62 direcional constitutivo de pGCW14-pGAP1. A cepa de levedura pode conter um marcador de seleção selecionado a partir do grupo que consiste da codificação de DNA, pelo menos uma resistência a antibióticos e DNA que codifica pelo menos um marcador auxotrófico.

[00141] Outra modalidade da invenção é direcionada a um método para produzir colágeno hidroxilado que inclui (i) proporcionar uma cepa de levedura como descrito neste documento e (ii) aumentar a cepa num meio durante um período de tempo suficiente para produzir colágeno. Nesta modalidade, a cepa de levedura pode ser selecionada a partir do grupo que consiste daquelas do gênero Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos; o meio pode ser selecionado do grupo que consiste em meio complexo de glicerol tamponado, meio complexo de metanol tamponado e extrato de levedura peptona dextrose; e o tempo de cultura ou cultivo pode variar de 24, 48 ou 72 horas. Em algumas modalidades deste método, a cepa de levedura inclui um promotor selecionado do grupo constituo pelo DNA do promotor constitutivo bi-direcional pTHX1 e o DNA do promotor constitutivo bi-direcional pGCW14-pGAP1. Em outras modalidades deste método, a cepa de levedura compreende pelo menos um marcador de seleção selecionado do grupo constituído por DNA que codifica uma resistência a antibióticos e DNA que codifica um marcador auxotrófico.

EXEMPLOS [00142] Os exemplos não limitantes a seguir são ilustrativos da presente invenção. O escopo da invenção não é limitado aos detalhes descritos nestes Exemplos.

EXEMPLO 1 [00143] A cepa Pichia pastoris BG10 (tipo selvagem) foi obtida de ATUM (anteriormente DNA 2.0). Uma sequência de DNA de MMV 63 (SEQ ID NO: 11) (“Sequência 9”) incluindo uma sequência de colágeno e vetores,

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 51/102 / 62 foi inserida no tipo selvagem Pichia pastoris que gerou a cepa PP28. MMV63 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 (cepa Pichia pastoris tipo selvagem) para gerar PP28. O vetor MMV63 é mostrado na FIG 1.

[00144] O DNA que codifica o colágeno bovino Tipo III nativo foi sequenciado (SEQ ID NO: 1) e a sequência foi amplificada pelo protocolo de reação em cadeia da polimerase PCR para criar uma sequência de DNA linear.

[00145] O DNA foi transformado nas células de levedura Pichia tipo selvagem (PP1) do DNA 2.0 usando um Protocolo de eletroporação Pichia (Bio-Rad Gene Pulser Xcell™ Total System #1652660). As células de levedura foram transformadas com o plasmídeo de co-expressão de P4HA/B e os transformantes (por exemplo, Clone #4) foram selecionadas numa placa Hygro (200 ug/ml).

[00146] Uma única colônia do Clone # 4 foi inoculada em 100 ml de meio YPD e cultivada a 30 graus durante a noite com agitação a 215 rpm. No dia seguinte, quando a cultura atingiu um OD600 ~ 3,5 (~ 3-5 X 10⁷ células / OD600) foi diluído com YPD fresco até OD600 ~ 1,7 e cultivado por mais uma hora a 30^oC com agitação a 215 rpm.

[00147] As células foram então centrifugadas nas células a 3.500g por 5 min; lavada uma vez com água e ressuspensas em 10 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, DTT 10 mM (adicionado fresco) e Sorbitol 0,6 M.

[00148] Para cada transformação, uma alíquota de 8 X 10⁸ células foram colocadas em 8 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, DTT 10 mM, Sorbitol 0,6 M e incubadas à temperatura ambiente durante 30 min.

[00149] As células foram centrifugadas a 5000g durante 5 min e lavadas com 1,5 ml de Sorbitol 1M gelado 3 vezes e ressuspensas em 80 ul de Sorbitol 1M gelado.

[00150] Várias quantidades (cerca de 5 ug) de DNA linearizado foram

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 52/102 / 62 adicionadas às células e misturadas por pipetagem.

[00151] A mistura de células e DNA (80-100 ul) foi adicionada a uma cuvete de 0,2 cm e pulsada de acordo com um protocolo para Pichia a 1500 v, 25 uF e 200 Ω.

[00152] Eles foram então imediatamente transferidos uma mistura de 1 ml de YPD e 1M Sorbitol (1: 1) e incubados a 30^o C por> 2 horas.

[00153] As células foram plaqueadas em diferentes densidades.

[00154] Colônias individuais foram inoculadas em 2 mL de meio BMGY em uma placa de 24 poços profundos e cultivadas por pelo menos 48 horas a 30^o C com agitação a 900 rpm. As células resultantes foram testadas para colágeno utilizando lise celular, SDS-page e ensaio de pepsina seguindo o procedimento abaixo.

[00155] As células de levedura foram lisadas em 1x tampão de lise usando um Qiagen TissueLyser a uma velocidade de 30 Hz continuamente durante 1 min. O tampão de lise foi feito a partir de 2,5 ml de HEPES 1 M (concentração final de 50 mM); 438,3 mg de NaCl; concentração final 150 mM; 5 ml de glicerol; concentração final 10%; 0,5 ml de Triton X-100; concentração final 1%; e 42 ml de água Millipure.

[00156] As células lisadas foram centrifugadas a 2.500 rpm por 15 minutos em uma centrífuga de mesa. O sobrenadante foi retido e o pelete descartado.

[00157] SDS-PAGE. SDS-PAGE na presença de 2-mercaptoetanol foi realizado no sobrenadante, marcadores de peso molecular, controle negativo e um controle positivo. Após a eletroforese, o gel foi removido e corado com Commassie Blue e depois descorado em água.

[00158] Ensaio de pepsina. Um ensaio de pepsina foi realizado com o seguinte procedimento:

Um ensaio BCA para obter a proteína total de cada amostra de acordo com o protocolo Thermo Scientific foi realizado antes do tratamento

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 53/102 / 62 com pepsina. A quantidade de proteína total foi normalizada para a concentração mais baixa em ou acima de 0,5 mg / ml para todas as amostras.

[00159] Uma amostra de 100 uL de lisado foi colocada num tubo de microcentrífuga. Uma mistura principal foi feita contendo o seguinte: 37% de HC l (0,6 pL de ácido por 100 pL), e

Estoque de pepsina a 1mg / mL em água deionizada. A quantidade de pepsina adicionada foi à relação de 1:25 pepsina: proteína total (peso: peso).

[00160] Após a adição de pepsina, as amostras foram misturadas três vezes com uma pipeta e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente para que a reação de pepsina tivesse lugar. Após uma hora, um volume de 1: 1 de tampão de carregamento LDS contendo β-mercaptoetanol foi adicionado a cada amostra e deixado a incubar durante 7 minutos a 70^oC. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas 14.000 rpm por 1 minuto para remover a turbidez.

[00161] Em seguida, 18 ul do topo das amostras foram adicionados a TAE a 3-8% utilizando tampão TAE e corridos num gel durante 1 hora e 10 minutos a 150 V. A Tabela 1 abaixo relata os resultados.

EXEMPLO 2 [00162] O Exemplo 1 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Uma sequência de DNA MMV77 (SEQ ID NO: 12) (Sequência 10) incluindo uma sequência de colágeno bovino modificada para aumentar a expressão em Pichia (SEQ ID NO: 3) (“Sequência 2”) foi inserido na levedura. Utilizou-se um promotor pAOX1 (SEQ ID NO: 5) (Sequência 3) para direcionar a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/mL para selecionar transformantes bem-sucedidos. A cepa resultante foi PP8. O vetor MMV77 é mostrado na FIG. 2. A digestão por restrição foi realizada utilizando Pme I. As cepas foram cultivadas em meio BMMY e testadas

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 54/102 / 62 quanto ao colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. EXEMPLO 3 [00163] O Exemplo 1 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Uma sequência de DNA MMV-129 (SEQ ID NO: 13) (Sequência 11) incluindo uma sequência de colágeno bovino modificada para aumentar a expressão Pichia foi inserida na levedura. Utilizou-se um promotor pCAT (SEQ ID NO: 9) (“Sequência 7”) para direcionar a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/mL para selecionar transformantes bem-sucedidos. A cepa resultante foi PP123. MMV129 foi digerido por Swa I e transformado em PP1 para gerar PP123. O vetor MMV129 é mostrado na FIG. 3. As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 4 [00164] Repetiu-se o exemplo 1 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações:

Uma sequência de DNA MMV-130 (SEQ ID NO: 14) (Sequência 12) incluindo uma sequência de colágeno de bovino Col3A1 (tipo

III) (SEQ ID NO: 3) (“Sequência 2”) modificada para aumentar a expressão em Pichia foi inserida na levedura. Um promotor de pDF mostrado na SEQ ID NO: 8 (“Sequência 6”) foi utilizado para direcionar a expressão da sequência de colágeno. Uma plataforma de aterrissagem AOX1 (SEQ ID NO: 10) (“Sequência 8”), que é cortada por Pme I, foi usada para facilitar a integração específica do sítio no genoma Pichia . Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/mL para selecionar transformantes bem-sucedidos. A cepa resultante foi designada PP153. MMV130 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 para gerar PP153. A sequência de col3A1 bovina modificada é dada pela SEQ ID NO: 3 (“Sequência 2”).

[00165] Um kit de purificação por PCR PureLink foi usado em vez da

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 55/102 / 62 extração com fenol para recuperar o DNA linearizado. As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 5 [00166] Exemplo 2 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Um vetor de DNA, MMV-78 (SEQ ID NO: 15) (“Sequência 13”), contendo P4HA bovino otimizado (SEQ ID NO: 6) (“Sequência 4”) e sequências de P4HB bovino (SEQ ID NO: 7) (Sequência 5) foram inseridas na levedura. MMV78 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 para gerar PP8. Tanto o P4HA como o P4HB continham os seus peptídeos de sinal endógenos e são direcionados pelo promotor bi-direcional Das1-Das2 (SEQ ID NO: 27) (Sequência 24). O DNA foi digerido por Kpn I e transformado em PP8 para gerar PP3. O vetor MMV78 é mostrado na FIG. 5. As cepas foram cultivadas em meios BMMY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 6 [00167] Exemplo 2 foi repetido seguindo-se os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: um vetor de DNA, MMV-78, contendo tanto P4HA de bovino como sequências de P4HB de bovino foram inseridos na levedura. Tanto P4HA como P4HB contiveram os seus peptídeos de sinal endógenos e foram direcionados pelo promotor bi-direcional Das1Das2. O DNA foi digerido por Kpn I e transformado em PP8 para gerar PP3.

[00168] Utilizou-se outro vetor, MMV-94 (SED ID NO: 16) (Sequência 14), contendo P4HB conduzido pelo promotor pAOX1, e foi também inserido na levedura. O peptídeo de sinal endógeno de P4HB foi substituído pelo peptídeo sinal de PHO1. A cepa resultante foi PP38. O MMV94 foi digerido pelo Avr II e transformado em PP3 para gerar PP38. O vetor MMV94 é mostrado na FIG. 6. As cepas foram cultivadas em meios

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 56/102 / 62

BMMY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 7 [00169] Exemplo 4 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Um vetor de DNA, MMV-156 (SEQ ID NO: 17) (Sequência 15), contendo tanto P4HA bovino como sequências P4HB bovinas foram inseridos na levedura. O P4HA continha os seus peptídeos de sinal endógenos e a sequência sinal P4HB foi substitua pela sequência Pre de fator alfa (SEQ ID NO: 23) (Sequência 21). Ambos os genes foram direcionados pelo promotor bi-direcional pHTX1 (SEQ ID NO: 26) (“Sequência 25”). O MMV156 foi digerido por Bam HI e transformado em PP153 para gerar PP154. O vetor MMV156 é mostrado na FIG. 7. As cepas foram cultivadas em meios BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 8 [00170] Exemplo 4 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Um vetor de DNA, MMV-156, contendo tanto P4HA de bovino como sequências de P4HB de bovino foram inseridos na levedura. O P4HA contém os seus peptídeos sinais endógenos e a sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência Pre do fator alfa. Ambos os genes foram conduzidos pelo promotor bidirecional pHTX1. O DNA foi digerido por Swa I e transformado em PP153 para gerar PP154.

[00171] Inseriu-se também outro vetor, MMV-191 (SEQ ID NO: 18)(Sequência 16), contendo P4HA e P4HB, dentro da levedura. A cópia extra de P4HA contém o seu peptídeo de sinal endógeno e a cópia extra de sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência Pre-Pro do Fator Alfa (SEQ ID NO: 24) (Sequência 22). As cópias extras de P4HA e P4HB foram conduzidas pelo promotor bi-direcional pGCW14-GAP1 (SEQ ID NO: 25) (Sequência 23). O MMV191 foi conduzido por Bam HI e transformado

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 57/102 / 62 em PP154 para gerar PP268. O vetor MMV191 é mostrado na FIG. 8. As cepas foram cultivadas em meios BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 9 [00172] Utilizaram-se os métodos e procedimentos do exemplo 1 para criar um vetor multifuncional. O vetor multifuncional contém DNA de colágeno e promotor e terminador associados, o DNA para as enzimas que hidroxilam o colágeno e os promotores e terminadores associados, o DNA para a expressão do marcador e o promotor e terminador associado, o DNA para a(s) origem(ns) de replicação para bactérias e leveduras e o(s) DNA(s) com homologia ao genoma de levedura para integração. O vetor multifuncional contém locais de restrição exclusivos estrategicamente colocados em 5',3' ou dentro dos componentes acima. Quando se deseja qualquer modificação na expressão de colágeno ou outros componentes do vetor, o DNA para componentes selecionados pode ser facilmente eliminado com enzimas de restrição e substituído pelo método de clonagem escolhido pelo usuário. A versão mais simples do vetor multifuncional MMV208 (SEQ ID NO: 19) (Sequência 17) inclui todos os componentes acima exceto promotor(es) para enzimas hidroxilase. O vetor MMV208 foi preparado utilizando os seguintes componentes: homologia de AOX de MMV84 (SEQ ID NO: 20) (“Sequência 18”), homologia ribossômica de MMV150 (SEQ ID NO: 21) (“Sequência 19”), origens bacterianas e de levedura de replicação de MMV140 (SEQ ID NO: 22) (Sequência 20), marcador de Zeocina de MMV140 e Col3A1 de MMV129. Versões modificadas de P4HA e B e terminadores associados foram sintetizados a partir de Genscript, eliminando os seguintes sítios de restrição: AvrII, Notl, PvuI, PmeI, BamHI, SacII, SwaI, XbaI, SpeI. O vetor foi transformado na cepa PP1.

[00173] As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 58/102 / 62 [00174] A Tabela 1 descreve a quantidade de colágeno produzido em g / L, bem como a porcentagem de colágeno hidroxilado. A quantidade de colágeno expressa foi quantificada por coloração de géis com corante azul de Coomassie e comparação do resultado contra uma curva padrão para o teor de colágeno. A quantidade de colágeno hidroxilado foi determinada comparando as fitas de amostra com uma fita padrão após tratamento 1:25 de pepsina. Expressão de colágeno hidroxilado por Pichia é vantajosa porque o colágeno hidroxilado é estável numa concentração elevada de pepsina necessária para ainda processar os polipeptídeos de colágeno.

Tabela 1

Exemplo	Vetor	Cepa	Colágeno (g/L)	Colágeno Hidroxilado (%)
Pichia pastoris de tipo selvagem	nenhum	PP1		—
1*	MMV-63 (SEQ ID NO: 11). Contém sequência de colágeno bovino Tipo III nativo (SEQ ID NO: 1)	PP28	0,05	0
2	MMV-77 (SEQ ID NO: 12). Contém sequência de colágeno bovino modificado (SEQ ID NO: 3)	PP8	0,1	0
3	MMV-129 (SEQ ID NO: 13) contém a sequência de colágeno bovino modificada (SEQ ID NO: 3) e contém o promotor pCAT (apresentado na SEQ ID NO: 9) para direcionar a expressão de colágeno.	PP123	0,5	0

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Exemplo	Vetor	Cepa	Colágeno (g/L)	Colágeno Hidroxilado (%)
4	MMV-130 (SEQ ID NO: 14) contendo sequência de colágeno bovino de Tipo III modificada por códon (SEQ ID NO: 3); promotor pDF (mostrado em SEQ ID NO: 8) utilizado para direcionar a expressão de colágeno. A plataforma de aterrissagem AOX1 (SEQ ID NO: 10) facilitou a integração específica de sítio do vetor no genoma Pichia.	PP153	1- 1,5	0
5*	MMV-77 (SEQ ID NO: 12). Contém sequência de colágeno bovino modificado (SEQ ID NO: 3); e MMV-78 P4HA bovina (SEQ ID NO: 6) e P4HB (SEQ ID NO: 7) controlada pelo promotor bidirecional Das1-Das2 (SEQ ID NO: 27)	PP3	0,1	15
6	MMV-77 + MMV-78. MMV-94 contém P4HB conduzido pelo promotor pAOX1, peptídeo de sinal endógenode P4HB substituído pelo peptídeo sinal de PHO1.	PP38	0,1	35
7	MMV-130 contendo sequência modificada de colágeno bovino Tipo III (SEQ ID NO: 3), MMV156 P4HA bovino (peptídeo de sinal endógenos) e P4HB (sequência pre do fator alfa; SEQ ID NO: 23)	PP154	1 - 1,5	15

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 60/102 / 62

Exemplo	Vetor	Cepa	Colágeno (g/L)	Colágeno Hidroxilado (%)
8	MMV-130 + MMV156. MMV-191 (SEQ ID NO: 18) contém as sequências de P4HA de bovino (peptídeo de sinal endógenos) e P4HB (sequência prepro do fator alfa; SEQ ID NO: 24) impulsionadas pelo promotor bi-direcional pGCW14-GAP1 (SEQ ID NO: 25).	PP268	1 - 1,5	40-50
9	VETORtodo em um	MMV-208 (SEQ ID NO: 19).	0,5 - 1	15 - 20

[00175] Os dados nos Exemplos 1 e 2 mostram que a modificação do códon da sequência de colágeno bovino Tipo III duplicou a quantidade de colágeno expressa por Pichia. A comparação dos dados dos Exemplos 2 e 3 mostra que a expressão de colágeno bovino Tipo III é ainda aumentada por um fator de 5, conduzindo a transcrição da sequência de codificação de colágeno Tipo III com o promotor pCAT. A comparação dos dados dos Exemplos 2 e 4 mostra que a expressão de colágeno bovino do Tipo III aumentada de dez a quinze vezes direcionando a transcrição da sequência de codificação de colágeno Tipo III com o promotor pDF e proporcionando uma almofada de aterragem AOX1 para facilitar a integração do vetor no DNA genômico de Pichia. A comparação dos dados dos exemplos 2 e 5 e 6 mostra que a transformação de Pichia com sequências de codificação para prolina hidroxilase (P4HA + P4HB) produziu colágeno hidroxilado e que a quantidade de colágeno hidroxilado poderia ser aumentada através da regulação adicional da expressão da hidroxilase de prolina. Os exemplos 7-9 mostram que a expressão do colágeno pode ser aumentada de cinco a quinze vezes e que a quantidade de colágeno hidroxilado aumentou pela introdução de dois vetores ou por uma abordagem de vetor all-in-one, em que ambas as sequências de colágeno e hidroxilase são codificadas pelo mesmo vetor.

I. EXEMPLO 10 [00176] Os métodos e procedimentos do exemplo 1 foram utilizados

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 61/102 / 62 para criar vetores quiméricos de Col3A1. O vetor MMV132 foi modificado para incluir o DNA do colágeno quimérico e o promotor associado PDF e terminador AOX1TT, o DNA para a expressão de marcadores e o promotor e terminador associados, o DNA para origem(ns) de replicação(ões) para bactérias e leveduras e o(s) DNA(s) com homologia ao genoma da levedura para integração. O vetor MMV63 foi o DNA fonte para os domínios de Col3A1 não modificados. O vetor MMV128 (Figura 21) foi o DNA fonte para os domínios de Col3A1 modificados. O comprimento total do polipeptídeo Col3A1 é de 1465 aminoácidos (aa). Os plasmídeos foram projetados para incorporar sequências de DNA Bovino nativas (não modificadas) e sequências de DNA de Pichia pastoris modificadas por códon. Os plasmídeos foram concebidos de tal modo que as transições entre as sequências modificadas e não modificadas de Col3A1 estavam em aa 710, 1.200 e 1.331. Estes métodos foram utilizados para criar os plasmídeos MMV193, MMV194, MMV195, MMV197, MMV198 e MMV199. Os vetores plasmídeos resultantes são apresentados na Tabela 2 abaixo com o plasmídeo totalmente otimizado MMV130 e o plasmídeo totalmente não otimizado MMV200 (FIG. 20) para comparação.

Tabela 2

Ponto de divisão	Primeira metade	Segunda metade	Plasmídeos
Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV130
710	Otimizado	Não otimizado	MMV193
1220	Otimizado	Não otimizado	MMV194
1331	Otimizado	Não otimizado	MMV195
710	Não otimizado	Otimizado	MMV197
1220	Não otimizado	Otimizado	MMV198
1331	Não otimizado	Otimizado	MMV199
Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV200

EXEMPLO 11 [00177] Repetiu-se o exemplo 2 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: PP1 e PP97 foram obtidos. A PP97 foi uma cepa em que dois genes de protease (PEP4 e PRB1) foram retirados da cepa hospedeira. As sequências de DNA MMV194, MMV195, MMV130 e MMV200 incluindo diferentes combinações de DNA de sequência de

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 62/102 / 62 colágeno bovino modificado e não modificado para expressão Pichia foram inseridas na levedura. Utilizou-se um promotor pDF para direcionar a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/mL para selecionar transformantes bem-sucedidos. A digestão por restrição foi efetuada utilizando Swa I para linearizar DNA para integração, tendo sido utilizado o DNA de 3-5ug de corte para vetores, exceto para MMV130 que foi digerido com Pme1 e foram transformados 200 ng de DNA. As cepas resultantes são mostradas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Cepa de Origem	Ponto de divisão	Primeira metade	Segunda metade	Plasmídeos	Cepa
PP1	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV130	PP153
PP1	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV194	PP205
PP1	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV195	PP206
PP1	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV200	PP328
PP97	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV130	PP333
PP97	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV194	PP266
PP97	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV195	PP267
PP97	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV200	PP334

EXEMPLO 12

II.

[00178] Exemplo 7 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Um vetor de DNA, MMV-156, contendo tanto P4HA de bovino como sequências de P4HB de bovino fora inserida na levedura. O P4HA contém os seus peptídeos sinais endógenos e a sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência Pre do fator alfa. Ambos os genes foram conduzidos pelo promotor bidirecional pHTX1. O DNA foi digerido por BamH1 e transformado. Veja a Tabela 4 para informações de cepa e transformação.

Tabela 4

Cepa de Origem	Ponto de divisão	Primeira metade	Segunda metade	Plasmídeos	Cepa
PP153	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV156	PP154
PP205	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV156	PP275
PP206	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV156	PP276
PP328	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV156	PP332
PP333	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV156	PP349
PP266	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV156	PP273
PP267	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV156	PP274
PP334	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV156	PP344

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 63/102 / 62

III. EXEMPLO 13 [00179] O Exemplo 8 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: o tampão de lise é feito com 50 mM de Na₂PO₄, 1 mM de EDTA, 5% de glicerol e o pH ajustado para 7,4 com ácido acético. Inseriu-se também outro vetor, MMV-191, contendo P4HA e P4HB, dentro da levedura. A cópia extra de P4HA contém o seu peptídeo sinal endógeno e a cópia extra de sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência Pre-Pro do Fator Alfa. As cópias extras de P4HA e P4HB foram conduzidas pelo promotor bi-direcional pGCW14-GAP1. O DNA foi digerido por BamHI e transformado. Veja a Tabela 5 para informações sobre transformação e nova deformação. As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno.

Tabela 5

Cepa de Origem	Ponto de divisão	Primeira metade	Segunda metade	Plasmídeos	Cepa	Colágeno (g/L)
PP154	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV191	PP268	0,12
PP275	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV191	PP329	0,16
PP276	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV191	PP330	0,16
PP332	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV191	PP347	0,12
PP349	Nenhuma	Otimizado	Otimizado	MMV191	PP407	0,09
PP273	1220	Otimizado	Não otimizado	MMV191	PP292	0,27
PP274	1331	Otimizado	Não otimizado	MMV191	PP293	0,22
PP344	Nenhuma	Não otimizado	Não otimizado	MMV191	PP346	0,12

EXEMPLO 14 [00180] Exemplo 2 foi repetido seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Um vetor de DNA, MMV-78, contendo tanto P4HA de bovino como sequências de P4HB de bovino fora inserida na levedura. P4HA e P4HB são direcionados pelo promotor bidirecional Das1-Das2. O DNA foi digerido por Kpn I e transformado em PP8 para gerar PP3 que contém a sequência de colágeno de SEQ ID NO: 3 (“Sequência 2”). Utilizou-se outro vetor, MMV-94 (SED ID NO: 16) (Sequência 14), contendo P4HB conduzido pelo promotor pAOX1, e foi também inserido na levedura. O peptídeo de sinal endógeno de P4HB foi substituído pelo peptídeo sinal de PHO1. A cepa resultante foi PP38.

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 64/102 / 62 [00181] Uma placa com 24 poços profundos foi preenchida com 2 ml de YPD em cada poço e foram inoculadas colônias individuais da cepa PP38. As colônias foram cultivadas em YPD por 24 horas com agitação a 900 rpm. As células foram centrifugadas a 3.000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido. Para a indução livre de metanol, o sobrenadante foi substituído por 2 mL de BMGY (1%) e cultivado por mais 48 horas. Para a indução de metanol, adicionou-se metanol a uma concentração final de 0,5% e as células cresceram durante 24 horas. O metanol foi adicionado de novo e as células cresceram durante mais 24 horas. No final da indução, retirou-se 1 ml de amostra para análise.

[00182] As amostras foram testadas para colágeno usando SDS-PAGE e coloração com Coomassie descrita no Exemplo 1. A fita para a amostra de indução isenta de metanol era mais escura que a fita para a amostra induzida por metanol, mostrando que a amostra de indução isenta de metanol tinha uma concentração mais elevada de colágeno expresso.

[00183] Termos como “otimizado” ou “otimizar”, como usados neste documento, incluem valores ou características realizados por seleção cuidadosa de características de construtos de DNA quimérico ou outras variáveis críticas do processo e não implicam o uso de uma variável conhecida de resultados efetivos.

[00184] Terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar a invenção.

[00185] Os títulos (tais como Campo da Invenção e Sumário) e subtítulos utilizados neste documento destinam-se apenas à organização geral de tópicos dentro da presente invenção, e não se destinam a limitar a divulgação da presente invenção ou qualquer aspecto do mesmo. Em particular, o assunto divulgado nos Campo da Invenção pode incluir uma nova tecnologia e não pode constituir uma recitação do estado da técnica. O

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 65/102 / 62 assunto divulgado no Sumário não é uma divulgação exaustiva ou completa de todo o escopo da tecnologia ou de quaisquer modalidades da mesma. A classificação ou discussão de um material dentro de uma seção desta especificação como tendo uma utilidade particular é feita por conveniência, e nenhuma inferência deve ser tirada de que o material deve necessariamente ou apenas funcionar de acordo com sua classificação neste documento quando é usado em qualquer composição.

[00186] Como usado neste documento, as formas singulares “um”, “uma” e o/a estão destinadas a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma.

[00187] Como usado neste documento, o termo e/ou inclui qualquer e todas as combinações de um ou mais dos itens listados associados e pode ser abreviado como /.

[00188] Os links são desativados pela inserção de um espaço ou espaço sublinhado antes de “www” e podem ser reativados pela remoção do espaço.

[00189] Como utilizado neste documento no relatório descritivo e reivindicações, incluindo como usado nos exemplos e a menos que expressamente especificado de outro modo, todos os números podem ser lidos como se prefaciados pela palavra substancialmente, sobre ou aproximadamente, mesmo se o termo não aparece expressamente. A frase “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser usada ao descrever magnitude e/ou posição para indicar que o valor e/ou a posição descrita está dentro de um intervalo razoável esperado de valores e/ou posições. Por exemplo, um valor numérico pode ter um valor de +/- 0,1% do valor declarado (ou intervalo de valores), +/- 1% do valor declarado (ou intervalo de valores), +/2% do valor o valor declarado (ou intervalo de valores), +/- 5% do valor declarado (ou intervalo de valores), +/- 10% do valor declarado (ou intervalo de valores), +/- 15% do valor declarado valor (ou intervalo de valores), +/20% do valor declarado (ou intervalo de valores), etc. Qualquer intervalo

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 66/102 / 62 numérico relatado neste documento destina-se a incluir todos os subintervalos incluídos nele.

[00190] Tal como utilizados neste documento, os termos preferido e preferivelmente referem-se a modalidades da tecnologia que proporcionam determinados benefícios, em certas circunstâncias. No entanto, outras modalidades podem também ser preferidas, de acordo com as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais modalidades preferenciais não implica que outras modalidades não são úteis, e não se pretende excluir outras modalidades do âmbito da tecnologia. Como referido neste documento, todas as percentagens de composição são em peso da composição total, salvo indicação em contrário. Tal como utilizado neste documento, a palavra incluir, e suas variantes, destina-se a ser não limitativa, de tal forma que a recitação de itens em uma lista não é para a exclusão de outros itens semelhantes, que podem também ser úteis nos materiais, composições, dispositivos e nos métodos desta tecnologia. Da mesma forma, os termos pode e podem, e suas variantes, pretendem-se não limitativos, de modo que a menção de que uma modalidade pode compreender certos elementos ou características não exclui outras modalidades da presente invenção que não contenham esses elementos ou características.

[00191] Embora os termos “primeiro” e “segundo” possam ser utilizados neste documento para descrever vários recursos/elementos (incluindo etapas), esses recursos/elementos não devem ser limitados por esses termos, a menos que o contexto indique o de outra forma. Esses termos podem ser utilizados para distinguir um característica/elemento de outro característica/elemento. Assim, uma primeira característica/elemento discutida abaixo pode ser denominada uma segunda característica/elemento e, de modo semelhante, uma segunda característica/elemento discutido abaixo pode ser denominado uma primeira característica/elemento sem se afastar dos

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 67/102 / 62 ensinamentos da presente invenção.

[00192] Espacialmente termos relativos, tais como “sob”, “abaixo”, “inferior”, “mais”, “superior” e semelhantes, pode ser utilizado neste documento para facilidade da descrição para descrever um elemento ou a relação do recurso a outro(s) elemento(s) ou recurso(s) como ilustrado nas figuras. Entender-se-á que os termos relativos espacialmente são destinados a englobar diferentes orientações do dispositivo em uso ou operação em adição à orientação representada nas figuras. Por exemplo, se um dispositivo nas figuras estiver invertido, os elementos descritos como abaixo ou inferior de outros elementos ou recursos serão orientados sobre os outros elementos ou recursos. Assim, o termo exemplar abaixo pode abranger tanto uma orientação de sobre quanto de baixo. O dispositivo pode ser orientado de outra maneira (rotacionando 90 graus ou em outras orientações) e as descrições relativas a espaço usadas neste documento interpretadas de acordo. Da mesma forma, os termos “para cima”, “para baixo”, “vertical”, “horizontal” e similares são usados neste documento apenas para fins de explicação, a menos que especificamente indicado de outro modo.

[00193] Quando uma característica ou elemento é referido neste documento como sendo “ligado” a outra característica ou elemento, ele pode estar diretamente na outra característica ou elemento ou recursos intervenientes e/ou elementos também podem estar presentes. Por outro lado, quando um recurso ou elemento é chamado de “diretamente ligado” a outro recurso ou elemento, não há elementos ou elementos intermediários presentes. Será também entendido que, quando uma característica ou elemento é referido como sendo “conectado”, “anexado” ou “acoplado” a outra característica ou elemento, ele pode ser conectado diretamente, anexado ou acoplado a outra característica ou elemento ou recursos intervenientes ou elementos podem estar presentes. Por outro lado, quando um recurso ou elemento é referido como sendo “diretamente conectado”, “diretamente anexado” ou “diretamente

Petição 870180128080, de 10/09/2018, pág. 68/102 / 62 acoplado” a outro recurso ou elemento, não há elementos intervenientes ou elementos presentes. Embora descritos ou mostrados em relação a uma modalidade, as características e elementos assim descritos ou mostrados podem aplicar-se a outras modalidades. Será também apreciado pelos versados na técnica que as referências a uma estrutura ou característica que é disposta “adjacente” a outra característica podem ter porções que se sobrepõem ou sustentam a característica adjacente.

[00194] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência em suas totalidades na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente de modo a ser incorporado por referência, especialmente referenciada divulgação que aparece na mesma sentença, parágrafo, página ou seção do relatório no qual a incorporação por referência aparece. A citação de referências neste documento não constitui uma admissão que essas referências são da técnica anterior ou têm qualquer relevância para a patenteabilidade da tecnologia divulgada neste documento. Qualquer discussão sobre o conteúdo das referências citadas destina-se apenas a fornecer um resumo geral das afirmações feitas pelos autores das referências e não constitui admissão quanto à precisão do conteúdo de tais referências.

Claims

1. Cepa de levedura geneticamente manipulada para produzir colágeno não hidroxilado, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) uma cepa de levedura; e (ii) um vetor compreendendo uma sequência de DNA para colágeno; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador de colágeno; uma sequência de DNA para um marcador de seleção, uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para um terminador para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para uma origem de replicação selecionada dentre uma para bactérias e uma para levedura; e uma sequência de DNA contendo homologia ao genoma da levedura, em que o vetor foi inserido na cepa da levedura.

2. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

3. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para colágeno é selecionada do grupo consistindo em colágeno de bovinos, porcinos, cangurus, jacarés, crocodilos, elefantes, girafas, zebras, lhamas, alpacas, cordeiros, dinossauros, e combinações dos mesmos.

4. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para colágeno é selecionada dentre DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno manipulado e DNA de colágeno modificado por códon.

5. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor induzido por

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2 / 9 metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido pDF, DNA para o promotor desreprimido pCAT, DNA para o promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pHTX1, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1 e combinações dos mesmos.

6. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo em um DNA para resistência a antibióticos e um DNA para marcador auxotrófico.

7. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o marcador de resistência a antibióticos é selecionado do grupo consistindo em resistência à higromicina, zeocina, geneticina e combinações das mesmas.

8. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor é inserido na levedura através de um método selecionado do grupo consistindo em eletroporação, transformação química e conjugação (“mating”).

9. Método para produzir colágeno não hidroxilado, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) fornecimento de uma cepa de levedura como definida na reivindicação 1; e (ii) cultivar a cepa em um meio por um período de tempo suficiente para produzir colágeno.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado do grupo consistindo em meio

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3 / 9 complexo tamponado com glicerol (BMGY), meio complexo tamponado com metanol (BMMY) e peptona dextrose com extrato de levedura (YPD).

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de 24 horas a 72 horas.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para colágeno é selecionada do grupo consistindo em colágeno de bovinos, porcinos, cangurus, jacarés, crocodilos, elefantes, girafas, zebras, lhamas, alpacas, cordeiros, dinossauros e combinações dos mesmos.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pHTX1 e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1

16. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo no DNA para resistência a antibióticos e no DNA para o marcador auxotrófico.

17. Cepa de levedura geneticamente manipulada para produzir colágeno hidroxilado, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) uma cepa de levedura;

(ii) um vetor compreendendo uma sequência de DNA para colágeno; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador; uma sequência de DNA para um marcador de seleção; uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para um terminador para o

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4 / 9 marcador de seleção; uma sequência de DNA para uma origem de replicação para bactérias e/ou leveduras; uma sequência de DNA contendo homologia ao genoma da levedura, em que o vetor foi inserido na cepa da levedura; e (iii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de DNA para P4HA1; uma sequência de DNA para P4HB; e pelo menos uma sequência de DNA para um promotor, em que os vetores foram inseridos na cepa da levedura.

18. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a cepa de levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

19. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para colágeno é selecionada dos grupos consistindo em colágenos de bovinos, porcinos, cangurus, jacarés, crocodilos, elefantes, girafas, zebras, lhamas, alpacas, cordeiros, dinossauros e combinações dos mesmos.

20. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para colágeno é selecionada dentre DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno manipulado e DNA de colágeno modificado.

21. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor induzido por metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido pDF, DNA para o promotor desreprimido pCAT, DNA para o promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pHTX1, DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1 e combinações dos mesmos.

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22. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pHTX1 e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1.

23. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo no DNA para a resistência a antibióticos e no DNA para o marcador auxotrófico.

24. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção é um para resistência a antibióticos selecionado do grupo consistindo em resistência à higromicina, zeocina, geneticina e combinações das mesmas.

25. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o vetor é inserido na levedura através de um método selecionado do grupo consistindo em eletroporação, transformação química e conjugação.

26. Método para produzir colágeno hidroxilado, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) fornecimento de uma cepa de levedura como definida na reivindicação 17; e (ii) cultivar a cepa em um meio por um período de tempo suficiente para produzir colágeno.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Candida, Komatagaella, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

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28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado do grupo consistindo em BMGY, BMMY e YPD.

29. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de 24 horas a 72 horas.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Candida, Komatagaella, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

31. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o DNA para colágeno é selecionado do grupo consistindo em colágeno de bovinos, porcinos, cangurus, jacarés, crocodilos, elefantes, girafas, zebras, lhamas, alpacas, cordeiros, dinossauros e combinações dos mesmos.

32. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o DNA para o promotor é selecionado do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pTHX1 e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1.

33. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o DNA para o marcador de seleção é selecionado do grupo consistindo no DNA para a resistência a antibióticos e no DNA para o marcador auxotrófico.

34. Vetor multifuncional, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) um DNA necessário para produzir colágeno, incluindo um promotor e um terminador;

(ii) um DNA para enzimas de hidroxilação selecionadas do grupo consistindo em P4HA1 e P4HB, incluindo promotores e terminadores;

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7 / 9 (iii) um DNA para um marcador de seleção; incluindo um promotor e um terminador;

(iv) um DNA para origens de replicação para leveduras e bactérias;

(v) DNAs com homologia ao genoma de levedura para integração no genoma; e (vi) sítios de restrição em uma posição selecionada do grupo consistindo em 5’, 3’, dentro dos DNAs acima, e combinações dos mesmos, permitindo a clonagem modular.

35. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA necessária para produzir colágeno é selecionada do grupo consistindo em colágeno de bovinos, porcinos, cangurus, jacarés, crocodilos, elefantes, girafas, zebras, lhamas, alpacas, cordeiros, dinossauros e combinações dos mesmos.

36. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pTHXl e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1.

37. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é DNA para resistência a antibióticos e DNA para o marcador auxotrófico.

38. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é um para resistência a antibióticos para um antibiótico selecionado do grupo consistindo em higromicina, zeocina, geneticina e combinações dos mesmos.

39. Sequência de DNA de colágeno quimérico, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 a 40 por cento ou de 60 a 90 por cento e

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DNA otimizado com base no comprimento total do DNA de colágeno quimérico.

40. Sequência de DNA de colágeno quimérico de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o DNA otimizado é originado no terminal C.

41. Sequência de DNA de colágeno quimérico de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o DNA otimizado é originado no terminal N.

42. Cepa de levedura produtora de colágeno, caracterizada pelo fato de que compreende:

um vetor compreendendo uma sequência de DNA para um colágeno quimérico como definido na reivindicação 39;

uma sequência de DNA para um promotor de colágeno;

uma sequência de DNA para um terminador; uma sequência de DNA para um marcador de seleção;

uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção;

uma sequência de DNA para um terminador para o marcador de seleção;

uma sequência de DNA para uma origem de replicação para bactérias e/ou leveduras; e uma sequência de DNA contendo homologia ao genoma da levedura.

43. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o DNA para o promotor é selecionado do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pTHX1 e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1.

44. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o DNA para o marcador de seleção é

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9 / 9 selecionado do grupo consistindo no DNA que codifica pelo menos resistência a um antibiótico e no DNA que codifica pelo menos um marcador auxotrófico.

45. Método para produzir colágeno hidroxilado, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) fornecimento de uma cepa de levedura produtora de colágeno como definida na reivindicação 42; e (ii) cultivar a cepa em um meio por um período de tempo suficiente para produzir colágeno.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura é selecionada do grupo consistindo naquelas dos gêneros Pichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações dos mesmos.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado do grupo consistindo em meio complexo tamponado com glicerol, meio complexo tamponado com metanol, e peptona dextrose com extrato de levedura.

48. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o período de tempo varia de 24 horas a 72 horas.

49. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura compreende um promotor selecionado do grupo consistindo no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pTHX1 e no DNA para o promotor bidirecional constitutivo pGCW14-pGAP1.

50. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura compreende pelo menos um marcador de seleção selecionado do grupo consistindo no DNA que codifica resistência a um antibiótico e no DNA que codifica um marcador auxotrófico.