JP2000125876A - アラニン脱水素酵素遺伝子、組換え体ｄｎａ及びアラニン脱水素酵素の製造法 - Google Patents
アラニン脱水素酵素遺伝子、組換え体ｄｎａ及びアラニン脱水素酵素の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子工学的方法によるアラニン脱水素酵素
の製造方法を提供する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列、または該アミノ酸
配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失も
しくは置換されたものであって、且つアラニン脱水素酵
素活性をもたらすアミノ酸配列をコ−ドするアラニン脱
水素酵素遺伝子、該アラニン脱水素酵素遺伝子がベクタ
− DNAに挿入されたものであることを特徴とする新規な
組換え体 DNA、該組換え体DNA を含有する微生物を培地
に培養し、培養物からアラニン脱水素酵素を採取するこ
とを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造法。
の製造方法を提供する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列、または該アミノ酸
配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失も
しくは置換されたものであって、且つアラニン脱水素酵
素活性をもたらすアミノ酸配列をコ−ドするアラニン脱
水素酵素遺伝子、該アラニン脱水素酵素遺伝子がベクタ
− DNAに挿入されたものであることを特徴とする新規な
組換え体 DNA、該組換え体DNA を含有する微生物を培地
に培養し、培養物からアラニン脱水素酵素を採取するこ
とを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アラニン脱水素酵
素遺伝子、組換え体ＤＮＡおよびアラニン脱水素酵素の
製造法に関する。
素遺伝子、組換え体ＤＮＡおよびアラニン脱水素酵素の
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アラニン脱水素酵素は、次式 L-アラニン＋ NAD+ →ピルビン酸＋ NH4+＋NADH で示される反応を触媒する酵素であり、臨床検査や食品
分析のL-アラニンの定量に利用される非常に重要な酵素
である。アラニン脱水素酵素は、従来より、例えば、Ba
cillus 株由来のアラニン脱水素酵素遺伝子をベクター
DNA に挿入した組み換え体 DNAを含むエッシェリシア属
に属する微生物を培地に接種、培養し、その培養物から
採取することにより製造されていた。しかしながら、上
記の製造法により得られたアラニン脱水素酵素は、L-ア
ラニンに対して親和性が低く、反応性が小さいという酵
素的性質を有しており、Ｌ−アラニンの定量を行うとき
には多量の酵素を必要とするなどの欠点があった。
分析のL-アラニンの定量に利用される非常に重要な酵素
である。アラニン脱水素酵素は、従来より、例えば、Ba
cillus 株由来のアラニン脱水素酵素遺伝子をベクター
DNA に挿入した組み換え体 DNAを含むエッシェリシア属
に属する微生物を培地に接種、培養し、その培養物から
採取することにより製造されていた。しかしながら、上
記の製造法により得られたアラニン脱水素酵素は、L-ア
ラニンに対して親和性が低く、反応性が小さいという酵
素的性質を有しており、Ｌ−アラニンの定量を行うとき
には多量の酵素を必要とするなどの欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先にエ
ンテロバクタ−・エアロゲネス（ Enterobacter aeroge
nes ）からＬ−アラニンに対して親和性が高く、反応性
が大きい酵素的性質を有する新規なアラニン脱水素酵素
を見出だした。本発明は、上記エンテロバクタ−・エア
ロゲネス（ Enterobacter aerogenes ）由来のアラニン
脱水素酵素を遺伝子工学的手法により生産することを目
的として、その生産のための遺伝子源となるアラニン脱
水素酵素遺伝子、更に、該遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ、および該組換え体ＤＮＡを用いるアラニン脱水素酵
素の製造法を提供することである。
ンテロバクタ−・エアロゲネス（ Enterobacter aeroge
nes ）からＬ−アラニンに対して親和性が高く、反応性
が大きい酵素的性質を有する新規なアラニン脱水素酵素
を見出だした。本発明は、上記エンテロバクタ−・エア
ロゲネス（ Enterobacter aerogenes ）由来のアラニン
脱水素酵素を遺伝子工学的手法により生産することを目
的として、その生産のための遺伝子源となるアラニン脱
水素酵素遺伝子、更に、該遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ、および該組換え体ＤＮＡを用いるアラニン脱水素酵
素の製造法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題について種々検討した結果、エンテロバクタ−
（Enterobacter）属細菌由来のアラニン脱水素酵素遺伝
子を単離及び構造決定することに成功し、さらに、アラ
ニン脱水素酵素をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組換え体ＤＮＡを得、この組換え体ＤＮＡをエ
ッシェリシア（Escherichia）属に属する菌株に導入し
たアラニン脱水素酵素生産能を有する菌株を培地に培養
するとき、効率よくアラニン脱水素酵素が生産されるこ
とを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、
（１）、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコ−
ドするアラニン脱水素酵素遺伝子。（ａ）配列番号２に
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）アミ
ノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つアラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（２）、以下の（ａ）または（ｂ）のアラニン脱水素酵
素。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる
タンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もし
くは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつアラニン脱水素酵素活性を有
するタンパク質。（３）、（１）記載のアラニン脱水素
酵素遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡ。（４）、（３）
記載の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体または形質
導入体。（５）、（４）記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からアラニン脱水素酵素を
採取することを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造法
を提供する。
上記課題について種々検討した結果、エンテロバクタ−
（Enterobacter）属細菌由来のアラニン脱水素酵素遺伝
子を単離及び構造決定することに成功し、さらに、アラ
ニン脱水素酵素をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組換え体ＤＮＡを得、この組換え体ＤＮＡをエ
ッシェリシア（Escherichia）属に属する菌株に導入し
たアラニン脱水素酵素生産能を有する菌株を培地に培養
するとき、効率よくアラニン脱水素酵素が生産されるこ
とを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、
（１）、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコ−
ドするアラニン脱水素酵素遺伝子。（ａ）配列番号２に
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）アミ
ノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つアラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（２）、以下の（ａ）または（ｂ）のアラニン脱水素酵
素。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる
タンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もし
くは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつアラニン脱水素酵素活性を有
するタンパク質。（３）、（１）記載のアラニン脱水素
酵素遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡ。（４）、（３）
記載の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体または形質
導入体。（５）、（４）記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からアラニン脱水素酵素を
採取することを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造法
を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明のアラニン脱水素酵素遺伝
子は、エンテロバクタ−・エアロゲネス（Enterobacter
aerogenes）ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然の遺伝子を
クロ−ニングすることにより得られる。遺伝子のクロ−
ニング方法としては、本発明のアラニン脱水素酵素のア
ミノ酸配列にもとづき、適当なプロ−ブＤＮＡを合成し
てこれを用いてエンテロバクタ−・エアロゲネスＤＮＡ
またはｃＤＮＡのライブラリ−からスクリ−ニングする
方法、あるいは、該ペプチドのアミノ酸配列にもとづき
適当なプライマ−ＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や
３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラ−ゼ連鎖反応（以
下ＰＣＲ法と略称する。）により、該遺伝子の断片を含
むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の遺伝子
を含むＤＮＡを得る方法などが挙げられる。
子は、エンテロバクタ−・エアロゲネス（Enterobacter
aerogenes）ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然の遺伝子を
クロ−ニングすることにより得られる。遺伝子のクロ−
ニング方法としては、本発明のアラニン脱水素酵素のア
ミノ酸配列にもとづき、適当なプロ−ブＤＮＡを合成し
てこれを用いてエンテロバクタ−・エアロゲネスＤＮＡ
またはｃＤＮＡのライブラリ−からスクリ−ニングする
方法、あるいは、該ペプチドのアミノ酸配列にもとづき
適当なプライマ−ＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や
３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラ−ゼ連鎖反応（以
下ＰＣＲ法と略称する。）により、該遺伝子の断片を含
むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の遺伝子
を含むＤＮＡを得る方法などが挙げられる。
【０００６】例えば、本発明では、アラニン脱水素酵素
遺伝子を以下のようにして得ることができる。先ず、エ
ンテロバクタ−・エアロゲネス（Enterobacter aerogen
es）ICR0220 （京都大学化学研究所より入手）を培養
し、得られた菌体から、例えば、Current Protocols in
Molecular Biology (WILEY Intersciense, 1989 )記載
の方法などにより染色体ＤＮＡを抽出する。
遺伝子を以下のようにして得ることができる。先ず、エ
ンテロバクタ−・エアロゲネス（Enterobacter aerogen
es）ICR0220 （京都大学化学研究所より入手）を培養
し、得られた菌体から、例えば、Current Protocols in
Molecular Biology (WILEY Intersciense, 1989 )記載
の方法などにより染色体ＤＮＡを抽出する。
【０００７】次いで、アラニン脱水素酵素のＮ末端アミ
ノ酸配列、リジルエンドペプチダ−ゼ消化により得られ
たペプチド断片のアミノ酸配列、エンテロバクター属に
属する微生物のコドン使用頻度などを考慮して、ＰＣＲ
に用いるプライマ−を合成する。これらのプライマ−と
上記で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行
い、アラニン脱水素酵素の一部をコードするＤＮＡを得
る。さらに、得られたＤＮＡの塩基配列にもとずき、プ
ライマ−を合成する。この合成プライマ−を用いて、ｃ
ＤＮＡのＨｉｎｄIII フラグメントをテンプレ−トとし
て、ＰＣＲを行い、アラニン脱水素酵素の一部をコ−ド
するＤＮＡを得る。次に、ＳｍａＩ等の制限酵素切断サ
イトを含む合成プライマ−とｃＤＮＡをテンプレ−トと
してＰＣＲを行い、アラニン脱水素酵素のＤＮＡを得
る。このようにして得られたアラニン脱水素酵素遺伝子
を常法に従いベクタ−ＤＮＡに組み込む。用いられるベ
クタ−ＤＮＡとしては、例えば、pUC119（宝酒造社
製）、pBR322（宝酒造社製）、pBluescript SK+ （Stra
tagene社製）などのプラスミドベクタ−ＤＮＡ、λEMBL
3（Stratagene社製）などのバクテリオファ−ジベクタ
−ＤＮＡが挙げられる。このようにして得られた組み換
え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは
大腸菌JM109（宝酒造社製）、XL-Blue（フナコシ社製）
などを形質転換又は形質導入して、夫々形質転換体又は
形質導入体を得る。この形質転換は、例えば、D.M.Morr
isonの方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）
により行なうことができる。また、形質導入は、例え
ば、B.Hohnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,
1979）により行なうことができる。宿主細胞としては、
大腸菌のほか、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの
微生物や動物細胞などが用いられる。
ノ酸配列、リジルエンドペプチダ−ゼ消化により得られ
たペプチド断片のアミノ酸配列、エンテロバクター属に
属する微生物のコドン使用頻度などを考慮して、ＰＣＲ
に用いるプライマ−を合成する。これらのプライマ−と
上記で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行
い、アラニン脱水素酵素の一部をコードするＤＮＡを得
る。さらに、得られたＤＮＡの塩基配列にもとずき、プ
ライマ−を合成する。この合成プライマ−を用いて、ｃ
ＤＮＡのＨｉｎｄIII フラグメントをテンプレ−トとし
て、ＰＣＲを行い、アラニン脱水素酵素の一部をコ−ド
するＤＮＡを得る。次に、ＳｍａＩ等の制限酵素切断サ
イトを含む合成プライマ−とｃＤＮＡをテンプレ−トと
してＰＣＲを行い、アラニン脱水素酵素のＤＮＡを得
る。このようにして得られたアラニン脱水素酵素遺伝子
を常法に従いベクタ−ＤＮＡに組み込む。用いられるベ
クタ−ＤＮＡとしては、例えば、pUC119（宝酒造社
製）、pBR322（宝酒造社製）、pBluescript SK+ （Stra
tagene社製）などのプラスミドベクタ−ＤＮＡ、λEMBL
3（Stratagene社製）などのバクテリオファ−ジベクタ
−ＤＮＡが挙げられる。このようにして得られた組み換
え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは
大腸菌JM109（宝酒造社製）、XL-Blue（フナコシ社製）
などを形質転換又は形質導入して、夫々形質転換体又は
形質導入体を得る。この形質転換は、例えば、D.M.Morr
isonの方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）
により行なうことができる。また、形質導入は、例え
ば、B.Hohnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,
1979）により行なうことができる。宿主細胞としては、
大腸菌のほか、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの
微生物や動物細胞などが用いられる。
【０００８】得られたアラニン脱水素酵素遺伝子の全塩
基配列（配列番号１参照）は、例えば、３７０ＤＮＡシ
−クエンス・システム（パ−キンエルマ−社製）を用い
て解析され、次いで、前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸の一次配列が確
定される（配列番号２参照）。なお、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列において、１もしくは複数、好ましく
は、数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されてお
り、かつ、アラニン脱水素酵素活性をもたらすアミノ酸
配列をコ−ドするアラニン脱水素酵素遺伝子は、すべて
本発明に含まれる。
基配列（配列番号１参照）は、例えば、３７０ＤＮＡシ
−クエンス・システム（パ−キンエルマ−社製）を用い
て解析され、次いで、前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸の一次配列が確
定される（配列番号２参照）。なお、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列において、１もしくは複数、好ましく
は、数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されてお
り、かつ、アラニン脱水素酵素活性をもたらすアミノ酸
配列をコ−ドするアラニン脱水素酵素遺伝子は、すべて
本発明に含まれる。
【０００９】そして、配列番号２に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、アラニン脱水素酵素活性
をもたらすアミノ酸配列をコ−ドするアラニン脱水素酵
素遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、
遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための周知
技術である、部位特定変異誘導法や遺伝子を選択的に開
裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去または付
加した後、遺伝子を連結する方法そしてオリゴヌクレオ
チド変異誘導法などが挙げられる。
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、アラニン脱水素酵素活性
をもたらすアミノ酸配列をコ−ドするアラニン脱水素酵
素遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、
遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための周知
技術である、部位特定変異誘導法や遺伝子を選択的に開
裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去または付
加した後、遺伝子を連結する方法そしてオリゴヌクレオ
チド変異誘導法などが挙げられる。
【００１０】上記のようにして得られたアラニン脱水素
酵素生産能を有する形質転換体または形質導入体、例え
ば、形質転換微生物を用いて、アラニン脱水素酵素を生
産するには、下記のようにして行なうことができる。上
記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養して
もよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
酵素生産能を有する形質転換体または形質導入体、例え
ば、形質転換微生物を用いて、アラニン脱水素酵素を生
産するには、下記のようにして行なうことができる。上
記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養して
もよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
【００１１】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦
ふすまの浸出液などの１種以上の窒素源に、塩化ナトリ
ウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第
２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。なお、培地の初発 pＨは、pＨ
７〜９に調整するのが適当である。また培養は 30〜42
℃、好ましくは37℃前後で６〜２４時間、通気攪拌深部
培養、振盪培養、静置培養などにより実施するのが好ま
しい。培養終了後、該培養物よりアラニン脱水素酵素を
採取するには、通常の酵素の採取手段を用いて得ること
ができる。
は、例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦
ふすまの浸出液などの１種以上の窒素源に、塩化ナトリ
ウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第
２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。なお、培地の初発 pＨは、pＨ
７〜９に調整するのが適当である。また培養は 30〜42
℃、好ましくは37℃前後で６〜２４時間、通気攪拌深部
培養、振盪培養、静置培養などにより実施するのが好ま
しい。培養終了後、該培養物よりアラニン脱水素酵素を
採取するには、通常の酵素の採取手段を用いて得ること
ができる。
【００１２】例えば、常法により菌体を、超音波破壊処
理、磨砕処理などをするか、または、リゾチームなどの
溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン
などの存在下で振盪もしくは放置して、自己消化を行わ
せて、本酵素を菌体外に排出させることができる。そし
て、この溶液を濾過、遠心分離などして、固形部分を除
去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミ
ン硫酸塩、硫酸マンガンなどにより核酸を除去したの
ち、これに硫安、アルコール、アセトンなどを添加して
分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
理、磨砕処理などをするか、または、リゾチームなどの
溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン
などの存在下で振盪もしくは放置して、自己消化を行わ
せて、本酵素を菌体外に排出させることができる。そし
て、この溶液を濾過、遠心分離などして、固形部分を除
去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミ
ン硫酸塩、硫酸マンガンなどにより核酸を除去したの
ち、これに硫安、アルコール、アセトンなどを添加して
分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００１３】上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得る
には、例えばセファデックス、ウルトラゲルもしくはバ
イオゲルなどを用いるゲル濾過法、イオン交換体を用い
る吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲルなどを用いる電
気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、
蔗糖密度勾配遠心法などの沈降法、アフィニティクロマ
ト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜などを用いる分画
法などを適宜選択し、またこれらを組合わせて実施する
ことにより、得ることができる。
には、例えばセファデックス、ウルトラゲルもしくはバ
イオゲルなどを用いるゲル濾過法、イオン交換体を用い
る吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲルなどを用いる電
気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、
蔗糖密度勾配遠心法などの沈降法、アフィニティクロマ
ト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜などを用いる分画
法などを適宜選択し、またこれらを組合わせて実施する
ことにより、得ることができる。
【００１４】得られたアラニン脱水素酵素の酵素化学的
性質は、以下に示すとおりである。 （１）作用：L-アラニン＋ NAD+ →ピルビン酸＋ NH4+
＋NADH （２）至適ｐＨ：１０．０〜１１．５ （３）至適温度：５２℃〜５８℃ （４）安定ｐＨ： ６．０〜１０．５ （５）分子量：２４５，０００（ゲル濾過法） 上記アラニン脱水素酵素は、Ｌ−アラニンに対して親和
性が高く、反応性が大きいことから、臨床検査や食品分
析におけるアラニンの定量用試薬に好適に用いることが
できる。
性質は、以下に示すとおりである。 （１）作用：L-アラニン＋ NAD+ →ピルビン酸＋ NH4+
＋NADH （２）至適ｐＨ：１０．０〜１１．５ （３）至適温度：５２℃〜５８℃ （４）安定ｐＨ： ６．０〜１０．５ （５）分子量：２４５，０００（ゲル濾過法） 上記アラニン脱水素酵素は、Ｌ−アラニンに対して親和
性が高く、反応性が大きいことから、臨床検査や食品分
析におけるアラニンの定量用試薬に好適に用いることが
できる。
【００１５】
（１）アラニン脱水素酵素の単離精製 エンテロバクタ−・エアロゲネス（Enterobacter aerog
enes）ＩＣＲ0220株をペプトン１．５％含有培地（０．
２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．２％Ｎ
ａＣｌ、０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１％
イ−ストエキス、ｐＨ７．２）で、３０℃、２４時間振
盪培養し、菌体を得る。得られた菌体（湿重量約９ｇ）
を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２（０．０
１％２−メルカプトエタノ−ル含有）１００ｍｌに懸濁
し、超音波処理により破砕する。得られた粗酵素液の硫
酸アンモニウム塩析（４０〜６０％飽和）沈殿区分を集
め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４（０．
０１％２−メルカプトエタノ−ル含有：緩衝液Ｐと言
う）に懸濁する。緩衝液Ｐに一晩透析した後、得られた
酵素液をＤＥＡＥセルロ−スカラムに吸着させ、０．１
５ＭＫＣｌ含有緩衝液Ｐで溶出し、活性区分を集める。
活性区分を濃縮した後、Ｒｅｄ−Ａカラム（アミコン社
製）に吸着させ、０．１ＭＫＣｌ含有緩衝液Ｐで溶出
し、精製されたアラニン脱水素酵素を得る。
enes）ＩＣＲ0220株をペプトン１．５％含有培地（０．
２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．２％Ｎ
ａＣｌ、０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１％
イ−ストエキス、ｐＨ７．２）で、３０℃、２４時間振
盪培養し、菌体を得る。得られた菌体（湿重量約９ｇ）
を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２（０．０
１％２−メルカプトエタノ−ル含有）１００ｍｌに懸濁
し、超音波処理により破砕する。得られた粗酵素液の硫
酸アンモニウム塩析（４０〜６０％飽和）沈殿区分を集
め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４（０．
０１％２−メルカプトエタノ−ル含有：緩衝液Ｐと言
う）に懸濁する。緩衝液Ｐに一晩透析した後、得られた
酵素液をＤＥＡＥセルロ−スカラムに吸着させ、０．１
５ＭＫＣｌ含有緩衝液Ｐで溶出し、活性区分を集める。
活性区分を濃縮した後、Ｒｅｄ−Ａカラム（アミコン社
製）に吸着させ、０．１ＭＫＣｌ含有緩衝液Ｐで溶出
し、精製されたアラニン脱水素酵素を得る。
【００１６】（２）アラニン脱水素酵素のＮ末端アミノ
酸配列およびプロテア−ゼ消化物のアミノ酸配列 アラニン脱水素酵素をリジルエンドペプチダ−ゼ（和光
純薬社製）で、３７℃、１２時間消化したのち、得られ
たペプチド断片をＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣシステム
（島津製作所社製、カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋｅｄＣ
４）で単離した。また、ＳｈｉｍａｄｚｕＣＴＦＦ−１
Ｃ−terminal fragument fractionator （島津製作所社
製）を用いて、Ｃ末端ペプチドを得た。アラニン脱水素
酵素のＮ末端アミノ酸配列及び得られた上記ペプチド断
片のアミノ酸配列をフェニルチオヒダントイン誘導体分
析装置を装備したプロテインシ−クエンサ−（４９２型
アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、エドマン
法により分析した。得られたＮ末端アミノ酸配列を配列
番号３、５種の消化ペプチド断片のアミノ酸配列を配列
番号４、５、６、７及び８に、また、Ｃ末端アミノ酸配
列を配列番号９にそれぞれ示した。 〔実施例２〕ＰＣＲ法によるクロ−ニング 実施例１において、培養して得られたエンテロバクタ−
菌体から Saito and Miuraらの方法（Biochem.Biophys.
Acta 72,619,1963）に従って、ｃＤＮＡを抽出した。Ｐ
ＣＲの基本的反応条件を、常法どおり、変性を９４℃、
１分間、アニ−ルを５０℃、１分間伸長反応を７２℃、
２分間で３０サイクルとした。ＰＣＲに用いるセンス
（ＮＯ）プライマ−（配列番号１０）及び、アンチセン
ス（ＮＲ）プライマ−（配列番号１１）は、酵素のＮ末
端アミノ酸配列とリジルエンドペプチダ−ゼ消化により
得られたペプチド断片のアミノ酸配列からデザインされ
た。上記２種のプライマ−とテンプレ−トとしてｃＤＮ
ＡのＨｉｎｄ IIIフラグメントを用いてＰＣＲを行い、
増幅されたＤＮＡ断片（４６０ｂｐ：ＤＮＡフラグメン
トＡ）を得た。得られた該ＤＮＡ断片を純化したのち、
Ｓａｎｇｅｒ等の方法により、ＰＲＩＳＭｋｉｔ（パ−
キンエルマ−社製）を用いて、３７３ＡＤＮＡシ−クエ
ンサ−（アプライドバイオシステムズ社製）により塩基
配列を決定した。得られた配列を基に、さらに４種のプ
ライマ−、ＮＳ１（配列番号１２）、ＮＳ２（配列番号
１３）、ＣＳ１（配列番号１４）、ＣＳ２（配列番号１
５）を合成した。
酸配列およびプロテア−ゼ消化物のアミノ酸配列 アラニン脱水素酵素をリジルエンドペプチダ−ゼ（和光
純薬社製）で、３７℃、１２時間消化したのち、得られ
たペプチド断片をＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣシステム
（島津製作所社製、カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋｅｄＣ
４）で単離した。また、ＳｈｉｍａｄｚｕＣＴＦＦ−１
Ｃ−terminal fragument fractionator （島津製作所社
製）を用いて、Ｃ末端ペプチドを得た。アラニン脱水素
酵素のＮ末端アミノ酸配列及び得られた上記ペプチド断
片のアミノ酸配列をフェニルチオヒダントイン誘導体分
析装置を装備したプロテインシ−クエンサ−（４９２型
アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、エドマン
法により分析した。得られたＮ末端アミノ酸配列を配列
番号３、５種の消化ペプチド断片のアミノ酸配列を配列
番号４、５、６、７及び８に、また、Ｃ末端アミノ酸配
列を配列番号９にそれぞれ示した。 〔実施例２〕ＰＣＲ法によるクロ−ニング 実施例１において、培養して得られたエンテロバクタ−
菌体から Saito and Miuraらの方法（Biochem.Biophys.
Acta 72,619,1963）に従って、ｃＤＮＡを抽出した。Ｐ
ＣＲの基本的反応条件を、常法どおり、変性を９４℃、
１分間、アニ−ルを５０℃、１分間伸長反応を７２℃、
２分間で３０サイクルとした。ＰＣＲに用いるセンス
（ＮＯ）プライマ−（配列番号１０）及び、アンチセン
ス（ＮＲ）プライマ−（配列番号１１）は、酵素のＮ末
端アミノ酸配列とリジルエンドペプチダ−ゼ消化により
得られたペプチド断片のアミノ酸配列からデザインされ
た。上記２種のプライマ−とテンプレ−トとしてｃＤＮ
ＡのＨｉｎｄ IIIフラグメントを用いてＰＣＲを行い、
増幅されたＤＮＡ断片（４６０ｂｐ：ＤＮＡフラグメン
トＡ）を得た。得られた該ＤＮＡ断片を純化したのち、
Ｓａｎｇｅｒ等の方法により、ＰＲＩＳＭｋｉｔ（パ−
キンエルマ−社製）を用いて、３７３ＡＤＮＡシ−クエ
ンサ−（アプライドバイオシステムズ社製）により塩基
配列を決定した。得られた配列を基に、さらに４種のプ
ライマ−、ＮＳ１（配列番号１２）、ＮＳ２（配列番号
１３）、ＣＳ１（配列番号１４）、ＣＳ２（配列番号１
５）を合成した。
【００１７】先に得たｃＤＮＡのＨｉｎｄ IIIフラグメ
ントをテンプレ−トとしてＴａＫａＲａＬＡＰＣＲ in
vitro Cloning Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いＬＡＰＣＲ
を行った。最初のＬＡＰＣＲは、Ｈｉｎｄ IIIカセット
−カセットプライマ−Ｃ１とプライマ−ＮＳ１またはＣ
Ｓ１を用いて行なった。第２のＬＡＰＣＲはテンプレ−
トとして得られたＰＣＲ産物と、Ｈｉｎｄ IIIカセット
−カセットプライマ−Ｃ２とプライマ−ＮＳ２、または
ＣＳ２を用いて行なった。第２のＬＡＰＣＲにより得ら
れた産物の塩基配列を前記方法により決定した。該酵素
のＮ末端アミノ酸配列及び５種のリジルエンドペプチダ
−ゼ消化物のアミノ酸配列により、その決定された配列
が酵素の塩基配列の一部を含んでいることを確認した。
これらの塩基配列を基に、ＳｍａＩ制限サイトを含むプ
ライマ−ＮＴ（配列番号１６）、及びＨｉｎｄIII 制限
サイトを含むプライマ−ＣＴ（配列番号１７）を合成し
た。最終的に、アラニン脱水素酵素遺伝子は、プライマ
−ＮＴ、プライマ−ＣＴ及びＴａｋａｒａＬＡＴａｑＤ
ＮＡを用いるＰＣＲにより得られた。得られた目的の
１．１３ｋｂのＤＮＡ断片をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮＩＩ
（フナコシ社製）により精製した。前述の方法により、
１１３１ｂｐの該酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）
が決定され、更に、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を配列番号２に示した。 〔実施例３〕形質転換大腸菌の作成 大腸菌ラクト−スオペロンなどに由来するプロモ−タ
−、オペレ−タ−及びリボソ−ム結合部位などの発現調
節領域、並びにＨｐａＩ切断部位を含むＤＮＡ配列発現
ベクタ−ｐＵＴＥ１００Ｋ’を作製した。得られた酵素
遺伝子を含むフラグメントをｐＵＴＥ１００Ｋ’のＨｐ
ａＩ部位に組み込み、組換え体プラスミドｐＥＡＡＤ−
ＨＳＩを構築した。ついで D.M.Morrison の方法（Meth
od in Enzymology,68,326,1979）に従い、組換え体プラ
スミドｐＥＡＡＤ−ＨＳ１を大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９（宝酒造社製）に導入し、組換え微生物、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＥＡＡＤ−ＨＳ１）を
得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＥＡＡＤ
−ＨＳ１）はＦＥＲＭ Ｐ−１７０２２として工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
ントをテンプレ−トとしてＴａＫａＲａＬＡＰＣＲ in
vitro Cloning Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いＬＡＰＣＲ
を行った。最初のＬＡＰＣＲは、Ｈｉｎｄ IIIカセット
−カセットプライマ−Ｃ１とプライマ−ＮＳ１またはＣ
Ｓ１を用いて行なった。第２のＬＡＰＣＲはテンプレ−
トとして得られたＰＣＲ産物と、Ｈｉｎｄ IIIカセット
−カセットプライマ−Ｃ２とプライマ−ＮＳ２、または
ＣＳ２を用いて行なった。第２のＬＡＰＣＲにより得ら
れた産物の塩基配列を前記方法により決定した。該酵素
のＮ末端アミノ酸配列及び５種のリジルエンドペプチダ
−ゼ消化物のアミノ酸配列により、その決定された配列
が酵素の塩基配列の一部を含んでいることを確認した。
これらの塩基配列を基に、ＳｍａＩ制限サイトを含むプ
ライマ−ＮＴ（配列番号１６）、及びＨｉｎｄIII 制限
サイトを含むプライマ−ＣＴ（配列番号１７）を合成し
た。最終的に、アラニン脱水素酵素遺伝子は、プライマ
−ＮＴ、プライマ−ＣＴ及びＴａｋａｒａＬＡＴａｑＤ
ＮＡを用いるＰＣＲにより得られた。得られた目的の
１．１３ｋｂのＤＮＡ断片をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮＩＩ
（フナコシ社製）により精製した。前述の方法により、
１１３１ｂｐの該酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）
が決定され、更に、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を配列番号２に示した。 〔実施例３〕形質転換大腸菌の作成 大腸菌ラクト−スオペロンなどに由来するプロモ−タ
−、オペレ−タ−及びリボソ−ム結合部位などの発現調
節領域、並びにＨｐａＩ切断部位を含むＤＮＡ配列発現
ベクタ−ｐＵＴＥ１００Ｋ’を作製した。得られた酵素
遺伝子を含むフラグメントをｐＵＴＥ１００Ｋ’のＨｐ
ａＩ部位に組み込み、組換え体プラスミドｐＥＡＡＤ−
ＨＳＩを構築した。ついで D.M.Morrison の方法（Meth
od in Enzymology,68,326,1979）に従い、組換え体プラ
スミドｐＥＡＡＤ−ＨＳ１を大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９（宝酒造社製）に導入し、組換え微生物、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＥＡＡＤ−ＨＳ１）を
得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＥＡＡＤ
−ＨＳ１）はＦＥＲＭ Ｐ−１７０２２として工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１８】組換え微生物，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ
Ｍ１０９（ｐＥＡＡＤ−ＨＳ１）を１ｍＭイソプロピル
−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＴＹ培地（バクトトリプ
トン１％、バクトイ−ストエキストラクト０．５％、Ｎ
ａＣｌ０．５％）で、３７℃、１５時間振盪培養した。
培養菌体の超音波破砕後の粗酵素抽出液は、アラニン脱
水素酵素活性を示した。 〔実施例４〕酵素活性の測定方法 標準反応溶液（１ｍｌ）は、以下の組成よりなる。
Ｍ１０９（ｐＥＡＡＤ−ＨＳ１）を１ｍＭイソプロピル
−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＴＹ培地（バクトトリプ
トン１％、バクトイ−ストエキストラクト０．５％、Ｎ
ａＣｌ０．５％）で、３７℃、１５時間振盪培養した。
培養菌体の超音波破砕後の粗酵素抽出液は、アラニン脱
水素酵素活性を示した。 〔実施例４〕酵素活性の測定方法 標準反応溶液（１ｍｌ）は、以下の組成よりなる。
【００１９】 Ｌ−アラニン（ｐＨ１０．０） ２０μｍｏｌ ＮＡＤ+ ４μｍｏｌ ＣＡＰＳ buffer （ｐＨ１１．０） ２００μｍｏｌ 酵素液 適量 （ＣＡＰＳ：3-cyclohexylaminopropanesulfonic acid の略） 反応は、キュベット（ｄ＝１．０ｃｍ）中、３０℃で行
ない、ＮＡＤ+ を添加後、生成するＮＡＤＨ量を測定す
る。即ち、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１４
０−２０，島津製作所社製）で３４０ｎｍの吸光度変化
を４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当た
りの吸光度変化を求め、その変化量から酵素活性を求め
た。
ない、ＮＡＤ+ を添加後、生成するＮＡＤＨ量を測定す
る。即ち、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１４
０−２０，島津製作所社製）で３４０ｎｍの吸光度変化
を４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当た
りの吸光度変化を求め、その変化量から酵素活性を求め
た。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、アラニン脱水素酵素遺
伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮ
Ａを含む形質転換体又は形質導入体、及び、アラニン脱
水素酵素の製造方法が提供される。本発明により得られ
たアラニン脱水素酵素は、アラニンに対して親和性が高
く、反応性が大きいので、産業上有用である。
伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮ
Ａを含む形質転換体又は形質導入体、及び、アラニン脱
水素酵素の製造方法が提供される。本発明により得られ
たアラニン脱水素酵素は、アラニンに対して親和性が高
く、反応性が大きいので、産業上有用である。
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Kikkoman Corporation <120> An alanine dehydrogenase gene, a recombinant DNA, and a process f or producing alanine dehydrogenase <130> <160> 17 <210> 1 <211> 1131 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 1 atgattatcg gtgttcctaa ggaaattaaa aataatgaaa atcgtgtggc aatgactcct 60 gctggtgtcg ttcatttatt aaatgctgga cataaagtta ttattgaaac aaacgctgga 120 ttaggcagtg gttttacgaa cgaagaatat aaacaagctg gtgctgaaat tattgaaagc 180 gcttcagatg tatggacgaa agctgatatg attatgaagg ttaaagaacc gcttgcatct 240 gagtacggtt atttccgtaa aggattaatc ttattcacat atcttcactt agctgcagaa 300 cctgaattaa caaaagcgtt ggtagatagt gaagtgattg ccattgcata tgaaacagtt 360 actgtaaatc gtacattacc acttctttca ccaatgagtg aagtagcagg cagaatggca 420 gcacaagtcg gagctcaatt ccttgaaaag acacaaggtg gtaaaggaat tctactaagt 480 ggtgtacctg gagtaaaacg tggcaaagta acgattattg gtggcggaat ggttggaaca 540 aacgctgcaa aaatcgcagt cggtctagga gcggatgtaa caatcatcga tttaaatcca 600 gatcgtttac gtcaattaga agacattttt ggtacaagtg ttcaaacatt aatgtcaaat 660 ccatacaata ttgctgaagc tgttaaagaa tccgatttag ttattggatc agtactcatt 720 cctggtgcaa aagctccgaa attagtgaca gaagaaatgg ttaaatccat gcaaccagga 780 tctgttattg tagacgttgc aatcgaccaa ggtggaaact tcgaaacagt tgatcatatt 840 acaactcatg atgacccaac ttatgttaaa cacggtgttg ttcattatgc agtagctaat 900 atgcctggtg cagttccacg tacagctaca attgccttaa caaatgtaac gattccttat 960 gctgtacaaa ttgcgacaaa aggtgtagtt aaagcagtga atgataatcc tgcaattaaa 1020 gctggtgtga acgtagcgaa tggccatgta acatttgaag cagtagcaaa cgatcttggc 1080 tacaaatatg taacagtaga agaagcaatt tctaaagaag caatcaatgc a 1131 <210> 2 <211> 377 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 2 Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg 5 10 15 Val Ala Met Thr Pro Ala Gly Val Val His Leu Leu Asn Ala Gly 20 25 30 His Lys Val Ile Ile Glu Thr Asn Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Asn Glu Glu Tyr Lys Gln Ala Gly Ala Glu Ile Ile Glu Ser 50 55 60 Ala Ser Asp Val Trp Thr Lys Ala Asp Met Ile Met Lys Val Lys 65 70 75 Glu Pro Leu Ala Ser Glu Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Ile 80 85 90 Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu Ala Ala Glu Pro Glu Leu Thr Lys 95 100 105 Ala Leu Val Asp Ser Glu Val Ile Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val 110 115 120 Thr Val Asn Arg Thr Leu Pro Leu Leu Ser Pro Met Ser Glu Val 125 130 135 Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Val Gly Ala Gln Phe Leu Glu Lys 140 145 150 Thr Gln Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Gly Val 155 160 165 Lys Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Met Val Gly Thr 170 175 180 Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val Thr Ile 185 190 195 Ile Asp Leu Asn Pro Asp Arg Leu Arg Gln Leu Glu Asp Ile Phe 200 205 210 Gly Thr Ser Val Gln Thr Leu Met Ser Asn Pro Tyr Asn Ile Ala 215 220 225 Glu Ala Val Lys Glu Ser Asp Leu Val Ile Gly Ser Val Leu Ile 230 235 240 Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys 245 250 255 Ser Met Gln Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln 260 265 270 Gly Gly Asn Phe Glu Thr Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Asp 275 280 285 Pro Thr Tyr Val Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn 290 295 300 Met Pro Gly Ala Val Pro Arg Thr Ala Thr Ile Ala Leu Thr Asn 305 310 315 Val Thr Ile Pro Tyr Ala Val Gln Ile Ala Thr Lys Gly Val Val 320 325 330 Lys Ala Val Asn Asp Asn Pro Ala Ile Lys Ala Gly Val Asn Val 335 350 345 Ala Asn Gly His Val Thr Phe Glu Ala Val Ala Asn Asp Leu Gly 350 355 360 Tyr Lys Tyr Val Thr Val Glu Glu Ala Ile Ser Lys Glu Ala Ile 365 370 375 Asn Ala 377 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 3 Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg 5 10 15 Val Ala Met Thr Pro 20 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 4 Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Met Val Gly Thr Asn 5 10 15 Ala Ala Lys 18 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 5 Thr Gln Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Gly Val 5 10 15 Lys 16 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 6 Ala Val Asn Asp Asn Pro Ala Ile Lys Ala Gly Val Asn Val Ala 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 7 Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val Pro 5 10 15 Arg Thr Ala Thr Ile 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 8 Ser Met Gln Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln 5 10 15 Gly Gly Asn Phe Glu 20 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 9 Ala Ile Asn Ala 4 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA(sense) degenerated from the N-terminal amino acid seq uence for amplification of a part of cDNA <400> 10 aargaratta araayaayga raa 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA(antisense) degenerated from the amino acid sequence o f peputides obteined from the lysyl endopeputidase digest for amplificat ion of a part of cDNA <400> 11 gttacytttc cncgyttnac ncc 23 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA according to the sequence of the amplified DNA fragme nt A for amplification of a part of cDNA <400> 12 ctccaggtac accacttagt agaattcc 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA according to the sequence of the amplified DNA fragme nt A for amplification of a part of cDNA <400> 13 gaagcggtaa tgtgcgattg acagtgac 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA according to the sequence of the amplified DNA fragme nt A for amplification of a part of cDNA <400> 14 aacagtcact gtcaatcgca cattacc 27 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA according to the sequence of the amplified DNA fragme nt A for amplification of a part of cDNA <400> 15 ggaattctac taagtggtgt acctgg 26 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA containing a SmaI restriction site for amplification of cDNA <400> 16 ggcccgggat agttatcggt gttcctaagg a 31 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA containing a HindIII restriction site for amplificati on of cDNA <400> 17 ggaagcttat gcattgattg cttctttaga 30
配列番号１０：アラニン脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配
列及びリジルエンドペプチダ−ゼ消化ペプチドのアミノ
酸配列を基に、設計されたＤＮＡ。 配列番号１１：アラニン脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配
列及びリジルエンドペプチダ−ゼ消化ペプチドのアミノ
酸配列を基に、設計されたＤＮＡ。 配列番号１２：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１３：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１４：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１５：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１６：ＬＡＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を基に、設計されたＳｍａＩ制限サイトをもつ
ＤＮＡ。 配列番号１７：ＬＡＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を基に、設計されたＨｉｎｄIII 制限サイトを
もつＤＮＡ。
列及びリジルエンドペプチダ−ゼ消化ペプチドのアミノ
酸配列を基に、設計されたＤＮＡ。 配列番号１１：アラニン脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配
列及びリジルエンドペプチダ−ゼ消化ペプチドのアミノ
酸配列を基に、設計されたＤＮＡ。 配列番号１２：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１３：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１４：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１５：ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片（ＤＮ
ＡフラグメントＡ）の塩基配列を基に、設計されたＤＮ
Ａ。 配列番号１６：ＬＡＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を基に、設計されたＳｍａＩ制限サイトをもつ
ＤＮＡ。 配列番号１７：ＬＡＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を基に、設計されたＨｉｎｄIII 制限サイトを
もつＤＮＡ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコ−ドするアラニン脱水素酵素遺伝子。 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつアラニン脱水素酵素活性を有するタンパク
質 - 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）のアラニン脱
水素酵素。 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつアラニン脱水素酵素活性を有するタンパク
質 - 【請求項３】 請求項１記載のアラニン脱水素酵素遺伝
子を含有する組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換え体ＤＮＡを含有す
る形質転換体または形質導入体。 - 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からアラニン脱水素酵素を
採取することを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10296645A JP2000125876A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | アラニン脱水素酵素遺伝子、組換え体ｄｎａ及びアラニン脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10296645A JP2000125876A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | アラニン脱水素酵素遺伝子、組換え体ｄｎａ及びアラニン脱水素酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000125876A true JP2000125876A (ja) | 2000-05-09 |
Family
ID=17836230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10296645A Pending JP2000125876A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | アラニン脱水素酵素遺伝子、組換え体ｄｎａ及びアラニン脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000125876A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103074309A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-05-01 | 河北师范大学 | 一种l-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法 |
-
1998
- 1998-10-19 JP JP10296645A patent/JP2000125876A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103074309A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-05-01 | 河北师范大学 | 一种l-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法 |
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