ES2309082T3 - Nueva carbonil reductasa, gen de la misma y metodo para usar la misma. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido descrito en las siguientes (a) o (b): (a) Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias; (b) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se puede obtener de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias por sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos y que tiene actividad enzimática en la reducción asimétrica de N-bencil-3-pirrolidinona para producir (S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Description
Nueva carbonil reductasa, gen de la misma y
método para usar la misma.
La presente invención se refiere a un nuevo
polipéptido, un gen que codifica el polipéptido, un vector de
expresión para la expresión del polipéptido, un transformante
obtenido por transformación de un hospedador usando el vector de
expresión, y un método de producción de un compuesto útil como
material para la síntesis de compuestos medicinales y otros
compuestos usando el transformante anterior.
En más detalle, la invención se refiere a un
polipéptido aislado de un microorganismo que tiene actividad
enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
y que tiene dicha actividad enzimática, un ADN que codifica el
polipéptido, un vector de expresión que contiene el ADN, y un
transformante obtenido por transformación usando el vector de
expresión. La presente invención también se refiere a un método de
producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
El
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
es un compuesto útil como intermedio para la síntesis de compuestos
medicinales tales como antibióticos \beta-lactama
y compuestos dihidropiridina.
Se conoce como método de producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
ópticamente activo el método que comprende sintetizar un compuesto
ópticamente activo y el método que comprende realizar una síntesis
asimétrica o resolución óptica partiendo de un compuesto proquiral.
En cuanto a dicho método, el documento
JP-A-06-141876
describe un método de producción de
N-bencil-3-pirrolidinol
ópticamente activo que comprende la reducción estereoselectiva de
N-bencil-3-pirrolidinona
en presencia de una enzima que tiene actividad en la reducción
estereoselectiva de
N-bencil-3-pirrolidinona.
Además, el documento
JP-A-10-150997
describe un método de producción de
N-bencil-3-pirrolidinol
ópticamente activo que comprende tratar
N-bencil-3-pirrolidinona
con una célula o un cultivo de un microorganismo o un producto
tratado del mismo. Sin embargo, estos métodos son bajos en la
concentración de sustrato alcanzable y en la conversión a partir
del sustrato en el producto, por tanto no pueden ponerse en uso
práctico.
Se descubrió un polipéptido derivado de un
microorganismo que reduce asimétricamente
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
y se descubrió que
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
puede producirse de forma eficaz, y ahora se ha completado la
presente invención.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar a polipéptido capaz de reducir asimétricamente
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Otro objeto de la invención es producir produce ese polipéptido de
forma eficaz utilizando la tecnología de recombinación génica. Un
objeto adicional de la invención es proporcionar un transformante
capaz de producir simultáneamente, a elevados niveles, ese
polipéptido y un polipéptido que tiene actividad glucosa
deshidrogenasa y, adicionalmente, proporcionar un método de
producción práctico de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
usando ese transformante.
Por tanto, la presente invención comprende un
polipéptido que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas (1)
a (5):
(1) Acción: Reduce asimétricamente
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
con
NADPH como coenzima;
NADPH como coenzima;
(2) pH de acción óptima: 4,5 a 5,5;
(3) Temperatura de acción óptima: 40ºC a
45ºC;
(4) Peso molecular: Aproximadamente 29.000
determinado por análisis de filtración en gel, aproximadamente
35.000 determinado por análisis de electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida;
(5) Inhibidor: Se inhibe por el ión cobre
divalente.
Además, la presente invención es un polipéptido
descrito en las siguientes (a) o (b):
(a) Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de
secuencias;
(b) Un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que se puede obtener de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias por
sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o más
aminoácidos y que tiene actividad enzimática en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Además, la presente invención comprende ADN que
codifican estos polipéptidos. O, también comprende un ADN que
codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática en la
reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol,
y que hibrida con un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC ID Nº 2 en la lista de secuencias en condiciones
rigurosas, o un ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad
enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol,
y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 60% con una
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 en la lista de
secuencias.
Además, comprende un vector de expresión que
contiene cualquiera de estos ADN y un transformante que contiene
dicho vector de expresión.
La presente invención también comprende un
método de producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
que comprende
una etapa de hacer reaccionar dicho
transformante y/o un producto tratado del mismo con
N-bencil-3-pirrolidinona,
y
una etapa de recoger el
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
producido de este modo.
A continuación, se describe la presente
invención con detalle.
Primero, se describe polipéptido de la
invención.
El polipéptido de la invención tiene actividad
enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
representada por la fórmula (I) mostrada a continuación para
producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
representado por la fórmula (II) mostrada a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Como dicho polipéptido, puede mencionarse una
enzima que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas (1) a
(5).
(1) Acción: Reduce asimétricamente
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
con
NADPH como coenzima;
NADPH como coenzima;
(2) pH de acción óptima: 4,5 a 5,5;
(3) Temperatura de acción óptima: 40ºC a
45ºC;
(4) Peso molecular: Aproximadamente 29.000
determinado por análisis de filtración en gel, aproximadamente
35.000 determinado por análisis de electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida;
(5) Inhibidor: Se inhibe por el ión cobre
divalente.
En la presente invención, la actividad
enzimática del polipéptido se determina añadiendo el sustrato
N-bencil-3-pirrolidinona
(1 mM), la coenzima NADPH (0,167 mM) y la enzima a tampón fosfato
100 mM (pH 6,5) y midiendo la disminución en la absorbancia a la
longitud de onda de 340 nm a 30ºC.
El pH de acción óptima y la temperatura de
acción óptima del péptido se determinan, por ejemplo, variando el
pH de reacción o la temperatura de reacción en el sistema de
medición de la actividad reductora anterior y midiendo la actividad
reductora.
El peso molecular basado en el análisis de
filtración en gel del péptido se determina por el cálculo a partir
del tiempo de elución relativo a los de proteínas de referencia en
filtración en gel. El peso molecular basado en electroforesis en
gel de SDS-poliacrilamida se determina por el
cálculo a partir de la movilidad relativa a las de proteínas de
referencia en electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida.
Los inhibidores se determinan, por ejemplo,
añadiendo diversos compuestos al sistema de medición de actividad
reductora anterior y midiendo la actividad reductora de cada
compuesto.
El polipéptido de la invención puede obtenerse
de un microorganismo que tiene una actividad en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Por tanto, el microorganismo a usar como fuente del polipéptido no
está particularmente restringido pero incluye, por ejemplo,
microorganismos que pertenecen al género Micrococcus, entre
los que la cepa Micrococcus luteus IFO 13867 es
particularmente preferida. El microorganismo que produce el
polipéptido de la invención puede ser una cepa silvestre o un
mutante. O, también puede usarse un microorganismo que se puede
obtener por fusión celular o un método genético tal como
manipulación génica. Un microorganismo manipulado génicamente capaz
de producir el polipéptido de la invención puede obtenerse por un
método que comprende una etapa de aislar y/o purificar dicha enzima
y determinar una parte o la secuencia de aminoácidos completa de la
misma, una etapa de determinar una secuencia de nucleótidos que
codifica la enzima en base a esa secuencia de aminoácidos, una etapa
de obtener una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima en
base a esa secuencia de aminoácidos, y una etapa de obtener un
microorganismo recombinante introduciendo esa secuencia de
nucleótidos en otro microorganismo.
En cuanto al medio de cultivo para el
microorganismo que produce el polipéptido de la invención, puede
usarse medio de cultivo líquido habitual que contiene fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, nutrientes
orgánicos y etc. con la condición de que el microorganismo pueda
crecer en el mismo.
La expresión "cultivo del microorganismo"
como se usa en esta memoria descriptiva significa células del
microorganismo o un fluido de cultivo que contiene dichas células.
El "producto tratado del mismo" significa un extracto o
producto purificado obtenido de las células del microorganismo o un
fluido de cultivo que contiene dichas células por extracción,
purificación o algún otro tratamiento.
El polipéptido de la invención puede purificarse
del microorganismo que produce ese polipéptido del modo
convencional. Por ejemplo, las células del microorganismo se
cultivan en un medio apropiado, y las células se recogen del fluido
de cultivo por centrifugación. Las células obtenidas se alteran
usando un sonicador, por ejemplo, y el residuo celular se retira
por centrifugación para dar un extracto libre de células. El
polipéptido puede purificarse de este extracto libre de células
aplicando, individualmente o en combinación, técnicas tales como
desalado (por ejemplo, precipitación en sulfato amónico,
precipitación en fosfato sódico), precipitación con disolvente
(precipitación por fraccionamiento de proteínas usando acetona,
etanol o similares), diálisis, filtración en gel, intercambio de
iones, cromatografía en columna tal como de fase inversa y
ultrafiltración.
El polipéptido de la invención puede ser una
enzima natural obtenida de un microorganismo como se ha mencionado
anteriormente o puede ser una enzima recombinante. Como enzima
natural, puede mencionarse un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de
secuencias.
El polipéptido de la invención también puede ser
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se puede
obtener de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en
la lista de secuencias por sustitución, inserción, deleción y/o
adición de uno o más aminoácidos y que tiene actividad enzimática en
la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Dicho polipéptido puede prepararse a partir del
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias por un método tal como el
descrito en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and
Sons, Inc., 1989).
La expresión "que tiene actividad enzimática
en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol"
se usa en este documento para indicar que cuando el polipéptido en
cuestión se somete a reacción con
N-bencil-3-pirrolidinona
en las condiciones de medición de la actividad reductora mencionadas
anteriormente, se produce
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
en un rendimiento no menor del 10%, preferiblemente no menor del
40%, más preferiblemente no menor del 60%, en comparación con el
caso en que se usa el polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de
secuencias.
El ADN de la invención se describe a
continuación.
El ADN de la invención puede ser cualquier ADN
que codifique dicho polipéptido mencionado anteriormente. Puede ser
un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID
Nº 2 en la lista de secuencias, o un ADN que codifica un
polipéptido que tiene actividad enzimática en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol,
y que hibrida con el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC ID Nº 2 en la lista de secuencias en condiciones
rigurosas.
La expresión "ADN que hibrida con el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 en la
lista de secuencias en condiciones rigurosas" significa un ADN
que se puede obtener por la técnica de hibridación de colonias,
hibridación de placas o hibridación de southern, usando el ADN que
tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 en la
lista de secuencias como sonda. Más específicamente, puede
mencionarse un ADN identificado realizando hibridación usando un
filtro con el ADN derivado de la colonia o placa inmovilizado sobre
el mismo, a 65ºC en presencia de NaCl 0,7 a 1,0 M, y después lavando
el filtro con una solución de SSC concentrada a un factor de 0,1 a
2 (comprendiendo la solución de SSC concentrada a un factor de 1
cloruro sódico 150 mM y citrato sódico 15 mM) a 65ºC.
La hibridación puede realizarse de acuerdo con
el método descrito en Molecular Cloning, A laboratory manual,
segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o en
otra parte.
El ADN de la invención puede ser un ADN que
codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática en la
reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 60%,
preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80%, más
preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90%, aún
más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95%,
mucho más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el
99%, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 en
la lista de secuencias.
La expresión "identidad de secuencia"
significa que las dos secuencias de nucleótidos en comparación son
idénticas entre sí, y el porcentaje (%) de identidad de secuencia
entre dos secuencias de nucleótidos en comparación se calcula
disponiendo de forma óptima las dos secuencias de nucleótidos en
comparación, contando aquellas posiciones en que aparece el mismo
nucleótido (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias,
dividiendo la cantidad encontrada de este modo de posiciones que se
ajustan por la cantidad total de bases en comparación y
multiplicando el cociente por 100. La identidad de secuencia puede
calcularse usando las siguientes herramientas para análisis de
secuencia: Unix Base GCG Wisconsin Package (Program Manual for the
Wisconsin Package, Versión 8, Septiembre de 1994, Genetics Computer
Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, EEUU 53711; Rice, P.
(1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger
Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, Inglaterra) y el ExPASy
World Wide Web Molecular Biology Server (Geneva University Hospital
y University of Geneva, Ginebra, Suiza).
El ADN de la invención puede obtenerse de un
microorganismo que tiene actividad enzimática en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Como microorganismo, puede mencionarse, por ejemplo,
microorganismos que pertenecen al género Micrococcus y, como
cepa particularmente preferida, puede mencionarse la cepa
Micrococcus luteus IFO 13867.
A continuación, se describe una realización del
método para obtener el ADN de la invención de un microorganismo que
tiene actividad enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
Primero, se determina la secuencia de
aminoácidos parcial del polipéptido purificado y de fragmentos
peptídicos que se pueden obtener por digestión de ese polipéptido
con una endopeptidasa apropiada por la técnica de Edman. Se
sintetizan cebadores de ADN basados en la información de la
secuencia de aminoácidos obtenida de este modo. Después, se prepara
el ADN cromosómico del microorganismo a partir de ese
microorganismo, que es la fuente del ADN anterior, por un método
convencional de aislamiento de ADN, por ejemplo, por el método de
Murray et al. (Nucl. Acids Res. 8: 4321-4325
(1980)). Usando los cebadores de ADN anteriores, se realiza una PCR
con el ADN cromosómico como molde para amplificar parte del gen del
polipéptido. Además, se preparan sondas de ADN marcando parte del
gen del polipéptido amplificado de este modo por métodos
convencionales, por ejemplo, por el método de marcaje de cebador
aleatorio (Anal. Biochem., 132, 6 (1983)). El ADN cromosómico del
microorganismo se escinde con una enzima de restricción apropiada,
los fragmentos escindidos con la enzima de restricción se insertan
en un vector y los vectores resultantes se introducen en células
hospedadoras apropiadas para construir de este modo una biblioteca
de ADN del cromosoma microbiano. La exploración de esta biblioteca
de ADN se realiza por el método de hibridación de colonias,
hibridación de placas o similar usando las sondas de ADN
anteriores, por lo cual se puede obtener un ADN que contiene el gen
del polipéptido. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN
obtenido de este modo que contiene el gen del polipéptido puede
determinarse por el método de secuenciación con didesoxi o método
de terminación de cadena con didesoxi, o similares. Por ejemplo,
esto puede realizarse usando el ABI PRISM Dye Terminator Cicle
Sequencing Ready Reaction Kit (producto de
Perkin-Elmer) y el ABI 373A DNA Sequencer (producto
de Perkin-Elmer).
El vector de expresión y el transformante de la
presente invención se describen ahora.
El gen de la enzima puede expresarse en el
transformante que se puede obtener insertando el ADN de la presente
invención en un vector e introduciendo el vector en un hospedador.
El vector a usar para este propósito puede ser cualquiera de los
capaces de expresar el gen de la enzima en hospedadores apropiados.
Como dicho vector, puede mencionarse, por ejemplo, un vector
plasmídico, vector fágico, vector cósmido, etc. Puede ser un vector
lanzadera capaz del intercambio génico entre diferentes cepas
hospedadoras. Generalmente, dicho vector comprende un factor
regulador tal como el promotor lac UV5, el promotor trp, el promotor
trc, el promotor tac, el promotor lpp, el promotor tuf B, el
promotor rec A o el promotor pL, y se usa adecuadamente como un
vector de expresión que contiene una unidad de expresión conectada
de forma funcional al ADN de la invención.
La expresión "factor regulador" como se usa
en este documento significa un promotor funcional y una secuencia
de nucleótidos que tienen elementos de transcripción relacionados
arbitrarios (por ejemplo, potenciador, caja CCAAT, caja TATA, sitio
SPI, etc.).
La expresión "conectado de forma funcional"
como se usa en este documento significa que el ADN y diversos
elementos reguladores, tales como el promotor y potenciador, que
regulan la expresión del mismo están unidos juntos cada uno en un
estado funcional en un hospedador de modo que el gen pueda
expresarse. Es bien sabido para los especialistas que el tipo y
especie del factor regulador puede variar de acuerdo con el
hospedador.
Como el hospedador en que tiene que introducirse
un vector de expresión que contiene el ADN de la invención, pueden
mencionarse bacterias, levaduras, hongos filamentosos, células
vegetales y células animales, por ejemplo. Sin embargo se prefiere
Escherichia coli. El ADN de la invención puede introducirse
en un hospedador del modo convencional. Cuando se usa
Escherichia coli como hospedador, el ADN de la invención
puede introducirse en el mismo por el método de cloruro cálcico,
por ejemplo.
Para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
por reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
usando el ADN de la invención, se requiere una coenzima tal como
NADPH o NADH. Sin embargo, realizando la reacción usando una enzima
capaz de convertir la coenzima oxidada en su forma reducida (a
partir de ahora mencionada como la capacidad regeneradora de
coenzima) junto con un sustrato de la misma, concretamente combinado
un sistema de regeneración de coenzima con el polipéptido de la
invención, es posible reducir marcadamente el consumo de la
coenzima, que es cara. Útiles como la enzima que tiene capacidad
regeneradora de coenzima están, por ejemplo, hidrogenasa, formiato
deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, aldehído deshidrogenasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
glucosa deshidrogenasa. La glucosa deshidrogenasa se usa
adecuadamente.
Cuando se usa un transformante que contiene
tanto el ADN de la invención como un ADN que codifica un polipéptido
que tiene actividad glucosa deshidrogenasa, la reacción anterior
puede realizarse de forma eficaz sin preparar por separado una
enzima que tenga capacidad regeneradora de coenzima y añadiendo la
misma al sistema de reacción, aunque dicha reacción también puede
realizarse añadiendo un sistema de regeneración de coenzima al
sistema de reacción de reducción asimétrica. Dicho transformante
puede obtenerse insertando el ADN de la invención y un ADN que
codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa deshidrogenasa
en el mismo vector e introduciendo éste en un hospedador, o
insertando estos dos ADN respectivamente en dos vectores diferentes
que pertenecen a grupos incompatibles e introduciendo éstos en el
mismo hospedador. Por tanto, puede usarse un transformante que
contiene un vector de expresión que comprende el ADN de la invención
y el ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa
deshidrogenasa, o un transformante que contiene tanto un primer
vector de expresión que contiene el ADN de la invención como un
vector de expresión que contiene el ADN que codifica un polipéptido
que tiene actividad glucosa deshidrogenasa. En cuanto al polipéptido
que tiene actividad glucosa deshidrogenasa, se prefiere uno
derivado de Bacillus megaterium.
La actividad glucosa deshidrogenasa en el
transformante se determina añadiendo el sustrato glucosa (0,1 M),
la coenzima NADP (2 mM) y la enzima a tampón clorhidrato de Tris 1 M
(pH 8,0) y midiendo el aumento en la absorbancia a la longitud de
onda de 340 nm a 25ºC.
Ahora se describe la producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
usando el transformante de la invención.
Dicho método de producción comprende una etapa
de hacer reaccionar el transformante anterior y/o un producto
tratado del mismo con
N-bencil-3-pirrolidinona
y una etapa de recoger el
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
producido de este modo.
A continuación, se describe este método más
específicamente. Primero, se añaden el sustrato
N-bencil-3-pirrolidinona,
NADPH o una coenzima similar, y un cultivo del transformante
anterior y/o un producto tratado del mismo, a un disolvente
apropiado, y se permite que la reacción proceda en agitación con el
pH ajustado. Esta reacción se realiza a una temperatura de 10ºC a
70ºC, y el pH se mantiene de 4 a 10 durante la reacción. La reacción
puede realizarse por lotes o de forma continua. En el modo por
lotes, se añade el sustrato de reacción a una concentración de
carga del 0,1% al 70% (p/v). El producto tratado del transformante
mencionado en este documento significa, por ejemplo, un extracto
crudo, células cultivadas, cuerpos del organismo liofilizados,
cuerpos del organismo secados con acetona, un producto de
alteración derivado de los mismos y similares. Además, éstos pueden
usarse en forma de la propia enzima o células como tales
inmovilizadas por medios conocidos. Esta reacción se realiza
preferiblemente en presencia de un sistema de regeneración de
coenzima. Por ejemplo, cuando, al realizar este reacción, se usa un
transformante capaz de producir tanto el polipéptido de la invención
como glucosa deshidrogenasa, se hace posible reducir marcadamente
el consumo de la coenzima añadiendo adicionalmente glucosa al
sistema de reacción.
El
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
producido por la reacción puede recogerse por un método
convencional. Por ejemplo, la materia suspendida, tal como células,
se retira, si es necesario, por un tratamiento tal como
centrifugación o filtración, la solución de reacción se hace básica
por la adición de hidróxido sódico o similares y se extrae con un
disolvente orgánico tal como acetato de etilo o tolueno, y el
disolvente orgánico después se retira a presión reducida. El
producto puede purificarse por tratamiento adicional tal como
destilación o cromatografía y etc.
La
N-bencil-3-pirrolidinona,
que sirve como sustrato en la reacción, puede preparase, por
ejemplo, por el método descrito en el documento
JP-A-54-16466.
Las cantidades de
N-bencil-3-pirrolidinona
y
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
pueden determinarse por cromatografía de gases (columna: Uniport B
PEG-20M al 10% (3,0 mm DI X 1,0 m), temperatura de
columna: 200ºC, gas de transporte: nitrógeno, detección: FID). La
pureza óptica de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
puede medirse por cromatografía líquida de alto rendimiento
(columna: Chiralcel OB (producto de Daicel Chemical Industries),
eluyente: n-hexano/isopropanol/dietilamina =
950/50/1, caudal: 1 ml/min, detección: 254 nm).
Por tanto, de acuerdo con la presente invención,
es posible producir de forma eficaz el polipéptido incluido en la
presente invención y, utilizando el mismo, se proporciona un
ventajoso método de producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
La Fig. 1 es un gráfico de la secuencia de
nucleótidos del ADN determinada en el Ejemplo 3 y la secuencia de
aminoácidos deducida a partir de la misma.
La Fig. 2 es un gráfico del método para
construir el plásmido recombinante pTSBG1 del Ejemplo 7 y la
estructura del mismo.
Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención con detalle. Sin embargo no son por definición limitantes
del alcance de la presente invención.
Los procedimientos detallados y etc. que afectan
a la tecnología de ADN recombinante usada en los siguientes
Ejemplos se describen en las siguientes bibliografías.
Molecular Cloning, 2ª Edición (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989)
Current Protocols in Molecular Biology (Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience).
Se purificó una enzima que tiene actividad en la
reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
uniformemente de la cepa Micrococcus luteus IFO 13867 del
siguiente modo.
Se preparó un medio líquido (400 ml) que tiene
la siguiente composición en cada matraz Sakaguchi de 2 l y se
esterilizó por vapor a 120ºC durante 20 minutos.
Composición del medio:
- Triptona
- 1,6% (p/v)
- Extracto de levadura
- 1,0% (p/v)
- NaCl
- 0,5% (p/v)
Agua corriente
pH 7,0
Este medio se inoculó con 1 ml de un fluido de
cultivo de la cepa Micrococcus luteus IFO 13867 preparada con
antelación por precultivo en el mismo medio, y se realizó un
cultivo en agitación a 30ºC durante 50 horas.
Las células se recogieron por centrifugación del
fluido de cultivo anterior (2 l) y se lavaron con solución salina
fisiológica. Por tanto, se obtuvieron 42 g de células húmedas de la
cepa anterior. Estas células húmedas se suspendieron en 170 ml de
tampón fosfato 100 mM (pH 7,0), después se añadieron
2-mercaptoetanol y fluoruro de fenilmetilsulfonilo
a las concentraciones finales respectivas de 5 mM y 0,1 mM, y las
células se alteraron ultrasónicamente usando SONIFIRE 250 (producto
de BRANSON). Los residuos celulares se retiraron de las células
alteradas por centrifugación, por lo cual se obtuvieron 180 ml de un
extracto libre de células.
Se añadió sulfato amónico a y se disolvió en el
extracto libre de células obtenido del modo anterior para alcanzar
una saturación del 40% y el precipitado resultante se retiró por
centrifugación (durante este procedimiento, el pH del extracto
libre de células se mantuvo at 7,0 usando amoniaco acuoso). Mientras
el pH se mantuvo a 7,0 del mismo modo que en el procedimiento
anterior, se añadió adicionalmente sulfato amónico a y se disolvió
en este sobrenadante de centrifugación para alcanzar una saturación
del 65%, y el precipitado resultante se recogió por centrifugación.
Este precipitado se disolvió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que
contenía 2-mercaptoetanol 5 mM, y la solución se
dializó durante una noche usando el mismo tampón.
Se disolvió sulfato amónico en la solución de
enzima cruda obtenida del modo anterior a una concentración final
de 1 M (mientras el pH de la solución de enzima cruda se mantuvo a
7,0 usando amoniaco acuoso), y la solución se aplicó a una columna
de fenil sepharose CL-4B (producto de Pharmacia
Biotech) (130 ml) equilibrada con antelación con tampón fosfato 10
mM (pH 7,0) que contenía 2-mercaptoetanol 5 mM y
sulfato amónico 1 M para adsorber la enzima. Después de lavar la
columna con el mismo tampón, la fracción activa se eluyó con un
gradiente lineal de sulfato amónico (de 1 M a 0 M). La fracción
activa se recogió y se dializó durante una noche usando tampón
fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía 2-mercaptoetanol
5 mM.
La solución de enzima cruda obtenida del modo
anterior se aplicó a una columna de DEAE sepharose
CL-4B (producto de Pharmacia Biotech) (20 ml)
equilibrada con antelación con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que
contenía 2-mercaptoetanol 5 mM para adsorber la
enzima. Después de lavar la columna con el mismo tampón, la fracción
activa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (de 0 M a 1,0 M).
La fracción activa se recogió y se dializó durante una noche usando
tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía
2-mercaptoetanol 5 mM.
La solución de enzima cruda obtenida del modo
anterior se aplicó a una columna de azul sepharose
CL-6B (producto de Pharmacia Biotech) (10 ml)
equilibrada con antelación con tampón fosfato 20 mM (pH 6,0) que
contenía 2-mercaptoetanol 5 mM para adsorber la
enzima. Después de lavar la columna con el mismo tampón, la fracción
activa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (de 0 M a 0,5 M).
La fracción activa se recogió y se dializó durante una noche usando
tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía
2-mercaptoetanol 5 mM.
La solución de enzima cruda obtenida del modo
anterior se aplicó a una columna TSK-GEL G3000 SWXL
(producto de Tosoh) equilibrada con antelación con tampón fosfato
100 mM (pH 7,0) que contenía 2-mercaptoetanol 5 mM
y sulfato sódico 100 mM, y la fracción activa se eluyó con el mismo
tampón. La fracción activa se recogió y se dializó durante una
noche usando tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía
2-mercaptoetanol 5 mM para dar una preparación
enzimática purificada, electroforéticamente uniforme. A partir de
ahora, esta enzima se menciona como BRD.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima obtenida se examinó para sus
propiedades enzimológicas. La actividad enzimática se determinó
básicamente añadiendo el sustrato
N-bencil-3-pirrolidinona
(1 mM), la coenzima NADPH (0,167 mM) y la enzima a tampón fosfato
100 mM (pH 6,5), dejando que la reacción procediera a 30ºC durante 1
minuto y midiendo la disminución en la absorbancia a la longitud de
onda de 340 nm.
Funcionaba sobre
N-bencil-3-pirrolidinona
con NADPH como coenzima y producía
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
con una pureza óptica no menor del 99% ee.
\newpage
La actividad enzimática se midió por el método
anterior dentro del intervalo de pH de 4,0 a 7,0 usando tampón
fosfato y tampón acetato como tampón. Como resultado, se descubrió
que el pH óptimo para la acción sobre
N-bencil-3-era de
4,5 a 5,5.
La actividad enzimática frente al sustrato
N-bencil-3-pirrolidinona
ejercida durante un minuto de la reacción se midió dentro del
intervalo de temperatura de 20ºC a 60ºC. Como resultado, redescubrió
que la temperatura óptima era de 40ºC a 45ºC.
El peso molecular de esta enzima se determinó
por filtración en gel usando una columna TSK-GEL
G3000 SWXL (producto de Tosoh) y, como eluyente, tampón fosfato 100
mM (pH 7,0) que contenía 2-mercaptoetanol 5 mM y
sulfato sódico 100 mM. El peso molecular de la subunidad de la
enzima se calculó a partir de la movilidad relativa a proteínas de
referencia en electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida. Como resultado, se descubrió
que el peso molecular de la enzima era de aproximadamente 29.000
determinado por análisis de filtración en gel o aproximadamente
35.000 determinado por análisis electroforético en gel de
SDS-poliacrilamida.
La reacción se repitió con la adición de
diversos iones metálicos y los inhibidores mostrados en la Tabla 1
y, tomándose la actividad sin adición como el 100%, se examinaron
las actividades relativas después de la adición de los mismos. Como
se muestra en la Tabla 1, la enzima se inhibió por el ión cobre
divalente.
\vskip1.000000\baselineskip
La BRD purificada obtenida en el Ejemplo 1 se
digirió con tripsina derivada de páncreas bovino (producto de Wako
Pure Chemical Industries), y se determinaron las secuencias de
aminoácidos de los fragmentos peptídicos obtenidos usando el
secuenciador de proteínas modelo ABI 492 (producto de Perkin Elmer).
En base a esta secuencia de aminoácidos, se sintetizaron dos
cebadores de ADN mostrados en las SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4 en la
lista de secuencias del modo convencional.
Se extrajo el ADN cromosómico de células
cultivadas de la cepa Micrococcus luteus IFO 13867 por el
método de Murray et al. (Nucl., Acids Res. 8:
4321-4325 (1980)). Después, usando los cebadores de
ADN preparados como se ha mencionado anteriormente, se realizó la
PCR con el ADN cromosómico obtenido como molde, después de lo cual
se amplificó un fragmento de ADN (aproximadamente 250 pb) que se
suponía que era parte del gen de BRD.
El ADN cromosómico de la cepa Micrococcus
luteus IFO 13867 se digirió completamente con la enzima de
restricción BamHI, seguido de la separación por electroforesis en
gel de agarosa. Después, usando el fragmento de ADN obtenido del
modo anterior (aproximadamente 250 pb) como sonda, se analizó la
digestión del ADN cromosómico por el método de Southern (J. Mol.
Biol., 98, 503 (1975)) (realizándose el marcaje de la sonda de ADN y
la detección de la misma usando el sistema de marcaje/detección
Gene Images (producto de Amersham)). Como resultado, se descubrió
que un fragmento de ADN de aproximadamente 4,5 kb hibridaba con la
sonda de ADN anterior.
Por lo tanto, la digestión anterior se sometió a
separación por electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron
fragmentos de ADN de 4,3 kb a 6,2 kb. Estos fragmentos de ADN se
insertaron en el vector plasmídico pUC19 (producto de Takara Shuzo)
en el sitio BamHI del mismo, seguido de la introducción en la cepa
Escherichia coli JM109 (producto de Takara Shuzo). De este
modo se construyó una biblioteca de ADN cromosómico de esta
cepa.
Usando el fragmento de ADN obtenido del modo
anterior como sonda, la biblioteca de ADN cromosómico construida
del modo anterior se sometió a exploración por el método de
hibridación de colonias (realizándose el marcaje de la sonda de ADN
y la detección de la misma usando el sistema de marcaje/detección
Gene Images (producto de Amersham) y realizándose el procedimiento
experimental de acuerdo con el manual adjunto al sistema). Como
resultado, se obtuvo una colonia positiva. Por lo tanto, se
seleccionó un plásmido recombinante pUC-BB,
producido por inserción del ADN (aproximadamente 4,5 kb) obtenido
de esta colonia positiva como el clon de ADN cromosómico que
contiene el gen de BRD.
El plásmido recombinante pUC-BB
obtenido del modo anterior se trató con diversas enzimas de
restricción y se analizaron los fragmentos de digestión
resultantes, y se preparó un mapa de escisión con enzimas de
restricción del mismo. Después, se construyeron plásmidos
recombinantes insertando diversos fragmentos de ADN obtenidos en el
momento del análisis anterior en pUC19 en el sitio de clonación
múltiple del mismo. Usando estos plásmidos recombinantes, se
analizaron las secuencias de nucleótidos de cada fragmento insertado
usando un ABI PRISM Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction
Kit (producto de Perkin Elmer) y ABI 373A DNA Sequencer (producto
de Perkin Elmer), y se determinó la secuencia de nucleótidos de un
fragmento de ADN (aproximadamente 1,4 kb) que se suponía que
contenía el gen diana. Esa secuencia de nucleótidos se muestra en la
Fig. 1. En cuanto a la parte estructural del gen en esta secuencia
de nucleótidos, la secuencia de aminoácidos deducida de esa
secuencia de nucleótidos se muestra debajo de la secuencia de
nucleótidos en la Fig. 1. Como resultado de la comparación de esta
secuencia de aminoácidos con la secuencia parcial de aminoácidos de
los fragmentos digeridos de BRD purificada por tripsina, se
descubrió que la secuencia de aminoácidos parcial completa de BRD
purificada existía en la secuencia de aminoácidos deducida de la
secuencia de nucleótidos y que era bastante idéntica en esa parte
(la secuencia de aminoácidos subrayada en la Fig. 1). Por tanto, se
consideró que ese gen era el gen de BRD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un ADN bicatenario como resultado de
la adición de un sitio NdeI a la parte del codón de inicio del gen
estructural de BRD y la adición suplementaria, justo detrás del
extremo 3' del mismo, de un codón de terminación (TAA) y un punto
de escisión EcoRI del siguiente modo. En base a la secuencia de
nucleótidos determinada en el Ejemplo 3, se sintetizaron un cebador
de ADN N-terminal con un sitio NdeI añadido a la
parte del codón de inicio del gen de BRD y un cebador de ADN
C-terminal con un codón de terminación (TAA) y un
sitio EcoRI justo detrás del extremo 3' del mismo gen. Las
secuencias de nucleótidos se estos dos cebadores se muestran en las
SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 6 en la lista de secuencias. Usando estos
dos cebadores de ADN sintéticos, junto con el plásmido
pUC-BB obtenido en el Ejemplo 3 como molde, se
amplificó un ADN bicatenario por PCR. El fragmento de ADN obtenido
se digirió con NdeI y EcoRI, y el fragmento resultante se insertó en
el plásmido pUCNT (documento WO 94/03613) en el sitio
NdeI-EcoRI cadena abajo del promotor lac para dar un
plásmido recombinante pNTBR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para alcanzar un elevado nivel de expresión del
gen de BRD en Escherichia coli, se obtuvo un plásmido a
partir del plásmido pNTBR preparado en el Ejemplo 4 por la reciente
adición de la secuencia Shine-Dalgarno derivada de
E. coli (9 bases) a un sitio cadena arriba del codón de
inicio del mismo gen, del siguiente modo. Primero, se construyó un
plásmido pUCT convirtiendo la G en el sitio NdeI del vector de
expresión pUCNT de E. coli usado en el Ejemplo 4 en una T
por el método de PCR. Después, se sintetizaron un cebador de ADN
N-terminal como resultado de la adición de la
secuencia Shine-Dalgarno derivada de E. coli
(9 bases) a 5 bases cadena arriba del codón de inicio del gen de
BRD mostrado en la SEC ID Nº 2 en la lista de secuencias y la
adición suplementaria de un sitio EcoRI justo delante de la
secuencia Shine-Dalgarno y un cebador de ADN
C-terminal como resultado de la adición de un sitio
SacI justo detrás del extremo 3' del mismo gen del modo
convencional. Las secuencias de nucleótidos de estos dos cebadores
se muestran en las SEC ID Nº 7 y SEC ID Nº 8 en la lista de
secuencias. Usando estos dos cebadores de ADN, con el plásmido pNTBR
construido en el Ejemplo 4 como molde, se sintetizó un ADN
bicatenario por PCR. El fragmento de ADN obtenido se digirió con
EcoRI y SacI, y el fragmento resultante se insertó en el plásmido
pUCT en el sitio EcoRI-SacI (cadena abajo del
promotor lac) para dar un plásmido recombinante pTBH.
\vskip1.000000\baselineskip
Para alcanzar adicionalmente un elevado nivel de
expresión del gen de BRD gene en E. coli, se construyó un
plásmido pTSBH sustituyendo por un ADN inferior en la proporción GC
el segmento de la base 1 a la 118 del mismo gen en el plásmido pTBH
construido en el Ejemplo 5, sin alterar la secuencia de aminoácidos
codificada por el mismo, del siguiente modo.
Se preparó un ADN bicatenario que tenía la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº 9 en la lista de secuencias por
el método convencional. Este se digirió con EcoRI y XhoI, y se
obtuvo un plásmido pTSBH sustituido para el fragmento de ADN
separado de pTBH por digestión con las mismas enzimas de restricción
y que contenía una parte 5' terminal del gen de BRD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un ADN bicatenario como resultado de
la adición de la secuencia Shine-Dalgarno derivada
de E. coli (9 bases) a 5 bases cadena arriba del codón de
inicio del gen de la glucosa deshidrogenasa derivado de la cepa
Bacillus megaterium IAM 1030 (a partir de ahora mencionada
como GDH), de un punto de escisión por SacI justo delante de la
secuencia anterior y de un punto de escisión por BamHI justo detrás
del codón de terminación del siguiente modo. En base a la
información de la secuencia de nucleótidos acerca del gen de GDH, se
sintetizaron un cebador de ADN N-terminal como
resultado de la adición de la secuencia
Shine-Dalgarno derivada de E. coli (9 bases)
a 5 bases cadena arriba del codón de inicio del gen estructural de
GDH y la adición suplementaria de un punto de escisión de SacI
justo delante de la secuencia anterior, y un cebador de ADN
C-terminal como resultado de la adición de un sitio
BamHI justo detrás del codón de terminación del gen estructural de
GDH por el método convencional. Las secuencias de nucleótidos de
estos dos cebadores se muestran en las SEC ID Nº 10 y SEC ID Nº 11,
respectivamente, en la lista de secuencias. Usando estos dos
cebadores de ADN, junto con el plásmido pGDK1 (Eur. J. Biochem.
186, 389 (1989)) como molde, se sintetizó un ADN bicatenario por
PCR. El fragmento de ADN obtenido se digirió con SacI y BamHI y se
insertó en el sitio SacI-BamHI (que existe cadena
abajo del gen de BRD) del pTSBH construido en el Ejemplo 5 para dar
un plásmido recombinante pTSBG1. El método para construir pTSBG1 y
la estructura del mismo se muestran en la Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó E. coli HB101 (producto de
Takara Shuzo) usando los plásmidos recombinantes pTBH, pSTBH y
pTSBG1 obtenidos en los Ejemplos 5, 6 y 7, para dar E. coli
HB101 (pTBH), HB101 (pTSBH) y HB101 (pTSBG1), recombinantes,
respectivamente. Entro los transformantes obtenidos de este modo,
E. coli HB101 (pTSBH) y HB101 (pTSBG1) se han depositado en
el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
International Patent Organism Depositary (Dirección: Central 6,
1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City,
Ibaraki Prefecture, Japón) con el número de acceso FERM
BP-7118 (fecha de depósito: 11 de abril, 2000) y el
número reacceso FERM BP-7119 (fecha de depósito: 11
de abril, 2000), respectivamente.
Además, el plásmido pGDA2 (J. Biol. Chem.,
(1989), 264, 6381) se digirió doblemente con EcoRI y PstI y el
fragmento de ADN obtenido de este modo (aproximadamente 0,9 kb) que
contenía el gen de GDH derivado de Bacillus megaterium IWG3
se insertó en el plásmido pSTV28 (producto de Takara Shuzo) en el
sitio EcoRI-PstI del mismo para construir un
plásmido recombinante pSTVG. E. coli HB101 (pTSBH) que se
hizo competente con antelación por el método de cloruro cálcico, se
transformó con este plásmido pSTVG a una elevada tasa de
introducción. Por tanto, E. coli HB101 (pTSBH, pSTVG) se
obtuvo con facilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los recombinantes E. coli HB101 (pTBH) y
HB101 (pTSBH) obtenidos en el Ejemplo 8 se cultivaron en agitación
cada uno en medio YT 2 X que contenía 200 \mug/ml de ampicilina a
28ºC durante 15 horas. Se inoculó una parte de 1 ml de este fluido
de precultivo en 100 ml de un medio esterilizado por autoclave en un
matraz Sakaguchi de 500 ml y que comprendía glicerol al 1,5% (p/v),
Bacto triptona al 1,5% (p/v), Bacto extracto de levadura al 0,4%
(p/v), cloruro sódico al 0,2% (p/v), dihidrogenofosfato potásico al
0,8% (p/v), sulfato de magnesio heptahidrato al 0,05% (p/v), y
Adekanol LG109 al 0,033% (p/v) (producto de Asahi Denka Kogyo),
ajustado a pH 6,0, y se realizó el cultivo en agitación a 30ºC
durante 60 horas. Las células se recogieron de dichos fluidos de
cultivo usando una centrífuga, después se suspendieron en tampón
fosfato 100 mM (pH 6,5) y se alteraron ultrasónicamente para dar un
extracto libre de células.
La actividad BRD de este extracto libre de
células se determinó del siguiente modo. Por tanto, la actividad
BRD se determinó añadiendo el sustrato
N-bencil-3-pirrolidinona
(1 mM), la coenzima NADPH (0,167 mM) y la enzima a tampón fosfato
100 mM (pH 6,5) y midiendo la disminución en la absorbancia a la
longitud de onda de 340 nm a 30ºC. La actividad enzimática capaz de
oxidar 1 \mumol de NADPH en NADP en 1 minuto en estas condiciones
de reacción se definió como 1 unidad. Las actividades BRD
determinadas de este modo de los extractos libres de células se
expresaron en términos de actividad específica y se compararon con
la del transformante que alberga el vector plasmídico pUCNT.
También se hizo comparación con la actividad BRD de un extracto
libre de células derivado de la cepa Micrococcus luteus IFO
13867 preparado del mismo modo que en el Ejemplo 1. Los resultados
obtenidos de este modo se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En cuanto a E. coli HB101 (pTSBH), se
observó un aumento distinto en la actividad BRD en comparación con
E. coli HB101 (pUCNT) que está transformada con el vector
plasmídico solo y, cuando se compara con la cepa Micrococcus
luteus IFO 13867, la actividad era aproximadamente 10 veces
mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los recombinantes E. coli HB101 (pTSBG1)
y HB101 (pTSBH, pSTVG) obtenidos en el Ejemplo 8 se cultivaron y se
trataron del mismo modo que en el Ejemplo 9 para dar los extractos
libres de células respectivos, que se ensayaron para la actividad
GDH del siguiente modo. La actividad GDH se determinó añadiendo el
sustrato glucosa (0,1 M), la coenzima NADP (2 mM) y la enzima a
tampón clorhidrato de Tris 1 M (pH 8,0) y midiendo el aumento en la
absorbancia a la longitud de onda de 340 nm a 25ºC. La actividad
enzimática capaz de reducir 1 \mumol de NADP en NADPH en 1 minuto
en estas condiciones de reacción se definió como 1 unidad. La
actividad BRD también se determinó del mismo modo que en el Ejemplo
9. Las actividades BRD y GDH determinadas de este modo de los
extractos libres de células se expresaron cada una en términos de
actividad específica y se compraron con las de E. coli HB101
(pTSBH) y HB101 (pUCNT) que está transformada con el vector solo.
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
En cuanto a E. coli HB101 (pTSBG1) y
HB101 (pTSBH, pSTVG), se observaron aumentos distintos en la
actividad BRD y la actividad GDH en comparación con E. coli
HB101 (pUCNT) que está transformada con el vector plasmídico
solo.
\vskip1.000000\baselineskip
El fluido de cultivo de E. coli HB101
(pTSBH) recombinante obtenida en el Ejemplo 9 se alteró
ultrasónicamente usando SONIFIRE 250 (producto de BRANSON). A 25 ml
de este fluido de alteración celular se añadieron 1,350 U de
glucosa deshidrogenasa (producto de Amano Pharmaceutical), 3,0 g de
glucosa, 3,0 mg de NADP y 0,25 g de
N-bencil-3-pirrolidinona.
Mientras esta mezcla de reacción se agitó a 30ºC con el pH ajustado
a 6,5 usando ácido clorhídrico o hidróxido sódico 5 M, se añadió
N-bencil-3-pirrolidinona
al mismo a un intervalo de 0,25 g/hora. Después de la adición de un
total de 2,0 g de
N-bencil-3-pirrolidinona,
se continuó adicionalmente la agitación durante 20 horas. Después
de completarse la reacción, se añadieron 2,5 ml de una solución
acuosa 5 M de hidróxido sódico, la mezcla se extrajo con tolueno, y
se retiró el disolvente. El análisis del extracto resultante reveló
que se obtenía
N-bencil-3-pirrolidinol
en un rendimiento del 74%. El
N-bencil-3-pirrolidinol
producido en esa ocasión era la forma S con una pureza óptica no
menor del 99% ee.
La cantidad de
N-bencil-3-pirrolidinona
y
N-bencil-3-pirrolidinol
se determinó por cromatografía de gases (columna: Uniport B
PEG-20M al 10% (3,0 mm DI x 1,0 m), temperatura de
columna: 200ºC, gas de transporte: nitrógeno, detección: FID). La
pureza óptica de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
se determinó por cromatografía líquida de alto rendimiento
(columna: Chiralcel OB (producto de Daicel Chemical Industries),
eluyente: n-hexano/isopropanol/dietilamina =
950/50/1, caudal: 1 ml/min, detección: 254 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
A 25 ml del fluido de cultivo de E. coli
HB101 recombinante (pTSBG1) obtenida en el Ejemplo 9 se añadieron
2,5 g de glucosa, 3,0 mg de NADP y 0,25 g de
N-bencil-3-pirrolidinona.
Mientras esta mezcla de reacción se agitó a 30ºC con el pH ajustado
a 6,5 usando ácido clorhídrico o hidróxido sódico 5 M, se añadió
N-bencil-3-pirrolidinona
al mismo a un intervalo de 0,25 g/2 horas. Después de la adición de
un total de 1,0 g de
N-bencil-3-pirrolidinona,
se continuó adicionalmente la agitación durante 17 horas. Después
de completarse la reacción, se añadieron 1,2 ml de una solución
acuosa 5 M de hidróxido sódico, la mezcla se extrajo con tolueno, y
se retiró el disolvente. El análisis del extracto resultante reveló
que se obtenía
N-bencil-3-pirrolidinol
en un rendimiento del 92%. El
N-bencil-3-pirrolidinol
producido en esa ocasión era la forma S con una pureza óptica no
menor del 99% ee.
\vskip1.000000\baselineskip
A 25 ml del fluido de cultivo de E. coli
HB101 recombinante (pTSBH, pSTVG) obtenida en el Ejemplo 9 se
añadieron 2,5 g de glucosa, 3,0 mg de NADP y 0,25 g de
N-bencil-3-pirrolidinona.
Mientras esta mezcla de reacción se agitó a 30ºC con el pH ajustado
a 6,5 usando ácido clorhídrico o hidróxido sódico 5 M, se añadió
N-bencil-3-pirrolidinona
al mismo a un intervalo de 0,25 g/hora. Después de la adición de un
total de 2,0 g de
N-bencil-3-pirrolidinona,
se continuó adicionalmente la agitación durante 16 horas. Después
de completarse la reacción, se añadieron 2,5 ml de una solución
acuosa 5 M de hidróxido sódico, la mezcla se extrajo con tolueno, y
se retiró el disolvente. El análisis del extracto resultante reveló
que se obtenía
N-bencil-3-pirrolidinol
en un rendimiento del 93%. El
N-bencil-3-pirrolidinol
producido en esa ocasión era la forma S con una pureza óptica no
menor del 99% ee.
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado de la clonación de un gen de un
polipéptido que tiene actividad enzimática en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
y el análisis de la secuencia de nucleótidos del mismo, ha sido
posible obtener un transformante capaz de producir, a elevados
niveles, el polipéptido anterior. También ha sido posible obtener
un transformante capaz de producir, a elevados niveles, el
polipéptido y glucosa deshidrogenasa simultáneamente. Además, ha
sido posible sintetizar de forma eficaz
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
a partir de
N-bencil-3-pirrolidinona
usando dichos transformantes.
<110> KANEKA CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva carbonil reductasa, gen de la
misma y método para usar la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H23460-95EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 01956776.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
01-08-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP01/06619
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-08-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2000-232756
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-08-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170>PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Micrococcus luteus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 834
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Micrococcus luteus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgayacngcng aratgtaygc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcytcnacna gytgrtgraa
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcatatgc gacggatgac gctgcc
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgaattct tacagcattt ccagtggtcg cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaattcta aggagattta tatatgcgac ggatgacgct gccgag
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggagctct tacagcattt ccagtggtc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN bicatenario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggagctct aaggaggtta acaatgtata aag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacggatcct tatccgcgtc ctgcttgg
\hfill28
Claims (20)
1. Un polipéptido descrito en las siguientes (a)
o (b):
(a) Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de
secuencias;
(b) Un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que se puede obtener de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias por
sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o más
aminoácidos y que tiene actividad enzimática en la reducción
asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 que se obtiene de un microorganismo que pertenece
al género Micrococcus.
3. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde dicho microorganismo es la cepa
Micrococcus luteus IFO 13867.
4. Un ADN que codifica el polipéptido de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un ADN que codifica un polipéptido que tiene
actividad enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol,
y que hibrida con un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC ID Nº 2 en la lista de secuencias en condiciones
rigurosas.
6. Un ADN que codifica un polipéptido que tiene
actividad enzimática en la reducción asimétrica de
N-bencil-3-pirrolidinona
para producir
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol,
y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con una
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 en la lista de
secuencias.
7. Un vector de expresión que contiene ADN de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, que es un plásmido pTSBH.
9. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, que contiene un ADN que codifica un polipéptido
que tiene actividad glucosa deshidrogenasa.
10. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9, donde dicho polipéptido que tiene actividad
glucosa deshidrogenasa es una glucosa deshidrogenasa derivada de
Bacillus megaterium.
11. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 10, que es un plásmido pTSBG1.
12. Un transformante que contiene el vector de
expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a
11.
13. Un transformante que contiene tanto el
vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 como un
vector de expresión que contiene un ADN que codifica un polipéptido
que tiene actividad glucosa deshidrogenasa.
14. El transformante de acuerdo con la
reivindicación 13, donde dicho polipéptido que tiene actividad
glucosa deshidrogenasa es una glucosa deshidrogenasa derivada de
Bacillus megaterium.
15. El transformante de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 14, donde un hospedador del mismo es
Escherichia coli.
16. El transformante de acuerdo con la
reivindicación 15, que es Escherichia coli HB101 (pTSBH).
17. El transformante de acuerdo con la
reivindicación 15, que es Escherichia coli HB101
(pTSBG1).
18. El transformante de acuerdo con la
reivindicación 15, que es Escherichia coli HB101 (pTSBH,
pSTVG).
19. Un método de producción de
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
que comprende
una etapa de hacer reaccionar el transformante
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 y/o un
producto tratado del mismo con
N-bencil-3-pirrolidinona,
y
una etapa de recoger el
(S)-N-bencil-3-pirrolidinol
producido de este modo.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, donde la etapa de reacción se realiza en presencia de un
sistema regenerador de coenzima.
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