ES2240205T3 - Nueva reductasa de carbonilo, su gen y su procedimiento de utilizacion. - Google Patents
Nueva reductasa de carbonilo, su gen y su procedimiento de utilizacion.Info
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Abstract
Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una actividad enzimática para reducir asimétricamente el (S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R, 5S)-6-cloro-3, 5-dihidroxihexanoato de terc-butilo, en el que el polinucleótido es seleccionado entre el grupo que consta de: (a) Polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprenden la secuencia de aminoácidos representados por el Nº de ID de SEQ: 1 en el listado de secuencias; (b) Polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos del Nº de ID de SEQ: 2 en el listado de secuencias; y (c) Polinucleótidos que hibridizan con las secuencias de nucleótidos representadas por el Nº de ID de SEQ: 2 en el listado de secuencias en condiciones severas.
Description
Nueva reductasa de carbonilo, su gen y su
procedimiento de utilización.
La presente invención se refiere a un polipéptido
nuevo, un gen que codifica el polipéptido, a un vector de expresión
para expresar el polipéptido, un transformante obtenido
transformando una célula hospedera usando el vector de expresión, y
a un método para producir un compuesto útil como un material para
síntesis de medicamentos y pesticidas usando el transformante. Más
particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido
aislado de un microorganismo que tiene una actividad enzimática para
reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, a un polinucleótido que codifica el
polipéptido, a un vector de expresión que incluye el polinucleótido,
y a un transformante transformado por el vector de
expresión.
expresión.
La presente invención también se refiere a un
método para producir (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. El método incluye los pasos de hacer
reaccionar el transformante, o un producto suyo procesado, con el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo, y obtener el
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo producido.
El
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo es un compuesto útil particularmente como
material para la síntesis de medicamentos y pesticidas,
El único método para producir (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo por reducción asimétrica de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo, que ha sido informado, emplea
dietil-metoxiborano y borohidruro de sodio (patente
de los EE.UU. Nº 52.783.131). Los problemas con esta técnica son que
se requiere un recipiente de reacción a temperaturas muy bajas, que
alcancen temperaturas tan bajas como -78ºC, por lo que se necesita
emplear materiales costosos, y otros análogos. Wada et al.
(Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (1998),
280-285) describe una carbonil reductasa dependiente
respecto a NADPH que está involucrada en la reducción del
4-cloro-3-oxobutanoato
de etilo.
Ha habido necesidad en un procedimiento práctico
de reacción para producir el (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo.
Los inventores de la presente invención han
encontrado un polipéptido derivado de un microorganismo para
realizar la reducción asimétrica de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo; han concebido un método que podía producir
eficientemente (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, y lograr finalmente la presente
invención.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un polipéptido capaz de reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un método que produzca eficazmente el polipéptido
usando la tecnología de ADN recombinante. Todavía otro objetivo de
la presente invención es proporcionar un transformante que pueda
producir dicho polipéptido, y un polipéptido que tenga una actividad
de glucosa dehidrogenasa, simultáneamente en gran escala. Incluso
todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar un
método práctico para producir el
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo usando el transformante.
La presente invención se refiere a un
polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una actividad
enzimática de reducción asimétrica del
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. El polinucleótido es hibridizado con una
secuencia de nucleótido representada por No de ID de SEQ. 2 en el
listado de secuencias en condiciones severas.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un polipéptido teniendo una actividad enzimática para reducir
asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. El polipéptido comprende la secuencia de
aminoácido representada por No de ID de SEQ. 1 en el listado de
secuencias o las secuencias de aminoácido del polinucleótido antes
mencionado.
Preferentemente, el péptido puede ser obtenido de
un microorganismo perteneciente al género Candida. Más
preferentemente, el microorganismo podría ser Candida magnoliae
IFO 0705.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un vector de expresión que incluye el polinucleótido anteriormente
descrito. Preferentemente, el vector de expresión podría ser
plásmido pNTCR que está contenido en la cepa de E. coli
depositada como FERM BP-6897.
En una realización, adicionalmente el vector de
expresión anteriormente descrito aún más podría incluir un
polinucleótido que codifica un polipéptido teniendo una actividad de
dehidrogenasa de glucosa.
Preferentemente, el polipéptido que tiene una
actividad de dehidrogenasa de glucosa podría ser una dehidrogenasa
de glucosa obtenido de de bacilo Megaterium.
Preferentemente, el vector de expresión podría
ser plásmido pNTCRG que está contenido en la cepa de E. coli
depositada como FERM BP-6898.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un transformante obtenido transformando una célula hospedera usando
el vector de expresión anteriormente descrito.
Preferentemente, el vector de expresión podría
ser el plásmido pNTCRG que se contiene en la cepa de E. coli
depositada como FERM BP-6898.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un transformante obtenido al transformar una célula hospedera usando
el vector de expresión anteriormente descrito.
Preferentemente, la célula hospedera podría ser
Escherichia coli. Más preferentemente, el transformante
podría ser E. coli HB101 (pNTCR) (FERM
BP-6897) de o E. coli HB 101 (pNTCRG)
(FERMBP-6898).
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un método para producir (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. El método comprende los pasos de hacer
reaccionar el transformante anteriormente descrito y/o un producto
procesado suyo con
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo, y obtener el
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo producido.
Preferentemente, el paso reaccionante es llevado
a cabo en presencia de una coenzima restaurando del sistema.
La Figura 1 es un diagrama que indica la
secuencia de un polinucleótido de la presente invención, y su
secuencia de aminoácido pronosticada.
La Figura 2 es un diagrama que indica un método
para producir el plásmido recombinante pNTCRG.
En lo adelante, la presente invención será
descrita en detalle. Como un polipéptido de la presente invención,
puede ser empleado cualquier polipéptido, mientras tenga una
actividad enzimática para reducir asimétricamente el (S)
-6-cloro-5-hidroxi-3-
oxohexanoato de terc-butilo representado por la siguiente
fórmula (I) de producir (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo representado por la siguiente fórmula
(II).
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo
(3R, 5S)-
6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc -butilo
Los ejemplos de tales polipéptidos incluyen un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de No de ID de
SEQ 1 en el listado de secuencias y que tiene una actividad
enzimática para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo.
Un polipéptido de la presente invención puede ser
obtenido de un microorganismo que tenga una actividad para reducción
asimétrica de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo de. Por lo tanto, el microorganismo usado como
fuente del polipéptido puede ser, pero no se limita a, la levadura
(género Candida), y más preferentemente de Candida
magnoliae IFO 0705. Esta cepa era un microorganismo depositado
originalmente con el de número de depósito CBS166 en el
Centraalbureau voor SchimMelcultures (CBS; Oosterstraat 1, Postbus
273, AG Baarn de NL-3740, Países Bajos), y el
aislamiento y las propiedades de la cepa son descritos en The
Yeasts, a Taxonomic Study. 3rd ed. pp. 731 (1984) Microorganismos
que producen polipéptidos de la presente invención pueden ser de un
tipo natural o la cepa de tipo variante. Por otra parte,
microorganismos modificados genéticamente (usando fusión de células,
la manipulación de genes, etcétera) pueden ser empleados.
Microorganismos modificados genéticamente para producir péptidos de
la presente invención pueden ser obtenidos por un método que incluye
los pasos: aislamiento y/o purificar de estas enzimas y determinar
su secuencia de aminoácidos entera o parcial; determinar las
secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos sobre la
base de sus secuencias de aminoácidos; obtener las secuencias de
nucleótidos que codifican los polipéptidos sobre la base de sus
secuencias de aminoácidos; introducir las secuencias de nucleótidos
en otros microorganismos para obtener microorganismos recombinantes;
y cultivar los microorganismos recombinantes para obtener enzimas de
la presente invención.
Un medio de cultivo para microorganismos que
produciría polipéptidos de la presente invención podría ser
cualquier medio de nutriente líquido conteniendo una típica fuente
de carbono, fuente de nitrógeno, fuente de sales minerales, fuentes
de nutrientes orgánicos, y análogas tanto como los microorganismos
puedan crecer.
El término "Cultivo de microorganismos" como
se usa en la presente solicitud se refiere a un microorganismo y
cultivo líquido que contiene el microorganismo, y producto
procesado'' hace referencia a un producto obtenido por extracción o
purificación del microorganismo mismo o a un cultivo líquido que
contiene el microorganismo.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser purificados de microorganismos que contienen los polipéptidos
usando un método convencional. Por ejemplo, un microorganismo está
cultivado en un medio apropiado, y el cultivo es centrifugado para
recoger el microorganismo. El microorganismo es desmenuzado en un
molino Dyno (fabricado por Willy A Bachofen Co., Ltd.), por
ejemplo, y centrifugado para retirar los residuos de células y
obtener por lo tanto un extracto libre de células. El extracto libre
de células es sometido a las técnicas, como desalado (por ej. la
precipitación con sulfato de amonio y precipitación con fosfato de
sodio), precipitación con solvente (un método de fraccionamiento de
proteína por precipitación usando acetona, etanol, o semejante),
diálisis, filtración en gel, intercambio iónico, cromatografía en
columna (por ej. cromatografía de fase reversa), y ultrafiltración,
a solas o en combinación, para purificar los polipéptidos. La
actividad enzimática puede ser determinada midiendo la reducción en
la absorción a una longitud de onda de 340 nm a 30 C dónde 5 mM de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
como un sustrato, 0,33 mM NADPH como coenzima y una enzima es
añadida a 100 mM de búfer fosfato (pH = 6,5).
Polipéptidos de la presente invención puede
comprender la secuencia de aminoácido de No de ID de SEQ. 1 en el
listado de secuencia de aminoácido que codifica para un
polinucleótido descrito a continuación.
Polinucleótidos de la presente invención puede
ser un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótido de No de
ID de SEQ. 2 en el listado de secuencias, y un polinucleótido capaz
de ser hibridizado con ese polinucleótido bajo condiciones
severas.
El polinucleótido capaz de ser hibridizado con el
polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótido de No de ID de
SEQ. 2 en el listado de secuencias bajo condiciones severas
representa un polinucleótido obtenido con un método de hibridación
de colonia, un método de hibridación del southern, o semejante
cuando la secuencia de nucleótido de No de ID de SEQ. 2 es usado
como una sonda de ADN. Específicamente, el polinucleótido puede ser
identificado de la siguiente manera. Un filtro sobre el que
polinucleótido, derivado desde una colonia o placa inmovilizada, es
sometida a hibridación con la secuencia de nucleótido de No de ID de
SEQ. 2 en NaCl 0,7 a 1,0 M a 65ºC, y de allí en adelante el filtro
es lavado con una solución de SSC que tiene 0,1 a la concentración 2
veces (la solución de SSC de concentración una vez contiene cloruro
de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM) a 65ºC.
La hibridación puede ser llevada a cabo en
conformidad con un procedimiento descrito en Molecular
Cloning, A laboratory manual, second edition (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989, o el semejante. Específicamente, los
ejemplos de un polinucleótido capaz de hibridación anteriormente
descrito incluyen un polinucleótido al menos 60% de identidad de
secuencias con la secuencia de nucleótido de No de ID de SEQ. 2,
identificación de secuencias, preferentemente al menos 80% de
identidad de secuencias, más preferentemente al menos 90% de
identidad de secuencias aún más preferentemente al menos 95%, y la
más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencias.
Polinucleótidos de la presente invención que
codifican polipéptidos que tiene la actividad enzimática para
reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo incluyen un polinucleótido que tiene al menos
60% identidad de secuencia con la secuencia del nucleótido No de ID
de SEQ. 2, preferentemente al menos 80% identidad de secuencia, más
preferentemente al menos 90% identidad de secuencia, aún más
preferentemente al menos 95% identidad de secuencia, y casi
preferentemente al menos 99% identidad de secuencia, como una
longitud del que codifican polipéptidos que tienen actividad
enzimática descrita arriba. El término "Identidad de secuencia"
quiere decir que dos secuencias de polinucleótido de ser comparadas
son idénticas a sí, y la razón (%) de la identidad de secuencias
entre dos polinucleótidos que son comparados es calculada de la
siguiente manera. Primero, dos secuencias de polinucleótido al ser
comparadas son alineadas en una manera óptima. El número de sitios
en el que la misma base de ácido nucleico (por ej. A, T, C, G, U)
esta presente en ambas secuencias (el número de sitios combinados)
es contado y el número de sitios combinados es dividido por el
número total de bases de ácido nucleico en el polinucleótido. El
valor resultante es multiplicado por 100. La identidad de secuencias
puede ser calculada usando la siguiente herramienta analizadora de
secuencia, por ejemplo: Unix-based GCG Wisconsin
Package (Program Manual for the Wisconsin Pack-age,
Version 8, September, 1994, Gentics Computer Group, 575 Science
Drive Madison, Wisconsin, USA53711; Rice P. (1996) Program Manual
for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall,
Cambridge, CB10 1 RQ, England) and the ExPASy World Wide Web server
for molecular biology (Genva University Hospital and University of
Genva, Genva, Switzerland).).
Polinucleótidos de la presente invención puede
ser obtenido de microorganismos que tienen la actividad enzimática
para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo asimétricamente a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. El microorganismo usado como fuente del
polinucleótido puede ser, no limitado para, levadura (género
Candida), y más preferentemente Candida magnoliae IFO
0705.
En lo adelante, un método para producir un
polinucleótido de la presente invención desde microorganismos que
tengan actividad enzimática para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo asimétricamente a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo será descrito. La presente invención no está
limitada a esto.
Inicialmente, las secuencias de aminoácido del
polipéptido purificado, y los fragmentos de péptidos obtenidos por
digestión del polipéptido con una endopeptidasa apropiada son
secuenciados por el método de Edman. Sobre la base de esta
información de secuencias de aminoácido, una plantilla del
nucleótido es sintetizada. De allí en adelante ADN cromosomal es
preparado de un microorganismo, de que el polinucleótido es creado,
usando un típico método de aislamiento de nucleótido (por ej. método
de Hereford descrito en Cell, 18, 1261 (1979)). PCR es
llevado a cabo usando plantillas de nucleótido anteriormente
descrito y este ADN cromosomal como una plantilla para amplificar
una parte del gen del polipéptido. Adicionalmente, la parte
amplificada del gen de polipéptido es etiquetada con un método de
etiquetado patrón aleatorio descrito en Anal. Biochem.,
132, 6 (1983), por ejemplo, preparar una sonda del
nucleótido. El ADN cromosomal del microorganismo es digerido por una
enzima de restricción apropiada. Los fragmentos resultantes son
incluidos en un vector que es introducido en una célula del
hospedero apropiada, así construir una biblioteca de ADN cromosomal
del microorganismo. Esta biblioteca de ADN es protegida usando la
sonda del nucleótido anteriormente descrito en conformidad con un
método de hibridación de colonia, un método de hibridación de placa,
o el semejante, obteniendo ADN que sí incluye el gen de polipéptido.
La secuencia de nucleótido es entonces obtenida desde fragmentos de
ADN que incluyen el gen de polipéptido que puede ser secuenciado en
serie con un método de secuenciación en serie de dideoxi, un método
de terminación de cadena de dideoxi, o el semejante. Por ejemplo, el
secuenciación en serie de la secuencia de nucleótido puede ser
llevado a cabo usando ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit (fabricado por Perkin Elmer Co., Ltd.) and
ABI 373A DNA Seqencer (fabricado por Perkin Elmer Co.,
Ltd.).
Los vectores para introducir polinucleótidos de
la presente invención en microorganismos hospederos, en que los
polinucleótidos son expresados, podrían ser cualquier vector tan
largo como el gen de la enzima puede ser expresada en
microorganismos hospederos apropiados. Los ejemplos de tales
vectores incluyen un vector plásmido, un vector fago, y un vector
cosmid. Un vector de puente puede ser usado para poder cambiar un
gen entre las cepas del hospedero. Tal vector típicamente incluye un
elemento de control, como un promotor IacUV5, un promotor trp, un
promotor trc, un promotor tac, un promotor lpp, un promotor tufB, un
promotor recA, o un promotor pL, y es preferentemente empleado como
un vector de expresión que incluye una unidad de expresión
operativamente vinculada al polinucleótido de la presente
invención.
El término "Elemento de control" usado es el
que se refiere a un promotor funcional y a una secuencia de
nucleótido que tiene cualquier elemento de transcripción asociado
(por ej. enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site).
La frase se "Operativamente Vinculado" usada
es la que se refiere a un polinucleótido que esta conectado con
elementos controladores, como un promotor y un reforzador, que
controlan la expresión del polinucleótido en tal manera de que los
elementos controladores pueden funcionar expresando el gen. Es bien
conocido para aquellos más experimentados que los elementos de
control pueden cambiar dependiendo de la célula hospedera.
Los ejemplos de células del hospedero, en que un
vector que tiene un polinucleótido de la presente invención es
presentado, incluyen bacterias, levadura, mohos, células de planta,
y células de animal. Escherichia coli es particularmente
preferible. Un polinucleótido de la presente invención puede ser
introducido en una célula hospedera que usa un método convencional.
Cuando E. coli es usado como una célula hospedera, un
polinucleótido de la presente invención puede ser presentado usando
un método de cloruro de calcio, por ejemplo.
Cuando se produce (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo reduciendo asimétricamente
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-
oxohexanoato de terc-butilo se usa el polipéptido de la
presente invención, una coenzima, como NADPH y NADH, es requerido.
Sin embargo, una enzima capaz de transformar en una coenzima oxidada
para reducir la coenzima (en el que esta referido como capacidad
restauradora de la coenzima) puede ser usada en dirección con el
sustrato correspondiente, es decir, un sistema restaurador de la
coenzima es usado en combinación con un polipéptido de la presente
invención en reacción, así reducir la cantidad de coenzima costosa
es usada. Los ejemplos de enzimas que tienen capacidad para
restituir la coenzima incluyen hidrogenasa, dehidrogenasa de
formiato, dehidrogenasa de alcohol, dehidrogenasa de aldehído,
hidrogenasa de glucosa-6-fosfato, y
dehidrogenasa de glucosa. Preferentemente, es usada dehidrogenasa de
glucosa. Tal reacción puede ser llevada a cabo añadiendo una
coenzima para restaurar el sistema a un sistema de reacción
asimétrico. Cuando se usa un transformante, como un catalizador,
transformado ambos con un polinucleótido que codifica un polipéptido
que tiene la actividad enzimática por reducción asimétrica de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo asimétricamente para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, y un polinucleótido que codifica un
polipéptido que tiene una actividad de dehidrogenasa de glucosa, las
reacciones pueden ser llevadas a cabo eficientemente sin preparar
una enzima que tenga la coenzima restituyendo la capacidad y añadir
la enzima a un sistema de reacción. Tal transformante puede ser
obtenido que incluye un polinucleótido que codifican un polipéptido
que tiene la actividad enzimática para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo asimétricamente para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, y un polinucleótido que codifica un
polipéptido teniendo una actividad de dehidrogenasa de glucosa, en
el mismo vector, e introduciendo el vector en una célula hospedera.
Por otra parte, el transformante puede ser obtenido incorporando
estos dos polinucleótidos en dos vectores obtenidos de grupos
incompatibles, e introducir estos polinucleótidos en la misma célula
hospedera.
La actividad de dehidrogenasa de glucosa del
transformante puede ser determinada midiendo un aumento en la
absorción a una longitud de onda de 340 nm a 25ºC, donde la glucosa
0,1 M como un sustrato, 2 mM NADP cuando una coenzima, y una enzima
son añadida a un búfer de HCI Tris 1 M (pH 8,0).
La producción de (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo usando un transformante de la presente
invención puede ser llevada a cabo de la siguiente manera.
Inicialmente,
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo como un sustrato, una coenzima como NADP, y el
cultivo del transformante o un producto procesado suyo, son añadidos
a un solvente apropiado, seguido por el ajuste del pH. La mezcla
resultante es agitada para hacerla reaccionar. La reacción es
llevada a cabo a una temperatura de 10ºC a 70ºC mientras se mantiene
el pH de la solución de reacción en un intervalo de 4 a 10. La
reacción es llevada a cabo en un proceso a lotes o un proceso
continuo. En el caso de un proceso en lote, un sustrato es
reaccionado y es añadido para preparar una concentración de 0,1% a
70% (p/v). El producto procesado de un transformante y el semejante
mencionado arriba hace referencia a un extracto crudo, a
microorganismos cultivados, a organismos liofilizados, organismos
deshidratados en acetona, homogenizados de tales microorganismos, y
el semejante. Tales productos procesados y el semejante pueden ser
usados en el estado siendo inmovilizados como enzimas o
microorganismos cuando lo son, por unos medios conocidos. Cuando la
reacción es llevada a cabo usando un transformante que produce el
polipéptido de la presente invención y una dehidrogenasa de glucosa,
la adición de glucosa para el sistema de reacción permite una
reducción de gran parte de la cantidad de coenzimas.
El (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo producido por la reacción puede ser purificado
por un método convencional. Por ejemplo, (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc -butilo es sometido a la centrifugación, a la
filtración y a otros procesos requeridos para retirar sustancias
suspendidas como microorganismos. El producto resultante es sometido
a la extracción con un solvente orgánico como acetato de etilo y
tolueno, y deshidratado con un deshidratante como sulfato de sodio.
El solvente orgánico es retirado bajo descompresión. El producto
resultante es entonces sometido a la cristalización, a
cromatografía, o al semejante para ser
purificado.
purificado.
En la reacción,
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc -butilo como un sustrato está preparado con el método
descrito en U.S. Patent No.52,783,131 el que es incluido por
referencia.
La cuantificación de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo y
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, y la medición de la proporción del
diastereomero (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo puede ser ejecutada por Cromatografía Líquida
de Alta resolución (columna: COSMOSIL 5CN-R (ID
4,6 x 250 mM) fabricado por Nacalai Tesque Co., Ltd), eluato:
1 mM solución fosfato/acetonitrilo = 5/1, velocidad de flujo: 0,7
mL/minuto, detección: 210 nm, temperatura de la columna: 30ºC).
Como se describe arriba, según la presente
invención, es posible producir eficientemente un polipéptido en la
presente invención. Con tal polipéptido, un método excelente para
producir (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo. En lo adelante, en la presente invención será
descrita vía ejemplos ilustrativos con la referencia a los dibujos
acompañando. La presente invención no está limitada a tales
ejemplos.
Los detalles de los métodos de manipulación
relacionado con las técnica de ADN recombinante empleadas en el
siguiente ejemplo son descritos en los siguientes textos.
Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring
Harbor Laboratory Press,1989)
Current Protocols in Molecular
Biology(Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience)
Desde Candida magnoliae IFO 0705, un
polipéptido que tiene la actividad enzimática para reducir
asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo son purificados individualmente de la
siguiente manera.
18 L de medio líquido que tienen la siguiente
composición fue preparado en un fermentador 30 L (fabricado por
Marubishi Bioeng Co., Ltd.), y esterilizado con vapor a 120ºC
de durante 20 minutos.
La composición del medio: agua, glucosa 4,0%,
extracto de levadura 0,5%, KH_{2}PO_{4} 0,1%,
(NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,65%, % de NaCl 0,1%,
MgSO_{4}.7H_{2}O 0,8%, ZnSO_{4}.7H_{2}O 0,06%,
FeSO4.7H_{2}O 0,09%, CuSO_{4}.5H_{2}O 0,005%,
MnSO_{4}.4-6H_{2}O 0,01%, y
LG-109 de Adecanol^{TM} (fabricado por NOF
Corporation) 0,02% (pH 7,0).
El medio más arriba fue inoculado con un cultivo
Candida magnoliae IFO 0705, que había sido precultivado en el
medio, por 180 mL/fermentador y cultivado a 33ºC con la agitación en
295 rpm y una velocidad de aireación de 5,0 NL/minutos mientras
mantenía el límite inferior de pH en 6,5 goteando 30% (w/w)
hidróxido de sodio. 655 g de 55% (w/w) acuosa, la solución de
glucosa fue añadida 22 horas y 25 horas después del principio del
cultivo. El cultivo fue llevado a cabo durante 30 horas.
Los microorganismos fueron colectados desde
cultivo resultante de 10 L por centrifugación y luego lavados con
una solución salina fisiológica, obteniendo 1350 g de
microorganismos húmedo. Los microorganismos húmedos fueron
resuspendidos en 2700 mL de un búfer de fosfato 100 mM (pH 6,7), y
2-mercaptoetanol y fluoruro de fenilmetilsulfonido y
fueron añadidos a las concentraciones finales de 5 mM y 0,1 mM,
respectivamente. Los microorganismos fueron rotos por molino de Dyno
(fabricado por Willy A Bachofen Co., Ltd.). Los
microorganismos interrumpidos fueron centrifugados para retirar
debris de la célula, obteniendo 2880 mL de un extracto libre de
células así.
El sulfato de amonio fue añadido y disuelto en el
extracto libre de células hasta obtener saturación del 60% Los
precipitados resultantes fueron retirados por centrifugación (en
este caso, el pH del extracto libre de células fue mantenido en 6,7
con el agua amoniacal). El sulfato de amonio fue añadido al
sobrenadante para obtener saturación del 75% mientras se mantenía de
forma similar pH 6,7. Los precipitados resultantes fueron colectados
por centrifugación. Los precipitados fueron disueltos y hecho
diálisis en 10 mM búfer de fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol toda la noche.
La solución crudo de enzima resultante anterior
fue suministrada a una columna de DEAE-TOYOPEARL
650M (500 mL; fabricado por Tosoh Corporation) que había sido
equilibrada con 10 mM búfer de fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol, con el propósito de que
polipéptidos que tiene actividad enzimática fueran adsorbidos a la
columna. La columna fue lavada con el mismo búfer. Las fracciones
activas fueron eluidas usando un gradiente lineal de NaCl (de 0 M a
0,5 M). Las fracciones activas fueron colectadas y luego dializadas
toda la noche en 10 mM búfer de fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol.
El sulfato de amonio fue disuelto en la solución
de crudo enzimático resultante anterior para una concentración final
de 1 M (mientras se mantenía pH 7,0 con agua amoníacal), y luego
suministrado a una columna de Fenil Sepharosa CL-4B
de (140 mL; fabricado por Pharmacia Biotech Co., Ltd.) que
había sido equilibrada con búfer de fosfato 10 mM (pH 7,0)
conteniendo 2 mM de 2-mercaptoetanol y 1 M de
sulfato de amonio, es decir polipéptidos que tienen actividad
enzimática fueron adsorbidos a la columna. La columna fue lavada con
el mismo búfer. Las fracciones activas fueron eluidas usando un
gradiente lineal de sulfato de amonio (de 1 M a 0 M). Las fracciones
activas fueron colectadas y luego dializadas durante la noche en 10
mM búfer de fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol.
La solución de crudo enzimático resultante
anterior se suministra a una columna de Azul Sepharosa
CL-6B (40 mL; de fabricado por Pharmacia Biotech
Co., Ltd.) que había sido equilibrada con 10 mM búfer de
fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol, con el propósito de que los
polipéptidos que tienen actividad enzimática fueran adsorbidas a la
columna. La columna fue lavada con el mismo búfer. Las fracciones
activas fueron eluidas usando un gradiente lineal de NaCl (de 0 M a
1 M). Las fracciones activas fueron colectadas y luego dializadas 10
mM búfer de fosfato (pH 7,0) conteniendo 2 mM de
2-mercaptoetanol durante la noche.
La solución de crudo enzimático resultante
anterior fue suministrada a una columna Super Q - TOYOPEARL 650S (12
mL; fabricado por Pharmacia Biotech Co., Ltd.) que
había sido equilibrada con 10 mM búfer de fosfato (pH 7,0)
conteniendo 2 mM de 2-mercaptoetanol, con el
propósito de que los polipéptidos que tiene actividad enzimática
fueran adsorbidos a la columna. La columna fue lavada con el mismo
búfer. Las fracciones activas fueron eluidas usando un gradiente
lineal de NaCl (de 0 M a 0,4 M). Las fracciones activas fueron
colectadas y luego dializadas en 10 mM búfer de fosfato (pH 7,0)
conteniendo 2 mM de 2-mercaptoetanol durante la
noche. Por lo tanto, una muestra del polipéptido puro que está
electroforéticamente solo fue obtenido (en el que en lo adelante es
referido como una enzima CR ).
La enzima CR purificada obtenida en El Ejemplo 1
fue desnaturalizada en presencia de Urea 8 M, y luego digerida con
lisil-endopeptidasa derivada de Acromobacter
(fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Las
secuencias de aminoácido de los fragmentos de péptido resultantes
fueron determinadas usando secuenciador de proteína AB1492
(fabricado por Perkin Elmer Co., Ltd.). Sobre la base de la
secuencia de aminoácido, las dos plantillas de nucleótidos (No de ID
de SEQ. 3 y 4) fueron sintetizado con un método convencional.
El ADN cromosomal fue extraído desde cultivos de
Candida magnoliae IFO 0705 acuerdo con el método de Hereford
(Cell, 18, 1261 (1979). De allí en adelante, el método
PCR fue llevado a cabo usando como una plantilla a base del
nucleótido más arriba preparado y el ADN cromosomal resultante, así
amplificando un fragmento de nucleótido de aproximadamente 350 bp
que son considerados para ser una parte del gen enzimática de
CR.
El ADN cromosomal de Candida magnoliae IFO
0705 fue digerido totalmente con enzima de restricción Apal, y los
fragmentos digeridos fueron separados con electroforesis de gel de
agarosa. De allí en adelante, un método del Southern (J. Mot.
Biol., 98, 503 (1975)) fue llevado a cabo usando un
fragmento de ADN de 350 bp obtenido para analizar fragmentos
digeridos de ADN cromosomal (el etiquetando y la detección de una
sonda de nucleótido fue llevada a cabo usando Gen Images Labeling
AND Detection System (fabricado por Amersham Co., Ltd.)). Por
consiguiente, fue descubierto que un fragmento de nucleótido de
aproximadamente 5,5 kb fue hibridizado con la investigación de
nucleótido.
Sobre la base de este hecho, después de que los
fragmentos digeridos fueron separados por gel de electroforesis de
agarosa, fragmentos de nucleótido de 4,3 kb para 6,2 kb fueron
colectados. Estos fragmentos de nucleótido fueron introducidos en el
sitio Apal del vector plásmido pBluescriptll KS (-) (fabricado por
STRATAGEN Co., Ltd.). El plásmido fue introducido en JM109 de
E. coli. La biblioteca de ADN cromosomal de esta cepa fue
preparada.
Por lo tanto el fragmento de nucleótido obtenido
fue usado como una sonda para seleccionar la biblioteca de ADN
cromosomal en concordancia con el método de hibridación por colonia
(el etiquetando y la detección de una sonda de nucleótido fue
llevada a cabo usando Gen Images Labeling and Detection System
(fabricado por Amersham Co., Ltd.), y el experimento fue
llevado a cabo en concordancia con los procedimientos descritos en
el manual de instrucción del sistema. Por consiguiente, una colonia
sola positiva fue obtenida. De allí en adelante, los plásmidos
recombinantes obtenidos desde esta colonia positiva, en que el ADN
de aproximadamente 5,5 kb había sido insertado, fueron doblemente
digerido con EcoRl y Sphl. Los fragmentos digeridos fueron
analizados con el método Southern como se describe arriba. Por
consiguiente, fragmentos de nucleótido de aproximadamente 1,0 kb
causado por la digestión usando las enzimas de restricción fueron
hibridizados con la sonda. Sobre la base de este hecho, el fragmento
de nucleótido de aproximadamente 1,0 kb fue insertado en el sitio
EcoRl-Sphl del plásmido pUC19 (fabricado por
Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido
recombinante pUC-ES y escogido como un clon de ADN
cromosomal que incluye el gen de la enzima CR.
El plásmido recombinante pUC-ES
de más arriba fue digerido con una variedad de enzimas de
restricción, y fragmentos digeridos producidos durante la reacción
fueron analizados para preparar un mapa de restricción. Luego varios
fragmentos de ADN obtenidos durante el análisis fueron insertados en
sitios de multicopias de pUC19, para formular plásmidos
recombinantes. Usando estos plásmidos recombinantes, las secuencias
de nucleótido de los respectivos fragmentos insertados fueron
analizadas ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (fabricado por Perkin Elmer Co., Ltd.) and ABI 373A DNA
Sequencer (fabricado por Perkin Elmer Co., Ltd.). Por
consiguiente, fue determinada la secuencia de base entera del
fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb que fue esperada incluye
el gen de la enzima prevista. La Figura 2 indica por lo tanto la
secuencia de base determinada. Una secuencia de aminoácido
pronosticada desde la secuencia del nucleótido para una porción del
gen estructural de la secuencia del nucleótido también es mostrada
en la secuencia de nucleótido correspondiente en La Figura 1. La
secuencia de aminoácido fue comparada con una secuencia del
aminoácido parcial de un fragmento de péptido digerido con una
lisil-endopeptidasa de la enzima de CR purificada.
Por consiguiente, fue descubierta que la secuencia de aminoácido
parcial de la enzima de CR purificada existía totalmente en la
secuencia de aminoácido pronosticada desde la secuencia de
nucleótido y se corresponde totalmente con esta (indicada con una
parte subrayada en la secuencia de aminoácido de la Figura 1). Por
lo tanto, el fragmento de ADN fue considerado que incluye el gen de
la enzima CR.
Un ADN de doble hebra que tiene: un sitio Ndel
añadido a una porción del codón de iniciación de un gen estructural
de la enzima CR; y un nuevo codón de terminación (TAA) y un sitio de
EcoRl adicionado inmediatamente después de un codón de terminación;
y T sustituida a G en el sexto nucleótido del extremo 5 ' del gen
con el propósito de destruir un sitio Sall del gen sin una
modificación del código de aminoácido, fue obtenido de la siguiente
manera. Una plantilla de nucleótido de N términos que tenía un
sitio Ndel adicionado a una porción del codón de iniciación del gen
estructural de la enzima CR y sustituyó T para G en el sexto
nucleótido del extremol 5 ' del gen fue sintetizada sobre la base de
la secuencia de nucleótido determinada en el Ejemplo 2. Además, una
plantilla de nucleótido de C-términos que tiene un
nuevo codón de terminación (TAA) y un sitio de EcoRl añadido
inmediatamente después del codón de terminación del gen estructural
de la enzima CR fue sintetizado sobre la base de la secuencia de
nucleótido determinada en el Ejemplo 2. Las secuencias de nucleótido
de estas dos plantillas son representadas por No de ID de SEQ. 5 y
6. Usando las dos plantillas de ADN sintéticas, un ADN de doble
hebra fue amplificado por PCR usando el plásmido
pUC-ES obtenido en el Ejemplo 2 como una plantilla.
El fragmento de ADN resultante fue digerido con Ndel y EcoRl, y
insertado en Ndel y sitios EcoRl descendente para del promotor lac
del plásmido pUCNT (WO94/03613), para obtener plásmido de
recombinante pNTCR.
Un ADN de doble hebra que tiene: una secuencia
Shine-Dalgarno (9 nucleótidos) de E. coli
añadido 5 nucleótidos ascendente desde el codón de iniciación del
gen dehidrogenasa de glucosa (en lo adelante referida como GDH)
derivada de Bacillus megaterium IAM 1030; un sitio de EcoRl
adicionado inmediatamente hasta aquí; y un sitio Sall
inmediatamente después del codón de terminación fue obtenido de la
siguiente manera. Sobre la base de la información de secuencias de
nucleótidos sobre el gen de GDH, una plantilla de nucleótido de N
términos que tenía la secuencia Shine-Dalgarno (9
nucleótidos) de E. coli adicionó 5 nucleótidos ascendente al
codón de iniciación del gen estructural de GDH y al sitio de EcoRl
adicionó inmediatamente hasta aquí, y una plantilla de nucleótido de
C términos que tenía el sitio de Sall adicionado inmediatamente
después del codón de terminación fueron sintetizados con un método
convencional. Las secuencias de nucleótido de estas dos plantillas
son representadas por No de ID de SEQ. 7 y 8. Usando las dos
plantillas de ADN sintéticos, uno DNA doble hebra fue sintetizado
por PCR usando el plásmido pGDK1 de (Eur. J Biochem.
186, 389 (1989)) como una plantilla. El fragmento de ADN
resultante fue digerido con EcoRl y Sall, y insertado en los sitios
EcoRl y de Sall de pNTCR construido en el Ejemplo 3 (existiendo
descendentemente el gen enzima CR) para obtener plásmido
recombinante pNTCRG. El método de producción y la estructura de
pNTCRG son indicados en La Figura 2.
La E. coli HB101 (fabricado por Takara
Shuzo Co., Ltd.) fue transformada usando el plásmido
recombinante pNTCR obtenido en el Ejemplo 3 y el plásmido
recombinante pNTCRG de obtenido en el Ejemplo 4, para obtener E.
coli recombinante HB101 (pNTCR) y HB101 (pNTCRG),
respectivamente. Los transformantes por tanto obtenidos, E.
coli HB101 (pNTCR) y HB101 (pNTCRG); fueron depositados en el
Ministry of International Trade and Industry, Agency of
Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience
and Human Technology (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken,
Japan) bajo los respectivos número de depósito FERM
BP-6897 y FERM BP-6898 en Septiembre
28, 1999, asignada a Budapest Treaty of the International
Recognition of the Deposit of Microorganisms para los
procedimientos de patente.
La E. coli recombinante HB101 (pNTCR)
obtenida en El Ejemplo 5 fue cultivada en medio 2xYT que contiene
120 \mug/mL de ampicillina, colectada, suspendida en un búfer de
fosfato 100 mM (pH 6,5), y sometido a tratamiento ultrasónico, para
obtener un extracto libre de células. La actividad enzimática de CR
del extracto libre de células fue medida de la siguiente manera. Es
decir 5 mM de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo como sustrato, 0,333 mM NADPH como coenzima,
y la enzima fue añadida a un búfer de fosfato 100 mM (pH 6,5), y la
reducción en la absorción en una longitud de onda de 340 nm fue
medida a 30ºC. Bajo estas condiciones de reacción, la oxidación de 1
\mumol NADPH para NADP en un minuto fue definida como una unidad
de la actividad enzimática. La actividad enzimática de CR por tanto
en el extracto libre de células fue representada como una actividad
específica y comparada con la de un transformante de referencia que
solamente incluye el vector plásmido. También, la actividad
enzimática de CR en el extracto libre de células de Candida
magnoliae IFO 0705 se preparó considerablemente de la misma
manera como se describió en el Ejemplo 1 fue comparada. Los
resultados son mostrados en la Tabla 1 a continuación.
| Expresión de la enzima CR | En E. coli Recombinante |
| Microorganismo | Actividad específica enzima CR (U/mg) |
| HB101 (pUCNT) | 0,12 |
| HB101 (pNTCR) | 3,76 |
| Candida magnoliae IFO 0705 | 0,11 |
Como se ve de la Tabla 1, E. coli HB101
(pNTCR) exhibió un aumento marcado en la actividad de la enzima CR
en comparación con E. coli HB101 (pUCNT), el cual se
transformó usando solamente el vector plásmido y exhibió una
actividad aproximadamente 34 veces mayor a la de Candida
magnoliae IFO 0705.
Fue medida la actividad de GDH de un extracto
libre de células, obtenido por procesado de E. coli HB101
(pNTCRG) recombinante (obtenida en el Ejemplo 5 de la manera
descrita en el Ejemplo 6) de la siguiente manera. Fueron añadidos
glucosa 0,1 M como un sustrato, 2 mM NADP como una coenzima, y la
enzima a un búfer Tris 1 M HCI (pH 8,0), y fue medido un aumento de
la absorción a una longitud de onda de 340 nm a 25ºC. En estas
condiciones de reacción, la reducción de 1 \mumol de NADP en NADPH
en un minuto fue definida como una unidad de la actividad
enzimática. La actividad enzimática de CR también fue medida como en
el Ejemplo 5. La actividad enzimática de CR por lo tanto, medida de
esta manera y la actividad enzimática de GDH en el extracto libre de
células fueron representadas como las actividades específicas y
comparadas con aquellas de E. coli HB101 (pNTCR) y HB101
(pUCNT) de transformantes usando solamente un vector. Los resultados
son mostrados en el Tabla 2 a continuación.
| Expresión Simultánea de la enzima CR y GDH en E. coli recombinante | ||
| Microorganismo | Actividad específica enzima CR (U/mg) | Actividad específica GDH (U/mg) |
| HB101 (pUCNT) | 0,12 | <0,01 |
| HB101 (pNTCR) | 3,76 | <0,01 |
| HB101 (pNTCRG) | 2,16 | 87,8 |
Como se ve en la Tabla 2, E. coli HB101
(pNTCRG) exhibió una actividad enzimática CR y GDH en comparación
con E. coli HB101 (pUCNT) que fue transformada usando
solamente un vector plásmido.
La E. coli HB101 (pNTCR) recombinante que
fue obtenida en el Ejemplo 5 fue inoculada en 50 mL de medio 2xYT
(Bacto tripton 1,6% (p/v), extracto de levadura Bacto 1,0%
(p/v), NaCl 0,5% (p/v), pH 7,0) esterilizado en un matraz Sakaguchi
500 mL, y cultivado con agitación a 37ºC durante 16 horas. Fueron
añadidos 680 unidades de GDH (fabricado por Amano Pharmaceutical
Co., Ltd.), 5,0 g de glucosa, 3,0 miligramos de NADP y 4,5 g de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a 25 mL del cultivo resultante. El cultivo fue
agitado a 30ºC durante 40 horas mientras fue ajustado a pH 6,5 con
una solución acuosa 5 M de hidróxido de sodio. Después de la
reacción, la solución de reacción fue sometida a extracción usando
acetato de etilo, y fue analizado el extracto después de retirado el
solvente. Por consiguiente, fue descubierto que (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
terc-butilo fue producido con un rendimiento de 96,9% La
proporción en exceso del diastereómero de (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo fue 98,2%
La cuantificación de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc -butilo y (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, y la medición de la proporción del
diastereómero de (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo fue ejecutada por cromatografía líquida de
alta resolución (columna: COSMOSIL 5CN-R (4,6 x 250
mm) fabricada por Nacalai Tesque Co., Ltd., eluente: solución 1 mM
fosfato/acetonitrilo = 5/1, velocidad del flujo: 0,7 mL/min,
detección: 210 nm, temperatura columna: 30ºC).
La E. coli HB101 (pNTCRG) recombinante
obtenida en el Ejemplo 4 fue inoculada en 100 mL de medio de 2xYT
(Bacto tripton que 1,6% (p/v), fueron añadidos extracto de levadura
Bacto 1,0% (p/v), NaCl 0,5% (p/v), pH 7,0) esterilizado en un matraz
de Sakaguchi 500 mL, y cultivada con agitación a 37ºC durante 16
horas, 5,0 g de glucosa, 1,5 mg de NADP, y 5,0 g de
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a 25 mL del cultivo resultante. El cultivo
fue agitado a 30ºC durante 24 horas mientras fue ajustado a pH 6,5
con una solución acuosa de hidróxido de sodio 5 M. Después de la
reacción, la solución de reacción fue sometida a extracción usando
acetato de etilo y fue analizado el extracto después de la retirada
del solvente. Como resultado, fue encontrado que (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo fue producido con un rendimiento de 97,2% La
proporción en exceso del diastereómero de (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc -butilo fue 98,5%.
Es posible clonar genes de polipéptidos que
tengan actividad enzimática para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a terc-butilo (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
asimétricamente, y obtener transformantes que tiene un alto nivel de
capacidad para producir polipéptidos analizando las secuencias de
nucleótido de los genes. Más, adicionalmente es posible obtener en
gran parte transformantes capaces de producir polipéptidos y glucosa
dehidrogenasa simultáneamente. Además, usando los transformantes es
posible sintetizar (3R,
5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo a partir de
(s)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo.
<110> KANEKA Corporation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva carbonil-enzima
reductora, un gen que la codifica y su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> TKS-4025
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Solicitud de patente japonesa
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2. 1. 2. 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida magnoliae IFO 0705
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2 <211> 726 <212>
DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida magnoliae IFO 0705
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Primer Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacngcngayc aracygayaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Primer Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgaattct aaggaggtta acaatgtata aagatttaga agg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Primer Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido
que tiene una actividad enzimática para reducir asimétricamente el
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo a
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, en el que el polinucleótido es seleccionado
entre el grupo que consta de:
(a) Polinucleótidos que codifican un polipéptido
que comprenden la secuencia de aminoácidos representados por el Nº
de ID de SEQ: 1 en el listado de secuencias;
(b) Polinucleótidos que comprenden la secuencia
de nucleótidos del Nº de ID de SEQ: 2 en el listado de secuencias;
y
(c) Polinucleótidos que hibridizan con las
secuencias de nucleótidos representadas por el Nº de ID de SEQ: 2 en
el listado de secuencias en condiciones severas.
2. Un vector de expresión que incluye un
polinucleótido según la reivindicación 1.
3. El vector de expresión según la reivindicación
2, en el que el vector de expresión es pNTCR plásmido como está
contenido en la cepa E. coli depositada como
BP-6897 FERM.
4. El vector de expresión según la reivindicación
2, que incluye adicionalmente un polinucleótido que codifica un
polipéptido tiene una actividad de glucosa dehidrogenasa.
5. El vector de expresión según la reivindicación
4, en la que el polipéptido que tiene una actividad de glucosa
dehidrogenasa es una glucosa dehidrogenasa obtenida del bacilo
megaterium.
6. El vector de expresión según la reivindicación
5, en la que el vector de expresión es pNTCRG plásmido como está
contenido en la cepa de E. coli, depositada como
BP-6898 FERM.
7. Un transformante obtenido transformando una
célula hospedera usando un vector de expresión según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 6.
8. El transformante según la reivindicación 7, en
la que la célula hospedera es Escherichia coli.
9. El transformante según la reivindicación 8, en
la que el transformante es E. coli HB101 (pNTCR) (FERM
BP-6897).
10. El transformante según la reivindicación 8,
en la que el transformante es E. coli HB101 (pNTCR) (FERM
BP-6898).
11. Un polipéptido codificado por un
polinucleótido de la reivindicación 1.
12. Un método para producir
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo, que comprende los pasos de hacer reaccionar
un transformante según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a
10, o un producto suyo procesado, con
(S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato
de terc-butilo, y obtener el
(3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato
de terc-butilo producido.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que el paso reaccionante es llevado a cabo en presencia de una
coenzima que restaura el sistema.
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Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60336324D1 (de) * | 2002-08-09 | 2011-04-21 | Codexis Inc | Enzymatische verfahren zur herstellung 4-substituierter 3-hydroxybuttersäure-derivate |
| WO2004052829A1 (ja) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Kaneka Corporation | 光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法 |
| US7541171B2 (en) * | 2003-08-11 | 2009-06-02 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| WO2005017141A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-02-24 | Codexis, Inc. | Improved halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| KR20060071397A (ko) * | 2003-08-11 | 2006-06-26 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 4-치환된 3-히드록시부티르산 유도체 및 이웃자리 시아노,히드록시 치환된 카르복실산 에스테르의 효소적 제조 방법 |
| CA2535147A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-05-19 | Codexis, Inc. | Improved glucose dehydrogenase polypeptides and related polynucleotides |
| CA2533838A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-02-24 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides |
| US7588928B2 (en) * | 2003-08-11 | 2009-09-15 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| DE10345772A1 (de) * | 2003-10-01 | 2005-04-21 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol |
| WO2006046455A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Kaneka Corporation | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 |
| DE102005044736A1 (de) | 2005-09-19 | 2007-03-22 | Basf Ag | Neue Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen |
| AT503017B1 (de) | 2005-12-19 | 2007-07-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen |
| US8304216B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-11-06 | Kaneka Corporation | Method for production of erythro-or threo-2-amino-3-hydroxypropionic acid ester, novel carbonyl reductase, gene for the reductase, vector, transformant, and method for production of optically active alcohol using those |
| US7879585B2 (en) | 2006-10-02 | 2011-02-01 | Codexis, Inc. | Ketoreductase enzymes and uses thereof |
| AT504542B1 (de) * | 2006-12-07 | 2008-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten |
| US7820421B2 (en) | 2007-02-08 | 2010-10-26 | Codexis, Inc. | Ketoreductases and uses thereof |
| JP2010536385A (ja) * | 2007-08-24 | 2010-12-02 | コデクシス， インコーポレイテッド | （ｒ）−３−ヒドロキシチオランの立体選択的生成のための改善されたケトレダクターゼポリペプチド |
| WO2009036404A2 (en) | 2007-09-13 | 2009-03-19 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the reduction of acetophenones |
| TWI601825B (zh) * | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| JP2010539948A (ja) * | 2007-09-28 | 2010-12-24 | コデクシス， インコーポレイテッド | ケトレダクターゼポリペプチドおよびその使用 |
| SI2205727T1 (sl) | 2007-10-01 | 2015-09-30 | Codexis, Inc. | Polipeptidi ketoreduktaze za izdelavo azetidinona |
| US8426178B2 (en) | 2008-08-27 | 2013-04-23 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| WO2010027710A2 (en) * | 2008-08-27 | 2010-03-11 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides and uses thereof |
| US8288141B2 (en) | 2008-08-27 | 2012-10-16 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| EP2329014B1 (en) | 2008-08-29 | 2014-10-22 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4s)-3[(5s)-5(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one |
| EP2379713A4 (en) * | 2008-12-18 | 2013-07-10 | Codexis Inc | RECOMBINANT HALOHYDRIN DEHALOGENASE POLYPEPTIDES |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| WO2010150946A1 (en) * | 2009-06-22 | 2010-12-29 | Sk Holdings Co., Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (r)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| SG177331A1 (en) | 2009-06-22 | 2012-02-28 | Codexis Inc | Ketoreductase-mediated stereoselective route to alpha chloroalcohols |
| ES2575560T3 (es) | 2009-08-19 | 2016-06-29 | Codexis, Inc. | Polipéptidos cetorreductasa para preparar fenilefrina |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| US9080192B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-07-14 | Codexis, Inc. | Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system |
| US9040262B2 (en) | 2010-05-04 | 2015-05-26 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| DK2639216T3 (en) | 2010-11-09 | 2018-09-24 | Kaneka Corp | Halogenated Indones and Methods for Preparation of Optically Active Indanones or Optically Active Indanols Using These |
| CN102676596A (zh) * | 2011-03-16 | 2012-09-19 | 苏州国镝医药科技有限公司 | 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7 |
| WO2013074650A1 (en) | 2011-11-18 | 2013-05-23 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for the preparation of hydroxy substituted carbamates |
| TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
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| WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
| DE102012017026A1 (de) | 2012-08-28 | 2014-03-06 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Sensor für NADP(H) und Entwicklung von Alkoholdehydrogenasen |
| KR101446551B1 (ko) | 2013-02-26 | 2014-10-06 | 주식회사 아미노로직스 | (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법 |
| JP6480416B2 (ja) | 2013-03-27 | 2019-03-13 | アニッキ ゲーエムベーハーＡｎｎｉｋｋｉ Ｇｍｂｈ | グルコースの異性化のための方法 |
| EP3134519B1 (en) | 2014-04-22 | 2018-06-06 | c-LEcta GmbH | Ketoreductases |
| CN104328148A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-02-04 | 尚科生物医药（上海）有限公司 | 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯 |
| EP3256577B1 (en) | 2015-02-10 | 2020-08-26 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the synthesis of chiral compounds |
| CN104830921B (zh) * | 2015-04-27 | 2019-07-02 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法 |
| CN105087685A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种合成（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 |
| CN105087684A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN106011092A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-10-12 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法 |
| CN106011095B (zh) * | 2016-07-27 | 2021-02-26 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法 |
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| CN108441523A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-24 | 南京工业大学 | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN110387359B (zh) * | 2018-04-17 | 2021-04-20 | 湖州颐盛生物科技有限公司 | 羰基还原酶突变体及其应用 |
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| CN114875081A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-09 | 湖北迅达药业股份有限公司 | 一种瑞舒伐他汀关键中间体的绿色工业化生产方法 |
| CN120981566A (zh) | 2023-01-12 | 2025-11-18 | 诺华股份有限公司 | 工程化酮还原酶多肽 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278313A (en) * | 1992-03-27 | 1994-01-11 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Process for the preparation of 1,3-dioxane derivatives useful in the preparation of HMG-COA reductase inhibitors |
| GB9512837D0 (en) | 1995-06-23 | 1995-08-23 | Zeneca Ltd | reduction of ketone groups |
| ES2207202T3 (es) * | 1998-04-30 | 2004-05-16 | Kaneka Corporation | Procedimiento para producir derivados de acido 6-cianometil-1, 3-dioxano-4-acetico. |
| CN1162422C (zh) * | 1998-08-05 | 2004-08-18 | 钟渊化学工业株式会社 | 制备光学活性的2－[6－(羟甲基)－1,3－二噁烷－4－基]乙酸衍生物的方法 |
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