DE69020979T2

DE69020979T2 - Neue Arginin-Deiminase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ein Antikrebsmittel, das dieses Enzym als wirksamen Bestandteil enthält.

Info

Publication number: DE69020979T2
Application number: DE69020979T
Authority: DE
Inventors: Miho Aoshima; Kaoru Miyazaki; Haruo Takaku
Original assignee: Japan Energy Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1990-08-02
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2010-08-03
Also published as: JP2900279B2; IE62120B1; ATE125295T1; IE902771A1; NO903398D0; DE69020979D1; NO178734C; CA2022177C; PT94882A; PT94882B; US5474928A; EP0414007A2; CA2022177A1; FI903826A0; ES2078277T3; NO178734B; EP0414007B1; EP0414007A3; DK0414007T3; JPH03164173A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Arginin- Deiminase und ihr Herstellungsverfahren. Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Antikrebsmittel, das diese Arginin-Deiminase als wirksamen Bestandteil enthält.

Beschreibung des Standes der Technik

Vor kurzem ist steigende Aufmerksamkeit auf den neuen Versuch konzentriert worden den Krebs, unter Verwendung von Enzymen auf der Grundlage des Erfordernisses der Ernährung der Krebszellen zu heilen. Mit anderen Worten, diese Behandlung versucht das Wachstum der Krebszellen zu inhibieren oder sie zu nekrotisieren, indem die Nahrung, die von den Krebszellen gebraucht wird, zersetzt wird und so die Nahrungquelle aus der Reichweite der Krebszellen zu verdrängen. Unter diesen Antitumorenzymen, sind L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) [siehe Nature, 229, 168 (1971)] und Arginase (EC 3.5.3.1) [Br. J. Cancer 19, 379 (1965)] bekannt. Jedoch ist L-Asparaginase nur gegen ein paar Arten von Krebs wie Leukämie und malignen Lymphoma wirksam, weil eine geringe Zahl von Krebsarten von L- Asparaginase abhängig ist, während Araginase bei Antikrebsaktivitäten in vivo versagt, obwohl sie inhibierende Aktivitäten gegen das Wachstum von einer Vielfalt von Krebszellen in vitro zeigt [Br. J. Cancer, 30, 50 (1974)].
Außerdem, obwohl berichtet worden ist, daß Arginin-Deiminase aus Mykoplasma und anderen Mikroorganismen erhältlich ist [J. Biol. chem., 241, 2228-2236 (1966), ibid., 252, 2615-2620 (1987), ibid., 250, 4580-4583 (1975), Arch. Biochem. Biophys. 69, 186-197 (1957), etc.], hat kein Bericht die Antikrebs- Aktivität diese Enzyms erwähnt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine neue Arginin- Deiminase zur Verfügung zu stellen. Eine andere Aufgabe ist es ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Arginin-Deiminase aus Mykoplasma zur Verfügung zu stellen. Des weiteren ist es eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Antikrebsmittel, das Arginin-Deiminase als wiksamen Bestandteil enthält, zur Verfügung zu stellen.
Die gegenwärtigen Erfinder erforschten viele neue Arten von Arginin-Deiminase, die aus Pseudomonas, Streptococcus, Mykoplasma und andere Mikroorganismen herleitbar sind. Als Ergebnis wurde die vorliegende Erfindung vollendet, als gefunden wurde, daß ein Zellextrakt von Mykoplama Arginin- Deiminase enthält, die ihren bestmöglichen pH im physilogischen Bereich hat, eine hohe Stabilität zeigt und folglich stark inhibierende Aktivitäten gegen das Wachstum der Krebszellen zeigt.
Arginin-Deiminase (EC 3.5.3.6.) ist ein Enzym, das eine Amidinogruppe von L-Arginin in L-Citrullin und Ammoniak hydrolysiert und es wird mit dem allgemeinen Namen der Arginindihydrolase bezeichnet. Das resultierende L-Citrullin wird in Ornithin und Carbamoylphosphat zerlegt und dieses Carbamoylphosphat wird weiter in Ammoniak und Wasser zerlegt. ATP wird in diesem Prozeß hergestellt. Mit anderen Worten die Arginin-Deiminase ist ein Enzym, das mit dem ersten Schritt des Weges verbunden ist, der zur Herstellung von ATP in Verbindung mit dem Metabolismus der Amidinogruppen des Arginins in Bakterien und Hefen führt.
Die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase stammt vom Mykoplasma ab und hat folgende physikochemische Eigenschaften:
(a) Funktion
Hydrolysiert die Amidinogruppen des L-Arginin in L-Citrullin und Ammoniak.
(b) pH-Optimum: 6,0 - 7,5
(c) Stabiler pH: 4,5 - 9,0
(d) Temperaturoptimum: Ungefähr 50ºC
(e) Km Wert: Ungefähr 0,2 mM
(f) Isoelektrischer Punkt (PI) : Ungefähr 4,7
(g) Molekulargewicht: Ungefähr 45000
(mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoreseverfahren)
Ungefähr 90000
(mittels Gelfiltrations-HPLC-Verfahren)
(h) N-terminale Aminosäureseguenz Ser-Val-Phe-Asp-Ser-Lys-Phe- Lys-Gly-Ile-His-Val-Tyr-Ser-Glu-
Auch die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase enthält die Aminosäuresequenz, die in Figur 4 gezeigt wird.
Die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase wird aus Mykoplasma mittels des folgenden Verfahrens hergestellt:
Jedes Mykoplasma, das eine Fähigkeit hat die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase herzustellen, kann verwendet werden. Diese Arten von Mykoplasma schließen M. arginini, M. hominis, M. salivarium, M. gallinarum und M. orale ein. Der am besten geeignete Stamm ist der M. arginini (IFO Katalog Nr. 14476, ATCC Katalog Nr. 23838 oder NCTC Katalog Nr. 10129) erhältlich vom Institute of Fermentation, Osaka, ATCC oder NCTC.
In der vorliegenden Erfindung wird das obige Mykoplasma in einem flüssigen Medium, wobei Arginin hinzugefügt wird, bei einer Temperatur von ungefähr 37ºC für einen oder mehrere Tage unter stehender Bedingung, kultiviert. Dieses Mykoplasma ist ein fakultativ anaerobes Bakterium und kann unter einer anaeroben Bedingung oder in der Gegenwart von Sauerstoff gezüchtet werden. Eine PPLO Fleischbouillon oder ähnliches wird verwendet und Arginin wird zu dem Medium in einem Verhältnis von 1 - 10 g zu 1 Liter des Mediums hinzugefügt.
Nach der Kultivierung werden die Zellen gesammelt, dann werden sie in einer Pufferlösung suspendiert, zum Beispiel eine Phosphatpufferlösung und sie werden auseinandergerissen mittels derartiger Mittel wie der Sonifikation; schließlich werden die Präzipitate mittels zentrifugaler Trennung oder einem ähnlichen Verfahren entfernt. Die überstehende Lösung wird so als Zellextraktion erhalten, die einem Verfahren der Reinigung mittels Chromatographie, wie einer Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder ähnlichem, unterzogen wird. Als Ergebnis wird eine Arginin-Deiminase, die die oben erwähnten physikochemieschen Eigenschaften hat, erhalten.
Die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase ist klar verschieden von den bekannten Arten der Arginin-Deiminase über die in verschiedener Literatur berichtet wird, wie in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Referenz (vorliegende Erfindung) Archives of Biochemistry and Biophysics 69, 186-197 (1957) Quelle Molekulargewicht isoelectrischer Punkt Vmax Optimaler pH N-Terminale Aminosäure M. arginini SDS-PAGE Gelfiltration M. arthritidis nicht bekannt M. hominis Pseudomonas putida Streptococcus faecalis
Des weiteren wurde die Homologiesuche zwischen der N- Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Arginin-Deiminase und den eingetragenen Proteinen in der Computerdatenbank durchgeführt, aber es wurde gefunden, daß kein Protein eine Aminosäuresequenz hat, die ähnlich zu der ist, die erfindungsgemäß erhalten wurde. Aus diesen Gründen ist geschlossen worden, daß die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase eine neue Arginin-Deiminase ist.
Zusätzlich wurde bei der vorliegenden Erfindung ein Versuch gemacht, um das Gen der Arginin-Deiminase von M. arginini aus der Genom DNA von M. arginini zu klonen.
Mittels DNA-Sequenzanalyse des geklonten Gens wurde eine Nukeotidsequenzkodierung für die Arginin-Deiminase bestimmt, wie in Figur 4 dargestellt. Demgemäß wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase 409 Aminosäuren enthält und ein Molekulargewicht von 46375 hat, beinahe mit dem Molekulargewicht der Proteine identisch ist, die mittels SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese erhalten werden.
Wie mit den Versuchen 1 bis 6 gezeigt, zeigt die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase eine ausgezeichnete Wirkung der Verlängerung des Lebens von Mäusen, die derartige Krebszellen wie Leukämiezellen, Fibrosarkomazellen und Dickdarmkrebszellen und ähnliche tragen. Aus diesem Grund ist es offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Arginin-Deiminase wirksam bei der Behandlung von einer Vielfalt an Tumoren ist, insbesondere malignen Tumoren bei Menschen.
Die Aktivität der Arginin-Deiminase kann bestimmt werden, indem sie veranlaßt wird Citrullin, unter Verwendung des Verfahrens, das von Fenske et. al [J. Bacteriol. 126, 501-510 (1976) berichtet wird, herzustellen und die Menge der Ausbeuten wird unter Verwendung des Verfahrens, das von Archibals [J. biol. Chem. 156, 121-142 (1944)] erhalten wurde, gemessen.
Insbesondere werden 20 ul Arginin-Deiminase-Lösung zu 1,0 ml 10 mM Arginin (gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,0 gelöst) hinzugefügt, dann wird einer Enzymreaktion erlaubt bei 37 ºC für 10 Minuten abzulaufen und die Reaktion wird beendet, indem 1 ml einer gemischten Säurelösung (H&sub2;SO&sub4; : H&sub3;PO&sub4; = 1 : 3) hinzugefügt wird. Dann werden der erhaltenen reaktiven Lösung 25 ul einer 3% wäßrigen Diacetylmonooximlösung hinzugefügt, auf 100 ºC für 20 Minuten unter lichtgeschützten Bedingungen erwärmt und bei Raumtemperatur 30 min abkühlen gelassen und dann wird die Menge der Citrullinausbeute quantitativ gemessen, indem die Extinktion bei 490 nm gemessen wird. Die Aktivität der Arginin-Deiminase, die 1 umol Citrullin in einer Minute herstellt, wird als 1 Einheit definiert.
Hinsichtlich einer akuten Toxizität der Arginin-Deiminase, gab es keinen Fall des Todes einer Maus wegen der Verabreichung von nicht mehr als 1 mg/Maus der Arginin-Deiminase oral oder intravenös in den Schwanz. Weiter zeigte die Sezierung der Tiere, die etwas verabreicht bekommen haben, keine Unregelmäßigkeiten an ihren Organen, so wurde die hohe Sicherheit der Arginin-Deiminase bestätigt.
Die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase kann mittels Injektion (subkutane Injektion, intravenöse Injektion oder arterielle Injektion etc.) in einer Vielfalt von pharmazeutischen Zubereitung und Formulierungen verabreicht werden. Sie kann auch in Kombination mit einem anderen pharmazeutisch aktiven Bestandteil, Träger und/oder Hilfsstoff verwendet werden.
Eine Vielfalt von Zubereitungsformen sind zulässig, wie Suspension, Flüssigkeit, Emulsion, Ampulle und andere Injektionsformen. Das erfindungsgemäße Mittel kann mittels jedes bekannten Mittels der pharmazeutischen Zubereitung hergestellt werden.
Wie die Dosierung der erfindungsgemäßen Arginin-Deiminase gemäß individueller Abweichung, Krankheitsbedingungen und ähnlichem variiert, kann die Arginin-Deiminase in einer Menge von 0,1 - 100 mg/1kg des menschlichen Körpergewichts pro Tag verabreicht werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt ein Gelfiltrationschromatogramm des erfindungsgemäßen M. arginini-Zellextrakts, Figur 2 ein Ionenaustauschchromatogramm der Fraktionen 42 - 52 davon und Figur 3 ein Affinitätschromatogramm der Fraktionen 50 - 53 davon. Figur 4 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz der Arginin-Deiminase und die Nukleotidsequenz, die das Enzym codiert. Figur 5 bis Figur 8 zeigen die Nukleotidsequenz und der Aminosäuresequenz dafür des Oligonukleotids, das als Sonden verwendet wird.

Detailierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen.

Beispiele der vorliegende Erfindung werden unten gezeigt.

Beispiel 1

Herstellung der Arginin-Deiminase

(1) Kultivierung von M. arginini

Ein Stamm von M. arginini (IFO Catalog Nr. 14476), der vom Institute of Fermentation, Osaka erhalten wurde, wurde in ein flüssiges Medium (zusammengesetzt aus 21 g an PPLO-Bouillon w/o CV (Difco), 10 g L-Arginin, 200 ml Pferdeserum, 100 ml 25% frisch hergestellten Hefeextrakt, 5 ml von 0,4 % Phenolrot- Lösung und 700 ml destilliertem Wasser und auf einen pH von 7,0 eingestellt) geimpft und dann in einem 5 % CO&sub2; Inkubator bei 37 ºC 2 Tage unter stehnder Bedingung kultiviert.

(2) Trennung und Reinigung von Arginin-Deiminase

(A) Herstellung des M. arginini-Zellextrakts

2 g M. arginini-Zellen wurden mittels Zentrifugierens von 2 Liter des flüssig Mediums, das gemäß dem obigen (1) Schritt erhalten wurde, bei 7000 U/min für 20 min getrennt. Diese M. arginini-Zellen wurden in 30 ml 10 mM Phosphatpuffer von pH 7,0 suspendiert. Die Zellen, die in dieser Suspension enthalten sind, wurden dann mittels Sonifikation zerrissen und die unlösliche Materie wird mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Schließlich wurde der Überstand als M. arginini- Zellextrakt erhalten.

(B) Die Reinigung der Arginin-Deiminase

Arginin-Deiminase wurde aus dem M. arginini-Zellextrakt gereinigt, der in dem obigen (A) Schritt erhalten wurde, indem die folgenden drei verschiedenen Arten der Chromatographie angewendet wurden.

i) Gelfiltrations-Chromatographie

Der obige M. arginini-Zellextrakt wurde bei einer Gelfiltrations-Chromatographie unter der folgenden Bedingung, unter Verwendung von Cellulofine CGL-2000m [Chisso Corporation], eingesetzt
Säulengröße: 2,6 x 90 cm
Volumen des Gels: 480 ml
Fließgeschwindigkeit: 24 ml/h
Volumen der Fraktion 6 ml jede
Eluent: 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), + 0,5 M Natriumchlorid
Die Extinktion bei 280 nm und die Arginin-Deiminase-Aktivität von jeder so erhaltenen Fraktion wurden, mittels der zuvor erwähnten Verfahren, gemessen und die Ergebnisse waren, wie in Figur 1 gezeigt. Es wurde gefunden, daß die Arginin-Deiminase in den Fraktionen 42 - 52 enthalten war.

ii) Ionenaustausch-Chromatographie

Die Fraktionen 42 - 52, die in dem obigen i) Schritt erhalten wurden, wurden 24 Stunden gegen einen 10 mM Phophatpuffer dialysiert. Dann wurde die innere dialysierte Lösung bei einer Ionenaustausch-Chromatographie unter der folgenden Bedingung, unter Verwendung von DEAE-Toyopearl [Toso Co.], eingesetzt:
Säulengröße: 2,6 x 30 cm
Volumen des Gels: 320 ml
Fließgeschwindigkeit: 60 ml/h
Volumen der Fraktion 10 ml jede
Eluent: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) (linearer Gradient des Natriumchlorids von 0 bis 0,5M)
Mit anderen Worten, es wurden die dialysierten Fraktionen, die Arginin-Deiminase enthalten, zu einer DEAE-Toyopearl-Säule hinzugefügt, mit demselben Puffer equilibriert, der bei der Dialyse verwendet wurde, um Arginin-Deiminase zu absorbieren und 10 ml von jeder Fraktion wurde mittels Elution unter der Bedingung eines linearen Gradienten der Natriumchlorid- Konzentration von 0 M bis 0,5 M in dem Puffer, bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/h, gesammelt.
Wie in dem obigen i) Schritt wurde die Extinktion bei 280 nm und die Arginin-Deiminase-Aktivität von jeder Fraktion gemessen und die Ergebnisse waren wie in Figur 2 gezeigt. Es wurde gefunden, daß die Arginin-Deiminase in den Fraktionen 50 - 53 enthalten war.

iii) Affinitäts-Chromatographie

Die Fraktionen 50 - 53, die in dem obigen ii) Schritt erhalten wurden, wurden 24 Stunden gegen einen 10 mM Kaliumphosphatpuffer dialysiert. Dann wurde die dialysierte Lösung bei einer Affinitäts-Chromatographie unter der folgenden Bedingung, unter Verwendung einer Arginin-Sepharose 48 [Pharmacia Co.], eingesetzt:
Säulengröße: 2,2 x 10 cm
Volumen des Gels: 38 ml
Fließgeschwindigkeit: 50 ml/h
Volumen der Fraktion 8 ml jede
Eluent: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) (linearer Gradient des Natriumchlorids von 0 bis 1,0M)
Mit anderen Worten, es wurden die dialysierten Fraktionen, die Arginin-Deiminase enthalten, zu einer Arginin-Sepharose-Säule hinzugefügt, mit demselbben Puffer equilibriert, der bei der Dialyse verwendet wurde, um Arginin-Deiminase zu absorbieren und 8 ml von jeder Fraktion wurde mittels Elution unter der Bedingung eines linearen Gradienten der Natriumchlorid- Konzentration von 0 M bis 1,0 M in dem Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/h gesammelt.
Wie in dem obigen ii) Schritt wurde die Extinktion bei 280 nm und Arginin-Deiminase-Aktivität von jeder Fraktion gemessen und die Ergebnisse waren wie in Figur 3 gezeigt. Es wurde gefunden, daß die Arginin-Deiminase in den Fraktionen 71 - 81 enthalten war.

iv) SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Die Fraktionen 71 - 81, die in dem obigen iii) Schritt erhalten wurden, wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese gemäß dem Verfahren, das von Laemmli et al. [Nature, 727, 680-685 (1970)] berichtet wurde, analysiert. Die Reinigung der Arginin-Deiminase wurde bestätigt als eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 45000 beobachtet wurde.

(C) Physikochemisch Eigenschaften der Arginin-Deiminase

Die folgenden Messungen wurden mit der Enzymlösung gemacht, die in dem obigen (B) iii) Schritt erhalten wurde:

i) pH-Optimum, Temperaturoptimum, stabiler pH und stabile Temperatur.

Der bestmögliche pH-Bereich beträgt 6,0-7,5 und der stabile pH-Bereich, wenn sie bei 4ºC 24 Stunden behandelt wird, beträgt 4,5-9,0. Die höchste Aktivität wird in einem Temperaturbereich von 45-55 ºC erhalten und bezüglich der Stabilität gegenüber Temperatur, wird die Aktivität vollständig bei einer Behandlung von 95 ºC für 5 Minuten oder bei 60 ºC für 30 Minuten verloren.

ii) Substratspezifität

Die Arginin-Deiminase hydrolysiert L-Arginin, um L-Citrullin und Ammoniak herzustellen.

iii) Molekulargewicht

Die Messung mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese weist auf ein Molekulargewicht von ungefähr 45000 hin.
Messung mittels Gelfiltrations HPLC-Verfahren, unter Verwendung einer TSK G3000SWXL [Toso Co.] weist auf ein Molekulargewicht von ungefähr 90000 hin.

iv) Isoelektrischer Punkt

Die Messung des isoelektrischen Punktes mittels der Elektrofokussierung weist auf einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 4,7 hin.

v) Km Wert und Vmax

Mittels der Lineweaver-Burk-plot-Analyse wurden Km und Vmax als 0,2 mM und beziehungsweise 50 E/mg bestimmt.

vi) Die Aminosäuresequenz vom N-terminal wurde mittels eines Peptidsequenzer [Applied Biosystem Co.] wie folgt bestimmt:

Ser-Val-Phe-Asp-Ser-Lys-Phe-Lys-Gly-Ile-His-Val-Tyr-Ser-Glu-

vii) Biologische Aktivität

Die Arginin-Deiminase zeigt eine inhibierende Aktivität gegen das Wachstum der Krebszellen in vitro und weist auf eine ausgezeichnete Wirkung der Verlängerung des Lebens von krebstragenden Mäusen in vivo hin.

Beispiel 2

(1) Herstellung von einer Mykoplasmagenom-DNA

M. arginini [IFO Katalog Nr. 14476] wurde mittels SDS aufgelöst (lysed) und dann wurde es mittels Protinase K und dann mittels RNase A behandelt. Dann wurde die Lösung mit Phenol und dann mit Chloroform extrahiert; schließlich wurde Genom-DNA mittels Dialysierens der resultierenden wässrigen Schicht gegen 10 mM Tris-Salzsäure (pH 8,0) in 1 mM EDTA hergestellt.

(2) Herstellung der Mykoplasmagene-Bibliothek

Die Mykoplasmagenom-DNA wurde in dem obigen (1) Schritt mittels geeigneter Restriktionsenzymen verdaut, dann wurde sie in einen Plasmidvektor pUC19 [Toyobo Co.] eingesetzt; schließlich wurde dieser Vektor in E. coli HB101 [gekauft als fähige Zellen von Takara Shuzo Co.] eingeführt, um eine Mykoplasmagene-Biblothek bereitzustellen.

(3) Entwurf und Synthese des Oligonukleotids für die Hybridisationssonde.

Es wurde kürzlich berichtet, daß die DNA des Mykoplasma nur eine geringe Menge an GC [Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 166-169 (1987)] enthält. Im Hinblick auf diese Erkenntnisse wurde ein Oligonukleotid, das 24 Basen (eine Mischung von 4 Arten und siehe Figur 5 bis 8 für ihre Sequenz) hat, aus der N- terminalen Aminosäuresequenz der Arginin-Deiminase entwickelt und mittels eines DNA-Synthesizer [ABI Model 308 B] synthetisiert.

(4) Screening mittels Kolonie-Hybridisation

Das Oligonukleotid, das in dem obigen Schritt (3) synthetisiert wurde, wurde mittls 32p markiert und als Sonde für das Screening der Mykoplasmagen-Bibliothek verwendet, in dem (2) Schritt hergestellt. Somit wurden positive Klone isoliert.

(5) Bestimmung der Nukleotidsequenzen

Plasmid DNA wurde aus den Klonen in dem obigen (4) Schritt und das DNA-Fragment erhalten, das mit der Sonde hybridisiert wird, wurde in M13mplg [Toyobo Co.] integriert. Unter Verwendung des Dideoxyverfahrens, wurde die Nukleotidsequenz für beide Stränge des geklonten Gens bestimmt. Die Ergebnisse werden in Figur 4 gezeigt.
Ein 1230 bp offen zu lesender Rahmen, der eine Nukleotidsequenz einschließt, die das N-terminale codiert, wurden 30 Aminosäuresequenzen der Arginin-Deiminase in dem geklonten Gen gefunden und die 1227 bp Gene, gefolgt von dem Initialcodon ATG, wurden als das Arginin-Deiminase-Gen des M. arginini (siehe Figur 4) identifiziert. Da es bekannt ist, daß der TGA-Codon als Tryptophancodon im Mykoplasma erkannt worden ist [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 2306-2309 (1985), wurden die TGA-Codons, die in 5 verschieden Positionen in den Arginin- Deiminase-Genen existieren, als Tryptophan-Codons angesehen und die Analyse wurde duchgeführt in der Annahme, daß es nur 2 Terminationscodons gibt, TAA und TAG.
Das Molekulargewicht, das sich von den gesamten 409 Aminosäuren ableitet, betrug 46375, was fast identisch mit dem Molekulargewicht ist, das mittels der Protein-SDS- Polyacylamidgelelektrophorese erhalten wird.

Beispiel 3

Herstellung der formulierten Arginin-Deiminase

Die Fraktionen 71-81, die im Beispiel 1 (2) iii) Schritt erhalten wurden, wurden 24 Stunden gegen eine Phosphat gepufferte Saline (PBS) (pH 7,4) dialysiert und das dialysierte Produkt wurde mittels (PBS) in einer 0,2 - 2,0 mg/ml Lösung gelöst. Dann wurde die Lösung mittels Filtration mit einem 0,2 um Filter sterilisiert, um eine Arginin- Deiminase-Zubereitung von der Art einer wäßrige Lösung herzustellen.

Beispiel 4:

Expression der Arginin-Deiminase mittels Transformant

(1) Herstellung des Mutant-Gens

Gemäß dem Kunkel Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488 (1985) wurde eine Punktmutation durchgeführt, um alle von den 5 TGA-Codons des Arginin-Deiminase-Gens (gezeigt in Figur 4) mittels TGG-Codons zu ersetzen, die die Tryptophancodons der E. Coli sind, unter Verwendung von 5 verschiedenen Typen des Oligonucleotid als Primer. Sodann wurden Klone, bei denen alle der 5 TGA-Codons durch TGG-Codons ersetzt worden sind mittels des Plaquehybridisierungsverfahren, unter Verwendung des obigen Oligonucleotids als Sonde, ausgewählt. Die ausgewählten Klone wurden sequenziert, um sicher zu gehen, daß alle der 5 TGA-Codone durch TGG-Codone ersetzt wurden.

(2) Herstellung des Arginin-Deiminase-Expressionsvektors (pAD 12)

Das Plasmid pAD 12 wurde hergestellt, indem in die Sac I-Hind III Seite des Plasmids pVC 19 Gene eingesetzt wurden, die die Strukturgene und Regulatorgene 240 bq aufwärts davon von den mutierten Arginin-Deiminasegenen enthalten, die im obigen (1) Schritt erhalten wurden. Es wurde gefunden, daß das resultierende Plasmid pAD 12 eine Promotersequenz der Mykoplasma-Arginini-Arginin-Deiminase hat und eine Analyse der Basensequenz des pAD 12 weist auf die Anwesenheit der Konsensussequenz (SD, -10, -35 Sequenz) des prokaryotischen Zellpromotors hin. Daher wurde es als möglich angenommen, daß das Plasmid pAD 12 als eine Vektor exprimierende Arginin- Deiminase von E. Coli. dient.

(3) Kultivierung von Transformanten und Herstellung des Zellextrakts.

Das pAD 12, das in dem obigen (2) Schritt hergestellt wurde, wurde in E. Coli HB 101 (Takara Shuzo Co.) eingeführt und der resultierende Transformant wurde über Nacht bei 37 ºC in einem 5 ml LB Medium [1,0% Bacto Tryptone (DIFCO Co.), 0,5% Bacto Hefeextrakt (DIFCO Co.), 0,2% Glukose, 1,0% NaCl, pH 7,5] kultiviert. Sodann wurde 1 ml des Kulurmediums zu 250 ml des LB Mediums hinzugefügt, um über Nacht bei 37 ºC kultiviert zu werden. Die Zelle, die aus der Kultur mittels Zentrifugierens gesammelt worden war, wurde zweimal mit einer physilogischen Saline gewaschen und in 2 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Sodann wurden die Zellen mittels Sonifikation zerrissen und der Überstand wurde, nach der Entfernung der unlöslichen Bestandteile mittels Zentrifugierens, als Zellextrakt erhalten. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, um einen Zellextrakt von E. Coli HB 101, der das pUC 19 behält, das nicht die Arginin-Deiminasegene enthielt, herzustellen. Dieser Extrakt wurde als Kontrolle verwendet.

(4) Messung der Arginin-Deiminaseaktivität

Der HB 101 Zellextrakt, der die pAD 12 bewahrt und der HB 101 Zellextrakt, der die pUC 19 (Kontrolle) bewahrt, die beide in dem Schritt (3) erhalten wurden, wurden 10-Mal mit einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt und 10 ul von jeder resultierenden Lösung wurden bei 37 ºC 5 Stunden lang inkubiert. Sodann wurde die Menge der Citrullinausbeute mittels des oben erwähnten Verfahrens bestimmt. Die Menge der Arginin-Deiminase-Expression in dem HB 101, das pAD 12 bewahrt, wurde aus dem Unterschied zwischen der Menge der Citrullinausbeute in dem HB 101, das pAD 12 bewahrt und dem in dem HB 101, das pUC 19 bewahrt, berechnet. Das Ergebnis deutet auf 1,2 Einheiten Arginin-Deiminaseaktivität für jede 250 ml des LB Mediums hin. Des weiteren werden die Testergebnisse, die die Antikrebswirkungen der erfindungsgemäßen Arginin- Deiminase betreffen in den Versuchen unten dargestellt.
Versuch: Antikrebswirkungen der Arginin-Deiminase
Versuch 1: Verfahren unter Verwendung von kultivierten Stämmen von humanen Krebszellen.
Zuerst wurden 1 x 10&sup4; Zellen von jeder humanen Krebszelle in eine 24-Vertiefungen Mikroplatte geimpft, die 1,0 ml DME Medium mit einem 10% Kälberserum enthält und die Arginin- Deiminasezubereitung, die in dem obigen Schritt erhalten wurde, wurde zu diesem Medium in einer derartigen Menge hinzugefügt, daß die Konzentration der Zubereitung in dem Medium 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug. Dann wurden, nach der Kultivierung bei 37ºC 3 Tage in einem 5 % CO&sub2; Inkubator, die Zahl der Krebszellen unter Verwendung eines automatischen Zellzählers (Coulter counter) [Coulter Co.] gezählt. Als Kontrolle wurde dieselbe Menge an PBS zu dem Medium, anstelle der Arginin-Deiminase-Zubereitung hinzugefügt. Die inhibierende Aktivität auf das Krebszellenwachstum wurde in den Begriffen der Zahl der Krebszellen in den Proben, bezüglich der korrespondierenden Zahl für die Kontrolle, die auf 100 festgesetzt wurde, aufgezeigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zellart Nr. der Zellen (% der Kontrolle) Humane Leberkrebszellen (HLE) Humane maligne Fibro-Sarkomazellen (B32) Humanes squamöse Karzinomkrebszellen (Caski) Humane squamöse Karzinonikrebszellen (HSC-4) Humanes maligne Melanomzellen (VMRC) Mumane nasopharyngeale Karzinomzellen (KB) Humane Lungenkarzinoinzellen (A549)
Versuch 2: Verfahren unter Verwendung von Maus-Leukämiezellen L11210
Eine Gesamtmenge von 21 männlichen CDF&sub1; Mäusen (BALB/c weiblich x DBA/B männlich, 7 Wochen alt, wurden als Versuchstiere verwendet und 1 x 10&sup5; Zellen der Leukämiezellen L1210 wurden i.p. in jede Maus transplantiert. Dann wurden 9 Mäuse zufällig aus einer Kontrollgruppe ausgewählt und die anderen wurden gleichmäßig auf zwei Testgruppen geteilt. Die zuvor erwähnten Arginin-Deiminase-Zubereitungen wurden ständig i.p der Testgruppe täglich 8 Tage lang injiziert. Den Kontrollgruppentieren wurde PBS verbreicht.

Versuch 3: Verfahren unter Verwendung von Maus-Fibro-Sarkoma- Meth A.

Eine Gesamtmenge von 27 männlichen CDF&sub1; Mäusen (BALB/c weiblich x DBA/2 männlich, 7 Wochen alt, wurden als Versuchstiere verwendet und 1 x 10&sup6; Zellen der Fibro-Sarkoma- Meth A wurden i.p. in jede Maus transplantiert. Dann wurden 9 Mäuse zufällig aus einer Kontrollgruppe ausgewählt und die anderen wurden gleichmäßig auf zwei Testgruppen geteilt. Die zuvor erwähnten Arginin-Deiminase-Zubereitungen wurden ständig i.p der Testgruppe täglich für 10 Tage injiziert. Den Kontrollgruppentieren wurde PBS verbreicht.

Versuch 4: Verfahren unter Verwendung von Maus-Kolon- Krebszellen Kolon 26

Eine Gesamtmenge von 25 männlichen CDF&sub1; Mäusen (BALB/c weiblich x DBA/2 männlich, 7 Wochen alt, wurden als Versuchstiere verwendet und 1 x 10&sup6; Zellen der Kolon- Krebszellen Kolon 26 wurden i.p. in jede Maus transplantiert. Dann wurden 9 Mäuse zufällig aus einer Kontrollgruppe ausgewählt und die anderen wurden gleichmäßig auf zwei Testgruppen geteilt. Die Arginin-Deiminase-Zubereitungen wurden ständig i.p der Testgruppe täglich für 14 Tage injiziert. Den Kontrollgruppentieren wurde PBS verbreicht.

Versuch 5: Verfahren unter Verwendung von Maus-Sarkoma 180

Eine Gesamtmenge von 24 männlichen ICR Mäusen, 7 Wochen alt, wurden als Versuchstiere verwendet und 1 x 10&sup6; Zellen der Sarkomazellen 180 wurden i.p. in jede Maus transplantiert. Dann wurden 8 Mäuse zufällig aus einer Kontrollgruppe ausgewählt und die anderen wurden gleichmäßig auf zwei Testgruppen geteilt. Die Arginin-Deiminase-Zubereitungen wurden ständig i.p der Testgruppe täglich für 14 Tage injiziert. Den Kontrollgruppentieren wurde PBS verbreicht.

Versuch 6: Verfahren unter Verwendung von Maus-Ascites- Hepatoma MH 134.

Eine Gesamtmenge von 26 männlichen C3H/HeN Mäusen, 7 Wochen alt, wurden als Versuchstiere verwendet und 1 x 10&sup6; Zellen der Ascites-Hepatoma MH 134 wurden i.p. in jede Maus transplantiert. Dann wurden 10 Mäuse zufällig aus einer Kontrollgruppe ausgewählt und die anderen wurden gleichmäßig auf zwei Testgruppen geteilt. Die Arginin-Deiminase- Zubereitungen wurden ständig i.p der Testgruppe täglich für 14 Tage injiziert. Den Kontrollgruppentieren wurde PBS verbreicht.
Die Antikrebswirkung wurde in Begriffen des Prozentsatzes (T/C%) der Durchschnittszahl von Tagen aufgezeigt, die die Testgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe lebten. Die Ergebnisse, die aus den obigen Versuchen 2 bis 6 erhalten werden, werden in den Tabellen 3 bis beziehungsweise 7 gezeigt. Tabelle 3 (L1210) Gruppe Durchschnittliche Zahl an gelebten Tagen Kontrolle (N=9) Maus Tabelle 4 (Meth A) Gruppe Durchschnittliche Zahl an gelebten Tagen Kontrolle (N=9) Maus Tabelle 5 (Kolon 26) Gruppe Durchschnittliche Zahl an gelebten Tagen Kontrolle (N=9) Maus Tabelle 6 (Sarkoma 180) Gruppe Durchschnittliche Zahl an gelebten Tagen Kontrolle (N=8) Maus Tabelle 7 (MH 134) Gruppe Durchschnittliche Zahl an gelebten Tagen Kontrolle (N=10) Maus

Claims

1. Polypeptid, das sich von Mycoplasma herleitet und durch eine Arginin-Deiminase-Aktivität und die folgenden physikochemischen Eigenschaften gekennzeichnet ist:

(a) Funktion und Substratspezifität: Hydrolisiert die Amidingruppen von L-Arginin zu L-Citrullin und Ammoniak.

(b) pH-Optimum: 6,0 bis 7,5

(c) Stabil beim pH: 4,5 bis 9,0

(d) Temperaturoptimum: etwa 50 ºC

(e) Km-Wert: etwa 0,2 mM

(f) Isoelektrischer Punkt (pI) : etwa 4,7

(g) Molekulargewicht: etwa 45.000 nach SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese; und etwa 90.000 nach Gelfiltrations-HPLC.

(h) Aminosäuresequenz vom N-Terminus: Ser-Val-Phe-Asp-Ser-Lys- Phe-Lys-Gly-Ile-His-Val-Tyr-Ser-Glu-.

2. Polypeptid, das sich von Mycoplasma herleitet und durch die Aminonosäuresequenz gemäß Figur 4 gekennzeichnet ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 und dadurch gekennzeichnet, daß man Mycoplasma, das Arginin zersetzen kann, kultiviert und das kultivierte Produkt einer Extraktion, Abtrennung und Reinigung unterwirft und das Polypeptid erhält.

4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 2, wobei das Mycoplasma, das Arginin zersetzen kann, ein M. arginini-Stamm ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oligonucleotide gemäß Figuren 5 bis 8 als Proben zum Screenen verwendet.

6. DNA mit einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 2 und dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen, die durch ein Plasmid mit einer DNA gemäß Anspruch 6 transformiert worden sind, kultiviert und das kultivierte Produkt abtrennt und reinigt und das Polypeptid erhält.

8. Anti-Krebsmittel, enthaltend als Wirkstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2.