SU1291027A3

SU1291027A3 - Способ получени гликопротеина,обладающего противоопухолевой и лектиноподобной активностью

Info

Publication number: SU1291027A3
Application number: SU823396893A
Authority: SU
Inventors: Есикуми Тикао; Фудзи Такаеси; Фурусо Такоо; Мацунага Кенити; Охара Минору; Кобаяси Акира
Original assignee: Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Фирма)
Priority date: 1981-02-10
Filing date: 1982-02-09
Publication date: 1987-02-15
Also published as: DE3261014D1; EP0058093A1; JPS5932480B2; CA1184899A; RO82759A; JPS57134496A; EP0058093B1; RO82759B; DD202168A5; PH18757A; AU551672B2; PH18378A; US4663438A; AU8016682A; ZA82511B

Description

Изобретение относитс к медицине и касаетс получени биологически активного соединени .

Цель изобретени - создание способа получени нового гликопротеина, обладающего противоопухолевой и лек- тиноподобной активностью.

Способ иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1. Штамм СМ-101 . Coriolus versicolor (Fr.) Quel (FERM- P2412; ATCC 20547) культивируют в питательной среде, содержащей, вес.%; глюкоза 5; пентон 0,2; дрожжевой экстракт 0,3; , 0,1; MgSO 0,1, в течение 10 дней,

Развившийс на поверхности культу- ральной среды мицелий гомогенизируют с водным физиологическим раствором и получают посевную культуру.

Ее высевают в каждьш из 100 сосудов дл культивировани емкостью 1 л, содержащих по 200 мл среды вышеописанного состава и культивируют в течение 25 дней при 25-27°С. Получают 2,0-4,5 г/один сосуд проросшего мицели .

100 г полученного мицели экстрагируют 3 л водного 0,1 н.раствора NaOH при 97°С в течение 1 ч. Экс- тракт отдел ют, нейтрализуют кислотой и концентрируют.

Концентрат обессоливают и затем последовательно подвергают диализу и ультрафильтрации дл удалени низкомолекул рных соединенийS имеющих молекул рный вес менее 5000.

Концентрат (или порошкообразное соединение, полученное высушиванием обработанного концентрата) смешивают с фосфатным буфером дл поддержани рН смеси 3,5 и после нейтрализации супернатанта, полученного центрифугированием смеси, его подвергают ультрафильтрации дл удалени солей, причем ультрафильтрацию провод т под давлением 1,5 кг/см при 10°С с одновременным охлаждением и перемешиванием на аппаратуре дл ультрафильтра- 50 очищенный продукт при необходимости

ции (настольньй HighfIow72000, Ami- con Comnany с диафрагмой ДМ-5). После концентрировани обессоленного супернатанта в концентрат добавл ют фосфатный буфер дл поддержани рН смеси 3, затем смесь центрифугируют и собирают осадок.

Фракции, осаждающиес при стабилизированном рН 3,5, ионной силе 0,30|U

5

0

5

и температуре в течение 2 ч, отбрасывают , а собирают только фрак; ии, осаждаемые из оставшегос раствора при рН. 3,0 (изоэлектрической точке в интервале рН 3s0-3,5).

Осадок раствор ют в воде, довод т рН до 7,0 и очи1дают обессоливанием, затем высушивают до порошкообразного состо ни „

Гликопротеин имеет следующие характеристики .

Молекул рный вес 5000-300000. Весовое отношение белковой части к его сахаридной части от 50/50 до 80/20. N-концева кислота представл ет собой в основном тирозин, лейцин или аланин,

С-концевак аминокислотна последовательность представл ет собой лей- цинфенилаланин-валин.

Элементный состав, %: углерод 35,2-49,3; водород 4,8-8,0; азот 4,3-12,3; сера от следов до 2,5; фосфор от следова до 1,2; кислород остальное.

Изоэлектрическа точка легсит з интервале рН 2,5-5,0. .

В качестве компонента в глккопро- теин входит нуклеинова кислота.

По данным инфракрасной спектроскопии поглощени гликопротенк иг-1еет максимум поглощени в интервалах 3600-3200 и 1200-1000 см а также при 1600 и 1530 .

Пример 2-18. Вместо штамма СМ-101 используют каждый из штаммов грибов, представленных в табл. 1,

Мицелий экстрагируют водным раст- ворителем, таким как гор ча вода или водный 0,01-2,0 н, раствор щелочи при 80-100 С в течение 1-8 ч. После удалени экстрагируемого остатка водный экстракт нейтрализуют кислотой и кон- центрируют. .После обессоливани концентрат при необходимости подвергают диализу и/или ультрафильтрованию дл удалени низкомолекул рного соединени (м.в. менее 5000), Полученный

концентрируют и сушат до порошкообразного состо ни . Затем продукт подвергают , фракционному оса ф.ен.чю в изоэлектрической точке с рН 255-550, 55 ионной силе 0,1-3,1/и и при температуре среды 5-25°С5 в течение более чем 0,5 ч;

Характеристики полученных препаратов приведены в табл. 1.

Физические и физиологические свойства предлагаемого сединени по примерам 1-18 приведены в табл, 2.

Каждое из соединений по примерам 1-18 про вл ет следующие характерные цветные реакции сахарида и белка;

d -нафтол - сернокислотна .реакци цвет темно-красный; индол - сернокислотна реакци - цвет коричневый; ан- трон - сернокислотна реакци - цвет зеленовато-голубой; фенол сернокислотна реакци - цвет коричневый; триптофан - сернокислотна реакци - цвет красновато-коричневьш; тиоглико- лева кислота - сернокислотна резкдн - зеленовато-коричневый; OIJCHH - сол нокислотна реакци - зеленовато- коричневый; реакци Лоури-Фолина - цвет синий; нингидринова реакци продукта гидролиза гликопротеина хлористоводородной кислоты - красновато- синий.

Т а б л и ц а 1

FEKM-P 2412 (АТСС 20547)

FERM-P 2413 (АТСС 20548)

FERM-P 2414 (АТСС 20545)

FERM-P 2415 (АТСС 20549)

FERM-P 2416 (АТСС 20550)

FERM-P 2417 (АТСС 20551)

FERM-P 2418 (АТСС 20552)

FERM-P 2419 (АТСС 20553)

FERM-P 2420 (АТСС 20554)

FERM-P 2421 (АТСС 20555)

FERM-P 2422 (АТСС 20556)

FERM-P 2423 (АТСС 20557)

FERM-P 2424 (АТСС 20558)

versicolor (Fr,)

CM-114

versicolor (Fr,)

CM-115

hirsutus (Fr.)

CM-151

pargemenus (Fr.)

CM--161

versition (Fr.)

. CM-101

censors (Berk.)

CM-166

Продолжение табл.i

FERM-P 2425 (ATCC 20559)

FERM-P 2426 (ATCC 20560)

FERM-P 2711 (ATCC 20561)

FERt-I-P 2712 (ATCC 20562)

FERM-P 3686 (ATCC 20564)

FERM-P 988 (ATCC 20565)

Сч-- г со

гТ о

-I со о - - f

tyv

t-j 00 о fооiN

«- lO

ОО СО

С и гТ -

СП Г- U U - t -

CJ AJ о и

-СО ШsD

гЛ cyiГЧ

-J

СЛ СЧ

-о1Л V-Г

чО

.

г «--

о r-i if

ке-о

О W .- гч о

- оееСП

1 о -

1Л о о

CJiJV-: Г

ш со г

U W о - о

(Nгп (

(О - - о

,- f rg о

U -1 о - -

г - U JJ о m -

- t I

+ I

+ Ч-

+ + I

+ +

u : о 3

I

+ i

+

+ I

+

+ I

++

+ I

+ 1 +

+I+

Claims

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И ЛЕКТИНОПОДОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, заключающийся в том, что мицелий гриба рода Coriolus экстрагируют водой или водным 0,01-2,0 н. раствором щелочи при .температуре 80-100°C в течение 1-8 ч, из полученного экстракта удаляют низкомолекулярные вещества путем диализа и/или ультрафильтрации, полученный концентрат подвергают фракционному осаждению в изоэлектрической точке с pH 2,5 - 5 при ионной силе раствора от 0,1 до 3,1 |U при температуре 5-25 °C в течение 1-8 ч, при поддержании pH на заданном уровне в процессе фракционирования выделяют фракции, содержащие целевой продукт, нейтрализуют, обессоливают и высушивают.

2. Способ по п. ^отличающийся тем, что экстракции подвергают мицелий гриба Coriolus versicolor (Fr.) Quel, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel, Coriolus pargemenus (Fr.) Pat., Coriolus censors (Berk) Imaz.

SU .,,,1291027