NL8401225A - Farmaceutisch produkt met anti-tumor werking; gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een antitumor therapie. - Google Patents

Description

1 ; - -1- 1 VO 6099

Farmaceutisch produkt met anti-tumor werking; gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een anti-tumor therapie................. .

........De uitvinding heeft betrekking op een farmaceutisch produkt met anti-tumor werking, alsmede op het gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een anti-tumor therapie.

5 Het is bekend dat lectinen, zoals concanavaline A, synthe tische analoga daarvan, synthetische dubbelstrengs RNA molekulen (ds RNAs), zoals poly I : C (hetgeen staat voor polyriboinosine-polyribo-cytidylzuur, ook wel aangeduid als polyinosine : polycytidylzuur en afgekort als poly (l).poly (C) en poly A : U (polyadenyl polyuridyl-10 zuur), alsmede synthetische en natuurlijke analoga daarvan (zie bijv. Riley et al, Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 169, 183-188, 1982: Carter et al, Augmenting Agents in Cancer Therapy, biz. 177-183, 1981, ed.

E.M. Hersh et al, Raven Press, New York; Levine et al, Augmenting Agents in Cancer Therapy, biz. 151-163, 1981, ed. E.M. Hersh et al, 15 Raven Press, New York; Levine et al, Cancer Research 39, 1645-1650, 1979; Krown et al, Augmenting Agents in Cancer Therapy, biz. 165-176, 1981, ed. E.M. Hersh et al, Raven Press, New York; Dewdney et al, Pontificiae Academiae Scientiarum Scripta Varia 43, 355-375, 1979) uiteenlopende anti-tumor werkingen vertonen in bepaalde onderzoeks-20 modellen. De anti-tumor werking is echter veelal, zeker bij de mens, betrekkelijk zwak, terwijl de beste resultaten bereikt worden met stoffen, die een voor klinische toepassing onaanvaardbaar hoge toxiciteit vertonen. Zo vermelden bijv. Phillips et al, Toxicol.Appl. Pharmacol. 18, 220-230, 1971 en Homan et al, Toxicol. Appl.Pharmacol. 25 23, 579-588, 1972 acute LD5q waarden na intraveneuze toediening van poly I : C aan muizen van 75 mg/kg (mannetjes- en vrouwtjesmui zen) resp. minder dan 17,8 mg/kg (mannetjesmuizen). Poly A : U is minder toxisch dan poly I : C, maar heeft ook een duidelijk zwakkere anti-tumor werking. Volgens Lacour et al, The Lancet, ii, 161-164, 1980, 30 verbetert poly A : U de overlevingskansen bij operabele borstkanker bij de mens, terwijl geen ongewenste neven-effecten schijnen op te treden.

Verder is bekend dat muramyl dipeptide (MDP, chemische naam 8401225 -2- N-acetylmuramyT-L-alanyl-D-isoglutamine) een immuno-adjuvans is voor de vorming van specifieke anti lichamen tegen oplosbare en deeltjes-vormige antigenen (Chedid et al, Progr.Allergy, 25, 63-105, 1978), waarvan onder andere bekend is dat het bij toevoeging van minerale 5 olie, bijv. Freund's incomplete adjuvans, een goed adjuvans wordt voor specifieke, door cellen gemedieerde immuuunreacties (Chedid et al, J. Reticulo-endothel. Soc. 26, 631-640, 1979). Zelf is MDP niet immu-nogeen. Ook kan MDP verscheidene niet-specifieke effectormechanismen van het immuunsysteem, waaronder resistentie tegen pathogenen en pro-10 duktie van interleukinen stimuleren (Parant, Springer Semin.Immuno-pathol. 2, 101-118, 1979; Wood et al, Cell. Immunol .70, 407, 1982).

MDP op zich vertoont echter geen significante anti-tumor werking. Samenvattend zijn de volgende eigenschappen van MDP bekend: A. stimulatie van de vorming van specifieke antilichamen (humoraal 15 adj uvans).

B. stimulatie van de specifieke cellulaire immuniteit (cellulair adjuvans).

C. stimulatie van de niet-specifieke weerstand.

D. interferon inductie (lymfocyten en/of monocyt/macrofaag factor).

20 E. interleukinen inductie (leukocytfactoren).

F. macrofaag - activatie.

G. ongewenste effecten, zoals pyrogeniteit (koortsverwekkend vermogen), inductie van tijdelijke leukopenie (tekort aan circulerende witte bloedcellen), inductie van gewrichtsontsteking (arthritis) en ver- 25 hoogde gevoeligheid voor de toxiciteit van endotoxinen.

Sommige van deze eigenschappen zijn gekoppeld aan het gebruik van olie.

Er zijn verscheidene niet-pyrogene analoga en prodrug vormen van MDP beschreven (Kiso et al, Carbohydrate Research 90,C 8-C 11, 1981; Lederer, Prog. Immunol IV, 1194-1211, 1980; Krueger et al, J.Exp. 30 Med. 159, 68-76, 1984; Durette et al, Carbohydrate Research 108, 139-147, 1982; Matsumoto et al, Infection and Immunity 39, 1029-1040, 1983; Ogawa et al, Infection and Immunity 35, 612-619, 1982; Saiki et al, Infection and Immunity 39, 137-141, 1983; Chedid et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2472-2475, 1976; Lederer. J.Med.Chem. 23, 819, 1980; 35 Matsumoto et al, Infection and Immunity 32, 748-758, 1981; Tsujimoto et al, Microbiol.Immunol. 23, 933-936, 1979; Durette et al, J.Med.

Chem. 25, 1028-1033, 1982; Lefranchier et al, J.Med.Chem. 25, 87-90, 8401225 -3- 1982; Masihi et al, Infection and Immunity 43, 233-237, 1984; Kusu-moto et al, Bull.Chem.Soc. Japan 52, 1665-1671, 1979; Arnon et al, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 77, 6769-6772, 1980). De eigenschappen van al deze bekende analoga en prodrug vormen lopen nogal uiteen. Zo is 5 het analogon 6-0-(2-tetradecylhexadecanoyl)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, vergeleken met MDP zelf, een sterkere stimulator van de cellulaire immuniteit en een zwakkere stimulator van de niet-specifieke weerstand; is het analogon 6-0-acetyl-N-acëtylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine inactief als stimulator van de niet-specifieke 10 weerstand en equivalent met MDP als cellulair adjuvans, en is het analogon N01- (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl)-Ne-stearoyllysine een sterkere stimulator van de niet-specifieke weerstand dan MDP.

Concanavaline A en synthetische polynucleotiden hebben de genoemde eigenschappen A t/m D en F in meerdere of mindere mate met 15 MDP gemeen, evenals vele van de onder G vermelde effecten. Poly A : U is in tegenstelling tot poly I : C echter nauwelijk pyrogeen. De synthetische polynucleotiden zijn zwak immunogeen, concanavaline A daarentegen sterk immunogeen.

Thans is verrassenderwijze gevonden, dat de toepassing van 20 een combinatie van een niet of aanvaardbaar toxisch lectine, ds RNA of een synthetisch of natuurlijk analogon daarvan, en muramyl dipeptide (of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan) leidt tot een synergistisch effect wat de anti-tumor werking betreft, zonder gepaard te gaan met een toename van de toxiciteit.

25 De uitvinding heeft dan ook betrekking op een farmaceutisch produkt met anti-tumor werking, omvattende een of meer farmacologisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, verdunningsmiddelen en/of hulpstoffen, alsmede (a) ten minste één stof, gekozen uit de groep bestaande uit niet of aanvaardbaar toxische lectines, niet of aanvaard-30 baar toxische analoga daarvan, niet of aanvaardbaar toxische synthetische dubbelstrengs RNA molekulen en niet of aanvaardbaar toxische analoga daarvan, en (b) muramyl dipeptide (MDP) of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan, in hoeveelheden die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een ef-35 fectieve anti-tumor werking bezitten.

Geschikte representanten van de groep, waaruit component (a) 8401225 -4- wordt gekozen, zijn concanavaline A, poly I : C, poly A : U, en niet of aanvaardbaar toxische synthetische of natuurlijke analoga daarvan.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt component (a) gekozen uit de groep, bestaande uit poly A : U, niet of aanvaardbaar 5 toxische synthetische of natuurlijke analoga daarvan, en niet of aanvaardbaar toxische synthetische of natuurlijke analoga van poly I : C.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft het farmaceutisch produkt de vorm van één enkele oplossing voor intraveneuze, 10 intramusculaire of subcutane toediening.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de^itvinding heeft het farmaceutisch produkt echter de vorm van een oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van component (a) en een afzonderlijke oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of 15 subcutane toediening van component (b). Door afzonderlijke toediening, d.w.z. toediening op verschillende plaatsen, kan een al te sterke vorming van antilichamen tegen component· (a), welke een gevolg is van de immuno-adjuvans werking van component (b), en daarmee een neutralisatie van de werking bij een volgende injectie en eventuele anafylac-20 tische reacties worden vermeden.

De uitvinding heeft verder tevens betrekking op een gebruik van het farmaceutisch produkt volgens de uitvinding in een anti-tumor therapie.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op het 25 gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke component (a) bevat, in combinatie met het gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke component (b) bevat, in een anti-tumor therapie, waarbij de twee samenstellingen gelijktijdig of vrijwel gelijktijdig op verschillende plaatsen worden toegediend in hoeveelheden, die enerzijds 30 toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een effectieve anti-tumor werking bezitten.

Bij voorkeur zijn de twee bedoelde samenstellingen oplossingen voor intraveneuze, intramusculaire en/of subcutane toediening, in het bijzonder waterige oplossingen. Andere toedieningsroutes, bijv. 35 intraperitoneale toediening, zijn echter ook mogelijk.

De uitvinding wordt aan de hand van het onderstaande voorbeeld nader toegelicht.

8401225 -5-

Voorbeeld

Onderzocht werd het effect van intraveneus (i.v.) geïnjecteerde waterige oplossingen van MDP in combinatie met concanavaline A, poly I : C of poly A : U, tegen solide subcutane (s.c.) Meth A fibrosarcoma transplantaten in syngene BALB/c muizen.

5 Voor de experimenten werden 11 weken 0ude BALB/c vrouwtjes- muizen gebruikt. Het Meth A sarcoma van BALB/c oorsprong werd verkregen bij het Clinical Research Centre (Harrow, Middlesex, Groot Brit-tannië) en door seriegewijze intraperitoneale passage in de ascites vorm aangehouden.

10 Het MDP werd verkregen bij het Institut Pasteur Production (Marnes-la-Coquette, Frankrijk). Concanavaline A werd verkregen van Calbiochem (San Diego, Californa, USA); poly I : C en poly A : U van Miles Laboratories Inc. (Elkhart, Indiana, USA).

Tenzij anders is aangegeven werden de stoffen i.v. geïnjec-15 teerd in 0,5 ml pyrogeenvrije fysiologische zoutoplossing.

De muizen werden op dag 0 s.c. met 3x10^ levenskrachtige Meth A cellen in het abdomen geïnjecteerd. De behandeling werd begonnen op dag 9, toen de tumor een diameter van ongeveer 7,5 mm had. De omvang van licht en donker gekleurde necrose werd gemeten op dag 11 20 en uitgedrukt als 100 keer de verhouding van de gemiddelde diameters van het necrotische gebied en de tumor. De diameters werden met een schuifmaat gemeten. Groeiremming werd genoteerd indien de tumor binnen 2 dagen na de behandeling niet groter was geworden. Volledige genezing werd genoteerd indien de tumors binnen 19 dagen na de behan-25 deling volledig waren verdwenen.

De gegevens zijn uitgedrukt als de gemiddelde waarde* SEM. (SEM = Standard error of the mean).

Significantie-analyse geschiedde volgens Student's t-test. P-waarden boven 0,05 werden niet-significant geacht.

30 De testresultaten zijn in onderstaande tabel A samengevat.

8401225 -6-

TABEL A

Effect van MDP op de antitumoractiviteit van concanavaline A poly I : C en poly A : U.

Behandeling 1 necrose 2 frequentie (¾) ___'_ van_ component (a) dosis MDP n frequentieU)omvang groei- volledi- (/Ug) licht donker inhi- ge gene- ' ' bitie 3 zing k concanavaline A 200 - 9 67 .0 46±3 22 22 6 200 +10 0 100 67±3 5 80 80 20 - 4 0 0 0 0 20 + 5 80 0 40±3 0 0 poly I : C 25 9 44 33 49±2 11 11 25+10 0 100 66+3 5 80 70 3 - 4 25 0 49 0 0 3 + 4 25 75 50+5 5 75 75 poly A : U 100 - 10 0 0 40 10 100 + 10 0 100 57±2 100 70 25 - 10 0 0 0 0 25 + 10 20 0 30±0 30 10 fysiologische 19 0 0 0 0 zoutoplossing + 19 5 0 43 5 0 - 1 BALB/c muizen met 9 dagen oude Meth A tumoren werden i.v. met compo nent (a) alleen of gemengd met 30^ug MDP geïnjecteerd.

- 2 Necrose werd gemeten op dag 11. De omvang wordt gegeven als gemiddel de waarde ± SEM.

- 3 Geen toename van de tumor grootte binnen 2 dagen na de injectie.

- 4 Volledige verdwijning van de tumor binnen 19 dagen na de behandeling.

- 5 p < 0,05 vergeleken met de overeenkomstige behandeling zonder MDP.

- 6 Eén tumor verdween op dag 35 (niet inbegrepen).

8401225 -7-

Uit de testresultaten blijkt dat i.v. injectie van 200^ug concanavaline A en van 25^ug poly I : C een bescheiden mate van necrose en regressie van Meth A tumoren veroorzaakte. Door de toevoeging van MDP namen de frequentie, de intensiteit en de omvang van 5 necrose en vooral de frequentie van regressie aanzienlijk toe. Een lagere dosis concanavaline A van 20^ug vertoonde geen anti-tumor activiteit. Wanneer aan deze lagere dosis MDP werd toegevoegd, werd alleen herstel van de necrotiserende activiteit bereikt. Een lage dosis poly I : C van slechts 3^ug, welke op zichzelf geen significante anti-tumor 10 activiteit vertoonde, werd echter door toevoeging van MDP even effectief als de combinatie van 25^ug poly I : C en MDP. Een dosis poly A : U van 1OO^ug veroorzaakte geen necrose en had slechts een geringe invloed op de tumorgroei, maar toevoeging van MDP resulteerde in een omvangrijke necrose en een hoge regressiefrequentie. Een lagere dosis 15 poly A : U van 25^ug, gecombineerd met MDP, had slechts een matige activiteit.

Verder werd ook de toxiciteit van i.v. geïnjecteerd poly A : U, in verschillende doses alleen of in combinatie met uiteenlopende doses MDP, bepaald. De resultaten worden getoond in de bijgaande 20 figuur. Groepen van 5 muizen kregen laboratorium voedsel en water ad libitum en werden in een omgeving van constante temperatuur (18°C) en vochtigheidsgraad gehouden. De verandering van het lichaamsgewicht, gemeten 24 uur (zwarte bolletjes) resp. 48 uur (kruisjes) na de injectie, werden proportioneel uitgedrukt ten opzichte van de individuele 25 gewichten, zoals die onmiddellijk voorafgaand aan de injectie waren en weergegeven als gemiddelde ± SEM (vertikale balken). De conditie van de muizen werd na 4 uur van de behandeling beoordeeld en gekwalificeerd als goed (G) of matig (M). Lethaliteit werd binnen 72 uur na de injectie in geen van de groepen waargenomen, ook niet bij doserin-30 gen die 10-20 x hoger zijn dan de therapeutische dosis. Ook werden in geen van de testreeksen bijverschijnselen zoals lethargie en diarree waargenomen.

Uit de in de figuur getoonde resultaten blijkt, dat een gecombineerde toediening van poly A : U en MDP alleen in de hoogste do-35 seringen (300^ug MDP + 1000 of 2000^ug poly A : U) een geringe, maar significante afname van het lichaamsgewicht tot gevolg had ten opzichte 8401225 -8- van toediening van poly A : U alleen. Het herstel was snel, zoals de resultaten na 48 uur tonen.

De resultaten van een onderzoek aan verschillende organen, 72 uur na de injectie verricht, zijn in onderstaande tabel B samengevat.

Vermeld worden de gemiddelde waarden ± SEM.

8401225 CM CO CM τ- Ο I ΟΙ ΟΙ Ο #1 | «ι I Λ I Λ Ο I Ο I Ο I Ο

CO III

3 +[ I +1 I +1 I +1 Ε ιιι

>> ΟΙ O'- I CM I CO

JO CM I CM I CM I *— I t η I «t I rt I a OIOIOI o I I I *

I * I -It I -X

«θ' ' I CM I UO I <3· OIOIOI o • I A I A I Λ OIOIOI o 4J +11+11+11+!·

4-> ·!— 1—1 CM I CM I LO

-c - e cn i co i r--· i co u ·> I · I «I » v— OIOIOI o

5: III

<U - I I I

cn I I I

m I I I

ε οι Γ-- I *+ i cn

fO 1— I Ο I CM I O

tO ·> I "I "I " xr oioioi o

O III

·!- i- +11 +11 +11 +1

r— Φ I I I

> cn I 1- I I"* I co +> qj i^icnicni cn Ό · r— "I "I “I « JZ I *3- I «Ο· I «tf

I I I

C I II

fO I I I

> I I~~. I I— I 1- OIOIOI ΙΟ) «I «I *· I ·>

4-> OIOIOI O

XT · · £“ I I I

U Φ +1 I +1 I +1 I +1 •i— cr> I I I cn cn

(M E CM I CO I CO I UO C C

•ο. · o r*. I i^- I co I co <-·!- CQ ..O r— "I »1 "I ·> CO (/1 OIOIOI O coco c I I I o o I 4-1 · <D I I I I— i— cn -μ I I I Cl Cl ILii I II oo

^ III +J -M

CQ *3-1 CO I *3-1 1— 33 tr oioioi ο oo C ·!— C OIOIOI o nn <u « I «I « I « h- C E OIOIOI ο ω <u <u ω ιιι £ £ +> -Γ- +1 I +1 I +! I +1 O u

JZ E III CO CO

ο ό <n I cn I «3-1 co *i— ·ι— •r- ·Γ- ο I co I co I co cn cn

5 -Ω OIOIOI O OO

φ Λ I Λ I Λ I Λ p— I— cn oioioi ο 00 C III -I- ·Ι— to ιιι mm tO III >, >, cn CO I CM 1 (Til CO <4- <4- S_ OIOIOI o ο « I *> I * I " <u aj

SZ OIOIOI Ο Ό XJ

ai ιιι i- +1 I +1 I +1 I +1 C £= <U III to to •I- co I cm I Γ'- I r*. > >

C CO I CO I 00 I CO

λ I *> I *> I « a) ai

III· SZ JZ

I I I > 00 I I · I · *r- -f—

I I > I -I- N IM

I I · I Q.O.

• I I T- I O O O

>1 I I

• I I ZD I ·· C C

•1- I · I · · I <U 4) I > I c I C +J +4 11 σι I · 1 1 + r c 1 -r-ι >,i >j 10 *— cn o *r— I I I— IQ.1— CM 0 C CO CO I D_ I 01 00 00 I— -I— CO I Ol Q- I 2! a " *> r— cn O I 2; I I 00 ai 01- 1 1 cn 1 cn cn Ό 1— CL I cn I 3 1 3 3 vv C OOI 31 -\l \ —.

tö -I- +j I 'O OIO Cl Cl jz tn 3 1 01 01 00 <V >> O I OIOI OO * * XJ <4- N I CO I CM I CO CM * 8401225 -10-

Opgemerkt wordt dat een toename van het miltgewicht een vrij algemeen effect van Immunostimulerende stoffen is. Van grote gewichtsveranderingen in de organen is verder geen sprake. Het macroscopische aspect van de verschillende organen 72 uur na de 5 toediening was normaal.

Samenvattend blijkt dat de synergistische verhoging van de anti-tumor werking ten gevolge van de toevoeging van MDP niet gepaard gaat met een verhoging van de toxiciteit.

8401225

Claims (8)

1. Farmaceutisch produkt met anti-tumor werking, omvattende een of meer farmacologisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, ver-dunningsmiddelen en/of hulpstoffen, alsmede (a) ten minste één stof, gekozen uit de groep bestaande uit niet of aanvaardbaar toxische ^ lectines, niet of aanvaardbaar toxische analoga daarvan, niet of aanvaardbaar toxische synthetische dubbelstrengs RNA molekulen en niet of aanvaardbaar toxische analoga daarvan,en (b) muramyl dipeptide (MDP) of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodruc vorm daarvan in hoeveelheden die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en ander- ^ zijds een effectieve antitumorwerking bezitten.

2. Farmaceutisch produkt volgens conclusie 1, waarin component (a) gekozen is uit de groep, bestaande uit concanavaline A, poly I : C, poly A : U, en niet of aanvaardbaar toxische synthetische of natuurlijke analoga daarvan.

^ 3. Farmaceutisch produkt volgens conclusie 1, waarin com ponent (a) gekozen is uit de groep, bestaande uit poly A : U, niet of aanvaardbaar.toxische synthetische of natuurlijke analoga daarvan, en niet of aanvaardbaar toxische -synthetische of natuurlijke analoga van poly I : C.

^ 4. Farmaceutisch produkt volgens een of meer van de conclu sies 1-3, in de vorm van één enkele oplossing voor intraveneuze, in-tramusculaire of subcutane toediening.

5. Farmaceutisch produkt volgens een of meer van de conclusies 1-3, in de vorm van een oplossing voor intraveneuze, intramuscu- λ pr laire of subcutane toediening van component (a) en een afzonderlijke oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van component (b).

6. Gebruik van een farmaceutisch produkt volgens een of meer van de conclusies 1-5 in een antitumortherapie.

7. Gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke component (a) zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1-3 bevat, in combinatie met het gebruik van een farmaceutische samenstelling,-., welke component (b) zoals gedefinieerd in conclusie 1 bevat, in een anti-tumor therapie, waarbij de twee samenstellingen gelijktijdig or of vrijwel gelijktijdig op verschillende plaatsen worden toegediend 8401225 * -12- * * * in hoeveelheden, die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een effectieve antitumorwerking bezitten.

8. Gebruik volgens conclusie 7, waarbij de twee samenstellingen oplossingen zijn voor intraveneuze, intramusculaire en/of 5 subcutane toediening. 8401225