DE69634751T2

DE69634751T2 - MODIFIZIERTE METHIONINASE, DEREN VERWENDUNG, REKOMBINANTE WIRTsZELLEN DIE GROSSE MENGEN VON METHIONINASE PRODUZIEREN UND VERFAHREN ZUR AUFREINIGUNG VON METHIONINASE

Info

Publication number: DE69634751T2
Application number: DE69634751T
Authority: DE
Inventors: Yuying Tan; Valeryi Lishko
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: US6231854B1; EP0839055A1; AU6270196A; JP2002531050A; US5888506A; DE69634751D1; US5891704A; CA2221690C; CN1174512A; CA2221690A1; ATE295740T1; AU708361B2; WO1996040284A1; JP2004081209A; EP0839055A4; CN1173745C; EP0839055B1

Description

Technisches Gebiet
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind modifizierte Methioninase-Zusammensetzungen, Verfahren zur Reinigung von Methioninase, Verfahren zur Kopplung von Methioninase an ein Polymer, wie zum Beispiel PEG, Verwendung von Methioninase bei der Antimethionin- und Antihomocystein-Chemotherapie. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Verwendung von modifizierter Methioninase in der Krebstherapie, kardiovaskulären Therapie und zum Tumor-Imaging und zur -Diagnose. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter die rekombinante DNA-Technologie. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Module mit hoher Expression, die Methioninase kodieren.
Hintergrund
Die therapeutische medikamentöse Behandlung von Krebs ist auf die Verwendung von Arzneimitteln gerichtet, welche die Krebszellen selektiv inhibieren oder abtöten, während sie die normale Gewebsfunktion über einen akzeptierbaren Umfang hinausgehend nicht beeinträchtigen. Die Schwierigkeit mit der üblichen Chemotherapie bestand in der Toxizität der Therapeutika für normales Gewebe.
Es wurde gezeigt, dass viele Tumoren in vielen verschiedenen Zelltypen und evaluierten Tumorgeweben, einschließlich Tumoren des Kolons, der Brust, der Prostata, der Ovarien, Nieren, Larynx, Melanome, Sarkome, der Lunge, des Gehirns, Magens und der Blase ebenso wie Leukämien und Lymphome, einen absoluten Bedarf an Methionin aufweisen. Die Methioninabhängigkeit wurde als eine Unfähigkeit von Tumoren zu wachsen definiert, wenn Methionin im Wachstumsmedium durch Homocystein ersetzt wird. Siehe zum Beispiel Chello et al., Cancer Res., 33: 1898–1904, 1973; und Hoffman, Anticancer Res., 5: 1–30. 1985.
Es wurde gezeigt, dass eine Methionin-Depletion Methionin-abhängige Tumorzelien in der späten S/G₂-Phase des Zellzyklus selektiv synchronisiert. Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7310, 1980. Unter Verwendung der Kombination von Methionin-Verarmung, gefolgt von Repletion von Methionin, gekoppelt mit der Exposition gegenüber einem Antimitotikum, bezeichnet als Antimethionin-Chemotherapie, wurden Tumorzellen selektiv aus den Cokulturen von normalen Zellen und Tumorzellen eliminiert, was zu Kulturen mit kräftig proliferierenden normalen Zellen führt, Stern et al., J. Natl. Cancer Inst., 76: 629–639, 1986.
Damit jedoch eine Methionin-abhängige Chemotherapie in vivo durchgeführt werden kann, ist es notwendig, dass man über Mittel verfügt, die im Serum zirkulierendes Methionin wirksam depletieren. Es wurden keine Methionin-Depletionsverfahren beschrieben, die zirkulierende Methioninspiegel in vivo auf eine Weise reduzieren, die zu wirksamen Antitumortherapien ausreicht.
Methioninase, ein Enzym, das Methionin abbaut, wurde aus vielen verschiedenen Bakterienquellen gereinigt, und es wurde berichtet, dass es die Rate der Tumorzellproliferation in vitro verlangsamt. Kreis et al., Cancer Res., 33: 1862–1865 und 1866–1869, 1973; Tanaka et al., FEBS Letters, 66: 307–311, 1976; Ito et al., J. Biochem., 79: 1263–1272, 1976; und Nakayama et al., Agric. Biol. Chem., 48: 2367–2369, 1984.
Kreis et al., Cancer Res., 33: 1866–1869, 1973, haben die Verwendung von hoch unreinen Methioninase-Aufbereitungen beschrieben, die aus Clostridium sporogenes zu 1150 Einheiten/kg/Tag isoliert wurden, um das Wachstum von in ein Mausmodell implantierten Carcinosarkomzellen zu inhibieren. Obwohl das Enzym scheinbar das Zellwachstum des Primärtumors reduzierte, wurde nicht berichtet, dass es das T/C-Verhältnis (Verhältnis von Behandlung:Kontrolle) des Tumordurchmessers unter 50% reduzierte, und es wurde nicht berichtet, dass es eine Wirkung auf Metastasen aufweist. Die Autoren deuteten auch an, dass eine Tumorspezifität der Methioninase ohne andere nicht spezifizierte Interventionen nicht erwartet werden kann, und kommentieren nicht weiter über die Möglichkeit, dass Endotoxin oder andere Komponenten der unreinen Aufbereitung für die beobachteten Wirkungen verantwortlich waren. Die einzige in Studien berichtete Toxizität bestand in der Abwesenheit des Körpergewichtsverlusts der Tiere nach der Behandlungsdauer und eine negative makroskopische Untersuchung auf Toxizität. Die Autoren berichten weiter, dass das Enzym eine Serumhalbwertzeit von 4 Stunden aufwies. Die Enzymaufbereitung war nur halbrein und enthielt signifikante Endotoxinmengen, welche die Interpretation der Ergebnisse komplizieren.
Kreis war zudem unfähig, die Serummethioninspiegel auf unter ca. 8% der Kontrolle zu reduzieren. Dies ist möglicherweise der hohen K_m (ca. 90 mM) des Clostridium-Enzyms zuschreibbar. Es wurde berichtet, dass die Methioninase-Aufbereitung instabil war und bei ihrer Reinigung nur eine 29%ige Rückgewinnung (Ausbeute) erreicht werden konnte.
Kreis et al., Cancer Res., 33: 1866–1869, 1973, berichteten weiter die Verwendung einer Methionin-freien Ration als Mittel zur Depletion von Methionin als eine Antitumor-Therapie. Die Autoren berichten jedoch, dass die Ration das Tumorwachstum nicht so wirksam verlangsamte wie die Verwendung einer unreinen Aufbereitung von Methioninase und zu der unerwünschten Nebenwirkung des kontinuierlichen Gewichtsverlustes des Tieres führte. Die Autoren berichteten nicht die Verwendung von Methionin-defizienten Rationen kombiniert mit der Methioninase-Behandlung und untersuchten nicht die Zellsynchronisation.
Die erfindungsgemäßen Prioritätsanmeldungen offenbaren eine wirksame Chemotherapie von Tumoren, die auf die wirksame Reduktion der Methioninmenge gerichtet ist, um eine nützliche Antitumorwirkung ohne schädliche Verletzung unter Verwendung von Methioninase bereitzustellen. Gegenstand der Erfindung ist die Verbesserung der offenbarten therapeutischen und diagnostischen Verfahren und Zusammensetzung durch Bereitstellung einer Quelle zur Herstellung gewerblich brauchbarer Quantitäten von hochreiner rekombinanter Methioninase.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun entdeckt, dass Methioninase, entweder in PEGylierter Form oder wie hergestellt und gereinigt als eine hochreine Endotoxin-freie rekombinante Form, die Methioninspiegel in Säugern ohne Schädigung depletieren kann, wirksam zur selektiven Inhibition des Tumorwachstums und weiter zum selektiven Arretieren und dadurch Synchronisieren der Tumorzellen zur antimitotischen Chemotherapie verwendet werden kann.
Es wurde auch entdeckt, dass die Methionin-Depletion am wirksamsten ist, wenn mehrere verschiedene Verfahren synergistisch verwendet werden, um die wirksamen Methionin-Spiegel erheblich zu reduzieren. Diese Verfahren schließen Methionin- Verarmung unter Verwendung einer Methionin-freien Ernährung, die kompetitive Inhibition von Methionin durch Verwendung von Inhibitoren ein, die mit Methionin um die Methionin nutzenden Enzyme konkurrieren, Chemotherapeutika, die den Vorteil des durch die Methionin-Depletion und Kombinationen davon induzierten spezifischen Tumor-selektiven Zellzyklusblocks ausnutzen.
Folglich ist hierin ein Verfahren zur Inhibition des Tumorzellwachstums beschrieben, umfassend das Kontaktieren einer Population von Tumorzellen mit einer, wie hierin definierten, therapeutisch wirksamen Methioninasemenge für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Stase des Zellzyklus in Zellen der Population zu induzieren und statische Tumorzellen zu bilden. Unter „Kontaktieren" versteht man, dass die erfindungsgemäßen Therapeutika in eine ausreichend dichte Proximität zum targetierten Tumor dergestalt gebracht werden, dass eine Tumor-inhibierende Wirkung beobachtet wird, oder dass die Therapeutika in ein Medium, wie zum Beispiel in ein Nährmedium oder Blut dergestalt gegeben werden, dass der Methionin-Spiegel im Medium auf einen Spiegel abgesenkt wird, bei dem das Wachstum der Tumorzellen im Medium inhibiert wird. Unter „statischen" Tumorzellen versteht man Tumorzellen, deren Wachstum inhibiert ist. Das Verfahren kann in vitro oder in vivo praktisch ausgeführt werden. Das Kontaktieren der Tumorzellen braucht nicht direkt stattzufinden und kann durch Kontaktieren des Nährmediums, enthaltend die Tumorzellen, entweder in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Das Kontaktieren kann auch durch Kontaktieren von zirkulierendem Blut mit Methioninase erreicht werden. Solches zirkulierende Blut kann Tumorzellen enthalten oder keine enthalten, da es sich bei den Tumoren um solide Tumoren handeln kann, die nicht zirkulieren. Unter „Inhibieren des Tumorzellwachstums" versteht man, dass die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindung das Wachstum eines Tumors, wie zum Beispiel anhand der Größe gemessen, im Vergleich zu einem Tumor, der nicht mit der Verbindung behandelt wurde um 10% bis 100%, bevorzugter um 34% bis 79% und noch bevorzugter um 55% bis 68% reduziert.
Methioninase wird als Antitumor-Reagens zur Verlangsamung oder zum Stoppen der Zellteilung durch Depletion von Methionin verwendet. Diese Wirkung kann mit kompetitiven Inhibitoren des Methionins verstärkt werden. Methioninase kann außerdem in Kombination mit antimitotischen und anderen Zellzyklus-spezifischen zytotoxischen Mitteln verwendet werden, um die therapeutische Wirksamkeit der antimitotischen oder anderen Zellzyklus-spezifischen zytotoxischen Mittel durch Induktion der Zellzyklussynchronisation zu erhöhen.
Methioninase wird auch bei der Homocystein-Depletionschemotherapie zur Reduktion des Risikos für eine und zur Behandlung einer kardiovaskuläre(n) Erkrankung verwendet. Methioninase wird auch zur Depletion von [¹²C]-Methionin im Blut und Tumor vor der Repletion mit [¹¹C]-Methionin zum Nachweis und zur Diagnose von Tumoren im Körper bei ultrahoher Auflösung verwendet.
In einer Ausführungsform werden die Tumorzellen zuerst einem Methionin-Verarmungsschritt unterzogen, um zuerst den Methionin-Spiegel zu reduzieren. Die Methionin-Verarmung kann optional von Homocystein begleitet sein, um die Toxizität für normale Zellen zu reduzieren, wodurch die Spezifität der Therapie erhöht wird.
Ein anderer hierin beschriebener verwandter Aspekt stellt die Verwendung der vorliegenden Methionin-Depletionsverfahren zum Arretieren der Tumorzellen in der späten S/G₂-Phase des Zellzyklus heraus, gefolgt von der Behandlung zur synchronen Initiierung des „Cycling" von Zellen und der Verabreichung eines Zellzyklus-spezifischen zytotoxischen Mittels, wie zum Beispiel eines Antimitotikums zum selektiven und wirksamen Abtöten von Tumorzellen. Der Durchschnittsfachmann ist mit Zellzyklus-spezifischen zytotoxischen Mitteln, die für Zellen in bestimmten Phasen des Zellzyklus toxisch sind, vertraut. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Kontaktieren der statischen Tumorzellen, die durch den vorangehenden Methionin-Depletionsschritt mit einer Zellzyklus-induzierenden Methioninmenge zur Initiierung des „Cyclings" von Zellen der „Cycling"-Zellen bildenden statischen Tumorzellen hergestellt werden, und
(b) Kontaktieren der „Cycling"-Zellen mit einem Zellzyklus-spezifischen zytotoxischen Mittel in einer Menge, die zur Inhibition der Mitose der Mitosezellen ausreicht, wodurch das Tumorzellwachstum inhibiert wird.

In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

(a) Kontaktieren der statischen Tumorzellen, die durch den vorangehenden Methionin-Depletionsschritt mit einer Zellzyklus-induzierenden Methioninmenge zur Initiierung der Mitose der Mitosezellen bildenden statischen Tumorzellen herbeigeführt werden, und
(b) Kontaktieren der Mitosezellen mit einem Antimitotikum in einer Menge, die zur Inhibition der Mitose der Mitosezellen ausreicht, wodurch das Tumorzellwachstum inhibiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Methioninase zur Senkung der Homocystein-Spiegel in Patienten zur Reduktion des Risikos für und zur Behandlung von kardiovaskuläre(n) Erkrankungen.
Hierin ist ein Verfahren zur Depletion von Methionin durch Verabreichung von Methioninase zur Tumordiagnose und zum Tumor-Imaging beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Therapeutika zur Methionin-Depletionstherapie, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von im Wesentlichen isolierter Methioninase mit einer spezifischen Aktivität von mindestens ca. 10 bis ca. 50 Einheiten Methioninaseaktivität pro Milligramm (mg) Protein und weniger als ca. 1 bis ca. 100 ng Endotoxin pro mg Protein. In der bevorzugten Ausführungsform enthält das Therapeutikum weniger als 10 Nanogramm Endotoxin pro mg Protein, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die hierin beschriebenen Therapeutika schließen auch eine Endotoxin-freie Methioninase ein. In einer Ausführungsform wird die Methioninase, unter Verwendung eines neuen und effizienten Verfahrens aus Pseudomonas putida unter verbesserten Fermentationsbedingungen gezüchtet, hergestellt. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß auch ein Verfahren zur Isolation eines verbesserten, einen hohen Methioninasegehalt produzierenden Stammes von P. putida bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform wird die Methioninase aus einem rekombinanten Wirt, enthaltend ein Expressionsmodul, das Methioninase codiert, hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Methioninase-Zusammensetzungen werden in einer chemisch modifizierten Form durch Kopplung der Methioninase an Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG), gebildet. Die erfindungsgemäße PEG-modifizierte Methioninase weist eine hohe Methionin-Depletionsaktivität, eine verlängerte Halbwertzeit und eine niedrige Immunogenität auf.
Die erfindungsgemäßen Methioninase-Zusammensetzungen, die auch als ein rekombinantes Protein bereitgestellt sind, das unter Verwendung eines Expressionsvektors, wie zum Beispiel eines Vektors mit hoher Expression, produziert wird, sind hierin definiert. Unter Verwendung eines Systems mit hoher Expression hergestellte Methioninase kann ohne weiteres unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren gereinigt werden, um eine Methioninase-Zusammensetzung zu erhalten, die Endotoxin-frei und hochrein ist, wobei die spezifische Aktivität von ca. 10 bis ca. 50 Einheiten/mg Methioninase beträgt.
Gegenstand der Erfindung sind weiter Vektoren, enthaltend Nukleinsäure-Moleküle, die unerwartet hohe Methioninasespiegel exprimieren. Derartige Vektoren, wie zum Beispiel die, die den T7-RNA-Polymerase-Promotor benutzen, wurden zur Herstellung von Methioninase zu ca. 1 bis ca. 4 g/Liter mit einer spezifischen Aktivität von ca. 2,6 bis ca. 5 im Rohhomogenat, das von ca. 10 bis ca. 20% des zellulären Gesamtproteins unter geeigneten Inkubationsbedingungen darstellt, verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind weiter Gentherapie-Verfahren, die ein cloniertes Niethioninasegen benutzen, das anstelle von Zusammensetzungen verwendet werden kann, die Methioninase für die hierin offenbarten Verfahren enthalten. Die Zellen können verändert werden, um Methioninase in einem Patienten als ein Mittel zur Abgabe einer therapeutischen Methioninasemenge an das Serum des Patienten zu exprimieren.
Andere Merkmale, Vorteile und verwandte erfindungsgemäße Ausführungsformen werden basierend auf den hierin enthaltenen Offenbarungen erkannt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zusammenstellung von 6 graphischen Darstellungen zur Erläuterung des Wachstums von Tumorzelllinien in Methionin-freien, Homocystein-freien oder Methionin- und Homocystein-freien Medien.
2 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirksamkeit von Methioninase zur Reduktion des Wachstumsgrades des humanen Lungentumors (H460) in Maus-Xenotransplantaten erläutert. Die Ergebnisse von der Behandlung mit 5-FU und Vincristin sind auch erläutert.
3 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung von Methioninase, 5-FU und Vincristin auf das Körpergewicht von Mäusen mit implantiertem humanem Lungentumor (H460) erläutert.
4, 5 und 6 sind graphische Darstellungen der Pharmakokinetik von Methioninase und Methionin nach Verabreichung von Methioninase an drei humane Patienten. Der prozentuale Anteil der Methioninase-Aktivität wird als ein relativer prozentualer Anteil der Aktivität der Ausgangsaufbereitung von Methioninase gemessen. Der prozentuale Anteil von Methionin wird als ein relativer prozentualer Anteil der Methionin-Konzentration vor Verabreichung von Methioninase gemessen.
7 ist eine Erläuterung des Methioninase-Homocystein-Stoffwechselzyklus.
8 stellt die Nukleotidsequenz und entsprechende Aminosäuresequenz von Methioninase dar, die das aus P. putida isolierte DNA-Molekül codiert.
9 stellt ein Diagramm von in Vektoren enthaltenen repräsentiven Modulen mit hoher Expression dar.
10 stellt einen Umriss der verwendeten Reinigungsschritte zum Erhalt hochreiner, Endotoxin-freier Methioninase bereit.
11 stellt eine Übersicht über die typische Reinheit und Rückgewinnungsausbeuten für rMETase unter Verwendung des hierin beschriebenen Reinigungsverfahrens bereit.
12 stellt ein Beispiel der Reinheit der anhand der vorliegenden Verfahren hergestellten rMETase bereit.
13 stellt ein Aktivitätsprofil für verschiedene rMETase-Formulierungen bereit.
14 stellt HPLC-Analysedaten für PEG-rMETase bereit.
15 stellt HPLC-Analysedaten für PEG-rMETase bereit.
16 stellt die Pharmakokinetik von PEG-rMETase in Mäusen bereit.
17 stellt die von der rMETase auf KB3-1-Zellen in vitro bereitgestellte Wachstumsinhibition bereit.
18 stellt die Wirksamkeit von rMETase gegen KB3-1-Zellen in nackten Mäusen bereit.
19 stellt die Toxizität von rMETase auf das Körpergewicht in nackten Mäusen bereit.
20 stellt die Toxizität von rMETase auf Blutzellen in nackten Mäusen mit KB3-1-Zellen bereit.
21 stellt die Toxizität von rMETase in BALB/c-Mäusen bereit.
22 stellt die Toxizität von rMETase in BALB/c-Mäusen bereit.
23 stellt eine Toxizitätsbewertung von Methioninase in humanen Patienten bereit.
24 stellt eine pharmakokinetische Bewertung von rMETase in einem humanen Patienten bereit.
25 stellt Daten bereit, welche die Wachstumsinhibition von rMETase auf H460 und HT29 in nackten Mäusen nachweist.
26 stellt einen Vergleich der Empfindlichkeiten für rMETase zwischen normalen Zellen und humanen Krebszellen in vitro bereit.
Die Zeichnungen sind nicht unbedingt maßstabgerecht und bestimmte erfindungsgemäße Merkmale können gegebenenfalls im Interesse der Klarheit und Präzision maßstabmäßig übertrieben und in schematischer Form gezeigt sein.
Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
Unter „Aminosäurerest" versteht man eine Aminosäure, die nach chemischem Aufschluss (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidverknüpfungen gebildet wird. Die hierin beschriebenen Aminosäurereste liegen bevorzugt in der „L"-isomeren Form vor. Reste in der „D"-isomeren Form können jedoch für jedweden L-Aminosäurerest substituiert werden, solange die gewünschte funktionelle Eigenschaft durch das Polypeptid beibehalten wird. NH₂ verweist auf die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids anwesend ist. COOH verweist auf die freie Carboxygruppe, die am Carboxyterminus eines Polypeptids anwesend ist. Im Einklang mit der Standardpolypeptid-Nomenklatur (beschrieben in J. Biol. Chem., 23: 3552–59. 1969 und bei 37 C. F. R. 1.822 (b) (2) übernommen), ist hierdurch unter Bezugnahme eingeschlossen [sic].
Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass alle Aminosäurerest-Sequenzen, die hierin durch Formeln dargestellt sind, eine links-nach-rechts Orientierung in der üblichen Richtung des Aminoterminus zum Carboxyterminus aufweisen. Außerdem ist die Phrase „Aminosäurerest" breitgefächert definiert, um die in der entsprechenden Tabelle aufgelisteten Aminosäuren und modifizierten und ungewöhnlichen Aminosäuren einzuschließen, wie zum Beispiel die, die in 37CFR 1.822 (b) (4) aufgelistet sind und hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind. Es sollte weiter zur Kenntnis genommen werden, dass ein Gedankenstrich am Anfang oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz aus einem oder mehr Aminosäurerest(en) oder eine kovalente Bindung an eine Amino-terminale Gruppe, wie zum Beispiel NH₂ oder Acetyl oder an eine Carboxy-terminale Gruppe, wie zum Beispiel COOH, anzeigt.
Unter „rekombinantem DNA-Molekül (rDNA-Molekül)" versteht man ein DNA-Molekül, das durch funktionelle Verknüpfung zweier DNA-Segmente hergestellt wird. Ein rekombinantes DNA-Molekül stellt folglich ein Hybrid-DNA-Molekül dar, umfassend mindestens zwei Nukleotidsequenzen, die in der Regel nicht zusammen in der Natur vorkommen. Man sagt, dass rDNAs, die keine gemeinsame biologische Herkunft aufweisen, d. h. evolutionär unterschiedlich sind, „heterolog" sind.
Unter „Vektor" versteht man ein rDNA-Molekül, das zur autonomen Replikation in einer Zelle fähig ist und an das ein DNA-Segment, z. B. ein Gen oder Polynukleotid, funktionell verknüpft werden kann, um auf diese Weise die Replikation des angelagerten Segments herbeizuführen. Vektoren, die zum Richten der Expression von Genen fähig sind, die für ein oder mehr Polypeptid(e) codieren, werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Besonders wichtige Vektoren erlauben die zweckmäßige Expression eines erfindungsgemäßen Methioninase-Proteins.
B. Methioninase als ein Antitumormittel
I. Methionin-Depletion
Methioninase wird hierin als ein Antitumormittel in vielen verschiedenen Modalitäten für im Wesentlichen zum Depletieren von Methionin aus einer Tumorzelle, Tumorgewebe oder dem Kreislauf eines Säugers mit Krebs oder zur Depletion von Methionin, wenn seine Depletion als wünschenswert erachtet wird, wie weiter hierin beschrieben wird, verwendet.
Wohingegen Verfahren aus dem Stand der Technik die Spiegel von Methionin in vivo auf nicht niedriger als ca. 35 Mikromol (μM) reduzieren können, sind keine Verfahren bekannt, die Methionin-Spiegel sicher, leicht und rasch erheblich unter ca. 10 μM senken können. Unter erheblich versteht man mindestens nachweisbar unter 10 μM, bevorzugt weniger als 1 μM, bevorzugter weniger als 0,1 μM und am bevorzugtesten auf nicht nachweisbare Spiegel, unter Verwendung üblicher Methionin-Nachweisverfahren. Methionin kann in wässrigen Lösungen, einschließlich Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Plasma und Serum, anhand vieler verschiedener Verfahren gemessen werden. Ein beispielhaftes Verfahren stellt die Umkehrphasen-FPLC unter Verwendung von Methionin-Standards dar.
Die Depletion kann in vivo im Kreislauf eines Säugers, in vitro in Fällen, in denen die Methionin-Depletion in der Gewebekultur oder anderen biologischen Medien erwünscht ist und in Verfahren ex vivo, bei denen biologische Flüssigkeiten, Zellen oder Gewebe außerhalb des Körpers manipuliert und anschließend in den Körper des Patienten (Säugers) zurückgebracht werden, durchgeführt werden.
Die Depletion von Methionin im Kreislauf, in Kulturmedien, biologischen Flüssigkeiten oder Zellen wird zur Reduktion der Methioninmenge, die für das zu behandelnde Material zugänglich ist, durchgeführt und umfasst deshalb das Kontaktieren des zu depletierenden Materials mit einer Methionin-depletierenden erfindungsgemäßen Methioninasemenge unter Methionin-depletierenden Bedingungen, um auf diese Weise das umgebende Methionin im zu kontaktierenden Material abzubauen.
Da Tumorzellen von ihrem Nährmedium für Methionin abhängig sind, kann die Depletion auf die Nährquelle für die Zellen und nicht unbedingt auf die Zellen selbst gerichtet werden. Deshalb kann bei einer erfindungsgemäßen Applikation in vivo die Methioninase mit dem Nährmedium für eine Population von Tumorzellen kontaktiert werden. in dieser Ausführungsform kann es sich bei dem Medium um Blut, Lymphe, Spinalflüssigkeit und ähnliche Körperflüssigkeiten handeln, wo die Methionin-Depletion erwünscht ist.
Eine Methionin-depletierende Menge kann, abhängig von der Applikation, sehr weitgehend variieren und in der Regel von der im Material anwesenden Methioninmenge der gewünschten Depletionsrate und der Toleranz des Materials zur Exposition gegenüber Methioninase abhängen. Die Methionin-Spiegel in einem Material und deshalb die Raten der Methionin-Depletion aus dem Material können ohne weiteres mittels einer Reihe verschiedener aus dem Stand der Technik überall bekannter chemischer und biochemischer Verfahren überwacht werden. Beispielhafte Methionindepletierende Mengen werden hierin weiter beschrieben und können im Bereich von 0,001 bis 100 Einheiten (U) Methioninase, bevorzugt ca. 0,01 bis 10 U und bevorzugter ca. 0,1 bis 5 U Methioninase pro Milliliter (ml) des zu behandelnden Materials liegen.
Methionin-depletierende Bedingungen stellen mit der biologischen Aktivität des Methioninase-Enzyms kompatible Pufferungs- und Temperaturbedingungen dar und schließen mit dem Enzym kompatible moderate Temperatur-, Salz- und pH-Bedingungen ein. Beispielhafte Bedingungen schließen ca. 4–40 Grad Celsius (°C), eine Ionenstärke, die ca. 0,05 bis 0,2 M NaCl entspricht und einen pH von ca. 5 bis 9, obwohl physiologische Bedingungen bevorzugt sind, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß Methioninase als ein Antitumormittel und die Verwendung von Methioninase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren in Betracht gezogen und umfasst deshalb das Kontaktieren einer Population von Tumorzellen mit einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge für eine Zeitdauer, die zur Induktion der Stase des Zellzyklus in Zellen der Population und zur Bildung statischer Tumorzellen ausreichend ist.
Wie hierin beschrieben ist die Platzierung von Tumorzellen in die Zellzyklusstase aus vielen verschiedenen Gründen, einschließlich, aber nicht begrenzt darauf, die selektive Verlangsamung des Tumorwachstums, Abtöten der Tumorzellen durch Aufrechterhaltung der Zellen in Stase für solche verlängerten Zeitspannen, um auf diese Weise den Zelltod herbeizuführen und Aufbereitung einer Population von Tumorzellen für die Zellzyklussynchronisation vor einer anschließenden chemotherapeutischen Behandlung und dergleichen wünschenswert.
Die zur Induktion der Zellzyklusstase durch Kontakt mit Methioninase erforderliche Zeitdauer hängt von mehreren Faktoren ab, wie zum Beispiel der Methioninasemenge, die mit den Zellen oder dem die Zellen enthaltenden Medium in Kontakt kommt, der Methioninmenge, der spezifischen Aktivität des Enzyms, der Temperatur und anderen Reaktionsbedingungen, die sich auf die Reaktionsrate auswirken und ähnliche Parameter, die ohne weiteres vom Fachmann kontrollierbar sind. Bei typischen Zeitdauern handelt es sich um 10 Minuten bis ca. 30 Tage, bevorzugt ca. 1 Stunde bis 20 Tage und bevorzugter ca. 1 bis 10 Tag(e).
Die Zellzyklusstase ist ein Zustand, in dem sich die Zelle weder teilt noch durch den vollen Zyklus von Ereignissen zykliert, wobei die Phasen individuell als G₀-, G₁-, G₂- und S-Phasen bezeichnet werden. Es wird angenommen, dass die Zellen nach der Methionin-Depletion in der späten S/G₂-Phase das „Cycling" einstellen, wie durch die DNA-Akkumulation relativ zu normalen ruhenden Zellen belegt werden konnte. Verfahren zur Identifizierung der Zellzyklusstase können anhand vieler verschiedener histologischer Verfahren bestimmt werden und können mittels der Zellkultur evaluiert werden und beinhalten, wie in den Beispielen beschrieben, das Messen des DNA-Gehalts einer Zellpopulation.
Tumoren, für die die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verwendungen nützlich sind, schließen jedweden malignen Zelltyp ein, wie er zum Beispiel in einem soliden Tumor oder einem hämatologischen Tumor gefunden wird. Beispielhafte solide Tumoren können folgende einschließen, sind aber nicht begrenzt auf einen Tumor eines Organs, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pankreas, Kolon, Zäkum, Magen, Gehirn, Kopf, Hals, Ovarien, Nieren, Larynx, Sarkom, Lunge, Blase, Melanom, Prostata und Brust. Beispielhafte hämatologische Tumoren schließen Tumoren des Knochenmarks, T- und B-Zellmalignitäten, Leukämien, Lymphome, Blastome, Myelome und dergleichen ein.
In einer Ausführungsform wird das Kontaktieren in vivo durch Verabreichung, durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion, einer therapeutisch wirksamen Menge einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung, enthaltend erfindungsgemäße Methioninase an einen Patienten erreicht, wobei die zirkulierende Methioninquelle der in dem Patienten vorliegenden Tumorzellen depletiert wird. Das Kontaktieren von Methioninase kann auch durch Verabreichung der Methioninase in das Gewebe, enthaltend die Tumorzellen erreicht werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer Methioninase stellt eine prädeterminierte Menge dar, die zum Erreichen der gewünschten Wirkung, d. h. zur Depletion von Methionin im Tumorgewebe oder im Kreislauf eines Patienten berechnet wird und dadurch die Tumorzellen veranlasst, sich nicht mehr zu teilen.
Die Dosierungsbereiche zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Methioninase sind folglich die, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung herbeizuführen, bei der die Symptome der Tumorzellteilung und das „Cycling" von Zellen reduziert sind. Die Dosierung sollte nicht so groß sein, dass sie unerwünschte Nebenwirkungen, wie zum Beispiel das Hyperviskositätssyndrom, Lungenödeme, dekompensierte Herzinsuffizienz und dergleichen verursacht. Die Dosierung wird im Allgemeinen mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und dem Schweregrad der Erkrankung des Patienten variieren und kann von einem Fachmann festgelegt werden.
Die Dosierung kann von dem jeweiligen Arzt im Falle von jedweder Komplikation angepasst werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Methioninase stellt in der Regel eine Menge dergestalt dar, dass sie – wenn sie in einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung verabreicht wird – ausreichend ist, um eine intravasale (Plasma) oder lokale Konzentration von ca. 0,001 bis ca. 100 Einheiten (U) pro ml, bevorzugt über ca. 0,1 U und bevorzugter über 1 U Methioninase pro ml zu erreichen. Typische Dosierungen können auf das Körpergewicht bezogen verabreicht werden und liegen im Bereich von ca. 5–1000 U/Kilogramm (kg)/Tag, bevorzugt ca. 5–100 U/kg/Tag, bevorzugter ca. 10–50 U/kg/Tag und noch bevorzugter ca. 20–50 U/kg/Tag.
In bevorzugten Verbindungen, Zusammensetzungen und Verwendungen ist eine verwendete Methioninase im Wesentlichen frei von Endotoxin, wie weiter hierin besprochen wird. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von rekombinant hergestellter Methioninase, die im Wesentlichen frei von Endotoxin ist.
Die Methioninase kann parenteral mittels Injektion oder durch graduelle Infusion in Abhängigkeit der Zeit verabreicht werden. Methioninase kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, oral, intramuskulär, subkutan, intrakavitär, transdermal und dermal verabreicht werden, kann durch peristaltische Mittel abgegeben werden oder kann direkt in das Gewebe, enthaltend die Tumorzellen, injiziert werden oder kann mithilfe einer Pumpe, die an einen Katheter angeschlossen ist, der einen potenziellen Biosensor oder Methionin enthalten kann, verabreicht werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, enthaltend Methioninase, sollen üblicherweise intravenös, wie zum Beispiel durch Injektion einer Dosiseinheit, verabreicht werden. Der Begriff „Dosiseinheit", wenn unter Bezugnahme auf ein erfindungsgemäßes Therapeutikum verwendet, verweist auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosierungseinheit für die Person geeignet sind, wobei jede Einheit eine prädeterminierte Quantität des Wirkstoffs enthält, der zur Herbeiführung der gewünschten therapeutischen Wirkung in Assoziation mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. dem Träger oder Vehikel, berechnet wird.
Die Zusammensetzungen sind auf eine mit der Dosierungsformulierung kompatible Weise und in einer therapeutisch wirksamen Menge zu verabreichen. Die zu verabreichende Quantität hängt von dem zu behandelnden Patienten, der Kapazität des Systems des Patienten zur Nutzung des Wirkstoffs und dem Grad der gewünschten therapeutischen Wirkung ab. Präzise Mengen des zu verabreichenden erforderlichen Wirkstoffs obliegen dem Ermessen des Arztes und sind für jeden Patienten individuell abgestimmt. Hierin sind jedoch geeignete Dosierungsbereiche für die systemische Applikation offenbart, die von der Verabreichungsroute abhängen. Geeignete Regime zur initialen Verabreichung und Auffrischungsgaben („Booster Shots") werden auch in Betracht gezogen und nehmen die Form einer initialen Verabreichung, gefolgt von Wiederholungsdosen in ein- oder mehrstündigen Intervallen durch eine sich anschließende Injektion oder andere Verabreichung an. Beispielhafte Mehrfachverabreichungen werden hierin beschrieben und sind insbesondere zur Aufrechterhaltung von kontinuierlich hohen Methioninasespiegeln im Serum und Gewebe und umgekehrt niedrigen Serum- und Gewebs-Methioninspiegeln bevorzugt. Als Alternative werden intravenöse Dauerinfusionen, die zur Aufrechterhaltung der Konzentrationen im Blut in für in vivo-Therapien in den spezifizierten Bereichen ausreichend sind, in Betracht gezogen.
II. Methionin-Depletion
Bei der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung kann die Methionin-Depletion durch Kontaktieren eines Methionin-enthaltenden Materials mit Methioninase, wie vorstehend beschrieben, von einem oder mehr supplementierenden Methionin-Depletionsschritt(en) begleitet sein. Es werden überdies erfindungsgemäß eine Reihe verschiedener Behandlungsverfahren in Betracht gezogen, bei denen, wie hierin nachstehend weiter beschrieben ist, die Depletion von Methionin wünschenswert ist.
a. Methionin-Verarmung
Ein Methionin-Verarmungsschritt kann zum Beispiel verwendet werden, um zuerst die umgebenden Methioninspiegel zu reduzieren, worin der Verarmungsschritt das Kontaktieren der Tumorzelle(n) mit Methionin-freien Nährstoffen für eine Zeitspanne der Methioninverarmung, die vor oder während des Methioninase-Kontaktierungsschrittes durchgeführt wird, beinhaltet. Ein Methionin-Verarmungsschritt kann die Verwendung von Methionin-defizientem Medium in vitro, d. h. Medium mit niedrigen Methioninspiegeln oder keinem Methionin oder die Verwendung in vivo einer Methionin-freien Ernährung umfassen. Methioninfreie Medien sind überall aus dem Stand der Technik der Gewebekulturen bekannt. Ein beispielhaftes Medium stellt das Eagle Minimal Essential Medium (mit mangelndem Methionin und Cholinchlorid) mit nicht essentiellen Aminosäuren dar, wie es zum Beispiel von GIBCO erhältlich ist. Methionin-defiziente Aminosäurenährstoffe sind auch gewerblich erhältlich, einschließlich des Nährstoffs TD 92077, der von der Teklad Inc. erhältlich ist.
Die Zeitspanne für einen Methionin-Verarmungsschritt kann von der speziellen Applikation abhängig, sehr weitgehend variieren und stellt eine Zeitspanne dar, die ausreicht, um die Konzentrationen von Methionin in der Zellkultur, im Gewebe oder in Gefäßen auf einen niedrigeren Spiegel abzusenken und jedwede weitere erheblichen Abnahmen des Spiegels aufzuhalten. Typische Zeitspannen können von ca. 6 Stunden bis ca. 2 Monate, bevorzugt ca. 1 Tag bis 2 Wochen betragen.
Da es sich bei Methionin um eine essentielle Aminosäure handelt, ist zur Kenntnis zu nehmen, dass viele Applikationen der vorliegenden Verfahren für normale Zellen etwas toxisch sein können. Wie jedoch hierin beschrieben, metabolisieren normale Zellen und Tumorzellen den Methionin-Präkursor, Homocystein, unterschiedlich dahingehend, dass Homocystein die Methionin-Defizienzen in normalen Zellen supplementieren kann, während es die Methionin-Defizienzen von Tumorzellen nicht zu „retten" vermag.
Folglich wird in einer verwandten erfindungsgemäßen Ausführungsform die Verwendung eines Methionin-defizienten Nährstoffes (Medium oder Ernährung), der mit einem Methionin-Präkursor, wie zum Beispiel Homocystein oder einem Analogon davon supplementiert werden kann, der bei normalen Zellen zur Bereitstellung notwendiger Ernährungssupplemente verwendet werden kann, in Betracht gezogen. Homocystein kann dem Nährmedium bei einer Konzentration von ca. 5 bis ca. 200 Mikromol (μM), bevorzugt ca. 10 bis ca. 100 μM zugefügt werden.
In dieser Ausführungsform nützliche bevorzugte Methionin-Präkursoren schließen L-Homocystein-Thiolacton, Homocystein und 4-Methylthio-2-oxobutansäure ein.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst der Schritt des Fütterns eines Säugers mit einer Methionin-defizienten Ernährung folglich eine Zeitspanne, um die intravasalen Konzentrationen des Methionins zu depletieren. Die Ernährung kann optional Methionin-Präkursoren als ein Methionin-Supplement enthalten. Als Alternative kann der Methionin-Präkursor, wie überall bekannt ist, durch Injektion oder andere Routen verabreicht werden. Bevorzugte tägliche Dosierungen des Homocysteins als ein Ernährungssupplement betragen ca. 5 bis ca. 1000 mg Homocystein pro Kilogramm Körpergewicht des Säugers pro Tag.
Die Verabreichungsrouten des Homocysteins sind in der Regel die gleichen wie für die zuzufügende Methioninase und hängen zur Abgabe des Supplements vom Zielgewebe ab.
b. Kompetitive Inhibitoren der Methionin nutzenden Enzyme
Den in den Beispielen beschriebenen Beobachtungen zufolge wurde weiter entdeckt, dass kompetitive Inhibitoren der Methionin nutzenden Enzyme zur synergistischen Steigerung der Wirksamkeit von hierin beschriebenen Methionin-Depletionsverfahren nützlich sind. Folglich wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Methionin-Verarmungsschrittes in Betracht gezogen, der weiter das Kontaktieren der Tumorzellen mit einer Menge eines kompetitiven Inhibitors von Methionin über eine Zeitspanne, die zur Inhibition des Methioninmetabolismus durch ein Methionin nutzendes Enzym ausreicht. Methioninnutzende Enzyme, die zur Lenkung kompetitiver Inhibitoren nützlich sind, schließen S-Adenosyl-methionin-decarboxylase, Methionin-t-RNA-Synthase und Methionin-Adenosyltransferase ein.
Die zur Inhibition von Methionin erforderliche Zeitspanne stellt bevorzugt die Dauer der Methionin-Verarmungszeitspanne selbst ein.
Kompetitive Methionin-Inhibitoren konkurrieren mit Methionin als ein Substrat für Methionin-nutzende Enzyme und wirken deshalb zur Inhibition jedweder normalen metabolischen Wirkung, die endogenes Methionin durch direkten Wettbewerb, d. h. Inhibition des Methionin-Metabolismus, produzieren könnte. Wenn die Zelle Methionin und den damit einhergehenden Methioninmetabolismus erfordert, wirkt der kompetitive Inhibitor zur Reduktion des Methionin-Metabolismus, wobei zum Erreichen der gleichen Wirkung, die beobachtet wird, wenn kein Inhibitor anwesend ist, höhere Methionin-Konzentrationen erforderlich sind.
Bei einem kompetitiven Inhibitor von Methionin kann es sich um jedwedes Methionin-Derivat handeln, das als ein klassischer kompetitiver Inhibitor funktioniert. Typische kompetitive Inhibitoren schließen Alkylderivate von Methionin (d. h. Alkylthionine) ein, bei dem die Methylgruppe von Methionin zum Beispiel durch eine Ethylgruppe (Ethionin), eine Propylgruppe (Propthionin), eine Butylgruppe (Buthionin) oder eine Pentylgruppe (Pnthionin) ersetzt ist.
Als nützliche Methionin-kompetitive Inhibitoren werden auch Cycloleucin und halogenierte Methionine in Betracht gezogen. Ein typisches halogeniertes Methionin ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Fluormethionin, Chlormethionin, Bromethionin und Iodmethionin besteht. Folglich wird ein in Betracht gezogener kompetitiver Inhibitor von Methionin aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkylthionin, Cycloleucin und einem halogenierten Methionin besteht, worin das genannte Alkylthionin nicht Methionin ist.
Eine Menge eines kompetitiven Methionin-Inhibitors, der zur kompetitiven Inhibition von Methionin wirksam ist, stellt eine Menge dar, um eine Reduktion der wirksamen Methionin-Konzentration hervorzurufen. Diese Menge stellt, wie in den Beispielen gezeigt, in der Regel einen molaren Überschuss im Vergleich zum anwesenden Methionin dar. Diese Inhibitormenge liegt in der Regel im Bereich eines 10- bis 1000fachen molaren Überschusses im Vergleich zur Methionin-Konzentration im Medium, in dem das Methionin kompetitiv inhibiert werden soll, die bevorzugt das mindestens 20fache des molaren Überschusses und bevorzugter mindestens das 50fache des molaren Überschusses aufweist. Wenn der Inhibitor in vivo verwendet werden soll, liegt die Dosierung, wie hierin gezeigt wird, in der Regel bei ca. 5–30 mg pro kg des Tierkörpergewichts, bevorzugt bei ca. 25 kg/kg.
Die zur Wirksamkeit erforderliche Inhibitormenge kann abhängig von der Menge des anwesenden endogenen Methionins zum Zeitpunkt, an dem der Inhibitor verabreicht wird, variieren. Diese Beziehung zwischen der Methionin-Konzentration und der wirksamen Konzentration des Inhibitors wird durch die in den Beispielen gezeigten Dosierungstitrationsergebnisse nachgewiesen und ist durch die klassische Reaktionsratentheorie für kompetitive Inhibitoren definiert. Typische Inhibitormengen liegen im Bereich von ca. 10 μM bis ca. 1 mM.
Die Menge des wirksamen Inhibitors kann überdies durch die hierin beschriebenen in vitro-Histokulturverfahren prädeterminiert werden, um zuerst die wirksamen Bedingungen in einem bestimmten Tumorgewebe auf Methionin-Depletion durch jedwede der hierin beschriebenen Verfahren, gefolgt von der Bestimmung der wirksamen Konzentration des Inhibitors zu etablieren.
Die Inhibition des Methionin-Metabolismus durch Verwendung eines kompetitiven Methionin-Inhibitors kann durch viele verschiedene Indikatoren, einschließlich der in den Beispielen beschriebenen Indikatoren überwacht werden. Diese Indikatoren schließen die Histokultur eines Gewebes zum Messen des DNA-Gehalts als einen Indikator des Arretierens des Zellzyklus und erhöhte Inhibition des Wachstums von Tumorgewebe in einer mit einer Methionin-freien Ration gefütterten Maus ein. Andere Indikatoren werden vom Fachmann erkannt werden.
c. Synergistische Wirkung der Verwendung von mehrfachen Methionin-Depletionsverfahren – Antimethionin-Chemotherapie
Eine hierin beschriebene Ausführungsform zieht die Verwendung mehrfacher Verfahren zur Methionin-Depletion, auf die im Allgemeinen als auf Antimethionin-Chemotherapie verwiesen wird, in Betracht, um den Vorteil der Synergie wahrzunehmen, der auftritt, wenn zwei oder mehr verschiedene Verfahren zur Methionin-Depletion eingesetzt werden.
Zu den hierin beschriebenen Methionin-Depletionsverfahren gehören Folgende: (1) Die Methionin-Verarmung unter Verwendung eines Methionin-freien Mediums (in vitro) oder in der Ernährung (in vivo), (2) Exposition gegenüber Methioninase zur enzymatischen Depletion endogener Methionin-Spiegel, (3) kompetitive Methionin-Inhibitoren zur Reduktion der wirksamen Konzentration von endogenem Methionin, insbesondere in Kombination mit Verfahren (1) und (2) vorstehend, wo die Methioninspiegel bereits reduziert sind und (4) Verwendung von Methionin-Präkursoren, wie zum Beispiel das hierin beschriebene Homocystein, zur Steigerung der Selektivität von jedwedem der anderen drei Methionin-Depletionsverfahren für Tumorzellen.
Folglich können die hierin beschriebenen Antimethionin-Chemotherapieverfahren zur Methionin-Depletion durch jedwede Art von Kombinationen der oben identifizierten Verfahren, einschließlich (1) plus (2), (1) plus (3), (2) plus (3), (1) plus (2) plus (3) und jedwede dieser vier Kombinationen plus (4) durchgeführt werden.
Zur maximalen Depletion von Methionin und seiner sich ergebenden Metaboliten besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Methionin-freien Ernährung, die aber Methionin-Präkursoren enthält, einschließlich der Verwendung eines kompetitiven Inhibitors von Methionin und Methioninase.
III. Enhancement der antimitotischen Tumortherapie
In einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung der hierin beschriebenen Methionin-Depletionsverfahren in Verfahren zur Steigerung (Enhancement) der Potenz und Selektivität der üblichen Chemotherapien und bevorzugt die Selektivität von zur Krebstherapie verwendeten Antimitotika in Betracht gezogen.
Der wichtigste Zweck zur Verwendung von Methionin-Depletionsschritten in Kombination mit üblichen Antimitotika-Therapien besteht darin, den Vorteil der Tatsache wahrzunehmen, dass die Methionin-Depletion die Tumorzellproliferation selektiv und spezifisch vor der Mitose dergestalt stoppt, dass nach Repletion der Zellen, des Gewebes, Mediums oder der Vaskulatur mit Methionin, die statischen Zellen mit dem „Cycling" von Zellen zur Mitose synchron beginnen, wobei die Population von Zellen zur gleichförmigen Proliferation und für die Wirkungen der Zellzyklus-spezifischen Chemotherapie anfällig gemacht werden. Zur Veranlassung der Tumorzellen, in die Zellstase einzutreten, kann jedwedes für den Zellzyklus zytotoxische Mittel verwendet werden. Solche Mittel sind dem Durchschnittsfachmann weithin bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das für den Zellzyklus zytotoxische Mittel ein Antimitotikum dar.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird folglich die Verwendung von Methioninase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Antitumor-Chemotherapie in Betracht gezogen, wobei die genannte Chemotherapie den hierin beschriebenen Methionin-Depletionsschritt zur Bltdung statischer Tumorzellen, gefolgt von den folgenden zusätzlichen Schritten umfasst:

(a) Kontaktieren der statischen Tumorzellen mit einer Zellzyklus-induzierenden Menge von Methionin zur Initiierung der Mitose der statischen Tumorzellen, wodurch Mitosezellen gebildet werden, und
(b) Kontaktieren der Mitosezellen mit einem Antimitotikum in einer Menge, die zur Inhibition der Mitose der Mitosezellen ausreicht, wodurch das Tumorzellwachstum inhibiert wird.

Methionin, Methioninsalze und funktionelle Äquivalente davon, die zur Initiierung des „Cycling" von Zellen einer statischen Zelle funktionieren werden als Zellzyklus-induzierende Mittel bezeichnet und können zusammen oder alternativ als das Reagens zur Initiierung des „Cycling" von Zellen und der Mitose in einer oder mehr statischen Zelle(n) in der Methionin-depletierten Tumorzellpopulation verwendet werden.
Eine Zellzyklus-induzierende Menge eines Zellzyklus-induzierenden Mittels ist eine Menge, die das „Cycling" von Zellen in mindestens einigen wenigen (10%), bevorzugt der meisten und bevorzugter mindestens 90% der statischen Zellen in der Methionin-depletierten Tumorzellpopulation initiiert. Die Initiierung und das Ausmaß des „Cycling" von Zellen kann ohne weiteres mittels Verwendung von histologischen oder metabolischen Markern gemessen werden. Für Methionin liegt eine Zellzyklus-induzierende Menge in der Regel im Bereich von ca. 1 Mikromol (μM) bis ca. 2,5 Millimol (mM) und bevorzugt ca. 10 bis 250 μM. S-Phasen-spezifische Arzneimittel können auf ähnliche Weise zum Angriff auf jedwede Tumorzellen verwendet werden, die sich noch in der S-Phase befinden, wenn das Methionin repletiert ist.
Die Routen zum Kontaktieren (zur Verabreichung) des Zellzyklus-induzierenden Mittels mit den statischen Tumorzellen können variieren, es wird sich aber in der Regel um die gleichen Routen handeln, wie sie, wie hierin beschrieben, zur Verabreichung von Methioninase oder kompetitiven Inhibitoren verwendet werden.
Der richtige Zeitpunkt und die Zeitspannen zum Kontaktieren der statischen Tumorzellen mit einem Zellzyklus-induzierenden Mittel können abhängig vom Tumor, und anderen Erwägungen variieren, die empirisch bestimmt werden können, wie zum Beispiel durch die hierin beschriebenen Histokultur-Verfahren. Das Zyklus-induzierende Mittel kann vor oder im Wesentlichen gleichzeitig mit dem Antimitotikum zugefügt werden. Es kann vorteilhaft sein, den Inducer vor dem Antimitotikum zuzufügen, wenn bestimmt wurde, dass das entsprechende Antimitotikum schnell wirkt und die Zellzyklus-Induktion langsam ist. Diese Parameter können vom speziellen Tumortyp, der Gewebslokation, der Wahl des Antimitotikums und dergleichen abhängen. Die Optimierung von Variablen, wie zum Beispiel des richtigen Zeitpunkts, der Dosierung und der Arzneimittelwahl können überdies ohne weiteres mittels einer Reihe verschiedener Verfahren vor der in vivo-Verabreichung der therapeutischen Verfahren durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Optimierungsverfahren besteht in der Verwendung des hierin beschriebenen beispielhaften Histokultur-Assaysystems.
Der richtige Zeitpunkt zum Kontaktieren eines Antimitotikums hängt von der Induktion des „Cycling" von Zellen der statischen Tumorzellen ab. Antimitotika können in der Regel mit den mitotischen Zellen zu jeder Zeit während des „Cyclings" und sobald die Zellen mitotisch wurden, kontaktiert werden. Für einige Tumorzellpopulationen kann dieses Ereignis nach dem Zufügen des Inducers rasch auftreten, wobei das gleichzeitige oder nahezu gleichzeitige Zufügen von sowohl Inducer als auch Antimitotikum zu den statischen Tumorzellen ermöglicht wird. Als Alternative kann das Antimitotikum ca. 1 Stunde bis 30 Tage nach dem Inducer, bevorzugt aber innerhalb von einem oder zwei Tagen der Induktion zugefügt werden.
Bei dem Antimitotikum oder anderen hierin verwendeten Zellzyklus-spezifischen Mitteln kann es sich um jedwedes Mittel handeln, das auf Zelltoxizität basierende Mechanismen aufweist, die auf die Zellproliferation, Mitose oder das „Cycling" von Zellen gerichtet sind. Folglich können Antimitotika jedwede von einer Reihe verschiedener Verbindungen einschließen, bei denen es sich um Antimetabolite handelt oder die anderweitig Toxizität für sich teilende (mitotische) Zellen aufweisen. Die bevorzugte klinische Pharmakologie eines Antimitotikums zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren besteht in der Inhibition der zellmitotischen Aktivität, der Inhibition der Nukleinsäuresynthese, von Alkylierungsmitteln, Antibiotika, Alkaloiden und ähnlichen Antitumormitteln. Sofern auf dem Gebiet der Pharmakologie ständig weitere Fortschritte verzeichnet werden, ist zur Kenntnis zu nehmen, dass die Erfindung nicht auf derzeit bekannte Antimitotika und andere Zellzyklus-spezifische Mittel beschränkt ist, sondern vielmehr die Verwendung von Äquivalenten bekannter Verbindungen, neu entdeckten oder entwickelten Verbindungen und ähnlichen Mitteln einschließt, die die geforderte Aktivität aufweisen.
Beispielhafte Alkylierungsmittel schließen Cyclophosphamid (CTX; Cytoxan), Chlorambucil (CHL; Leukeran), Cisplatin (CisP; Platinul), Busulfan (Myleran), Melphalan, Carmustin (BCNU), Streptozotocin, Triethylenmelamin (TEM), Mitomycin C und ähnliche Alkylierungsmittel ein.
Beispielhafte Antimetaboliten schließen Methotrexat (MTX), Etoposid (VP16; Vepesid) 6-Mercaptopurin (6MP), 6-Thioguanin (6TG), Cytarabin (Ara-C), 5-Fluoruracil (5FU), Dacarbazin (DTIC) und ähnliche Antimetaboliten ein.
Beispielhafte Antibiotika schließen Actinomycin D, Doxorubicin (DXR; Adriamycin), Daunorubicin (Daunomycin), Bleomycin, Mithramycin und ähnliche Antibiotika ein.
Beispielhafte Alkaloide schließen Vincaalkaloide, wie zum Beispiel Vincristin (VCR), Vinblastin und dergleichen ein.
Andere Antitumormittel schließen Taxol und Taxolderivate, die Cytostatika, Glucocorticoide, wie zum Beispiel Dexamethason (DEX; Decadron) und Corticosteroide, wie zum Beispiel Prednison, Nukleosid-Enzym-Hemmer, wie zum Beispiel Hydroxyharnstoff, Aminosäure-depletierende Enzyme, wie zum Beispiel Asparaginase und ähnliche diverse Antitumormittel ein.
Die Synthese und Formulierung der vorstehenden antimitotischen (zytotoxischen) Mittel sind weithin bekannt, werden in vielen verschiedenen Quellen beschrieben und werden deshalb hier nicht wiederholt. Beispielhafte Quellen für die Synthese und Formulierungen der vorstehenden Mittel schließen die Physician's Desk Reference, Barnhart, Hrsg., Medical Economics Company, Inc., Oradell, N. J., 1992; und Merck Index, 11. Auflage, Merck & Co., 1989, ein.
Die Verwendung von in chemotherapeutischen Regimen vorstehend beschriebenen zytotoxischen Mitteln ist im Allgemeinen im Stand der Technik der Krebstherapie gut charakterisiert, und ihre Verwendung hierin fällt mit einigen Anpassungen unter die gleichen Erwägungen zur Überwachung der Verträglichkeit und Wirksamkeit und zur Kontrolle der Verabreichungsrouten und Dosierungen. Die tatsächlichen Dosierungen der zytotoxischen Mittel kann zum Beispiel abhängig von der Response der kultivierten Zellen des Patienten, die unter Verwendung der vorliegenden Histokultur-Verfahren bestimmt wird, variieren. Im Allgemeinen wird die Dosierung im Vergleich zu der in Abwesenheit des synchronisierten „Cycling" von Zellen verwendeten, wie durch die vorliegenden Offenbarungen gezeigt, reduziert.
Typische Dosierungen eines wirksamen zytotoxischen Mittels können in den vom Hersteller empfohlenen Bereichen liegen und können, wo durch in vitro Responses oder Responses in Tiermodellen angezeigt, um bis zu einer Größenordnung der Konzentration oder Menge reduziert werden. Folglich hängt die tatsächliche Dosierung vom Ermessen des Arztes, dem Zustand des Patienten und der Wirksamkeit des therapeutischen Verfahrens bezogen auf die in vitro-Ansprechbarkeit der primären kultivierten malignen Zellen oder der histokultivierten Gewebeprobe oder dem in den entsprechenden Tiermodellen beobachteten Responses ab.
IV. Gentherapie
In einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung einer rDNA zur Expression von Methioninase im Gewebe oder in den Lymphozyten, die das zu behandelnde erfindungsgemäße Gewebe umgeben, beschrieben. Zu diesem Zweck wird in Betracht gezogen, dass das Methioninase-Enzym für den Kontaktierungsschritt durch die Expression eines regulierbaren Methioninase exprimierenden Gens präsentiert wird, wodurch das Methioninase-Genprodukt hergestellt wird.
Wie vorstehend beschrieben gibt es eine große Reihe verschiedener geeigneter Expressionsvektoren, die derzeit zur Expression von Methioninase, die verwendet werden kann, bekannt ist. In einer Ausführungsform ist die Expression des Methioninase-Gens regulierbar. Folglich weist ein Expressionsvektor eine zweite Nukleotidsequenz auf, die funktionsfähig mit der ersten Methioninase codierenden Sequenz verknüpft ist, welche ein Mittel für die Regulation der Expression des Methioninase-Gens definiert. Ein beispielhaftes Mittel ist ein induzierbarer Promotor, wobei er bevorzugte Promotoren darstellt, die tumorspezifisch sind. Expressionsmodule, in denen die Expression des Methioninase-Gens durch einen tumorspezifischen Promotor kontrolliert wird, sind für die Gentherapie, wie hierin beschrieben, besonders nützlich.
Eine Klasse induzierbarer Promotoren sprechen auf eine Komponente an, die dem Kulturmeduim zugefügt werden kann oder ohne weiteres in eine Wirtszelle, enthaltend das Gen zur Expression des Methioninase-Gens, penetrieren kann. Eine andere Klasse sind tumorspezifische Promotoren, wie vorstehend beschrieben, wie zum Beispiel der Promotor des carcinomembryonalen Antigens (CEA).
Folglich ist auch ein Methionin-depletierendes Verfahren beschrieben, worin das Kontaktieren von Methioninase mit einer Population von Tumorzellen die folgenden Schritte umfasst:

(i) Einführen eines Expressionsvektors in die Tumorzellen oder in den Tumor infiltrierende Lymphozyten oder ihre Knochenmark-Präkursoren in vivo oder ex vivo, worin der Expressionsvektor eine Nukleotidsequenz aufweist, die Methioninase codiert und zur regulierten Expression von Methioninase fähig ist und eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Mittel zur Regulation der Expression von Methioninase zur Bildung von mit dem Methioninase-Gen transfizierte Zellen bereitstellt;
(ii) Kontaktieren der Tumorzellen in vivo mit den mit dem Methioninase-Gen transfizierten Zellen; und
(iii) Expression der Methioninase-codierenden Nukleotidsequenz in den transfizierten Zellen, wodurch Methioninase in den transfizierten Zellen gebildet wird und wodurch die Tumorzellen mit der hergestellten Methioninase kontaktiert werden. Unter „Einführen" versteht man jedwedes Verfahren, das dem Durchschnittsfachmann zum Insertieren des Expressionsvektors in die Targetzellen auf eine Weise bekannt sein wird, worin das im Expressionsvektor enthaltene Gen von den Targetzellen exprimiert werden kann. Die Einführung kann ex vivo oder irr vivo durchgeführt werden. Eine derartige „Einführung" kann zum Beispiel durch Transfektion, Transformation oder Virusinfektion erreicht werden.

Die Transfektion von Tumorzellen, entweder adhärenter Zellen oder Zellen in Suspension oder in vivo, können anhand einer Reihe verschiedener bekannter Transfektionsverfahren erreicht werden. Danach wird die transfizierte Zelle (wenn eine Transfektion ex vivo verwendet wird) erneut in den Wirt eingeführt und darf sich in der nativen, relevanten Umgebung des zu behandelnden Gewebes lokalisieren, wodurch die transfizierten Zellen mit den zu behandelnden Tumorzellen kontaktiert werden. Die Einführung von Methioninase in transfizierte Zellen kann durch eine Reihe verschiedener Mittel erreicht werden, erfordert aber im Allgemeinen die Anwesenheit eines selektierbaren Markers.
In einer Ausführungsform stellt das Mittel zur Regulation der Expression des Gens einen induzierbaren Promotor dar, der auf ein Reagens anspricht, das dem Medium zugefügt werden kann. Der Metallothionin-Promotor ist beispielhaft. Als Alternative kann der induzierbare Promotor einen tumorspezifischen Promotor darstellen. Ein derartiger Promotor wirkt, um Methioninase-Expression auf die Tumorzelle zu targetieren.
Die zu transfizierenden Zellen können eine Probe von den Tumorzellen oder normalen Immunzellen, wie zum Beispiel den Tumor infiltrierende Zellen, wie zum Beispiel den Tumor infiltrierende Lymphozyten oder Knochenmark-Präkursoren des Knochenmarks, wie zum Beispiel hämatopoietische Stammzellen oder Progenitorzellen darstellen. Die Zellen können entweder in vivo oder ex vivo vorliegen.
Beispiel 9 beschreibt die Isolation eines Methioninase codierenden Nukleinsäuremoleküls. Das Beispiel beschreibt weiter die Bildung von Expressionsvektoren zur Verwendung in der Batch-Fermentation zur Herstellung von Methioninase. Ein Fachmann kann das clonierte Methioninase-Gen ohne weiteres verwenden, wie zum Beispiel das, das in pAC-1 zur Herstellung einer zur Verwendung in der vorstehend beschriebenen Gentherapie geeigneten Expressionskassette bereitgestellt ist.
C. Therapeutika
Es werden Therapeutika, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von im Wesentlichen isolierter Methioninase, die bevorzugt rekombinant hergestellt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger beschrieben.
L-Methioninase (L-Methionin-α-desamino-γ-mercaptomethan-Lyase oder Methioninase) stellt ein Enzym dar, das Methionin durch Desaminierung und Desthiomethylierung abbaut. Die Methioninase-Aktivität kann mindestens durch Messen der Menge von α-Ketobutyrat gemessen werden, das nach Spaltung von Methionin gebildet wird. Eine Einheit (U) Methioninase wird als eine Enzymmenge definiert, die 1 Mikromol α-Ketobutyrat pro Minute aus Methionin unter den Standard-Assay-Bedingungen bildet, die von Ito et al., J. Biochem., 79: 1263–1272, 1976; und Soda, Analyt. Biochem., 25: 228–235, 1968, beschrieben wird.
Methioninase kann aus einer Reihe verschiedener Quellen hergestellt werden, einschließlich direkt aus Bakterienkulturen isoliert oder aus einem rekombinanten DNA-Molekül, das ein Methioninase-Protein codiert, wie es zum Beispiel in Beispielen 9 bis 12 beschrieben wird, exprimiert werden.
Bakterielle Quellen der Methioninase schließen Pseudomonas putida, Pseudomonas ovalis und Aeromonas sp. und jegliche anderen potenziellen Methioninase-Quellen ein. Stämme von P. putida sind gewerblich erhältlich von der ATCC und weisen die Zugriffsnummern ATCC 8209 bzw. ATCC 7955 auf. Die anderen Bakterien sind im Allgemeinen von akademischen Forschungskreisen erhältlich. Die Reinigung von Methioninase wurde anhand einer Reihe verschiedener Verfahren beschrieben. Siehe zum Beispiel Kreis et al., Cancer Res., 33: 1862–1865, 1973; Tanaka et al., FEBS Letters, 66: 307–311, 1976; Ito et al., J. Biochem., 79: 1263–1272, 1976; Nakayama et al., Agric. Biol. Chem., 48: 2367–2369, 1984; und Soda, Analyt. Biochem., 25: 228–235, 1968. Keine dieser Verfahren führen jedoch zu einer hochreinen Endotoxin-freien Methioninase. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind zwei Verfahren, die zum Reinigen von Methioninase verwendet wurden, so dass sie im Wesentlichen Endotoxin-frei sind.
Eine bevorzugte Methioninase weist eine spezifische Aktivität von ca. 10 bis ca. 50 Einheiten (U) pro mg Protein auf. Typische Autbereitungen aus gereinigter Methioninase, die eine spezifische Aktivität von ca. 10 bis ca. 50 U/mg aufweisen, werden hierin beschrieben. In Beispiel 12 wies Methioninase, die unter Verwendung des Expressionsvektors pAC-1 hergestellt wurde, eine spezifische Aktivität von ca. 20,1 U/mg auf.
Es wird im Wesentlichen eine bevorzugte Methioninase isoliert. Unter im Wesentlichen isoliert versteht man, dass das Enzym mindestens 50 Gew.-% rein, bevorzugt mindestens 90% rein und bevorzugter mindestens 99% rein oder weitgehend homogen ist. Ein bevorzugtes Protein ist weitgehend homogen, wenn es auf elektrophoretischen Medien, wie zum Beispiel anhand der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) analysiert wird. Unter homogen auf PAGE versteht man nur eine einzelne nachweisbare Bande.
Eine bevorzugte Methioninase ist im Wesentlichen frei von Endotoxinen, wie zum Beispiel bakteriellen Lipopolysacchariden, aufgrund der mit Endotoxinen einhergehenden unerwünschten Nebenwirkungen bei physiologischem Kontakt in einem Säuger, wie zum Beispiel durch i.v.- oder i.p.-Verabreichung. Unter im Wesentlichen frei versteht man weniger als ca. 10 Nanogramm (ng) Endotoxin pro Milligramm (mg) Methioninase-Protein, bevorzugt weniger als 1 ng Endotoxin pro mg Methioninase und bevorzugter weniger als 0,1 ng Endotoxin pro mg Methioninase. Der Endotoxin-Assay ist im therapeutischen Fach überall bekannt und kann mittels vielen verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Verfahren wird in den Beispielen beschrieben.
Eine bevorzugte Methioninase ist hitzestabil, um auf diese Weise seine Haltbarkeit und Wirksamkeit zu erhöhen, wenn sie unter Bedingungen von erhöhten Temperaturen, wie zum Beispiel in vivo in einem Tierkörper verwendet wird. Unter hitzestabil versteht man, dass das Enzym für die Dauer von 10 Minuten 60 Grad Celsius (60°C) ausgesetzt werden kann und 80%, bevorzugt 90% und bevorzugter 95% seiner spezifischen Aktivität beibehält.
Eine bevorzugte Methioninase weist eine Serum-Halbwertzeit von mindestens 5 Stunden, bevorzugt 6 Stunden und bevorzugter mindestens 7 Stunden auf.
Aus P. putida aufbereite Methioninase oder die Verwendung eines Expressionsvektors, enthaltend ein aus P. putida isoliertes DNA-Molekül, das Methioninase codiert, ist insbesondere bevorzugt. Methioninase aus P. putida weist bei der Analyse auf PAGE-SDS unter Denaturierungsbedingungen ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 43 Kilodalton auf. Ein bevorzugtes Verfahren zum Reinigen der Methioninase wird in den Beispielen beschrieben.
Ein Therapeutikum umfasst folglich einen physiologisch verträglichen Träger zusammen mit weitgehend isolierter Methioninase, die darin als Wirkstoff aufgelöst oder dispergiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Therapeutikum nicht immunogen, wenn es an einen humanen Patienten zu therapeutischen Zwecken verabreicht wird.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt eine Methioninase dar, die chemisch modifiziert ist, umfassend an ein Polymer konjugierte Methioninase. Die Methioninase ist bevorzugt weitgehend isoliert und im Wesentlichen Endotoxin-frei. Unter „chemisch modifiziert" versteht man jedwede Form von Methioninase, die in eine Form verändert ist, die sich von der in der Natur vorkommenden gereinigten Methioninase unterscheidet. Die Methioninase ist bevorzugt durch Verknüpfung der Methioninase mit einem Polymer, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, chemisch modifiziert.
Wie hierin verwendet werden die Begriffe "pharmazeutisch verträglich", "physiologisch verträglich" und grammatische Variationen davon, die auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien verweisen, miteinander austauschbar verwendet und stellen dar, dass die Materialien zur Verabreichung an oder auf einen Säuger oder Menschen ohne die Herbeiführung unerwünschter physiologischer Wirkungen, wie zum Beispiel Übelkeit, Schwindel, Magenbeschwerden und dergleichen, fähig sind.
Die Aufbereitung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die Wirkstoffe darin aufgelöst oder dispergiert enthält, wird im Stand der Technik gut verstanden. Diese Zusammensetzungen werden in der Regel als sterile injizierbare Substanzen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, wässrig oder nicht wässrig, hergestellt, es können jedoch auch für Lösungen oder Suspensionen geeignete feste Formen vor Gebrauch in Flüssigkeit hergestellt werden. Die Aufbereitung kann auch emulgiert werden. Insbesondere bevorzugt sind, wie hierin beschrieben, Phospholipid- und Liposom-Zusammensetzungen. Außerdem kann eine therapeutische Methioninasemenge in einer Salbe oder auf einem diffusionsfähigen Patch, wie zum Beispiel einem Verband, vorhanden sein, um eine lokale Abgabe des Mittels zu bieten.
Der Wirkstoff kann mit Hilfsstoffen gemischt werden, die pharmazeutisch verträglich und mit dem Wirkstoff kompatibel sind und in Mengen zur Verwendung in den hierin beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Hilfsstoffe sind zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol oder dergleichen und Kombinationen davon. Die Zusammensetzung kann, falls erwünscht, außerdem kleine Mengen von Hilfssubstanzen, wie zum Beispiel Feuchtigkeitsmittel oder Emulgatoren, Puffer zum Einstellen des pH und dergleichen enthalten, welche die Wirksamkeit des Wirkstoffs verstärken.
Das erfindungsgemäße Therapeutikum kann pharmazeutisch verträgliche Salze der Komponenten darin einschließen. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen die Säureadditionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Polypeptids gebildet werden), die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen gebildet werden, ein. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-Hydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet werden.
Physiologisch verträgliche Träger sind aus dem Stand der Technik überall bekannt. Beispielhaft für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine Materialien zusätzlich zu den Wirkstoffen und Wasser enthalten oder einen Puffer, wie zum Beispiel Natriumphosphat, bei physiologischem pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Wässrige Träger können noch weiter mehr als ein Puffersalz ebenso wie Salze, wie zum Beispiel Natrium- und Kaliumchloride, Dextrose, Propylenglycol, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe, enthalten.
Flüssige Zusammensetzungen können zusätzlich zu und ausschließlich von Wasser, wie hierin beschrieben, auch flüssige Phasen enthalten. Beispielhaft für solche zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, wie zum Beispiel Baumwollsamenöl, organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat und Wasser-Öl-Emulsionen, insbesondere die vorstehend beschriebenen Liposom-Zusammensetzungen.
Ein Therapeutikum enthält eine wirksame Methioninasemenge, in der Regel eine Menge von mindestens 0,1 Gew.-% aktivem Protein pro Gewicht des Gesamttherapeutikums und beträgt bevorzugt mindestens ca. 25 Gew.-%. Ein Gewichtsprozent ist ein gewichtsanteiliges Verhältnis von Methioninase-Protein zur Gesamtzusammensetzung. Folglich betragen zum Beispiel 0,1 Gew.-% 0,1 g Methioninase pro 100 Gramm der Gesamtzusammensetzung.
Sofern eine Methioninase-Zusammensetzung in vivo intravasal verwendet werden kann, wird in einer Ausführungsform die Formulierung eines Therapeutikums zur kontrollierten Abgabe der Methioninase und optional zum Abschirmen des Methioninase-Proteins vor dem Abbau und anderen Phänomenen, welche die Serumhalbwertzeit von therapeutisch verabreichter Methioninase reduzieren würden, in Betracht gezogen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Therapeutika in Betracht gezogen, die Abgabevehikel, wie zum Beispiel Polymere, polymere Vehikel, partikuläre Stoffe, Latexe, Koazervate, Ionenaustauschharze, Liposomen, magensaftresistente Beschichtungen, Mediatoren, Bioadhäsiva, Mikrokapseln, Hydrogele und ähnliche Vehikel enthalten. Beispielhafte Arzneimittelabgabevehikel, die Liposomen einschließen, werden mindestens von Tarcha in "Polymers for Controlled Drug Delivery", CRC Press, Boca Raton, 1990, beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiter ausführliche Verfahren zur Reinigung von Methioninase, die im Vergleich zu anderen bekannten Verfahren überlegene Ausbeuten und Reinheit bereitstellen. Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung rekombinanter Methioninase, insbesondere der unter Verwendung eines transformierten Wirtes produzierten, enthaltend ein Methioninase codierendes Modul mit hoher Expression, umfasst die folgenden Schritte:

(a) Erhitzen eines Extrakts aus einer transformierten Zelle, die Methioninase in wässrigen Puffern enthält, von ca. 40–60°C für ca. 1–10 min, bevorzugt 50°C für 1 min;
(b) Zentrifugieren des erhitzten Extrakts von ca. 10k bis 20k U/min in einem GS-3-Rotor (Sorvall DuPont) für ca. 15 min bis 1 Stunde, bevorzugt bei ca. 13k U/min für 30 min bei 4°C;
(c) Ultrafiltration des Überstandes unter Verwendung eines Filters einer Porengröße von ca. 50k bis 100k, bevorzugt einer Millipore Prep/Scale: TFF PLHK 100k 2,5 ft² Patrone unter Verwendung eines 10 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 8,3);
(d) DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl einer niedrigen Ionenstärke (von ca. 10–50 mM) in einem 10–20 mM Kaliumphosphatpuffer bei ca. pH 7,0–7,6 und Sammeln der Fraktionen enthaltend Methioninase, die mit einem KCl-Gradienten von 40–244 mM eluiert werden, bevorzugt unter Verwendung einer DEAE-Sepharose-FF-Säule;
(e) eine zweite DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl-Medium einer mittleren Ionenstärke (50–10 mM) in einem 10–20 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von ca. 8,0–8,6 und Sammeln der Fraktionen enthaltend Methioninase, die in einem Phosphatpuffer (pH 8,3) eluiert werden, der in 100–200 M KCl eluiert wird, bevorzugt unter Verwendung einer DEAE-Sepharose-FF-Säule; und;
(f) Kontaktieren genannter Fraktionen, die in Schritt (e) mit einem zum Absorbieren von Endotoxin fähigen Chromatographie-Medium gesammelt werden; und Sammeln des Eluenten, wodurch Endotoxin aus genanntem Eluent zur Bildung von Endotoxin-freier Methioninase mit mindestens 20 Einheiten Methioninase-Aktivität pro Milligramm Protein und von 1–100 ng Endotoxin pro mg Protein, bevorzugt unter Verwendung einer Acticlean^® Etox-Säule, entfernt wird.

Der Zellextrakt wird bevorzugt aus einer Wirtszelle, die zur Expression hoher Spiegel von rekombinanter Methioninase (von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins) verändert wurde, hergestellt. Als Alternative kann ein Organismus, der Methioninase natürlich exprimiert, als das Ausgangsmaterial verwendet werden. Für Bakterienzellextrakte werden die Extrakte im Allgemeinen durch zuerst Ernten und Waschen der Bakterienzellkulturen zur Bildung einer Zellpaste/eines Zellpellets, abhängig davon, ob das Ernten durch Zentrifugation oder Hohlfaserfiltration erfolgte, hergestellt, welche Verfahren im Allgemeinen bekannt sind.
Die Zellen werden dann unter Verwendung üblicher Mittel aufgeschlossen. Die Zellen werden bevorzugt unter Verwendung eines Homogenisators, wie zum Beispiel eines Homogenisators des Kavitatortyps, zum Beispiel einem Modell Nr. HC8000 von der Microfluidic Corp., aufgeschlossen.
Die sich ergebende Suspension wird zur Präzipitation selektiver Proteine und anderer unlöslicher Materialien erhitzt. Typische Erhitzungsbedingungen betragen 1–10 Minuten von ca. 45–60°C. Ein Erhitzungsschritt von 50°C für 1 Minute ist bevorzugt.
Der erhitzte Extrakt wird zum Entfernen von Debris zentrifugiert, und der Überstand wird filtriert und in zwei Schritten, wie vorstehend beschrieben, auf ein DEAE-Ionenaustauschchromatographie-Medium aufgebracht. Bevorzugte Adsorptions- und Elutionsbedingungen werden in den Beispielen beschrieben. Jedwede Art von DEAE-Ionenaustauschsäulenchromatographie-Medien kann in diesen drei Stufen verwendet werden, und die Wahl der Medien darf nicht als einschränkend ausgelegt werden. Zu gewerblichen Quellen zählen Pharmacia Fine Chemicals, BioRad und Sigma.
Danach wird zur Herstellung eines Proteins mit akzeptierbaren Endotoxin-Spiegeln, wie vorstehend angeführt, Endotoxin entfernt. Der Schritt zur Entfernung von Endotoxin kann auf jedwede von vielen verschiedenen Weisen, die alle weithin bekannt sind, durchgeführt werden und beinhalten in der Regel das Kontaktieren des Proteins in Lösung mit einem Chromatographie-Medium, das zur Adsorption des Endotoxins fähig ist und Erzielen eines Chromatographie-Medium-Eluenten, der Endotoxin-freies Protein enthält. Das bevorzugte gewerblich erhältliche Reagenz zur Verwendung bei der Entfernung des Endotoxins ist Acticlean^® Etox.
D. Chemisch modifizierte Methioninase
Methioninase kann mit der Absicht der Verlängerung seiner Halbwertzeit und Verminderung seiner Immunogenität oder Antigenität an ein Polymer konjugiert werden.
Bei überempfindlichen Individuen besteht die Möglichkeit einer allergischen Reaktion. Andererseits können gegen Methioninase gerichtete Antikörper die Halbwertzeit der Methioninase verkürzen.
Es wurden verschiedene Ansätze unternommen bei dem Versuch, das Problem bezüglich der Antigenität von Polypeptiden und Proteinen zu lösen. Die Kopplung von Polymeren, wie zum Beispiel Polyethylenglykol an Proteine, stellt einen der Ansätze zur Reduktion der Protein-Antigenität dar. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die chemische Modifikation von Methioninase, die durch ein neues und wirksames Verfahren hergestellt wird, worin gereinigte Methioninase mit Polyethylenglykol (PEG) unter Bedingungen gekoppelt wird, welche die Aktivität des Enzyms aufrechterhalten. Die erfindungsgemäße PEG-Methioninase weist eine verlängerte Halbwertzeit und keine scheinbare Immunogenität auf.
Die neue Methioninase, die an Polyethylenglykol („PEG-Methioninase" oder „PEGylierte Methioninase") konjugiert ist, weist eine hohe Methionin-Depletionsaktivität, eine verlängerte Halbwertzeit und geringe Immunogenität auf. Folglich stellt PEG-Methioninase eine neues Mittel zur Inhibition des Tumorwachstums bereit, während die Stabilität aufrechterhalten wird, wobei seine Halbwertzeit im Serum erhöht, die Immunogenität und Toxizität vermindert werden.
Die erfindungsgemäße PEG-Methioninase, die stabil bei der Methionin-Depletion mit einer langen Halbwertzeit wirksam und nicht immunogen ist, kann als ein sicheres und wirksames Antitumormittel zur mehrfachen Dosierung verwendet werden. PEG-Methioninase kann in einer flüssigen Formulierung von 0,12 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2) bei –70°C, 4°C und bei Raumtemperatur ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
Wichtiger ist, dass die erfindungsgemäße PEG-Methioninase nicht immunogen ist, die sie zur Behandlung von Krebspatienten, die empfindlich für Methioninase sind und eine wiederholte Dosierung benötigen, besonders wünschenswert macht. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass wie mit der Methioninase die PEG-Methioninase in einer Reihe verschiedener Formulierungen bereitgestellt werden kann.
Eine bevorzugte Formulierung der gereinigten Endotoxin-freien Methioninase liegt mit 0,12 M Natriumchlorid, in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) bei einer Konzentration zwischen 0,06 M und 0,2 M vor. Die Aktivität beträgt ca. 10 Einheiten/mg.
Die PEGylierte Methioninase kann anhand von dem Durchschnittsfachmann weithin bekannten Mitteln getestet werden. So kann zum Beispiel in vivo-Testen zur Bestimmung der Pharmakologie, Sicherheit und funktionellen Merkmale von durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellter PEG-Methioninase verwendet werden.
Solche Tests können die Bestimmung der akuten Toxizität, Pharmakokinetik von PEG-Methioninase, Depletion von Methionin im Serum und Bewertung der Immunogenität von PEG-Methioninase einschließen.
Gereinigte Endotoxin-freie PEG-Methioninase wird in die Schwanzvene von Mäusen injiziert, und die Blutproben werden alle zwei Stunden gesammelt. Die Methioninasespiegel werden durch den Aktivitätsassay gemessen. Die Methionin-Spiegel werden anhand der HPLC nach der Methionin-Derivatisierung gemessen.
Akute Toxizitätsstudien können an jedweden geeigneten Versuchstieren durchgeführt werden, wie zum Beispiel denen, die in Beispiel 5 und 15 beschrieben werden. Den Mäusen werden 10–100 Einheiten/1–10 mg PEG-Methioninase in die Schwanzvene injiziert. Die Vitalzeichen und visuellen Beobachtungen werden aufgezeichnet. Die Blutproben werden vor der Injektion und alle zwei Stunden nach der Injektion gesammelt. Sowohl die Methioninase-Aktivität als auch die Methionin-Spiegel werden gemessen. Sowohl die Nieren- als auch Leberfunktion werden gemessen. Die An- oder Abwesenheit toxischer Wirkungen auf die Gewebe, wie zum Beispiel die Lunge, Nieren, Leber und das Gehirn werden mithilfe von Standardverfahren bestimmt. Das Blut und Knochenmark werden auch analysiert.
In einer anderen Ausführungsform wird die Methioninase an ein Polymer konjugiert, was zu einer weitgehend nicht immunogenen Zusammensetzung führt und auch in einer Zunahme der Halbwertzeit der Methioninase-Aktivität in vivo resultiert.
In einer Ausführungsform wird die Methioninase durch Konjugation an ein Polymer chemisch modifiziert.
In einer anderen Ausführungsform wird die Methioninase durch Konjugation an ein Polyalkylenoxid chemisch modifiziert. Beispiele der Polyalkylenoxide schließen Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, Copolymere von Ethylenoxid und Copolymere von Propylenoxid ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Methioninase durch Konjugation an Polyethylenglykol chemisch modifiziert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die an Polyethylenglykol konjugierte Methioninase weitgehend frei von Endotoxin.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Pharmazeutikum, umfassend eine therapeutisch wirksame Methioninasemenge, die an ein Polymer konjugiert ist. Das Polymer kann ein Polyalkylenoxid darstellen, zum Beispiel Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, Copolymere von Ethylenoxid und Copolymere von Propylenoxid, ist aber nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Pharmazeutikum bereitgestellt, umfassend eine therapeutisch wirksame Methioninasemenge, die an Polyethylenglykol konjugiert ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Pharmazeutikum eine therapeutisch wirksame Methioninasemenge, die weitgehend frei von Endotoxin ist und an Polyethylenglykol konjugier ist. Eine derartige Zusammensetzung kann aus Material hergestellt werden, das aus den Organismen isoliert wird, die Methioninase natürlich produzieren oder bevorzugt aus einem Wirt, der zwecks Expression von Methioninase verändert wurde.
Auch bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung von Endotoxin-freier Methioninase, die durch Kopplung von Endotoxin-freier Methioninase an ein Polymer konjugiert ist, die durch Kopplung von Endotoxin-freier Methioninase mit einem Polymer an ein Polymer konjugiert ist, um eine weitgehend nicht immunogene, chemisch modifizierte, Endotoxin-freie Methioninase zu bilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren die Kopplung der Methioninase an Polyethylenglykol ein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Kopplung mittels Reaktion Endotoxin-freier Methioninase mit Methoxypolyethylenglykol-succinimidyl-carbonat durchgeführt.
Auch bereitgestellt ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Methioninase weitgehend frei von Endotoxin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Methioninase an ein Polymer konjugiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt das Polymer ein Polyalkylenoxid dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Methioninase an Polyethylenglykol konjugiert.
E. Formulierungen der rekombinanten Methioninase
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter Methioninase in lyophilisierter oder kristalliner Form. In aller Einzelheit wurde beobachtet, dass Methioninase unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ohne weiteres lyophilisiert oder kristallisiert werden kann. Es wurde gefunden, dass die sich ergebende Methioninase-Aufbereitung, kristallisierte oder lyophilisierte Formen, hoch stabil und ohne weiteres hydratisierbar sind und nach der Rehydratisierung höchst aktiv blieben.
Ein Reihe verschiedener aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren kann zum Erhalt von Methioninase in kristallisierter oder lyophilisierter Form verwendet werden. In den Beispielen wurde die Lyophilisierung und Rekristallisation von Methioninase unter Verwendung eines Verdis Freeze Mobile 24 bei 100 Millibar, 72 Stunden bei –80°C durchgeführt. Ein Fachmann kann bekannte Verfahren zur Verwendung bei der Herstellung lyophilisierter oder kristallisierter Methioninase-Formen ohne weiteres anpassen.
F. DNA-Segmente und -Vektoren
I. Methioninase-codierende DNA-Moleküle
Es wurde gefunden, dass durch die funktionsfähige Verknüpfung eines isolierten DNA-Moleküls, das Methioninase an einen Promotor, insbesondere einen RNA-Polymerase-Promotor, wie zum Beispiel den T7-RNA-Polymerase-Promotor, codiert, rekombinante Methioninase bei Spiegeln von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins exprimiert werden kann, wenn er in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Es werden erfindungsgemäß Module zur hochgradigen Expression bereitgestellt, die hohe Spiegel von rekombinanter Methioninase exprimieren, wenn sie unter geeigneten Bedingungen in einen Wirt eingeführt werden.
Wie hierin verwendet, verweist ein Modul mit hochgradiger Expression oder ein erfindungsgemäßes Expressionsmodul auf ein Nukleinsäuremolekül, das ein oder mehr Expressionskontrollelement(e) enthält, welche die Transkription und Translation einer funktionsfähig verknüpften Nukleotidsequenz, die Methioninase codiert, lenkt. Bei dem Expressionsmodul kann es sich um ein isoliertes Nukleinsäuremolekül handeln oder es kann in einem Vektor vorliegen (nachstehend beschrieben).
Die erfindungsgemäßen Expressionsmodule enthalten Kontrollelemente, die die Herstellung der rekombinanten Methioninase dergestalt lenken, dass die hergestellte rekombinante Methioninase von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins, bevorzugt mehr als 10% des zellulären Gesamtproteins darstellt. Die bevorzugten Expressionskontrollelemente stellen RNA-Polymerase-Promotoren dar, wobei es sich bei den bevorzugtesten um den T7-RNA-Polymerase-Promotor handelt. Andere Beispiele von RNA-Polymerase-Promotoren schließen die Tac- und Trc-Promotoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Promotor stellt ein Expressionskontrollelement dar, das durch eine DNA-Sequenz gebildet wird, die das Auftreten einer Bindung einer RNA-Polymerase und Transkription erlaubt. Promotor-Sequenzen, die mit einem bestimmten Wirtssystem kompatibel sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden in der Regel in einem Plasmidvektor bereitgestellt, der einen oder mehr zweckmäßige Restriktionsorte) enthält. Typisch für solche Plasmidvektoren sind die, die den T7-RNA-Polymerase-Promotor, pT7 und pET, enthalten, die aus einer Reihe verschiedener Quellen, wie zum Beispiel gewerblichen Lieferanten und der American Type Culture Collection erhältlich sind.
Die erfindungsgemäßen Expressionsmodule umfassen weiter eine Nukleinsäuresequenz, die Methioninase codiert. Wie hierin verwendet, wird von einer Nukleinsäure gesagt, dass sie Methioninase codiert, wenn die Transkription und Translation des Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Sequenz, zur Herstellung eines Proteins mit Methioninase-Aktivität führt.
L-Methioninase (L-Methionin-α-desamino-γ-mercaptomethan-Lyase oder Methioninase) stellt ein Enzym dar, das Methionin durch Desaminierung und Desthiomethylierung abbaut. Methioninase-Aktivität kann durch Messen von mindestens der α-Ketobutyrat-Menge gemessen werden, die durch Spaltung von Methionin gebildet wird. Eine Einheit (U) Methioninase wird als die Enzymmenge definiert, die 1 Mikromol α-Ketobutyrat pro Minute aus Methionin unter den Standard-Assaybedingungen bildet, die von Ito et al., J. Biochem., 79: 1263–1272, 1976; und Soda. Analyt. Biochem., 25: 229–235, 1968, beschrieben werden.
Die Methioninase-codierende Nukleinsäuresequenz kann eine unveränderte Sequenz umfassen, die aus einem Organismus erhalten wurde, der rekombinante Methioninase natürlich produziert oder kann eine Sequenz umfassen, die aus einem Organismus erhalten wird, der Methioninase, die verändert wurde, um eine oder mehr Nukleinsäure- oder Aminosäuresubstitution(en), -deletion(en) oder -addition(en) zu enthalten, natürlich produziert.
Das Methioninase-codierende Nukleinsäuremolekül, ob verändert oder unverändert, kann von jedwedem Organismus hergeleitet werden, der Methioninase natürlich produziert. Die bevorzugte Quelle des Methioninase-codierenden Nukleinsäuremoleküls ist Pseudomonas putida. Beispiel 9 offenbart die Isolation und Sequenzierung eines Methioninase-codierenden Nukleinsäuremoleküls aus P. putida. Andere bevorzugte Quellen für ein Methioninase-codierendes Nukleinsäuremolekül, aber nicht beschränkt darauf, schließen Trichomonas vaginalis, Nippostrongylus brasiliensis und Fusobacterium sp. ein.
Die komplette Codierungssequenz für Methioninase kann unter Verwendung einer Reihe von verschiedenen Verfahren aus einer Reihe verschiedener Quellen erhalten werden, insbesondere denen, die vorstehend angeführt wurden. Die Isolation von Methioninase-codierenden Nukleinsäuremolekülen aus einem Organismus mit Ausnahme von P. putida wird durch die in 8 bereitgestellten Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen erheblich erleichtert.
Ein Fachmann kann spezifisch die in 8 bereitgestellte Nukleinsäuresequenz zur Herstellung von Paaren von Oligonukleotid-Primers zur Verwendung in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) zum selektiven Amplifizieren eines Methioninase-codierenden Nukleinsäuremoleküls aus Methionin exprimierenden Organismen ohne weiteres verwenden. Bei den in 8 bereitgestellten bevorzugten PCT-Primerpaaren handelt es sich um die folgenden:
5'-GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3' (Sense)
5'-CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3' (Antisense)
Ein bevorzugter PCR-Denaturierungs-/Annealing-/Verlängerungszyklus unter Verwendung der vorstehenden PCR-Primer läuft wie folgt ab: Zuerst Denaturierung 10 Minuten bei 95°C, dann 5 Denaturierungszyklen 30 Sekunden bei 94°C, Annealing 30 Sekunden bei 60°C und Verlängerung 2 Minuten bei 72°C; dann 25 Denaturierungszyklen 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, dann Verlängerung 1,5 Minuten bei 72°C; dann endgültige Verlängerung 10 Minuten bei 72°C. Die PCR-amplifizierten Produkte stellen zwei Banden dar, von denen die 1365-bp-Bande gesammelt und als die Insert-ONCase-1-DNA gereinigt wurde.
Als Alternative kann ein Fragment der Nukleotidsequenz von 6 als eine Sonde zur Isolation von Methioninase-codierender DNA aus Organismen mit Ausnahme von Pseudomonas putida unter Verwendung aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren verwendet werden. Oligomere, die ca. 18–20 Nukleotide (codierend eine aus ca. 6–7 Aminosäuren bestehende Strecke) enthalten, werden hergestellt und zum Sondieren genomischer DNA-Bibliotheken zum Erhalt von Hybridisierung unter Bedingungen von ausreichender Stringenz verwendet, um falsch Positive unter Verwendung von aus dem Stand der Technik weithin bekannten Verfahren zu eliminieren. (Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press 1989).
DNA-Segmente (d. h. synthetische Oligonukleotide), die sowohl als Sonden oder spezifische Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) als auch Methioninase codierenden Gensequenzen verwendet werden, können ohne weiteres durch chemische Verfahren, zum Beispiel das Phosphotriester-Verfahren nach Matteucci et al., (J. Am. Chem. Soc., 103: 3185–3191, 1981) oder unter Verwendung von automatisierten Syntheseverfahren synthetisiert werden. Außerdem können größere DNA-Segmente ohne weiteres durch gut bekannte Verfahren, wie zum Beispiel die Synthese einer Gruppe von Oligonukleotiden, die das DNA-Segment definieren, gefolgt durch Hybridisierung und Ligation von Oligonukleotiden zum Aufbau des kompletten Segments hergestellt werden.
Außer den auf PCR und DNA-Sonden basierenden Verfahren können Methioninase codierende DNA-Moleküle unter Verwendung von polyclonalem Antiserum oder monoclonalen Antikörpern, die gegen Peptidfragmente von 8 gebildet werden, von denen vorhergesagt wird, dass sie immunogen sind, isoliert werden. Solche Antikörper können zum Sondieren einer aus einem gegebenen Organismus generierten Expressionsbibliothek, wie zum Beispiel einer λgtll-Bibliothek, zum Erhalt von Methioninase codierenden DNA-Molekülen aus einem Organismus mit Ausnahme von P. putida verwendet werden.
Sobald ein natürlich vorkommendes Methioninase-codierendes Nukleinsäuremolekül erhalten wird, kann ein Fachmann ohne weiteres zufällige oder ortsspezifische Mutageneseverfahren zur Veränderung der Methioninase-codierenden Sequenz einsetzen, um auf diese Weise den Grad der Expression zu erhöhen oder um eine oder mehr Aminosäure(n) aus der codierten Methioninase zu substituieren, addieren oder deletieren.
In einer Ausführungsform wird die Methioninase-codierende Sequenz verändert, um auf diese Weise den Expressionsgrad der rekombinanten Methioninase in einer gegebenen Wirtszelle ohne Änderung der Aminosäuresequenz der codierten Methioninase zu steigern. Die gesteigerte Expression von rekombinanter Methioninase in einem bestimmten Wirt kann durch Veränderung von einem oder mehr der im Nukleinsäuremolekül vorliegenden Codonen erhalten werden, so dass die sich ergebenden Codone die sind, die vom Wirtsorganismus zum Codieren einer bestimmten Aminosäure häufiger verwendet werden. Die Veränderung einer Nukleotidsequenz, damit sie die bevorzugten Codone enthält, kann unter Verwendung aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren, wie zum Beispiel ortsgerichteter Mutagenese oder durch Synthetisieren eines Nukleinsäuremoleküls, enthaltend die bevorzugten Codone, erreicht werden.
Außer den Veränderungen, die sich auf die Expression auswirken, können die Methioninase-codierenden Nukleinsäuremoleküle dergestalt verändert werden, um auf diese Weise die Reinigung des sich ergebenden Proteins zu erleichtern. Durch Veränderung von entweder des Amino- oder Carboxy-Terminus der rekombinanten Methioninase, um auf diese Weise eine Polyhistidinstrecke hinzuzufügen, kann wie zum Beispiel in den Beispielen offenbart wurde, Ni⁺⁺-Sepharose verwendet werden, um das sich ergebende Fusionsprotein zu reinigen.
Die Methioninase-codierende Sequenz kann auch zum Einführen von Veränderungen in die Aminosäuresequenz der codierten Methioninase verändert werden, um auf diese Weise einen oder mehr Aminosäurerest(e) zu addieren, substituieren oder deletieren. Die sich ergebende rekombinante Methioninase enthält bevorzugt Veränderungen, die in rekombinanter Methioninase mit besseren biologischen oder physiologischen Eigenschaften, wie zum Beispiel gesteigerter Aktivität, verminderter K_m, verminderter Immunogenität oder verlängerter Serum-Halbwertzeit resultieren. Derartig veränderte Formen können rationell ausgelegt oder wahllos generiert werden.
Es wird gesagt, dass eine Veränderung rationell ausgelegt wird, wenn die Veränderung basierend auf der Aminosäuresequenz der Ausgangs- und sich ergebenden Proteine und einer gewünschten physiologischen Eigenschaft spezifisch gewählt wurde. So soll zum Beispiel ein Typ einer rationell ausgelegten Veränderung hydrophobe Aminosäuren mit weniger hydrophoben Resten zur Erhöhung der Löslichkeit ersetzen. Das bevorzugte Verfahren zur Generierung rationell ausgelegter Veränderungen besteht in einer ortsgerichteten Mutagenese unter Verwendung eines mismatched PCR-Primer-Verlängerungsverfahrens.
Man ist der Ansicht, dass Veränderungen zufällig generiert werden, wenn die Veränderung nicht rationell ausgewählt ist. Zufallsmutageneseverfahren, wie zum Beispiel chemische Mutagenese, PCR-Shuffling und Linker-Scanning-Mutagenese, generieren eine große Vielfalt verschiedener zufälliger und nicht spezifischer Veränderungen in einer gegebenen Protein codierenden Sequenz. Derartige Verfahren können zur radikalen Veränderung des Methioninase-codierenden Nukleinsäuremoleküls verwendet werden.
Veränderte Formen von auf diese Art und Weise generierter rekombinanter Methioninase werden dann unter Verwendung einer Reihe verschiedener aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren auf gewünschte Eigenschaften gescreent. Die Wahl des eingesetzten Selektionsverfahrens hängt vom Wirt, Vektor und den eingesetzten Mutageneseverfahren ebenso wie den Eigenschaften, auf die ausgewählt wird, ab.
Gegenstand der Erfindung sind weiter Vektoren, enthaltend eines oder mehr der erfindungsgemäßen Expressionsmodule. Vektoren sind DNA-Moleküle, die zur autonomen Replikation in einem Wirt fähig sind. Vektoren können einen episomalen Replikationsstartpunkt enthalten, der sich von einem natürlich vorkommendem Plasmid, einem genomischen Replikationsstartpunkt herleitet oder sich von einem viralen Genom herleiten kann. Die Wahl des Vektors, in den ein erfindungsgemäßes Expressionsmodul eingesetzt wird, hängt – wie aus dem Stand der Technik überall bekannt ist – direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften, z. B. Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle, ab.
In einer Ausführungsform schließt der Vektor ein prokaryotisches Replikon ein. Prokaryotische Replikone, wie zum Beispiel das ColEl-Replikon, sind aus dem Stand der Technik überall bekannt und können ohne weiteres in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Expressionsmodul eingesetzt werden. Der Vektor kann außerdem ein Gen einschließen, das einen selektierbaren Marker, wie zum Beispiel eine Arzneimittelresistenz, codiert.
Eukaryotische Expressionsvektoren können auch in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Expressionsmodul verwendet werden. Eukaryotische Zellexpressionsvektoren sind aus dem Stand der Technik überall bekannt und sind von mehreren gewerblichen Quellen erhältlich. Typisch für solche Vektoren sind PSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCCC, Nr. 31255), der hierin beschriebene Vektor pCDM8 und die ähnlichen eukaryotischen Expressionsvektoren. Hochgradige Expressionsvektoren können weiter unter Verwendung von Insektenzellexpressionssystemen, wie zum Beispiel einem auf dem Bacculovirus basierenden Vektorsystem, herbeigeführt werden.
In allgemeiner Hinsicht beinhaltet die Herbeiführung eines Methioninase codierenden Moduls mit hoher Expression in der Regel Folgendes:
Zuerst wird eine DNA erhalten, die Methioninase codiert. Wenn die Sequenz, wie von einer Bakterienquelle erwartet wird, durch Introne nicht unterbrochen wird, ist sie zur Expression in jedwedem Wirt geeignet. Diese Sequenz kann verändert werden, damit sie sich durch Insertion von Sequenzen, enthaltend eine oder mehr Restriktionsendonukleasestellen an Regionen, welche die Methioninase-codierende Sequenz flankieren, in einer ohne weiteres exzidierbaren und zurückgewinnbaren Form befindet.
Die exzidierte oder rückgewonnene Codierungssequenz wird dann in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Kontrollelement mit hoher Expression, bevorzugt in einen replizierbaren Expressionsvektor platziert. Das Expressionsmodul oder der Expressionsvektor wird dann zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet, und der transformierte Wirt wird unter Bedingungen kultiviert, um die Produktion der rekombinanten Methioninase zu bewirken. Die rekombinante Methioninase wird optional aus dem Medium oder aus den Zellen isoliert; die Rückgewinnung und Reinigung des Proteins könnte in einigen Fällen nicht notwendig sein, wenn gegebenenfalls einige Verunreinigungen toleriert werden können.
Jeder der vorangehenden Schritte kann auf viele verschiedene Weisen durchgeführt werden. So können zum Beispiel die gewünschten Codierungssequenzen aus genomischen Fragmenten erhalten und direkt in entsprechenden Wirten verwendet werden. Die Konstruktionen der Expressionsvektoren, die in einer Reihe von verschiedenen Wirten funktionsfähig sind, werden unter Verwendung von zwei oder mehr entsprechenden Replikonen und Kontrollelementen hergestellt. Geeignete Restriktionsorte können, wenn nicht üblicherweise verfügbar, an den Enden der Codierungssequenz addiert werden, um auf diese Weise ein exzidierbares Gen zum Insertieren in diese Vektoren bereitzustellen.
II. Transformierte Wirtszellen, die hohe Spiegel rekombinanter Methioninase exprimieren
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiter Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsmodul oder -vektor transformiert werden, um von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins als rekombinante Methioninase, bevorzugt mehr als ca. 10% des zellulären Gesamtproteins zu produzieren. Die Wirtszelle kann entweder ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Wirt sein.
Jedweder prokaryotische Wirt kann zur Expression der hochgradigen erfindungsgemäßen Methioninase-codierenden Module verwendet werden. Der bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli. In den folgenden Beispielen wurden die DH5α- und BL21-(DE3)-Stämme von E. coli verwendet.
Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen schließen Insektenzellen, Hefezellen und Säugerzellen, bevorzugt Insektenzellen, wie zum Beispiel SP6 und Vertebratenzellen, wie zum Beispiel die aus einer Maus, einer Ratte, einem Affen oder einer humanen Fibroblastenzelllinie ein. Andere bevorzugte eukaryotische Wirtszellen schließen Zellen aus dem Ovar des Chinesischen Hamsters (CHO; Chinese Hamster Ovary), die von der ATCC als CCL61 erhältlich sind, NIH Embryozellen aus der Schweizer Maus NIH/3T3, die von der ATCC als CRL 1658 erhältlich sind, Nierenzellen vom Babyhamster (BHK; Baby Hamster Kidney Cells) und ähnliche eukaryotische Gewebekultur-Zelllinien ein.
Die Transformation eines entsprechenden Wirts mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Modul zur hochgradigen Expression wird durch weithin bekannte Verfahren erreicht, die in der Regel vom Typ des verwendeten Wirts und Vektors abhängen. In Bezug auf die Transformation prokaryotischer Wirtszellen, ist die Elektroporation oder Salzbehandlung der Wirtszellen bevorzugt, siehe zum Beispiel Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110, 1972; und Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).
In Bezug auf die Transformation von eukaryotischen Zellen ist die Elektroporation oder die Verwendung eines kationischen Lipids bevorzugt, siehe zum Beispiel Graham et al., Virol., 52: 456, 1973; und Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1373–76, 1979.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes Expressionsmodul enthalten, können durch weithin bekannte Verfahren identifiziert werden. Zellen, die sich zum Beispiel aus der Einführung eines erfindungsgemäßen Expressionsmoduls ergeben, können zur Herbeiführung von Einzelkolonien cloniert werden. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet, lysiert und ihr DNA-Gehalt auf das Vorliegen der rDNA unter Verwendung eines Verfahrens wie zum Beispiel das von Southern, J. Mol. Biol., 98: 503, 1975, oder Berent et al., Biotech., 3: 208, 1985, beschriebene, untersucht werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist jedoch weiter, wie nachstehend beschrieben, ein Schnellscreeningsverfahren zur Identifikation von Transformanten, die hohe Spiegel rekombinanter Methioninase exprimieren.
III. Identifikation von Wirten, die hohe Spiegel rekombinanter Methioninase exprimieren
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiter Verfahren zur Identifikation einer transformierten Wirtszelle, die rekombinante Methioninase in Spiegeln von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins produziert. Es wurde spezifisch beobachtet, dass transformierte Wirtszellen, die von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins als rekombinante Methioninase exprimieren, eine distinkte und beobachtbare rosa Farbe aufweisen. Dies ist insbesondere ausgeprägt, wenn E. coli als der Wirt verwendet wird.
Zur Identifikation einer transformierten Wirtszelle, die hohe Konzentrationen rekombinanter Methioninase exprimiert, wird eine transformierte Zelle auf oder in einem Medium unter Bedingungen gezüchtet, bei denen die rekombinante Methioninase exprimiert wird und die visuelle Inspektion der wachsenden Zellen ermöglicht. Die wachsenden Zellen oder Kolonien werden untersucht und basierend auf der Anzeige einer rosa Farbe ausgewählt.
Eine Reihe verschiedener Kultur-/Wachstumsbedingungen können zum Züchten transformierter Wirtszellen zur Auswahl unter Verwendung der vorliegenden Verfahren eingesetzt werden. Die Komponenten des Wachstumsmediums hängen ab von den Nährstoffanforderungen des eingesetzten Wirts-/Vektorsystems und dem zur Identifikation der rosa Farbe, die mit hohen Spiegeln rekombinanter Methioninase-Expression einhergeht und dadurch die Isolation eines Clons mit hochgradiger Expression erlaubt, verwendeten Inspektionssystem. Das bevorzugte Medium ist ein festes Medium, auf das die transformierten Wirtszellen ausplattiert und als isolierte Kolonien, von denen sich jede von einem einzelnen Wirt herleitet, gezüchtet werden können. Das bevorzugte Identifikationsverfahren von Clonen mit hochgradiger Expression stellt die visuelle Inspektion der wachsenden Kolonien dar.
IV. Produktion rekombinanter Methioninase unter Verwendung eines Moduls mit hochgradiger Expression
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiter Verfahren zur Produktion rekombinanter Methioninase. Rekombinante Methioninase kann spezifisch in gewerblich signifikanten Mengen unter Verwendung eines Wirts, der mit einem oder mehr der erfindungsgemäßen hochgradigen Expressionsmodul(en) transformiert ist, hergestellt werden. Ein derartig transformierter Wirt exprimiert rekombinante Methioninase in einer Konzentration von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirte kann ein Fachmann ohne weiteres rekombinante Methioninase zur Verwendung in einer Reihe verschiedener diagnostischer und therapeutischer Verfahren unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren produzieren.
Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung rekombinanter Methioninase, die unter Verwendung eines transformierten Wirts produziert wird, enthaltend ein Methioninase codierendes Modul mit hoher Expression oder aus einem Wirt, der Methioninase natürlich produziert, umfasst die folgenden Schritte:

(a) Erhitzen eines Extrakts aus einer transformierten Zelle, der Methioninase in wässrigen Puffern enthält, von ca. 40–60°C für 1–10 min, bevorzugt 50°C für 1 min;
(b) Zentrifugieren des erhitzten Extrakts von ca. 10k bis 20k U/min in einem GS-3-Rotor (Sorvall DuPont) für ca. 15 min bis 1 Stunde, bevorzugt bei ca. 13k U/min für 30 min bei 4°C;
(c) Ultrafiltration des Überstandes unter Verwendung eines Filters einer Porengröße von ca. 50k bis 100k, bevorzugt einer Millipore Prep/Scale: TFF PLHK 100k 2,5 ft² Patrone unter Verwendung eines 10 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 8,3);
(d) DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl einer niedrigen Ionenstärke (von 10–50 mM) in einem 10–20 mM Kaliumphosphatpuffer bei ca. pH 7,0–7,6, und Sammeln der Fraktionen enthaltend Methioninase, die mit einem KCl-Gradienten von 40–200 mM eluiert werden, bevorzugt unter Verwendung einer DEAE-Sepharose-FF-Säule;
(e) eine zweite DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl einer mittleren Ionenstärke (50–10 mM) in einem 10–20 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von ca. 8,0–8,6 und Sammeln der Fraktionen, enthaltend Methioninase, die in einem Phosphatpuffer (pH 8,3) eluiert werden, eluiert in 100–200 mM KCl, bevorzugt unter Verwendung einer DEAE-Sepharose-FF-Säule; und;
(f) Kontaktieren genannter Fraktionen, die in Schritt (e) mit einem zum Absorbieren von Endotoxin fähigen Chromatographie-Medium gesammelt werden; und Sammeln des Eluenten, wodurch das Endotoxin aus genanntem Eluenten entfernt wird, um von Endotoxin freie Methioninase mit mindestens 20 Einheiten Methioninase-Aktivität pro Milligramm Protein und von 1–100 ng Endotoxin pro mg Protein, bevorzugt unter Verwendung einer Acticlean^® Etox-Säule, zu bilden.

Der Zellextrakt wird bevorzugt aus einer Wirtszelle, die zur Expression hoher Spiegel von rekombinanter Methioninase (von ca. 5–75% des zellulären Gesamtproteins) verändert wurde, hergestellt. Für Bakterienzellextrakte werden die Extrakte im Allgemeinen durch zuerst Ernten und Waschen der Bakterienzellkulturen zur Bildung einer Zellpaste/eines Zellpellets hergestellt, abhängig davon, ob das Ernten durch Zentrifugation oder Hohlfaserfiltration erfolgt, welche Verfahren im Allgemeinen überall bekannt sind.
Die Zellen werden dann unter Verwendung üblicher Mittel aufgeschlossen. Die Zellen werden bevorzugt unter Verwendung eines Homogenisators, wie zum Beispiel des Kavitatortyps, zum Beispiel einem Modell Nr. HC8000 von der Microfluidics Corp., aufgeschlossen.
Die sich ergebende Suspension wird zur Präzipitation selektiver Proteine und anderer unlöslicher Materialien erhitzt. Typische Erhitzungsbedingungen betragen von ca. 45–60°C für 1–10 Minuten. Ein Erhitzungsschritt von 50°C für 1 Minute ist bevorzugt.
Der erhitzte Extrakt wird zum Entfernen von Debris zentrifugiert, und der Überstand wird filtriert und in zwei Schritten, wie vorstehend beschrieben, auf ein DEAE-Ionenaustauschchromatographie-Medium aufgebracht. Bevorzugte Adsorptions- und Elutionsbedingungen werden in den Beispielen beschrieben. Jedwede Art von DEAE-Ionenaustauschsäulenchromatographie-Medien kann bei diesen Schritten verwendet werden, und die Wahl der Medien darf nicht als einschränkend ausgelegt werden. Zu gewerblichen Quellen zählen Pharmacia Fine Chemicals, BioRad und Sigma.
Danach wird zur Herstellung eines Proteins mit akzeptierbaren Endotoxin-Spiegeln, wie vorstehend angeführt, Endotoxin entfernt. Der Schritt zur Entfernung von Endotoxin kann auf jedwede von vielen verschiedenen Weisen, die alle weithin bekannt sind, durchgeführt werden und beinhaltet in der Regel das Kontaktieren des Proteins in Lösung mit einem Chromatographie-Medium, das zur Adsorption des Endotoxins und Erzielen eines Chromatographie-Medium-Eluenten fähig ist, der Endotoxin-freies Protein enthält. Das bevorzugte gewerblich erhältliche Reagenz zur Verwendung bei der Entfernung des Endotoxins stellt Acticlean^® Etox dar.
G. Verwendung von Methioninase zur Prävention der Hyperhomocysteinämieassoziierten kardiovaskulären Erkrankung
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt die Verwendung von Methioninase zur Homocystein-Depletionstherapie dar.
Hyperhomocysteinämie wird mit verschiedenen Typen kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die erste Assoziation dieser Erkrankungen mit Homocystein wurde von McCully 1969 gemacht. (McCully, K. S., Am. J. Pathol., 56: 111–28, 1969). McCully fand ein Link zwischen den erhöhten Homocysteinkonzentrationen im Plasma und arteriusklerotischen Erkrankungen. Eine vor kurzem abgeschlossene Studie mit 1,041 Studienteilnehmern aus der Framingham Heart Study fand, dass erhöhte Plasmaspiegel des Homocysteins zu einem erhöhten Risiko für Arteriosklerose führen (Selhub, J. et al., N. Engl. J. Med., 32: 286–91, 1995). Andere Studien haben selbst eine moderate Hyperhomocysteinämie mit der peripheren vaskulären, cerebrovaskulären und der koronaren Herzerkrankung in Verbindung gebracht. (Kang, S. et al., Annu. Rev. Nutr., 12: 279–98, 1992). So sind zum Beispiel die Homocystein-Konzentrationen bei fastenden Patienten mit vaskulärer Erkrankung um 31% höher als bei normalen Personen. Homocystein-Konzentrationen im Plasma von 12% über der Obergrenze des Normbereichs wurden mit einer 3,4fachen Zunahme des Risikos für einen Myokardinfarkt in Verbindung gebracht. (Stampfer, M. et al., JAMA, 268: 877–81, 1992). In Studien zum Homocystein-Metabolismus wurde ermittelt, dass 20 Fallkontrollen und Querschnittsstudien mit über 2000 Personen zeigen, dass Patienten mit Schlaganfall und anderen kardiovaskulären Erkrankungen höhere Homocysteinspiegel im Blut aufweisen als Patienten, die nicht an kardiovaskulären Erkrankungen leiden. Dies steht der Tatsache entgegen, dass die meisten Patienten mit Myokardinfarkt normale Cholesterinspiegel aufweisen. Ein beeindruckendes Ergebnis wurde in der Physicians Health Study gefunden, in der prospektiv gezeigt wurde, dass – wenn Blut vor der Diagnose der kardiovaskulären Erkrankung entnommen wurde – 271 Männer, die später Mykardinfarkte erlitten, signifikant höhere mittlere Homocystein-Spiegel zur Baseline aufweisen als entsprechende Kontrollen, die keine Myokardinfarkte aufweisen (Ueland, P. et al., Cardiovascular Disease Hemostasis and Endothelial Function, New York: Marcel Decker; 183–236, 1992). Obwohl eine Reihe verschiedener Erkrankungen zu erhöhten Homocysteinspiegeln führen können, liegt die Relation zwischen hohen Homocysteinspiegeln und der vaskulären Erkrankung ungeachtet der zugrundeliegenden metabolischen Ursache vor. In einer direkten Studie wurden in Pavianen vaskuläre Läsionen induziert, und die Paviane wurden über 3 Monate mit Homocystein infundiert (Ueland, P. et al., vorstehend). Hyperhomocysteinämie kann durch orale Verabreichung von Methionin, gefolgt von der Messung der Homocysteinspiegel bei den Patienten diagnostiziert werden. Von der Norm abweichende Homocystein-Kozentrationen im Plasma nach diesem oralen Methionin-Challenge sind bei Patienten mit arteriosklerotischer Erkrankung 12-mal mehr vorhanden als bei normalen Personen (Ueland, et al., vorstehend). Homocystein-Spiegel im Plasma können mithilfe von HPLC-Assays leicht und schnell gemessen werden. Studien deuten darauf hin, dass bei 40% der Bevölkerung erhöhte Homocystein-Spiegel und ein Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung vorliegen könnten (Stampfer, M. und Malinow, M., New Engl. J. Med., 332: 326–329, 1995). Hyperhomocysteinämie kann akute Effekte bei der Induktion der ateriosklerotischen Erkrankung aufweisen und bei den Personen zu einem Risiko für einen Myokardinfarkt und einer cerebrovaskulären Erkrankung führen. Eine akute medikamentöse Intervention ist folglich für einen großen Anteil von Personen mit Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung angezeigt. Die erfindungsgemäße Methioninase kann als die Therapie der Wahl zur akuten Intervention zwecks sofortiger Senkung der Homocycteinspiegeln bei Risikopersonen angewendet werden. Methioninase katalysiert zwei Reaktionen, die Spaltung von sowohl der Stickstoff-Kohlenstoff-Bindung und der γ-Kohlenstoff-Schwefel-Bindung nicht nur zu Methionin, sondern auch zu Homocystein (Hoffman, Bioch. et Biophys. Acta, Reviews on Cancer, 738: 49–87, 1984). 7 erläutert den Stoffwechselzyklus des Homocystein- und Methionin-Metabolismus. Die Vitamine B-12, B-6 und Folat beeinflussen die „linke" Seite des in der Figur erläuterten Zyklus und sind bei einigen Personen bei der Aufrechterhaltung normaler Homocysteinspiegel nach den Methioninase-Therapien hilfreich. Die „rechte" Seite des Zyklus ist jedoch von den Spiegeln dieser Vitamine unabhängig. Auf der rechten Seite des Zyklus kann die Anwesenheit von Methionin über erhöhte Transmethylierungsreaktionen, die zu Krebs wie auch zur arteriosklerotischen Erkrankung führen können, in übermäßigen Homocystein-Spiegeln resultieren. Für Personen mit Abnormalitäten auf der rechten Seite des Zyklus könnte eine Aufrechterhaltung wie auch die akute Anwendung von Methioninase notwendig sein, um normale Homocystein-Spiegel aufrechtzuerhalten. Für kardiovaskuläre Erkrankungen ist die Substratspezifität der Methioninase sowohl für Methionin als auch Homocystein kritisch: Methioninase senkt sowohl den Methioninspiegel, bei dem es sich um einen Präkursor von Homocystein handeln kann, als auch den Homocystein-Spiegel direkt. Frühere Arbeiten in diesem Bereich haben nur die Verwendung der Vitamine B-12, B-6 und Folat als Therapie zur Senkung der Hyperhomocysteinämie vorgeschlagen. Wie in 7 gezeigt, behebt die ledigliche Bereitstellung dieser Vitamine keine der Abnormalitäten auf der rechten Seite des Zyklus und könnte gegebenenfalls das Homocystein bei Personen mit Abnormalitäten auf der rechten Seite des Zyklus nicht senken. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die an solchen kardiovaskulären Erkrankungen leiden, mit Methioninase.
In einem Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer kardiovaskulären Erkrankung bereitgestellt, umfassend die Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge.
Eine therapeutisch wirksame Methioninasemenge zur Homocyctein-Depletion stellt eine prädeterminierte Menge dar, die zur Erzielung des gewünschten Homocystein-Depletionsspiegels berechnet wird, um auf diese Weise zum Beispiel das Risiko für Arteriosklerose zu reduzieren.
Folglich sind die Dosierungsbereiche zur Verabreichung von erfindungsgemäßer Methioninase die, die zur Herbeiführung der gewünschten Wirkung hoch genug sind, womit zum Beispiel das Risiko für eine oder der Grad der Arteriosklerose reduziert sind. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, dass sie unerwünschte Wirkungen verursacht, wie zum Beispiel Hyperviskositätssyndrom, Lungenödem, dekompensierte Herzinsuffizienz und dergleichen. Im Allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und Schweregrad der Erkrankung bei dem Patienten und kann von einem Fachmann bestimmt werden.
Die Dosierung kann vom individuellen Arzt im Fall einer Komplikation angepasst werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Methioninase ist in der Regel eine Menge dergestalt, dass – wenn sie in einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung verabreicht wird – zur Erlangung einer intravasalen (Plasma) oder lokalen Konzentration von ca. 0,001 bis ca. 100 U pro ml, bevorzugt über ca. 0,1 U und bevorzugter über ca. 1 U Methioninase pro ml ausreicht. Typische Dosierungen können basierend auf dem Körpergewicht verabreicht werden und liegen im Bereich von ca. 5–1000 U/Kilogramm (kg)/Tag, bevorzugt ca. 10–50 U/kg/Tag und bevorzugter ca. 20–40 U/kg/Tag.
In bevorzugten Verfahren ist eine verwendete Methioninase weitgehend frei von Endotoxin, wie vorstehend ausführlich besprochen wurde. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von hierin produzierter Methioninase, die im Wesentlichen frei von Endotoxin aus einer rekombinanten Quelle ist.
Dem Durchschnittsfachmann bekannte Verabreichungsverfahren können eingesetzt werden und werden hierin beschrieben.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Patient mit einer kardiovasklulären Erkrankung mittels Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Methioninase behandelt, die im Wesentlichen frei von Endotoxinen und an ein Polymer konjugiert ist. In einem bevorzugten Aspekt stellt das Polymer Polyethylenglykol dar. In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt stellt die kardiovaskuläre Erkrankung Arteriosklerose dar. In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird die Methioninase an Patienten mit extrakranieller Stenose der Arteria carotis, peripherer vaskulärer, cerebrovaskulärer, koronarer Herzerkrankung und okklusiven vaskulären Erkrankungen, verabreicht.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt sind Mittel zur Behandlung eines Patienten mit Hyperhomocysteinämie durch Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge bereitgestellt. Die Methioninase kann weitgehend frei von Endotoxinen sein, und die Methioninase kann durch ein Polymer, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, konjugiert sein.
Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel zur Senkung der Homocysteinspiegel in einem Patienten, umfassend den Schritt der Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge, worin die Methioninase im Wesentlichen frei von Endotoxinen ist. In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verfahren zur Prävention einer kardiovaskulären Erkrankung bei einem Patienten bereitgestellt, umfassend den Schritt der Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Methioninasemenge. In einem bevorzugten Aspekt ist die an den Patienten verabreichte Methioninase im Wesentlichen frei von Endotoxin. In einem anderen bevorzugten Aspekt ist die Methioninase an ein Polymer konjugiert. In einem noch anderen bevorzugten Aspekt ist ein Verfahren zur Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen bei einem Patienten bereitgestellt, umfassend den Schritt der Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Menge einer Methioninase, die im Wesentlichen frei von Endotoxin ist, worin die Methioninase auch an Polyethylenglykol konjugiert ist. Beispiel 7 stellt ein Beispiel von Homocystein-Depletion in vivo bereit.
H. Verwendung von Methioninase zum Tumor-Imaging
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt sind Mittel zur Diagnose eines Tumors bei einem Patienten bereitgestellt, umfassend die Schritte der Depletion von ¹²C-Methionin bei einem Patienten durch Verabreichung von Methioninase an den Patienten, gefolgt durch Repletion des Methionins bei dem Patienten durch Verabreichung von ¹¹C-Methionin an den Patienten und schließlich dem Nachweis der Anwesenheit von ¹¹C-Methionin in den Tumorzellen des Patienten. Die ¹¹C-Methylierung kann durch Mittel nachgewiesen werden, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt darauf, Positronenemssionstomographie-Scanning (PET-Scanning). Der Durchschnittsfachmann ist mit anderen Verfahren zum Nachweis der ¹¹C-Aufnahme durch Krebszellen vertraut. Solche Verfahren werden zum Beispiel in Lapela et al., J. Nucl. Med., 35: 1618–23, 1994; Miyazawa et al., J. Nucl. Med., 34: 1896–91, 1993; Leskinen-Kallio et al., J. Nucl. Med., 33: 691–95, 1992; Shields et al., J. Nucl. Med., 33: 581–84, 1992; Huovinen et al., Brit J. Cancer, 67: 787–91, 1993; Dethy et al., J. Nucl. Med., 35: 1162–66, 1994; Lindholm et al., J. Nucl. Med., 34: 1711–16, 1993; Leskinen-Kallio et al., J. Nucl. Med., 32: 1211–18, 1991; und Mineura et al., J. Nucl. Med., 32: 726–28, 1991 beschrieben, die alle hierdurch unter Bezugnahme hierin eingeschlossen sind.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt ist die bereitgestellte Methioninase im Wesentlichen frei von Endotoxin.
In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt wurde die Methioninase an ein Polymer, wie zum Beispiel Polyethylenglykol konjugiert.
Beispiele
Die folgenden diese Erfindung betreffenden Beispiele sind erläuternd und sollten selbstverständlich nicht als die Erfindung spezifisch einschränkend ausgelegt werden.
Solche erfindungsgemäßen Variationen, die zudem bereits bekannt sind oder später entwickelt werden, die in den Aufgabenbereich des Durchschnittsfachmannes kommen würden, müssen als in den hierin nachstehend beanspruchten erfindungsgemäßen Rahmen fallend berücksichtigt werden.
Beispiel 1
Scaling-up-Produktion von Methioninase
Es wurde ein Stamm von Pseudomonas putida modifiziert und für Kanamycin-Resistenz und hohe Spiegel der Methionin-Expression wie folgt ausgewählt:
ATCC 8209 Pseudomonas putida und ATCC 77100 E. coli wurden im Oktober 1993 von der ATCC erworben. ATCC 77100 wurde in LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual A.1, 1989) mit 50 μg/ml Kanamycin gezüchtet. Plasmid pCN 51, ein Shuttle-Vektor, enthaltend ein Kanamycin-Resistenzgen, das zur Replikation sowohl in P. putida als auch E. coli fähig ist (Nieco et al., Gene, 87: 145–149, 1990), das hierdurch unter Bezugnahme hierin eingeschlossen ist, wurde aus ATCC 77199 isoliert und unter Verwendung des Triton-Lysozym-Verfahrens gereinigt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual 1.29–1.30, 1989). ATCC 8209 wurde in LB-Medium gezüchtet und mit pCN 51 unter Verwendung von Standard-Transformationsverfahren, wie beispielsweise die zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1.74–1.84, 1989, beschriebenen, transformiert. Der Kanamycin-resistente Stamm wurde mit Kanamycin (100 μg/ml) in LB-Medium ausgewählt und in LB-Platten (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual A.1–A.4, 1989) in 100 μg/ml Kanamycin weiter gezüchtet. In 100 μg Kanamycin in LB wurde über Nacht eine Einzelkolonie gezüchtet und unter Bedingungen einer hohen Methioninase-Expression gebracht: 10% LB, 0,1% Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, 0,1% Harnstoff, 0,025% Hefeextrakt, 0,01% Magnesiumsulfat und 0,25% Methionin mit 50 μg/ml Kanamycin für die Dauer von 24 Stunden. Die Expression von Methioninase wurde mit dem Standard-Methioninase-Assay, wie hierin beschrieben, gemessen. Der Methioninase überproduzierende Stamm von Pseudomonas putida wurde ausgewählt und als AC-1 bezeichnet.
Ein Fermentationsverfahren im Produktionsmaßstab für AC-1, Pseudomonas putida, wurde dann eingesetzt. Es wurde eine AC-1-Einzelkolonie in einer LB-Platte, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Die ausgewählte Kolonie wurde in 5 ml LB, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin bei 26°C 18 Stunden unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Zwei ml der Bakterien wurden in 600 ml LB, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin bei 26°C 6 Stunden unter Schütteln bei 200 U/min amplifiziert. Danach wurden 50 ml Bakterien in 2 Liter LB, enthaltend 50 μM/ml Kanamycin bei 26°C über Nacht (18 Stunden) unter Schütteln bei 100 U/min inkubiert. – Danach wurden 2 Liter Bakterien (OD₆₀₀ 1,2–1,6) in einem 40 Liter fassenden Tank in einem Spezialmedium, das 10% LB, 0,1% Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, 0,1% Glycerol, 0,1% Harnstoff, 0,025% Hefeextrakt, 0,01% Magnesiumsulfat und 0,25% Methionin unter hohen Belüftungsbedingungen enthielt, 24 Stunden bei 26°C gezüchtet. Die OD₆₀₀ erreichte 1,2–1,8, und die Aktivität erreichte 20–30 Einheiten/Liter. Die optimale Zelldichte zum Ernten liegt bei einem OD₆₀₀ von 1,5–1,8 mit 2–3 mg/l Methioninase. Dies entspricht 1 kg feuchten Zellen/400 Litern. Ein vollständig ausgerüsteter Fermenter würde mit einer annähernden Ausbeute von 1 kg feuchter Zellen/10–20 Litern verwendet werden. Die Zellen wurden mit einer AGT-Säule (Modell UFP-500-E-55-Patrone, A/G Technology Corporation) geerntet, wobei die Temperatur bei 4°C gehalten wurde, dann unter Verwendung einer automatisch gekühlten Zentrifuge (Sorvall Superspeed RC2-B) bei 4°C, bei 9k U/min 10 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann gesammelt.
Die Zellen wurden dann in Extraktionslösung (20 mM Kaliumphosphat, pH 9,0) bei einer Dichte von 500 g feuchten Zellen/Liter suspendiert und unter Verwendung von drei Passagen mit einem Kavitator-Homogenisator (Microfluidics Corp., Modell Nr. HC 8000) aufgeschlossen. Das Homogenat wurde bei –800°C sofort nach dem Zellaufschluss gelagert. Die spezifische Aktivität von Methioninase im Homogenat betrug 0,08–0,1 Einheiten/mg Protein.
Die AC-1-Homogenat wurde in Extraktionspuffer (10 mM Kaliumphosphat pH 7,2, 10 μM Pyridoxalphosphat, 0,01% β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA und 20% Ethanol suspendiert und wurde 2 Minuten bei 50°C erhitzt. Der Erhitzungsschritt kann für jedwede Zeitdauer, die zum Präzipitieren von hitzeempfindlichen kontaminierenden Proteinen ausreicht, durchgeführt werden, während die Methioninase-Aktivität aufrechterhalten wird. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 12k U/min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit einer Millipore Prep/Scale-TFF PLHK 100k 2,5 ft² Patrone ultrafiltriert. Der pH wurde dann auf 7,2 eingestellt.
Ein Probe von ca. 25–35 g Gesamtprotein in 101 Extraktionspuffer (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% J-Mercaptoethanol) wurde auf eine Toyopearl DEAE-650M-Säule 10 cm × 50 cm (Toso Haas Japan), die mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) voräquilibriert war, aufgebracht. Die Säule wurde mit 20–30 l 40 mM Kaliumchlorid in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol, vorgewaschen, bis die OD₂₆₀ unter 0,1 absank. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten von Kaliumchlorid bei Konzentrationen eluiert, die bei 40 mM begannen, wobei sie bis zu 300 mM im Extraktionspuffer anstiegen. Es wurden Elutionsfraktionen von 400 ml gesammelt. Die Fraktionen, die Methioninase enthielten, wurden mittels dem Methioninase-Aktivitätsassay, wie hierin beschrieben, bestimmt und gepoolt. Die gepoolten Fraktionen wurden mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,3, enthaltend die gleiche Konzentration Pyridoxalphosphat und β-Mercaptoethanol und 150 mM Kaliumchlorid, voräquilibriert.
Eine Probe von ca. 1–2 g Gesamtprotein, die aus dem Methioninase-Peak der DEAE-650M-Säule (5 cm × 20 cm) in Puffer, enthaltend 10 mM Kaliumphosphat pH 8,3, 150 mM Kaliumchlorid, 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% J-Mercaptoethanol, erhalten wurde, wurde auf eine DEAE-Sephadex A50-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 150–500 mM KCl in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,3, enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol, eluiert. Es wurden Elutionsfraktionen von 150 ml gesammelt. Die Fraktionen, enthaltend Methioninase, die durch den wie hierin beschriebenen Aktivitätsassay bestimmt wurden, wurden gepoolt. Die gepoolte Methioninase wurde dann zur Entfernung von Endotoxin weiter gereinigt. Die Probe wurde durch Dialyse in 0,12 M Natriumchlorid und 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,1, voräquilibriert. Die Probe wurde auf eine 5 cm × 15 cm Acticlean Etox Harzsäule (Sterogen Bioseparations, Arcadia, CA) aufgebracht. Das Enzym wurde dann unter Verwendung des gleichen Puffers aus der Säule eluiert, wobei die Eluentenfraktionen, die die Methioninase- Aktivität enthielten, gesammelt wurden und die Endotoxinmenge danach an den eluierten Fraktionen bestimmt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieses Reinigungsverfahrens.
In einer Analyse der gereinigten Methioninase wurde auf einem 7,5%igen SDS-PAGE-Gel eine einzelne Proteinbande von 43 kD beobachtet, die eine Untereinheit des Proteins von 172 kD darstellte, wenn die aktiven Fraktionen aus der zweiten Säule mittels SDS-PAGE analysiert wurden. Die Reinheit der anhand dieses Verfahrens isolierten Methioninase betrug 98,7%, wie unter Verwendung der HPLC-Analyse gesehen wurde, die nur einen Protein-Peak nachwies.
Die hierin beschriebenen Extraktionsverfahren führten zu einer Aufbereitung von weitgehend isolierter Methioninase, die im Wesentlichen frei von Endotoxin war. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass Modifikationen an den Extraktionsverfahren vorgenommen werden können, die im Rahmen der Erfindung beschrieben und darin eingeschlossen sind.
Beispiel 2
Abhängigkeit humaner Tumoren von erhöhten Methioninspiegeln
Methionin-Abhängigkeit kommt beim humanen Krebs häufig vor. Zwanzig humane NCI-Tumorzelllinien aus allen wichtigen Organsystemen wurden auf Methionin-Abhängigkeit getestet. Es wurde ermittelt, dass alle zwanzig Zelllinien Methioninabhängig waren. Außerdem wurden frische humane Tumorproben getestet, und es wurde gefunden, dass sie Methionin-abhängig waren. Normale humane Zelllinien waren nicht Methionin-abhängig.
1 zeigt die Ergebnisse eines solchen Tests. In 1 wurden normale Zellstämme und Tumorzelllinien in Eagles MEM mit 10% dialysiertem Serum gezüchtet, die das eine oder andere aufwiesen: Methionin-enthaltend, Homocystein-frei (MET⁺HCY^–); Methionin-frei, Homocystein-enthaltend (MET^–HCY⁺) oder Methionin-frei, Homocystein-frei (MET^–HCY^–). Nieren-, Kolon-, Lungen- und Prostatakrebs-Zelllinien und Melanome und normale Fibroblasten-Stämme wurden in Methionin-(MET)-enthaltendem Medium, MET-freiem Medium, „Homocystein"-(HCY)-enthaltendem Medium und in MET-freiem Medium, Homocystein-(HCY)-enthaltendem Medium und in MET-freiem, HCY-freiem Medium gescreent. Die Zellen wurden in Eagles Minimum Essential Medium (MEM-Medium), supplementiert mit 10% dialysiertem fetalem Rinderserum, 10 μM Hydroxocobalamin und 100 μM Folsäure, gezüchtet. Das Medium wurde mit oder ohne Methionin auf die folgende Weise supplementiert: MET+HCY: Das Medium wurde mit 100 μM L-Methionin ohne Homocystein supplementiert. METHCY+: Das Medium wurde mit 200 μM D,L-Homocystein ohne Methionin supplementiert. METHCY: Das Medium war Methionin-frei und Homocystein-frei. Das fetale Rinderserum wurde 10-mal gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Serum:PBS von 1:12) dialysiert.
Die Zellproliferation wurde anhand der metabolischen Reduktion des Farbstoffes XTT, wie durch Absorption bei 450 nm gemessen, bestimmt. Die Zellen wurden auf 48-Well-Platten durch Inokulation von zwischen 5 × 10³ und 2 × 10⁴ Zellen pro Well gezüchtet. XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolhydroxid), das in lebensfähigen Zellen metabolisch zu einem in Wasser löslichen Formazan-Produkt reduziert wird, wurde zur Bestimmung der Zellproliferation verwendet. Die Absorption des reduzierten Produkts wurde bei 450 nm gemessen. XTT wurde zu 1 mg/ml in vorgewärmter (37°C) PBS, Phenazinmethosulfat (PMS) wurde zu 5 mM in PBS hergestellt. Frische XTT-Lösung wurde mit PMS-Stammlösung bei einem Verhältnis von 5 11 PMS pro 1 ml XTT gemischt. Jedes Well wurde mit 1 ml Medium gefüllt. Jedem Well wurden 0,25 ml gemischtes XTT zugefügt. Die Absorption von reduziertem XTT wurde nach 3-stündiger Inkubation bei 450 nm mit einem Hitachi U-2000 Spektrophotometer abgelesen. Die OD von XTT wurde alle 3 Tage, nachdem die Zellen für initiale 24 Stunden kultiviert wurden, gemessen. Die Vorhaut- Fibroblastenstämme FS-3 und HS-68 proliferierten im Wesentlichen in MET⁺HCY^– oder MET^–HCY^– gleich. Es wird jedoch hier eine neue Beobachtung berichtet, insofern, dass beide Fibroblastenstämme bis zu einem gewissen Grad proliferieren konnten und sich dann mindestens 16 Tage in MET-HCY-Medium selbst aufrechterhalten.
Tabelle 2 erläutert die Ergebnisse von einem Zellproliferationsassay von 20 Tumorzelllinien. In dem Assay wurden 5 × 10³–2 × 10⁴ Zellen/Well bezogen auf die Zellsuspension in 48-Well-Platten in MEM mit 10% fetalem Rinderserum 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden mit Hanks Basic Salt Solution (HBSS) zweimal gewaschen und wurden dann in 3 Gruppen aufgeteilt. Gruppe I: Zellen kultiviert in MET⁺HCY^–-Medium; Gruppe II: Zellen kultiviert in MET^–HCY⁺-Medium; Gruppe III: Zellen kultiviert in MET^–HCY^–-Medium. Die Zellen wurden in einem begasten Inkubator mit 95% Luft/5% CO₂ kultiviert. Die Medien wurden alle 2–3 Tage gewechselt. In Tabelle 2 wird starkes Wachstum der Zelllinien mit +++, etwas Wachstum mit ++, geringes Wachstum mit + und kein Wachstum mit – angezeigt. Annähernd eine Hälfte der Tumorzelllinien konnten nicht im MET-freien, HCY-enthaltenden Medium wachsen, wobei der Rest in verschiedenen Graden wuchs, wohingegen das gleiche Medium den normalen Zellen ermöglichte, ebenso in MET-enthaltendem Medium zu wachsen. Obwohl die normalen Zellstämme in einem gewissen Ausmaß wachsen konnten und sich dann für die Dauer von zwei Wochen oder länger in MET-freiem, HCY-freiem Medium selbst aufrechterhalten, starben alle getesteten 20 Tumorzelllinien in diesem Medium, was darauf hindeutet, dass potenziell alle Krebsarten mithilfe von MET-Verarmung selektiv abgetötet werden können. Dieses Beispiel stellt Belege dafür bereit, dass die Methionin-Abhängigkeit universal sein und ein selektives Target für die Krebstherapie, insbesondere mit Methioninase als das Therapeutikum darstellen könnte.
Beispiel 3
Inhibition von humanem Tumorwachstum durch Methioninase in Maus-Xenotransplantatmodellen
Zum Testen der Wirksamkeit von Methioninase auf die Reduktion des Tumorwachstums wurde ein Maus-Xenotransplantatmodell verwendet. Ein humaner Lunbenkrebs-Tumor (H460) wurde in die Subkutis von nackten Mäusen transplantiert. Die Mäuse wurden in vier Gruppen zu je vier Mäusen aufgeteilt. Vier Tage nach der Transplantation wurde an Gruppe A 0,4 ml Puffer (0,12 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat pH 7,1) durch intraperitoneale Injektion alle 4 Stunden verabreicht; an Gruppe B wurde Methioninase (1 Einheit/g) durch intraperitoneale Injektion alle 4 Stunden verabreicht; an Gruppe C wurde 5-FU (60 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion alle 4 Tage verabreicht; und an Gruppe D wurde Vincristin (VCR) (0,9 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion alle 4 Tage verabreicht. Tumorgröße und Körpergewicht wurden alle zwei Tage gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 und 3 ersichtlich. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass die Behandlung mit Methioninase das Wachstum des humanen nicht kleinzelligen Lungenkarzinoms (H460) in nackten Mäusen erheblich verlangsamte. In diesen Experimenten wurden den Mäusen normale nicht Methionin-depletierte Rationen verfüttert. Die Wirksamkeit der Methioninase gegen H460 stand in starkem Gegensatz zur 5-Fluoruracil- und Vincristin-Behandlung, die gegen diesen Tumor inaktiv waren. Die Aktivität der verabreichten Methioninase führte zu keinem Gewichtsverlust für eine bis zu 10-tägige Behandlung bei 40–120 Einheiten/Tag, was auf die Möglichkeit einer geringen Toxizität hindeutet. Im Gegensatz dazu führte Vincristin zu Gewichtsverlust, was auf Toxizität hindeutet. Methioninase ist folglich ein hochwirksames Antitumormittel mit einem neuen Tumor-selektiven Wirkmechanismus mit minimaler Toxizität, das eine potenzielle klinische Wirksamkeit gegen humane solide Tumoren nachweist.
Beispiel 4
Aufbereitung von PEG-Methioninase
Methoxypolyethylenglykol-succinimidyl-carbonat, (M-SC-5000 PEG), Molekulargewicht 5000, wurde in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,3) bei einer Konzentration zwischen 2 mM und 20 mM aufgelöst. Die Molverhältnisse von M-SC 5000 PEG zu Methioninase wurden von 6:1 bis 240:1 variiert. Die PEGylierungsreaktionen wurden in Reaktionspuffer (25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,3), 30 Minuten bis 60 Minuten bei 4°C oder 20°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit Stopp-Puffer (0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5) bei 0°C gestoppt. Nicht zur Reaktion gebrachtes M-SC 5000 PEG wurde dann durch Gelfiltrationschromatographie, wie hierin beschrieben, entfernt. Die sich ergebende PEG-Methioninase wurde in 0,12 M Natriumchlorid und 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2) mit der Verwendung von 30k Amicon Centriprep Concentrators formuliert. Die PEG-Metioninase wurde dann durch Filtration mit einem Mikron-Membranfilter von 0,2 μM sterilisiert. Die PEG-Methioninase kann ohne Aktivitätsverlust bis zu 6 Monate bei –70°C gelagert werden.
Die Methioninase-Aktivität wurde gemessen. Die Aktivität der PEG-Methioninase wurde bei mindestens 60% der Aktivität von nicht-PEGylierter Methioninase aufrechterhalten. Die PEG-Methioninase wurde sowohl durch native als auch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie von Laemmli und Sambrook (Laemmli, Nature, 227–660, 1970; Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 18, 47–18.59, 1989) beschrieben und wie folgt modifiziert: Die Elektrophorese von PEG-Methioninase wurde in vorgegossenen 7,5% Polyacrylamidgelen in 0,2 M Tris-Glycinpuffer (pH 8,3), mit oder ohne SDS durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt und mit 40% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt. Es wurden keine nicht modifizierten Methioninasebanden gesehen, wenn PEG-Methioninase auf native Gele aufgebracht wurde, obwohl eine sehr kleine Bande in SDS-Gelen gesehen werden konnte.
PEG-Methioninase wurde dann mittels einer HPLC-Gelfiltrationssäule wie folgt analysiert: PEG-Methioninase (20 l bei 1–2 mg/ml) wurde unter Verwendung einer 20-μm-Öse auf eine Progel-TSK G3000 SW-Säule (Supelco) in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) aufgebracht und mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) bei einer Fließrate von 1,0 ml/mn eluiert. Es wurde nur ein Protein-Peak, der PEG-Methioninase-Peak, der frei von nicht zur Reaktion gebrachtem PEG war, nachgewiesen; es konnte kein nicht PEGylierter Methioninase-Peak nachgewiesen werden. Die Reinheit von PEG-Methioninase betrug ca. 100%.
a) Studien zum zeitlichen Verlauf der PEGylierungsreaktion
Der zeitliche Verlauf der Konjugation von Polyethylenglykol zu Methioninase wurde wie folgt gemessen: 0,07 mM Methioninase wurde mit 0,4 mM M-SC 5000 PEG in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,3) über verschiedene Zeitspannen bis zu 2 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht. Die Reaktionen wurden an verschiedenen Zeitpunkten mit 0,2 M Natriumphosphat (pH 6.5) gestoppt. Nicht zur Reaktion gebrachtes PEG wurde mit einem 30k Amicon Centriprep Concentrator entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 ersichtlich.
PEG-Methioninase wurde auf nativen und SDS-PAGE-Gelen wie hierin beschrieben analysiert. Das Aussehen einer Bande mit einem höheren Molekulargewicht wurde gemessen und wird in Tabelle 3 mit den Symbolen –, +–, + oder ++ angezeigt, wobei – den Mangel an PEG-Methioninase oder Methioninase anzeigt, +– kleine Mengen PEG-Methioninase oder Methioninase anzeigt und ++ große Mengen PEG-Methioninase oder Methioninase anzeigt. Tabelle 3 zeigt auch die Aktivität der PEG-Methioninase oder Methioninase an.
b) Konzentrationsabhängigkeit der Methioninase-PEGylierung mit dem M-SC 5000 PEG
0,07 mM Methioninase wurden mit verschiedenen Konzentrationen (0,4 mM bis 4,0 mM) M-SC 5000 PEG in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,3) zur Reaktion gebracht. Die Molverhältnisse betrugen 1:6–1:60. Die Reaktionen wurden bei den gleichen Bedingungen wie in Beispiel a für 60 Minuten bei 4°C durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 ersichtlich.
c) Pharmakokinetik von PEG-Methioninase
Die Molverhältnisse der PEGylierung von Methioninase mit M-SC 5000 PEG zu Methioninase betrugen 1:6 (P1) bzw. 1:12 (P2). Die Reaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie unter (b) vorstehend durchgeführt. Die gereinigten P1 und P2 wie auch nicht modifizierte Methioninase wurden in die Schwanzvene von drei verschiedenen Gruppen von Mäusen injiziert. Die Blutproben wurden nach 0, 1, 2, 3, 4 und 20 Stunden gesammelt. Der Aktivitätsassay von Methioninase und PEG-Methioninase und die Depletionsspiegel von Methionin wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 ersichtlich.
Beispiel 5
Antigenitätsexperiment unter Verwendung von PEG-Methioninase in Meerschweinchen:
Methioninase wurde mit M-SC 5000 PEG bei Molverhältnissen von 1:60, 1:120 bzw. 1:240 30 Minuten bei 20°C zur Reaktion gebracht. Die anderen Bedingungen sind die gleichen wie unter (a) vorstehend. PEG-Methioninase wurde mittels des Methioninase-Aktivitätsassays, der Elektrophorese und HPLC analysiert. Es war keine Bande oder ein Peak von nicht modifizierter Methioninase nachweisbar. Folglich handelte es sich bei der PEG-Methioninase um die einzige Enzymquelle.
2 mg Methioninase oder PEG-Methioninase wurden alle zwei Tage insgesamt dreimal intraperitoneal an Meerschweinchen verabreicht. Zwei Wochen später wurden 4 mg Methioninase oder PEG-Methioninase intravenös verabreicht.

0,2 Natriumphosphatpuffer und BSA wurden in diesem Experiment als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse werden gemäß den Kriterien in Tabelle 6 bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 ersichtlich. Die PEGylierung von Methioninase führt, wie in Meerschweinchen getestet, zu einer Zusammensetzung von extrem niedriger Antigenität. Es ist bekannt, dass Meerschweinchen auf Antigene empfindlicher als Menschen reagieren. Tabelle 6 Bewertungskriterien für die Antigenität in der Studie zu PEG-Methioninase bei Meerschweinchen

0. Normal	11. Dyspnoe
1. Ruhelosigkeit	12. Rhonchus
2. Piloerektion	13. Cyanose
3. Zittern	14. Schwankender Gang
4. Laufende Nase	15. Springen
5. Niesen	16. Keuchen und sich vor Schmerzen krümmen
6. Husten	17. Convulsion
7. Hyperpnoe	18. Seitenlage
8. Miktion	19. Cheyne-Stokes-Atmung
9. Entleerung	20. Tod
10. Lakrimation

Bewertungskriterien
Die Ergebnisse zeigten, dass PEG-Methioninase im Gegensatz zu bovinem Serumalbumin (BSA) und Methioninase in Meerschweinchen keine Antigenität aufweist, was darauf hinweist, dass PEG-Methioninase nicht immunogen ist, wenn sie an einen Säuger verabreicht wird.
Beispiel 6
Verabreichung von Methioninase zur humanen Krebstherapie
Es wurde eine Dosis-eskalierende Studie der Phase I zu Methioninase zur Ermittlung der Toxizität, Pharmakokinetik und maximal tolerierten Dosis der Methioninase begonnen. An 2 Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs wurde eine 2-Stunden-Infusion von 5 000 Einheiten (0,5 g) und 10 000 Einheiten (1,0 g) Methioninase mittels i.v.-Infusion über 2 Stunden verabreicht. Blut- und Harnproben wurden in regelmäßigen Abständen von 0 bis 24 Stunden gewonnen. Die Bewertungen der Toxizität wurden gemäß dem WHO-Gradingsystem durchgeführt. Pharmakokinetikdaten wurden sowohl für die Methioninase- als auch Methioninspiegel im Serum erhoben.
Bei allen gemessenen Toxizitätskriterien, die einen Mindestgrad von 0 aufwiesen, wurde keinerlei akute klinische Toxizität beobachtet. Die Halbwertzeit von Methioninase betrug bei Patientin 1 und Patientin 2 2 Stunden bzw. 3,2 Stunden. Die Depletion des Serummethionins begann innerhalb von 30 Minuten der Infusion und wurde über 4 Stunden nach Abschluss der Infusion aufrechterhalten. Die niedrigsten Serum-Methioninspiegel lagen bei Patientin 1 und Patientin 2 bei 35% bzw. 19% bezogen auf den Spiegel vor der Behandlung. Die Ergebnisse sind in Tabellen 8–10 und 4–6 ersichtlich. Die Patientinnen wurden wie folgt behandelt:
Patientin 1: Datum: 14. Dezember 1994. Diagnose: Brustkrebs mit axillärem Lymphknoten und Lungenmetastasen. Weiblich, 46 Jahre alt. 5 000 Einheiten (0,4 g) Methioninase, gereinigt gemäß dem Extraktionsverfahren (Beispiel 1), wurden in einer intravenösen Infusion (200 ml) in 2 Stunden verabreicht. Blutproben wurden vor der Behandlung und danach alle zwei Stunden bis zu 20 Stunden entnommen. Die Methionin- und Methioninasespiegel wurden gemessen und die relativen Spiegel berechnet, 4.
Patientin 2: Datum: 2. Februar 1995. Diagnose: Brustkrebs mit axillärer Lymphknotenmetastase. Weiblich, 54 Jahre alt. 10 000 Einheiten (0,8 g) Methioninase, gereinigt gemäß dem Extraktionsverfahren (Beispiel 1), wurden in einer intravenösen Infusion (400 ml) in 2 Stunden verabreicht. Blutproben wurden vor der Behandlung und danach alle zwei Stunden bis zu 20 Stunden entnommen. Die Methionin- und Methioninasespiegel wurden gemessen und die relativen Spiegel berechnet, 5.
Patientin 3: Datum: 15. Oktober 1995. Diagnose: Brustkrebs mit axillärer Lymphknotenmetastase. Weiblich, 45 Jahre alt. 20 000 Einheiten (1,6 g) Methioninase, gereinigt gemäß dem Extraktionsverfahren (Beispiel 1). wurden in einer intravenösen Infusion (1000 ml) in 10 Stunden verabreicht. Blutproben wurden vor der Behandlung und danach alle zwei Stunden bis zu 20 Stunden entnommen. Die Methionin- und Methioninasespiegel wurden gemessen und die relativen Spiegel berechnet, 6.
Bei Patientin 3 wurden Serum-Methioninasespiegel in Höhe von 50% des Maximalspiegels für die sich anschließenden 6 Stunden nach der Infusion aufrechterhalten. Methionin verarmte um über das 200fache, von 23,1 μM auf 0,1 μM, zur Stunde 10 der Infusion. Es wurde bei allen gemessenen Toxizitätskriterien keinerlei klinische Toxizität beobachtet.
Die Bewertung der Toxizität wurde gemäß den WHO-Toxizitätskriterien in vier Bereichen durchgeführt: a. Daten zur Krankengeschichte und Diagnose; b. körperliche Untersuchung; c. Bewertung von Laboruntersuchungen und d. Bewertung der Pharmakokinetik (Methioninase- und Methioninspiegel im Serum). Die Ergebnisse, die in Tabellen 8–11 und 4–6 ersichtlich sind, weisen darauf hin, dass die erfindungsgemäße Methioninase nicht toxisch ist und zur Senkung der Methioninspiegel bei Menschen angewendet werden kann.
Tabelle 11 Vitalparameter von mit Methioninase behandelten Patientinnen
Beispiel 7
Homocystein-Depletion in vivo
Die Wirksamkeit von Methioninase in vivo zur Anwendung bei der erfindungsgemäßen Depletion von Homocystein wurde anhand der Verabreichung des Enzyms an Mäuse wie folgt nachgewiesen: 4 Einheiten Methioninase, gereinigt gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, wurden intraperitoneal in Mäuse injiziert. Circa eine Stunde nach der Injektion wurden die Blutkonzentrationen von Methionin, Homocystein und Cystein durch Aussetzen von 50 μl Mausserum nach der Derivatisierung mit PITC zur Analyse mit der Umkehrphasen-HPLC untersucht. Das chromatographische Profil wurde mit dem von PITC derivatisierten internen Methionin-, Homocystein- und Cystein-Standards verglichen. Die Empfindlichkeit des Assays betrug ca. 0,5 μM Methionin.
Wie in Tabelle 12 ersichtlich ist, wies die Methioninase in vivo eine signifikante Homocystein-Depletionsaktivität ohne irgendwelche signifikante Depletion der Cysteinspiegel in vivo im Vergleich zu den Homocystein- und Cysteinspiegeln in der Kontrolle, unbehandelte Mäuse, auf.
Beispiel 8
Verwendung von Methioninase zum Tumor-Imaging
[¹¹C]-Methionin wird bei einem Patienten durch Verabreichung von, wie hierin beschrieben, gereinigter Methioninase depletiert. Die Methioninase ist bevorzugt frei von Endotoxin. Die Methioninase (10 000–20 000 Einheiten) wird durch intravenöse Infusion über 4–8 Stunden verabreicht. Dann werden ca. 5–50 mCi [¹¹C]-Methioninase verabreicht. Positronenemissionstomographie-Imaging (PET) wird dann zum Nachweis der Aufnahme des [¹¹C]-Tracers durch die Zellen des Patienten verwendet. Die Tracer-Aufnahme wird durch Berechnung sowohl des standardisierten Aufnahmewerts (SUV) als auch des Wertes der kinetischen Influx-Konstanten (Ki) durch dem Durchschnittsfachmann bekannte Mittel quantifiziert. Erhöhte [¹¹C]-Methioninspiegel in Zellen deuten darauf hin, dass es sich bei diesen Zellen wahrscheinlich um Tumorzellen handelt. Die präferenzielle [¹¹C]-Methionin-Aufnahme durch die Tumorzellen stellt ein Mittel zum selektiven Nachweis von Tumorzellen unter normalen Zellen bereit.
Die vorstehende Beschreibung, einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und Beispiele, ist zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung beabsichtigt und darf nicht als einschränkend ausgelegt werden. Zahlreiche andere Variationen und Modifikationen können bewirkt werden, ohne aus dem wahren Gedanken und Rahmen der vorliegenden Erfindung zu kommen.
Beispiel 9
Isolation von Nukleinsäuremolekülen, codierend Methioninase, PCR-Reaktion des Inserts des Methioninase-Genclons:
Genomische DNA von Pseudomonas putida AC-1, hergeleitet von ATCC8209, wurde als Matrize verwendet; die verwendeten Primer waren wie folgt:
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: zuerst Denaturierung 10 Minuten bei 95°C, dann 5 Denaturierungszyklen 30 Sekunden bei 94°C, Annealing 30 Sekunden bei 60°C und Verlängerung 2 Minuten bei 72°C; danach 25 Denaturierungszyklen 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, danach Verlängerung 1,5 Minuten bei 72°C; danach endgültige Verlängerung 10 Minuten bei 72°C. Die PCR-amplifizierten Produkte stellen zwei Banden dar, von denen die 1365-bp-Bande gesammelt und als die Insert-ONCase-1-DNA gereinigt wurde.
Clonierung und Transformation
Die ONCase-1-DNA wurde mit dem pT7Blue-T-Vektor (Novagen) an der EcoR-V-T-Clonierungsstelle ligiert. Die pONCase-1-DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren in DH5α-Bakterienzellen transformiert.
DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase und der Didesoxy-Nukleotid-Terminierungsreaktion durchgeführt. Das Primer-Walking-Verfahren wurde verwendet. [³⁵S]-dATP wurde zum Markieren verwendet. Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf 6%igen Polyacryl-Keil- oder Nicht-Keilgelen, enthaltend 8 M Harnstoff, analysiert. Die DNA-Proben wurden in der Reihenfolge von ACGT geladen. Die DNA-Sequenzen wurden mithilfe des MacVector analysiert. Die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz sind in 8 ersichtlich. (SEQ ID NO: 6)
Beispiel 10
Clone mit hoher Expression von rekombinanter Methioninase, PCR-Reaktion des Inserts für den Methioninase-Expressionsclon:
Der pONCase-1-Clon wurde als die Matrize verwendet, die verwendeten Primer sind wie folgt:
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Zuerst Denaturierung 10 Minuten bei 95°C, danach 5 Denaturierungszyklen 1 Minute bei 94°C, Annealing 1,5 Minuten bei 56°C und Verlängerung 2 Minuten bei 72°C; danach 20 Denaturierungszyklen 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C, danach Verlängerung 1,5 Minuten bei 72°C; danach endgültige Verlängerung 10 Minuten bei 72°C. Zwei PCR-amplifizierte Produkte, Bande von ONCase-2- (1238 bp), ONCase-3 (1220 bp), wurden gesammelt und gereinigt.
Clonierung und Transformation
Die DNA der ONCase-2- und ONCase-3-DNA wurden mit NdeI und BamHI aufgeschlossen und mit dem pT7,7-Vektor an den NdeI- und BamHI-Clonierungsstellen ligiert. Die pONCase-2- und pONCase-3-DNA-Sequenzen wurden dann in BL21-(DE3)-Bakterienzellen unter Verwendung von Standardverfahren transformiert.
Auswahl von pAC-1- und pAC-2-Clonen
Die positiven Clone wurden von Ampicillin enthaltenden Platten ausgewählt. Nach 24-stündiger Lagerung bei 4°C wiesen die positiven Clone, welche hohe Spiegel rekombinante Methioninase exprimierten, eine distinkte rosa Farbe auf, die ihre Identifikation und Auswahl ermöglichte. Die Methioninase-Expressionspiegel der positiven Clone wurden anhand des Aktivitätsassays bestimmt. Zwei Clone mit hoher Expression wurden als der pAC-1-Clon, der ONCase-3 enthielt und als der pAC-2-Clon, der ONCase-2 enthielt, ausgewählt.
Konstruktion des pAC-3-Clons und des pAC-4-Clons
Das Tetrazyklin-Resistenz-Gen wurde aus pBR322 an den AvaI- und ClaI-Stellen erhalten. Das Ava-I-Ende wurde in ein stumpfes Ende gefüllt und wurde mit pAC-1 ligiert, das mit den BamHI- und ClaI-Restriktionsenzymen, mit dem BamHI-Ende in ein stumpfes Ende gefüllt, aufgeschlossen wurde. Positive Clone, die nach 24-stündiger Lagerung bei 4°C rosafarbig wurden, wurden von den Tetrazyklin enthaltenden Platten ausgewählt. Ein rekombinanter Methioninase-Clon mit hoher Expression wurde anhand des Aktivitätsassays bestimmt und als der pAC-3-Clon bezeichnet.
Das Tetrazyklin-Resistenzgen wurde auch aus den pBR322 an den AVAI- und HindIII-Stellen erhalten. Das AvaI-Ende wurde in ein stumpfes Ende gefüllt und wurde mit pAC-1, das mit den HindIII- und ClaI-Restriktionsenzymen, mit dem ClaI-Ende in ein stumpfes Ende gefüllt, ligiert wurde. Positive Clone, die nach 24-stündiger Lagerung bei 4°C rosafarbig wurden, wurden von den Tetrazyklin enthaltenden Platten ausgewählt. Ein rekombinanter Methioninase-Clon mit hoher Expression wurde anhand des Aktivitätsassays bestimmt und als der pAC-4-Clon bezeichnet. Ein Reihe verschiedener Clone mit hochgradiger Expression sind in Tabelle 13 und 9 ersichtlich.
Beispiel 11
Fermentation von rekombinanten Methioninase-Expressionsclonen
Die Expressionclone von rekombinanter Methioninase wurden in Terrific Broth-Medium, enthaltend entweder Ampicillin (100 μg/ml) oder Tetrazyklin (10 μg) bei 28°C oder 37°C unter Schütteln bei 400 U/min in einem 61 fassenden Kolben oder Fermenter gezüchtet.
Beispiel 12
Reinigung von rekombinanter Methioninase
Ein Grundriss des Reinigungsverfahrens ist in 10 und 11 ersichtlich.
(1) Behandlung der Probe vor der Säule

Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation bei 800 × g 10 Minuten bei 4°C geerntet. Das Bakterienpellet wird dann in Extraktionslösung (20 mM Kaliumphosphat pH 9,0, 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol) suspendiert und mit einem Homogenisator des Kavitator-Typs (Microfluidics Corp., Modell Nr. HC 8000) aufgeschlossen. Die Wärmebehandlung des Homogenats wird dann 1 Minute bei 50°C durchgeführt. Die Suspension wird mit einer automatisch gekühlten Zentrifuge (SORVALL Superspeed RC 2-B) 30 min bei 4°C bei 13k U/min zentrifugiert. Der Überstand wird dann gesammelt. Diesem Schritt folgt die Ultrafiltration mit einer Millipore Prep/Scale – TFF PLHK 100k 2,5 ft² Patrone mit Puffer (10 mM Kaliumphosphat pH 8,3). Der pH wird mittels Ultrafiltration auf 7,2 eingestellt. (2) Chromatographie-Bedingungen Die erste Säule: DEAE Sepharose FF

Säule:	XK 100/60, Höhe: 32 cm, Volumen: 2,5 l
Lösung:	[A] 40 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol. [B] 200 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol.
Fließrate:	5 ml/min.
Probe:	Ca. 100–200 g Gesamtprotein (10–20 mg/ml) werden auf die erste Säule aufgebracht.
Gradient:	[1] Vorwaschen mit Lösung A, ca. 10 Volumen, bis die OD₂₈₀ unter 0,1 absinkt. [2] Gradient: Lösung B von 20–100%.
Fraktionen:	Es werden Elutionsfraktionen von 200 ml gesammelt. Die Fraktionen, enthaltend rMETase werden anhand des Aktivitätsassays identifiziert und gepoolt.

Die zweite Säule: DEAE-Sepharose FF

Säule:	XK 50/30, Höhe: 25 cm, Volumen: 500 ml
Lösung:	[A] 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol. [B] 200 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01% β-Mercaptoethanol.
Fließrate:	5 ml/min
Probe:	Ca. 10–20 g Gesamtprotein (2–4 mg/ml), nach der Dialyse in 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat für 24 Stunden, werden auf die zweite Säule aufgebracht.
Gradient:	[1] Vorwaschen mit Lösung A, ca. 5 Volumen, bis die OD₂₈₀ auf unter 0,05 absinkt. [2] Gradient: Lösung B von 0%–60%.
Fraktionen:	Elutionsfraktionen von 200 ml werden gesammelt. Die Fraktionen, enthaltend rMETase werden anhand des Aktivitätsassays identifiziert und gepoolt.

Die dritte Säule: Sephacryl S-200 HR

Säule:	HiPrep 26/60, Volumen 320 ml.
Lösung:	0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2)
Fließrate:	1,2 ml/min
Probe:	Ca. 10 ml konzentrierte Probe, (nach der Dialyse in 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2) für 12 Stunden), werden auf die dritte Säule aufgebracht.
Fraktionen:	Elutionsfraktionen von 20 ml, enthaltend rMETase, die anhand der gelben Farbe und des Aktivitätsassays identifiziert werden, werden gesammelt.

Die vierte Säule: Acticlean^® Etox
Gereinigte rMETase (10–20 mg Protein/ml) in einem Volumen von 100–200 ml wird auf eine 500 ml fassende Acticlean^® Etox-Säule aufgebracht und mit Elutionspuffer (0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphat pH 7,2) eluiert, um Endotoxin zu eliminieren. Acticlean^® Etox ist wieder verwendbar und kann mit 1 M Natriumhydroxid gereinigt werden und kann autoklaviert werden.
Konzentration des Endeluenten
Der Endeluent wird mit 30k Amicon Centriprep Concentrators konzentriert. Die Formulierung für gereinigte rMETase beträgt 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat pH 7,2.
Reinigung von rMETase-Histidin: Chromatographie auf einer Ni⁺⁺-Sepharose-Säule

Das Zellhomogenat wird nach der Vorsäulen-Behandlung in Bindungspuffer (5 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) suspendiert. Die Säule wird dann mit 10 Volumina Bindungspuffer gewaschen, gefolgt von Waschen mit 6 Volumina Waschpuffer (60 mM Imidazol, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM Tris, HCl, pH 7,9). Die Elution tritt nach 6 Volumina Elutionspuffer (1 M Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.0) auf, die durch die Säule laufen konnten. Die Fraktionen, enthaltend rMETase, die durch die gelbe Farbe identifiziert wurde, werden gesammelt. Beispiel 13 Analyse auf die Reinheit von rMETase mit HPLC

Säule:	SUPELCO, 8-08541, Progel TM-TSK, G 3000-SWXL, 30 cm × 7,8 cm.
Eluentenlösung:	0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2).
Fließrate:	0,1 ml/min
Probe:	20 μl (0,1–1 mg/ml)

Eine Probe zur Herstellung von rMETase ist in 10 und 11 ersichtlich. Die Reinheit ist in 12 ersichtlich.
Beispiel 14
Formulierungen, enthaltend rekombinante Methioninase, kristallisierte und lyophilisierte Formen
Lösungsformulierung:
rMETase wird in Lösung formuliert, 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), bei der Konzentration von 10–20 mg/ml. Die Stabilität der rMETase ist in 13 ersichtlich.
Kristallisierte Form:
rMETase (10–20 mg/ml), in einem 0,15 M Natriumchlorid und 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) wurde unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (DNA-Grad, superfein, Sigma) entsalzt. Die Lösung wurde auf einem Trockeneis- und Acetonbad eingefroren und dann in einem Vakuum von 100 Milifar, bei –80°C, 72 Stunden unter Verwendung eines Verdis Freeze Mobils 24 eingefroren.
Lyophilisierte Form:
rMETase (10–20 mg/ml), in einem 0,15 M Natriumchlorid und 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), wurde auf einem Trockeneis- und Acetonbad eingefroren und in einem Vakuum von 100 Milifar bei –80°C, 72 Stunden unter Verwendung eines Verdis Freeze Mobils 24 eingefroren.
Assay auf Aktivität:
Der Assay wurde in einem 1 ml Volumen aus 50 mM Phosphatpuffer pH 8,0, enthaltend 10 μM Pyridoxalphosphat und 10 mM Methionin 10 min bei 37°C mit variierenden Enzymmengen durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zufügen von 0,5 ml 4,5%iger TCA gestoppt. Die Suspension wurde bei 15k U/min 2 min zentrifugiert. 0,5 ml Überstand mit 0,5 ml 0,05%iger 3-Methyl-2-benzthiazolinon-hydrazon in 1 ml 1 M Natriumacetat pH 5,2 wurde in 30 min bei 50°C inkubiert. α-Ketobutyrat wurde dann mittels Spektrophotometrie bei OD₃₅₅ bestimmt. Die Proteinmenge wurde mithilfe des Lowry Reagent Kit-Verfahrens (Sigma) bestimmt. Die spezifische Aktivität wurde als Einheiten/mg Protein berechnet.
Die Aktivität von rMETase wurde verglichen, und die Ergebnisse zeigten keinen großen Unterschied zwischen verschiedenen Formulierungen.
Beispiel 15
Chemische Modifikation von rekombinanter Methioninase
Die gereinigte rMETase wurde in einem 0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) bei einer Konzentration zwischen 0,1 M und 0,2 M formuliert. Die Aktivität betrug ca. 20 Einheiten/mg.
M-SC 5000 PEG, Molekulargewicht 5000 (Methoxy-SC-PEG, MG 5000 von Shearwater Polymers Inc.), wurde in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,3) bei einer Konzentration zwischen 2 mM und 20 mM aufgelöst. Die Molverhältnisse von M-SC 5000 PEG zu rMETase wurden von 10:1 bis 120:1 variiert.
Die PEGylierungsreaktionen wurden in Reaktionspuffer (25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,3), 60 Minuten bei 20°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit Stopppuffer (0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5) bei 0°C gestoppt. Nicht zur Reaktion gebrachtes M-SC 5000 PEG wurde dann mit 30k Amicon Centriprep Concentrators entfernt. Die resultierende PEG-Methioninase wurde in 0,15 M Natriumchlorid und 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2) während des Zentrifugierens mit 30k Amicon Centriprep Concentrators formuliert.
Analyse von PEG – rMETase in vitro
PEG-rMETase wurde anhand des Aktivitätsassays, der Elektrophorese und der HPLC analysiert, 14–16.
Aktivitätsassay
Die Aktivität von PEG-rMETase lag zwischen 80% und 20% bezogen auf die nicht modifizierte rMETase.
Elektrophorese
PEG-rMETase wurde auf native wie auch SDS-PAGE aufgebracht.
HPLC-Analyse:
PEG-rMETase wurde auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht; es wurde kein rMETase-Peak am Ausgangspunkt nachgewiesen, nur der PEG-METase-Peak beobachtet. Die Retentionszeit (RT) wurde zusammen mit den Molverhältnissen von PEG und rMETase, die zunahmen, kürzer.
Pharmakokinetik von PEG-rMETase:
Gereinigte Endotoxin-freie PEG-rMETase wurde in die Schwanzvene von Mäusen injiziert. Die Blutproben wurden alle zwei Stunden gesammelt. Die rMETase-Spiegel wurden anhand des Aktivitätsassays gemessen (16).
Beispiel 16
Wirksamkeit und Toxizität von rekombinanter Methioninase
Wachstumsinhibition von Zellen durch rMETase in vitro
KB3-1-Zellen (humanes Plattenepithelkarzinom) wurde in RPMI 1640-Medium, supplementiert mit 10% FBS, gezüchtet. Verschiedene Konzentrationen von rMETase wurden dem Medium zugefügt und bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert. Die relative Zellzahl wurde bei OD₅₇₀ gemessen. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass rMETase wirksam das Zellwachstum inhibierte (17).
Wachstumsinhibition von H460 und HT29 durch rMETase in vitro
Humane Lungenkrebszellen H460 und humane Kolonkrebszellen HT29 wurden 4 Tage mit verschiedenen rMETase-Konzentrationen (0–4 Einheiten/ml) gezüchtet, dann wurden die Lebendzellen gezählt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass rMETase sowohl das H460- als auch das HT20-Zellwachstum wirksam inhibierte (25).
Vergleiche der Empfindlichkeiten für rMETase zwischen normalen Zellen und humanen Krebszellen in vitro
Normale humane Vorhaut-Fibroblasten HS-68 und humane Keratinozyten wurden als Kontrollen verwendet und mit humanen Kolonkrebszellen SW-620 und humanen Lungenkrebszellen H322m verglichen. Die Zellen wurden mit verschiedenen rMETase-Konzentrationen (0–4 Einheiten/ml) drei Tage gezüchtet, und dann wurden die Lebendzellen gezählt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl SW-620 als auch H322m-Zellen beider rMETase-Konzentration von 1 Einheit/ml tot waren, die normalen humanen HS-68-Zellen noch am Leben waren, obwohl die Wachstumsrate reduziert war. Die normalen humanen Keratinozyten waren im Vergleich zu Krebszellen auch viel weniger empfindlich für rMETase (26).
Wachstumsinhibition von Zellen durch rMETase in nackten Mäusen 2 × 10⁵ Zellen wurden in Balb/c nu/nu, weibliche Mäuse, in Gruppen zu acht, injiziert. Kontrolle: normale Kochsalzlösung. Gruppe I: rMETase 30 Einheiten, Gruppe II: rMETase 100 Einheiten; i.p., zweimal täglich, von Tag 5 bis Tag 14. Die Tumorgröße und das Körpergewicht wurden gemessen. Das Blut wurde am Tag 18 gesammelt. Die Ergebnisse wiesen nach, dass rMETase das Tumorwachstum ohne Verlust von Körpergewicht und ohne jedwede Wirkung auf die Blutzellproduktion wirksam inhibierte (18–22).
Wachstumsinhibition von H460- und HT29-Zellen durch rMETase in nackten Mäusen
10⁶ H460-Zellen bzw. HT29-Zellen wurden s.c. transplantiert, 40 Einheiten oder 100 Einheiten rMETase wurden von Tag 2 bis Tag 16 zweimal täglich mittels einer i.p.-Injektion gegeben. Die Kontrollgruppe bekam zweimal täglich eine i.p.-Injektion mit 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Die Mäuse wurden am Tag 16 getötet. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass rMETase das Tumorwachstum ohne Körpergewichtsverlust und ohne Wirkung auf die Blutzellproduktion wirksam inhibierte.
Klinische Pilotstudie der Phase I mit gereinigter, rekombinanter METase
Patientin 1, weiblich, 50 Jahre alt, mit einem Mammakarzinom (Stage IV) mit Lymphknotenmetastasen, erhielt 10 000 Einheiten (0,5 g) rMETase als iv-Infusion über 10 Stunden.
Patientin 2, 48 Jahre alt, weiblich, mit einem Mammakarzinom (Stage IV) mit Lymphknotenmetastasen, erhielt 5 000 Einheiten (0,25 g) rMETase als Infusion über 24 Stunden.
Patientin 3, 56 Jahre alt, weiblich, mit Nierenkarzinom (Stage III) über 24 Stunden, erhielt 10 000 Einheiten (0,5 g) rMETase als i.v.-Infusion. Tabelle 14.
Die körperlichen Untersuchungen wurden aufgezeichnet, und die Blutproben wurden vor der Behandlung, während der Behandlung alle zwei Stunden und bis zu 48 Stunden (wie angezeigt) nach Beendigung der Infusion entnommen. Die Laborbestimmungen wurden gemäß den WHO-Kriterien durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die rMETase-Spiegel sofort nach Beginn der Infusion verbessert waren und der hohe Spiegel während der Infusion bei allen Patientinnen aufrechterhalten wurde. In einer Patientin fiel der Methioninase-Spiegel nach 48 Stunden wieder zur Baseline ab. Die Ergebnisse zeigten, dass der rMETase-Spiegel sofort nach Beginn der Infusion verbessert war und den höchsten Punkt nach 10 Stunden erreichte. Acht Stunden nachdem die Infusion gestoppt wurde lag der Spiegel bei 50% bezogen auf den Peak und wurde noch 16 Stunden nach Infusionsende bei 20% bezogen auf den Peak aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Laboruntersuchungen wurden gemäß den WHO-Kriterien bewertet und zeigten, dass bei Patientinnen-1, -2 oder -3 keine akute Toxizität vorlag (Tabellen 15 und 23 und 24). Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass rMETase keine Toxizität hervorrief.

Claims

Modifizierte Methioninase umfassend an Polyethylenglykol konjugierte Methioninase, worin genannte modifizierte Methioninase die hohe Methionin-Depletionsaktivität von nicht modifizierter Methioninase aufrechterhält.
Modifizierte Methioninase nach Anspruch 1, worin die Methioninase im Wesentlichen frei von Endotoxin ist und rekombinant hergestellt wurde.
Therapeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der modifizierten Methioninase nach Anspruch 1 oder 2.
Verwendung einer modifizierten Methioninase nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie.
Verwendung nach Anspruch 4, worin genanntes Arzneimittel zur Behandlung eines Tumors oder einer kardiovaskulären Erkrankung bestimmt ist.
Verwendung einer modifizierten Methioninase nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei der Tumordiagnose.
Rekombinante Wirtszellen, die einen hohen Anteil des Expressionsmoduls codierend Methioninase enthalten, wobei genannter Modul eine Nukleotidsequenz codierend Methioninase, die funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, umfasst, worin genannte Promotorsequenz die Expression von Methioninase in genannte Wirtszellen dergestalt richtet, dass die Expression von Methioninase von 5–75% des von genannten Wirtszellen produzierten Gesamtproteins beträgt.
Zellen nach Anspruch 7, worin genannte Methioninase-codierende Nukleotidsequenz aus einem Organismus isoliert wird, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Nippostrongylus brasiliensis und Fusobacterium sp.
Zellen nach Anspruch 7 oder 8, die Bakterienzellen darstellen und worin genannter Promotor der T7-RNA-Polymerase-Promotor ist.
Zellen nach Anspruch 8 oder 9, die Zellen von E. coli darstellen.
Zellen nach Anspruch 10, die Zellen von E. coli BL21 (DE3) darstellen.
Zellen nach Anspruch 7 oder 8, die Immunzellen darstellen.
Zellen nach Anspruch 12, worin der Promotor einen Tumor-spezifischen Promotor darstellt.
Verfahren zur Bildung hoher Methioninase-Spiegel, welches Verfahren das Kultivieren der Zellen nach einem der Ansprüche 8 bis 13 und optional die Wiedergewinnung von Methioninase aus genannter Kultur umfasst.
Verfahren zur Identifikation von Zellen, die hohe Methioninase-Spiegel exprimieren, wobei genanntes Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren genannter Wirtszellen unter Bedingungen, worin Methioninase exprimiert wird und Identifizieren von Wirtszellen, die rosafarbig sind, als Bildner hoher Methioninase-Spiegel.
Verfahren nach Anspruch 15, worin genannte Zellen auf einem Festmedium kultiviert werden.
Verfahren zur Reinigung von Methioninase, wobei genanntes Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren der Zellen nach einem der Ansprüche 7 bis 13 unter Bedingungen, worin Methioninase exprimiert wird; (b) Erhitzen eines Extrakts aus einer transformierten Zelle, die Methioninase in wässrigen Puffern enthält, von 40–60°C für 1–10 min; (c) Zentrifugieren des erhitzten Extrakts von 10k bis 20k U/min [in einem GS-3-Rotor (Sorval DuPont)] für 15 min bis 1 Stunde; (d) Aussetzen des Überstandes der Ultrafiltration unter Verwendung einer Porengröße von 50k bis 100k; (e) Aussetzen des Überstandes der DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl einer niedrigen Ionenstärke (von 10–50 mM) bei pH 7,0–7,6 und Sammeln der Fraktionen enthaltend Methioninase, die mit einem KCl-Gradienten von 40–200 mM eluiert werden; (f) Aussetzen der Fraktionen einer zweiten DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in KCl einer mittleren Ionenstärke (100–200 mM) bei pH 8,0–8,6 und Sammeln der Fraktionen enthaltend Methioninase, die in Phosphat-gepufferter KCl von 0,1 bis 0,2 M KCl eluiert werden; (g) Kontaktieren genannter Fraktionen, die in Schritt (e) mit einem zum Absorbieren von Endotoxin fähigen Chromatographie-Medium gesammelt werden; und (h) Sammeln des Methioninase enthaltenden Eluenten.