JPS5946928B2 - 糖尿病治療及び予防薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、百日咳■相菌又は■相菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｐｈａｓｅ Ｉ ｏｒ ＩＩ
） に属するインシュリン分泌増強活性成分生産能
を有する微生物の培養生成物から得られるインシュリン
分泌増強活性画分を有効成分として含有する糖尿病治療
及び予防薬に関する。

更に、本発明者は、上記インシュリン分泌増強活性画分
中、特定菌株即わち百日咳■相菌東浜株の培養液から得
られる画分につき、その精製を一層推進することにより
、インシュリン分泌増強活性画分を得ることができ、更
にその１例として新規な蛋白性物質（本発明者はこの分
質を”ＹＨ７５１２”と命名した。

）インシュリン分泌増強活性因子として単離同定するこ
とに成功したものである。

従って、本発明はインシュリン分泌増強活性画分又、イ
ンシュリン分泌増強活性因子である新規な蛋白性物質Ｙ
Ｈ７５１２に係る。

蛋白質様物質から成るインシュリン分泌増強活性画分（
以下、単に活性画分と略称する。

）は、哺乳動物のインシュリン分泌を促進し且つ血糖値
を正常値に維持調整すると言う驚ろ（べき薬理作用を有
し、従って各種糖尿病の治療及び予防薬として極めて有
用であることが判明した。

本発明の活性画分は、病原菌として公知の百日咳■相菌
又は■相菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
ｐｈａｓｅＩｏｒｌＩ）に属する微生物を培養し、培
養物、特に培養液からインシュリン分泌増強活性成分を
採取することにより得られる。

培養物からの活性成分の有オリな採取及び精製は活性因
子の１種として単離同定されたＹＨ７５１２の製法に準
じて実施されるが、より一般的には、カラムクロマトグ
ラフ、透析、電気泳動法、ゲルろ適法、イオン交換樹脂
法、沈澱−再溶解抽出、溶剤抽出、或いはこれらの手段
の組合せなど、当該分野で汎用の多（の分別精製方法に
より達成され得、従って本発明は特定の採取精製方法に
何等限定されるものではない。

Ｉ相菌培養精液から培地成分のみを除いて回収される蛋
白質様の産生物から成る粗製画分自体、何等の精製手段
を更に施こすことなしに０．２（Ｕｎｉｔｓ／μｇ）程
度の高い比活性を有し、その１７ｑで後記する糖尿病薬
として所要の力価である５０単位程度は充分に保障し得
るので医薬として使用可能である。

活性画分の極めて有利な採取精製方法の１例として、カ
ラムクロマトグラフ的手段を掲示し得る。

この場合、微生物の培養上精液は、・・イドロキシアバ
タイト（生化学工業（株）製）、カルボキシメチルセフ
ァロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・ケミカルズ社製）
、コンＡ−セファロース−４Ｂ（同社製）などの充填材
より成るカラムを通される。

活性成分はこれらのカラムに極めて選択的に吸Ｎされ、
次いで０．５ＭＮａＣ１含有の０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ７，０）等の適切に選定された溶出液により溶離さ
れて活性画分を与える。

この両分に透析操作を極宜施こすことにより、不要な塩
類が除去されて高活性の医薬調整用画分が得られる。

又、活性成分は菌体内にも存在するので、所望の場合に
は、例えば菌体浮遊液にＮ ａ Ｃｌを添加して菌体内
活性成分を溶液中に浸出せしめる手段などを採用しても
よい。

当該分野で汎用されている所謂硫安沈澱法も又、本発明
活性画分の製造方法として使用し得る。

この場合、微生物培養上清液に固体（ＮＨ４）２ＳＯ４
を飽和溶解度近傍まで添加し、希アンモニア水でＰＨを
６〜７に調整する。

次いで、沈澱物を水洗後、０．１ＭＴｒｉｓ−０，５Ｍ
ＮａＣＡ緩衝液（ＰＨ８）により活性成分は溶解抽出さ
れて活性画分を与える。

完全な病原菌と非病原菌（百日咳■相菌）との中間に分
類される百日咳■相菌も又活性成分を産生ずるものであ
ることは前記の通りであるが、収率は■相菌よりも高く
はな（一般に不安定である。

尚、百日咳■相菌又は■相面の菌学的性質、培養条件等
は、 Ｂｅｒｇｙ’ ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
１ｎａｔｉｖｅＢ ａｃｔｅｒｉ ｏｌ ｏｇｙ 第８版１９７４年Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｔｈｅ ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ＆ ｗｉｌｌｋｎｓ ＣＯ。

Ｊ 、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、１２９ ： ５２３〜５５０
（１９６９）、細菌学実習提要：第３版第６頁以下、
昭和４７年（丸善（株）発行）、等に記載されている。

こうして得られる本発明の活性画分は、糖尿病の治療及
び予防薬として極めて有用であり、人体に対する有効量
は総力価（後記測定方法参照）が３０年位程度以上とな
るように規定され、通常、活性画分の比活性（蛋白質量
として）に応じて固形物として約１０ ｎ ｆ／Ｋｙ
（体重）〜数１０μグ／〜（体重）の範囲である。

廚者に対する投与方法は、静脈内投与が最も有効であり
、その地腹腔内、筋肉内及び皮下投与、或いは消化管内
への直接投与、経口投与、直腸内投与及び舌下、皮肉、
鼻粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効である。

投与形態としては、注射液、坐剤、腸溶剤、舌下錠及び
吸入剤等を例示し得る。

注射液の最も単純な組成を例示すれば、活性画分１μＶ
〜数■（蛋白質として）、ＮａＣｔ９ｍｆＩ及び滅菌蒸
留水で１−としたものをあげ得る。

尚、本明細書に於いて１活性画分１１とは、活性成分含
有液体及びこれを凍結乾燥処理等で乾燥して得られる活
性成分含有固体の両者を意味するものとする。

例えば、注射薬液は両者のいずれを出発材料としても得
られることは自明であろう。

又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめることのな
い任意の他成分を混合し得ることも当業者にとり自明で
あろう。

インシュリン分泌増強活性成分の１例としての本発明の
蛋白性物質ＹＨ７５１２は、下記の組成及び性質を有す
る。

存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解性白色粉
末であり、４ｍｇ／ｍｇ程度までは室温で水に易溶、Ｇ
ＮＨＣｔ中で不溶性白濁を生じ、ピリジン、ドテシル硫
酸ナトリウム、メルカプトエタノール、システィン溶液
に易溶。

冷時（４℃）、ＹＨ７５１２の溶液に硫安、ドライアイ
ス・アセトンあるいはエタノール、トリクロロ酢酸の添
加により、各々白濁、沈澱を生ずる。

水とクロロホルムあるいはｎ〜ブタノーノ４合液におい
て、ＹＨ７５１２はこれら両液の界面に集まる。

ＹＨ７５１２の水溶液を８０℃以上に加温すると白濁す
る。

０．５Ｍ ＮａＣ１含有０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）にＹＨ７５１２を溶解し、次いで蒸留水を外
液として透析すると、一時白濁するが透析の続行により
完全に再溶解し、白濁は消失する。

分子量： ０．５Ｍ ＮａＣｔを含有する０、１Ｍリン酸緩衝１（
ｐｆ（７，０）で平衡化させたバイオ−ゲルＰ−１００
（Ｂ ＩＯ、ＲＡＤ社製）カラムＣ２，８Ｘ８０ｃｍ
）を用いたゲルろ適法による分子量は、７７．０００±
６，４００である。

組成： Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９５重量％以上、フェノール
硫酸法による糖質約１重量係であり、且つ蛋白質成分の
アミノ酸組成及び組成比（μＭ／／１００μＭ）は、ア
スパラギン酸（Ａｓ ｐ ） ７．５ 、スレオニン（
Ｔｈ ｒ ） ７．３、セリン（Ｓｅｒ）６．４、グル
タミン酸（Ｇｌｕ）１０．０、プロリン（Ｐｒｏ）５．
ｓ、グリシ７ （Ｑ ｌ ｙ ） ８．８、アラニン（
Ａｌ ａ ） ９．３．１／２シスチン（Ｃｙ ｓ／２
） ２．５、バリン（Ｖａｌ）６．５、メチオニンＣ
Ｍｅ ｔ ） ２．８、イソロイシン（Ｉｌｅｕ）４．
０、ロイシン（Ｌｅｕ）７．８、チロシン（Ｔｙｒ）６
．５、フエ＝７ｔｚアラニジ（Ｐｈｅ）３．７、リジン
（Ｌｙ ｓ ） ３．３、ヒスチジン（Ｈｉ ｓ ）
１．５及びアルギニン（Ａｒｇ）６．４であり、脂質は
検出限界値以下である。

等電点ｐＨ二 ８．４±０．５ ディスク電気泳動パターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度７．５％
、ＩＮＫＯＨ−氷酢酸緩衝液ＣＰＨ４，３））、試料３
０μ？、通電４ｍＡｓ ２時間／ゲル１本、アミドブラ
ックＩＯＢによる染料、７％ｍ酸溶液による脱色の条件
下でのディスク電気泳動において、距離（スペーサ・ゲ
ル先端を基準として）２．２２１±０．０６１ｃｍの位
置に極めて先鋭な単一のバンドを与える。

生物学的性質： 咄浮動物に対しインシュリン分泌増強作用及び耐糖能良
化作用を有し、これらの作用は１回の投与で数週間乃至
数ケ月にわたって持続する。

急性毒性（ＬＤ５０）はａａｙ系マウス（静注）で約２
００μ？／Ｋｙ体重である。

実施例Ｉ：ＹＨ７５１２の製造及び精製 百日咳■相菌東浜株（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
−ｔｕｓｓｉｓ ｐｈａｓｅ Ｉ＋Ｔｏｈａｍａ ５ｔ
ｒａｉｎ）の凍結乾燥保存菌株（北里大学薬学部微生物
学教室提供）をＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ平板培地で
３７℃、２日間培養後、下記第１表に組成を示すイオン
交換樹脂扉Ｃｏｈｅｎ−Ｗｈｅｅ ｌｅｒの変法培地（
ＣＷ培地）２００ｒ１１１を分注した５００ｍ１の振盪
コルベンに１白金耳接裡し、３７℃、２０〜２２時間振
盪培養した。

この培養液の菌量な、分光光度計（波長６５０ ｎｍ
）で測定し、加えた時の菌量が最終濃度約０．１×１０
９個／ｒｎｌとなるように、イオン交換樹脂加ＣＷ培地
１４を分注した２ｔの振盪コンベルに加え、３７℃、４
８時間振盪培養（振盪回数９７回／分）を行なった。

尚、上記菌株の菌学的性質は、先にあげた百日咳■相菌
に関する文献の記載と一致した。

第１表 Ｃｏｈｅｎ−Ｗｈｅｅｌ ｅ ｒの変法培地組成カザミ
ノ酸 １０グ 酵母エキス １１ リン酸二水素カリウム ０．５ ｒ可溶性澱粉
２グ ０．５係饋酸銅液 １ｍｅ １％塩化カルシウム液 １ｍ１ ４％塩化マグネシウム １ゴ ポリベプトン ５ｔ １％シスチン液 ２．５ｍ１０．５％硫
酸鉄液 １ｍ 塩化ナトリウム ２．５１ （蒸留水を加えて総量１０００ｉｌし、２０％ＮａＯＨ
水溶液でｐＨ７，２に調整後、陰イオン交換樹脂（ダイ
ヤイオン５Ａ−２０ＡＰ；三菱化成（株）製）３ｖを加
え、１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌して使用に供し
た。

）得られた４８時間振盪培養液を、５６℃で３０分間加
温した後、４℃で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）して
培養上滑液と菌体とに分離した。

得られた培養上清液を本発明物質ＹＨ７５１２の精製単
離のための出発材料とした。

１０ｔの培養上清液をＩＮ塩酸でｐＨ６，０に調整後、
第１精製工程としてハイドロキシアパタイトカラム（２
，５Ｘ ４Ｃｒｒｌ）に流速２００ｍｌ！／時間で流し
た。

大部分の蛋白質は吸着されずそのままカラムを通過し、
目的とするインシュリン分泌増強活性（後記活性測足法
参照）も殆んど検知されなかった。

尚、蛋白質濃度の測定は後記第２表註記のＬｏｗｒｙの
方法による。

その後、吸着された物質についてはまず０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）でカラムを洗い、次いでリン酸
緩衝液のモル濃度を０．１にｐＨを７．０に夫々上げて
吸着された蛋白質を順次溶出する。

しかし目的の活性画分はよだこの条件では溶出されず：
更に同じ条件のリン酸緩衝液に０．５ＭのＮａＣｔを含
む同組成のリン酸緩衝液で溶出した。

この条件で浴出された蛋白質に一致して目的活性画分を
効率よく回収することができた（第１図）（得られた活
性画分を濃縮し、ついで透過分子量限界ｓ 、ｏ ｏ
ｏの透析膜（’ｌ’ｈｏｍａｓ社製のＣａｔ Ｎｏ 。

３７８７−Ｆ２５）に入れた後蒸留水に対して２回（計
１２時間）０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対
して２回（計１２時間）夫々透析した。

更に精製を進める為に、上記透析後の活性部分を含む浴
液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化さ
イシたカルボキシメチルセファロースＣＬ−６Ｅカラム
（１，５ｘ １０ｃｍ ）に通した。

このカラムに吸着されない物質には全く活性は存在しな
かったが、次いでリン酸緩衝液のモル濃度を０．１にｐ
Ｈを７．０に上げ、更に食塩０．５Ｍを加えて溶出され
た蛋白質に一致した活性画分が得られた（２）２図）。

この部分は）ディスク電気泳動法的には未だわずかな不
純物乞営むため、この活性画分を濃縮しついで透析膜（
上記と同規格）に入れた後、蒸留水に対して２回（酢１
２時間）、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で２
回（計１２時間）、透析した。

透併後の試料を０．０１ Ｍ ！ｊン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で平衡化したコンＡ−セファロース４Ｂカラム（
１，５Ｘ ８ｃ７ｎ）に通した。

先ず同一緩衝液で展開すると微少量の蛋白質が溶出され
るがこの部分に活性はな（、次いで０．５ＭＮａ（、：
ｔを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７−０）で溶出さ
れる蛋白質部分に一致した活性画分が得られた（第３図
）。

この部分は、ディスク電気泳動法的に極微量の不純物を
含むため、この部分を集めて濃縮後、０．５ＭＮａＣ１
を含む０．０１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対し
て透析し、透析後の試料を同一緩衝液で平衡化されたパ
イオーゲルｐ−１００ＣＢＩＯ，ＲＡＤ社製）カラム（
２，８Ｘ６０ｃｒｒｌ）によってゲルろ過を行なった。

その結果、分子量ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏ前後の位置にピー
クを示す蛋白質成分と一致して純粋な活性画分が得られ
た（第４図）。

以上の精製工程による活性の回収率、精製度等は第２表
に示す通りである。

尚、ゲル１本当りの試料は３０μＶ（蛋白質として）、
通電は４ｍＡで２時間、染色はアミド。

ブラック１０Ｂ１脱色は７％酢酸溶液による。

得られた結果を第５図（ゲル状態図及びデンシトメータ
による泳動図）に示す。

この結果、最終工程による試料は不純物を全く含まない
単一物質であり且つ後記実施例■で定義のインシュリン
分泌増強活性は単離されたこの物質に一致することが確
認された。

ＹＨ７５１２のサブユニット構成を見るため、Ａ 、
Ｌ 、 ５ｈａｐｉｌｏの方法（Ａ 、Ｌ 、５ｈａｐ
ｉｌ。

ｅｔ ａｌ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ 、ｃｏｍｍ 、 １９６７ 。

２８８１５） により、ＳＤＳ （ドデシル酸硫酸ナ
トリウム）電気泳動法を次の通り実施した。

１％ＳＤ８．１％メルカプトエタノール、４Ｍ尿素にＹ
Ｈ７５１２サンプル５０μグ／チューブ（蛋白質として
）を加え３７℃、２時間インキュベートした後、この混
合物を１％ＳＤＳを含む１０チポリアクリルアミドゲル
にアプライし、８ｍＡ、４時間／ゲル１本当り、通電し
、コムジー（Ｃｏｏｍｓｉｅ）ブルーで染色、７．５係
酢酸で脱色。

得られた結果を第６図（ゲル状態及びデンシトメータに
よる泳動図）に示す。

実施例ＩＩ：ＹＨ７５１２の薬理効果 −１活性測定法 ＹＨ７５１２（又は活性画分）の活性は棟々のインシュ
リン分泌刺激物質に対する動物の反応性で測定出来るが
、通常はグルコースを刺激物質として用いる。

０検定用使用動物 ウィスター系雄性ラット（体重１３０〜１４０１） ０試験力法 各力価の粗精製あるいは精製標品を生理食塩水に溶解し
、七〇〇−２ｍ１．をエーテル麻酔下で股静脈内に注入
し、３日後にインシュリン分泌増強活性を測定する。

なお実験開始前１８〜２０時間絶食させる。

創建方法は、ラット尾静脈より０．ＩＴｌｅの血液を採
取後、直ちに３０％グルコース溶液を体重１００１当り
１ｍ腹腔内に投与し、正確に１５分後、０．１ｍｅの血
液を再び採取する。

インシュリン分泌増強活性は、グルコース投与前、後の
血糖値および血中インシュリン値の差より求める。

血糖値はグルコースオキシダーゼ法、インシュリンは二
抗体法にて測定する。

尚、以下の薬理試験で使用の静注液も上記と同組成より
成る。

血糖値及びインシュリンの測定法法は夫々下記文献及び
キットによる。

血糖値ニゲルコースオキシダーゼ法 Ｂ ｅｒｇｍｅｙｅｒ Ｊ（、−Ｕ 、 ｔ ａｎｄ
Ｂｅｒｎｅｔ 、Ｅ ｏｉｎｌｌＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ”Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ 、Ｈ，刊、ｅ ｄ ｓ 、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋＡｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ Ｐ １２３ （１９
６３）グルコスタット インシュリン二二抗体法 Ｍｏｒｇａｎ−ＣｏＲ、、ａｎｄ Ｒａｚａｒｏｗ Ａ
、Ｉ） １ａｂｅｔｅｓ−叱 １１５（１９６８） インシュリンリアキット−ダイナボット社製インシュリ
ン分泌増強活性の計算力法 まず以下の式に従って活性物質投与群及び対照群ラット
の△Ｉ／△Ｇ値を求める。

△■／△Ｇ（μＵ／ｍｆｊ） 尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌されるインシ
ュリン量が血糖値によって太き（影響されるためである
。

次に活性物質の力価は 単位（Ｕｎｉｔ）＝重物質投与群ラットの平均△■／△
Ｇ一対照群の平均△■／△Ｇ で求める。

本物質の比活性は力価単位を、蛋白質量 （Ｌｏｗｒｙの方法）で除したものとする。

０用量−反応関係 ＹＨ７５１２精製標品の力価と投与量（蛋白質量として
）との関係を第３表に示す。

※各５例の平均値 ＹＨ７５１２精製標品はシグモイド様の用量反応関係を
示すが、ＹＨ７５１２又は活性画分精製標品の力価及び
精製工程での計算では、出来るだけ直線部分（２５Ｏｎ
１〜１０００ｎグ）をえらんだ。

一２ＹＨ７５１２の薬理効果の要約 本物質はインシュリン分泌増強活性を主作用とし、その
他に耐糖能の良化作用、インシュリン分泌活性、ストレ
プトシトシン誘起糖尿病の治癒を促進する作用、更に遺
伝性糖尿病の耐糖能を改善するなど、薬理的に有能な効
果がみしれる。

更にこれらの作用は本物質の１回きりの投与で、いずれ
も数週間から数ケ月にわたって持続する。

これらの活性はマウス・ラット及び犬において詳細に検
討されるが、各種共に全（同様の現象が観察されること
から本物質の薬理作用には独走は影響しないと考えられ
る。

本物質は主に糖尿病治療薬として有用と考えられるが、
現在糖尿病に対する薬物療法は、インシュリン注射ある
いは血糖降下薬の経口投与のみでいずれも対症療法にす
ぎず、殆んど不治の病と言ってさしつかえない。

しかもインシュリン注射のために毎日通院しなげればな
らない繁雑さがあり血糖降下薬の投与では血糖値の異常
低下の発現が常に危険視されている。

本物質の特徴は、これ自身インシュリン分泌活性を有す
るのみならず血糖値をいろいろな条件で高めた時（高血
糖状態、特に摂食時に類するグルコース負荷時）にのみ
血中インシュリンを増加させて血糖値をすみやかに正常
に戻す作用があり、更に、この物質の利点としては、１
回投与で数週間から数ケ月にわたって活性が持続するこ
とである。

従って血糖値に対するインシュリン分泌の反応が低下し
た様な場合には、この物質投与によりインシュリン分泌
が再賦活化される。

以上の点より、本物質は糖尿病、糖尿病の合併症及び糖
尿病が起因となる様々な成人病の治療薬としてばかりで
な（、前糖尿病状態への適用や、現在全く治療法がなく
悲惨な状態にある若年型糖尿病の予防及び治療薬ならび
に診断薬として有用である。

−３インシユリン分泌増強活性 この作用は本物質の主たる作用の１つであるが、ラット
（ウスイタ−系雄性）、イヌ（ピーグル犬、雄雌）につ
いて実；検を行なった。

ラット 実験条件は活性測定法の項と同様であるが本物質投与３
日目に各インシュリン分泌刺激物質に対する反応性を正
常群と比較した（第４表）。

最も生理的な因子であるグルコース投与では、グルコー
スの投与経路の違いにもかかわらず、対照群に比し顕著
な血中インシュリン濃度の増加がめられた。

またグルカゴン（１〜／にり）、エピネフリン（２００
μｆ／に９）などのホルモン刺激に対ｊる反応性も著明
に増加していた。

更に現在臨床で使用されている血糖降下薬であるトルブ
タミド（２００〜／に７）、グリベンクラミド（２ＴＩ
ＪＩ／Ｋｑ）のインシュリン分泌活性の増強も入られた
。

以上の知見から、本物質投与はインシュリン分泌刺激物
質に対する生体の反応性を著しく増強することが確認さ
れた。

犬 犬に各力価の本物質を静脈内に投与し、３日後にグルカ
ゴン（２５μ？ ／に９体重、静注）あるいはグルコー
ス（０，３ｆ／Ｋｇ体重、静注）刺激を行いインシュリ
ン分泌増強活性を調べた。

実験開始前１８時間絶食した。

グルカゴン刺激時の実験結果を第５表に示した１５ｏｎ
ｆ（蛋白質として、以下同様）／Ｋｇ（体重）で弱いな
がらグルカゴン投与５分後にインシュリ・ン分泌の増強
が対照群と比較してみもれ、投与量の増加と共にインシ
ュリン分泌の増強がみもれ、１μｆ／Ｋｙでほぼ反応は
最高に達した。

以上の結果以外にも、グルコース（経口投与、静脈内投
与）及びエピ坏フリンによっても同様にインシュリン分
泌作用の増強がみられた（第６表）ことから、犬におい
てもインシュリン分泌刺激物質に対する反応性が本物質
の投与により著しく高まっていると考えられる。

一４グロコース負荷後の耐糖能良化作用 ラット、犬において経口的にグルコースを負荷し、負荷
後の血糖値の減衰と血中インシュリン値の増加を測定し
耐糖能を判定した。

１８〜２０時間絶食後にグルコースをラットでは０．５
Ｐ／１００ｙ体重、イヌでは１５１／犬投与した。

ラット、イヌで本物質処置群では対照群に比較し、血中
グルコースの上昇は著明に抑制される一方、血中インシ
ュリン値は明らかな増加をみせ、その後血糖値の正常化
と一致してインシュリン値ハクルコース負荷前の値にす
みやかに戻り、インシュリンの過剰分泌による低血糖の
発現は入られなかった（第７乃至第８表）。

従って、本物質処置動物では、耐糖能が著しく良化して
いることが示された。

５一本物質前処置によるストレプトシトシン誘発糖尿病
の治癒 ストレプトシトシン（以下５ＴＺ）投与はスイ臓ランゲ
ルハンス島β細胞を特異的に破壊することにより実験動
物に糖尿病を誘起することが知られているが、本物質前
処置しておいたラットではＳＴＺによって引き起こされ
た糖尿病状態をすみやかに治癒させ、非絶食時血糖及び
耐糖能を正常化することが見い出された。

実験方法は本物質を１μ？ラツトに投与し、３〜５日後
ＳＴＺ （５ｍｌ１／１００ ｆ静注）を投与スる。

ＳＴＺ投与２４時間後対照群及び本物質処理群共に高血
糖を発症するが、その後処理群では５日目、７日目と血
糖値が正常域に近づき血中インシュリン量も対照群に比
し有意に高い（第９表）。

更にＳＴＺ投与７日目日目ルコース負荷試験を行い、耐
糖能についても検討した（第１０表）。

これらのラットを絶食すると血糖値はみかげ上対照群（
ＳＴＺのみ投与）、本物質処置群共に同じになるが、対
照群では明らかに正常群に比較して耐糖能の劣化が認め
られる。

一方処置群ではほぼ正常群に匹敵するまでに耐糖能が改
善されている又血中インシュリンも対照群に比ベグルコ
ースに反応し有意に高い。

以上の結果から本物質前処置ではＳＴＺによる糖尿病を
治癒すると考えられる。

−６ヒト類似自然発症糖尿病マウスＣＫＫ系）における
本物質投与による耐糖能の改善 ＫＫ系マウスは遺伝的及び環境的因子を背景として加令
と共に糖尿病を自然発症することから、ヒト糖尿病に類
似のモデル病態動物と考えられている。

従って本物質の治療効果がこの動物に及ぶか否かは、動
物実験における結果をヒトで類推する上で大きな指標と
なると思われ、以下の実験を行った。

ＫＫ系マウスは名古屋大学農学部家畜育種学教室より提
供され、以後兄弟交配及び飼育を続げたものについて行
った。

実験方法は、生後２０〜２５週令のマウス（体重約４０
１）で、経口法によるグルコース負荷（０，１５グ／体
Ｎ２０１？）を行い、明らかに正常群ＣｄｄＹ系）に比
較して耐糖能の劣化が認められる５例をまず選抜した。

第１１表に示すごと（これらのマウスはグルコース負荷
後、クルコースの消失は殆んど見られず明らかに糖尿病
状態にあると考えられる。

これらのＫＫ系群に本物質を０．１μＶ尾静注後３日目
に再びグルコース負荷を行った。

その結果耐糖能は本物質投与前に比較し著しく亢進して
いた。

更に正常群よりもはるかに良化さえ示している。

従って本物質投与は自然発症糖尿病に充分の治療効果を
発現すると考えられる。

−７薬理活性の作用持続性 本物質の各薬理活性は本物質投与数時間後から発現し３
〜７日目に最高に達しその後除々に各活性は低下するが
ラット（０゜５μｍ）、イヌ（１，０μ？ ／Ｋｇ）を
用いての作用の持続性の実験結果について述べる。

イヌでは本物質投与１５日目に静注法によるグルコース
負荷での耐糖能、２９日目、４２日目に夫々エピネフリ
ン、グルカゴン刺激時のインシュリン分泌増強活性を調
べた。

その結果４２日目においてもなお充分な増強活性が示さ
れた（第１２表）。

ラットにおいても本物質投与２８日目においてもなおも
最高時の活性（投与３日後）の約５０％を発現した。

以上の結果から用量の関係でその作用の強弱はあるが、
作用は数週間から数ケ月持続すると考えられる。

−８有効量、投与形態 ＹＨ７５１２０人間に対する有効量は、精製標品の場合
、１０ ｎ ｆ／に−９（体重） 〜１ ｔｔｆｔＡｑ
Ｃ体重）程度であるが、２μｆＩ／Ｋｔｉ （体重）
以上の一時的な大量投与も可能である。

最も有効な投与方法は、静脈内投与であるが、その他の
投与方法でもよい。

一９活性の安定性 熱安定性 実験方法 試料溶液（４０μ？蛋白質Δ砿ＰＨ７゜０）
を３７℃から１００℃まで１５分間熱処理を行い・１ン
シュリン分泌増強活性の変化を調べた。

対照としては４℃保保存品を用い、活性の表示は４℃標
品を１００とした相対活性で示した。

本物質の熱安定値は５６℃以下であるが、８０℃処理に
おいても活性の残存が入られた。

ｐＨ安定性 ４０μ？蛋白質／祷の溶液を、３Ｎ−塩酸あるいは３Ｎ
−苛性ソーダを用いて夫々のｐＨに調整し、２４時間４
℃に保持した。

その後ｐＨを中性付近に戻し動物に投与しインシュリン
分泌増強活性の変化を検討した。

結果を、第１４表にｐＨ７，０を１００とする相対活性
で示す。

安定値はｐＨ４から９であるが３以下及び１０゜１１に
おいても活性は残存している。

−１０急性毒性 ｄｄＹ系マウスを用いたＹＨ７５１２精製標品の急性毒
性ＬＤ５０（μＰ／に９体重）は次の通りである。

実施例■：活性画分の製造、精製及び活性測定−百日咳
ＮＩＨＩ４４ Ｃ３７７９Ｂ ）菌株百日咳ＮＩ：Ｅ（
１１４（３７７９Ｂ ）菌株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を、実施例１と同様に振盪
培養、菌体分離して、培養上滑液ｌＯｔを得た。

この培養上清液を２分して、１刀の液をＩＮ塩酸でｐＨ
６，０に調整後、ハイドロキシアパタイトカラム（２，
５Ｘ ４ｃｍ ）に流速２００ｍｅ／ｈｒで適した。

カラムを水洗後、吸着物質な０−５Ｍ ＮａＣ１含有
０．１Ｍリン酸緩衝液ＣｐＨ７，０）で溶出した。

得られた溶出液を透過分子量限界ｓ、ｏｏｏの透析膜（
Ｔｈｏ ｍ ａｓ ）社製Ｃａｔ、Ａ３７８７ Ｆ２
５ ）に入れて蒸留水に対して３回（計１８時間）透析
処理し、活性画分を得た。

次いでこの両分を凍結乾燥処理して褐色調白色微粉末（
標品■）２８．６■を得た。

他力の培養上清液５ｔには、（ＮＨ４）２ＳＯ４を飽和
値の９０％まで添加して（希アンモニア水でｐＨ６，５
に調整）、殆んどの蛋白様物質を沈澱させた。

次いで沈澱物を充分水洗後０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−０
，５Ｍ ＮａＣｔ緩衝液（ｐＨ９）で浸出処理し、抽
出液を得た。

ＩＮＨＣｔで中和後、抽出液を上記透析膜で蒸留水に対
して計３回（１８時降透析処理して、活性画分を得、凍
結乾燥粉末（標品ＩＩ）１１．υバ得た。

一２百日咳 前野株■相菌（Ｍａｅｎｏ ｐｈａｓｅ
Ｉ）百日咳 前野株■相菌（Ｍ ａｅｎｏ ｐｈａｓｅ
Ｉ ）の凍結乾燥保存菌（北里大学薬学部微生物学教
室提働を用いて、上記実施例ＩＩ−Ｉと同様にして、活
性画分の凍結乾燥粉末（標品■及び■）夫々２３．６■
、１０．８ｍｇを得た。

一３各標品の活性及び急性毒性 前記実施例１１１−Ｉの方法により、得られた各標品の
比活性を求めた（第１５表）。

各標品の急性毒性（ＬＤ５０）は、第１６表に示す通り
である。

従ってこれらの活性画分粉末標品は、ＹＨ７５１２と同
様に糖尿病治療乃至予防薬として使用に適するものであ
り、有効量は１〜１００μｆｌｌＫｑＣ体ｔである。

【図面の簡単な説明】

第１乃至６図は、本発明実施例■の実験説明図であり、
第１図はハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
を、第２図はカルボキシメチルセファロースＣＬ−６Ｂ
カラムクロマトグラフを、ｍ３図はコンＡ−セファロー
スカラムクロマトグラフを、第４図はバイオケルＰ−１
００カラムクロマトグラフを、第５図はＹＨ７５１２の
ディスク電気泳動図を、第６図はＹＨ７５１２のＳＤＳ
電気泳動図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 百日咳■相菌又は■相菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ
   ｅｒｔｕｓｓｉｓ ｐｈａｓｅ Ｉ ｏｒ Ｉ
   Ｉ）に属するインシュリン分泌増強活性成分生産能を有
   する微生物の培養生成物の画面を有効成分とする糖尿病
   治療及び予防薬。