DE69837205T2

DE69837205T2 - Hochexprimierende module mit zwei oder mehreren tandemkopien einer für methioninase kodierenden sequenz

Info

Publication number: DE69837205T2
Application number: DE69837205T
Authority: DE
Inventors: Yuying San Diego TAN
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: EP1005557B1; AU752107B2; CA2299282C; WO1999007858A3; DE69837205D1; AU8688498A; WO1999007858A2; CA2299282A1; JP3710709B2; JP2001512683A; EP1005557A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Methioninase-Expressionssystem, das zwei oder mehr Tandemnukleotidsequenzen enthält, die Methioninase kodieren, und Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Methioninase davon. Dieses Herstellungssystem führt zu einem hohen Ausmaß an Methioninaseaktivität. Die so erzeugte Methioninase ist für eine Antimethionin- und Antihomocysteintherapie geeignet.
Eine therapeutische Behandlung von Krebs auf Arzneistoffbasis umfasst die Verwendung von Medikamenten, welche die Krebszellen selektiv inhibieren oder abtöten, während die normale Gewebefunktion nicht über ein akzeptables Maß hinaus geschädigt wird. Die Schwierigkeit bei der herkömmlichen Chemotherapie war die Toxizität therapeutischer Arzneistoffe für normales Gewebe.
Es wurde gezeigt, dass viele Tumore ein absolutes Erfordernis für Methionin in verschiedenen Zelltypen und bewerteten Tumorgeweben aufweisen, einschließlich Tumore des Kolon, der Brust, der Prostata, der Eierstöcke, der Niere, eines Kehlkopfmelanoms, eines Sarkoms, der Lunge, des Gehirns, des Magens und der Blase, sowie Leukämien und Lymphome. Die Methioninabhängigkeit wurde als Unvermögen von Tumoren zum Wachsen definiert, wenn Methionin in dem Wachstumsmedium durch Homocystein ersetzt wird, vgl. z.B. Chello et al., Cancer Res., 33, 1898–1904, 1973, und Hoffman, Anticancer Res., 5, 1–30, 1985.
Es wurde gezeigt, dass eine Methioninabreicherung selektiv Methionin-abhängige Tumorzellen in die späte S/G₂-Phase des Zellzyklus synchronisiert, vgl. Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7306–7310, 1980. Unter Verwendung einer Antimethionin-Chemotherapie, bei der es sich um eine Methioninverarmung handelt, gefolgt von einer Abreicherung von Methionin und gekoppelt mit einem Aussetzen gegenüber einem antimitotischen Mittel, wurden Tumorzellen selektiv aus Cokulturen von normalen Zellen und Tumorzellen beseitigt, was zu Kulturen von normalen Zellen führte, die sich stark vermehrten, vgl. Stern et al., J. Natl. Cancer Inst., 76, 629–639, 1986.
Um eine Methionin-abhängige Chemotherapie in vivo durchzuführen, ist es erforderlich, ein Mittel zur Verfügung zu haben, um zirkulierendes Methionin im Serum effektiv abzureichern. Es wurden keine Methioninabreicherungsverfahren beschrieben, welche die Konzentrationen an zirkulierendem Methionin in vivo in einer Weise vermindern, die ausreichend ist, um in Antitumortherapien effektiv zu sein.
Methioninase, wobei es sich um ein Enzym handelt, das Methionin abbaut, wurde von verschiedenen bakteriellen Quellen gereinigt und es wurde berichtet, dass es die Geschwindigkeit der Tumorzellenvermehrung in vitro verlangsamt, vgl. Kreis et al., Cancer Res., 33, 1862–1865, und 1866–1869, 1973; Tanaka et al., FEBS Letters, 66, 307–311, 1976, Ito et al., J. Biochem. 79, 1263–1272, 1976, und Nakayama et al., Agric. Biol. Chem. 48, 2367–2369, 1984.
Kreis et al., Cancer Res. 33, 1866–1869, 1973 haben die Verwendung von stark unreinen Methioninasepräparaten, die von Clostridium sporogenes mit 1150 Einheiten/kg/Tag isoliert worden sind, zur Hemmung des Wachstums von Carcinosarkomzellen, die in ein Mausmodell implantiert worden sind, beschrieben. Obwohl das Enzym offensichtlich das primäre Tumorzellenwachstum verminderte, wurde nicht beschrieben, dass es das T/C (behandelt gegen Kontrolle)-Verhältnis des Tumordurchmessers unter 50 % verminderte, und es wurde nicht beschrieben, dass es irgendeinen Effekt auf die Metastase hat. Die Autoren haben auch angegeben, dass die Tumorspezifität der Methionase nicht ohne andere unspezifischen Maßnahmen erwartet werden kann, und sie kommentieren ferner nicht die Möglichkeit, dass ein Endotoxin oder andere Komponenten des unreinen Präparats für die festgestellten Effekte verantwortlich ist bzw. sind. Die einzigen beschriebenen Toxizitätsstudien waren das Fehlen eines Tierkörpergewichtsverlusts nach der Behandlungsdauer und eine negative Grobuntersuchung bezüglich der Toxizität. Ferner berichten die Autoren, dass das Enzym eine Serumhalbwertszeit von 4 Stunden aufwies. Kreis et al., Cancer Res. 33, 1866–1869, 1973 haben ferner die Verwendung einer Methionin-freien Diät als Mittel zum Abreichern von Methionin als Antitumortherapie beschrieben, jedoch verlangsamte die Diät das Tumorwachstum nicht so effektiv wie die Verwendung selbst eines unreinen Präparats von Methioninase und führte zu der unerwünschten Nebenwirkung eines kontinuierlichen Gewichtsverlusts des Tiers.
Die Stammanmeldungen zu dieser Anmeldung beschreiben eine effektive Chemotherapie von Tumoren, die auf die Verminderung der Menge von Methionin gerichtet ist, so dass ein nützlicher Antitumoreffekt ohne schädliche Wirkungen unter Verwendung von Methioninase bereitgestellt wird. Die vorliegende Erfindung verbessert die beschriebenen therapeutischen und diagnostischen Verfahren und die beschriebene therapeutische und diagnostische Zusammensetzung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung kommerziell brauchbarer Mengen an rekombinanter Methioninase mit hoher Reinheit unter Verwendung von Expressionssystemen, die mindestens zwei Kopien des Methioninasegens enthalten.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Erzeugung von Methioninaseexpressionssystemen, die zwei oder mehr Tandemkopien von Methioninase-kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der Methioninase in einer hohen Konzentration erzeugen kann, welcher zwei oder mehr Tandemkopien einer Nukleotidsequenz umfasst, die Methioninase kodiert, und die funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, wobei die Nukleotidsequenz aus der Gruppe bestehend aus

a) einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das die in der 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist,
b) einer Nukleotidsequenz, die als Protein-kodierend in der 1 gezeigt ist, und
c) einer Nukleotidsequenz, die eine Methioninase kodiert, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, die an den komplementären Strang einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, gemäß der 1, unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert,

Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann rekombinante Methioninase in einer geeigneten Wirtszelle, wie z.B. E. coli, in Konzentrationen von etwa 40 bis 75 % des gesamten zellulären Proteins erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Methioninase-Expressionsvektoren beschrieben, die zwei oder mehr Tandemkopien des P. putida-Methioninasegens enthalten, das funktionell mit einem T7 RNA-Polymerasepromotor verknüpft ist. Diese Systeme wurden verwendet, um etwa 1 bis 4 g/Liter rekombinante Methioninase mit einer Aktivität von etwa 6,4 bis etwa 12,4 Einheiten/ml und einer spezifischen Aktivität von etwa 3,8 bis etwa 10,2 Einheiten/mg vor der Reinigung unter Verwendung geeigneter Inkubationsbedingungen und Reinigungsverfahren zu erzeugen.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Methioninase unter Verwendung von Zellen bereit, die den Methioninase-Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthalten.
Im Wesentlichen reine rekombinante Methioninase, die unter Verwendung von Zellen erzeugt worden ist, welche die Methioninase-Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, ist in Zusammensetzungen für eine diagnostische und therapeutische Verwendung geeignet, insbesondere in Verfahren zur Inhibierung des Tumorzellenwachstums zur Senkung von Homocysteinkonzentrationen in Patienten zur Verminderung des Risikos von kardiovaskulären Erkrankungen, Fettsucht und negativen Symptomen des Alterns und zu deren Behandlung, sowie zum Abreichern von Methionin für eine Tumordiagnose und -bildgebung.
Die rekombinante Methioninase kann in chemisch modifizierten Formen bereitgestellt werden, z.B. durch Koppeln an Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG).
1 zeigt das Nukleotid (und die entsprechende Aminosäuresequenz) eines Methioninase-kodierenden DNA-Moleküls, das aus P. putida isoliert worden ist.
2 zeigt eine Übersicht über die Reinigungsschritte, die verwendet werden, um Endotoxin-freie Methioninase mit hoher Reinheit zu erhalten.
3 ist ein Diagramm eines Ein-Kopie- und eines Zwei-Kopien-Methioninase-Expressionssystems.
4 vergleicht die Methioninase-Expressionsniveaus als eine Funktion der Zeit unter Verwendung von Ein-Kopie- und Zwei-Kopien-Expressionssystemen.
Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu und bestimmte Merkmale der Erfindung können im Hinblick auf die Klarheit und die Knappheit bezüglich des Maßstabs übertrieben dargestellt und in schematischer Form gezeigt sein.
Die Begriffe „Mehrkopie"- oder „Mehrfach"-Expressionssystem beziehen sich hier auf ein Nukleinsäuremolekül, das ein oder mehrere Expressionssteuerungselement(e) enthält, das bzw. welche die Transkription und Translation von zwei oder mehr Tandemkopien einer Nukleotidsequenz steuert bzw. steuern, die Methioninase kodiert. Vorzugsweise enthält das Expressionssystem zwei bis vier Tandemkopien der Methioninase-kodierenden Sequenzen, die gleich oder verschieden sein können. Gegebenenfalls können die Nukleotidsequenzen im Hinblick auf diejenigen, die in der Natur vorkommen, so modifiziert werden, dass sie stumme Mutationen enthalten, um Kodons bereitzustellen, die von E. coli bevorzugt werden. Solche Kodons sind bekannt, vgl. z.B. die US-Patente 4,356,270 und 4,571,421 (Genentech).
Die resultierende erzeugte rekombinante Methioninase repräsentiert etwa 40 bis 75 % des gesamten zellulären Proteins, vorzugsweise mehr als 50 % des gesamten zellulären Proteins. Das bevorzugte Expressionssteuerungselement ist der T7 RNA-Polymerasepromotor.
Andere Beispiele für RNA-Polymerasepromotoren umfassen unter anderem die Tac- und Trc-Promotoren.
Im Sinne der vorliegenden Beschreibung „kodiert" eine Nukleotidsequenz Methioninase, wenn die Transkription und Translation der Sequenz zur Erzeugung eines Proteins führt, das eine Methioninaseaktivität aufweist. Kopien von Methioninase-kodierenden Nukleotidsequenzen sind „tandemartig" orientiert, wenn sie als direkte Wiederholungen der gleichen oder von verschiedenen Methioninase-kodierenden Sequenzen bereitgestellt sind. Die 3 zeigt ein Diagramm eines Mehrfach-Expressionssystems, das zwei Tandemkopien des P. putida-Methioninasegens enthält.
L-Methioninase (L-Methionin-α-desamino-γ-mercaptomethanlyase oder Methioninase) ist ein Enzym, das Methionin durch Desaminierung und Dethiomethylierung unter Erzeugung von α-Ketobutyrat abbaut. Ein Verfahren zur Messung der Methioninaseaktivität ist die Bestimmung der Menge an gebildetem α-Ketobutyrat. Eine Einheit (U) von Methioninase ist als eine Enzymmenge definiert, die 1 Mikromol α-Ketobutyrat pro Minute aus Methionin unter den Standardtestbedingungen erzeugt, die von Ito et al., J. Biochem., 79, 1263–1272, 1976, und Soda, Analyt. Biochem. 25, 228–235, 1968, beschrieben worden sind.
Die Methioninase-kodierende Nukleotidsequenz kann unverändert sein, wie sie von einem Organismus erhalten wird, der dieses Enzym in natürlicher Weise erzeugt, oder sie kann modifiziert sein, so dass sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitution(en), -deletion(en) oder -addition(en) aufweist.
Das Methioninase-kodierende Nukleinsäuremolekül kann, verändert oder unverändert, von jedwedem Organismus stammen, der Methioninase in natürlicher Weise erzeugt. Die bevorzugte Quelle des Methioninase-kodierenden Nukleinsäuremoleküls ist Pseudomonas putida. Das Beispiel 1 beschreibt die Isolierung und Sequenzierung eines Methioninase-kodierenden Nukleinsäuremoleküls von P. putida (vgl. die 1). Andere bevorzugte Quellen umfassen unter anderem Trichomonas vaginalis, Nippostrongylus brasiliensis und Fusobacterium sp.
Die Mehrfachkopie-Expressionssysteme können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden, wie z.B. einem Restriktionsabbau und anschließender Ligation.
Gegebenenfalls können die Methioninase-kodierenden Sequenzen verändert werden, so dass die Reinigung des resultierenden Proteins erleichtert wird, z.B. durch Hinzufügen einer Polyhistidinverlängerung entweder am Amino- oder am Carboxyende. Ni²⁺-Sepharose kann dann zur Reinigung des resultierenden Fusionsproteins verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die eines oder mehrere der Mehrfachkopie-Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung enthalten. Vektoren sind DNA-Moleküle, die in Wirtszellen eingeführt werden können und zu einer autonomen Replikation innerhalb eines Wirts fähig sind. Vektoren können somit einen episomalen Replikationsursprung enthalten, der von einem natürlich vorkommenden Plasmid abgeleitet ist, einen genomischen Replikationsursprung enthalten oder von einem viralen Genom abgeleitet sein. Die Auswahl des Vektors, in den ein erfindunsgemäßes Expressionssystem insertiert wird, hängt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, wie z.B. der Gegenwart eines geeigneten Markers und der zu modifizierenden Wirtszelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor ein prokaryotisches Replikon, wie z.B. das Co1E1-Replikon, sowie einen selektierbaren Marker, wie z.B. eine Arzneistoffresistenz.
Eukaryotische Expressionsvektoren können ebenfalls verwendet werden, wobei diese bekannt sind und von mehreren kommerziellen Quellen erhältlich sind. Typische Vektoren dieser Art sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC, #31255) und der hier beschriebene Vektor pCDM8. „High level"-Expressionsvektoren können ferner unter Verwendung von Insektenzellexpressionssystemen, wie z.B. einem Bacculovirus-basierten Vektorsystem, erzeugt werden.
Die Wirtszellen für die Methioninaseerzeugung können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Ein bevorzugter prokaryotischer Wirt ist E. coli. In den folgenden Beispielen wurden die DH5α- und BL21(DE3)-Stämme von E. coli verwendet.
Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Insektenzellen, Hefezellen und Säugerzellen, vorzugsweise Insektenzellen, wie z.B. SP6, und Wirbeltierzellen, wie z.B. diejenigen einer Fibroblastenzelllinie einer Maus, einer Ratte, eines Affen oder eines Menschen. Andere bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO-Zellen), die von ATCC als CCL61 erhältlich sind, NIH Schweiz-Maus-Embyrozellen NIH/3T3, die von ATCC als CRL 1658 erhältlich sind, Babyhamster-Nierenzellen (BHK) und entsprechende eukaryotische Gewebekulturzelllinien.
Die Transformation eines geeigneten Wirts mit einem Mehrfachkopie-Methioninaseexpressionssystem der vorliegenden Erfindung wird mit bekannten Verfahren erreicht, die typischerweise von der Art des Wirts und des Vektors, die verwendet werden, abhängen. Die Transformation prokaryotischer Wirtszellen findet vorzugsweise durch eine Elektroporation oder eine Salzbehandlung statt, vgl. z.B. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, 1972, und Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Die Transformation eukaryotischer Zellen findet vorzugsweise durch eine Elektroporation oder durch die Verwendung eines kationischen Lipids statt, vgl. z.B. Graham et al., Virol. 52, 456, 1973, und Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373–76, 1979.
Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein Mehrfachkopie-Expressionssystem der vorliegenden Erfindung enthalten, können mit bekannten Techniken identifiziert werden. Zellen von einzelnen Kolonien können geerntet werden, lysiert werden und deren DNA-Gehalt kann bezüglich der Gegenwart der rDNA unter Verwendung eines Verfahrens untersucht werden, wie es z.B. von Southern, J. Mol. Biol., 98, 503, 1975, oder Berent et al., Biotech. 3, 208, 1985 beschrieben worden ist. Alternativ beschreibt die gleichzeitig anhängige Anmeldung US-Seriennummer 08/642,541 ein schnelles Screeningverfahren zur Identifizierung von Transformanten, die hohe Konzentrationen an rekombinanter Methioninase exprimieren, auf der Basis einer Färbung von Kolonien, die auf festen Medien ausgebildet sind.
Rekombinante Methioninase wird in kommerziell signifikanten Konzentrationen unter Verwendung eines Wirts erzeugt, der mit einem oder mehreren der Mehrfachkopie-Methioninaseexpressionssystemen der vorliegenden Erfindung transformiert worden ist. Ein solcher transformierter Wirt wird rekombinante Methioninase in einer Konzentration von etwa 40 bis 75 % des gesamten zellulären Proteins exprimieren. Das Protein kann gegebenenfalls gereinigt werden.
Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren ist in der 2 gezeigt und umfasst die Schritte:

a) Erwärmen eines Extrakts einer transformierten Zelle, die Methioninase enthält, in wässrigen Puffern bei etwa 40 bis 60°C für etwa 1 bis 10 min, vorzugsweise bei 50°C für 1 min,
b) Zentrifugieren des erwärmten Extrakts bei etwa 10000 bis 20000 U/min in einer GS-3-Zentrifuge (Sorvall, DuPont) für etwa 15 min bis 1 Stunde, vorzugsweise bei etwa 13000 U/min für etwa 30 min bei 4°C,
c) Ultrafiltrieren des Überstands unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von etwa 50K bis 100K, vorzugsweise einer Millipore Pre/Scale:TFF PLHK 100 K 2,5 Fuß²-Kartusche unter Verwendung eines 10 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 8,3),
d) Durchführen einer DEAE-Ionenaustauschchromatographie in KCl mit niedriger Ionenstärke (etwa 10 bis 50 mM) in einem 10 bis 20 mM Kaliumphosphatpuffer bei etwa pH 7,0 bis 7,6, und Sammeln von Methioninase-enthaltenden Fraktionen, die in einem 40 bis 200 mM KCl-Gradienten eluierten, vorzugsweise unter Verwendung einer DEAE-Sepharose FF-Säule,
e) Durchführen einer zweiten DEAE-Ionenaustauschchromatographie in KCl mit mittlerer Ionenstärke (50 bis 100 mM) in einem 10 bis 20 mM Kaliumphosphatpuffer bei etwa pH 8,0 bis 8,6, und Sammeln von Methioninase-enthaltenden Fraktionen, die in einem Phosphatpuffer (pH 8,3) und in 100 bis 200 mM KCl eluierten, vorzugsweise unter Verwendung einer DEAE-Sepharose FF-Säule, und
f) Inkontaktbringen der im Schritt(e) gesammelten Fraktionen mit einem Chromatographiemedium, das Endotoxine absorbieren kann, und Sammeln des Eluens, wodurch die Endotoxine von dem Eluens zur Bildung Endotoxin-freier Methioninase mit mindestens 20 Einheiten Methioninaseaktivität pro Milligramm Protein und 1 bis 100 ng Endotoxin pro mg Protein entfernt werden, vorzugsweise unter Verwendung einer Acticlean^® Etox-Säule.

Der Zellextrakt wird aus einer Wirtszelle hergestellt, die so verändert worden ist, dass sie eines der Mehrfachkopie-Methioninaseexpressionssysteme der vorliegenden Erfindung enthält. Bezüglich Bakterienzellextrakten werden die Extrakte im Allgemeinen durch zuerst Ernten und Waschen von Bakterienzellkulturen zur Bildung einer Zellpaste/eines Zellpellets hergestellt, und zwar abhängig davon, ob das Ernten mittels Zentrifugation oder durch eine Hohlfaserfiltration stattfindet, wobei diese Verfahren allgemein bekannt sind.
Die Zellen werden dann unter Verwendung herkömmlicher Mittel aufgebrochen. Vorzugsweise werden die Zellen unter Verwendung eines Homogenisators, wie z.B. eines Homogenisators des Kavitator-Typs, wie z.B. eines Microfluidics Corp. Modell #HC8000 aufgebrochen.
Die resultierende Suspension wird erwärmt, um selektive Proteine und andere unlösliche Materialien auszufällen. Typische Erwärmungsbedingungen sind von etwa 45 bis 60°C für 1 bis 10 min. Bevorzugt ist ein Erwärmungschritt von 50°C für 1 min.
Der erwärmte Extrakt wird zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und der Überstand wird filtriert und in zwei Schritten auf ein DEAE-Ionenaustauschchromatographiemedium aufgebracht, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Bevorzugte Adsorptions- und Elutionsbe dingungen sind in den Beispielen beschrieben. Jedwedes verschiedener DEAE-Ionenaustauschchromatographiemedien kann in diesen Schritten verwendet werden und die Auswahl des Mediums wird nicht als beschränkend erachtet. Kommerzielle Quellen umfassen Pharmacia Fine Chemicals, BioRad und Sigma.
Danach werden die Endotoxine zur Erzeugung eines Proteins entfernt, das akzeptable Konzentrationen an Endotoxinen aufweist, wie es weiter oben beschrieben worden ist. Der Endotoxinentfernungsschritt kann in jedweder bekannten Art und Weise durchgeführt werden, einschließlich durch Inkontaktbringen des Proteins in Lösung mit einem Chromatographiemedium, das Endotoxine adsorbieren kann, und Eluieren des Endotoxin-freien Proteins. Das bevorzugte kommerzielle Reagenz zur Verwendung bei der Entfernung von Endotoxinen ist Acticlean^® Etox.
Therapeutische Zusammensetzungen
Die im Wesentlichen isolierte rekombinante Methioninase, die unter Verwendung eines Wirts hergestellt worden ist, der mit einem der Mehrfachkopie-Methioninaseexpressionssysteme der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist, kann zu therapeutischen Zusammensetzungen formuliert werden.
Diese Zusammensetzungen werden vorzugsweise eine rekombinante Methioninase enthalten, die eine spezifische Aktivität von etwa 10 bis 50 Einheiten (U) pro mg Protein, typischerweise etwa 16 bis 24 U/mg aufweist.
Zum Einbringen in solche Zusammensetzungen ist die Methioninase vorzugsweise im Wesentlichen gereinigt. Mit im Wesentlichen gereinigt ist gemeint, dass das Enzym eine Reinheit von mindestens 90 Gew.-%, vorzugsweise eine Reinheit von mindestens 95 % und mehr bevorzugt von mindestens 99 % aufweist oder im Wesentlichen homogen ist. Die Homogenität kann durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE oder SDS-PAGE) bestätigt werden, bei der nur eine einzelne erfassbare Bande bereitgestellt wird.
Die rekombinante Methioninase sollte im Wesentlichen frei von Endotoxinen sein, wie z.B. von bakteriellen Lipopolysacchariden, und zwar aufgrund der unerwünschten Nebenwirkungen, die mit Endotoxinen einhergehen, wenn sie z.B. durch eine i.v.- oder i.p.-Verabreichung physiologisch mit einem Säuger in Kontakt kommen. Mit im Wesentlichen frei ist gemeint, dass weniger als etwa 10 Nanogramm (ng) Endotoxin pro Milligramm (mg) rekombinantes Methioninaseprotein, vorzugsweise weniger als 1 ng/mg und mehr bevorzugt weniger als 0,1 ng/mg vorliegen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen können ferner einen physiologisch tolerierbaren Träger umfassen. Die Ausdrücke „pharmazeutisch verträglich", „physiologisch tolerierbar" und grammatikalische Variationen davon, die sich beide auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, bedeuten, dass die Materialien an einen Säuger oder einen Menschen verabreicht werden können, ohne dass unerwünschte physiologische Effekte, wie z.B. Übelkeit, Schwindel, eine Magenverstimmung und dergleichen auftreten.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzungen, die Wirkstoffe enthält, die darin gelöst oder dispergiert sind, ist bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als sterile injizierbare Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt, die wässrig oder nicht-wässrig sind, jedoch können auch feste Formen, die für ein Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Verwendung geeignet sind, hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden. Darüber hinaus kann eine therapeutische Menge an rekombinanter Methioninase in einer Salbe oder einem diffusionsfähigen Pflaster, wie z.B. einem Verband, vorliegen, um eine lokale Abgabe des Mittels bereitzustellen.
Der Wirkstoff kann mit Trägern gemischt werden, die pharmazeutisch verträglich und mit dem Wirkstoff kompatibel sind, und zwar in Mengen, die zur Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Träger sind z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin oder dergleichen und Kombinationen davon. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung gegebenenfalls kleinere Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie z.B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel und dergleichen, welche die Effektivität des Wirkstoffs verstärken.
Die Methioninase kann in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen bereitgestellt werden, wie z.B. als Säureadditionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Polypeptids gebildet werden), die mit anorganischen Säuren wie z.B. Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie z.B. Essig-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)hydroxiden, und organischen Basen, wie z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet sein.
Physiologisch tolerierbare Träger sind bekannt. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die zusätzlich zu den Wirkstoffen und Wasser keine Materialien enthalten, oder die einen Puffer, wie z.B. Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides, wie z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Ferner können wässrige Träger mehr als ein Puffersalz sowie Salze wie z.B. Natrium- und Kaliumchlorid, Dextrose, Propylenglykol, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe enthalten.
Flüssige Zusammensetzungen können zusätzlich zu Wasser und zum Ausschluss von Wasser, wie es hier beschrieben ist, flüssige Phasen enthalten. Beispiele für solche zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, wie z.B. Baumwollsaatöl, organische Ester, wie z.B. Ethyloleat und Wasser-Öl-Emulsionen, insbesondere die weiter oben beschriebenen Liposomenzusammensetzungen.
Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine effektive Menge an rekombinanter Methioninase, typischerweise eine Menge von mindestens 0,1 Gew.-% aktivem Protein pro Gewicht der gesamten therapeutischen Zusammensetzung, und vorzugsweise mindestens etwa 25 Gew.-%. Der Gewichtsprozentsatz ist das Gewichtsverhältnis von rekombinantem Methioninaseprotein zu der Gesamtzusammensetzung. Folglich sind z.B. 0,1 Gew.-% 0,1 g rekombinante Methioninase pro 100 g der Gesamtzusammensetzung.
Es kann auch eine gesteuerte Abgabe der rekombinanten Methioninase bewirkt werden, die ferner das rekombinante Methioninaseprotein vor einer Zersetzung schützt und die Serumhalbwertszeit erhöht.
Therapeutische Zusammensetzungen können auch Abgabevehikel wie z.B. Polymere, polymere Vehikel, Teilchen, Latizes, Coazervate, Ionenaustauscherharze, Liposomen, enterische Beschichtungen, Mediatoren, Biohaftmittel, Mikrokapseln, Hydrogele und dergleichen Vehikel sein. Beispiele für Arzneistoffabgabevehikel, die Liposomen umfassen, sind z.B. von Tarcha in „Polymers For Controlled Drug Delivery", CRC Press, Boca Raton, 1990, beschrieben worden.
Die rekombinante Methioninase kann chemisch modifiziert werden, z.B. durch Konjugation an ein Polymer oder eine sonstige Veränderung der kovalenten Struktur ohne Verändern der primären Aminosäuresequenz. Bevorzugte Polymere sind Polyalkylenoxide oder Polysac charide. Das Koppeln an ein Polymer erhöht die Serumhalbwertszeit und vermindert die Immunogenität oder Antigenität der resultierenden Verbindung.
Ein bevorzugtes Polymer ist bzw. sind Polyethylenglykol, insbesondere MSC-5000 PEG, Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, Copolymere von Ethylenoxid und Copolymere von Propylenoxid. Verfahren zur chemischen Modifizierung von Proteinen sind bekannt und können zur Modifizierung der rekombinanten Methioninase einfach verwendet werden, vgl. z.B. PCT/US93/11311.
Verabreichung und Nutzen
Methioninase kann in diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendet werden, die entwickelt und an anderer Stelle beschrieben worden sind, vgl. PCT/US93/11311. Beispielsweise wird Methioninase 1) als Antitumormittel in verschiedenen Modalitäten, wie z.B. durch Abreichern von Methionin in Tumorzellen, 2) zum Induzieren einer Zellzyklusstase in Tumorzellen gefolgt von einer Zellsynchronisation und die Verwendung antimitotischer Mittel, 3) in einer Kombination mit antimitotischen und Zellzyklus-spezifischen cytotoxischen Mitteln, 4) zum Abreichern von zellulärem Methionin vor dem Markieren mit Methionin, das bei der Tumordiagnose und -lokalisierung verwendet werden kann, und 5) zum Abreichern von Serumhomocystein zur Verhinderung und Heilung von kardiovaskulären Erkrankungen, die durch hohe Serumkonzentrationen von Homocystein vermittelt werden, verwendet. Rekombinante Methioninase, die erfindungsgemäß hergestellt worden ist, wurde an neun Patienten verabreicht, wobei eine Infusionsdosierung bis zu 20000 Einheiten, die über zehn Stunden infundiert wurde, eingesetzt wurde, wies keine signifikanten Nebenwirkungen auf und führte zu einer Abreicherung von Methionin für 10 Stunden nach der Infusion.
Die folgenden Beispiele, welche diese Erfindung betreffen, dienen der Veranschaulichung und beschränken die Erfindung nicht.
Beispiel 1
Isolierung von Nukleinsäuremolekülen, die Methioninase kodieren
Genomische DNA von Pseudomonas putida AC-1, das von ATCC8209 abgeleitet war, wurde als Templat verwendet, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Zuerst Denaturieren bei 95°C für 10 min, dann 5 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 30 s, Hybridisieren bei 60°C für 30 s und Verlängern bei 72°C für 2 min; dann 25 Zyklen Denaturieren bei 94°C für 30 s, bei 60°C für 30 s, dann Verlängern bei 72°C für 1,5 min, dann ein letztes Verlängern bei 72°C für 10 min. Die PCR-amplifizierten Produkte bilden zwei Banden, von denen die 1365 bp-Bande gesammelt und als das Insert ONCase-1-DNA gereinigt wurde.
Die ONCase-1-DNA wurde mit dem pT7Blue T-Vektor (Novagen) an der EcoR V T-Klonierungsstelle ligiert. Die pONCase-1-DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren in DH5-α-Bakterienzellen transformiert.
Das DNA-Sequenzieren wurde unter Verwendung von T7 DNA-Polymerase und die Didesoxynukleotid-Terminierungsreaktion durchgeführt. Es wurde das Primer-Walking-Verfahren eingesetzt. [³⁵S] dATP wurde zum Markieren verwendet. Sequenzierreaktionen wurden auf 6 % Keil- oder nicht-Keil-Polyacrylamidgelen, die 8M Harnstoff enthielten, durchgeführt. DNA-Proben wurden in der Reihenfolge von ACGT beladen. DNA-Sequenzen wurden mittels MacVector analysiert. Die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz sind in der 1 gezeigt.
Beispiel 2
Klone mit starker Expression
Der pONCase-1-Klon wurde als das Templat verwendet, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Zuerst Denaturieren bei 95°C für 10 min, dann 5 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 1 min, Hybridisieren bei 56°C für 1,5 min und Verlängern bei 72°C für 2 min; dann 20 Zyklen Denaturieren bei 94°C für 30 s, bei 56°C für 30 s, dann Verlängern bei 72°C für 1,5 min, dann ein letztes Verlängern bei 72°C für 10 min. Zwei PCR-amplifizierte Produkte, die ONCase-2 (1238 bp)- und die ONCase-3 (1220 bp)-Bande, wurden gesammelt und gereinigt.
Die DNA von ONCase-2 und ONCase-3-DNA wurden mit NdeI und BamHI abgebaut und mit dem pt7.7-Vektor an den NdeI und BamHI-Klonierungsstellen ligiert. Die pONCase-2- und pONCase-3-DNA-Sequenzen wurden dann in BL21 (DE3)-Bakterienzellen unter Verwendung von Standardverfahren transformiert.
Die positiven Klone wurden aus Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Nach 24 Stunden Lagern bei 4°C wiesen die positiven Klone, die eine hohe Konzentration von rekombinanter Methioninase exprimierten, eine deutliche rosa Farbe auf, die deren Identifizierung und Auswahl ermöglichte. Die Methioninaseexpressionsniveaus der positiven Klone wurden durch einen Aktivitätstest bestimmt. Zwei stark exprimierende Klone wurden als der pAC-1-Klon, der ONCase-3 enthielt, und als der pAC-2-Klon, der ONCase-2 enthielt, ausgewählt.
Das Tetracyclin-Resistenzgen wurde von pBR322 an den AvaI- und ClaI-Stellen erhalten. Das AvaI-Ende wurde in ein stumpfes Ende einbezogen, mit pAC-1 ligiert und mit BamHI und ClaI abgebaut, wobei das BamHI-Ende in ein stumpfes Ende einbezogen wurde. Positive Klone, die nach 24 Stunden Lagern bei 4°C rosa wurden, wurden aus Tetracyclinenthaltenden Platten ausgewählt. Durch einen Aktivitätstest wurde ein stark exprimierender rekombinanter Methioninaseklon, pAC-3, ausgewählt.
Das Tetracyclin-Resistenzgen wurde auch von pBR322 an den AvaI- und HindIII-Stellen erhalten. Das AvaI-Ende wurde in ein stumpfes Ende einbezogen und mit pAC-1 ligiert, das mit HindIII und ClaI abgebaut wurde, wobei das ClaI-Ende in ein stumpfes Ende einbezogen wurde. Positive Klone, die nach 24 Stunden Lagern bei 4°C rosa wurden, wurden aus Tetracyclin-enthaltenden Platten ausgewählt. Durch einen Aktivitätstest wurde ein stark exprimierender rekombinanter Methioninaseklon, pAC-4, bestimmt. Die von diesen Vektoren erhaltenen Expressionsniveaus sind in der Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 3
Erzeugung eines Tandem-Methioninase-Expressionssystems
Das Plasmid pAC-1 wurde von der amplifizierten Zellbank mit dem QIA prep Spin Miniprep-Kit (Quiagen) isoliert und dann mit BamHI abgebaut, um den Wirtsvektor zu erhalten, der eine einzelne, Methioninase-kodierende Nukleotidsequenz enthielt.
ONCase-3 wurde mit dem NdeI abgebaut, mit dem Klenow Fill-in-Kit (Stratagene) gefüllt und mit BamHI als Insert für das zweite Methioninasegen abgebaut. Die Ligation wurde mit dem DNA Ligationskit von Stratagene bei einer höheren T4-Ligasekonzentration durchgeführt, vgl. die 3. Das resultierende Plasmid wurde dann gemäß der Bedienungsanleitung in kompetente E. coli BL21 (DE3)-Zellen transformiert.
Positive Klone wurden aus Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Nach der optionalen Lagerung bei 4°C über Nacht wiesen die Klone, die hohe Konzentrationen von Methioninase exprimierten, aufgrund der starken Anreicherung der Pyridoxalphosphat-enthaltenden Methioninase eine deutliche gelb-orange Farbe auf. Der Klon, bei dem sich der höchste Methioninase-Gehalt zeigte, wurde durch einen Aktivitätstest bestätigt. Wenn ein Test bezüglich der Aktivität durchgeführt wurde, waren alle gelb-orangen Kolonien bezüglich Methioninase positiv, und nicht-gefärbte Klone waren Methioninase-negativ. Der Klon mit der höchsten Methioninaseaktivität, pAC-11, wurde selektiert und mittels BamHI- und NdeI-Abbau bestätigt.
pAC-11 stellt eine hohe Methioninaseerzeugung von 50 % des gesamten intrazellulären Proteins bereit, wie es in der Tabelle 2 gezeigt ist.
Beispiel 4
Fermentation rekombinanter Methioninase-Expressionsklone
Zellen, die pAC-1 und pAC-11 enthielten, wurden in Terrific Broth-Medium, das entweder Ampicillin (100 μg/ml) oder Tetracyclin (10 μg) enthielt, bei 28°C oder 37°C unter Schütteln inkubiert. In der Tabelle 3 wird das Niveau der Methioninaseerzeugung, die von diesen Vek toren erhalten worden ist, verglichen. Diese Ergebnisse sind in der 4 graphisch aufgetragen, um den Zeitverlauf zu zeigen.

* Der pAC-1-Klon enthält ein Methioninasegen. Der pAC-11-Klon enthält zwei Methioninasegene.
** Bakterienwachstum in 1 XTB 800 ml bei 28°C.

Beispiel 5
Reinigung von rekombinanter Methioninase
Eine Übersicht über das Reinigungsverfahren ist in der 2 gezeigt.
(1) Vorsäulenbehandlung der Probe
Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 800 × g bei 4°C für 10 min geerntet. Das Bakterienpellet wird dann in einer Extraktionslösung (20 mM Kaliumphosphat pH 9,0, 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01 % β-Mercaptoethanol) suspendiert und mit einem Homogenisator des Kavitatortyps (Microfluidics Corp. Modell #HC 8000) aufgebrochen. Eine Wärmebehandlung des Homogenisats wird dann bei 50°C für eine Minute durchgeführt. Die Suspension wird mit einer automatischen gekühlten Zentrifuge (SORVALL Superspeed RC 2-B) bei 4°C bei 13000 U/min für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wird dann gesammelt. Nach diesem Schritt wird eine Ultrafiltration mit einer Millipore Prep/Scale-TFF PLHK 100k 2,5 Fuß²-Kartusche mit Puffer (10 mM Kaliumphosphat pH 8,3) durchgeführt. Der pH-Wert wird durch die Ultrafiltration auf 7,2 eingestellt.
(2) Chromatographische Bedingungen
Die erste Säule: DEAE Sepharose FF

Säule: XK 100/60, Höhe: 32 cm, Volumen: 2,5 Liter
Lösung: [A] 40 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), das 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01 % β-Mercaptoethanol enthält. [B] 200 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), das 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01 % β-Mercaptoethanol enthält.
Flussrate: 5 ml/min.
Probe: etwa 100 bis 200 g Gesamtprotein (10 bis 20 mg/ml) werden auf die erste Säule aufgebracht.
Gradient: [1] Vorwaschen mit einer Lösung A mit etwa 10 Volumina, bis OD₂₈₀ auf unter 0,1 fällt. [2] Gradient: Lösung B von 20 % bis 100 %.
Fraktionen: Elutionsfraktionen von 200 ml werden gesammelt. Die Fraktionen, die Methioninase enthalten, werden durch einen Aktivitätstest identifiziert und vereinigt.

Die zweite Säule: DEAE Sepharose FF

Säule: XK 50/30, Höhe: 25 cm, Volumen: 500 ml
Lösung: [A] 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), das 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01 % β-Mercaptoethanol enthält. [B] 200 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), das 10 μM Pyridoxalphosphat und 0,01 % β-Mercaptoethanol enthält.
Flussrate: 5 ml/min.
Probe: etwa 10 bis 20 g Gesamtprotein (2 bis 4 mg/ml) nach der Dialyse in 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,3), das 10 μM Pyridoxalphosphat enthält, für 24 Stunden werden auf die zweite Säule aufgebracht.
Gradient: [1] Vorwaschen mit einer Lösung A mit etwa 5 Volumina, bis OD₂₈₀ auf unter 0,05 fällt. [2] Gradient: Lösung B von 0 % bis 60 %.
Fraktionen: Elutionsfraktionen von 200 ml werden gesammelt. Die Fraktionen, die Methioninase enthalten, werden durch einen Aktivitätstest identifiziert und vereinigt.

Die dritte Säule: Sephacryl S-200 HR

Säule: HiPrep 26/60, Volumen 320 ml.
Lösung: 0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2). Flussrate: 1,2 ml/min.
Probe: etwa 10 ml konzentrierte Probe (nach der Dialyse in 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat (pH 7,2) für 12 Stunden) werden auf die dritte Säule aufgebracht.
Fraktionen: Elutionsfraktionen von 20 ml, die Methioninase enthalten und durch eine gelbe Farbe und einen Aktivitätstest identifiziert werden, werden gesammelt.

Die vierte Säule: Acticlean^® Etox
Gereinigte Methioninase (10 bis 20 mg Protein/ml) in einem Volumen von 100 bis 200 ml wird auf eine 500 ml Acticlean^® Etox-Säule aufgebracht und mit Elutionspuffer (0,15 M Natriumchlorid in 10 mM Natriumphosphat pH 7,2) eluiert, um Endotoxine zu beseitigen. Acticlean^® Etox ist wieder verwendbar und kann mit 1 M Natriumhydroxid gereinigt und autoklaviert werden.
Konzentrierung des letzten Eluens
Das letzte Eluens wird mit 30 K Amicon Centriprep-Konzentratoren konzentriert. Die Formulierung für gereinigte Methioninase ist 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2.
Reinigung von Methioninase-Histidin: Chromatographie auf Ni²⁺-Sepharosesäule
Das Zellhomogenisat wird nach der Vorsäulenbehandlung in Bindungspuffer (5 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris·HCl, pH 7,9) suspendiert. Die Säule wird dann mit 10 Volumina Bindungspuffer und dann mit 6 Volumina Waschpuffer (60 mM Imidazol, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM Tris·HCl, pH 7,9) gewaschen. Die Elution findet statt, nachdem 6 Volumina Elutionspuffer (1 M Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris·HCl pH 9), durch die Säule laufen gelassen worden sind. Die Methioninase-enthaltenden Fraktionen, die durch die gelbe Farbe identifiziert werden, werden gesammelt.

Claims

Expressionsvektor, der Methioninase in einer hohen Konzentration erzeugen kann, welcher zwei oder mehr Tandemkopien einer Nukleotidsequenz umfasst, die Methioninase kodiert, und die funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, wobei die Nukleotidsequenz aus der Gruppe bestehend aus a) einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das die in der 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, b) einer Nukleotidsequenz, die als Protein-kodierend in der 1 gezeigt ist, und c) einer Nukleotidsequenz, die eine Methioninase kodiert, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, die an den komplementären Strang einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, gemäß der 1, unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert, ausgewählt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, bei dem die Nukleotidsequenz diejenige ist, die als Protein-kodierend in der 1 gezeigt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, bei dem die Nukleotidsequenz ein Protein kodiert, das die in der 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und die entsprechende Nukleotidsequenz von 1 umfasst, die so modifiziert ist, dass sie ein oder mehrere von E. coli bevorzugte(s) Kodon(s) enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, bei dem der Promotor der T7 RNA-Polymerasepromotor ist.
Zellen, die so modifiziert sind, dass sie den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthalten.
Zellen nach Anspruch 5, bei denen es sich um E. coli handelt.
Zellen nach Anspruch 6, bei denen es sich um E. coli BL21(DE3) handelt.
Verfahren zur Herstellung von Methioninase, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 unter Bedingungen, bei denen die Methioninase erzeugt wird, und gegebenenfalls Gewinnen der Methioninase aus der Kultur umfasst.