DE68913063T2

DE68913063T2 - Antitumor-Antibiotikum Kedarcidin.

Info

Publication number: DE68913063T2
Application number: DE68913063T
Authority: DE
Inventors: James Allen Bush; Salvatore Forenza; Sandra June Hofstead; Kin Sing Lam; James Andrew Matson; Koji Tomita
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-12
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2009-04-13
Also published as: KR970010137B1; DK173589D0; AU3272889A; FI93969C; HK83195A; NZ228672A; KR900016469A; MY105842A; ES2061760T3; US5001112A; ATE101653T1; NO891462L; NO174474C; EP0337430A2; DK173589A; CA1338262C; DK174751B1; PL161004B1; EP0337430A3; FI93969B

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft das hier als Kedarcidin bezeichnete Antitumor-Antibiotikum, dessen Produktion durch Streptoalloteichus sp. nov. Stamm L585-6, pharmazeutische Mittel, die das Antibiotikum enthalten und Verfahren zur Inhibierung des Tumorwachstums durch dieses Antibiotikum. Die Erfindung betrifft auch den Kedarcidin produzierenden Mikroorganismus Streptoalloteichus sp. nov. Stamm L585-6, ATCC 53650.

Kurzfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Antitumor-Antibiotikum Kedarcidin mit folgenden Charakteristika:
(a) Aussehen: lederfarbener Feststoff;
(b) Molekulargewicht: 12.400 Dalton mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren; 17.000 Dalton mittels Gelfiltration/HPLC-Verfahren;
(c) UV-Spektrum: im wesentlichen wie in Fig.1 gezeigt;
(d) isoelektrischer Punkt: 3,65; und
(e) umfassend ein Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
worin X ausgewählt ist unter H-ala-ser, H-ser und H.
Die oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Antibiotikums unterscheiden es von anderen bekannten Peptid-Antibiotika mit Antitumoraktivität, wie Neokarzinostatin, Makromycin, Largomycin, Actinoxanthin und AN- 7D.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Kedarcidin, wobei man einen Kedarcidinproduzierenden Streptoalloteichus-Stamm in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum aus der Kulturbrühe gewinnt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kedarcidin produzierenden Stamm von Streptoalloteichus sp. nov., Stamm L585-6, ATCC 53650.
Gemäß einein weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein pharmazeutisches Mittel, das eine Tumor-inhibierende Menge des Antiobiotikums Kedarcidin und einen pharmazeutlsch akzeptablen Träger umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung des Tumorwachstums in einem Säugerwirt, wobei man dem einen Tumor aufweisenden Wirt eine Tumor-inhibierende Menge des Antibiotikums Kedarcidin verabreicht.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeit das UV-Spektrum des erfindungsgemäßen Antibiotikums Kedarcidin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Im folgenden sind die Bedeutungen der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Abkürzungen für Aminosäuren angegeben:
asx: Asparaginsäure + Asparagin
thr: Threonin
ser: Serin
glx: Glutaminsäure + Glutamin
asp: Asparaginsäure
asn: Asparagin
glu: Glutaminsäure
gln: Glutamin
pro: Prolin
gly: Glycin
ala: Alanin
val: Valin
met: Methionin
ile: Isoleucin
leu: Leucin
tyr: Tyrosin
phe: Phenylalanin
his: Histidin
lys: Lysin
arg: Arginin
cys: Cystein
trp: Tryptophan

Produzierender Organismus

Der Stamm L585-6 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Maharastra State, Indien, genommen wurde. Die Charakteristika des Stamms L585-6 werden nachfolgend näher erläutert.

Morphologie

Der Stamm L585-6 ist ein gram-positiver, filamentöser Organismus, der ein Substrat- und Luftmycel bildet. Das Substratmycel penetriert in den Agar und ist nicht fragmentiert. Man beobachtet kugelförmige, dichte Hyphenaggregate mit einem Durchmesser von 5 bis 25 um zusammen mit koaleszierenden vegetativen Hyphen. Das Luftmycel ist gut verzweigt und entwickelt geradlinig gedrehte oder spiralförmige lange Hyphen, in denen Sporen in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Kette gebildet werden. Dichte Büschel oder verzweigte kurze Sporenketten bilden sich hauptsächlich in ISP-Medium Nr. 5. Beide Sporentypen sind oval bis kurz zylindrisch (0,4 bis 0,6 x 1,0 bis 2,0 um), nicht-motil und haben eine glatte Oberfläche.
Nach 5- bis 10-tägiger Inkubation beobachtet man farblose ballonähnliche Körper (5 bis 20 um Durchmesser) einzeln oder in Massen am Luftmycel. Nach 3-wöchiger oder längerer Inkubation entwickeln sich diese ballonähnlichen Körper zu gelbbraunen sklerotischen Granula (40 bis 100 um ), die mit weiteren verlängerten Lufthyphen bedeckt sind.

Kulturcharakteristika

Das Wachstums ist im allgemeinen mäßig, auf Czapek's Sucrose-Nitratagar , Hafermehlagar und Stärke-Mineralsalzeagar ist es sogar sehr schwach. Das Luftmycel wird auf Tyrosinagar und Glycerin-Asparaginagar gebildet, auf den ISP-Medien Nr. 2, 3, 4 und 6 sowie auf Bennett's-Agar bildet es sich dagegen nicht. Die Farbe des Luftmycels ist gelblich-weiß. Schwarze melanoide Pigmente bilden dich auf den ISP-Medien Nr. 6 und 7. Die anderen verschiedenen Pigmente werden nicht gebildet. Die Kulturcharakteristika des Stammes L585-6 sind in Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I Kulturcharakteristika des Stammes L585-6 Medium Charakteristika 1) Sucrose-Nitratagar (Czapek-Dox-Agar) Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr. 1) Hefeextrakt-Malzextrakt Agar (ISP Nr. 2) Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3) Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4) Glycerin-Asparaginagar (ISP Nr. 5) 2) G: keines oder wenig A: keines S: farblos D: keines G: mäßig, nicht-trübe, flockig D: tief gelblich-braun (75)3) G: mäßig S: dunkles gelblich-braun (78) D: tief gelblich braun (75) G: wenig A: keines oder wenig, weiß, wenn vorhanden C: farblos A: mäßig, gelblich-weiß (92) Fortsetzung Tabelle I Medium Charakteristika Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6) Tyrosinagar (ISP Nr. 7) Glukose-Asparagin-Agar Bennett's-Agar G: mäßig A: keines S: leicht grau-gelb-braun (79) D: bräunlich-schwarz (65) A: üppig, gelblich-weiß (92) S: schwarz D: schwarz G: schwach S: dunkel orange-gelb (72) D: keines A: keines oder wenig, weiß, wenn vorhanden S: dunkel grau-gelb-braun (81) D: mäßig, gelb-braun (77) 1) Nach 3-wöchiger Inkubation bei 28ºC 2) G= Wachstum: A= Luftmycel: S= Substratmycel: D= diffusibles Pigment 3) Die Angabe der Farben und Zahlen in Klammern erfolgt gemäß der ISCC-NBS-Bezeichnung

Physiologische Eigenschaften

Optimales Wachstum wird bei 30 bis 35ºC beobachtet. Der Temperaturbereich für das Wachstum liegt bei 18 bis 39ºC. Kein Wachstum erfolgt bei 15ºC und 41ºC; kein Wachstum erfolgt auf Medien, die mit mehr als 5 % NaCl ergänzt sind. Gelatine wird verflüssigt, Stärke wird jedoch nicht hydrolyisiert. Von 25 getesteten Zuckern werden nur D-Ribose und D-Glukose für das Wachstum verwertet. Die physiologischen Charakteristika und die Kohlehydratverwertung sind in den Tabellen II und III zusammengestellt. Tabelle II Physiologische-Eigenschaften des Stamms L585-6 Hydrolyse von: Verwertung von: *2 Gelatine + Stärke: Lösliche Stärke - Kartoffelstärke - Milchkoagulation + Peptonisierung + Produktion von: Nitratreduktase - od. *1 + (w) Tyrosinase + Toleranz gegenüber: Lysozym, 0,01% (G/v) + NaCl, 1% - 4% (G/v) + 5% - pH, 5,0 - 11,0 + 4,5 und 12 - Temperatur Wachstumsbereiche 18ºC-39ºC kein Wachstum 15ºC u. 41ºC Optimales Wachstum 30ºC-35ºC L-Rhamnose - D-Glukose + D-Galaktose - D-Fruktose - D-Mannose - L-Sorbose - Sucrose - Lactose - Cellobiose - Melibiose - Trehalose - Raffinose - D-Melezitose - Lösliche Stärke - Cellulose - Dulcit - Inosit - D-Mannit - D-Sorbit - Salicin - Fortsetzung-Tabelle II Glycerin - D-Arabinose - L-Arabinose - D-Xylose - D-Ribose - *1 Negativ in Czapek's Sucrose-Nitratbrühe und positiv in Pepton-Nitratbrühe *2 Basalmedium: Pridham-Gottlieb's-Medium (=ISP Nr. 9- Medium) Tabelle III Weitere physiologische Eigenschaften des Stamms L585-6 Hydrolyse von: Säure aus: Adenin - Casein + Esculin + Hippursäure + Hypoxanthin - Tyrosin + Harnstoff - Xanthin - Überleben bei 50ºC, 8 h - Verwertung von: Benzoat - Citrat - Mucat - Glycerin - D-Arabinose - L-Arabinose - D-Xylose - L-Rhamnose - D-Glukose - D-Mannose - Lactose - Cellobiose - Melibiose - Trehalose - Raffinose - D-Melizitose - Inosit - D-Mannit - Fortsetzung Tabelle III Verwertung von: Säure aus: Succinat + Tartrat - D-Sorbit - Erythrit - Adonit - Methyl-α-glukosid - *Die Tests beschrieben von Gordon et al. J. Gen. Microb. 1978, 109: 69-78.

Zellwandchemie

Die Zellwandzusammensetzung des Stamms L585-6 wurde gemäß den von Becker et al. in Appl. Microbiol. 13: 236-243 (1965), Yamaguchi in J. Bacteriol. 89: 444-453 (1965) und Lechevalier und Lechevalier in Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-92 (1976) beschriebenen Methoden untersucht. Das Zellwandpeptidoglykan enthält meso-Diaminopimelinsäure. Zu den Gesamtzellzuckern zählen Galaktose, Glukose und Ribose. Demnach handelt es sich um den Zellwandtyp IIIC. Die Phospholipide zählen zum Typ P-II und enthalten Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerin und Phosphatidylinosit. Die Hauptmenachinone sind MK-9(H&sub3;) und MK-9(H&sub6;). Der Glykolattest ist negativ.

Taxonomie

Von den zu den Actinomycetales-Genera mit langen Sporenketten zählenden Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiopsis und Amycolata unterscheidet sich der Stamm L585-6 in der Zellchemie, umfassend den Zellwandtyp, das Zellzuckermuster, Phospholipide und Menachinone. Kibdelosporangium (Shearer et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 47-54, 1986), Kitasatosporia (Takahashi et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 30: 377-387, 1984) und Amycolatopsis (Lechevalier et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 29-37, 1986) sind mit dem Stamm L585-6 aufgrund der Zusammensetzung der Phospholipide und Menachinone verwandt. Kibdelosporangium und Amycolatopsis unterscheiden sich von dem erfindungsgemäßen Stamm jedoch durch die Anwesenheit von Arabinose im Zellwandzucker: Kitasatosporia unterscheidet sich durch die Anwesenheit von LL- und meso-Diaminopimelinsäure in der Zellwand. Zusätzlich besitzt Kibdelosporangium einen hyphen-umhüllenden, sporangium-ähnlichen Körper mit einer echten Membran und Kitasatosporia bildet submerse Sporen. Derartige Strukturen werden beim Stamm L585-6 nicht beobachtet. Chemotaxonomisch sind Streptoalloteichus (Tomita et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 37:211-213, 1987), Actinosynnema (Hasegawa et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 28:304- 310, 1978) und Saccharothrix (Labeda et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 426-431, 1984) am meisten mit dem Stamm L585-6 verwandt. Actinosynnema bildet Luftsporenketten von der Spitze eines Synnema. Saccharothrix bildet Ketten fragmentierter kokkoider Elemente im vegatativen Mycel und Luftmycel und bildet keine Cluster verzweigter, kurzer Sporenketten oder sklerotischer Granula. Die Morphologie der Ketten der kokkoiden Elemente in Saccharothrix australiensis und S. aerocolonigenes (Labeda Int. J. Syst. Bacteriol. 36:109-110, 1986) ist der Morphologie von Nocardiopsis verwandt, sie ist jedoch nicht mit derjenigen einer Streptomyces-Spezies verwandt. Der Stamm L585-6 gehört demnach weder zu Actinosynnema noch zu Saccharothrix.
Streptoalloteichus hindustanus besitzt lange spiralenförmige Arthrosporen-Sporenketten, verzweigte kurze Sporenketten und sklerotische Granula im Luftmycel und einen dichten, kugelförmigen Hyphenkörper sowie einen kleinen, sporangium-ähnlichen Körper, der 1 bis 4 Sporen mit Flagellum umhüllt, im vegatativen Mycel. Der Stamm L 585-6 bildet alle der kleinen sporangium-ähnlichen Vesikel. Wie streptoalloteichus bildet der Stamm L585-6 einen ballonähnlichen Körper, der sich zu sklerotischen Granula entwickelt. Die Struktur wurde bei vielen Streptomyces- Spezies, wie S. kanamyceticus (Shirling et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 265-394, 1972) und S. roseiscleroticus (Chainia rubra) (Shirling et al., Int. J. Syst. Bacterial. 22: 265-394, 1972) beobachtet.
Aufgrund der obigen Vergleichsbetrachtungen wird der Stamm L585-6 als zum Genus Streptoalloteichus gehörend klassifiziert. Der Stamm L585-6 unterscheidet sich von Streptoalloteichus hindustanus dadurch, daß er kein Luftmycel auf den ISP-Medien Nr. 2, 3 und 4 und auf Bennett's- Agar bildet, kein Melanin bildet, Stärke nicht hydrolysiert, bei 41ºC nicht wächst und nur D-Ribose und D-Glukose von den 25 getesteten Zuckern verwertet. Der Stamm L585-6 ist demnach eine neue Spezies des Genus Streptoalloteichus.
Eine biologisch reine Kultur des Stammes L585-6, eine neue Spezies des Stammes streptoalloteichus, wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) hinterlegt und in die permanente Mikroorganismensammlung unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 53650 eingereiht.

Antibiotikumproduktion

Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum wird durch Kultivieren des Stammes L585-6 oder eines Mutanten davon unter submersen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium produziert. Der produzierende Organismus wird in einem Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Cerelose und Glycerin. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie Fischmehl, Hefeextrakt oder Anmoniumsalze. Falls erforderlich, werden anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate etc., zugegeben. Spurenelemente wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink etc. werden gewünschtenfalls zu dem Medium gegeben oder sie können als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums vorhanden sein. Die Inkubationstemperatur kann jede Temperatur sein, bei der der produzierende Stamm kultiviert werden kann, beispielsweise 18 bis 39ºC. Es ist jedoch bevorzugt, die Fermentation bei 25 bis 35ºC, insbesondere bei 27ºC bis 32ºC, vorzunehmen. Vorzugsweise arbeitet man bei einem neutralen pH des Mediums. Die Produktion des Antibiotikums wird im allgemeinen während eines Zeitraums von etwa 4 bis 8 Tagen durchgeführt. Üblicherweise erfolgt die optimale Produktion in etwa 5 bis 6 Tagen. Zur Herstellung relativ geringer Mengen des Antibiotikums kann man Schüttelkulturen oder Oberflächenkulturen verwenden, zur Herstellung größerer Mengen jedoch sind submerse aerobe Kulturen in sterilen Tanks bevorzugt. Wenn eine Tankfermentation durchgeführt wird, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe durch Inokulieren der Kulturbrühe mit Sporen des Mikroorganismus zu erzeugen und ,wenn man ein frisches, aktives vegetatives Inokulum erhalten hat, das Inokulum in das Fermentationstankmedium aseptisch zu transferieren. Weiter kann das Bewegen mit einem mechanischen Impeller-Rührer erfolgen. Antischaummittel, wie Schmalzöl oder Silikonöl, kann man falls erforderlich, zugeben.
Die Produktion des Antibiotikums Kedarcidin im Fermentationsmedium kann man während der Fermentation leicht mittels antimikrobieller Assays unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testorganismus oder mittels Zellcytotoxizitäts- Assay unter verwendung von Murin-(B16-F10) oder Human-Tumorzellinien (z.B. HCT-116, KB) leicht verfolgen.
Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung des besonders bevorzugten oben beschriebenen Stammes L585-6 oder eines Organismus, der der obigen Beschreibung entspricht, beschränkt. Die Erfindung umfaßt vielmehr auch andere Kedarcidinproduzierende Stämme oder Mutanten dieser Organismen, die anhand üblicher Methoden, wie Röntgenstrahlung, UV-Strahlung, Behandlung mit Stickstofflost, Phagenbehandlung und dergleichen produziert werden können.

Isolierung und Reinigung des Antibiotikums

Das erfindungsgemäße Antitumorprotein kann man aus der Fermentationsbrühe unter Verwendung herkömmlicher Methoden zur Proteinabtrennung gewinnen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, isoelektrische Präzipitation, Aussalzen, Elektrophorese, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie. Im allgemeinen verwendet man eine Kombination dieser Techniken um das Protein bis zur scheinbaren Homogenität zu reinigen. Die Isolierungs- und Reinigungsverfahren kann man verfolgen und steuern mittels mikrobiologischer Assays, wie B. subtilis-, in vitro- Cytotoxizitäts-Assays gegen Murin- oder Humankrebszelllinien, in vivo-Antitumorassays oder mittels physikalischer Methoden, wie UV- oder HPLC-Techniken. Das Schema I zeigt eine typische Folge von Isolierungs- und Reinigungsschritten. Diese Folge ist lediglich beispielhaft und es ist dem Fachmann klar, daß andere Methoden in gleicher Weise verwendet werden können, solange das Protein in hoher Reinheit unter Erhalt seiner biologischen Aktivitäten erhalten wird. SCHEMA I Isolierung und Reinigung des Proteins Fermentationsbrühe Mycel Filtrat Anionaustausch Puffer Eluens Puffer + 1M NaCl Gefiltration preparativer Anionenaustausch gereinigte Proteinlösung Lyopilisierung gereinigtes Protein
Gemäß Schema I wird die unlösliche Masse der gesamten Fermentationsbrühe unter Verwendung herkömmlicher Methoden, wie Zentrifugieren oder Filtrieren, ahgetrennt. Wenn die Brühe filtriert wird, kann man vorteilhafterweise eine Filterhilfe, wie Dicalit, verwenden. Das Filtrat wird dann einer Anionaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines kationischen Puffers im PH-Bereich von 7 bis 8 und anschließend des gleichen Puffers, der Natriumchlorid enthält, als Eluierungsmittel (Eluens) unterzogen. Ein geeigneter kationischer Puffer in diesem pH-Bereich ist: beispielsweise Tris-HCl. Die mit dem NaCl-enthaltenden Puffer eluierte Fraktion wird gesammelt, konzentriert und weiter mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung des gleichen kationischen Puffers gereinigt. Die Fraktionen werden gesammelt und auf die Anwesenheit der aktiven Komponente hin untersucht. Ein zweckmäßiges System zur Kontrolle des Eluats ist der Bacillus subtilis-Assay. Diejenigen Fraktionen, die Inhibitionszonen zeigen, werden vereinigt, konzentriert und weiter mittels Anionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines kationischen Puffers mit einem pH-Bereich von 7 bis 8 als Anfangslaufmittel und anschließend mit einem linearen Gradienten mit zunehmender Ionenstärke gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden mittels Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), isoelektrischer Fokussierung und HPLC-Techniken auf Homogenität untersucht. Die als homogen beurteilten Fraktionen werden zusammengegeben und lyophilisiert, wobei man das aktive Protein enthält.

Antibiotikum

Kedarcidin ist ein potentes Protein-Antitumor-Antibiotikum, das aus einer einzelnen Polypeptidkette und einem Nicht- Protein-Chromophor besteht. Obwohl Proben des Antibiotikums nach der physikalisch-chemischen Charakterisierung und nach biologischen Tests als homogen mittels SDS-PAGE, isoelektrischer Fokussierung und HPLC beurteilt wurden, hat sich während der Sequenzierungsversuche herausgestellt, daß das Antibiotikum aus einer Hauptkomponente und einer oder zwei Nebenkomponenten (Varianten) besteht. Die Varianten unterscheiden sich in der N-terminalen Aminosäuresequenz des Polypeptids, wie nachfolgend noch näher beschrieben wird. Die Trennung oder Isolierung der einzelnen Varianten ist hinsichtlich der Antitumoraktivität nicht erforderlich.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Varianten des Kedarcidins, bei denen der Peptidteil des Antibiotikums anhand bekannter Verfahren verändert sein kann, so daß man Fragmente oder Derivate davon erhält, beispielsweise durch Deletion, Addition oder Substitution bestimmter Aminosäuren entlang der Primärstruktur des Peptids ohne im wesentlichen die Antitumoraktivität des Antibiotikums zu ändern.

Aminosäurezusammensetzung

Unter Verwendung von Standardmethoden wurde die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Proteins ermittelt und in Tabelle VI angegeben. TABELLE VI Aminosäurezusammensetzung von Kedarcidin Ausbeute Reste
(a) Zahl der Reste pro Peptid unter Zugrundelegung eines Molekulargewichts von 12 000 für das Peptid
(b) Zahl der Reste pro Peptid unter Zugrundelegung von insgesamt 114 Resten. Die Werte in Klammern geben die Zahl der Reste pro Peptid an, bestimmt durch Aminosäuresequenzanalyse.

Aminosäuresequenz

Zur Analyse der Amino-terminalen Sequenz wurde Kedarcidin mit 2-Mercaptoethanol reduziert, weiter mit SDS-PAGE (15 % Acrylamid) gereinigt und aus dem Gel mittels Elektroelution oder Elektroblotting gewonnen.
Für die meisten enzymatischen Spaltungen wurde Kedarcidin ohne weitere Reinigung verwendet. Kedarcidin wurde mit 20 mM Dithiothreitol in 100 ul 0,4 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, enthaltend 6 M Guanidin HCl, 0,1 % Na&sub2;EDTA,2 h bei 50ºC reduziert und anschließend mit 100 mM 4-Vinylpyridin über Nacht bei Raumtemperatur S-pyridylethyliert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ul 2-Mercaptoethanol 1 h bei 50ºC gestoppt. Die Reagentien wurden durch 24-stündige Dialyse gegen 5 % (V/V) Essigsäure entfernt und das modifizierte Kedarcidin wurde anschließend in einem Speedvac-Zentrifugenkonzentrator (Savant Instruments) getrocknet.
Die enzymatische Spaltung des S-pyridylethylierten Kedarcidins mittels ASP-N-Enzym oder S. aureus V8-Protease erfolgte in 40 ul 0,1 M Tris-Essigsäurepuffer, pH 8,0, enthaltend 0,7 M Harnstoff, bei 37ºC über Nacht unter Verwendung eines Enzym-/Substratverhältnisses von 1:100 (ASP-N) oder 1:10 (V8-Protease). Die Trypsinverdauung erfolgte in 40 ul 0,1 M Tris-Essigsäurepuffer, pH 8,0 bei 37ºC über Nacht in einem Enzym-/Substratverhältnis von 1:20. Die enzymatischen Verdauungsansätze wurden mit Trifluoressigsäure (TFA) auf pH 2,0 angesäuert und mittels Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt.
Die Peptidreinigung durch Umkehrphasen-HPLC erfolgte mit einem Trennsystem Modell 130A (Applied Biosystems Inc.) und wurde bei 40ºC an einer RP-300-Säule (2,1 x 100 mm, Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt. Zur Elution wurden lineare Acetonitrilgradienten, bestehend aus 0,1%-iger TFA in Wasser als Startpuffer und 60 % Acetonitril, enthaltend 0,085 % TFA,als Endpuffer verwendet. Die Peptide wurden manuell gesammelt. Die Aminosäuresequenzbestimmungen erfolgten mit einer automatischen Aminosäuresequenzvorrichtung (Modell 475A, Applied Biosystems Inc.) unter Verwendung von Standardmethoden.
Die Polypeptid-Hauptkomponente besteht aus 114 Aminosäureresten. Die Aminosäuresequenz ist folgendermaßen: Terminus
Es wurden zwei Nebenkomponenten identifiziert. Einer davon fehlt das erste Alanin der Hauptkomponente und der zweiten fehlen die beiden ersten Aminosäuren, d.h. Alanin und Serin der Hauptkomponente.

Molekulargewichtsbestimmung

(a) Gelfiltrations-/HPLC-Methode

Die Gelfiltration erfolgt unter Anwendung einer TSK-G200 SW-Säule (7,5 x 300 mm)(LKB-Produkter AB, Schweden) und unter Anwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer, der 0,5 M NaCl (pH 7,4) enthält, bei einer Fließrate von 0,5 ml/Min. Alternativ kann man eine Waters Associates Proteinanalysensäule 1-125 unter Anwendung von 0,2 M Tris- Acetat als Eluierungsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. verwenden. Die Bestimmung des Molekulargewichts ergibt einen Wert von 17 000 Daltons aus der Vergleichskurve, die mit Standard-Molekulargewichtsmarkern (Bio Laboratories) erhalten wurde.

b) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese- Methode

Eine Probe des Proteins und Molekulargewichtsmarker (bezogen von Diversified Biotech, Maine) werden mit einem gleichen Volumen Seprasol (gebrauchsfertige Proteinsolubilisierungsflüssigkeit, die Sukrose und einen Identifizierungsfarbstoff enthält) vermischt und 3 Min. bei 90ºC unmittelbar vor der Elektrophorese erhitzt. Die Elektrophorese erfolgt bei 300 V in Seprabuff (Trisglycin-SDS, pH 8,5) bis der Identifizierungsfarbstoff den Boden des Gels erreicht hat. Das Gel wird dann wenigstens 10 h in eine Färbelösung eingetaucht (1,25 g Comassie BB R-250, 92 ml Eisessig in 908 ml wäßrigem Methanol) und anschließend in eine Entfärbungslösung (75 ml Essigsäure und 50 ml Methanol in 875 ml Wasser) eingetaucht, bis der Hintergrund des Gels transparent wird. Seprasol und Seprabuff wurden von Integrated Separation System, Massachusetts, bezogen. Die Molekulargewichtsbestimmung mit dieser Methode ergibt einen Wert von 12 400 Daltons.

Isoelektrische Fokussierung

Das für die Fokussierung verwendete Gel wird hergestellt durch Vermischen folgender Bestandteile:
29,1 % Acrylamid in Wasser 10 ml
0,9 % N,N'-Methylen-bis-acrylamid in Wasser 10 ml
Glycerin 7 ml
1802 Ampholin, pH 2,5 bis 4 3 ml
Wasser auf 60 ml
Die erhaltene Lösung wird 10 Min. entgast und anschließend gibt man 1,5 ml 1%iges Ammoniumpersulfat in Wasser und 10 ul N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin zu. Man gießt die Mischung in eine Gießform und läßt polymerisieren. Die verwendeten Elektrodenlösungen sind 1 M Phosphorsäure an der Anode und 2 % 1809 Ampholine pH 6 - 8 an der Kathode. Die Fokussierungerfolgt 2 h mit konstanter Stromversorgung von 25 W. Die Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozent im Volumen. Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes ergab einen Wert von 3,65 und die Laufstrecke von der Kathode beträgt 6,25 cm.

Biologische Aktivität

Die Antitumoraktivität des Proteins wurde gegenüber transplantierbarer Murin-P388-Leukämie bestimmt. 10&sup6; P388- Leukämiezellen, erhalten von DBA/2-Donormäusen mit transplantierbarer Murinleukämie, wurden CDF&sub1;-Mäusen intraperitoneal (ip) oder intravenös (iv) implantiert. Gegen ip-implantierte 388-Leukämie wurden die Mäuse ip entweder mit Saline (Kontrolltiere) oder mit Kedarcidindosen 1 x täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen behandelt, wobei nach einem Tag nach der Tumorinokulation begonnen wurde. Gegen iv-implantierte P388-Leukämie erhielten die Mäuse Kedarcidin iv an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Implantation. Die Tiere wurden täglich beobachtet und der Todestag wurde registriert. Die Änderung des mittleren Körpergewichts (von Tag der Leukämieimplantation bis zum Tag der letzten Behandlung) wurde für alle Gruppen als Mittel zur Bewertung der Toxizität des Arzneimittels herangezogen.
Die Zahl der lebenden Mäuse in jeder Gruppe am 5. Tag nach der Tumorimplantation wurde als zusätzliches Mittel zur Bewertung der Toxizität des Arzneimittels herangezogen. Wenn mehr als 5 Mäuse pro Behandlungsgruppe am 5. Tag gestorben waren, wurde das Ergebnis als tnerapeutisch nicht brauchbar betrachtet. Die behandelten Gruppen bestanden aus 4 oder 6 Mäusen: die Kontrollgruppen umfaßten 10 Mäuse. Die Zahl der gegebenenfalls am 30. Tag (dem letzten Tag der Versuche) überlebenden Mäuse wurden ebenfalls registriert. Am Ende der Versuche wurde die mittlere Überlebenszeit (MST) für jede Gruppe bestimmt und dazu verwendet, % T/C, das das Verhältnis der MST einer behandelten Gruppe zu der MST der Kontrollgruppe, multipliziert mit 100 ist, berechnet. Ein % T/C-Wert von 125 oder mehr bedeutet eine signifikante Antitumoraktivität. Die in vivo-Daten sind in den Tabellen IV und V zusammengestellt. TABELLE IV Antitumoraktivität gegen ip-implantierte P388-Leukämie Lot Dosis a) Verdünnung od.mg/kg/inj. Mittl. Überlebenszeit Mittl. Gewichtsveränderung Zahl der lebenden Mäuse am 5.Tag Kontrolle a) Das Arzneimittel wurde ip 1 x täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, beginnend 1 Tag nach der Tumorinokulation b) Lyophilisiertes und rekonstituiertes Präparat der Probe DI8F4I3. TABELLE V Antitumoraktivität gegenüber iv-implantierte P388-Leukämie Dosis a) /Verdünnung od mg/kg/Inj. Mittl. Überlebenszeit Mittl. Gewichtsveränderung Zahl der lebenden Mäuse am 5. Tag Control a) Das Arzneimittel wurde iv am Tag 1, 3 und 5 nach der Tumorimplantation verabreicht
Kedarcidin wurde auch gegenüber Murin-B16-Melanom bewertet, das intraperitoneal mit 0,5 ml eines 10%-igen Tumorbreis implantiert wurde. Für jede Dosis wurden 10 Mäuse verwendet. Das Arzneimittel wurde intraperitoneal 1 x täglich an neun aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, beginnend 1 Tag nach Tumorimplantation. Die Zahl der am Tag 10 und am Ende der Versuche, d.h. am Tag 60, lebenden Mäuse wurde registriert. Die Testergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. %/T/C-Werte von 125 oder mehr bedeuten signifikante Antitumoraktivität. TABELLE VI Antitumoraktivität von Kedarcidin gegenüber ip-implantiertes B16-Melanom Dosis (mg/kg/Dosis) Mittlere Gewichtsveränderung Zahl der lebenden Mäuse am 5. Tag (60)* Kontrolle *Zahl in Klammern = Zahl der am Tag 60 nach der Tumorimplantation lebenden Mäuse
Die in den Tabellen IV, V und VI zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß das Antibiotikum Kedarcidin eine wirksame Substanz mit reproduzierbarer in vivo-Antitumoraktivität gegenüber Murinleukämie P388 und B16-Melanom ist. Die beobachtete Aktivität manifestiert sich in einer Erhöhung der Lebensdauer der Versuchstiere gegenüber ip-implantiertes B16-Melanom und gegenüber ip- und iv-implantierte P388- Leukämie, wobei letztere aufgrund ihrer disseminierenden Natur eine schwieriger zu behandelnde Erkrankung ist. Kedarcidin wurde auch gegenüber subkutan implantiertes B16- Melanom, M5076-Murin-Lungentumor und intrakranial-implantierte P388-Leukämie getestet, es zeigte jedoch keine signifikante Aktivität bei diesen Tiermodellen.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel, die eine wirksame Tumor-inhibierende Menge des erfindungsgemäßen Antibiotikums in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Derartige Mittel können auch weitere aktive Antitumormittel enthalten und in einer für die gewünschte Verabreichungsart geeigneten pharmzeutischen Zubereitungsform vorliegen. Beispiele derartiger Formen sind feste Mittel zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granula, flüssige Mittel zur oralen Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form eines sterilen festen Mittels vorliegen, das in sterilem Wasser, physiologischer Saline oder anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor Gebrauch gelöst werden kann.
Die optimalen Dosierungen und Behandlungspläne für die Anwendung des erfindungsgemäßen Antibiotikums als Antitumormittel bei Säugetieren (einschließlich des Menschen) können vom Fachmann leicht bestimmt werden. Dabei hängt die tatsächlich verabreichte Dosis von der betreffenden Formulierung, der Verabreichungsart und dem Situs, Wirt und der zu behandelnden Erkrankung ab. Viele Faktoren, die die Wirkung des Arzneimittels modifizieren, sind zu berücksichtigen, wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeit, Verabreichungsart, Exkretionsrate, Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Arzneimittelempfindlichkeit und Schwere der Erkrankung.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen.

Anwendungsbeispiele

Beispiel 1

Herstellung einer vegetativen Kultur des Streptoalloteichus- Stammes L585-6

Streptoalloteichus sp. Stamm L585-6 (ATCC 53650) wird in Reagensgläsern auf Hefe-Malzextrakt-Agar übertragen, der besteht aus:
Dextrose 4,0 g
Hefeextrakt 4,0 g
Malzextrakt 10,0 g
CaCO&sub3; 1,5 g
Agar 15 g
destilliertes Wasser 1 l
Der Schrägagar wird zwei Wochen bei 28ºC inkubiert. Man stellt eine vegetative Kultur her durch Transferieren des Oberflächenwachstums der Schrägkultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen Mediums enthält, das besteht aus:
Cerelose (Corn Products) 30 g
Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.) 10 g
Nutrisoy (Archer Daniels Midland Co.) 10 g
CaCO&sub3; 3g
destilliertes Wasser auf 1 l
Die vegetative Kultur wird 72 h bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 250 Upm inkubiert.

Beispiel 2

Fermentation im Schüttelkolben

5 ml der vegetativen Kultur des Beispiels 1 werden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der 100 ml eines Produktionsmediums enthält, das besteht aus:
Glycerin 30 g
Pharmamedia 10 g
Distiller's solubles (Nutrition Products Co.) 15 g
Fischmehl 10 g
CaCO&sub3; 6g
destilliertes Wasser auf 1 l
Die Produktionskultur wird bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 250 Upm inkubiert. Die Produktion des Proteinantibiotikums wird mit einem mikrobiellen Assay unter Anwendung von B. subtilis und einem in vitro Cytotoxizitätsassay unter Anwendung der Murin-Melanomzellinie B16-F10 und unter Anwendung von Human-Tumorzellinien verfolgt. Die optimale Produktion wird im allgemeinen nach 144 bis 168 h erreicht.

Beispiel 3

Tankfermentation

25 ml der vegetativen Kultur des Beispiels 1 inokuliert man in eine 2 l Vitroflasche, die 500 ml des gleichen vegetativen Mediums enthält. Die Saatkultur der 2. Stufe wird weiter 72 h bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 250 upm inkubiert. 500 ml der Saatkultur werden in einen New Brunswick Microgen-Fermenter (16 l Nennvolumen) inokuliert, der 10 l des Produktionsmediums mit der im Beispiel 2 gegebenen Zusammensetzung enthält. Die Fermentation wird bei 28ºC, einer Belüftung von 1 Volumen pro Min. und unter Rühren bei 250 Upm durchgeführt. Die Produktion des Antibiotikums Kedarcidin wird mit den geeigneten in vitro-Bioassays verfolgt.

Beispiel 4

Isolierung und Reinigung von Kedarcidin

Man vermischt 10 l der rohen Fermentationsbrühe mit 6 l Dicalit und filtriert die erhaltene Aufschlämmung über eine Dicalitschicht. Die unlöslichen Bestandteile werden verworfen und das Filtrat wird durch eine Zeta Prep 250 QAE-Ionenaustauschersäule (LKB-Produkter AB, Schweden) bei einer Rate von 30 ml/Min. gepumpt. Die Säule wurde vorher mit 2 l 50 mM Tris-HCl-Puffer, PH 7,4, äquilibriert. Die abfließende Flüssigkeit wird gesammelt. Die Säule wird mit 1 l 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 gewaschen und anschließend mit 500 ml 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,5 Mol NaCl, eluiert. Das Eluat wird gesammelt und von 500 ml auf 100 ml unter Anwendung einer Amicon-Standard-Ultrafiltrationszelle, die mit einer Amicon-YM 5-Membran ausgerüstet ist, konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird in eine Gelfiltrationssäule (5 x 100 cm), die mit 1400 ml Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter Ab, Schweden) in einem gleichen Volumen 50 mM Tris-HCl-Puffer gefüllt ist, perkoliert. Das Ultrogel-Bett wurde vorher mit 5 l 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,4 äquilibriert. Die beschickte Säule wird mit 2 l 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, mit 60 ml/Min. eluiert. Nach einem ersten Aliquot von 450 ml, werden 10 ml Fraktionen gesammelt und jede Fraktion wird gegen B. subtilis getestet. Diejenigen Praktionen, die Inhibitionszonen (Fraktionen 83 bis 133) ergeben, werden vereinigt und anschließend auf 100 ml mittels Ultrafiltration konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird in eine Ionenaustauschersäule (2,5 x 15 cm) perkuliert, die mit einer Aufschlämmung von 70 ml DEAE Trisacryl (LKB- Produkter AB, Schweden) im gleichen Volumen 50 mM Tris- HCl-Puffer gefüllt ist. Das Trisacryl-Bett wurde vorher mit 10 Säulenvolumina 50 mM Tris-HCl-Puffer äquilibriert. Die beschickte Säule wird zuerst mit 10 Säulenvolumina 50 mM Tris-HCl-Puffer und anschließend mit 300 ml eines linearen Gradienten (Steigung = 0,1 M/h) eluiert. Aus 100 % Tris-HCl- Puffer bis 100 % 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/h eluiert. Es werden insgesamt 47 5 ml Fraktionen gesammelt und gegen B. subtilis getestet. Die aktiven Fraktionen 25 bis 37 werden vereinigt und einer analytischen Gelfiltration/HPLC unter Verwendung einer Waters Protein Analysensäule 1-125, 0,2 M Tris-Acetat, pH 7,0 bei einer Fließrate von 1 ml/Min. als Eluierungsmittel und unter Verwendung eines UV-Detektors bei 260 nm unterzogen. Unter diesen Bedingungen zeigt das Chromatogram einen einzelnen Peak bei einer Retentionszeit von 8,3 Min. Die vereinigten Fraktionen erweisen nach Untersuchung mittels isoelektrischer Fokusierung und SDS-PAGE unter den oben angegebenen Bedingungen als homogen. Die Konzentration der aktiven Komponente wird zu 4,25 mg/ml durch Lyophilisierung eines 10 ml Aliquots und Korrektur auf das Puffergewicht bestimmt.

Claims

1. Antibiotikum Kedarcidin mit folgenden Charakeristika:

(a) Aussehen: lederfarbener Feststoff;

(b) Molekulargewicht: 12.400 Dalton mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren; 17.000 Dalton mittels Gelfiltration/HPLC-Verfahren;

(c) UV-Spektrum: im wesentlichen wie in Fig.1 gezeigt;

(d) isoelektrischer Punkt 3,65; und

(e) umfassend ein Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:

worin X ausgewählt ist unter H-ala-ser, H-ser und H.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Kedarcidin, wobei man einen Kedarcidin-produzierenden Streptoalloteichus-Stamm in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, und das Antibiotikum aus der Kulturbrühe gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der produzierende Stamm der Stamm L585-6, ATCC 53650, ist.

4. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus streptoalloteichus sp. nov., Stamm L585-6, ATCC 53650.

5. Pharmazeutisches Mittel, das eine Tumor-inhibierende Menge an Kedarcidin und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.

6. Verwendung von Kedarcidin zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Inhibierung des Tumor- Wachstums in einem Säuger-Wirt.

7. Antibiotikum Kedarcidin, hergestellt durch ein Verfahren, wobei man

a. einen Kedarcidin-produzierenden Streptoalloteichus- Stamm in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert; und

b. das Antibiotikum aus der Kulturbrühe gewinnt.

8. Antibiotikum Kedarcidin, hergestellt durch das Verfahren des Anspruchs 7, wobei der produzierende Stamm der Stamm L585-6, ATCC 53650, ist.