DD210307A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums a53868 faktor a und von derivaten hiervon - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung des Faktors A von A 53868, naemlich von N- hoch 2-Glycyl-N-(1-methylen-2-phosphonomethyl)leuciamid und von Derivaten dieser Verbindung an der Amidgruppe und an der Phosphonogruppe durch uebliche Zuechtungen von Streptomyces luridus NRRL 15101 oder einer den Faktor A von A53868 bildenden Mutante oder Rekombinante hiervon und gegebenenfalls anschliessende Umsetzung dieser Verbindung mit Leucinaminopeptidase oder durch selektive saure Hydrolyse unter nachfolgender herkoemmlicherLoesungsphasenpeptidsynthese und Bildung von an der Amidgruppe und/oder der Phosphonogruppe substituierten Derivaten. Die so erhaltenen Verbindungen stellen neue Antibiotika dar und eignen sich ferner auch als immunmodulierende Mittel.

Description

Aktenzeichen: AP C 12 P/255 126/4 X-5847M

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A53868 Faktor A und von Derivaten hiervon

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfharen zur Herstellung § des neuen Antibiotikums A53868 Faktor A und von Derivaten hiervon, und diese Verbindungen sind^;hochwirksame imrnunmodulierende Mittel. .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Auf-, 2Q gäbe der Erfindung: .

Es besteht ständig, Bedarf an, neuen ,und. verbesserten·· Antibiotika. Antibiotika mit verbesserter Wirksamkeit werden sowohl zur Behandlung von Erkrankungen beim Menschen als auch auf dem Gebiet der Veterinärmedizin benötigt. Einige der Zielsetzungen" für verbesserte Antibiotika sind eine erhöhte Wirkungsstärke, ein breiteres Hemmspektrum gegenüber Bakterien, eine erhöhte Wirksamkeit in vivo und ein verbessertes pharmakologisches Verhalten, wie eine stärkere orale Absorption, eine höhere Konzentration im Blut oder im Gewebe, eine längere Halbwertszeit im Körper, eine günstigere Ausscheidungsgeschwindigkeit und ein zweckmäßigerer Ausscheidungsweg sowie eine günstigere Stoffwechselgeschwindigkeit und ein besseres Stoffwechselmuster.

Das Abwehrsystem des Körpers (Immunsystem) ist äußerst

26,JaH

komplex, und ein Verständnis seines Mechanismus ist daher ein wichtiges Ziel. Die Kenntnisse auf diesem Gebiet haben sich in den vergangenen 10 Jahren zwar rasch erweitert, doch bleibt immer noch viel zu lernen' übrig. Makro-5

phagen spielen eine wichtige Rolle im Immunsystem. Diese Zellen sind sowohl phagozytisch (sie "können mikrobielle Zellen verdauen und abtöten) als auch sekretorisch (sie setzen chemische Signale frei, die sich durch den Körper verteilen). Makrophagen können mehr als 50 destruktive oder instruktive sekretorische Produkte tragen oder wenigstens bilden und sind gelegentlich auch zu einer vollständigen 'Zerstörung von Tumorzellen befähigt. Immunmodulierende Mittel, deren Wirkung-auf einer Aktivierung von Makrophagenzellen beruht, sind daher ziemlich wertvoll. . .

Zum Stand der Technik über Immunmodulatoren wird hingewiesen auf H. Umegawa, Recent Studies on Antibiotics and Small !Molecular. Immunomodulators with; Potential Usefulness in Treating Lung Cancer: Part II—Small Molecular Weight ^O Immunomodulators Produced by Microorganisms, in .Inter. J. Clin. .Pharmacol. Ther-. and .Toxicol . 20(1), 19 bis; 23 (1982) .

In US-PS 4 331 591 wird ein chemisches Verfahren;zur Herstellung von Peptidderivaten aus bestimmten. (X-Aminophosphonsäuren beschrieben'. Diese.- Derivate· verstärken die Wirksamkeit von Antibiotika, wie Penicillin, Cephalosporinen und D-Cyoloserin. Die darin angeführten.Verbindungen unterscheiden sich jedoch sowohl strukturell als auch wirkungsmäßig von den vorliegenden Verbindungen.

Die bekannten Antibiotika sind in der einen oder anderen Hinsicht immer noch verbesserungsbedürftig, und Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung neuer Antibiotika _mit verbesserter Wirksamkeit.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun durch die im folgenden angegebenen neuen Verbindungen und Verfahren zu.ihrer Herstellung gelöst. Hierbei handelt es sich entweder um das' Antibiotikum A53868 Faktor A oder Derivate hiervon.

Das Antibiotikum A53868 Faktor A, das die Verbindung N -GIy-• cyl-N-{l-methylen-2-phosphonoethyl)leucinamxd ist, hat die Formel I . Chis

CHe—P-OH. Ö OHa OH

CH3 CHa

Dieses'" -Antibiotikum' A53868 Faktor A ist ein neuer Vertreter aus einer Gruppe von Phosphonopeptidantibiotika. Zu Vertretern dieser Antibiotikagruppe gehören Alafosfalin (L-Alany1- L-I-amirioethy !phosphorsäure), (siehe Antimicrobial Agents and Chemotherapy¹ 18(6), 897 bis 905 (1980) ) , FR-31564" ("siehe Antimicrobial Agents and Chemotherapy 19(6)/ 1013 bis 10 23 (19'8I)) und andere-Verbindungen (siehe EP-PS 26409 und EP-PS 26410 sowie JP-PS J5 6051-494 und' JP-PS J5 6156-294).

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen haben (unter Einschluß der Verbindung der obigen Formel I) die Formel II

CH₂ 0 -WH-CH-CC-NH-C-CHa-P-OR²

ή ^r- ι (id

Z' . OH₂ QR³

Jx

worin

R für die charakteristische Gruppe einer (^-Aminosäure der Art steht, wie sie normalerweise in Proteinen zu finden ist,

und :

kyl sind,

2 3

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder C,-C,-Al-

- 4 -

Z Wasserstoff, C₁-C,--Alkyl, C, -C-.-Alkanoyl , Phenyl-C,-C₃-

Ib Xb 1 j

alkyl, Phenyl-(X) -C,-C,-alkanoyl oder eine

schutzgruppe bedeutet, Z' Wasserstoff oder C,-C,-Alkyl ist, X Sauerstoff oder Schwefel darstellt, m für 0 oder 1 steht und.

η für 0, 1, 2 oder 3 steht,

2 mit der Maßgabe, daß R und R

sie beide für Alkyl stehen, oder sind Salze hiervon.

2 3

mit der Maßgabe, daß R und R identisch sein müssen, falls

Die Verbindung der Formel II, worin η für 1 steht und R ,

2 3

R , R , Z und Z^f jeweils Wasserstoff sind, entspricht der Verbindung der obigen Formel I.

^-5 Bei¹ einer· bevorzugten- Gruppe-von Verbindungen der-Formel II steht Z' für Alkyl, wobei Z ebenfalls Alkyl- sein muß.

Sine- weitere bevorzugte Gruppe von- Verbindungen der Formel II. sind Derivate der Verbindungen- der: Formel I mit de'r Formel Ha:' ' '

R CH₂ O

(Ha)

2'

· ·

CHo- ^NCH3

worin

R für die charakteristische Gruppe einer Ci-Aminosäure der-Art steht¹, wie sie normalerweise in- Proteinen zu

finden ist, .

2 3

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder C,-C-,-

Älkyl sind,

Z Wasserstoff, C-Cg-Alkyl, C,-C_g-Alkanoyl, Phenyl-C,-C, · alkyl, Phenyl-(X) -C₁ -C-.-alkanoyl oder eine Amino-

. m 1 3

schutzgruppe bedeutet, Z' Wasserstoff oder C-Cg-Alkyl ist,

r Π C\

^ X Sauerstoff oder Schwefel darstellt, m für 0 oder 1 steht und

η für 0, 1, 2 oder 3 steht,

2 3 mit den Maßgaben, daß R und R identisch sein müssen, falls sie beide für Alkyl stehen, und einer der Substituen-

12 3

ten R , R , R , Z oder Z' eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben muß, falls η für 1 steht, oder die Salze hiervon.

Die Verbindungen der Formel II eignen sich als Antibiotika und/oder als Zwischenprodukte für Antibiotika. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel II oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon enthalten, werden daher zur Behandlung bestimmter Infektionen verwendet. Weiter eignen sich diese Verbindungen auch zur ,Regulierung des Immunsystems, da sie Makropha.genzellen aktivieren.

Das Antibiotikum A53868 Faktor A (Verbindung der Formel I) 2.0: wird, dadurch hergestellt, daß man Streptomyces luridus NR.RL·,, 15j1 0,1,. oder eine Mut ante oder Rekcnbinanre hiervon, die A53868 Faktor A bildet, in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen ' so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet ist..

.ή /. \Λ Λ hMM,l

Das Antibiotikum A53868 Faktor A läßt sich aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Techniken isolieren. Durch weitere Umsetzung des Produkts der Formel I nach herkömmlichen Techniken ergeben sich die Verbindungen der obigen Formel Ha. Zu diesen Techniken gehören folgende:

Eine Derivatisierung einer Verbindung der Formel JIa, worin wenigstens einer der S' für Wasserstoff steht.

2 3 wenigstens einer der Substituenten R , R , Z oder Z' nicht

Eine Umsetzung einer Verbindung der Formel I durch Lösungsphasenpeptidsynth.ese zu Verbindungen der Formel Ha, worin R Wasserstoff ist und Z oder. Z' nicht Wasserstoff bedeutet.

Eine Umsetzung einer Verbindung der Formel.I mit Leucinaminopeptidase oder durch selektive saure Hydrolyse; unter anschließender herkömmlicher Lösungsphasenpeptidsynthese zu Verbindungen- der obigen Formel Ha. 20

In. dieser Beschreibung werden' die folgenden Abkürzungen verwendet, von denen die meisten wohlbekannt sind:

AIa = Alanin

Arg = Arginin

Asp == Asparaginsäure

Asx" = Asparagin oder Asparaginsäure

Cys = Cystein

GIn = Glutamin ' .

GIu = Glutaminsäure

GIx = Glutamin oder Glutaminsäure

GIy = Glycin

Hse = Homoserin

He = Isoleucin '

Leu = Leucin

Lys = Lysin

Met = Methionin

Nie = Norleucin

Nva = Norvalin

Pro = Prolin

Phe = Phenylalanin

Ser = Serin

Thr = Threonin

T.rp = Tryptophan

Tyr = Tyrosin

VaI = Valin 10

Die Abkürzung LAPP (für Leucylaminopropenyljohosphonat) wird für den folgenden Rest IV verwendet, der den Verbindungen der Formeln I und II gemeinsam ist und die folgende Formel hat 1.5.

(IV).

A.

worin R- und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder

2 """ C, -C^-Alkyl sind,- mit der Maßgabe, daß R und R identisch sein müssen, falls sie beide für Alkyl stehen.

Die erfindungsgemäßen· Verbindungen können durc'h. die folgende Formel Hb dargestellt werden

'-fM--W — a____, =- (lib-)'

i- ρ;·!—-^n-υυτ; Lftr"r

' Z'

worin LÄPP der obigen Formel IV entspricht, R für die charakteristische Gruppe einer ex-Aminosäure der Art steht, wie sie normalerweise in Proteinen zu

finden ist, Z Wasserstoff, C, -C_g-Alkyl, C, -Cg-Alkanoyl, Phenyl-C-,-C-,-

alkyl, Phenyl-(X) -C,-C,-alkanoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,

Z' Wasserstoff oder C₁-C,-Alkyl ist,

1 b

X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet,

m für 0 oder 1 steht und

η für .0, 1, 2 oder 3 steht, oder sind Salze hiervon.

Unter einer charakteristischen Gruppe-einer c-Aminosäure der Art, wie -sie- normalerweise · in "Proteinen- zu finden' ist, wird der Rest R in einer natürlichen ex-Aminosäure der all-

*N ·

.j gemeinen Formel

HN -. CH - COOH 15- : &

verstanden, wie er normalerweise' in Proteinen vorkommt. Beispiele'für solche Aminosäuren und die entsprechenden; Gruppen- R--' sind-Alanin- (R' = Methyl), Leucin- (R- = Isobutyl), Glutaminsäure (R = 2-Carboxyethyl). Zusätzlich kann R auch; ein an das'' Aminostickstoffatom ( unter - gleichzeitigem Verlust eines der an das Stickstoffatom gebundenen Wasserstoffatome) gebundener Rest sein, so daß ein stickstoffhaltiger Ring gebildet wird, wie er beispielsweise im s 25 Prolin vorkommt.

Unter den hierin verwendeten ' Angaben C, -C-.-Alkyl und C,-C,-AlkyT werden geraäkettige-oder¹ verzweigtkettige Alky!gruppen verstanden, die 1 bis- 6 Kohlenstoffatome oder 1 bis 3 Kohlenstoff atome enthalten'. Zu solchen Gruppen gehören Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Butyl, s-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl und dergleichen.

Unter der hierin verwendeten Angabe C,-C,.-Alkanoyl wird ein Acylrest verstanden, der von einer Carbonsäure abgeleitet ist, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. In einem solchen Rest kann die Älkylgruppe geradkettig, verzweigt-

kettig oder cyclisch sein. Beispiele für solche Gruppen sind Acetyl, Propionyl, n-Butyryl, Isobutyryl, n-Valeryl und Isovaleryl.

'

Die Angaben Phenyl-C·,-C-j-alkyl und Phenyl-(X) -C-.-C-.-alkanoyl beziehen sich auf Gruppen wie Benzyl, Phenethyl, Benzoyl, Phenylacetyl, Phenylpropionyl, Phenoxyacetyl und Phenylthioacetyl.

Die Angabe Aminoschutzgruppe ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind zu finden in Protective Groups in Organic Synthesis von Theodora W. Greene, John Wiley, and Sons, New York, 1981, Kapitel 7.

•^' Das Ar. "ci£>i ot χ-ι. u τ rSZS^Q J¹ a ^l. or _Λ ib. αϊ Vertreter aus einein Antibiotiikumkomplex, der nehr als einen Faktor enthält. Der Komplex von A53868 enthält überwiegend den Faktor A und andere, bisher noch, nicht charakterisierte Faktoren.

^:Die/ in^: der Fermentatiöns^!techhik^: 'und' in diener''B'e*§cnre'ibüng· verwendete. Angäbe Kömplex bezieht sich auf ein; Geiniseh aus gleichzeitig gebildeten einzelnen antibiotischen Faktoren. Anzahl und Verhältnis der gebildeten einzelnen Faktoren in einem antibiotischen Komplex schwanken selbstverständlich in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen, wie dies dem mit der fermentativen Herstellung von Antiobiotika vertrauten Fachmann geläufig ist. Im Komplex von A53868ist der Faktor A der überwiegende Faktor.

iiv'deh folgenden Abschnitten werden" die Eigenschaften des Faktors A von A53868 beschrieben. '

Der Faktor A von A53868 ist ein farbloses amorphes Material, das die empirische Formel C₁₁B₉₉N-O^ 3,5;.y Mpl;ekulargewicht von..,.etwa_;-307. aufweist. ..Ein.e lyse des Faktors A von A5 38 6 8 zeigt, daß dieser die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung hat:

- 10 Gefunden · Berechnet für

	Probe I	Probe Ii	,74
Kohlenstoff	41,32	38	,78
Wasserstoff	7,61	6	,42
Stickstoff	11,53	12	-
Sauerstoff	24,3 8		,70
Phosphor	-	7	_
Asche*	13,58

.40,12 6,43 12,76 24,30 9,41

Asche* 13,58

* Bei der Asche handelt es sich einer Untersuchung zufolge um Phosphat

Eine Massenspektrometrie des Faktors A von A53868 mittels Bombadement mit schnellen Atomen führt, zu folgenden. Ergebnissen: ;

m/Z HRMS Elementarzusammensetzung

M+H' 308- 308,13818 . ^Cll^H23^N3°5ⁱ' 143 143,11878 C₇H₁₅N₂O

C₃H₉NO₃P-

Molekulargewicht = 3 07 Molekularformel = ^CH^H22^N3°5^P

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Faktors A von A53868 (freie Säure) ' in einem* KBr^-PeIiet geht aus der Zeichnung hervor. Darin lassen sich signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ~) feststellen:"

3368, 3312, und 3300 ^:(breit, stark), 3063 (schwach), 2966 (mittel bis schwach), 2833 (sehr schwach), 2663 (schwach), 1671 (stark), 1625 (Schulter), 1536 (stark), 1469 (schwach), 1442 (schwach), 1386 (mitt§l bis schwach), 1340 (sehr schwach), 1277 (sehr schwach), 1240 (Schulter), 1207 (stark), 1157 (sehr schwach), 1068 (mittel), 1048. (stark), 918 (mittel bis schwach), 797 (mittel), 778 (mittel) und 6 25 (schwach).

308	3	08	,1	381	8
143	1	43	, J-	187	8
Γ38-	1	38	,0	324	0

Aininosäureanalysen von Proben des Faktors A von A53868, die mit 6n HCl hydrolysiert worden sind, führen zu folgenden Ergebnissen:

μΜοΙ/mg Aminosäure Gefunden Berechnet Mittlere prozentuale -^ -'· ^;: ' · . . - ,:^; .' ':·. :. ' ;^: / · " -Reinheit '

Glycin 2,8 3,2 87 .%

Leucin 2,86 3,2 87 %

Eine elektrometrische Titration des Faktors A von A53868 in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt die Anwesenhe'it einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von 8,2 (nämlich der Glycylaminogruppe).

Der Faktor A von A53868 ist löslich .in,Wasser, uhd^Dimethylsulfoxid und unlöslich in den meisten,,organ_:isc.hen .Lösungsmitteln.

Eine magnetische Kernresonanzspektrometrie des Faktors A von' A53868 unter Einsatz eines 360 MHz-Instrument3 und einer in DMSO-d, gelösten Probe zeigt, daß der Fak~o^v, A vm A53868 die in obiger Formel I gezeigte Struktur hat..

Die Verbindungen"-der Formeln I and II sind zur Bildung von Salzen befähigt, die ebenfalls Teil dieser Erfindung sind. Die Verbindungen der Formeln I und IT haben, wie ersichtlich, sowohl eine saure Funktion, die Salze bilden kann, als auch eine Aminogruppe, die zur Bildung von Säureadditionssalzen befähigt ist. Solche Salze eignen sich bei-QQ spielsweise zur Abtrennung und Reinigung der Antibiotika. Ferner sind pharmazeutisch annehmbare Salze besonders brauchbar.

Pharmazeutisch annehmbare Alkalimetallsalze, Erdalkaliine- ^g tall salze und Aminsalze sowie Säureädditionssalze sind besonder S" gut brauchbar.- Z"ü beispielsmäßigen und geeigneten Alkalimetallsalzen sowie -Erdalkalimetallsalzen gehören die Salze, von Natrium, Kalium, Lithium, Caesium, Rubidium, Ba-

rium, Calcium und Magnesium. Zu geeigneten Aminsalzen gehören die Ammoniumsalze sowie die primären, sekundären und tertiären C,-C.-Alkylammoniumsalze und Hydroxy-C^-C^-alkyl-

ammoniumsalze. Zu beispielsmäßigen Aminsalzen gehören die 5

Salze, die durch Umsetzung einer Verbindung der Formel II mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, s-Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Cyclohexylamin, Diisopropylami.n, Cyclohexylamin, Ethanolamin, Triethylamin, 3-Amino-1-propanol

und dergleichen gebildet werden

10

Die kationischen Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze werden unter Anwendung von Verfahren hergestellt, wie - sie zur Bildung kationischer Salze üblich sind. Hierzu löst man beispielsweise eine entsprechende Verbindung der Formel

ι c

II in einem geeigneten Lösungsmittel, wie'Wasser, und versetzt diese Lösung dann mit einer Lösung, die die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base enthält, wobei darauf zu achten ist, daß der pH-Wert der Lösung nicht zu basisch wird. Das so gebildete Salz , läßt sich

^Q dann durch übliche Methoden isolieren, beispielsweise durch Filtration oder··'Verdampfung des Lösungsmittels. Wahlweise kann man die Verbindung der Formel II in Lösung auch über ein entsprechendes Ionenaustauscherharz schicken.

^° Die mit organischen Aminen gebildeten Salze können in ähnlicher· Weise- hergestellt werden. Hierzu kann man beispielsweise das gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung einer entsprechenden Verbindung der Formel II in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, geben, und das Lösungsmittel.sowie¹den Überschuß an Ämin dann durch Verdampfung entfernen.

Zu beispielsmäßigen und geeigneten Säureadditionssalzen gehören die durch übliche Umsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildeten Salze wie beispielsweise die Salze von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronen-

säure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäurs, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Cam- phersäure, Glutarsäure', Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfon-

säure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure,. Zimtsäure und ähnlichen Säuren.

Das neue Antibiotikum der Formel I wird hergestellt durch Züchtung eines den Faktor A von A53868 bildenden Stammes von .S'treptorayces luridus unter submersen aeroben /Bedingungen in einem-geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität. Die Gewinnung des Antibiotikums erfolgt unter Anwendung verschiedener in der Fermentationstechnik anerkannter Isolierungs- und Reini-.^; gungsverf aaren.

Der zur Herstellung des Faktors A von A53868 brauchbare neue Organismus ist aus einer Bodenprobe isoliert.worden, die von. Granik Rapids am Fuße des Grand Canyon in Arizona, V.St.A'., gesammelt wurde; Dieser Organismus, der als" KuI-' tür A53868 bezeichnet wird, ist klassifikationsmäßig ein Stamm von Streptomyces luridus. Diese Klassifikation beruht auf einem Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen dieser Art (R.E- Buchanan und; N.E. Gibbons, "Sergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, MD, V.St.A., 1974; E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 18 (2), 142 (1968)', E. Küster "Simple Working Key for the Classification and Identification of Named Taxa Included in the International Streptomyces Project", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 22 (3), 134 bis 148 (1972), H. Nonomura, "Key for Classification and- Identification of 458 Species of the Streptomycetes Ineluded in ISP", J. Ferment. Technol. 52- (2), 78 bis 92 (1974), I.M. Szabo et al., "A Diagnostic Key for the Identification of "Species" of Streptomyces and Streptoverti-

eilIum- Included in the International Streptomyces Project", Acta Botanica Academiae Scientiarium Hungaricae 21 (3-4), 387 bis 418 (1975) und S.A. Waksman, "The Actinomycetes" Band II, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, V.St.A., 1961, Seite 236).

Diese Klassifikation beruht auf Methoden, wie sie für das International Septromyces Project (ISP) (E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces Species"/ Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16- (3), 313 bis 340 (1966)) zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen empfohlen worden sind.

Die Kohlenstoffverwertung wird bestimmt unter Verwendung ^io'" des' Grundmediums- ISP^: f^!9-, das- mit' filtarsteririsierten Kohlenstoff quellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 % versetzt'wird. Die Sterilisation des¹ Grundmediums erfolgt durch Äutoklavierung. Nach 14-tägiger Bebrütung· bei 3 0⁰C

werden die Platten abgelesen

20

.Die Zellwandzucker werden bestimmt unter Verwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Lecnevalier (M.P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera", vom Subkomitee über Äctinomyceten der

2° American Society of Microbiology, deren Vorsitzender Dr. Thomas G. Pridhairrist, gefördertes· Seminar am Institute of Microbiology, Rutgers university, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, V.St.A., 1971). Das Isomere von Diaminopimelinsäure wird unter Anwendung des Verfahrens von B.Becker-^ret al. bestimmt (B. Becker- at al,, "Rapid Differentiation Between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 11, 421 bis 423 (1964) ) .

Die Melanoidpigmentproduktion (Chromogenität) wird bestimmt unter Verwendung von IS? #1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP #6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP #7

(„Tyros in-Agar) und abgewandeltem ISP #7 (ISP #7 ohne Tyrosin) .. .'

Die" Stärkehydrolvse wird bestimmt durch Nachweis der Anwe-5

senheit von Stärke mit Iod auf Platten von ISP #4 (anorganische Salze-Stärke-Agar} (D.J. Bla.zevic und G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiolo-

: gy", John Wiley and Sons, New York, NY, V.St.A., 1975, Seite 99) .

Der Temperaturbereich und die Natriumchloridverträglichkeit werden unter Verwendung von Agarmedium ISP #2. ermittelt. Zur Messung der Natriumchloridverträglichkeit ver- setzt man den Agar bis zur Erreichung der gewünschten Kon- *"-' zentrationen mit NaCl . Bei diesen Konzentrationen wird' danr bei 3Ö^ÖC"S¥

Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt unter Verwendung der ISCC~N3S^: Cen-xoid Color Charts, Standard' Probe Nr^:. 2105 (üS-Depar croenz. of Commerce ,National; Bureau "of Standards, Washington., Ü.C., V-. St. A., 1958) und'des Color, Harmony Manual (4. Auflage/ Color Standards Dept., Container'Corp. of America, IL, V.St.A. 1958).

ZüchtungsCharakteristiken

A53868 bildet reichliche Luftmycelien, deren Sporenmasse eine.'"Farbe in der roten (R.) Farbenreihe hat. Die am nächsten kommende Farbtafel für die rote Farbenreihe im System _von Tresner und Backus (Color Harmony Manual und H.D. - ' Tresner und S.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbioi. 11, 335 bis 338 (1956)) ist 5ca hellgelblich-pink bis 4ec gräulich-gelblich-pink. Im System ISCC-NBS ist das am nächsten kommen-

35. de Farbblättchen 31.ρ.y. Pink., nämlich fahlgelblich-pink. Diese Züchtungseigenschaft wird gebildet auf Hafermehl-Agar (ISP #3), Czapek-Lösung-Agar und Tomatenpaste-Hafer-

mehl-Agar (TPO). Am besten läßt sich dieses Züchtungsmerkm'al sehen, wenn man das Ganze auf einem Agar aus anorganischen Salzen und Stärke (ISP.#4)· wachsen läßt.

Die Unterseite der· Kolonie bildet keine unterscheidbaren Pigmente. Beim Wachsenlassen auf ISP #4 ist die- Unterseite schwach örange-gelb gefärbt. Beim Wachsenlassen auf anderen Medien verändert sich die Schattierung und Intensität dieser Farbe. Es werden¹keine löslichen Pigmente gebildet. 10

Trägt man diese Kultur zur Ermittlung ihres Variationsvermögens auf, dann zeigt sie einen stabilen homogenen Kolonietypus. Gelegentlich läßt sich auch eine Variante ohne Lufthyphen beobachten.

Die bei der Züchtung erhaltenen Informationen gehen im einzelnen aus der folgenden Tabelle I hervor.

TABELLE I

·. .. ..

Züchtungschäxakteristiken von A538 68

Medium Charakteristiken

_Isp '* . 68.S.OY

Reichlich

68. S. OY Am Reichlich: 3CA fahl OY (R)

Nr. 2

Sp Keines

G Gut'

ISP R 33.br pink

Nr. 3 Aar Annehmbar: 4ec: gräulich-gelblich-pink (R)

Sp Keines

G Reichlich

ISP R '7Lm-OY

Nr. 4 Am Reichlich: 5CA hellaelblich-pink (R)

Sp Keines

- 17 TABELLE I (Fortsetzung)

Medium Charakteristiken^a

G Reichlich

ISP R 86.1.gelb

Nr.. 5 Am Reichlich: a weiß (W)

Sp Keines

G Annehmbar

Czapek-' R 73.p.OY.(sehr-fahl)

. Agar: Am Annehmbar: 3CA ρ.OY bis 4ecgy.yPK (R)

' " ' Sp; Keines ^:" ' - > ?

G Reichlich R 72.d.OY.

TPO

-. Am Reichlich: 3CA p.OY bis 5cb gy.yPK (R) 15·.., . ...." .

Sp Keines

^aG - Wachstum

'..· R = Unterseite _: Am= Luftmycel

Sp= lösliches Pigment

Morphologische Charakteristiken "

Die Kultur A53868 bildet gut. entwickelte und nichtfragmentierende Luftmycelien, die monopodisch verzweigt sind. Die Sporophoren haben eine mittelmäßige Länge und sind als Haken und offene Schlaufen mit einem weiten Durchmesser angeordnet. Gelegentlich lassen sich auch einfache Spiralen beobachten. Solche Spiralen sind dann kurz, dicht und komqq' pakt. Die Morphologie der Sporophoren fällt in den Bereich Retinaculiaperti (RA) von Pridham et al., supra.

Diese Morphologie läßt sich am besten auf ISP Nr. 4-Agar und Czapek-Lösung-Agar beobachten. Reife Sporenketten ent-, halten im allgemeinen etwa 10 Sporen pro Kette. Die Sporen- . ".· form ist. kugelförmig bis länglich., jedoch vorwiegend, läng-• . lieh. Die Sporengröße wird mit einem optischen Lichtmikroskop unter Verwendung eines Vickers Image Splitting

Measuring Eyepiece bestimmt. Die Sporengröße reicht von 0,9 3 bis 1,85 μπι in der Länge und von 0,6 2 bis 1,30 μΐη in der Breite. Die mittlere Größe beträgt 1,28 μπι χ 0,94 μΐη.

Die Oberflachenornamentation der Sporen ist glatt.

Physiologische Charakteristiken

Eine Analyse hydrolysierter Gesamtzellen zeigt die Gegenwart von LL-DÄP (Diaminopimelinsäure), wobei jedoch.kein meso-Isomeres vorhanden ist. Eine Zuckeranalyse hydrolysierter Gesamtzellen zeigt die Gegenwart von Glucose, Mannose und Ribose. Dies entspricht einer Zellwand vom Typ I und einem nichtcharakteristischen oder NC-Zuckermuster (siehe Bergey..'s Manual_r,supra) . Diese Kombination aus vorherrschenden Zellwandbestandteilen weist auf den Genus Streptomyces hin.

A53868 hat: folgendes Kohlenstoffverwertungsmuster: L-Ärabinose, D-Glucöse, Cellobiose, D-Fruetose, D-Galactose, Isoinosit,, Lactose,.: D-Maltose,. D-Ribose, Salicin, Natriumacetat,. Natriumeitrat, Natriumsuccinat: und D-Xylose werden, alle für ein Wachstum, gebraucht. D-Arabinose, Melibiose, D-Mannit, D-Raffinose, L-Rhamnose und Saccharose unterstützen das Wachstum nicht. ...

25^: ... .' .. . . .' : .. . . . . . . :

Die Kultur A53868 verflüssigt Gelatine- und hydrolysiert Stärke.. Sie reduziert Nitrat nicht. Magermilch wird durch die Kultur weder hydrolysiert noch peptonisiert. · '

Die Kultur A53868 verträgt NaCl bis zu 7 % und wächst bei Temperaturen zwischen 10 und 37⁰C.

Die Kultur A53868 bildet Melanoidpigmente, wenn man sie in Trypton-Hefeextrakt-Brühe {ISP Nr. 1) und auf Schrägen aus

35" Pepton-Hef eextrakt-Eisen-Ägar (I3?^; Nr.. β) und Tyrq.sin-Agar (ISP Nr. 7) wachseh läßt.'

Artenbestimmung

Die züchtungstechnischen', morphologischen und physiologischen Charakteristiken von A53868 werden mit veröffentlich-,

ten Beschreibungen ähnlicher. Arten verglichen. 14 Arten von

Streptomyces ähneln der Kultur A53868 ziemlich stark und

werden daher im einzelnen untersucht. Die zwei ähnlichsten

Arten zu A53868 werden selektiert. Diese zwei Kulturen

sind: . .

Streptomyces lavendofoliae (E.B. Shirling et al.,' supra,

Streptomyces luridus (E.B. Shirling et al., supra, Seite

14 2).

Diese zwei Kulturen gehören der: Liüefätur zufolge- irf'die" rote (R) Farbreihe, haben eine retinaculiaperti (RA) Sp.o-. renmorphologiei, weisen eine glatte (Sm) Sporenoberfl.ächenornamentation auf, bilden iMelanoidpigmente, zeigen ein KohlenstoffVerwertungsmuster und verfügen über andere Char-

Ω

^w akteristiken, so daß sie der Kultur. .A538.68 ziemlich ähnlich

s'ind. Sie-sind, beide in der ApproveS· List of Bacterial.ν Names angeführt (V.B.D. Skerman et al., Intern/Journal of - Systematic Bacteriol. 30 (1), 225 bis 420 (1980)).

Ein weiterer Vergleich der Kultur A53868 mit diesen beiden Kulturen ergibt¹ folgendes:

Streptomyces lavendofoliae:

Diese Kultur hat viele Charakteristiken mit A53868 gemeinsam·; wobei auch einige Unterschiede bestehen, die jedoch zahlreicher sind als bei Streptomyces luridus. Die allgemeine Morphologie, die.·Pigmentation, das Fehlen löslicher Pigmente, die Bildung von Melanoidpigment, die Farbe der Sporenrnasse, die Ornamentation der Sporenoberfläche und die Kohlenstoffverwertung sind alle ähnlich zu A53S68.

Streptomyces lavendoföliae unterscheidet sich von A53868 jedoch darin, daß es eine längere Sporenkette, hat, mehr

-.20 -

1 spiralförmige Sporophoren aufweist, keine Fructose verwertet und auf Czapek-Lösung-Agar schlechter wächst.

Streotomyces luridus:

Diese Kultur ist züchtungsmäßig, morphologisch und physiologisch ähnlich wie A53868. Beide Kulturen liegen in der roten (R) Farbreihe, weisen keine unterscheidbaren Pigmente auf, haben die· gleiche (RA) Sporenmorphologie mit einer glatten'Sporenoberflache, bilden Melanoidpigmente und zeigen ein ähnliches KohlenstoffVerwertungsmuster. Die Ahn--Henkelten und Unterschiede zwischen AS3868 und Streptomyces luridus sind in der Tabelle II zusammengefaßt. Aus den Tabellen III und IV gehen stärker detaillierte Vergleiche zwischen A5:3868 und Streptomyces luridus hervor.

TABELLE II

Vergleich zwischen der Kultur A53868 und Streptomyces

'^: " ' luridus '

Ahn1i chk ei t e η

Farbe der Lüftsporenmas'se (R) KohlenstoffVerwertungsmuster Züchtungscharakteristiken Fehlen unterscheidbarer Pigments

Bildung von Melanoidpigmenten

Morphologie (RA) Fehlen löslicher Pigmente Länge der Sporenketten (10 bis 50) Sporenform Ornamentation der Sporenoberfläche Hydrolyse von Stärke. ^:

Unterschiede'

Gelatineverflüssigung NaCl-Verträglichkeit Nitratreduktion

Reaktion mit Magermilch

Verwertung von- Fructose .

TABELLE III

Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch die Kultur. A53868 und durch Streptorayces luridus ^c

Kohlenstoffquelle

A53868 Streptornyces luridus

Kein Kohlenstoff

L-Arabinose +

D-Fructose · +

D-Glucose +

Isoinosit +

D-Mannit

Raffinose '-- ' ' - -- '- " - ' - .- . -

L-Rhamnose

Saccharose

D-Xylose 4·

D-Arabinose

Cellobiose +

D-Galactose +

Lactose. +

D-Maltose +

Melibiose

Natriumacetat +

Natriumcitrat -f

Natriümsuccinat +

Ribose +

SaIiein . +

- = keine Verwertung

+ =' Verwertung

+ = fragliche Verwertung

NU = nicht untersucht

NU NU-, NU-NU NU NU-NU NU NU NU'

TABELLE IV

Vergleich zwischen AS3868 und Streptomyces luridus

Charakteristik.	A538 68	Streptomyces
		luridus
Farbe der Luftsporenmasse	rot	rot
KohlenstoffVerwertungsmuster	+ :	+
(D-Fructose)	+	+
Zellwandart		NUa
Gelatinverflüssigung	+	-
Melanoidpigment	+	+
ISP Nr. 1.	+	+
ISP Nr. 6	+	+
ISP Nr. 7 .. .	+	+
ISP Nr. 7, abgewandelt	-	NU"
Morphologie	RA	RA
NaCl-Verträglichkeit, %	7	<7
Nitratreduktion	-	+
Farbe der Unterseite	0Y:	OY
Magermilch	-	.+
Lösliche Pigmente	-	-
Sporenform	länglich	länglich
Sporenoberfläche	Sm	Sm
Hydrolyse von Stärke	+	+
Temperaturbereich, 0C	10 bis 37	NU

NU = nicht untersucht

Diese Vergleiche zeigen, daß A53868 zu Streptomyces luridus sehr ähnlich ist. Die Kultur A53868 wird daher als ein Stamm von Streptomyces luridus (Krasilnikov, Korenyako, Meksina, Valedinskaya und Veselov) Waksman 1961 klassifiziert. Diese Klassifikation beruht auf einem Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen und nicht auf direkten Läborvergleichen. .

Die zur Bildung des Faktors A von A53868 brauchbare .Kultur

von Streptomyces luridus ist beim Northern Regional Research Center, US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, V.St.A., hinterlegt und Teil der dortigen Kulturensammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 15101 frei bezogen werden kann.

Genauso wie im Falle anderer Organismen sind auch die Eigenschaften der den Faktor A von A5 3 868 bildenden Kultur, nämlich von Streptomyces luridus NRRL 15101, einer Varia-·

^O tion zugänglich.. So lassen sich beispielsweise durch Behandlung mit verschiedenen bekannten mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien, Varianten, Rekombinanten und Mutanten des Stammes NRRL 15101 erhalten. Alle natürlichen und induzierten Varianten, Mutanten"und Rekombinanten von Streptomyces luridus NRRL 15101, die den Faktor A von A5 3 868 produzieren, können verwendet werden.

Zum Wachsenlassen von Streptomyces luridus NRRL 15101 läßt sich irgendeines der verschiedenen Züchtungsmedien verwenden. Aus; Gründen einer wirtschaftlichen¹' Produktion;·, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Produkts' sind jedoch bestimmte Züchtungsmedien bevorzugt. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle für, eine· großtechnische Fermentation ist daher beispielsweise lösliche Stärke, obwohl sich auch Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin und dergleichen verwenden lassen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist ein- Pankreasverdauungsprodukt von Casein, wobei sich jedoch auch enzymhydrolysiertes Casein, enzymatisch verdautes Sojabohnenmehl, säurehydrolysiertes Casein und dergleichen eignen. Eine Anreicherung des Mediums mit Glycin und Leucin kann ebenfalls' günstig sein.

Anorganische Nährsalze, die .den Züchtungsmedien zugesetzt werden können.., sind die löslichen Salze, die Ionen von Calcium, Kalium, Ammonium, Chlorid, Sulfat, Nitrat,: Phosphat und ähnlichem bilden können.

-24 - · .

Im Züchtungsmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus notwendig sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Be-

5. standteilen des Mediums in solchen Mengen vor, daß sie dem Wachstumsbedarf des Organismus entsprechen. Bei großtechnischen Fermentationsmedien kann ein Zusatz geringer Mengen, beispielsweise einer Menge von 0,2'mi pro Liter, eines Ant!schaummittels, wie Polypropylenglykol, erforderlich sein, wenn die Schaumbildung zu einem Problem wird.

Zur Produktion wesentlicher Mengen des Faktors A von A53S68 wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen des Faktors A von A53868 lassen sich durch Schüttelkolbenzüchtung herstellen. Infolge der zeitlichen Verzögerung der Produktion des Antibiotikums, zu der es gewöhnlich bei einer Beimpfung großer Tanks mit der Spcrenform des Organismus kommt,- wird vorzugsweise unter Verwendung eines vegetativen Inokulums gearbeitet. Zur Herstellung eines solchen vegetativen Inokulums beimpft man ein kleines Volumen an Züchtungsmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das- vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank übertragen.

Der den Faktor A von A53868 bildende Organismus kann bei

>

Temperaturen' zwischen etwa;10 und etwa 37°C wachsen. Zu einer optimalen Produktion des Faktors A von A53868 scheint es bei Temperaturen von etwa 28 bis 30⁰C zu kommen.

Durch das Züchtungsmedium wird sterile Luft verteilt, wie dies bei aeroben submersen Züchtungsverfahren, üblich ist.

F_Ur eine ausreichende Produktion des Faktors A.von A53868 soll die Menge an gelöstem Sauerstoff auf über 30 % Luft- Sättigung (bei.3O⁰C und atmosphärischem Druck) gehalten

.. , - 25 -

werden.

Bei einer Tankfermentation soll man den pH-Wert des Fermentationsmediums vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis ^ö 7,4 halten. Dies läßt sich durch Zusatz geeigneter Mengen an beispielsweise Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure erreichen.

Die Bildung des Faktors A von A53868 läßt sich während der !0 Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe oder

von Extrakten der Mycelfeststoffe hinsichtlich ihrer anti-(-';·) . biotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen untersucht, von denen man weiß, daß sie gegenüber dem Antibiotikum sen-

.-· sitiv sind. Ein zur Untersuchung dieses Antibiotikums; geeigneter Versuchsorganismus ist Micrococcus luteus. Dieser Bioversuch wird vorzugsweise mittels Papierscheiben auf Agarplatten durchgeführt.

Nach erfolgter Produktion unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man den Faktor A von A53868 aus

dem Fermentationsmedium unter Anwendung,von in" der Fermentationstechnik üblichen Methoden gewinnen. Die während der Fermentation eines den Faktor A von A53868 produzierenden ^ Organismus gebildete antibiotische Aktivität kommt im all- ' ^ 25 gemeinen in der Brühe vor. Der Faktor A von A53868 läßt sich daher maximal gewinnen, indem man die Fermentationsbrühe zur Entfernung der Mycelmasse zuerst filtriert. Die

.' dabei erhaltene filtrierte Brühe läßt sich durch die ver—

schiedensten Techniken reinigen, wodurch man zum Komplex . von A53868 gelangt. Eine hierzu bevorzugte Methode besteht in einer Adsorption an in einer entsprechenden Säule befindliche Aktivkohle und anschließenden Eluierung unter Gewinnung des Komplexes von A53868.

Zur weiteren Reinigung und Auftrennung des Komplexes von A53868 unter Gewinnung des. einzelnen Faktors A von A53868 bedient man sich zusätzlicher Adsorptions- und Extraktions-

; - 26 -

verfahren. Zu für die Reinigung des Komplexes von A5 3868 und des Faktors A von A53868 brauchbaren adsorptiven Materialien gehören: (1) Hochporöse Polymere (Diaion HP-20), (2) Sephadex A25 und G-5.0, Bio-Gel P-2 und P-IO, (3) Anionenaustauscherharze, die (a) stark basisch sind, wie Polystyrol, BioRad AG 1 und AG 2, Bio-Rex, Dowex 1 und 2, Amberlit IRA 400, 401 und 410, (b) mittelmäßig basisch sind, wie Epoxypolyamine, Bio-Rex 5 und Duolite A3uB, oder (c) schwach basisch sind, wie Polystyrol:oder phenolische PoIyamine, Bio-Rad AG3, Duolite A-6 , A-7, Amberlit IRA 68/ IR-45, IR-4B, (4) Siliciumdioxidgel, (5) Magnesiumsilicatgel, (6). polymere Adsorbentien (XAD-2 und 4), (7) Umkehrphasenharze, wie Siliciumdioxidgel/C,„ und Siliciumdi-

. . .. oxidgei/c_o/ ...(8) Aktivkohle, ·( 9 ) DEAE -Cellulose, DEAE-Sepha-

. dex, (lO) Polyamide, (11) Aluminiumoxid oder (12) Mikrocellulose. ' .

Bezugsquellen für.solche Adsorbentien sind:

Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, V.St-A. für Bio-Rad-Harze und 'BlO-GeI-HaIZe,

Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA,- V. St. A. für' Amberlit und .XAD-Harze, . , '

Diamond Shamrock Chemical Co., Redwood City, CA, V.St-A. für Duolitharze,

Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden für Sephadex-Harze, *

Dow Chemical Co., Midland, MI, V.St.A. und Diaion-Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan für Dowex-Harze, und . .'..

30- E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland für XAD-Harze,' Siliciumdioxidgel/C-. _o und S'iliciumdioxidgel/Co .

. ' ' . " . : ' IO ,' -. O

Die Verbindungen der Formel Ha werden aus einer Verbindung der Formel I unter Anwendung von für Peptidsynthesen üblichen Methoden hergestellt. Diese Methoden bestehen in einer Kupplung der Aminosäuren oder Peptidfragmente durch' Umsetzung der Carboxyfunktion einer solchen Verbindung mit

der Aininofunktion einer anderen derartigen Verbindung unter Bildung einer Amidbrücke. Zur Erzielung einer sauberen Kupplung ist es wünschenswert, daß (1) alle reaktionsfähigen Funktionen, die nicht direkt an der Reaktion teilneh- ° men, unter Anwendung geeigneter Blockierungsgruppen inaktiviert sind und (2) die Carboxyfunktion, die gekuppelt werden soll, geeignet aktiviert ist, damit die Kupplung ablaufen kann. All dies erfordert eine sorgfältige Auswahl von sowohl der Reaktionsfolge.als auch den Reaktionsbedingungen und den Einsatz spezieller Blockierungsgruppen, damit sich das gewünschte Peptidprodukt ergibt- Jede der Ami- φ nosäuren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet wird und die über die besonders ausgewählten Schutzgruppen und/oder aktivierenden Funktionen ver-

15.. fügt, wird unter Anwendung von in der Peptidchemie anerkannten Techniken hergestellt.

Ausgewählte Kombinationen an Blockierungsgruppen werden an jedem Punkt der Synthese der Verbindungen der Formel-ΊIa verwendet. Diese besonderen Kombinationen haben sich als am saubersten funktionierend erwiesen. Für die Synthese der Verbindungen der Formel Ha können sich zwar auch andere Kombinationen eignen, wenn auch gegebenenfalls'mit ei-

·-, nem geringeren Ausmaß an Erfola. So eignen sich als Ämino-

/) .

^ 25 blockierungsgruppen bei der Synthese der Verbindungen der Formel Ha beispielsweise Benzyloxycarbonyl (CBz), t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl (AOC), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (MBOC), Adamantyloxycarbonyl (AdOC) und Isobornyloxycarbonyl. Benzyl (BzI) wird allgemein als Hydroxyschutzgrüppe für den Tyrosylrest verwendet, obgleich sich auch andere Schutzgruppen einsetzen lassen, wie p-Nitrobenzyl (PNB), p-Methoxybenzyl (PMB) und dergleichen.

Die, zur Herstellung der Verbindungen der Formel Ha verwen-. 35 deten Carboxyblockierungsgruppen können irgendwelche typische esterbildende Gruppen sein, und hierzu gehören beispielsweise Methyl, Ethyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, p-Methoxybenzyl, 2,2,2-Trichlorethyl und dergleichen.

Eine Kupplung der geeignet geschützten N-blockierten Aminosäure oder des entsprechenden Peptidfragments mit einer geeigneten geschützten carboxyblockierten Aminosäure oder einem entsprechenden Peptidfragment bei der Herstellung der Verbindungen der Formel Ha besteht darin, daß man die freie Carboxyfunktion der Aminosäure oder des Peptidfragments gegenüber der Kupplungsreaktion aktiv macht. Dies läßt sich unter Anwendung irgendeiner hierzu bekannten Technik erreichen. Eine solche Aktivierungstechnik besteht

* in einer Umwandlung der Carboxyf unktion in ein gemischtes Anhydrid. Die freie Carboxyfunktion wird durch Umsetzung mit. einer anderen Säure, normalerweise einem Derivat einer Carbonsäure, wie einem Säurechlorid hiervon, aktiviert. Beispiele für zur Bildung gemischter Anhydride verwendba-

¹^ _rer Säurechloride sind ,Ethylc.hlorf orini.at, Phenylchlorformiat, ..s-B.utylchlorformiat,'. Iso.bu.tylchlorformiat,. Pivaloylchlorid und dergleichen. Isobutylchlorformiat ist bevorzugt.

Eine,andere Methode zur Aktivierung der Carboxyfunktion zum Zwecke der Durchführung der Kupplungsreaktion besteht in einer Umwandlung, in ihr: aktives /Esterderivat. Zu. solchen aktiven Estern gehören beispielsweise^ 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylester und dergleichen.. Eine.andere anwendbare Kupplungsmethode; ist die wohlbekannte Azidkupplungsmethode.

An/ bestimmten Punkten bei der zur Herstellung der Verbindungen der Formel Ua angewandten Synthesefolge ist eine Spaltung ausgewählter Blockierungsgruppen notwendig. Der mit der Technik der Peptidsynthese vertraute Durchschnittschemiker kann aus repräsentativen Schützgruppen ohne weiteres die Gruppen auswählen,- die in dem Sinne kompatibel sind, daß sich, eine selektive Spaltung des Produkts unter Entfernung von ein oder mehr Schutzgruppen, jedoch nicht aller an der Aminosäure oder dem Peptidfragment.vorhandenen Schutzgruppen erreichen läßt. Hierbei handelt es sich

- 23 -

um in der Peptidchemie anerkannte Techniken. Bezüglich einer ausführlicheren Diskussion der Techniken, die für eine selektive Spaltung verfügbar sind, wird auf die hierzu bekannte Literatur hingewiesen (siehe Schröder und Lübke, The Peptides, Band I, Academic Press, New York 11965), insbesondere die Tabelle auf den Seiten 72 bis 75).

Eine Abspaltung der Carboxyscnutzgruppen läßt sich durcn alkalische Verseifung erreichen. Zur Entesterung der ge- ·

^-0 schützten Carboxylgruppe werden im allgemeinen verhältnismäßig starke alkalische Bedingungen angewandt, so daß hier-' zu gewöhnlich Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid und dergleichen, verwendet ,werden. Die Reaktionsbedingungen, unter denen es zu einer Verseifung kommt, sind allgemein bekannt. Die Carboxyschützgruppen lassen,sich auch durch katalytisch^ Hydrogenolyse unter Einschluß von beispielsweise einer Hydrogenolyse in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladium-auf-Kohle, entfernen. In den Fällen, in denen die Carboxyschutzgruppe p-Nitrobenzyl oder 2,2,2-Trichlorethyl ist, läßt sich eine Deblockierung ferner auch durch Reduktion in Anwesenheit von Zink und Chlorwasserstoffsaure, erzielen.

_^ Die Aminoblockierungsgruppen werden gespalten, indem man s 25 die geschützte Aminosäure oder das entsprechende Peptid

mit einer Säure, wie Ameisensäure, Tri.fluoressigsäure (TFA), . p-Toluolsulfonsäure (TSA), Benzolsulfonsäure (BSA), Naphthalinsulf onsäure und dergleichen, spaltet und so als Produkt

>

das jeweilige Säureadditionssalz bildet. Eine Abspaltung der Aminoblockierungsgruppe läßt sich auch durch Behandlung der blockierten Aminosäure oder des blockierten Pep- tids mit einem Gemisch aus HBr oder HCi und Essigsäure erreichen, wodurch das entsprechende Hydrobromid oder Hydrochloridals Säureadditionssalz gebildet wird. Das jeweils angewandte Verfahren oder Reagens ist abhängig von den chemischen oder physikalischen Eigenschaften der Materialien, die in der speziellen Deblockierungsreaktion invol- '.

- - viert sind.

Die Verbindungen der Formel II, worin η für 0 steht und Z Wasserstoff ist, nämlich die H-LAPP-Verbindungen, eignen sich besonders als Zwischenprodukte. Diese Verbindungen werden hergestellt durch Abspaltung'der Glycylgruppe von der Verbindung der Formel I. Die Glycylgruppe läßt sich selektiv durch Leucinaminopeptidase (lap) oder durch selektive saure Hydrolyse entfernen, wodurch man zum H-LAPP-Zwischenprodukt gelangt.

Die allgemeine Reaktionsfolge zur Herstellung der Verbindung der Formel Ha läuft wie im folgenden angegeben ab. In dieser Reaktionsfolge bedeutet das Symbol AA einen Aminosäurerest, wäbrend GLAPP den Faktor A von A5 38 68 darstellt.

GLAPP

-(AA)¹'

(AA)¹-GLAPP

H-LAPP

-(AA)

(AA)-LAPP

(AA)²-(AA)¹-LAPP ^(AA)³

;aa)²-(aa:)¹-glapp (aa)³-(aa)²-(aa)¹-laf

Bei der Herstellung der Verbindungen der Formel Ha nach dieser .Reaktionsfolge'verwendet man vorzugsweise eine Verbindung, die die Gruppe LAPP des beabsichtigten Endprodukts als C-terminalen Reaktanten. enthält.

Zu Beispielen für typische Verbindungen der Formel II ge-

- 31 1 hören folgende:

Ala-Gly-LAPP, Tyr-Ala-Gly-LAPP, ⁵ .· Ärg-Gly-LAPP,

Tyr-Arg-Gly-LAPP, Nva-Gly-LAPP, Tyr-Nva-Gly-LAPP, Val-Gly-LAPP,

¹⁰ ' Tyr-Vai-Gly-LAPP,

Nle-Gly-LAPP, Tyr-Nle-G.ly-LAPP, Leu-Gly-LAPP,

Gly-Leu-Gly-LÄPP,

15 .:

Ile-Gly-LAPP,

.Gly-Ile-Gly-LAPP, Ala-Gly-LAPP, Phe-Äla-Gly-LAPP,

Met-Ala-Gly-LAPP,

Leu-Ala-GIy-LAPP, Ile-Ala-Gly-LAPP,. Lys-GIy-LAPP, Pro-Gly-LAPP,

Thr-GlV-LAPP, 25

• Trp-LAPP,

Val-Ala-Gly-LÄPP, Ser-Äla-Gly-LÄPP, Nle-Ala-Gly-LAP?,

Met-Gly-LAPP, 30

Tyr-Met-Gly-LAPP, Phe-iMet-Gly-LAPP, Leu-Met-Gly-LAPP, Ile-Met-Gly-LAPP, Val-Met-Glv-LAPP,

35 ' · "; ·

Ser-Met-Gly-LAPF; Äla-LAPP', Tyr-LAPP,

NIe-LAPP,

Hse-LAPP,

Ala-Val-LAPP,

Cys-LAPP, Cys-GIy-LAPP,

.Hse-Gly-LAPP,

Val-Gly-LAPP,

Gly-Leu-LAPP, Gly-Ala-LAPP, Gly-Nle-LAPP,

Phe-Gly-LAPP,

Gly-Hse-LAPP,

Nva-Gly-LAPP, Cys-Gly-LAPP, Gly-Gly-LAPP,

VaI-LAPP,

Ile-LAPP, .

Arg-LAPP, Asp-LAPP, GIy-Asx-LAPP,

GIn-LAPP, /

GIu-LAPP, ' '

Glx-Gly-LAPP, '

Leu-LAPP, Nva-LAPP,

Phe-LAPP,:

Ser-LAPP .

und dergleichen.

Die Erfindung bezieht sich weiter auch auf Methoden zur Regulierung des Immunsystems mit den Verbindungen der Formeln I, II. und III und auf Zusammensetzungen, die solche Verbin-' düngen enthalten. Die Verbindungen der Formel III sind bekannt (siehe beispielsweise Science 166, 122 (1969)), wobei ihre immunmodulierende Wirksamkeit bisher jedoch nicht

erkannt wurde. Die Verbindung der Formel III, worin R und R jeweils Wasserstoff sind,- ist das Antibiotikum Fosfomycin.

* Die Verbindungen der Formeln I, II und III weisen eine immunmodulierende Wirksamkeit auf, wie s,i-ch durch in vitro- und in vivo-Versuche, bei denen die Fähigkeit der Verbindungen zur Aktivierung von Makrophagen ermittelt wird, und durch in vivo-Versuche an Tieren mit experimentell hervorgerufenen intrazellularen Infektionen gezeigt wird.. Die Verbindungen der Formeln I und II stellen eine für diese Methode bevorzugte Verbindungsgruppe dar. Die damit verwandten Phosphonsäureantibiotika Alaphosphin und Fosmidomycin weisen beim in vitro-Versuch keine immunmodulierende Wirksamkeit auf.

Die Wirksamkeit der Verbindungen der Formeln I, II und III auf die Aktivierung von Makrophagen ist unter Anwendung an-IS erkannter Verfahren bestimmt worden.

Bei einem Verfahren wird'die Fähigkeit der Verbindungen zur Aktivierung von Makrophagen der Maus in vitro bestimmt. Hierzu setzt man peritoneale Makrophagen einer Verbindung der Formel I, II oder III gleichzeitig mit der Zugabe von Zielzellen ' aus-;· 48 Stunden später bestimmt man die Tumorzytotoxizität dieser'behandelten Makrophagen durch Trypan- bläuauszählung. Die prozentuale Wachstumshemmung von Zel·^- len P815, die eine Folge der durch die Zusammensetzung hervorgerufenen Makrophagenaktivierung ist, wird berechnet durch Vergleich mit den Zellen P815, die in Gegenwart von einem Puffer ausgesetzten Makrophagen gewachsen sind. Die bei Versuchen .unter Anwendung dieses Verfahrens erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden.Tabellen I und.II her-

vor. :

- 34 TABELLE I

Einleitung einer von Makrophagen vermittelten Tumorzytotoxizität durch die Verbindung I

Konzentration der Verbindung I

Prozentuale Makr.ophagenzytotoxizitat Versuch 1 Versuch 2

100

50

25-

12,5 6,25 3,12 1,56 .0

53 35 4.3 27 0

11 NU ·. 0

NU^a 29 32 39 0

14

.0

NU = nicht untersucht

TABELLE II ;.

Einleitung -einer von Makrophagen vermittelten Tumorzytoto-

xiz i ta ρ durch Fosfomycin'

Fosfomycinkonzentration (

Prozentuale Makrophagenzytotoxität Versuch 1 Versuch 2

100 10

47 4 9

30

11

Bei einem weiteren Verfahren werden peritoneale Makrophagen nach 3, 5 oder 10 Tagen von mit- einer Zusammensetzung behandelten Mäusen.durch Waschen des Peritoneums geerntet und durch Adsorption an Kunststoff gereinigt. Man überschichtet etwa 4 χ 10 Makrophagen in 16 mm-Röhrchen mit

4 4 χ 10 Zellen von P815, die in 2 ml Medium 1640 vom Roswell Park Memorial Institute enthalten sind, das mit 20 %-igem fetalen Kälberserum ergänzt ist. Alle Kulturen werden in' einem befeuchteten und 5 % CO„ in Luft enthaltenden Inkubator bei 37°C gehalten, und nach 48· Stunden bestimmt man

die Zytotoxizität auf Basis einer Auszählung der lebensfähigen Zellen in einem Hämozytotneter . Für jede Gruppe werden Dreifachkulturen gehalten. Man berechnet die mittlere Zellauszählung und die Standardfehlergrenze (S.F.'). Unter diesen Bedingungen beeinflussen peritoneale'Makrophagen von normalen BALB/c-Mäusen, die mit Tri.s.. gepufferter Kochsalzlösung behandelt worden sind, das Wachstum der Zielzellen P81.5 nicht, wie eine entsprechende Bestimmung von sowohl der Anzahl an lebensfähigen Zellen als auch der DNA-Synthese der Leukämiezellen ergibt. Das Verhältnis aus den Makrophagen und den Zielzellen beträgt etwa 10 : .1 zu Beginn eines jeden Versuchs. Die auf die durch die Zusammensetzung vermittelte Makrophagenaktivierung hervorgerufene Wachstumshemmung der Zellen P815 wird berechnet durch einen Vergleich mit Zellen P815, die in Gegenwart von Makrophag'eh-aus mit Puffer behandelten Tieren-gewachsen sind. Die bei einem solchen Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

TABELLE III

Makrophagenaktivierung in vivo Gunter? Verwendung" der '-.'Ve-r^bindung I

Dosis der Ver-25 bindung I (mg/kg)

Prozentuale Makrophagenzytotoxizität am Tag

0 3 5 10

100 10

0 0

43

25 20

0 0

Ferner haben sich die Verbindungen der Formeln I, II und III auch bei Versuchen als Immunmodulatoren wirksam erwiesen, bei denen man sowohl normale als auch immunsupprimierte Tiere mit intrazellularen Infektionen infiziert, wobei der überwiegende Teil der Zellimmunität aus aktivierten Makrophagen besteht. Intrazellulare Infektionen können durch Bakterien, Pilze, Rickettsien, Protozoen und Viren hervorgerufen werden, wozu folgende gehören:

-Jb-

Mycobacterium tuberculosis, Bruceila, Salmonella typhi, Listeria monocytogenes, Histoplasma capsuLaturn, Candida albicans, Chlamydiae, Legionella, Toxoplasma gondii, Besnoitia jellisoni, Plasmödiuin berghei, Leishmaniasis und Herpes simplex.

Bei einem Versuch-erweist sich eine -Vorbehandlung mit der Verbindung I als · hochwirksam zum Schutz von Mäusen.'gegenüber letalen Infektionen durch Listeria monocytogenes EGD. Bei diesem Versuch werden CD,-Mäuse mit einem· Gewicht von 18 bis 20 g einer parenteralen Vorbehandlung mit der Ver-Suchsverbindung an den Tagen 5,3 und 1 unterzogen, bevor man zur intravenösen Infektion in die laterale. Sehwanzvene 0,1 ml einer- Zubereitung spritzt, die 5 χ 10 'lebensfähige Zellen :von Listeriä monocytogenes· EGD enthält. Die zu untersuchende Verbindung wird in pyrogenfreiem Wasser solu- bilisiert und intraperitoneal in 0,25 ml der Lösung verabreicht. Für jede untersuchte Konzentration werden 10 Mäuse verwendet. 10 als Kontrolle dienende Mäuse unterzieht man

an- den Tagen 5, 3 .und 1 vor der Infektion einer intraperi- tonealen Behandlung mit 0,25 ml pyrogenfreiem Wasser. Die Mäuse werden in Käfigen gehalten, mit Wasser versorgt und täglich gefüttert. Die Anzahl der überlebenden Mäuse wird über eine Zeitdauer von 14 Tagen täglich ausgezählt. Allen nach 14.Tagen noch lebenden Tieren ordnet man willkürlich eine überlebensdauer von 15 Tagen zu. Für jede Tiergruppe berechnet man die mittlere Überlebensdauer-. Signifikante Unterschiede zwischen den behandelten Tiergruppen und -den Kontrollgruppen werden durch den üblichen T-Test bestimmt.

Die Verbindung I erweist sich beim Limulus-Lysat-Test auf Endotoxin als negativ und zeigt beim üblichen AgardiffusiOnsversuch gegenüber Listeria monocytogenes EGD in vitro keine innere antibakterielle Wirksamkeit.

Die beim in vivo-Versuch gegenüber Listeria monocytogenes erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt .

TABELLE IV

Schützender Einfluß einer Vorbehandlung mit der Verbindung I gegenüber Infektionen durch Listeria monocytogenes an der

Maus

Prozent der-Überlebenden-Tiere

Tage	Unbehandel-	Vorbehandl	12,5	ung mit	Verbindung I.-,	100"'
nach	te Kontrol		100	(mg/kg)		100
Infek tion	len	6,25	100	25	50	100
	100	100	100	" 100	100	80
2	100	100	80	100	100	50 ' '
3	30	100	80	90	8 0	50
4	20	60	70	70	70^	50
5	20	50	70	40-	40	50
6	20	40	70	40	30	50
7	0	30	70	40	3 0	50
8	0	30	70	40	30	50
9	0	30	70	40	.30	50
10	0	30	70	40	30.	50
11	0 .	30	70	40	30	. 50
12	0	30	70	40	30	50
13	0	30	70	40	3 0	50
14	0	30	4.0 .	30
.15. .	.0	30	40	30

Mittlere

35 Überlebens- 4,6 dauer (Tage)

7,9* 11,9^;

7,6

* Aufgrund des T-Test's signifikant verschieden von den . unbehandelten Kontrollen. P - 0,0 5

- jö -

Bei einem anderen Versuch sind Behandlungen mit der Verbindung I vor der Infektion signifikant wirksam zum Schutz von Mäusen vor einer letalen Infektion durch Candida albicans A26. Bei diesem Versuch unterzieht man CD,-Mäuse mit einem Gewicht von 18 bis 20 g einer intraperitonealen oder subkutanen. Vorbehandlung mit der zu untersuchenden Verbindung an den Tagen 5, 3 und 1 vor der intravenösen Infektion mit 5 χ 10 lebensfähigen Zellen von Candida albicans A26. Die zu untersuchende Verbindung ist in pyrogenfreiem Wasser solubilisiert und wird in 0,25 ml Lösung verabreicht. Bei jeder Konzentration werden 10 Mäuse untersucht. 1.0 infizierte Mäuse behandelt man intraperitoneal oder subkutan an den Tagen 5, 3 und 1 vor der Infektion mit 0,25 ml pyrogenf reiem Wasser als Kontrollen. Die immunmodulatorischen Einflüsse der zu, untersuchenden Verbindung werden an Mäusen· untersucht, die- man vor der Infektion 24 Stunden einer Röntgenstrahlung von 400R unterzieht, oder an Mäusen untersucht, die man an den Tagen 5, 3 und 1 vor der Infektion intraperitoneal mit 50 mg Cyclophosphamid pro kg behandelt.

Die.Mäuse werden in Käfigen gehalten, mit Wasser versorgt und täglich gefüttert. Die Anzahl der überlebenden ,.Mäuse wird"täglich ausgezählt. Den normalen Mäusen, die 18 Tage nach Infektion :noch am Leben sind, ordnet man willkürlich eine Überlebensdauer von 19 Tagen zu. Den mit Röntgenstrahlen oder mit Cyclophosphamid behandelten 'Mäusen> die 12 Tage nach Infektion noch am Leben sind,. ordnet man-willkürlich eine Überlebensdauer von 13 Tagen zu- Die mittlere Überlebensdauer wird für jede Tiergruppe berechnet. Signifikante Unterschiede zwischen den behandelten und den unbehandelten Tiergruppen werden durch den T-Test bestimmt- Die Verbindung I zeigt beim üblichen Agar-Diffusionsversuch in vitro keine innere..antifungale Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A26.

Die bei in vivo-Versuchen gegenüber Candida albicans erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen V.bis VII zusammengefaßt .

TABELLE V

Schutzwirkung einer Vorbehandlung mit der Verbindung I gegegenüber einer Infektion durch Candida albicans bei normalen Mäusen .

Dosis der Mittlere Über- Prozentuale Erhöhung der Verbindung I lebensdauer mittleren Überlebensdau-(mg/kg) (Tage) er gegenüber den unbe-

handelten Kontrollen

50 7,1 31,5*

12,5 _c 9,1 68,0*

ünbehandelte _ ₄

Kontrollen

* Aufgrund des T-Tests signifikant verschieden von den unbehandelten Kontrollen- P = 0,05 · ... .....

TABELLE VI

Schutzwirkung einer Vorbehandlung mit der Verbindung I gegenüber einer Infektion .durch Candida albicans bei mit Cyclophosphamid vorbehandelten Mäusen

Dosis der Ver- ' ' Mittlere Über-- Prozentuale;, Erhöhung- der bindung I lebensdauer' mittleren Überlebensdauer (mg/kg) (Tage) gegenüber den unbehandel-

ten Kontrollen

50 . 6,1 38,6*

25 6,8 54,5*

Ünbehandelte .₄

Kontrollen ' " ·

* Aufgrund des T-Tests signifikant verschieden von den un behandelten Kontrollen. P =0,05

- 4(J -

TABELLE VII

Schutzwirkung einer Vorbehandlung mit der Verbindung I gegegenüber einer Infektion durch Candida albicans bei mit Röntgenstrahlen behandelten Mäusen

Dosis der Mittlere Über- Prozentuale Erhöhung der Verbindung I lebensdauer mittleren Überlebensdauer (mg/kg) (Tage) gegenüber den unbehandelten

Kontrollen

25 5,3 ' 43,2*

12,5 5,1 37,8*

Unbehandelte '. _ _ Kontrollen ' ^J/

* Aufgrund des T-Tests signifikant verschieden von den un-]_5 behandelten' Kontrollen. P = 0,05

Die Verbindungen der Formeln I, II und III zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur Korrektur von Immunstörungen bei Menschen und Tieren aus, die einer solchen Korrektur· be- ' dürfen, und sie eignen sich daher' zur .therapeutischen Behandlung von Menschen und Tieren. Die Verbindungen der- Formeln I, II und III werden infolgedessen als- Mittel angese- ; hen, die sich für verschiedene therapeutische Zwecke einsetzen lassen. Sie eignen sich zur Unterstützung der kollektiven Immunität des Körpers durch Erhöhung oder Unterstützung der therapeutischen Stimulation der Zellimmunität. Sie eignen sich daher in¹vivo ' zur Behandlung von Krankheiten, die auf einer chronischen Infektion beruhen, wie fungalen odermykoplasmalen Infektionen, Tuberkulose, Leprose, akuten und chronischen Vireninfektionen und' dergleichen. Bei einer Anwendung können die immunmodulierenden Verbindungen der Formeln I, II und III in Kombination mit ein oder mehr antimikrobiellen Mitteln oder Antibiotika verabreicht werden. Solche Kombinationen können, prophylaktisch oder· therapeutisch zur Bekämpfung und/oder Behandlung mikro.bielle.rInfektionen verwendet, werden. .

Weiter dürften sich diese Verbindungen auch überall dort eignen, wo man es mit einer ZeIlimmunität zu tun hat, und vor allem dort, wo es Immunitätsstörungen gibt, wie beim Di-George-Syndrom (kongenitales Fehlen von Thymus). Diese Verbindungen dürften sich daher auch zur therapeutischen Behandlung bestimmter autoimmuner Erkrankungen eignen, bei denen schädigende Antikörper vorhanden sind, wie bei systemischem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis und dergleichen. Ferner eignen sich die Verbindungen auch zur Behandlung von Zuständen mit subnormaler Immunreaktion, wie sie bei Neoplasmien oder Organtransplantationen auftreten. Durch Verabreichung, einer wirksamen immunregulatorischen Menge der vorliegenden Verbindungen läßt sich daher die Behandlung solcher Zustände (insbesondere von Neuro-. plasrnien) entweder allein- oder in Verbindung mit anderen Behandlungsformen, wie:-einer chirurgischen Entfernung, unterstützen. ' (j '"· ^; . '

Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht daher in-einem· Verfahren- zur· Regulierung des· Trnmunsys-tems-bei

Mensch oder Tier, wo eine solche Immunregulierung notwendig ' ist ν indem-"'man" eine - wirksame. imiaunregu lator is ehe Menge einer dieser Verbindungen, vorzugsweise zusammen mit einem ^!> pharmazeutischen Träger, verabreicht. Unter .einer Regulierung oder Modulierung wird vorliegend verstanden, daß die Verbindungen das Immunsystem zur Unterstützung eines normalen und ausgewogenen Zustands veranlassen. Zur Durchführung dieser erfindungsgemäßen Methoden verabreicht man ei-.ne Verbindung der Formeln I, II oder III parenteral an ein go infiziertes oder suszeptibles warmblütiges Tier.

Die zur Regulierung des Immunsystems wirksame Dosis ist abhängig von der verabreichten Verbindung, der Stärke der Infektion, auf die das Immunsystein reagieren muß, und dem 3g Alter, Gewicht und Zustand des jeweiligen Tiers, Die.für einen, parenteralen Schutz erforderliche Gesamtdosis bewegt sich im allgemeinen jedoch im Bereich von etwa 5 bis etwa 100 mg/kg und liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis

- 42 etwa 50 mg/kg.

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die sich zur Regulierung des Immunsystems zur Bekämpfung intrazellularer Infektionen eignen. Diese Zusammensetzungen enthalten eine Verbindung der Formel I oder II zusammen mit einem geeigneten Träger. Für eine parenterale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen lassen sich unter Anwendung von in der Pharmazie üblichen Methoden formulieren.

Wirksame injizierbare Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, können entweder in Suspensionsform oder in Lösungsform vorliegen. Bei der Herstellung geeigneter Formulierungen ist zu beachten, daß die Wasserlöslichkeit der -Säureadditionssalze im allgemeinen größer ist als die der freien Basen. In ähnlicher Weise lösen sich die' Basen • besser in verdünnten Säuren oder in sauren .Lösungen als in neutralen oder basischen Lösungen-.

- " " " ' ' ' -. ' . ; ' ' - In der Lösüngsform' ist die· Verbindung in einem physiologisch annehmbaren Träger gelöst. Solche Träger- umfassen ein geeignetes Lösungsmittel, erforderlichenfalls Konservierungsmittel', wie Benzylalkohol, und Puffer. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Wasser und wäßrige Alkohole, Glykole-und Carbonatester, wie Diethylcarbonat. Solche wäßrige Lösungen enthalten im allgemeinen nicht mehr als 50 Vol.-% an organischem Lösungsmittel.

3Q Für injizierbare Suspensionszusammensetzungen braucht ^:man ein flüssiges Suspendiermedium mit oder ohne Hilfsmittel als Träger. Beim Suspendiermedium kann es sich beispielsweise handeln um wäßriges Polyvinylpyrrolidon, inerte Öle, wie Pflanzenöle oder- hochgereinigte Mineralöle, oder wäßri-

3g ge Carboxymethylcellulose. '

Geeignete physiologisch annehmbare Hilfsstoffe sind erfor-

derlich, um die Verbindung in Suspensionszusammensetzungen suspendiert zu halten. Die Hilfsstoffe können ausgewählt werden aus Verdickungsmittel^ wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und den Alginaten. Viele

5' oberflächenaktive Mittel eignen sich auch als Suspendiermittel. Brauchbare Suspendiermittel sind Lecithin, Addukte aus. Alkylphenol und Polyethylenoxid, Naphthal'insulfonate, Alkylbenzolsulfonate und die Polyoxyethylensorbitanester.

Viele Substanzen, die die Hydrophilie, Dichte und Oberflächenspannung des flüssigen Suspendiermediums beeinflussen, können in einzelnen Fällen die Herstellung injizierbarer Suspensionen unterstützen. So können beispielsweise Antischaummittel auf Siliconbasis, Sorbit und Zucker brauchba-

re Suspendiermittel sein. .

Ä'us'f ührünqs'belspiele":

Durch die folgenden Beispiele wird die Herstellung der Ver- bindungen der Formeln I und II -näher'erläutert„

B e" i S' ρ i e 1 1

Herstellung der Verbindung I 25

A. Schüttelkolbenfermentation von A53868

Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces luri.dus NRRL 15101 wird in 1 bis 2 ml sterilisiertem Wasser gelöst. Diese Lösung verwendet man dann zur Beimpfung einer Agarschräge mit folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Rinderextrakt O, .05

Glucose . 1,25.

Maisstärke 0,5

Kartoffeldextrin 0,5

Hefeextrakt 0,05

Enzymhydrolysat von Casein 0,03

Lösliches Fleischpepton

Rohrzuckermelasse 0,25

MgSO₄.7H₂O 0,025

Czapek-Mineralgrundmischung 0,2

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Vor Sterilisation wird der pH-Wert mit 5n NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach der Sterilisation beträgt der pH-Wert 6,8.

^a NZ Ämin A,' Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ, V-Sf.A. O.M. Pepton, Amber Laboratories, Juneau, WI 53039, V.St.A. Die¹Czapek-Mineralgrundmischung hat folgende Zusammensetze?- ' züng: · ···· · - . - · .. · - - . - · · ·

Kci 10 %

MgSO₄.7H₂o ; 10 %

'FeSO₄.7H₂O 2 % (in 2 ml konz. HCl gelöst)

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter ;

Die beimpfte Schräge wird etwa 7 bis 14 Tage bei 30⁰C bebrütet. Die auf der- Schräge befindliche' reife Kultur wird mit sterilem destilliertem Wasser (10 ml) überdeckt und mit einer sterilen Pipette zum Loslösen der Sporen abge-

30' kratzt. Sin Teil (0,5 ml)- der erhaltenen Sporensuspension wird zur Beimpfung von 5 0 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

- 45 Bestandteile ' Menge (%)

Glucose .1,5

Kartoffeldextrin 2,0

Sojabohnenschrot ' 1,5

Hefeextrakt 0,1

Maisquellwasser 1,0

CaGO₃ 0,2

Kaltes Leitungswasser . q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert wird vor der Sterilisation von etwa 5,6 mit 5n,NaOH auf 6,5 eingestellt. Nach der Sterilisation- beträgt der pH-Wert 6,5 bis 6,7.

Das beimpfte vegetative Medium bebrütet man in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben etwa 48 Stunden bei 3O⁰C auf einem Rotationsschüttler, der sich in einer Kreisbahn von etwa 5 cm mit 250 U/min' bewegt.

Vegetative Kulturen lassen sich mit.Erfolg aus Sehrägagarkultüren, aus'in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kultureh 'und 'aus' lyophilisierten Pellets ^:der "Kulturen in^:Gang setzen.

Unter Verwendung von bebrütetem vegetativem Medium (0,8 bis 2 %, Vol./Vol.) beimpft man dann 50 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile . Menge (%)

,Lösliche Stärke · . · 3,0

Pankreatisch verdautes Casein ' 1,0

MgSO₄.7H₂O 0,05

K₂HPO₄ 0,05

Ammoniummolybdat 0,01

CaCO₃ 0,2 :

Czapek-Mineralgrundmischung⁰' 0,2(0,2 ml/1.)

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

- 46 ^a Siehe Fußnote (c) des Mediums für den Schrägagar.

Das beimpfte Produktionsmedium bebrütet man in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben 3 bis 5 Tage bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler., der sich in einer Kreisbahn von etwa 5 cm mit 25 0 U/min bewegt.

B. Tankfermentation von A5 3868

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum verwendet man 10 ml des in obiger Weise hergestellten bebrüteten vegetativen Mediums zur Beimpfung von 400 ml eines vegetativen Wachstumsmedxums der zweiten Stufe', das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Dieses Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1-Kolben 48 Stunden bei 3O⁰C auf einem Rotationsschüttler bebrütet, der sich in einer Kreisbahn von etwa 5 cm mit 2 50 U/min bewegt,

Das so hergestellte inkubierte vegetative Medium der zwei- ten Stufe· (21) verwendet man zur Beimpfung von- 100 1 sterilem Produktionsmedium, das die gleiche Zusammensetzung ' wie im 'Abschnitt A.. angegeben'' hat ;. Das beimpfte-Produktionsmedium läßt man in einem 165 1-Fermentationstank etwa 4 bis 6 Tage bei einer Temperatur von 3O⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit herkömmlichen Rührern ge- rührt und mit steriler Luft in- solcher Menge belüftet, daß eine Menge -an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten wird, die größer ist als 30 % an Luftsättigüng bei atmosphärischem Druck.

C. Abtrennung der Verbindung I

Die in der in Abschnitt B. beschriebenen Weise erhaltene Fermentationsbrühe (200 ml) wird unter Verwendung eines Filterhilf smi-ttels (2 %, Hyflo, Johns-Manvil Ie Products' Corp.) filtriert. Das Mycel wird verworfen und die filtrierte Brühe wird zur Adsorption durch eine mit Diaion HP-20 gefüllte und 16 1 fassende Säule (Mitsubishi Ind.)

geschickt. Die Säule wird mit 150 1 eines 1:9-Gemisches aus Acetonitril und Wasser eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 4 1 gesammelt werden. Die Elution der Verbindung I wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht. Bei diesem Versuch wird die Verbindung aus einer etwa 0,9 χ 30 cm messenden und mit Zorbax ODS (DuPont, 12 μ) gefüllten Säule bei 5,1 Minuten unter folgenden Bedingungen eluiert.

Fließgeschwindigkeit = 2,0 ml/min . Detektion - UV bei 25 4 nm

Sensitivität =0,16 Absorptionseinheiten über

die volle Skalenbreite

Elutionslösungsmittel = 8 % CH-,CN in 0,1 % Phosphatpuffer, pH == 3 '

Die gewünschten Fraktionen werden unter Vakuum zur¹ Entfernung des Acetonitrils eingeengt, wodurch man zu einer, wäßrigen Lösung gelangt, die 167 g (die Konzentration wird durch Wiegen· getrockneter Teilmengen bestimmt) an Rohprodukt gelangt.

Einen Teil des wäßrigen Rohprodukts (50 g) gibt man auf eine 2 1 fassende und mit. Diaion HP-20 gefüllte Säule. Die

25· Säule wird zuerst mit 10 % NaCl enthaltendem Wasser (4 1) gewaschen und dann mit einem. 1:.9-Gemisch aus Acetonitril und Wasser eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 200 ml gesammelt werden. Die Fraktionen werden durch Hochleistungsf lüssigkeitschromatographie analysiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Entfernung von Acetonitril eingeengt, wodurch man zu weiterem wäßrigem Konzentrat gelangt, das etwa 15 g Rohprodukt'enthält. ^;

.Teilmengen der wäßrigen Konzentrate (8 bis 10 g) oder des 35 ursprünglichen HP-2 0 wäßrigen Rohrprodukts gibt man auf eine 2 1 fassende.und mit LP-l/C,_o gefüllte präoarative ümkehrphasen-HPLC-Säule, die wie in ÜS-PS 4' 287'120 beschrieben zubereitet wird (siehe Beispiele 6 und 7). Die

1' Säule wird mit Wasser (2 1) und dann mit einer Lösung aus · 5 Teilen Acetonitril und 95 Teilen Wasser plus 0,1 % Essigsäure (pH. = 3) bei einer Fließgeschwindigkeit von 120 ml/ min eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 80 ml gesammelt werden, die man durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht. .Der Verlauf der Elution wird durch Ultraviolettlicht bei 254 nm überwacht. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und lycphilisiert, wodurch man zu einem stärker gereinigten Produkt (2 bis 4. g) gelangt.

Dieses Produkt _wird ' dann wie folgt weiter gereinigt. Teilmengen (1 g) 'chromatographiert man über einer 1 Liter fassenden und mit Zorbax ODS (12 μ) gefüllten präparativen Umkehrphasen-HPLC-Säule, die man mit einer Lösung aus 5 Teilen Acetonitril und 9 5 Teilen Wasser plus 0,1 % Essigsäure (pH = 3) bei einer Fließgeschwindigkeit von 50- ml/min eiuiert, wobei Fraktionen von jeweils 25 ml gesammelt werden. Die Elution wird durch Ultraviolettlicht bei 254 nm überwacht, und die Fraktionen werden durch Hochleistungsflüs- - sigkeitschromatographie bei 225 nm analysiert. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne lyophilisiert', wodurch man zu. 200 bis 500. mg gereinigtem· Material (Reinheit =85 bis; 95 %) gelangt. .

Die Gesamtausbeute dieses Materials aus. 200 1 Fermentationsbrühe beträgt 5° bis 6 g.

Das gereinigte Material unterzieht, man. dann einem Limulusamoebocytenlysat-Versueh (LAL ) bezüglich; Endotoxin. Ist der Versuch positiv, dann filtriert man das Material zur Ent- fernung des Endotoxins in Form einer Lösung von 1 mg/ml Wasser durch einen Zeta-Por-Filter (AMF CUNO₇ Meriden, CT, V.St.A.). Das Filtrat wird zur Trockne lyophilisiert, wodurch man zu insgesamt .3 bis 5,6 g gereinigter,endotoxinfreier Verbindung I gelangt. .

Das Endotoxin wird auch durch' Hohlfaserbündeldialyse in-

1. steriles pyrogenfreies Wasser entfernt. Hierzu löst man das Material (etwa 500 mg) in Wasser (5 ml). Die Lösung wird dann kontinuierlich durch ein Hohlfaserbündel aus 44er Fasern von Spectra-Por HF (Spectrum Medical Industries, Inc., New York, NY, V.St.A.) mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 5000 Dalton im Kreislauf geführt. Das Hohlfaserbündel ist in einer Hohlfaserbündeldialyse-Apparatur von Fleaker (Corning Glass Works, Corning, NY, V.St.A.) angeordnet, die mit 300 ml sterilem pyrogenfreiem Wasser gefüllt ist. Das Konzentrat wird unter Verwendung einer FMI-Pumpe (Modell RP, Fluid Metering Co., Oyster Bay, NY, V.St.A.) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min kontinuierlich durch das Hohlfaserbündel im Kreislauf geführt.

D. Eigenschaften der Verbindung I

Form : Farblos', amorph

Empirische Formel: C₁ H -N 0 P .

Molekulargewicht: etwa 307 Elementaranalyse:

Gefunden Berechnet für

	Probe I	Probe II	40,12
Kohlenstoff	41,32	38,74	6,43
25 Wasserstoff	7,61	6,78	12,76
Stickstoff	11,53	12,42	' 2 4,30
Sauerstoff	24,38	-	9,41
Phosphor	-	7,70	—
Asche*	13,58	—

'* Bei der Asche handelt es sich einer Untersuchung zufolge um Phosphat. .

Durch Bombardierung mit raschen Atomen erhaltene Massenspektralanalyse:'

m/Z

HRMS

Element ar zusammensetzung

M+H 308

143 138

308,13818

143,11878

138 ,03240

C₃H₉NO₃P

Molekulargewicht - 307

Molekularformel = ^c-i ι ^H ₂2^N3°5^P

Das Infrarotabsorptionsspektrum (freie Säure) in KBr-PeI-lets; zeigt signifikante Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ):

3368, 3312 und 3300 (breit, stark), 3063 (schwach), 2966 (mittel bis schwach), 2833 (sehr schwach), 2663 (schwach), 1671 (stark), 1625 (Schulter)., 1536 (stark), 1469 (schwach), 1442. (schwach) ·, 1386 (mittel bis schwächT, 1340 (sehr' schwach), 1277 ' (sehr schwach)'', · 1240 (Schulter),12Ό7 (stark), 1157 (sehr schwach), 1068 (mittel)', 1048 (stark), 918 (mittel bis schwach), 797 (mittel),778 .(mittel) und 625

2Q (schwäch') .. ·

Aminosäürean'aiyse:.: (mit . ' 6nVHOl .': hydrolysierte 'Proben) :

Aminsoäure μΜοΙ/mg Mittlere prozen-

. gefunden berechnet tuale Reinheit

Glycin Leucin

2,8 2,86

3,2. 3,2

87 % 87 %

Elektrometrische Titration (in.66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid): pK -Wert = 8,2 (Glycylaminogruppe).

Löslichkeit: Löslich in Wasser und Dimethylsulfoxid, unlöslich in den meisten organischen Lösungsmitteln.

Magnetische Kernresonanz (360 MHz-Gerät, Probe in DMSO-d

gelöst): Die Struktur entspricht der-Formel I.

-oilBeispiel2

Zur Herstellung der Verbindung I geht man wie bei Beispiel

1 beschrieben vor, wobei man die Reinigung in der mit

LP-l/C,_o gefüllten Säule jedoch durch folgendes Verfahren ersetzt:

Rohprodukt aus der HP-20-Stufe (180 bis 200 g/200 1 Fermen tation) wird 30 Minuten in Methanol» (6 bis 8 1) gerührt O ^und dann filtriert. Man rührt die nicht aufgelösten Feststoffe erneut'in Methanol und filtriert dann wieder.- Die zwei Methanolextrakte werden vereinigt und eingeengt (auf

2 1). Das Konzentrat gibt man zu 10 Volumina Ethylacetat, und der sich bildende Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und getrocknet, wodurch man zu 72 bis 80 g Rohgelangt-,·'· . . '

Das- nach diesem Verfahren erhaltene Produkt (100 g) wird in Wasser (400 bis 500 ml) gelöst. Die Lösung wird durch Zusatz von konzentriertem NH OH auf pH'10 eingestellt. Die erhaltene'" Lösung" gibt "man in einer Geschwindigkeit von 2 0 mi/ in in' auf" eine; 2 1 fassende lonehausfcäuschersäule' (AG1'--X4 in der Aceta.tf orm, Korngröße 0,075 bis 0,15 mm, Dowex, mit Wasser gepackt und gewaschen). Die Säule wird dann mit -Wasser (4'1) gewaschen und mit 0 , 025, %-iger Eisessigsäure eluiert, wobei man Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 1 Liter sammelt. Die Fraktionen werden durch analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie über eine 0,65 χ 15 cm messende und mit Zorbax ODS (6 μ) gefüllte Säule überwacht,-die man mit 7,5 %-igem Acetonitril in einem 0,1 %-igen Phosphatpuffer (pH = 3) eluiert. Die ge- ' wünschten Fraktionen werden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 15,5 g stärker gereinigtem Produkt (Reinheit = 80 bis 90 %) gelangt.

Dieses.Produkt unterzieht man dann wie bei Beispiel 1. einer weiteren Reinigung durch präparative Hochleistungsflüssig-

keitschromatographie mit Zorbax ODS (12 μ), wobei man zur Elution jedoch ein Lösungsmittelsystem aus 5 Teilen Acetonitril und 95 Teilen Wasser plus 0,025 % Pentafluorpropion-

säure verwendet

5

Beispiel 3

Herstellung' von H-LAPP

IQ Man setzt die Verbindung I mit Leucinaminopeptidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,. V. St-. A. ) bei einem pH-Wert von 7,5 zwei Stunden bei Raumtemperatur um. Die umsetzung wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht. Nach vollständiger Umsetzung der Verbindung i wird

15- das Reaktionsgemisch durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einer mit Zorbax ODS gefüllten Säule unter Verwendung von 7,5 % CH^CN in 0-, I-molarem Phosphatpüf f er mit einem pH-Wert von 3,5 und Wasser aufgearbeitet, wodurch man N-(l-Methylen-2-phosphonoethyl)leucinamid

20. /H-LAPP?' in 2 0 %-ige.r Ausbeute erhält.

Massenspektralanalyse·: m/Z'

M + H

251

Molekulargewicht =250 Molekularformel = C_n

Beispiel4.

Herstellung von Ala-Gly-LAPP

Die Verbindung I setzt man mit dem- gemischten Anhydrid aus Alanin und Isobutylchlorformiat in.üblicher Weise um, wodurch man zu Ala-Gly-LAPP gelangt." 35

Beispiel '5 Herstellung von T.rp-LAPP

5 iMan setzt H-LAPP unter Anwendung herkömmlicher Methoden mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Tryptophan um, wodurch man Trp-LAPP erhält.

Beispiel 6 Herstellung von He^--GIy-LAPP

Man setzt Ala-Gly-LAPP mit dem gemischten Anhydrid aus Isoleucin und Isobutylchlorformiat in herkömmlicher Weise um, IQ wodurch man zu .Ile-GlyrLAPP gelangt.

B ^-e" i s' ρ i e^- 1 7

Herstellung von CH-,-C ( 0)-NH-GLAPP

Man löst 100 mg der Verbindung I (GLAPP) in 2,5 mlPyridin. Die Lösung· wird mit"^- 1^- ml' Eä/sigsäureanhydrid versetzt' und das^: Gemisch 3 Stunden' bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird unter Stickstoffatmosphäre auf 1 ml eingeengt, worauf man das Konzentrat mit 2 ml Wasser.. versetzt und die Lösung einfriert und lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 115 mg des Titelprodukts.^-

Die unter Bombardierung mit raschen Atomen durchgeführte Massenspektralanalyse ergibt folgende Werte:

m/Z . ^-

M.+ H 350 (Hinweis auf eine Monoacylierung) M + Na 37 2

M + K 388

Molekulargewicht = 3 49

Beispiel 8 Herstellung von GLAPP-Mono- und Dimethylphosphonoestern

Man löst 100 mg der Verbindung I (GLAPP) in 3 ml Methanol. Die Lösung wird unter Rühren mit 0,5 ml In Chlorwasserstoff säure versetzt, worauf man unter weiterem Rühren langsam 1 ml destilliertes Diazomethan in Diethylether zugibt. Das Gemisch wird 3 Stunden weiter gerührt und dann über Nacht stehengelassen. Das Methanol wird unter Stickstoffatmosphäre entfernt, worauf man das Ganze mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt, die Lösung einfriert und lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 75 mg der Verbindun-

2 3

gen der Formel I, worm R und R jeweils Methyl sind oder

worin einer der Sub.stituent.en R oder R Methyl ist und der andere Wasserstoff bedeutet.

Eine durch Bombardierung mit raschen Atomen durchgeführte Massenspektralanalyse ergibt folgende Werte: m/Z . .

M + E 336 M' + H. 3 22

Molekulargewicht des MonomethyIesters =321 Molekulargewicht des Dimethylesters =3 35

Claims (10)

Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A53868

Faktor A und von Derivaten hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptcmyces luridus NElFlL 15101 oder eine· Mutante oder Rekombinante hiervon, die A53868 Faktor A bildet, in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff,

Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet ist.

2 3

mit den Maßgaben, daß R und R identisch sein müssen, falls sie beide Alkyl bedeuten, und einer der Substituen-

12 3

ten R , R , R , Z oder Z¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben muß, falls η für 1 steht, oder die Salze hiervon herstellt.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man Streptomyces luridus NRRL 15101 züchtet.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer weiteren' Stufe den Faktor A von A53868 isoliert.

4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch g e kennz ei chnet , daß man in weiteren Stufen den Faktor A von A53868 mit Leucinaminopeptidase umsetzt/oder einer.selektiven sauren Hydrolyse unterzieht und dann eine herkömmliche Lösungsphasenpeptidsynthese durchführt und so die Verbindungen der Formel Ha

v Ch= Ar na

worin

R die charakteristische Gruppe einer ^.-Aminosäure darstellt, wie sie normalerweise, in Proteinen zu finden ist,
md R
Alkyl sind,

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder C, -C-,-

Z Wasserstoff, C,-C,-Alkyl, C, .-C-.-Alkanoyl, Phenyl-C-,-C₅-

Io i D Ij

alkyl, Phenyl-(X) -C.-C-.-alkanoyl oder eine Aminoschutζgruppe bedeutet,

Z' Wasserstoff oder C,-C' -Alkyl darstellt, X Sauerstoff oder Schwefel ist,
m für O oder 1 steht, und

η für O, 1, 2 oder 3 steht,

5. Verfahren nach Punkt 3,dadurch g e ]_5 k e η η ζ e i c h η e t , daß man in einer weiteren Stufe den Faktor A von A53868 einer herkömmlichen Lösungsphasenpeptidsynthese unterzieht, und so Verbindungen-der Formel Ha gemäß Punkt 4 bildet, worin R ' oder Z¹ nicht Wasserstoff bedeuten.

Ha gemäß Punkt 4 bildet, worin R Wasserstoff ist und Z

6- Verfahren nach Punkt 3, 4 oder 5, dadurch g'e k e'η η ^; ζ-'β··⁵ i c/h'ne^t , daß man in einer'-''weiteren·'" Stufe ^eine Verbindung der.Formel Ha,derivatisiert, worin wenigstens einer der S

für Wasserstoff: steht.

wenigstens einer der Substituenten R , R , Z oder Z' nicht

7. Verfahren nach Punkt 1, 3, 4, 5 oder 6., dadurch gekennzeichnet , daß man ein phar mazeutisch annehmbares Salz herstellt.

^:

8. Verfahren nach Punkt 7, da d'u.'r c h ge -

k e η η ζ e i "c h η e t , daß man als Phosphonatsalz das Mononatriumsalz, das Dinatriumsalz, das MonoammoniumsaIz, das Diammoniumsalz oder das Monocyclohexylammoniumsalz herstellt.

9. Verfahren, nach Punkt 7, dadurch ge-

kennzeichnet , daß man als Aminsalz das Hydrochloridsalz herstellt.

10- . Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es den Mikroorganismus Streptomyces luridus NRRL 15101 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Hierzu-r Sei ta Zei